JPH09507232A - ２，４−ジスルホフェニルブチルニトロン、その塩および薬学的スピントラップ剤としてのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式Ｉの2,4-ジスルホ-α-フェニル-tert-ブチルニトロンおよびその薬学的に受容可能な塩が開示される。これらの物質は、脳卒中において起こるような急性中枢神経系酸化にかかっている患者に、または進行性中枢神経系機能喪失として現われ得る段階的中枢神経系酸化にかかっている患者の、経口または非経口（例えば、静脈内）投与に対して薬剤として有用である。これらの物質はまた、酸化的損傷を引き起こす疾患の治療の副作用を改善するためにも用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 2,4-ジスルホフェニルブチルニトロン、その塩 および薬学的スピントラップ剤としてのそれらの使用 発明の背景 本発明は、特定のニトロン(nitrone)化合物およびその塩ならびに薬学的ニト ロンフリーラジカルトラップ剤としてのこれらの有益な使用に関する。背景の情報 α-フェニル-tert-ブチルニトロン(alpha-phenyl-tert-butyl nitrone)（ して同定され、電子スピン共鳴(「ESR」)と共に用いてフリーラジカルの検出に 役立った。PBNは、特定のフリーラジカルと反応し、そして特徴的なESRスペクト ルを生じる化学種を生成することが見い出され、これによりフリーラジカルの存 在または不在を決定することが可能になった。 1970年代後期および1980年代初期に、医学会は、心臓発作、脳卒中などのよう な疾患において、フリーラジカルが演ずる役割に注目し始めた。PBNは、これら の環境内にフリーラジカルが存在するという分析的な証拠を提供するために、次 第にインビトロで用いられるようになった。その後、PBNはまた、インビボで動 物モデルに投与され、さらにまた、虚血シミュレーションなどの間にフリーラジ カルを観察しようとして、分析用補助物として投与された。 1980年代中頃において、重篤な外傷性虚血動物の試験により、PBN治療された 動物の方がコントロールに比べてより生存しがちであることが示されたとき、PB Nの治療効果の可能性が初めて暗示された。 1991年５月２日に、PCT特許出願WO-91-05552号が公開された。この特許出願( 現在発行されている米国特許第5,825,032号および同第5,036,097号と一部対応 する)に、以下の式により定義されるPBNおよびPBN誘導体の一群が記載されてい た： たはＺであり；あるいは であり、そしてｎは、１〜５の全ての整数である)あるいは であり、そしてＹは、tert-ブチルまたは水酸化またはアセチル化tert-ブチルま たは置換フェニルである。これらの化合物は、フリーラジカル損傷に関連すると 報告された脳卒中および他の病態の後遺症(aftermath)を治療するための薬剤と して提案された。 1992年に、PBNおよび関連化合物ならびにそれらの医療的使用に関連した２番 目のPCT特許出願が出願された。この出願(先願の米国特許出願第716,952号（199 1年６月18日付け出願）に基づく)は、1992年12月23日にWO 92/22290号として公 開された。この1992年の刊行物は、２つの非常に広範でかつ一般的な開示内容を 提供した。第１に、フリーラジカルに関連するできるだけ多くの疾患病態を記載 することが試みられた。これらは、ほんのちょっと主要な部分を述べただけでも 、CNS病態（脳卒中、老化、片頭痛などを含む）から末梢器官疾患（アテローム 性動脈硬化症、とこずれ(bed sore)、創傷、および筋肉疲労(muscle overexerti on)を含む）まで、さらにUV被曝までおよんでいる。第２に、出来るだけ多くの 可能性のあるスピントラップ剤(spin trap)を掲載することが試みられた。 全範囲の非PBN物質に加えて、この出願は、潜在的に有用なPBN化合物の定義を 大きく拡げて、PBNおよび以下の式のPBN誘導体を包含していた： であり、ｎは、１〜５（好ましくは１〜３）であり； Ｒ²は、独立して（分子内でさまざまであり得る）、ハロゲン、アルキル、オキ シアルキル、アルケニル、オキシアルケニル、ＯＨ、ＮＨ₂、ＮＨＺ、ＮＺ₂、Ｎ Ｏ、 −ＳＯ₃Ｈ、−ＯＳＯ₃Ｈ、ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−Ｓ（アルケニル、および ハロアルキル（特に−ＣＦ₃を含む））であり； Ａは、ＯまたはＳであり；そして Ｚは、Ｃ₁〜Ｃ₆の直鎖、分岐鎖のアルキル基または環状基であり；そしてＹは、 １つまたはそれ以上の位置が水酸化またはアセチル化され得るtert-ブチル基で あり；フェニルまたは PBNは、当時、最も好ましい化合物であると述べられ、正常な細胞または損傷 のない細胞に対しては測定可能な効果を有さないと言われ、そして多くの誘導体 もまた、有用であると述べられ、そしてその誘導体としては以下のものが挙げら れた：ヒドロキシ誘導体（特に、2-、3-または4-ヒドロキシフェニルt-ブチルニ トロンおよびフェニル(モノ-、ジ-、またはトリヒドロキシ)tert-ブチルニトロ ン）;PBNエステル（特に、アセトキシ誘導体のような2-、3-または4-ヒドロキシ フェニルt-ブチルニトロンを遊離するエステル）；2-、3-、または4-カルボキシ フェニルt-ブチルニトロン；フェニルヒドロキシブチルニトロン；アルコキシル 誘導体（特に、2-、3-、または4-ヒドロキシフェニルt-ブチルニトロン、例えば 、PBNの2-、3-、または4-メトキシフェニル誘導体を遊離するアルコキシル誘導 体）；およびアセトアミド誘導体（特に、2-、3-、または4-アミノフェニルt-ブ チルニトロンを遊離するアセトアミド誘導体）；ジフェニルニトロン(PPN)およ び類似のジフェニルニトロン誘導体；N-tert-ブチル-α-(4-ニトロフェニル)ニ トロン；およびN-tert-ブチル-α-(2-スルホフェニル）ニトロン。発明の説明 １つの特定のPBN誘導体およびその塩は、予期せぬ優れた薬理学的特性を有す ることが、現在発見されている。この誘導体、すなわち2,4-ジスルホニルPBNは 、一般的に前述のWO 92/022290号公報において記載された物質の広範囲の一群に 分けられるが、具体的には開示されていない。その有益な特性も予測されていな い。 ２つのスルホネート基を有する本発明の化合物は、水に対する溶解性の改善を 示すことが予想されたが、その疎油的な(lipophobic)特性のために、血液／脳関 門を越えて輸送されにくいことを示すこともまた予想された。しかし、本発明の 化合物を製造し、そしてインビボで試験すると、本発明の化合物は、PBNと比較 して予期しない薬効(efficacy)の増大を示した。この薬効の増大は、PBNと比較 して効力(potency)の増大と共に生じた。この効力および薬効の著しい増大とは 全く対照的に、PBNと比較して著しいかつ非常に大きな毒性の減少があった。 これらの結果は予想されなかった。なぜなら、特定の定義された化合物の一群 内における構造／活性の関係の一般文献においては、治療的効力は、代表的には 、毒性と共に共変化するからである。従って、大部分の関連化合物は、治療的効 力対毒性の比を維持している。対照的に、密接に関連するアナログに対してその 効力が増大し、かつその毒性が減少した場合、本発明の化合物は、この予想され る関係から逸脱した。 従って、第１の局面において、本発明は、以下のPBN-ジスルホニル化合物： およびその薬学的に受容可能な塩を提供する。 第２の局面において、本発明は、活性成分として、この化合物またはその塩を 有する、非経口(例えば、静脈内)投与および経口投与可能な薬学的組成物を提供 する。 第３の局面において、本発明は、中枢神経系への急性酸化的損傷を伴う病態に かかっている患者（例えば、脳卒中になった患者）を治療する方法を提供し、こ の方法においては、本発明の化合物またはその塩に基づく薬学的組成物は非経口 （例えば、静脈内）投与される。 第４の局面において、本発明は、中枢神経系に対する長期の低グレード酸化ス トレス(protracted low grade oxidative stress)および中枢神経系機能の進行 性喪失により特徴付けられる病態にかかっている患者を治療する方法を提供する 。この方法においては、本発明の化合物またはその塩に基づく薬学的組成物は、 非経口（例えば、静脈内）投与、または好ましくは経口投与される。 第５の局面において、本発明は、癌治療により患者に発生した酸化的損傷から 生じる副作用を減少させ、または改善する方法を提供する。この方法においては 、本発明の化合物またはその塩に基づく薬学的組成物は、非経口（例えば、静脈 内）投与または経口投与される。発明の詳細な説明 この詳細な説明を以下の節に並べる： 図面の簡単な説明 化合物および塩 化合物の調製 薬学的組成物 治療される病態および治療レジュメ 実施例図面の簡単な説明 本明細書中において、以下のものが添付の図面により参照される： 図１は、化合物を調製するために用いた反応を図示したフローチャートである 。 図２(Ａ、ＢおよびＣ)および図３(Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ)は、２組のグラフで あり、これらのグラフは、先行技術のニトロンラジカルトラップ剤の場合の動物 の体温調節能力（用量レベルの関数として生じる）の望ましくない変化を図示し たものであり、そしてこれと、本発明の化合物の場合のそのような望ましくない 毒性効果の欠如とを対比させたものである。 図４(Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ)は、４つ１組のグラフであり、このグラフは、溶液 中の主要酵素のβアミロイドタンパク質の不活性化を妨げる相対的能力により図 示されるように、段階的な神経変性病態（例えば、アルツハイマー病）の治療に おいて、密接に関連する先行技術のニトロン化合物と比較して、本発明の化合物 の優位性を実証したものである。 図５は、ラットにおける中大脳動脈閉塞の後に観察された最終的な梗塞容積(i nfarct volume)の減少における本発明の化合物の有効性を図示したグラフである 。 図６(Ａ、ＢおよびＣ)は、本発明の化合物が動物における高用量レベルの抗癌 剤の副作用を減少させる能力を図示した３つのグラフである。化合物および塩 本発明の化合物は、2,4-ジスルホニル α-フェニルtert-ブチルニトロンであ る。この化合物はまた、本明細書中において「2,4-ジスルホニルPBN」または「P BN 2,4-ジスルホネート」と略称される。この化合物は、固体として以下の酸の 形態で存在し： そして低いｐＨ条件においては溶液中に存在する。この化合物はまた、高いpHで は、以下のものとして示され得るイオン化した塩の形態で存在する： または ここで、Ｘは、薬学的に受容可能なカチオンである。最も一般的には、このカチ オンは、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのような一価の物質である が、これはまた薬学的に受容可能な一価のアニオンと組み合わせて多価カチオン （例えば、クロライド、ブロマイド、ヨーダイド、ヒドロキシル、ニトレート、 スルホネート、アセテート、タルトレート、オキサレート、スクシネート、パル モエート(palmoate)などのアニオンとのカルシウム；このようなアニオンとのマ グネシウム；このようなアニオンとの亜鉛など）でもあり得る。これらの多価カ チオンと一価アニオンとの組み合わせが、構造式中に示される場合、本明細書中 では、一価アニオンは「Ｙ」とする。 これらの物質の中で、遊離酸およびナトリウム単塩、カリウム単塩またはアン モニウム単塩が最も好ましく、カルシウム塩およびマグネシウム塩もまた、上記 単塩より幾分よくないが、好ましい。化合物の調製 図１において詳述され、そして実施例１において実証されるように、本発明の 化合物は、２工程の反応系列により調製され得る。第１工程においては、市販の tert-ブチルニトレート(2-メチル-2-ニトロプロパン)を、活性化亜鉛／酢酸触媒 またはアルミニウム／水銀アマルガム触媒のような適切な触媒を用いて、対応 するn-ヒドロキシルアミンに変換する。この反応は、0.5〜12時間、特に約２〜 ６時間ぐらいで、約15〜100℃の温度にて、液体反応媒質（例えば、亜鉛触媒の 場合、アルコール／水混合液、またはアルミニウムアマルガム触媒の場合、エー テル／水混合液）中で行われ得る。 第２工程においては、新たに形成されたヒドロキシルアミンを、4-ホルミル-1 ,3-ベンゼンジスルホン酸と、代表的にはアミンをわずかに過剰に用いて反応さ せる。この反応は、同様の温度条件で行われ得る。この反応は、一般に、10〜24 時間で完了する。 このように形成される生成物は、遊離酸であり、そして89g/モルの分子量によ り特徴付けられる。この生成物は、白色粉末状物質であり、加熱すると分解する 。この生成物は、１g／mlより大きい水溶解性を示すこと、およびD₂O中での¹H N MRスペクトルが8.048ppm(dd,8.4, 1.7Hz);8.836ppm(d,8.4Hz);8.839ppm(d,1.7Hz );8.774ppm(s)に表れることにより特徴付けられる。 水性媒質に溶かした遊離酸を２当量の適切な塩基（例えば、カリウム塩につい てはKOHなど）と混合することにより、様々な塩が容易に形成され得る。薬学的組成物 化合物(その塩を包含する)は経口または非経口(例えば、静脈内または筋肉内 注射)投与に適する薬学的組成物に処方され得る。 経口投与のための組成物は、液体溶液または懸濁液、粉末、錠剤、カプセル剤 などの形態をとり得る。このような組成物において、PBN 2,4-ジスルホネートま たはその塩は、通常、少量成分(0.1〜約50重量%)であり、残りは所望の剤形を形 成するのに有用な種々のビヒクルまたはキャリアおよび加工補助物(processing aid)である。液体形態としては、緩衝剤、懸濁調合剤、着色剤、フレーバーなど を含有する適切な水性または非水性ビヒクルが挙げられ得る。 固体形態としては、例えば、任意の以下の成分または同様の特性の化合物が挙 げられ得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合 剤；澱粉または乳糖のような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル(Primogel)または コーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；コ ロイド状二酸化ケイ素のようなグライダント(glidant)；ショ糖またはサッカリ ンのような甘味剤；またはペパーミント、砂糖、メチルサリチレートまたはオレ ンジフレーバーのようなフレーバー剤。 注射可能な組成物の場合、これらは、一般に、注射可能な減菌生理食塩水また はリン酸緩衝化生理食塩水または当該分野で公知の他の注射可能なキャリアに基 づく。さらに、活性ニトロンは、代表的には、少量成分であり、しばしば約0.05 〜10重量%であり、残りは注射可能なキャリアなどである。治療される病態および治療レジュメ 2,4-ジスルホニル PBNで治療される病態は、一般的に３つのグループに分かれ る。第１のグループは、中枢神経系領域への急性の強い酸化的損傷を伴う病態を 含む。これらの病態の例としては、脳卒中、脳卒中に関連する病態、振とう症お よびクモ膜下出血が挙げられる。この環境において、化合物は、可能な限り迅速 かつ直接に患者の血流中へ薬剤を送達するように設計されるようにして投与され る。これは、通常、静脈内投与を意味する。 これらの病態を治療するための静脈内用量レベルは、約１〜約120時間、特に2 4〜96時間の間ではすべて、約0.1mg/kg/時間〜少なくとも10mg/kg/時間の範囲で ある。約10〜約500mgの予備添加(preloading)のボーラスもまた、適切な定常病 態レベルを達成するために投与され得る。 静脈内投与が好ましいが、筋肉内注射のような非経口投与の他の形態も同様に 用いられる。この場合、同様の用量レベルが用いられる。2,4-ジスルホニル PBN の予期せぬ主要な利点は、それが、PBN自体の場合において可能であるレベルよ りも非常に高いレベルで投与され得ることである。実施例に示されるように、10 00mg/kg/時間までの用量およびそれ以上の用量、または10〜2500mg/kgの静脈内 ボーラス用量は、PBNそれ自体ではこのような用量からは死亡または急性毒性に 至るが、2,4-ジスルホニル PBNまたはその塩では可能であることが示されている 。2,4-ジスルホニル PBNでは、これらの高用量レベルにおける予想せぬ用量/応 答曲線のポジティブな持続があり、これは、脳卒中または他の外傷の直後の強力 な大量投与が、多くの場合には、回復に対して主要なポジティブな劇的効果を提 供 し得るという明瞭なメッセージを有する。 2,4-ジスルホニル PBN治療に好適に応答する病態の第２のグループは、中枢神 経系への長期の低グレード酸化的ストレスおよび段階的進行性中枢神経系機能喪 失により特徴付けられる病態である。これらの病態としては、アルツハイマー病 、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多発脳梗塞性痴呆、網膜症など が挙げられる。これらの病態の各々は、機能の進行性喪失により特徴付けられる 。2,4-ジスルホニル-PBNまたはその塩は、経口または非経口(例えば、静脈内)投 与される場合、機能の喪失を遅くし、ことによると逆転させ得る。非経口(例え ば、静脈内)投与が所望される場合、急性の病態の場合に使用されるのと同様の レベルであるが、その範囲の下限レベルが一般に用いられる。 これらの場合には、治療のためのレジュメは、長い年月にわたって続くので、 患者の利便性および耐容性のためには経口投与が好ましい。経口投与では、１日 当たり１〜３回の経口用量であり、それぞれ約0.02〜約50mg/kgが必要とされ、 好ましい用量は約0.04〜約5.0mg/kgである。 当然ながら、2,4-ジスルホニル PBNは、単独の活性薬剤として投与され得るし 、または他の薬剤と組み合わせて投与され得る。これはこの化合物の第３の適用 につながる。 2,4-ジスルホニル PBNによる治療に応答する病態の第３の組は、癌(新生物疾 患)治療により生じる酸化的損傷から患者に起こる副作用である。酸化的損傷(お よびこれによる副作用)を生じる治療としては、放射線照射(例えば、γ放射線) 療法および酸化的損傷を引き起こす化学療法剤による治療が挙げられる。これら の薬剤の例としては、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびブレオマイシンの ような抗生物質；プロカルバジン；イフォスファミド(ifosfamide)、メルファラ ンおよびクロラムブシルのようなナイトロジェンマスタード；アルキル化剤；代 謝拮抗剤；ホルモンおよび拮抗剤が挙げられる。 2,4-ジスルホニル PBNの投与は、これらの治療の間、患者の不安感を軽減する 効果を有し得る。さらに、本発明の化合物の投与は、これらの治療に対する患者 の耐容力を増大させ得る。しばしば治療の副作用は、これらの治療を中止させる か、または最適な高い用量の投与または多頻度のこれらの治療を妨げることを余 儀なくさせる。ある場合には、これらの副作用は、非常に有害であり、そして心 不全および他の主要な機能喪失につながる。動物での試験において、本発明の化 合物がこれらの抗新生物疾患治療の患者の耐容性を改善させ得ることが観察され た。 この治療において、本発明の化合物は、放射線照射または化学療法が行われる 前、行われている間、および行われた後に投与され得る。投与は、非経口または 経口であってもよく、もしくは2,4-ジスルホネート PBNを患者の血流中に導入す るのを可能にする任意の他の方法でもよい。 ポジティブな用量-応答関係が観察されている。それ自体では、そして副作用 の重篤度ならびに最大の可能な防護または改善を提供するという利点を考慮する と、ある環境においては、急性の強い酸化的CNS損傷に対しての上記のような多 量の2,4-ジスルホニル PBNを投与することが望ましい。他の環境においては、進 行性ニューロン性疾患治療に対して述べられたようなより低い用量が使用され得 る。 以下は、代表的な投与レジュメの実施例である：単一療法(アドリアマイシン 単独)において、２つの代表的な用量の組合せは、１平方メートル面積当たり10 〜600mgの化合物Ｉおよび１平方メートルの表面積当たり60mgのアドリアマイシ ン(アドリアマイシンの投薬は、７日毎または21日毎に行われる)である。化合物 Ｉは、アドリアマイシン投与の前に(例えば、アドリアマイシン投与の最高60分 前に)、アドリアマイシン投与と同時に、あるいはアドリアマイシン投与の後に( アドリアマイシン投与の数時間後および後日に)である。小児の用量は、代表的 には、両方の薬剤に対しては、より低い。より高用量は、多回投与耐性の腫瘍の 治療に対して用いられ得る。 実施例 実施例１ 2,4-ジスルホニルフェニル-N-t-ブチルニトロン(後の実施例における化合物「 Ｉ」)の合成。この好ましい合成法は、R.H. HintonおよびE.G.Janzen(J. Org. C hem. 57:2646-2651,1992)による研究に基づく。図１に示すように、この合成 は、アルデヒドとヒドロキシルアミンとの縮合を包含する。ヒドロキシルアミン は、不安定であり、そして活性化亜鉛触媒を用いて、使用する日に新しく調製さ れる。この合成は、以下の通りである：必須の化学物質 １． 95％エタノール ２． 2-メチル-2-ニトロプロパン ３． 亜鉛末 ４． 氷酢酸 ５． ジエチルエーテル ６． 飽和塩化ナトリウム ７． 硫酸マグネシウム、無水固形物 ８． 4-ホルミル-1,3-ベンゼンスルホン酸(分子量 310.21g／モル)、二ナト リウム塩、水和物 ９． メタノール 10． ジクロロメタン手順 Ａ．N-t-ブチルヒドロキシルアミンの調製 １．500ml用の３つ口丸底フラスコに、磁気撹拌子、温度計アダプター、温度 計、および滴下漏斗を取り付ける。 ２．95％エタノール(350ml)をフラスコに加え、そして氷浴中で10℃まで冷却 した。 ３．2-メチル-2-ニトロプロパン(6.18ｇ、0.060モル)、および亜鉛末(5.89ｇ 、0.090モル)を一度に(single portion)加えた。 ４．氷酢酸(10.8g、0.180モル)を滴下漏斗に入れ、そして激しく撹拌しながら 、温度を15℃未満に維持するような速度で滴下した。 ５．氷浴を外し、そして混合物を３時間室温で撹拌した。 ６．溶媒を混合物から除去して、t-ブチルヒドロキシルアミン、酢酸亜鉛およ び水が残った。 ７．ジクロロメタン(50ml)を加え、そして混合物をブフナー漏斗を通して濾過 した。 ８．濾紙上に残った硫酸亜鉛ケーキを２×25mlのジクロロメタンで洗浄した。 ９．水を分液漏斗中で濾液から分離し、そして有機層を硫酸マグネシウムで乾 燥した。 10．硫酸マグネシウムをひだ付き(fluted)濾紙を通して濾過することにより除 去し、次いでジクロロメタンをロータリーエバポレーションにより除去した。 11．生成物（収率100％＝5.34グラム）（粘性液）を、Ｂの部で使用するため にメタノール(50ml)に溶解した。 Ｂ．2,4-ジスルホニルフェニル-N-t-ブチルニトロンの調製 １．250ml用の３つ口丸底フラスコに、撹拌子、ガス分散チューブ、滴下漏斗 、および氷水の再循環により冷却されるフリードリッヒ冷却器を備え付けた。 ２．フラスコに、200mlのメタノール、4-ホルミル-1,3-ベンゼンジスルホン酸 (9.31g、30ミリモル)およびN-t-ブチルヒドロキシルアミン(Ａの部で得た25mlの メタノール溶液、理論上30ミリモル)を加えた。 ３．反応物を撹拌して窒素で泡立てさせながら、反応物を加熱用マントルで加 熱して還流した。 ４．混合物を２時間還流した。 ５．Ａの部で得たヒドロキシルアミンの残りを加えた。 ６．窒素で泡立てさせながら、少なくとも18時間（ただし、24時間以下）還流 を続けた。 ７．熱い反応混合物をブフナー漏斗で濾過し、そして固体を熱メタノールで洗 浄した。 ８．メタノールをロータリーエバポレーションにより除去して、黄色で粘性の ある油状物を得た。 ９．熱い1:1のエタノール：アセトン(200ml)を加え、そして混合物を加熱して 油状物を溶解させた。 10．溶液を冷却して生成物を結晶化させた。 11．生成物をブフナー漏斗上で集め、そして真空下で一晩乾燥した。 12．この反応は、代表的には、75％収率の化合物Ｉ（白色粉末）を与える。 実施例２ 2,4-ジスルホニルフェニル-N-t-ブチルニトロン(化合物Ｉ)の別の合成。これ は、初期に開発された方法であり、この方法を用いて、本明細書の実施例におい て報告される幾つかの実験に用いられる化合物の試料を調製する。この実施例の 生成物は、全ての点において実施例１の生成物と同一である。この合成方法は、 以下の通りである：必須の化学物質 １．アルミニウム箔（５cm幅の細片に切断し、そして約１cm直径の円筒状に丸 めた） ２．塩化水銀(II)(476mlの水中、9.68g) ３．エタノール ４．エーテル(６リットル) ５．純水 ６．2-メチル-2-ニトロプロパン ７．水酸化ナトリウム、２M（１リットルの水中80g） ８．硫酸マグネシウム、無水固形物 ９．4-ホルミル-1,3-ベンゼンスルホン酸(分子量310.21g／モル)手順 Ａ．N-t-ブチルヒドロキシルアミンの調製 １．円筒状のアルミニウム箔をHgCl₂溶液に15〜30秒間浸し、次いでエタノー ルに浸し、次いでエーテルに浸し、次いで500mlのジエチルエーテルおよび21.4m lの水を含む５リットル用のフラスコ内に置いた。 ２．フラスコに、250ml用の均圧滴下漏斗、機械的撹拌子、窒素流入口、およ び氷水の再循環により冷却されるフリードリッヒ冷却器を取り付けた。 ３．混合物を10分間撹拌した。 ４．2-メチル-2-ニトロプロパン(71.68g、75.5ml)を滴下漏斗を用いて、激し い還流を維持するような速度で加えた。 注意点：添加は、20分未満内で完了しなければならない、さもないと収率がか なり低下する。 ５．添加が進むにつれて、500ml部のエーテルを加えた。これは、ゲルを形成 することなく出来るだけ高い生成物濃度を維持するために行った。２リットルま でのエーテルを、収率に悪影響を及ぼすことなく加え得る。 ６．2-メチル-2-ニトロプロパンの添加が完了すると、反応物をさらに30分間 撹拌した。 ７．得られた灰色の懸濁液を３回分吸引濾過して、アルミニウム塩を取り除い た。 ８．各濾過ケーキを１リットルのエーテルで洗浄した。 ９．各層を一緒にしたものを300mlの２M NaOHで洗浄し、次いで乾燥(MgSO₄)し 、そして真空下で濃縮すると軟らかい白色固形物が残った。 10．固形物は、室温よりわずかに高い温度で溶融するが、真空オーブン中でさ らに乾燥され得て（わずか数分間）、38〜45gの固形物が残った。 11．固形物は、ペンタンからの再結晶により精製されるまたは精製されたもの として用いられ得る。 12．分子量−89g／モル Ｂ．2,4-ジスルホニルフェニル-N-t-ブチルニトロンの調製 １．250ml用のフラスコに、撹拌子、および氷水の再循環により冷却されるフ リードリッヒ冷却器を取り付けた。 ２．フラスコに、71.8mlのメタノール、14.5gの4-ホルミル-1,3-ベンゼンジス ルホン酸(46.7ミリモル、１当量)および5.0gのN-t-ブチルヒドロキシルアミン(5 6.2ミリモル、1.2当量)を入れた。 ３．混合物を一晩還流した。 ４．反応生成物を丸底フラスコに移し、そしてロータリーエバポレーションに より蒸発させて(rotovaped)乾燥した。 ５．固形分の残査をエーテルで混ぜ合わせ、このエーテルをデカンテーション により除いた(黄色)。 ６．工程５を繰り返した。 ７．熱メタノール濾過の後に、生成物(「化合物Ｉ」)をメタノールから結晶化 して、不溶性の沈殿物を除去し、そしてメタノールで２回再結晶した。 実施例３ 脳の虚血および再灌流損傷の後のニューロン喪失に対して防護(protect)する ための薬剤として、2,4ジスルホニルPBN(「化合物Ｉ」)、PBN、および２つのモ ノスルホネートPBN化合物のインビボでの薬効を比較するために、一連の実験を 行った。この試験の手順は、W. Cao、J.M. Carney、A. Duchon、R.A. Floydおよ びM. Chevionの「脳に対する虚血および再灌流損傷への酸素フリーラジカルの関 わり」(Neuroscience Letters, 88(1988), 233)により報告されている手順であ る。実験では、６匹のアレチネズミ(gerbil)のグループに、５分間の両側頸動脈 閉塞の30分前に、試験化合物を単回用量として腹腔内投与した。100ミクロン中 のニューロン核の密度を測定した。２匹のコントロールが存在した（試験化合物 を投与されないコントロール、および試験化合物を投与されず、かつ脳虚血を受 けていないコントロール）。表１に図示したように、本発明の化合物は、先行技 術の化合物と比較して、予期せぬ利点を示した。まず、低用量レベル（例えば、 3.2mg/kg）では、化合物Ｉは、ニューロン喪失の予防に対して、２〜３倍の効力 があると考えられる。高用量レベルでは、試験された脳が、非虚血のコントロー ルと同一のニューロン密度を示したので、化合物Ｉは、ニューロン喪失に対して 完全な防護(protection)を達成し得ると考えられる。先行技術の化合物は、これ らの用量レベルで毒性であるか、または非常に低い程度の防護を示すかのいずれ かであった。これらの結果は、PBNおよび２つの密接に関連したアナログと比較 して、化合物Ｉでは、神経防護に対する効力の明確な増大を示し、そしてPBNと 比較して予期せぬ毒性の低下を示す。 実施例４ 虚血後の治療において、化合物ＩをPBNおよび２つのスルホネートアナログと 比較した一連の実験を行った。実施例１に記載される一般的な方法を用いたが、 ５分間の虚血の後の再潅流の30分後に、単回用量として試験化合物を腹腔内投与 した。結果は、表２に要約される。表２は、本発明の化合物がさらにまた、低用 量でより効力があり、高用量でより効力がありかつ毒性が低いことを示す。さら にまた、毒性は、従来技術の化合物が高用量をなし得る能力を妨害し、このレベ ルでは、本発明の化合物は劇的に効果的な治療を提供する。 実施例５ 実施例１に記載される一般的な試験方法を用いて、アレチネズミにおいて５分 間の虚血の後の再潅流の開始60分後に静脈内投与したとき、化合物ＩをPBNと比 較してニューロン喪失の防護に対する相対的な効果を決定した。結果は、表３に 要約され、そして化合物Ｉが脳に対する損傷後の臨床上の治療環境において有意 により大きな治療利益を有することを示す。 脳損傷のないコントロールのアレチネズミにおいて、PBNも化合物Ｉもニュー ロン密度に対して効果を有さなかった。 実施例６ 脳損傷は、行動の変化として現れ得る。この実験において、実施例１に記載さ れるように、若い成熟(3〜4ヶ月齢)のアレチネズミを試験して、虚血が起こって 24時間後に８アーム迷路試験を行う能力を測定した。非虚血の動物と比較すると 、治療されない腸合、多くのさらなるエラーを犯した。PBNおよび化合物Ｉを試 験動物の何匹かに投与した。表４に詳細に示されるように、高用量の化合物Ｉで 治療されたアレチネズミは、非虚血の動物とは識別不能なエラーレベルを有した 。PBNは、効果がより低かった。これは、５分の虚血の後の若いアレチネズミの ８アーム放射状迷路試験において、化合物Ｉが、虚血後(24時間後)の時間的/空 間的な短期間の記憶の喪失に対してエラーを防止し得ることを示す。 実施例７ 虚血が起こった後の梗塞容積を減少させる本発明の化合物の能力を測定した。 表５に詳細に示されるように、低用量ではPBNおよび化合物Ｉは両方とも効果的 であったが、高用量ではＩは最良の防護を提供し、そしてPBNは毒性があった。 表５は、C57BL/6Jマウスにおいて、中大脳閉塞の60分後に試験化合物を静脈内投 与し、そして24時間継続したときに観察された梗塞容積を示す。 実施例８ この研究において、高齢のアレチネズミ(18〜24ヶ月齢、n=12/グループ)にお いて、化合物ＩとPBNとを虚血の30分前に投与した場合、10分の虚血からの致死 率の防護(生存した％)を与える能力について、化合物ＩとPBNとを比較した。表 ６に示されるように、PBNは、部分的にのみ効果的であるが、化合物Ｉは、すべ ての用量レベルにおいて優れており、そして高レベルにおいては完全な防護を達 成した。 実施例９ 当該分野で公知の化合物であるPBNと比較しての本発明の化合物の重要な利点 は、その著しく減少した毒性である。表７に詳細に示されるように、C57BL/6Lマ ウスにおける急性死亡率は、ニトロンの単回腹腔内用量の様々なサイズに基づい て決定される。PBNは、560mg/kg用量レベルにおいて有意な毒性を示した。化合 物Ｉは、ほぼ20倍大きな用量において毒性を示さなかった。 実施例10 ニトロンラジカルトラップ剤を用いて、インビボで観察された別の望ましくな い全身的効果は、体温の低下である。この毒性は、重篤な健康上の結果となり得 、そして他の病態の診断を複雑にもし得る。図２および４に詳細に示されるよう に、本発明の化合物を1000mg/kgという程の高いレベルでマウスおよびアレチネ ズミに投与しても、測定可能な体温の低下はなかった。対照的に、当該分野の化 合物であるPBNは、ほんの500mg/kgの用量で最高８℃の体温の低下があった。 実施例11 本発明の化合物を試験して、中枢神経系への長期の低グレード酸化ストレスお よび段階的進行性中枢神経系機能喪失により特徴付けられる病態の治療における その有効性を、アルツハイマー病(「AD」)用モデルにおけるその有効性を試験す ることにより決定した。このモデルは以下のことを基礎としている：最近の研究 は、高齢の個体の脳において、加齢に伴うタンパク質酸化の増加および酵素活性 の喪失があることを示している。高齢の個体からの線維芽細胞および異なる年齢 の赤血球の組織培養は共に、タンパク質のカルボニル含量(タンパク質酸化の尺 度)の指数的増加およびマーカー酵素活性の減少を示す。脳タンパク質の酸化は 、個体の生涯期間にわたり徐々に増加する。 ADにおける異常アミロイド前駆体ペプチドのプロセシングおよび代謝の役割も また、多くの異なるモデルにおいて調査した。胎児海馬ニューロンおよびニュー ロン/神経膠の培養物を用いるインビトロの研究は、βAP １〜40位が長時間の共 インキュベーションにわたって細胞障害性を生じることを示した。このペプチド をラットの脳に注入した場合、病変が生じた。提示されたβAPの分解フラグメン トのいくつかはまた、ニューロン障害性である[例えば、βAP(25〜35位)]。ニュ ーロン障害性は、グルタミン酸レセプターを介しても、そして非グルタミン酸レ セプターメカニズムによっても、その両方で仲介されるようである。ニューロン 培養物の共焦点顕微鏡による研究は、βAP(1〜40位)への曝露が酸化的ストレス を生じることを示した[ジクロロフルオレセインおよび増加した細胞内遊離カル シウムFura-2]。 βAPフラグメントは、組織抽出物中で、ならびに培養された海馬ニューロンお よび神経膠中で直接的にグルタミンシンテターゼ(GS)およびクレアチンキナーゼ (CK)を不活性化することが示されている(図４のＡおよびＢを参照のこと)。図４ のＡおよびＢは、AP(25〜35位)によるグルタミンシンテターゼおよびクレアチン キナーゼの用量に関連した不活性化を表す。アレチネズミの新皮質からの細胞質 ゾル画分を調製し、そして酵素活性を測定した。試料を、アッセイの前に10分間 、異なる濃度のペプチドの存在下でインキュベートした。実線記号は天然由来の 25〜35位のフラグメントの効果を表す。白丸は、逆配列(32〜25位)が酵素活性に 対して効果を有さなかったことを示す。白三角は、並び変えた(scrambled)アミ ノ酸配列もまた、25〜35位のものの効果に比較して酵素活性に対して効果を有さ なかったことを示す。各点は、５つの観察点の平均(＋/− s.e.)である。誘導さ れたβAPおよびフリーラジカルの他の細胞起源は、ADの開始および進行の重要な 決定因子である。 図４のＣおよびＤに示されるように、化合物ＩおよびPBNは、それぞれ、βAP フラグメントの効果に対して、GSおよびCKを防護する能力を示す。図４のＣおよ びＤは、異なる濃度のPBN(白丸)または化合物Ｉ(黒丸)を組み合わせて、BAP 25 〜35位(0.4mg/ml)と細胞質ゾル画分との共インキュベーションの防護効果を表す 。各点は、３つの観察点の平均(＋/− s.e.)である。ＣおよびＤに見られるよう に、化合物Ｉは完全な防護を与え、そして事実上、酸化の効果を逆転さえ可能で ある。対照的に、PBNの有効性は、実質的に防護が不完全なレベルで漸近的に横 ばい状態になっていくにつれて、全く制限される。 実施例12 脳卒中により引き起こされる中枢神経系の損傷を予防する本発明の化合物の有 効性をさらに示すために、実験を行った。 ラット限局性虚血の結果。 ラット限局性虚血モデルにおける化合物Ｉの薬効を決定するために２つの研究 を行った。このモデルにおいて、Sprague Dawleyラット(200〜300g)は、永久的 中大脳動脈閉塞(MCAO)を受けて限局性脳卒中を誘起した。化合物Ｉを、永久的閉 塞の後に、先ず腹腔内(i.p.)へのボーラス用量として投与し、次いで脳卒中後24 時間までの残り時間の間、静脈内(i.v.)への連続注入により投与した。用いた化 合物Ｉの用量は、100mg/kg(i.p.)次いで4.2mg/kg/時間(i.v.)であるか、または1 0mg/kg(i.p.)次いで0.42mg/kg/時間(i.v.)であるかのいずれかであった。 ラットを脳卒中の３日後に屠殺し、トリフェニルテトラゾリウム染色技術を用 いて、組織を組織学的に処理し、そして梗塞容積、すなわち総細胞壊死の領域を 画像解析を用いて定量した。これらの実験の結果は、図５に図示され、そして化 合物Ｉが両方の研究において約70%の有意な防護を提供することを示す。 文献の結果との比較 CaoおよびPhillis(Brain Research 664:267-272, 1994)により、本発明の化合 物ではないPBNについて、同様のデータが最近報告された。それらの研究におい て、ラットは、永久的中大脳動脈閉塞(MCAO)および総頸動脈閉塞を受けた。PBN は、脳卒中後の種々の時点において100mg/kgで腹腔内投与された。ラットを脳卒 中の２日後に屠殺し、そしてトリフェニルテトラゾリウム染色を用いて、梗塞容 積を定量した。 脳卒中の0.5、５、17、29および41時間後に、または脳卒中の５、17、29、41 時間後にPBNを投与した場合、梗塞容積はそれぞれの場合において約50%減少した 。50%防護を達成するために投与されたPBNの累積用量は、70%防護に要する化合 物Ｉの量の最低４倍である。従って、化合物Ｉは、ラットMCAO限局性虚血モデル において防護を提供する場合に、PBNよりもはるかに優れている。 実施例13 本実施例において、本発明の化合物(化合物Ｉ)を評価して、酸化を引き起こす 抗癌治療の副作用を改善する能力を決定した。 アドリアマイシン研究 アドリアマイシンは広く使用される抗癌剤である。それは非常に有効であるこ とが知られているが、酸化的損傷を引き起こす傾向から生じる重篤な副作用を有 することもまた知られている。これらの副作用は、高用量レベルで重篤なレベル の心臓損傷を引き起こすことを包含する。これらの副作用は、しばしば、この薬 剤の使用を制限するか、または使用され得る用量レベルを最大の抗新生物疾患の 有効性に対して望まれるレベルより低いレベルに制限する。 実験を行って、本発明の化合物が、アドリアマイシンのような抗癌剤の副作用 を減少させる場合に、そして動物で耐容性を与え得るより高いアドリアマイシン の用量レベルを可能にする場合に効果的であることを示した。 C57BL/6JおよびDBA/2J雄マウス(35〜40g)を、アドリアマイシンの急性致死効 果および化合物Ｉの前治療用量による急性致死率の予防について試験した。生理 食塩水または化合物Ｉのいずれかを、アドリアマイシン投与の30分前にマウスに 注射した。すべての注射は腹腔内に行った。アドリアマイシンの急性致死率は、 10〜30mg/kgの範囲であった。これらの試験におけるアドリアマイシンに対するL D₅₀は、両方のマウス系統において25mg/kgであることが見い出された。アドリア マイシン治療を行わない最高300mg/kgまでの化合物Ｉの用量は、２つのマウス系 統における生存率に対して効果を有さなかった。 30および100mg/kgの化合物Ｉによる前治療は、アドリアマイシン致死率用量効 果曲線において、用量に関係したシフトを生じた。図６は、DBA/2Jマウスを用い て得られた結果を示す。100mg/kgの化合物Ｉの用量は、右へ(致死率の低下の方 向)５倍のシフトを生じた。従って、化合物Ｉとアドリアマイシンとの組み合わ せは、最大耐容性用量の著しい増加を生じた。これらのより高用量は、多剤耐性 腫瘍を効果的に死滅させる範囲にある。 比較試験 PBN前治療は、アドリアマイシン用量-効果曲線において右へのわずかなシフト を生じた。化合物Ｉの用量は、アドリアマイシンと組み合わせて300mg/kgまで増 加し得たが、PBNとのこの組み合わせでは上限があった。100mg/kgのPBNの用量は わずかな鎮静作用を生じ、そして300mg/kgのPBNの用量は著しい鎮静作用および いくらかの複合毒性(10〜20%の致死率)を生じた。化合物Ｉ/アドリアマイシンは 、300mg/kgまでの化合物Ｉの用量では、何の複合毒性も生じなかった。 実施例14 安全性試験 化合物ＩおよびPBNを、その急性毒性に関して雄のSprague Dawley(200〜300g) ラットにおいて試験した。化合物を1000mg/kgで６匹のラットのグループに腹腔 内投与した。３日後に致死率を評価した。化合物Ｉは、致死にはならなかったが 、一方PBNは、この試験に使用した６匹のラットのうち５匹に致死的であった。 これらのデータは、化合物ＩがPBNよりも高い安全性を有するという点てアレチ ネズミのデータを確証する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，Ｂ Ｇ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カーニー，ジョン エム. アメリカ合衆国 ケンタッキー 40503, レキシントン，パロモー 4033

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．2,4-ジスルホニル α-フェニルtert-ブチルニトロン。 ２．以下の式の化合物： ３．以下の薬学的に受容可能な塩： ４．以下の式を有する、請求項３に記載の塩： ここで、Ｘは、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ₄、Ｃａ、Ｍｇ、ＣａＹおよびＭｇＹ（Ｙは、 薬学的に受容可能な一価のアニオンである）からなる群から選択される。 ５．薬学的に受容可能で非経口的に注射可能なキャリア中の請求項１に記載の 化合物を含有する薬学的組成物。 ６．薬学的に受容可能で非経口的に注射可能なキャリア中の請求項２に記載の 化合物を含有する薬学的組成物。 ７．薬学的に受容可能で非経口的に注射可能なキャリア中の請求項３に記載の 塩を含有する薬学的組成物。 ８．薬学的に受容可能で非経口的に注射可能なキャリア中の請求項４に記載の 塩を含有する薬学的組成物。 ９．薬学的に受容可能な経口キャリア中の請求項１に記載の化合物を含有する 薬学的組成物。 １０．薬学的に受容可能な経口キャリア中の請求項２に記載の化合物を含有す る薬学的組成物。 １１．薬学的に受容可能な経口キャリア中の請求項３に記載の塩を含有する薬 学的組成物。 １２．薬学的に受容可能な経口キャリア中の請求項４に記載の塩を含有する薬 学的組成物。 １３．脳卒中にかかった患者を治療する方法であって、少なくとも約0.2mg/kg /時間の請求項５、６、７、または８に記載の薬学的組成物の有効な脳卒中の治 療量を、該患者に非経口投与する工程を包含する、方法。 １４．前記組成物が、静脈内投与される、請求項１３に記載の方法。 １５．脳卒中にかかった患者を治療する方法であって、請求項９、１０、１１ 、または１２に記載の薬学的組成物の有効な脳卒中の治療量を、該患者に経口投 与する工程を包含する、方法。 １６．進行性中枢神経系機能喪失病態にかかっている患者を治療する方法であ って、請求項５、６、７、または８に記載の薬学的組成物の有効な進行性中枢神 経系機能喪失病態の治療量を、該患者に非経口投与する工程を包含する、方法。 １７．前記組成物が、静脈内投与される、請求項１６に記載の方法。 １８．進行性中枢神経系機能喪失病態にかかっている患者を治療する方法であ って、少なくとも約0.1mg/kg/日の請求項９、１０、１１、または１２に記載の 薬学的組成物の有効な進行性中枢神経系機能喪失の治療量を、該患者に経口投与 する工程を包含する、方法。 １９．酸化的損傷を生じる抗新生物疾患治療によって患者に引き起こされる副 作用を改善する方法であって、請求項９、１０、１１、または１２に記載の薬学 的組成物の有効な副作用改善量を、該患者に経口投与する工程を包含する、方法 。 ２０．酸化的損傷を生じる抗新生物疾患治療によって患者に引き起こされる副 作用を改善する方法であって、請求項５、６、７、または８に記載の薬学的組成 物の有効な副作用改善量を、該患者に非経口投与する工程を包含する、方法。 ２１．前記組成物が、静脈内投与される、請求項２０に記載の方法。