TW400384B - A new cephalosporin C acylase - Google Patents

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TW400384B
TW400384B TW083109758A TW83109758A TW400384B TW 400384 B TW400384 B TW 400384B TW 083109758 A TW083109758 A TW 083109758A TW 83109758 A TW83109758 A TW 83109758A TW 400384 B TW400384 B TW 400384B
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natural
acid sequence
dna
same
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TW083109758A
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Mineo Niwa
Yoshimasa Saito
Takaho Fujimura
Yoshinori Ishii
Yuji Noguchih
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co
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Description

五、發明説明（》) 本發明傺關於一種新穎之頭孢子菌素C醛基轉移酶（ 以下稱作"CC醛基轉移酶"）。更待別地，其傺關於一 S 藉蛋白質工程所製得之新穎突變CC酵基轉移酶，一種编 碼其之DNA, —種含該DNA之表現載體，一種轉殖以該表 現載體之微生物，及藉培養該轉殖殖做C C醯基轉移酶之生 産。 頭孢子薗素c醯基轉移酶傜對一種能水解頭孢子S素 C成為7-胺基頭抱子薗素（7-ACA)之酶的通稱》 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事寫本頁) 到目前為止，發現有三種應被歸類為CC醯基轉移酶， 卽頭孢子薗素C醯基轉移酶S E 8 3，H1 7 6 ,及V 2 2，基胺基 酸序列被掲示於 Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.72,232-243(1991)。在此文獻中 ,CC醛基轉移酶之胺基酸序列编號開始於基N-端部份之 甲硫胺酸（·ε1;1ιίοηίηβ)基β然而，在本説明軎中CC醯基 轉移酶之胺基酸序列編號傺開始於接近基Ν-端部份之甲 硫胺酸基之蘇胺酸(theonone)基，因為藉於原核生物中 表現CC醯基轉移酶基因所得之成熟CC醯基轉移酶之α -次單元之Ν-端甲硫胺酸被一種酶（如，胺基胜呔酶 > 移去 而得一具有蘇胺酸基作為其绱胺基酸之成熟CC醯基轉 移鞴重組DHA技術之天然型CCS基轉移酶之生産亦 掲示於該文獻，且發現表現之CCS基轉移W僳經胞内處 理而得由Of-次單元及>8-次單元組成之天然型式。然而 ，處理之效率一般在大腸捍餹中是低的》由深入研究所 得之结果，本發明之發明人已成功地製迪出具有較多所 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X 297公釐) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明O ) 欲性質之突變CC醯基轉移_，其具有較高Μ效價，pH表 現改變，較高處理效率等之特徽》 本發明之新穎之突變CCS基轉移酶可以下列特撖加以 定位》 一突變CC醯基轉移_其中至少一傾在天然之CCB基轉 移酶之胺基酸序列之Ala49, MetH^SerW^Met174 , Glu 35 8，Met 4es，Met 5β6 ,或 Met 750 位置之胺基酸被一不 同之肢基酸取代〇 取代Met 1β4之不同胺基酸之較佳例可包括中性胺基 酸，如甘胺酸（glycine),丙胺酸（alanine),白胺酸 (leucine)及類似者。 取代 Ser 1ββ，Met 174 ，Met 4β6 , Met 及 /或
Met7 se之不同胺基酸之較佳例可包括中性胺基酸，如 丙胺酸及類似者》 取代Glu3S8之不同胺基酸之較佳例可包括中性胺基 酸（如，異白胺酸等），鐮性胺基酸（如，離胺酸（lysine) 等）及類似者。 取代Ala 〃之不同胺基酸之最佳例為白胺酸* 本發明之突變CCS基轉移酶亦可為藉以不同胺基酸取 代在天然CC醣基轉移酶之其他位置之胺基酸之至少一 β 胺基酸而得之突變CC酵基轉移路，例如，以不間胺基酸 取代突變CCBI基轉移期I之Met2»9及/或Cys3ee。 突變CC醯基轉移酶之較佳例可以其在處理成α -次單元 及次單元前之先質形之下式表示： 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) -..................ri................訂................線 - -. / .·, (請先閲讀背面之注意事本頁) (' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 )
Al-48-Xl-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6- A466-505-X7-A507-749-X8-A751-773 其中A1-48與天然CC醛基轉移酶之自Thr1至Glu48之胺 基酸序列相同， A50 -163輿天然CC酵基轉移胸之自AspS0至Leu1**之 胺基酸序列相同， A167-173與天然CC醯基轉移酶之自Val167至Arg 173之 胺基酸序列相同， A175-357與天然CC醛基轉移酶之自Leu175至Val 357之 胺基酸序列相同， A359-464與天然CC酵基轉移驊之自Thr3S9至Ala 4β4之 胺基酸序列相同， Α466-505與天然CC醒基轉移W之自Pro46<^Ile ses之 胺基酸序列相同， A507-749輿天然CC酵基轉移酶之自Lys507至ALa 749之 胺基酸序列相同， A751-773與天然CCS基轉移W之自Val 75*至戍18 77 3之 胺基酸序列相同， XI為Ala或不同之胺基酸， X2,X4,X6,X7及X8分別為Met或不同之胺基酸， X3為Ser或不同之胺基酸，且 X5為Glu或不同之胺基酸， 但條件為Met2e9及/或cys3es可被不同之胺基酸取 本紙張尺度適用中國Η家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) -.......................裝................訂................線 (請先Μ讀背面之注意事窝本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A 7 _ B7____ 五、發明説明（本） 代，且當Xl為Ala刖]l2，}ί4,X6，X7及X8分別為Met，X3為SeΓ 且X5為Glu以外之胺基酸β 在本説明軎中，方便地使用了命名特別突®CC酵基轉 移_的命名》依此命名，例如，一種緒以白胺酸取代在 天然CC醯基轉移酶之胺基酸酸序列164位置之甲疏胺酸 基而製得之突變CC醛基轉移酶應命名為突變“酵基轉移 酶M164L,其中Μ為被取代之甲硫胺酸（一種胺基酸）之 單一字母缩寫，164為天然CC酵基轉移酶之胺基酸序列 之位置號碼且L為用於取代甲硫胺酸（前者之胺基酸）基 之白胺酸（不同之胺基酸）之單一字母缩寫。另一方面， 例如，突變CC醯基轉移_»1641及Μ164Α為分別藉以白按 酸及丙胺酸取代在天然CCS基轉移酶之胺基酸序列164 位置之甲硫胺酸基而製得。突變CC醯基轉移酶M164L/ M174A /M269Y為藉以白胺酸取代天然CC醵基轉移酶之胺基酸 序列位置164之甲硫胺酸基，以丙胺酸取代天然CC醯基 轉移酶之胺基酸序列位置174之甲硫胺酸基，且以酪肢 酸（tyrosine)取代天然CC醒基轉移酶之胺基酸序列位置 2 6 9之甲硫胺酸基而裂得。 本發明之突變CC醯基轉移酶可藉重組DNA技術，多胜 呔合成及類似者而製得。 比方，新潁CCS基轉移_可藉培餐一以包含缠碼新潁 CC醯基轉移酶之胺基酸序列之DN A之表現載龌轉殖之宿 主细胞於營養培養基中，再自經培養之基中回收新類CC 醯基轉移_而得》 (請先閲讀背面之注 意事 本頁) 裝· 訂. Γ 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 五、發明説明（丈） A7 B7 經濟部中夹標準局負工消費合作社印製 本方法之特別處以較詳細之方法解稼如下β 宿主細胞可包括撖生物〔細菌（如，大腸桿薗，枯草 捍醅，等），酵母菌（如，啤酒酵母，等），動物細胞枝 及培餐之植物細胞〕。微生物之較佳例可包括細菌，特 別是屬於艾欧利希@屬（Escherichia)(如，大腸桿菌JM 109 ATCC 53323,大腸桿菌 HB101 ATCC 33694,大腸桿 薗 HB101-16 FERM BP-1872,大腸桿菌 294 ATCC 31446 ，等），酵母®，持別是颶於酵母菌）B(Saccharo»yces) (如，啤酒酵母AH22),勖物細胞株（如，鼠 L 92 9細胞， 中國大鼠卵m(CHO)細胞，等〕及類似者。 當細菌，特別是大賜捍菌，被用作宿主細胞，表現載 龌通常由至少一偏啓動子-操作子匾，起始密瑪子，编《I 新潁CC醯基轉移酶之胺基酸序列之DNA,終止密碼子， 終止子區及可複裂單元所組成》當使用酵母菌或動物細 胞作為宿主細胞時，表現載體較佳由至少一值啓動子， 起始密碼子，編碼訊號胜呔及新穎CC醯基轉移酶之胺基 酸序列之DNA，及终止密碼子所组成。亦可將增強子序 列，新穎CC酵基轉移酶之5’-及3’-未编碼匾，接合邊界 ，多睇甘化位點及可奄奮可职之複裂單元插入表現載》 中。 啓動子-操作子區包含啓動子，操作子，及尚-大格諶 (SD)序列（如，AAGG，等）。較佳之啓動子-操作#區可 包含方便使用之啓動子-操作子匾（如，大腸捍菌之PL-啓動子及trp-啓動子 > 及CC醯基轉移_授-17 6染色髏基因 .......................•裝…… (請先閲讀背面之注意事βΟί窝本頁) (、 訂· 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 五、發明説明（b ) 之啓動子。於酵母菌中新穎CC醯基轉移酶之表現之啓動 子可包含啤酒酵母之TRP1基因，ADHI或ADHII基因及酸 磷酸化酶（PH05)基因之啓動子，且於哺乳類細胞中新顆CC 醛基轉移酶之表現之啓動子可包括SV40早或晚-啓動子 ，HTLV-LTR-啓動子，鼠金羼硫新質I(MMT)-啓動子，牛 痘-啓動子及類似者。 較佳之起始密碼子可包括甲硫胺酸密碼子（ATG)。 訊號胜肽可包括習知用於其他_之訊號胜肽（X然t-P A之訊號胜呔，天然胞質素原之訊號胜肽）及類似者。 编碼新穎CC醛S轉移酶之胺基酸序列之DN A可以習知 方式製得，如利用DNA合成儀之部份或全部DHA合成及/ 或將已插人可得自轉殖體〔如，大腸桿菌JM109(pCCU 176-2)FERM BP- 3 0 4 7〕之合適載體（如，pCCN 176-2)之 编碼天然醯基轉移酶之完整DN A序列以合適方式如習知 之突變方法〔如，卡匣突變方法（c f . T 〇 It u n a g a , T . e t a 1 .， Eur.J.Biochei. 153,445-449(1985)，PCR突變方法（cf. 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 H i g u c h i, R. e t a 1., Nucleic Acids Res. 16,7351-7 3 6 7 ( 1 9 8 8 ) )，K u n k e 1 1 s 方法（c f · K u n k e 1 T · A . e t a 1 ·, Methods Enzyiol. 154,367 ( 1 987 ))及類似者〕加上以 合適_ (如，限制_，鹼磷酸化_，.多核甘激酶，D ΝΑ黏 合梅，DN Α聚合酶，等）處理之處理。 终止密碼子可包括習知使用之终止密碼子（如，TAG, TGA,等）〇 终止子匾可包括天然或合成之終止子（如，合成之fd -8 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（7 ) 噬菌體終止子，等）。 可褀製單元為一於宿主細胞中能複製颶於其中之全部 DNA序列之DNA複合物，且可包括天然質醱，人工修钸之 質鼸（如，製備自天然質艨之DU A片段）及合成質鼸β質 釀之較佳例可包括用於大腸桿菌之質龌PBR322及其人工 修飾者（得自PBR322之合適限制酶處理之DNA片段 >,用 於酵母菌之酵母豳2#質體及酵母菌染色釀DNA,用於晡 乳類細胞之質龌pRSVneo ATCC 37198,質釀pSV2dhfr ATCC 37145,質醱 pdBPV-MMTneo ATCC 37224,及質朦 pSV2neo ATCC 3 7 1 4 9 〇 增強子序列可包括SV40之增強子序列（72.b.p.)^ 多腺甘化位黏可包括SV40之多腺甘化位黏。 接合邊界可包括SV40之接合邊界β 啓動子，起始密碼子，编碼新CC醯基轉移酶之胺基酸 序列之DNA,终止密碼子及终止子匾可連绩地並國圈地 以足夠的可複製單元（質體）速接起來，若須要，利用足 夠的DHA片段（如，連接子，或其他限制切鞀，等）以習 知方式（如，以限制酶作用，以T4DNA黏合酶黏合）而得 一表現載《 β 宿主细胞可以表現載釀轉殖（轉滅染 >。轉殖（轉戚染） 可以習知方式[如，Kushner方式用於大腸捍菌，磷酸 錚方法用於晡乳類细胞，微注射，等〕進行而得轉殖龌 (轉成染醱）》 為了藉本發明之方法製備新CC醸基轉移_，将包含表 (請先閲讀背面之注意事本頁) -Ί 裝· r 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ί ) 現載髏之如是所得之轉殖體培養於水性營養培餐基中。 營養培餐基可包含碩源（如，Μ萄糖，甘油，甘露醇 ，果糖，乳糖，等）及無機或有機m源（如，硫酸銨，氰 化銨，酪蛋白水解物，酵母®萃取物，多臃，薗胰臃， 牛肉萃取物等）β若須要，其他營餐源〔如，無檐鹽（如 ,二磷酸納或鉀，磷酸氫二押，氯化镁，硫酸鎂，氛化 鈣 >,維生素（如，維生素^),抗生素（如，氨苄育徽 素，卡那徽素），等〕可加入培養基中。對哺乳細胞之 培養，D u 1 b e c c 〇 ' s Μ 〇 d i f e d E a g 1 e ' s M i n i * u 疆 E s s e n t i a 1 M e d i u ( D Μ E M )添加以眙牛血淸及抗生素常被使用。 轉殖體（包括轉威染«)之培餐通常在PH 5.5-8.5(較 佳 pH 7 - 7 · 5 )及 1 8- 4 0*C (較佳 2 0 - 3 0 -C )下進行 5 - 5 0 小時 〇 當如是製造之新CCS基轉移酶存在於培養溶液中，培 養濾液（上清液）藉培餐掖之遇《或雄心而得。自培餐* 液中，新CC酵基轉移酶可以一般用於純化及分離天然或 合成蛋白質之習知方式純化（如，透析，凝騵遇濾，利 用抗-CC酵基轉移Μ單株抗醱之親和柱狀層析，在合適 吸附物上之柱狀層析，高效能液態層析，等笛所裂 造之新CCS基轉移_存在於培餐的轉殖體之外細胞質及 細胞質，細胞藉遇濾及離心收集起來，且其細胞壁及/ 或细胞膜鞴，如，以超音波及/或溶菌酶處理，來破银 而得殘餘物及/或溶胞液。殘餘物及/或溶胞液可溶解 於合適之水溶掖（如，8M水性尿素，βΜ水性naan»自 溶液中，新CC醯基轉移酶可以習知方式如以上所提出者 -10* 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210 X 297公釐) ........................Μ…… < ii (請先閲讀背面之注意事本頁) r 線 A7 B7 五、發明説明（9 ) 純化。 本發明進一步提供下式化合物之製備方法
CHz-R1 (I) 其中R1為乙酷氣基，羥基，或氫， 或其鹽， 其包含將下式化合物：
S
CHz-R1 (II) (請先閲讀背面之注意事項f •窝本頁) 、可 其中R1如上所定義且 R 2為羧基醛基， 或其鹽 與以包含了编碼本發明之新CC醯基轉移酶之DN A之表 現載髖所轉殖之撤生物之.培養液或與其處理之物質相接 譌。 R2之羧基醯基可包括脂肪族，芳香族或雜琢羧基醯 基且其合適之例可為Ci -Ce烷醯基其可有一或二隹合 逋的選自由胺基，羥基，羧基，Ci -C 6烷醏胺基，苯醯 胺、咩吩基及類似者所组成之群之取代基》 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明o) 化合物（I)及（II)之合適鹽可為齡金颶邇（如，納91， 鉀鹽，趣鹽u 若CCS基轉移梅活性常存在於轉殖之細胞，下列之製 備可為經培養之液之經處理物質之例子。 (U粗细胞：以習知方式例如過濾及離心自缠培餐之 液中分離》 (2>乾細胞.·以習知方式例如凍乾及真空乾燥藉乾燥 該粗細胞而得。 (3) 無細胞萃取液：以習知方式（如，利用有機}容劑以 礬土，海砂等研磨，或以超音波處理細胞）藉破壤該粗 或乾細胞而得〇 (4) _溶液：以習知方式（如，柱狀層析）藉純化或部 份純化該無細胞萃取物而得；且 (5) 固定細胞或酵素：以習知方式.（如，利用丙嫌酵按 ,玻璃珠，離子交換樹脂等方法）藉固定該細胞或_而 製備。 包含以_接觸化合物（II)之反應可於如水或缓衝溶液 之水性培餐基中進行，亦即，其通常可藉將經培餐之液 或其經處理之物質溶解或懸浮於如包含化合物（II)之水 或緩衝溶液之水性培養基中進行· 較佳之反應混合物，化合物（II)之濃度，反竈時間及 反鼴溫度可因欲使用之經培養之液或其經處理物質之性 質而不同。通常，反應你在PH6至1〇，較佳PH7至9在 5至4 0 *C，較佳5至3 7 eC下進行〇 . 5至5 0小時p -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X 297公釐) 裝----- :請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂 線 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A 7 B7_____ 五、發明説明（"） 反應混合物中作為作用物之化合物（II)之濰度可較佳 自1至100aig/*l之範圍中做遘擇<* 如是所製得之化合物（I)可以習知方式自反應混合物中純 化及分離。 突變醯基轉移酶之專一活性傜依如下所述之方法決定。 UGL-7ACA酵基轉移_活性：於在37-C預培餐1〇分鐘之
5 0 0 // 1 GL-7ACA 溶液〔10ig/·!於 0.15M Tris-Hcl(pH 7.5)〕加入20/«1之試樣醯基轉移_，且将混合物在37°c 培餐5分鐘。反應藉加入550//1之5%乙酸而停止。將 所得混合物離心（1〇,㈣〇rp·在室溫5分鐘）後，上淸液 用於分析7ACA形成。 HPLC條件：柱：TSKgel 0DS-80 TMCTR 4.4臟·Χ 1〇〇·麗 (T0S0H)，溶析液：ΙΟΟβΜ掙嫌酸，5.0»Μ η -己烷-1-磺 酸納於14.3% (V/V)乙脯；流速：l.〇il/»in;注射腰 積：10#1;偵測器：2 5 4 η·β 一傾單位定義為在37°C每分鐘能自GL-7ACA合成1.0 yu bo le之7 ACA之活性。 ii>CC醛基轉移酶活性：於在3TC預培餐10分鐘之500>ul 之CC溶液〔10*g/«l頭孢子菌素C之納鹽於0.15M Tris •HCl(pH 8.7)， pH 以 IN NaOH再調至 PB8.7]加入 20#1 之試櫬乙酵轉移酶，且将混合物在37»C培餐10分鑪》将 所得混合物離心（10,〇〇〇ΓΡ·在室溫5分鐘）後，上淸液 用於分析7ACA形成。 HPLCfe件：柱：TSKgel 0DS-80 TMCTR 4.4··Χ 100·· -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先Η讀背面之注意事^本頁) 裝. 線· 經濟部中央檫準局貝工消费合作社印製 A 7 •_B7___五、發明説明（ (TOSOH),溶析液：ΙΟΟβΜ檸櫬酸，5·0βΜ η-己烷-卜硫 酸納於14.3%(V/V)乙脯；流速：l.〇Bl/nin;注射髑 稹：2 0 1 ;偵測器：2 5 4 η 。 一偁單位定義為在37。(3毎分鐘能自頭孢子菌素1^之纳 鹽合成l.〇A mole之7ACA之活性〇 所附圈示之簡要説明如下。 第1團潁示用於本發明軎之資施例中之DNA寡聚物》 第2圓為構築PCC001A之圈示》 第3團為構築PCCQ0 2A之圖示。 第4画為構築p C K 0 0 2之圖示p 第5圖為構築PCC 0 0 7 A及pCCNt013之圖示。 第6圖為構築pCCO 13A之画示。 第7圔為構築P △ N1 7 6及P C K 0 1 3之圖示》 第8圖為製備·ρ18ρ181及npl8pl83之圖示。 第 9 _為製備·ρ18ρ181Μ164Α， ·ρ18ρ181Μ174Α， PCKM174A及 PCKM164A之園示。 第10圖為製備PCKS166A之圈示。 第11圖為裂備PCKM164L及PCKM164G之圖示。 第12圔為構築apl9pfu62之圖示》 第 13圓為製備RF DNA(japl9pfu62M465A,apl9pfu62M506A 及·ρ19ρίιιβ2Μ750Α>及表現載磨（PCKM465A, pCKM506A及 PCKM750A)之圖示 β 第 14圖為製備 Ρ269Ι358Κ, P269I358S& P269I358L之 -14- (請先聞讀背面之注意事窝本頁) 裝. 、可* 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210Χ 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（〇 ) _示》 第15圖為製備PCCE 3 58R及PCCE 3 58 T之圖示〇 第16圈為製備ρl64L269Y，pl64L269F及pl64L269Y305S 之圏不。 第17圔為製備P164L174A及Ρ164Α174Α之圖示。 第 18圈為製備 Ρ164Α269Υ, P164L174A269Y， P164L174A269F, P164A174A269Y305S之圖型。 第19圖為製備P164L174A269Y305S750A之園示。 第20圖為製備pCKA49l>2園示》 第21圖為製備P49L164L174A26 9Y個之圖示。 第22圖顯示突變CC酵基轉移_ M164A之核苷酸及胺基 酸序列β 第23圖顯示突變CC醯基轉移腾S166A之核甘酸及胺基 酸序列。 第24圖顦示突變CC酵基轉移_»12691/£3581[之核甘酸 及胺基酸序列β 第25醒顯示突變CC酵基轉移酶M164L/ Μ174Α/ Μ289Υ 之核甘酸及胺基酸序列。 第26_顯示突變CC醯基轉移_&49 1之核甘酸及胺基酸 序列β 在下列實例中，某些霣體，_, Τ4 DNA黏合醻，及其 他物質傈得自商業來源且依廠商之指示使用❶尤其，於 實例中用作起始物R之質體PCCK176-2及質鼸pTQiPAA 1^口分別以轉殖腥£.(：〇11]!1109(?(；(：11176-2)?£11»(8?- 3 0 4 7 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X 297公釐)
-.......................裝................訂................線 - Ί , (請先閱讀背面之注意事本頁) (C Α7 Β7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明O4·) 及轉殖鼸 E.coli HB101-16(pTQiPAAtrp)FERM BP-1870 已寄存於國際寄存機構，National· Institute of Bioscience and Hu«an-Technology,Agency of Industrial Science and Technology in Japan,且可 基於USP 5,192,678及歐洲専利申請公告No.302456容易 取得。其他霣龌等可依説明書之描述自該PCCH176-2， pTQiPAAtrp及可購得者而容易製得^ DNA之遘殖，宿主 細胞之轉殖，轉殖龌之培養，自經培養之液中作新cc® 基轉移_之回收，及類似者之操作係此技藹中所為人熟 知的或可自文獻中採用。 下列之實例僳用於說明本發明且本發明不限於此。 實例1(寡去氣核甘之合成） DNA寡聚物S0-M164A〔如第1(a)豳所列〕以381A DNA 合成儀（Applied Biosyste«s Inc.)合成。DNA以 28% 水 性II自CPG聚合物支持物（CPG:控制孔玻璃）薄出接替在 6 0 "C加熱9小時以移去所有保護基《反應混合物在輿空 下揮發，並将殘留物溶解於2 0 0 a1之TE缓衝液〔1〇1»10'1：:13-HCl(pH 7.4>，1·Μ EDTA〕β所得之粗DNA溶液注入反相 HPLC 〔柱:COSMOSIL C18 4·6ι·Χ Tesque),溶析液：A: 0.1M三乙基銨乙酸鹽溶液（PH7.2 -7.4), B··乙腈，梯度，起始 A(100%),終止 A(60%> + B(40%), 25分鏟内直線梯度，流速1.2·1/·ίη]。含 目檩DNA寡聚物之溶析液加以收集並於爽空中揮發•純 化之DNA溶解於200#1之ΤΕ溶液且在使用前貯存於- 20°Ce -16- (請先《讀背面之注意事
裝…… :k本頁) *^
C 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（》〇 所有其他列於第1園之DN A寡聚物以類似上述之方式 合成並純化》實例2 (在trp啓動子之控制下之天然CC醯 基轉移_Ν17β之表現載體之製備） (l)pCC002A,天然CCS基轉移_ Ν176之抗氨苄青徽素表 現載體，之構築： (i)pCCOOlA之構築：霣體 PCCN176-3〔從質體 PCCN176-2 (其可以習知之方式得自轉殖體大腸桿®JM109(pCCN176 -2)FERM BP- 3 0 4 7 )製備此質臞之方法掲露於JOURNAL OF F E R Μ E N T A T I 0 N A M D B I 0 E N G I N E E R I fi G V ο 1 . 7 2，1 9 9 1 之第 2 3 5頁](1.0 >«g)以EcoRI及Hindi I I切割，且将帶有整健 CC醯基轉移酶N176之编應匾之2.9kb片段藉璜脂凝騣霣 泳分離。另一方面，pTQiPAAtrp (Ι.Ο/ug),其為突 變t-PA〔其可以習知方式得自一轉殖體，大腸桿_HB 101-6(pTQiPAAtrp )FERM ΒΡ·1 870，且其製備方法掲 示於歐洲專利申請公報No.302456〕之表現載體，以X*al 及乂11〇1切割，並將一較大0“（5113&?)分離。合成01^寡 聚物 CT-1(5^ CCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA), CT-2 (5，- * AGCTTCACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCTAGGTAGTTGGTAACCTTGGTGTACACAC), TR-1(5，- AGCTTGTCCTCGAGATCAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTTG}及 TR-2 (5，- TCGACAAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGATCTCGAGGACA) -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X 297公釐）
.................……裝................訂................線 (請先閲讀背面之注意事本頁) 一 C 五、發明説明（π) 以Τ4聚核甘酸激酶磷酸化並以T4 DNA黏合酶黏合而得
/ S a 11 D il A K 段（11 4 b p ) ·所得 D N A 片段黏合至 J[鼸 a I / X h ο I DHA而得 pTQiPAdtrp。pTQiPAdtrp(1.0ju g>以 EcoRI及 Hind
m切割。將所得之帶trp啓動子之4.3kb DNA，部份之t-PA 纒碼區（Cys92至Trp 113)及fd噬@fl|中間終止子之重複 序列分離· 2.9kb及4.3kb DNAM段相混合並於T4 DNA黏 合酶（300單位，寶酒迪（股））存在下在ΙβΧ!於由50·Μ T r i s · H C 1 , 1 0 M H g C 1 2 , 1 〇 膽 Μ 二硫蘇糖酵及 / 1 M A Τ Ρ 组成之黏合級衡液反應5小時以黏合。將黏合混合物用 於轉殖大腸桿菌JM 109»所欲質讎，命名為PCC001A, 可得自其中一糰抗餌苄靑徽索之轉殖且以限制嫌鑛別0 (ii)pCC002A之構築：質龌PCC001A在trp啓動子和醯基 轉殖_基因間包含一部份之t-PA(Cys92至Trpll3>基因 。為了 除去此 B,將 pCC001A(1.0//g> 以 Clal 及 Mlul 消 化並将所得6.1kb DNAM段分離· B —方面，PCCN17(J-3 (1只g)以Mlul及Sau3AI消化以分雄编覉醯基轉移酶之Asp 7至Arg71之199bp DNA。合成的DNA寡聚物0 0 2 a及0 0 2b (分別0.5111〇16,見如下表1)於10；«1之缓衝液（檄化雄衢
Wi ： SO^MTris· BC1,lOiMMgCl2 ,10·Μ DTX, 1·0·Μ ATP) ♦ 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事本頁) 中37*C下1小畤以T4聚核苜酸激_(1.5單位，Takara Shuzo >磷酸化並将反謳涯合物加熱至55Ό 20分鐘以将醻去活 化，將所得混合物合併以與189bp之Sau 3AI/M1UI DUA 在Τ4»合》存下在15°C 3小時於20>ul之黏合纽衡掖 中黏合。於所得之黏合混合物中，加入(J.lkb之Clal/ -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 五、發明説明（*7) Μ 1 ul DN A片段並将混合物於額外的T4 DMA黏合酶（ 3 0 0單 位）存在下在4°C培養16小時。將所得黏合混合物用於轉 殖大腸捍睹JM109。自其中之一轉殖饑中分離做為CC醯 基轉移酶N176之表現載體之所欲質體PCC002A並藉限制 圏譜來鐽別》 表1: CC睡基轉移酶N176之N端之卡匣突變用之合成的 DNA寡聚物 每端之 限制位點 合成DN A寡聚物之序列 上股：5 | 3 ’ 下股：3 ’ 5 ' 名稱/長度 EcoRI/MluI AATTCGGATCCAAGCTTA 007a/18 GCCTAGGTTCGAATGCGC 007b/18 fMetThrMetAlaAlaAsnThr ClaI/Sau3AI CGATAAAATGACTATGGCGGCCAACACC 002a/28 TATTTTACTGATACCGCCGGTTGTGGCTAG 002b/30 fMetThrMetAlaAlaAsnThr Clal/BamHI CGATAAAATGACTATGGCAGCTAATACG 013a/28 TATTTTACTGATACCGTCGATTATGCCTAG 013b/30 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (2)CC醯基轉移梅N176之抗卡那徽索之表現載體PCK002 之構蔡質覼PCC002A以Dral (東洋妨請股汾有限^司）切割。所得混会物 以酚處理以除去_並以酒精沈澱。將回收之DNA懸浮於 20# 1之黏合缠衝液中並與磷酸化之EcoRI連接子（2# g -1 9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210 X 297公釐) A7 B7 五、發明説明（*Ο ,Pharmacia)混合，接簪以T4DNA黏合_ ( 3 0 0單位）在 4°C培養1β小時《反應混合物以酚萃取並以酒精沈澱。 囲收之DN Α以Eco RI消化並藉瓊脂凝謬電泳將缺少抗《(苄 靑ft素基因之所得5.6 kb DN A分離。另一方面，将質黼 ?在097〔其可得自轉殖體大腸桿醣*1)1109(?4 097>?£1{(18? - 377 2〕（l>ug>以EcoRI切拥，並將所得之1.2kb抗卡那 徽素基因之DNA分_e 1.2kb EcoRI DNA以T4 DNA黏合酶 (30 0單位）於50a 1之»合缓衡液在1β°〇下2小時》合至 5.6kb EcoRI DNA»黏合混合物用於轉殖大臈桿菌JM109 以得到帶有做為抗生素樣記之抗卡那微素基因之所欲霣 驩 PCK002。 例3 (CC醸基轉移89N17 6之髙表現載KPCK013之清築} ♦· (1) PCC013A之構築 (i)pCC 0 0 7 A之構築：資濉PCC001A以EcoRI及Mlul切割並 將所得6.4kb DNAH段藉瓊脂凝膠霣泳分離。回牧之DHA 以Τ4 DNAft合_(300單位 >在16*0下5小時黏合至合成 的DNA寡聚物〇〇7a及0 07 b(分別0.5#g,表U,其分別於 黏合反應前磷酸化》所得混合物用於轉殖大颺桿_JM 109以得到所欲質讎PCC0D7A· (iUpCCNt013 之構築：質讎 pCC 0 0 7 A(1.0yu g)以 Clal 及 BaaHI消化，並將所得e.lkb DNA藉5%聚丙烯醯胺凝黷 霣泳分離· DNA以T4 DNA黏合酶（3QQ睪位）黏合至合成的 寡聚物013 a及013b(分別0.5/1 g,毎一籲均磷酸化，表1】 β黏合涯合物用於轉殖大臈捍篇JM109並將所欲之質讎 -20- 本紙張尺度適用中8國家標準(CNS)A4规格(210X 297公爱) 請 先 閲 讀 背 ίι 之 注 意 事 書 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（·〇 PCC»t013自抗《苄青徽素之轉殖臞中分雄。 (iii)pCC013A 之構築：質 flftpCCNt013 以 BaaHI 及 Mlul 切 剌並将所得6.1kb DNA分離e S —方面，pCC002A(1.0#g) 以Mlul及Sau3AI切拥而得189bp DNAM段。所得DNA以 T4 NDA 鼬合醐（300 單位）黏合至 6.1kb BaiHI/MluI DNA Μ段並将黏合混合物用於轉殖大腸桿醣JM 109·自其中 一镰抗氨苄青徽素之轉殖讎中，分離具有富含AT之N埔 DN A序列（编瑪與天然CC醣基轉移醻N17 6相同之胺基酸序 列）之所欲質鑤PCC013A。 (2)天然CC醯基轉移酶（Π76之抗卡那徽素表現載釀PCK013 之構築： (i)pAN176 之構築：質 ®pCK002(1.0#g)以 Aatn (東洋 纺4 (股）>切割並將所得DHA以T4 DHA黏合胸（15〇單位） 處理以自身黏合。黏合混合物用於轉殖大鶼桿鷓JM109 以得到箝有單一 At all限制核酸内切酶位酤之所欲質讎 p A N 1 7 β。（ i i ) PC K0 1 3之構築：質髓 ΡΛ N 1 7 Μ 1 · 〇 # g > 以 冉食811消化並将直線化〇“以细»_(去覉酸_(1單位， 簀酒迪（股））於1〇〇·Μ Tris· HCl(pH 8.0)纽衡掖中42*C 下處理1小時。将去磷酸.化之DNA分離並以T4 DHAtt合 _鲇合至來自PCC013A之2.5kb Aatll DNA·黏合混合物 用於轉殖大腸桿》JH 109以得到薄有做為標記之抗卡那 徽素基因之所欲霣釀PC013·例4(以Kunkel方法之钃覉 CC醯基轉移WM176之DNA位黏突變） (1>编礪CC醯基轉移_11176之DNA之次遘殖至M13睡鱔_ : (請先Η讀背面之注意.we#寫 -本頁) 裝. 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7_ 五、發明説明（>。） (i)apl8pl81之製備：質體PCC013A(箝有抗氨苄育徽素 標記之天然CC醯基轉移_((176之表現戴儀且此霣臞掲示 於歃洲専利申_公報1<〇.558,241,?,8>以帥&1及8181消化。 將纊爾CC酸基轉移_1<176之Met1至Pro267之84 2bp DNA 分離，DNA在T4 DNA黏合酶存在下黏合至以S*al消化之 7250bp Μ13·ρ18且黏合混合物用於轉殖大腸桿蘭JM109 。自其中一俪«斑中，将所欲的RF DNA ·ρ18ρ181,其 中酸基轉移酶DN Α之部份已以輿Ml 3之正ori反方向插入 ，分雄並藉限制画譜繡別·製備RF DNA ·ρ18ρ181來瀠 之噬鼸鼸溶液並在使用前貯存於4Ό。 RF DHA«pl8pl8 3以類似上述方式»備來自PCC013A 之编《CCS 基轉移 _Ν176 之 Het1 至 Ala414 之 1162 bp HpaI/Eco47mDNA 及以 HincII切割之 7250bp Μ13·ρ18· (iU 單股 U-ipl8pl81-SS 之製備（參考文獻 IUnkel,T.A. 等氏 Methods Enzyil.154,367):將大腸桿 S3(C236( d u t - , u n g — ，F · ) ( B i ο - R a d L a b .)之單一遘殖株在 3 7 °C 培養於2·1之含有氯徽索（30#g/«l)之2XTY培養掖1β小 時〇将细胞換到新鮮含有30>ug/al氯徽素之2ΧΤΥ培養 掖（50·1)並持鑛在37*0培·餐。當在60 On·之吸收到逢0 . 3 ，将1P18P181之曬菌讎溶液加入培餐中β培養持鑛額外 5小時·在17,000><苢4-C下離心15分鐘後，將上淸掖再 離心一次•所得上淸液（30·1)以 RHase(150/i g/al,Sig^a) 在室瀛下處理30分鏞，接著加入7.5al之PE6溶液（3.5M NH 4 OAc於20%聚乙烯甘油醒8,000>。在離心（17.000X g -2 2- (請先閲讀背面之注意事寫 本頁) 裝 訂· 線 本紙張尺度適用中國圉家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A 7 B7 _*__五、發明説明（) ，15分鐘，4eC)後，殘餘物懸浮於2 0 0 #1之由3 0 0 ·»»N a C 1 , 1 0 0 u Μ T r i s · H C 1 ( p Η 8 . 0 )及 〇 . 1 η Μ E D T A 組成之 缓衝液中。所得溶液先後以200// 1之酚及200# 1之粉/ CHC13 (1: 1)萃取並以CHC13 (200#1)洗二次。於溶液 中，加入7.5M NH4〇Ac(100；ul)及乙酵（600/<1)以沈激 噬薗醱DNAe DNA藉離心收集，以700#1之冰冷乙潜 洗並於真空中乾燥。純化之單股u-dna(u-bp18p181_ss) 懸浮於20〆之TE缓衝液並在使用前貯存於4°Ce其他Kunkel突變方法之單股U-DNA以類似上述方式製 備。 (2〉用於突變CC醛基轉移酶M164A之mpl8pl81M164A之製 備： 寡去氣核糖核酸S0-M164A(0.2nmol)以T4 DNA激SS (10 單位）培養於15#1之由1.3nM ATP， lflmM二硫蘇糖酵 (DTT), 50bM Tris· HC1, 6.6bM 於 5% 聚乙嫌甘油醇（PEG) 所組成之缓衝液中37 °C 60分鐘。磷酸化之引子（1.5# 1，2 0 p m ο 1 與 b p 1 8 p 1 8 1 之 S S - U - D N A (1 # 1 , 〇 . 1 P 〇 1 )混合 於 20>ul之由 1〇·Μ Tris· HCl(pH8.0), 6ι«Μ 及 40 祖 M NaCl 組成之缓衝液》混合物加熱至75 5分鐘，接著在40分 鏞時間冷卻至室溫，然後將混合物至於❶於混合毪 中•加入T4 DNA聚合酶（15單位），T4 DNA黏合酶（600 單位），100BM 二硫 S 耱酵（DTT，6#1>，1〇ΐΜΑΤΡ(2//1) (dATP 及5nM ΟΤΡΛ, dCTP，dGTP及dTTP，2#l)e所得混合物先後 培餐於室溫5分鐘及37 °C 1.5小時、反應混合物的一部 -23- (請先閲讀背面之注意事«本頁) •，裝 訂 -¼ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) 經濟部中央揉準赁工消费合作社4装 A7 B7_五、發明説明（a ) 份（1·0；« 1)加入依 Sigesada之方法（Sigesada，K.(1983) SAIB0-K0U6AKU(日文）2,616-626〕製得之大腸桿鯆JM 109之勝任細胞（C01petent cell)(100>u 1),且細胞在滬 冰上培餐30分鐘。於轉殖之細胞中加入培餐於L培養液 (A600: 0·8, 200>u 1>之大腸桿菌JM109,且細胞之混合 物加入3；u 1之在55 *C預热之Η上層瓊脂（1%菌胰蛋白諫 ,0.8%以(；1,0.8无瓊脂）。混合物塗佈於8板（1%囍胰 蛋白朦，0.896 1^(；1，1.5%瓊脂）且板在37°0培養16小時 。自板之菌斑中，分離所欲之RF DNAUP18P181M164A) 並藉以BaiHI切剌來鑑別β (3>内於突變CC醏基轉移酶Μ164Α之PCKM164A之製備： ?18卩181»1164八以》11111及88181消化，且 5 8 2 5?0(^>1段 藉瓊脂凝驥霣泳分離》並且，PCK013(帶有抗卡那育徽 素標記之天然CC醯基轉移明N176之表現載鼸，且此質艚 之製備掲示於歐洲專利申餹公報No. 558,24 1 , p.8>以 Mlul及BstBI切割且分離較大之DNA片段。所得DNA(0.03 Ρ·〇1>在室《下5小時以T4 DNAftf合酶（300單位}於1(Μ 1 黏合緩衡液（66MTris·HCl(pH7.β)，6·6M，10M泠-硫烷乙酵 〇.5·Μ ATP)黏合至 582bp MluI/BstBI DNA(0.15 Ρ·〇1Κ黏合混合物用於ΐί殖大臈桿篇JM109。自其中一 值抗卡那徽素之轉殖讎中，分離出所欲質讎PCKM164A並 限制圓譜嫿別》 轉殖釀命名為大腸捍聞JtU0 9/pCKM164A,其甘油篇 掖以習知之方式製備β -24- (請先閱讀背面之注$_ 項再譽 寫本頁) 订 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央揉準扃工消费合作社印裂 A7 B7 五、發明说明（》) (4)用於突變CC醯基轉移WM174A之·Ρ18Ρ181Μ174Α之» 備： Ρ18Ρ181Μ174Α以類似上述之方式製備自·Ρ18Ρ181之 SS-U-DNA及 DUA寡聚物 S0-M174A。 (5>用於突變CC醯基轉移_ Μ174Α之表現載醱PCKM174A之 製備： 用於突變CC醯基轉移_»1174丨之表現載黼及其轉殖讎 以類似上述之方式裂備並分別PCKM 174 Α命名為大腸桿箱 JM109/ pCKH174A〇 (6)用於突變CC醯基轉移酶S166A之表現載fll PCKS166A之 製備： 用於突變CC醯基轉移酶S166A之apl8pl83S166A以類似 上述之方式製備自·Ρΐ8ρ183及D»A寡聚物S0-S166A<5’-CATCCGCCAAAfiCTT6AACCACACC6CACCCATAAQ). P18P18 3S166A以Mlul及BstBI切割0将較小的DNAH段 分離並輿PCK013以Mlul及BstBI切割之較大DHAH段黏合 而得PCKS166A·大腸桿醣JM109以pCILSieeA_殖而得轉 殖讎大腸捍_JMlQ9/pCKS166A,其甘油期液以習知方 式裂備》 例5(以PCR方法之鑼《CC醒基轉移_Ν17β之BDA之位黏突 變） (U用於突變CCS基轉移_Hie4L之表現載fll PCKH164L之 製備： pCK013(棋板 DNA, 0.5f^ol},DHA寡聚物 SO-MluFor〔 -2 5 _ 本紙張尺度適用中困國家標率（CNS > A4规格（210X297公釐） 14· i*l_i I ammme§ ·1§ —•J· 4H· in -j . (請先H讀背面之注意事項耳f本頁) 訂 -'" ft c A7 _B7__ 五、發明説明（A ) 引子 #1, 125ρ·0ΐ，第 1(b)圈〕及 S0-M164L〔引子 #2, 125 Ρ ο 1 ,第 1 ( b ) _〕舆 T a q D Ν Α 聚合 _ ( K u r a b ο , 1 單位）混合 於 100 # 1之由 10·Μ Tris · HC1 (pH9 . 0)，50·Μ KC1 , Ο . 196 Triton X-100, 2.5·Μ及 0.2·Μ dNTP组成之级衝掖。混 合物以磷物油覆II且PCR(聚合_鍵反應）以如下進行· 初始變性化（9βΌ 0.5分鐮）後，反應進行30鏟擴大循琢 (97°〇1.5分艟，50*〇2.5分艟及72-〇2.5分鐘>,接著 终止延伸（72*C 7分鏟）·反應混合物以酚萃取，以乙酵 沈醱且以 BaiHI及 Mlul切割· 285bp BaaBI/MluI DNA黏 合至PCKM164A之以BaiHI及Mlul切割之較大DNA片段，黏 合混合物用於轉殖大腸桿«JM109*自其中之一鴒抗卡 那徽素之轉殖醱中，分雄所欲質讎PCKM164L且藉限制函 譜鱷別》大腸桿菌JM109以PCKM164L轉殖而得轉殖龌大 腸榫g|JM109/pCKH164L,其甘油儲液以習知方式製備》 (2)用於突變CC醯基轉移醻Μ1β4 6之表現載《PCKM164G之 製備： 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印裝 用於突變CC醯基轉移_)1164 6之DNA片段之突變及攘大 你利用PCK013(楔板DNA)及DNA寡聚物S0-MluF〇r〔引子 #1,第1(b)·〕及S0-M1&46 [第1(b)麵〕以類似於上述 之方式完成》所得285bp BaiHI/MluI DNA黏合至PCIM184A 以Mlul及BaaHI切繭之較大DMAH段而得pCKMie4Ge大腸 捍» JM109以pCKM 164G轉殖而得«殖體大腸榫菌JM10 9/ pCKMie46,其甘油饑液以習知之方式製備。 (3>用於其他M104突變CC醯基轉移_之表現載讎： -2 6 - Ά» · —* · ^ 本紙張尺度適用中國國家橾率（CNS > A4規格（210X297公釐〉 經濟部中央橾率扃工消费合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（/) 用於 M164X突變 CC 睡基轉移_ (X= C,D,E，F,H，I,K，N，P ,〇,11,3,?^,¥或1)之表現載饞及其轉殖餹以類似上述之 方式製備》 例6(用於其他突變CC釀基轉移_之表現載龌之製備） (1) ·ρ19ρίιιβ2之構築： Μ13·Ρ19以Sial(5單位）及Hindm(5單位）切割並将 所得7.2 fcb DN A藉璜脂凝膠霣泳來分離。另一方面， PCK002 (此質體之構築掲示於歃洲專利申請公報No. 558,241，P.7)以 SmI 及 Hindffl 切割並分離 1.6kb DHA。 所得DNA以T4 DNA黏合酶（ 3 0 0單位）20 1之黏合缓衝液 在15eC 2小時黏合至7.2kb Snal/Kindm DNA。黏合潺 合物甩於轉殖大腸桿菌JM109以得所欲之RF DNA ipl9pfu62e «Pl9pfu62之單胶 U-DHA(SS-U-DNA)以類似 於例2 (1) (ii)所述之方式製備。 (2) 用於突變CC醯基轉移_ H465A之apl9pfu62M465A之裂 備： 伊19?111(52»14 6 5 4以類似於上述之方式製備自衫190以62 之 SS-U-DNA及 DNA寡聚物 S0-M485A〔第 l(a)_〕· (3>用於突變CC醒基轉移酶M506A之apl9pfue2M506A之裂 備： 臟pl9pfu62M506A以類似於上述之方式製備自》Pl9pfu62 之 SS-U-DNA及寡聚物 SO-M 5 0 9A [第 1U)_〕0 (Ο用於突變CC醯基轉移_ M750A之·ρ19ρίϋ62Μ750Α之裂 備： -27" 〜 本紙張尺度逋用中國國家揉率（CNS > A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再f本頁 訂 A7 B7 五、發明説明（4) 一 C ... (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁 pl9pfu62M750A以前述之方式製備自·ρ19ρίιι62之SS-U-DNA及 DNA寡聚物 SO-M750A〔第 l(a)HM » <5>用於突變CC釀基轉移酶H465A之表現載體ρ(：ΚΜ4β5Α之 裂備： 屋？19?{1182114 65人以？81;1及）1(；〇1消化，且藉瓊脂鑀0霣 泳分離較小之DNAH段（1271bp)e同時，PCK013以PstI 及Ncol切割。分雔較大DHA並以T4 DNA黏合Μ於由50·Μ Tris·HCl,10M，l.QaMDTT及5%PEG6,000所组成之 級衝液中黏合至1271bp Pstl/Ncol DNA。黏合混合物用 於轉殖大腸桿0DH1OB。自其中之一抗卡那徽素之轉殖 艤中，分離所欲霣IHPCKH465A並藉限制圏譜蠭別•大腸 桿g|JM109以PCKM465A轉殖而得轉殖臞大勝桿iIJMlOS/ PCKM465A,其甘油餘液以習知方式製備。 (6) 用於突變CC醒基轉移酶M506A之表現《體PCKH506A之 製備： I % ν,ν 經濟部中央揉準局負工消費合作社印裝 pCKM5〇eA以類似上述之方式構築自PCK013及 臟pl9pfu62M506A。大腸桿篇JM109以PCKM506A轉殖而得 轉殖讎大腰桿篇JM109/PCKM506A,其甘油儲液以習知之 方式製備〇 (7) 用於突« CC醒基轉移_ M750A之表現載羅PCO750A 之裂備： PCKM7 50A以類似上述之方式構築自PCK013及 pl9pfu62M750Ae 大腸桿篇 JM109 以 PCKM750A 轉殖而得 轉殖讎大腸桿麴JM109/PCKM750A,其甘油鐮液以習知 -28-本纸張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格< 210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（>7) 之方式裂備。 例7(用於E35 8突變CC醯基轉移Μ之表現載體之製備） 請先閲讀背面之注^^項再^^本頁 (U用於Μ269Ι/Ε358突變CC醯基轉移酶之表現載«之製 備 (i) 用於突變CC醣基轉移酶Μ269Ι/Ε358Κ之表現載《 P269I358K之製備PCK0 13以Hpal及Mlul切割之較大DNAH 段（0.5faol), DNA聚合物 S0-E358K[5，-TAACCGGGCCATG GCGCGTCTTGACTATATCGAACT，125pnol,列於第 1(b) (ii)_ ]SS0-BstF〇r[5'-ATCGC6TCTTCGAAATACCGG6CATC,125 PBol,列於第 l(b)(ii)B ]舆了&9 DNA 聚合酶（TaliaRa，l單 位）混合於 l〇〇#l之由 10·Μ Tris.HCl<pH8.3)，50·Μ KC1, 0.1%明醪，1.5βΜ及0.2·Μ dNTP組成之缓衝液· 混合物以礦物油覆番並接受初始變性化（96 °C 0.5分鏟）
,25锢擴大循琛（97·(3 1.5分鐮，50Ό 2.5分鐘及72°C 經濟部中央榣準局貝工消费合作社印袋 2.5分艟），及終止延伸<72^0 7分鐘）。反應混合物以酚 萃取，以乙酵沈澱，以Ncol及BstBI切割。所得DNA (290bp)黏合至PCKG13以Ncol及BstBI切割之較大DNA片 段。黏合混合物用於轉殖大腸桿® DH10B(麻自Gibco-BRL),自其中之一抗卡那•徽素之轉殖《中，分離分欲 霣讎P26 9 I 358K且藉限制顯嫌鍾別》大腸桿菌JM10 9以 P269I358K轉殖而得轉殖《I大颺桿窗JM10 9/ P269I 358K,其甘油鏞液以習知方式製備·
(ii) 分別用於突變CC醸基轉移鼸M269I/E358S及H269I -29-本紙張尺度適用中國S家揉率（CNS ) A4规格（210X297公釐） A7 B7___ 五、發明説明（J) /E 358 L 之表現載《P269I358S 及 P269I358L 之製備： M269I/ E358S(或M269I/ E358L>之表現載β以類似上 述之方式製備自PCK013及DNA寡聚物SO-BstFor及S0-E358S〔或 S0-E358L,列於第 l(b)(ii)鼷〕。大腸桿® 109以P269I358S(或P269I358L)轉殖而得轉殖驩大腸捍® JM109/P269I358S(或大腸桿菌 JM109/P269I358L)，其 甘油貯液以習知方式製備· (2)用於其他E358突變CC醯基轉移酶之表現載鼸之製備 (U用於突變CC醯基轉移_£35811之表現載釀PCCE358R之 製備： 用於突變CC醯基轉移酶E358R之·ρ18ρ183Ε358Κ以類似 述於例2之方式製備自·ρ18ρ183及DNA寡聚物S0-E35 8R (第 l(b>(ii>圏·ρ18ρ183Ε3581ί以 Mlul及 Ncol切剌之 較小DNA黏合至PCC013A以Mlul及Ncol切割之較大DHA而 得PCCE358R。大腸桿菌JM109以PCCE358R轉殖而得轉殖 腥大腰桿發JM109/PCCE358R，其甘油篇液以習知之方 式製備》 (ii)用於突變CCIB基轉移酶E358T之表現載«PCCE358T 之裂備： 用於突變CCgl基轉移_ E3 58T之IP18P183K3 58T以類似 述於例2之方式製備自·ρ18ρ183及DNA寡聚物S0-E358T〔 第 l(b)(ii)_〕 。 ·ρ18ρ183Ε358Τ以 Hlul及 Ncol切割之 較小0^勘合至？(；(；013九以》11|11及1)(：〇1切割之較大0丨灰而 得PCCE358T。大腸挥篇JM10 9以PCCE358T轉殖而得轉殖 -30- 本紙張尺度適用中國國家揉率（CNS )八4规格（210X297公釐〉 锖先閱讀背面之注$項再t本f 訂 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印裝 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印装 A7 B7 _ 五、發明説明（巧） 體大腸桿SJM109/PCCE 3 58T,其甘油皤液以習知之方 式裂備。 例8(多突變CC醯基轉移_之製備） (1)H164L或M164A典其他突變CC醯基轉移酶之结合： (i>用於突變CCS基轉移_M164L/M269Y之表現載籲 P1ML2 69Y之製備： PC0164L以Mlul及BstBI切割並分離較小DNA(582bp) β另一方面，PCKM2 69Y(此質讎之構築方法掲示於歟洲 專利申請公報No.558 ,241, Ρ.10)以Mlul及BstBI切割· 所得 D H A ( c a 6 · 2 k b )切割並黏合至 5 8 2 b ρ Μ 1 u I / B s t B I D H A 。黏合混合物用於轉殖大腸捍菌DH 10Be從其中之一抗 卡那徽素之轉殖讎中，切割所欲P164L269Y並藉限制鼷 譜鑑別》大腸桿菌JM109以P164L2 69Y轉殖而得轉殖鼸大 腸桿麴JM109/P164L289Y,其甘油鎊液以習知之方式》 備。 (ii)用於突變CC醯基轉移酶N164L/M269F之表現載體 P164L2 69F之製備： PCKM164L以Mlul及BstBI切割並分離較小DNA(582bp} 。另一方面，PCKM 2 6 9 F(此質黼之構築方法掲示於歟洲 專利申讅公報 Νο·558,241, P.15-16}以 Mlul 及 BstBI 切 拥。較大DHAH段（ca 6.2kb)分離並黏合至582bp Mlul /BstBI DNAe黏合混合物用於轉殖大腸捍SIDH 10Ββ自 其中之一抗卡那徽素之轉殖讎中，分離所欲P164L 2 6 9 F 並藉限制·譜籲別•大腸榫篇JH 10 9以pi 64 L 269 F轉殖而 -31- 本紙張尺度適用中國國家揉率（CNS > A4规格（210X297公釐〉 (請先Μ讀背面之注意事項再•本頁) 訂 Λ 經濟部中央樣率局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W ) 得轉殖釀大腸桿窗JM109/P164L 2 6 9 F,其甘油鍺液以習 知之方式製備。
(iiU用於突變CC醯基轉移酶M164L/M 2 69Y/C305S之表 現載《I P164L289Y305S之製備： P164L269Y305S以類似上述方式製備自PCKM164L及 P269Y305S(此質體之構築方法掲示歐洲專利申請公報No. 558,241，ρ.10)β大腸捍麴以P164L269Y305S轉殖而得轉 殖鐮大腸捍@ JM109/P164L269Y305S,其甘油鏟液以習 知之方式製備》 (iv)用於突變CC醯基轉移_^1641/»4174灰之表現載讎 P164L174A之製備： 來自 PCKM164L之 Hpal/Ncol DNA(U22bp〉（棋板 DNA, 0.5fiol)· DNA寡聚 ftSO-MluFor 〔引子 #1, 125ρ·ο1, 第 l(b)(i)_ 〕及 S0-M172A2(5'-GACC66CAGCGCTA6CGCCC 6CCA6A6CTT6A,引子 #2, 125ρ·〇1)輿 Taq DNA聚合鵑（
TaKaRa· 1犟位）混合於100私1之由10麗M Tris· HC1( PH8.3)，50·Μ KC1, 0.1% 明醪，及 2·0·Μ dNTP组 成之緬衡掖中》混合物以籲物油覆M並接受初始變性化 (96Ό 0· 5分鐘），25« 擴大循琛（37Ό 1 .5分鐘，50·Ό , 2· 5分鏡及72·〇 2.5分鐘）及終止延伸（72*0 7分鐘>*所 得混合物以酚萃取，以乙酵沈澱，且以Mlul及Hhel消化 •所得DHA期合至PCKM174A以Mini及Nhel消化之較大DHA Η段而得所欲霣ΑΙρ1β41·174Αβ大鼸捍SIJM109以 -32- 本紙張尺度逋用中國國家橾率（CNS > A4规格（210X297公釐） I (請先Μ讀背面之注$項再填寫本頁) 訂 經濟部中夬揉率扃貝工消費合作社印笨 A7 B7_ 五、發明説明（w ) P164L174A轉殖而得轉殖臞大腸捍0JM1O9/P164L174A ,其甘油《液以習知之方式製備。 (V)用於突變CC釀基轉移_»11644/1(174 4之表現載臞 P164A174A之製備： P164A174A以類似上述之方式製備自PCKM164A(棋板DNA) ,SO-MluFor 〔引子 #1,第 l(b>(i>·〕 ， S0-M174A 〔引 子》2，第 l(a)_〕及 PCKM174A(載 »DNA)·大腸捍醣 JM 10 9以？1644174 4轉殖而得轉殖釀大腸桿菌』>1109/ P164A174A,其甘油皤液以習知方式製備。 (Vi)用於突變CC醯基轉移酶Μ1β4Α/Μ269Υ之表現載龌 Ρ164Α2 6 9Υ之製備： PCKH164A以Mlul及BstBI切割並分離較小DNA(582bp> 。另一方面，PCKM269Y以Mlul及BstBI切割。所得較大 DNAH段«合至582bp MluI/BstBI DNA並將黏合混合物 用於轉殖大膳桿®DHl()Be自其中之一抗卡那徽索之轉 形體中，分離所欲霣體P164A269Y並藉限制圈譜篇別· 大腸桿篇JM10 9以P164A269Y轉殖而得轉殖體大腸桿鏑JM 109/P164A269Y,其甘油皤液以習知之方式裂備。 (vii> 用於突變 CC 醒基轉移 _M164L/M174A/M269Y, M164L/M174A/M269F及 M164A/M174A/M2e9Y/C305S之表 現載臞之裂備：
P164L174A以Mlul及BstBI切割之較小DHA»合至 ρΜΜ269Υ(或 PCKH269F 或 P269Y305S)以 Mlul 及 BstBI 切割 之钕大 DNA 而得所欲霣《P164L174A269Y(或 P164L174A269F -33- 本纸張尺度適用中國國家梯率（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注$項再填寫本頁 訂 A7 _B7_ 五、發明説明（) 或 P164A174A269Y305S)。大腸桿 g JM109以 P164L174A269Y( 或 P164L174A269F或 P164A174A269Y305S)而得轉殖臞大 腸桿餘 JM109/P164L174A269Y(或大腸捍 gg JM109/ P164L174A269F或大腰桿篇 JM109/ P164A174A269Y305S) ，其甘油餹掖以習知之方式製備β (viii)用於突變CC醯基轉移酶M184L/ Μ174Α/ Μ2β9Υ/ C305S/M750A之表現載 fl|pl64L174A269Y305S750A之裂 備： PC 07 5 0 A以Pst I及N col切拥β較小DN A分離並》合至 P164L174A269Y305S以 PstI及 Hcol切割之較大 DNA而得 所欲質體。大腰桿菌JM109以P164L174A269Y305S750A轉 殖而得轉殖讎大腸桿菌JM109/P164L174A269Y305S750A ，其甘油健液以習知之方式製備。 (2)A49L與其他突變醏基轉移酶之結合： (i) 用於突變CC醯基轉移鵑A49L之IP18P181A49L之裂備： P18P181A49L以類似述於例2之方式裂備自·ί»18ρ181 之 SS-U-DNA及 DNA寡聚物 S0-A49L。 經濟部中夬樣準局貝工消费合作社印製 (請先«讀背面之注意事項再本霣) (ii) 用於突變CC醯基轉移_ A49L之表現載釀PCKA49L之 製備： P18P181A49L 以 Clal及 Mlul切拥並分離 218bp DNA,另 一方面，PCC013A以Clal及Mlul切割。所得較大DMA分離 並黏合至2 18 b p C 1 a I / Μ 1 u I D N A。贴合翯合杨用於轉殖 大臞榫®JM109e自其中之一抗《苄镇徽素之轉«艚中， 分_用於突變CC醯基轉移酶A49L之表現載讎·命名為 _ 3 4 _ 本紙張尺度逍用中國國家#率（CNS〉A4規格（η〇Χ297公釐） A7 B7 五、發明説明（》) PCCA49L並藉限制園譜鍾別》來自PCCA49L之250bp Hpal / Mlul DHAH段黏合至PCK013以Hpal及Mlul切拥之較大 DNA片段而得PCKA49L。 (iii)天然CC醯基轉移_輿突變CC醸基轉移_4491<之表 現之比較： 將大腸桿 S JM109/ PCKA49L(或 JM109/ PCK013)之甘 油餘液（1·1),其已以習知方式«以質《PCKA49L(或 PCK013)轉殖大腸桿菌JM10 9裂得，移人1〇〇·1之含50# g /雇1卡那徽素之L培餐液，並將混合物培餐於30-C 8小 時。培餐掖（3.75·1)加入25·1之含25# g/«l卡那徽素 之N-3培餐液（成份：5%醬油，1%甘油，1.2596 Κ2ΗΡ04 ,0.38% KH2P〇4, 50/ug/il 硫胺素.BC1，2 羅Μ NgSO 4 · 7H 2 〇 4 , 0.2·Μ CaC1 2 · 2H 2 〇，〇·〇 5·Μ FeS(U · 7B2 0),並将混合物在22.5*0下培餐16小時， 將3-吲呤丙烯酸（ΙΑΑ>加入培餐液至终濃度20/1 g/«l且 箱餐持鑛額外56小時*细胞藉在4Ό 14,000rp·離心15 分艟而收獲，戀浮於40·1之ΤΕ緩衝液（ΡΗ8·0>並藉聲波 振衋溶液·溶胞掖在4»C 14 , 000γρ·離心20分鏞而得上 淸液（命名為”》"部份《餘物再戀浮於40·1之含1〇〇·Μ Tris· HCl(pH8.0), 1·Μ EDTA及8Μ尿索之緩街液並藉轚 波振鼸溶胞》離心除去不溶物質後，收集上淸掖（命名 為"PPt"部份）。将突變CC醒基轉移酶A49L及天然CCB基 轉移_ N176之"湯"及"PPtK部份以15% SDS-PA6E分析。 细胞不溶前趙蛋白質因自天然CC醯基轉移»突變至突變 -35- _ 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 請 先 閲 面 之 注- 意 事 項 再： 訂 經濟部中央揉準局負工消费合作社印策 五、發明説明 CC醯基轉移酶A49L而大量減少。此結果與於"湯"中成熟 醯基轉移酶（天然CC醛基轉移酶或突變CC醯基轉移酶A49L >之量以反相 HPLC(如下表）分析結果一致。 A49L (單位/ Bl培養液） 天然（單位/ Bl培養液） 7 2.6 35.6 (iv>用於突變 CC醯基轉移酶 A49L / M164L/ M174A/ H269Y 之表現載體之製備： 來自 P164L174A269Y之 772bp Mlul/Ncol DNA黏合至
PCKA49L以Mlul及Ncol分割之較大DNA而得所欲質醱P49L 164L174A269Y。大腸择菌 JM109以 P49L164L174A269Y轉 殖而得轉殖驩大腸桿菌JM109/P49L164L174A269Y,其 甘油餘液以習知之方式製備。 例9(突變CC匿基轉移酶之表現與純化） (1)突變CC醯基轉移酶M164A之表現： 大腸桿_JM109/pCKM164A之甘油儲液（0.5·1)加入含 5 0yug/el卡那徽素之50β1之L培餐液中並将混合物在 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意炎填窝本頁) 30 *C培養8小時，培養液（3.75·1)移至25 ml之含1.0% 甘油及12.5# g/«l卡那徽素之N-3培餐液（5.0%醬油 (Osaka Shokuhinn Kagaku), 0.608X NaiHPOi, 0.7X ΚΗχΡ0«, 0.7X K,HP0«, 0.12* (NH4)*S〇4, 0.02X NH4CI, 0.0011X FeS0« ·7Η«0, 0.0011X CaCla*2HaO, 0.000276X NnS〇4· nHi〇, 0.000276X AlCls*6 H*0, 0.00011X C〇Clt.6HiO, 0.0000552X ZnS0«»7H*0, 0.0000552X ΝβΜο〇4·2ΗιΟ, 0.0000276X CuS〇4*7H*0, 0.0000138X HsB0«, 50 ^g/ml -3 6 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 經濟部中央標準局貝工消费合作获印製 A7 B7_ __五、發明説明Ο) vitanin Bl，〇.〇48!l； MgS〇4 > 混合物在 20-22 eC 培餐 88 小 時且在開始培餐後1 6小時加入泠-吲呤丙烯酸（终濃度2 0 g/nl)及16和24小時加入甘油（终濃度1.0% )。細胞 以離心（8,000rp·在4XM0分鐘 >，懸浮於1〇«1之TE缓衝 液（10·Μ Tris· Η(31：ρΗ8·0)，1.〇·Μ EDTA)及以轚波振縵 溶胞。離心（HOOOrpm在4eC 20分鐘）後，上清液（粗溶 胞液）貯於4-C直到使用。 (2) M164A之純化： 粗溶胞液（1.0ml)利用0.45/u m管柱防護（Millipore)過 濾並加人 TSK-gelTM DEAE-5PW(T0S0H,4.6X 50bb)离效 液相層析管柱。溶析以凹面梯度自80%之A缓衝液〔25 bM Tris· HCl(pH8.0)〕+20% 之 B 缓衝液〔0.5»{18(；1-2 5 Μ T r i s · H C 1 ( p Η 8 · 0 >〕至 5 0 % 之 A 缓衡液 + 5 0 % 之 B 缓衢液以30分鐘的時間，1.〇·1/·ίη之流速完成。在 230η·之吸收用於監澜溶出液。将以約0.16Μ liaCl溶析 之最後主峰收集以得突變CC醯基轉移_ M164A之純製備。 (3) 其他突變CC醯基轉移酶之表現： 帶有其他表現載體（如 PCKM164L，pCKM1646，pCKM174A, pCKM465A,pCKM506A,pCKM750A,pl64L/269Y,pl64L/269y /305S,pl64L/174A/269Y/305S,p269I/358K,p269I/358S ,pl64L/269F,pl64L/174A/269F,pCKSI66A,pl64L/174A/ 269Y/305S/750A,pl64A/269Y，pCK49L及 P49L/164L/174A) 之大腸桿菌JM109之培餐及粗溶胞液之製備以類似於上 迷之方式完成。 -37- (請先閲讀背面之注意事Γ填窝本頁) 裝. 、可 " 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210 X 297公釐) 五、發明説明oo (4) 其他突變CC醯基轉移酶之純化 其他突變CC酵基轉移酶（如M1641，M164G，M174A，M465A， M506A, M750A, M164L/M269Y, M164L/M269Y/C305S, M164L/M174A/M269Y/ S305S, M269I/E358K, M269I/E358S, M164L/M269F, M164L/M174A/M269F, S166A, M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A, M164A/269Y,及 A49L/M164L/M174A)自各別之粗溶胞液以類似上述之方 法純化。‘ (5) 突變CC酵基轉移酶之鑑定： 純化之突變CC障基轉移酶如，M164A，M164L,M164G，M174A， M465A, M506A, M750A, M164L/M269Y, M164L/M269Y/C305S, M164L/M174A/M269Y/S305S, M269I/E358K, M269I/E358S, M164L/M269F, M164L/M174A/M269F, S166A, M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A, M164A/269Y,及 A49L/M164L/M174A以 12.5% SDS-PAGE分 析及反相HPLC鑑別。從在硫烷乙酵存在下之SDS-PAGE 分析中，毎傾純化之醯基轉移Μ被確定由二催獨立的次 單元組成，即分別相當於《及泠次單元之25.4KDa及 58.4KDa胜肽，其分子量僳計算自其在凝匾電泳上之移 動。於1^1<(：分析中，每值鈍化之醯基轉移酶分成2播立 胜肽α及次單元，其分•別在約8. 7及5.8分鏞溶析出〔 HPLC條件：管柱：5C4-AR-30 0 , 4 . 6 Χ 50··,溶析液： 自35%至70%含有0.05%三氟乙酸之水性乙脯直線梯度 ，歴10分鏟；偵_ : 214 η·〕》毎鵪突變醯基轉移_之 二德次單元藉反相HPLC条统分離並以473 Α蛋白質定序器 (Applied Biosysteis)藉.胺基蜻定序分析確定其與天然 -3 8 _ 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 請 先 閲 背 面 之 注 意 事 窝 本 頁 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（;7 ) 醯基轉移酶有相同序列。 例10 (DN A序列分析） 用於突變酵基轉移酶如M164A，
M164L, M164G, M174A, M465A, M506A, M750A, M164L/M269Y, M164L/M269Y/C305S, M164L/M174A/M269Y/S305S, M269I/E358K, M269I/E358S, M164L/M269F, M164L/M174A/M269F, S166A, M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A, M164A/269Y,及 A49L/M164L/M174A 之 DNA序列以 373A DNA定序器（Applied Biosystems)決 定並確定舆預期相同。 例1 1 (CC酯基轉移酶活性） 列於表2之每個突變CC醯基轉移酶之在PH8.7之CCS 基轉移酶活性條以與上述相同之方式決定。結果見於表 2〇
.................;.....裝................訂................碌 (請先閲讀背面t注意炎I赛窝本頁) V 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210 X 297公釐) A7 B7 五、發明説明（w ) 表 2 CC醯基轉移酶之相對活性： (*以天然=1 0 0 %計算） 突變醯基轉移酶 CC醯基轉移酶活性 天然（N176) 100* M164L 122 M174A 123 M465A 136 M506A 140 M750A 142 M164L/M269Y 161 M164L/M269Y/C305S 141 M164L/M174A/M269Y/C305S 155 M269I/E358K 153 M269I/E358S 184 M164L/M269F 193 M164L/M174A/M269F 184 S166A · 186 M164L/M174A/M269Y 245 M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A 192 M164A/M269Y 172 A49L/M164L/M174A/M269Y 226 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 .................…：：裝：：： (請先閲讀背面之注意事I填窝本頁) ~i-o~ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) A7 B7 五、發明説明（矽） 例12(GL-7ACA醯基轉移酶活性） 列於表3之每個突變醯基轉移酶在PH7.5之GL-7ACA酵 基轉移酶活性以與上逑相同之方式決定。結果見於表3。 表 3 . GL-7ACA醯基轉移酶之相對活性 (*以天然=1 〇 〇 %計算） ................:……裝................訂.............V4 (請先閲讀背面之注意事寫本頁) -- <. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 突變醯基轉移酶 GL-7ACA醯基轉移酶活性 天然（N 1 7 6 ) 1 0 0 * Μ 1 64 A 167 M 164G 162 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210Χ 297公釐)

Claims (1)

  1. 申請專利範Π 89. 4 ί 2 {f 補充1 Α8 Β8 C8 D8 第831 0 97 58號「新穎之頭孢子菌素C醯基轉移酶」專利案 ^ ^ (89年4月12日修正） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ申請專利範圍：----- 1.—種突變頭孢子菌素c醸基轉移酶（cc醯基轉移酶）， 其中至少一個在天然CC醯基轉移酶之胺基酸序列之 Ala49，Met164，Ser166，Met174，Glu3S*，Met4 6 5，Met 5 0 6,或 Met7S<)位置被一不同之胺基酸取代，且以下式表示其被 處理成其α-次單元及/9-次單元前之前趨物之形式： Al-48-Xl-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505-X7-A507-749-X8-A751-773 其中A1-48與天然CC醯基轉移酶之自Thr1至Glu48 之胺基酸序列相同， A50 -163與天然CC醣基轉移酶之自厶805°至Leu163之 胺基酸序列相同， 鍊 A167-1 73與天然CC醯基轉移酶之自Val167至Arg173 之胺基酸序列相同， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A175-357與天然CC醯基轉移酶之自Leu175至Va丨357 之胺基酸序列相同， A359-464與天然CC醯基轉移酶之自Thr3 5 9至Ala464 之胺基酸序列相同， A466-505與天然CC醢基轉移酶之自Pro 4 6 6至I丨esos 之胺基酸序列相同， 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS > A4規格（210X297公釐） 申請專利範Π 89. 4 ί 2 {f 補充1 Α8 Β8 C8 D8 第831 0 97 58號「新穎之頭孢子菌素C醯基轉移酶」專利案 ^ ^ (89年4月12日修正） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) Λ申請專利範圍：----- 1.—種突變頭孢子菌素c醸基轉移酶（cc醯基轉移酶）， 其中至少一個在天然CC醯基轉移酶之胺基酸序列之 Ala49，Met164，Ser166，Met174，Glu3S*，Met4 6 5，Met 5 0 6,或 Met7S<)位置被一不同之胺基酸取代，且以下式表示其被 處理成其α-次單元及/9-次單元前之前趨物之形式： Al-48-Xl-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505-X7-A507-749-X8-A751-773 其中A1-48與天然CC醯基轉移酶之自Thr1至Glu48 之胺基酸序列相同， A50 -163與天然CC醣基轉移酶之自厶805°至Leu163之 胺基酸序列相同， 鍊 A167-1 73與天然CC醯基轉移酶之自Val167至Arg173 之胺基酸序列相同， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A175-357與天然CC醯基轉移酶之自Leu175至Va丨357 之胺基酸序列相同， A359-464與天然CC醯基轉移酶之自Thr3 5 9至Ala464 之胺基酸序列相同， A466-505與天然CC醢基轉移酶之自Pro 4 6 6至I丨esos 之胺基酸序列相同， 本紙張尺度逋用中國國家揉準（CNS > A4規格（210X297公釐） 六、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 A507-749與天然CC醣基轉移酶之自Lysse7至Ala749 之胺基酸序列相同， A751-773與天然CC醯基轉移酶之自Val7S1至Ala773 之胺基酸序列相同， XI爲丙胺酸（AU)或不同之胺基酸， X2，X4,X6，X7及X8分別爲甲硫胺酸（Met)或不同之胺基 酸， X3爲絲胺酸（Ser)或不同之胺基酸，且 XS爲麩胺酸（GU)或不同乏胺基酸， 但條件爲Met269及/或Cys3<)S或被上式中一或多個不 同之胺基酸取代，且當XI爲丙胺酸（Ala)則X2，X4，X6，X7 及X8均爲甲硫胺酸（Met), X3爲絲胺酸（Ser)且X5爲麩 胺酸（Glu)以外之胺基酸。 2. 如申請專利範圍第1項之突變頭孢子菌素C醯基轉移 酶，其中XI爲白胺酸，X3爲丙胺酸且Met2 69被酪胺 酸取代。 3. —種DNA，其編碼如申請專利範圍第1項之頭孢子菌 素C醯基轉移酶。 (請先閱讀背面之注^.項再填寫本頁) 訂』. 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製
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