JPH10120567A - Ｈｓｐ６０ファミリーに属するタンパク質のアコニチン含有合成抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分子量５７キロダルトンから６８キロダルト
ンまでの間の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０ファミ
リー）がその発症に関与する自己免疫疾患（例えば、Ｉ
型糖尿病や慢性関節リウマチなど）の患者の生理学的状
態を有効に改善させ、前記病気を効果的に治療すること
ができる、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
合成抑制剤を提供する。 【解決手段】 アコニチン又はその立体異性体を有効成
分として含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アコニチンを有効
成分として含有する、分子量が５７キロダルトン（ｋ
Ｄ）から６８ｋＤまでの間の熱ショックタンパク質群
（以下、ＨＳＰ６０ファミリーと称する）に属するタン
パク質の合成抑制剤に関する。本発明によるＨＳＰ６０
ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤は、特に、
ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の組織内合成
を抑制することにより、ＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質が発症に関与するものと考えられている自己
免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなど
の病気の患者の生理学的状態を有効に改善させ、Ｉ型糖
尿病や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患を効果的に
治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、自己免疫疾患が大きな問題となっ
ている。自己免疫疾患とは、本来ならば自己の身体を構
成する成分に対しては攻撃しないはずの免疫系が、自己
の組織と反応して破壊してしまう病気であり、例えば、
Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどが含まれる。例え
ば、近年わが国では、経済・社会・文化の発達と、生活
水準の向上や生活様式の変化に伴って、糖尿病患者は著
しく増加し、病態も重症化、複雑化してきた。糖尿病学
の進歩によって、患者の予後は改善したとはいえ、特有
な網膜症、腎症及び神経障害が多発し、加えて動脈硬化
も促進され、健康と社会活動に多大な支障をきたしてい
る。糖尿病のうち、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿
病；insulin-dependent diabetes mellitus ；ＩＤＤ
Ｍ）の発生率は、多くの国でこの数十年間に数倍に増加
し、現在生きているヒトの１％は７０才になるまでにＩ
型糖尿病に罹病するものと予想されている。

【０００３】Ｉ型糖尿病は、インスリン産生細胞である
膵臓ランゲルハンス島のβ細胞だけが自己免疫的に破壊
されるためにインスリン欠乏状態となる疾患で、臓器特
異的な自己免疫疾患である（Atkinson, M. A. et al.:
"Sci. Am.", 263 : 42-49, 1990; Todd JA.: "Immuno
l. Today", 11: 122-129, 1990)。Ｉ型糖尿病をおこす
自己免疫過程は、非常に厳密に膵臓だけに限られてお
り、しばしば大人になる前に発症してくることが多い。
Ｉ型糖尿病が臨床的に発症するときには、膵島の炎症
（膵島炎）があり、インスリンを産生しているβ細胞の
大半が特異的に失われる（Atkinson, M. A., et al.: "
Sci. Am.", 263 : 62-67, 1990)。糖尿病の臨床症状
は、β細胞の大部分（おそらく９０％以上）が再生でき
ない程度にまで破壊された後に初めて現れ、患者の生存
はインスリンの外的供給に依存することになる。即ち、
臨床診断によって発見することができる時期には、この
自己免疫反応が既に不可逆的な損傷を与えており、しか
もその多くは顕著な自覚症状を示さない等、Ｉ型糖尿病
は多くの問題を含んでいる。

【０００４】また、慢性関節リウマチは、関節滑膜を病
変の主座とする慢性炎症性疾患である。病変部位はとき
として関節滑膜のみにとどまらず、全身に及ぶこともま
れではない。関節滑膜に初発した炎症は、やがて滑膜増
殖、更に軟骨及び骨の破壊を起こし、関節組織の破壊が
引き起こされる。その結果、患者は社会的にも家庭的に
も著しく制限を受けるのみならず、経済的負担も無視で
きないものとなる。慢性関節リウマチの患者数は人口の
０．１〜０．３％とされる。これは慢性関節リウマチの
確診例であって、疑診例などや慢性関節リウマチの周辺
疾患を含めると患者数はその１０倍前後にも増えるもの
と思われる。

【０００５】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば、熱、重金属、薬剤、
アミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激
することにより、細胞に発現される一群のタンパク質で
ある。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在
しており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高
等動物により産生される。

【０００６】ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、
分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー（例えば、９
０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳＰ７０ファ
ミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳ
Ｐ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋＤのＨＳＰな
ど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、２０ｋＤ、２
５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰなど）の４ファミ
リーに大別することができる。なお、本明細書において
は、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳＰとその直後に
記載する数字とによって示すものとし、例えば、分子量
６０ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ６０』と称するものとす
る。以上のように、ＨＳＰには多くの種類が存在する
が、これらは分子量だけでなく、構造、機能、又は性質
などもそれぞれ異なるものである。ストレスへの応答に
加えて、これらのタンパク質の中には構成的に合成され
るものがあり、正常な環境の下で、タンパク質のフォー
ルディング、アンフォールディング、タンパク質サブユ
ニットの会合、タンパク質の膜輸送のような、必須の生
理的な役割を演じていることが示されている。熱ショッ
クタンパク質としてのこれらの機能は、分子シャペロン
と称される。

【０００７】自己免疫疾患の病因に関して注目されてい
ることのひとつに、分子相同性（molecular mimicry)が
ある。すなわち、自己抗原が微生物などの外来抗原と共
通抗原性をもっている場合、微生物感染によって生成さ
れる抗体や感作リンパ球が交叉反応によって自己の組織
を攻撃してしまう結果、自己免疫疾患が発症するものと
考えられている（Atkinson, M. A. et al.: "Sci. A
m.", 263 : 42-49, 1990;Shinha, A. A. et al.: "Scie
nce", 248 : 1380-1388, 1990)。例えば、細菌のＨＳＰ
６０ファミリーに属するタンパク質は、結核、らい病、
梅毒、在郷軍人病、又はライム病などの主たる抗原であ
り（Young, R. A. et al.: "Cell", 59:5-8, 1989)、
かつ、細菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
は強い免疫原性を有し、及び自己の（宿主であるヒト
の）タンパク質との分子相同性を有するために、感染症
がトリガーとなった分子相同性による自己免疫疾患が発
症するものと考えられている。

【０００８】例えば、糖尿病の患者やその家族の血中に
検出される６４ｋＤタンパク質と反応する抗体（６４ｋ
Ｄ自己抗体）はβ細胞特異的であるし、また糖尿病と診
断される直前によく出現しやすい。すなわち、Ｉ型糖尿
病において発症の原因と考えられている膵島細胞抗原
は、分子量６４ｋＤの糖タンパク質（Baekkeskov, S. e
t al.: "Nature", 298 : 167-169, 1982)である。６４
ｋＤタンパク質に対する抗体はヒトの糖尿病のみならず
（Atkinson, M. A. et al.: "Lancet", 335 : 1357-136
0, 1990)、ＢＢラット（Baekkeskov, S. et al.: "Scie
nce", 224 : 1348-1350, 1984)やＮＯＤマウス（Atkins
on, M. A. et al.: "Diabetes", 37: 1587-1590, 1988)
などのように、自然にＩ型糖尿病を発症し、ヒトのＩ型
糖尿病の多くの特徴を示す、Ｉ型糖尿病のモデル動物に
おいても検出される。Ｉ型糖尿病における膵臓β細胞の
６４ｋＤタンパク質は、サイトカインや熱刺激で誘導さ
れるので、熱ショックタンパク質である可能性がある。

【０００９】Ｉ型糖尿病のモデル動物であるＮＯＤマウ
スにおける膵臓ランゲルハンス島β細胞の６４ｋＤタン
パク質は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のＨ
ＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する抗体と
免疫学的に交叉反応性を示す自己抗原であることが示さ
れている。このように、ＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質と６４ｋＤタンパク質自己抗原との間に免疫
学的交叉が観察されることにより、膵臓β細胞の６４ｋ
Ｄタンパク質がＨＳＰ６０ファミリーの一員である可能
性があり、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
エピトープと交叉する自己免疫の機序が、Ｉ型糖尿病の
発症に関与することが示唆されている。また、結核菌の
ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に特異性を有
するＴリンパ球のクローンを移入すると、幼若ＮＯＤマ
ウスにランゲルハンス島炎と高血糖を引き起こす。ま
た、結核菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
を免疫原性のある投与方法、すなわちアジュバントとと
もにＮＯＤマウスに注射すると、糖尿病を早期に発症さ
せ得る（Elias, D. et al.: "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA", 87: 1576-1580, 1990)。マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質に対する動物の免
疫反応がＩ型糖尿病を引き起こすというこれらの事実
は、マイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質に対する抗体と交叉反応する抗原に対する免
疫系による攻撃が、β細胞に障害を与えることを示して
いる。

【００１０】また、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質は、慢性関節リウマチの動物モデルであるラット
のアジュバント関節炎や、ヒトのリウマチ関節炎に関連
していることが知られている。例えば、慢性関節リウマ
チの場合、細菌の菌体タンパク質である熱ショックタン
パク質のなかでもＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパ
ク質は、関節軟骨に存在するプロテオグリカンと分子相
同性をもっていることが明らかとなっている。ラットの
アジュバント関節炎ではＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質反応性Ｔリンパ球の関与が示されている（"C
urr. Top. Microbiol. Immunol.", 145 : 27-83, 198
9)。この疾患は、放射線照射を受けた免疫学的に無防備
の（ｎａｔｉｖｅ）ラットに、結核菌のＨＳＰ６０ファ
ミリーに属するタンパク質に対して反応性のＴリンパ球
のクローンを移入することにより、前記ラットに移すこ
とができることが見出された（"Science", 219 : 56-5
8, 1983; "Nature", 331: 171-173, 1988)。このＴリ
ンパ球は同時に関節のプロテオグリカンとも交叉反応性
を示す（"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 82: 5117-512
0, 1985)。このＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク
質で誘導される調節性Ｔリンパ球は、溶連菌やプリステ
インによる関節炎でも認められている。従って、アジュ
バント関節炎は、抗ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質Ｔリンパ球により引き起こされる自己免疫疾患の
ようである。また、ヒトの若年性関節リウマチでもＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質反応性Ｔリンパ球
の関与が考えられている。

【００１１】また、慢性関節リウマチの患者の滑液中か
らマイコバクテリア由来のＨＳＰ６０ファミリーに属す
るタンパク質に対して、特異的に反応するＴリンパ球が
取り出されている（"Lancet", II: 478-480, 1988; "Na
ture", 339 : 226, 1989; "Annu. Rev. Immunol.", 1
1: 637, 1993)。このように、マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質と交叉反応性を示
すタンパク質が高濃度に慢性関節リウマチの軟骨／パン
ヌス接合部に認められるのに対し、正常な組織や他の疾
患による慢性の炎症を呈する組織においては認められな
い（"Scand. J. Immunol.", 31: 283-288, 1990)。更
に、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する
抗体がヒト及びラットの慢性関節リウマチで検出される
（Kaufmann,S. H. E., et al.: "Immunol. Today", 11:
129-136, 1990)ことからも、慢性関節リウマチの病因
がマイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属するタ
ンパク質と構造の類似した自己抗原に対する自己免疫で
あるという可能性がある。従ってＨＳＰ６０ファミリー
に属するタンパク質に対する免疫応答の存在はラット及
びヒトの両方の関節炎に関連している。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自己免
疫疾患の患者の生理学的状態を有効に改善することがで
き、それらの自己免疫疾患を効果的に治療することので
きる方法を開発するために、ＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質に対して合成抑制作用を示す化合物に関
して種々検討を重ねてきた。その結果、本発明者らは、
意外にも、ブシの成分であるアコニチンが、病態を示す
組織の細胞におけるＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質の合成を特異的に抑制することを見出した。すな
わち、アコニチンを投与することにより、細胞内でのＨ
ＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の合成が抑制さ
れ、従って、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自己
免疫疾患の治療が可能であることを見出したのである。
本発明はこうした知見に基づくものであり、Ｉ型糖尿病
や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患を効果的に治療
することのできる、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質の合成抑制剤を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、アコ
ニチン又はその立体異性体を有効成分として含有するこ
とを特徴とする、分子量５７キロダルトンから６８キロ
ダルトンまでの間の熱ショックタンパク質（すなわち、
ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質）の合成抑制
剤に関する。

【００１４】本明細書において、「ＨＳＰ６０ファミリ
ー」とは、前記のとおり、分子量が５７ｋＤ〜６８ｋＤ
の熱ショックタンパク質群を意味する。また、ＨＳＰ６
０ファミリーに属するタンパク質としては、例えば、Ｈ
ＳＰ６０（すなわち、分子量６０ｋＤの熱ショックタン
パク質）、ＨＳＰ５８（すなわち、分子量５８ｋＤの熱
ショックタンパク質）、ＨＳＰ６５（すなわち、分子量
６５ｋＤの熱ショックタンパク質）、又はＧｒｏＥＬ
（すなわち、原核生物、例えば、大腸菌などの分子量約
６４ｋＤの熱ショックタンパク質）などを挙げることが
できる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤は、有効成分としてアコニチ
ン（ａｃｏｎｉｔｉｎｅ）又はその立体異性体を含有す
る。本発明の合成抑制剤において有効成分として使用す
ることのできるアコニチンは、式（Ｉ）：

【化１】 で表される化合物であり、例えば、ブシ等の生薬に含ま
れている。アコニチンには、立体異性体が存在し、それ
らの任意の純粋の立体異性体又はそれらの混合物を、本
発明の合成抑制剤の有効成分として用いることができ
る。

【００１６】本発明の合成抑制剤に含有されるアコニチ
ンは、化学合成によって、又は天然物から抽出して精製
することによって、調製することができる。あるいは、
市販品を用いてもよい。本発明の合成抑制剤において有
効成分として用いるアコニチンを、天然物から抽出する
場合には、例えば、アコニチンを含有する植物の全体又
は一部分（例えば、全草、葉、根、根茎、茎、根皮、
花、若しくは果実）をそのまま用いて、又は簡単に加工
処理（例えば、乾燥、切断、湯通し、蒸気加熱、若しく
は粉末化）したもの（例えば、生薬）を用いて抽出す
る。抽出条件は一般的に植物抽出に用いられる条件なら
ば特に制限はない。アコニチンを含有する植物として
は、これに限定するものではないが、例えば、カラトリ
カブト（烏頭；Ａｃｏｎｉｔｕｍｃａｒｍｉｃｈａｅｌ
ｉ Ｄｅｂｅａｕｘ）、ヤマトリカブト（Ａｃｏｎｉｔ
ｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ Ｔｈｕｎｂ．）、アコニツ
ム・ブラキポドム（Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｂｒａｃｈｙｐ
ｏｄｕｍ Ｄｉｅｌｓ）、又はアコニツム・クスネゾフ
ィー（Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｋｕｓｎｅｚｏｆｉｉ Ｒｅ
ｉｃｈｂ．）等を使用することができる。

【００１７】本発明におけるアコニチンを生薬から抽出
する場合、これに限定するものではないが、例えば、ブ
シから抽出することが好ましい。ブシ（附子；Ａｃｏｎ
ｉｔｉ ｔｕｂｅｒ；Ａｃｏｎｉｔｅ ｒｏｏｔ）と
は、カラトリカブト、ヤマトリカブト、又は同属植物の
塊根を意味し、それらの部分を単独であるいは任意に組
み合わせて使用することができる。

【００１８】本発明による合成抑制剤において有効成分
として用いることのできるブシ抽出物は、前記のアコニ
チンを含有していればよく、従って、ブシの粗抽出物を
用いることができる。本発明で用いることのできるブシ
抽出物の製造方法としては、ブシを、水（例えば、冷
水、温水、又は熱湯）によって抽出するか、又は有機溶
媒を用いて抽出することによって、得ることができる。
有機溶媒としては、例えば、アルコール（例えば、メチ
ルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコ
ール、イソプロピルアルコール、若しくはブチルアルコ
ール）、エステル（例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、
酢酸プロピル、若しくは酢酸ブチル）、ケトン（例え
ば、アセトン若しくはメチルイソブチルケトン）、エー
テル、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、
トルエン、ベンゼン、炭化水素のハロゲン誘導体（例え
ば、四塩化炭素、ジクロロメタン、若しくはクロロホル
ム）、ピリジン、グリコール（例えば、プロピレングリ
コール、若しくはブチレングリコール）、ポリエチレン
グリコール、又はアセトニトリルなどを用いることがで
き、これらの有機溶媒を単独、又は適宜組み合わせ、一
定の比率で混合し、更には無水又は含水状態で用いるこ
とができる。好ましくは、メチルアルコール及び／又は
クロロホルム等が望ましい。水抽出又は有機溶媒抽出の
方法としては、通常の生薬抽出に用いられる方法を用い
ることができ、例えば、（乾燥）ブシ１重量部に対し、
水又は有機溶媒３〜３００重量部を用いて、攪拌しなが
ら、その沸点以下の温度で加熱還流、常温で超音波抽
出、あるいは冷浸することが望ましい。抽出工程は、通
常は５分〜７日間、好ましくは１０分〜６０時間実施
し、必要に応じて、攪拌等の補助的手段を加えることに
より、抽出時間を短縮することができる。

【００１９】抽出工程終了後、濾過又は遠心分離等の適
当な方法により、水又は有機溶媒抽出液から、不溶物を
分離して粗抽出物を得ることができる。なお、本発明の
合成抑制剤において、天然物より抽出、分画したアコニ
チンを用いる場合には、前記の粗抽出物を特に精製する
ことなく、そのまま使用してもよい。常法による水抽出
物又は有機溶媒抽出物の他に、前記の粗抽出物を各種有
機溶媒又は吸着剤等により、更に処理した精製抽出物
も、本発明の合成抑制剤の有効成分として用いることが
できる。これらの粗抽出物及び各種の精製処理を終えた
精製抽出物を含むブシ抽出物は、抽出したままの溶液を
用いても、溶媒を濃縮したエキスを用いても良いし、溶
媒を留去し乾燥した粉末、更には結晶化して精製したも
の、あるいは粘性のある物質を用いても良く、またそれ
らの希釈液を用いることもできる。こうして得られたブ
シ抽出物は、ブシに含まれるアコニチンを含み、同時に
原料のブシに由来する不純物を含んでいる。

【００２０】本発明の合成抑制剤は、アコニチン、又は
アコニチンを含有する植物の抽出物、例えば、アコニチ
ンを含有する生薬の抽出物（特には、ブシ抽出物）を、
それ単独で、又は好ましくは製剤学的若しくは獣医学的
に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ま
しくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができ
る。投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散
剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマ
ルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の
経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投
与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げる
ことができる。これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、
アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、
乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロ
ース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セル
ロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タル
ク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコー
ル、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸
アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性
剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、
香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防
止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、アコニチン１重量部と乳糖９９重量部とを混合
して充填したカプセル剤などである。

【００２１】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのアコニチン、又はア
コニチンを含有する植物の抽出物、例えば、アコニチン
を含有する生薬の抽出物（特には、ブシ抽出物）の他
に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性
溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶
剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶
解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤な
どを任意に用いることができる。また、本発明の合成抑
制剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法
を用いて投与してもよい。例えば、本発明の合成抑制剤
をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませ
て、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植す
ることができる。

【００２２】本発明の合成抑制剤は、これに限定される
ものではないが、アコニチンを、０．０１〜０．９９重
量％、好ましくは０．１〜０．８０重量％の量で含有す
ることができる。また、アコニチンを含有する植物の抽
出物、例えば、アコニチンを含有する生薬の抽出物（特
には、ブシ抽出物）を有効成分として含有する本発明の
合成抑制剤は、その中に含まれるアコニチンが前記の量
範囲になるように適宜調整して、調製することができ
る。なお、アコニチンを含有する植物の抽出物、例え
ば、アコニチンを含有する生薬の抽出物（特には、ブシ
抽出物）を有効成分として含有する合成抑制剤を、経口
投与用製剤とする場合には、製剤学的に許容することの
できる担体を用いて、製剤化することが好ましい。本発
明の合成抑制剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、
患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法な
どにより異なり、特に制限はないが、アコニチン量とし
て通常成人１人当り１ｍｇ〜１００ｍｇ程度を、１日１
〜４回程度にわけて、経口的に又は非経口的に投与す
る。更に、用途も医薬品に限定されるものではなく、種
々の用途、例えば、機能性食品や健康食品として飲食物
の形で与えることも可能である。

【００２３】

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れるアコニチンは、細胞内のＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質の合成を特異的に抑制する作用があるの
で、前記アコニチンを投与すると細胞でのＨＳＰ６０フ
ァミリーに属するタンパク質の生合成が特異的に減少す
る。従って、前記アコニチンは、ＨＳＰ６０ファミリー
に属するタンパク質がその発症に関連する自己免疫疾
患、例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの予防
及び治療に使用することができる。すなわち、本発明
は、アコニチン又はその立体異性体を有効成分として含
有することを特徴とする、自己免疫疾患治療剤、例え
ば、Ｉ型糖尿病治療剤又は慢性関節リウマチ治療剤にも
関する。また、本発明は、アコニチン又はその立体異性
体を含有する植物の抽出物を有効成分として含有するこ
とを特徴とする、自己免疫疾患治療剤、例えば、Ｉ型糖
尿病治療剤又は慢性関節リウマチ治療剤にも関する。更
に、本発明は、ブシの抽出物を有効成分として含有する
ことを特徴とする、自己免疫疾患治療剤、例えば、Ｉ型
糖尿病治療剤又は慢性関節リウマチ治療剤にも関する。

【００２４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 胃癌細胞株ＫＡＴＯ III （ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０
３）を、１０％非働化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６
４０培地中で、５％二酸化炭素条件下で、熱ショック処
理時以外は、３７℃で培養した。

【００２５】（２）アコニチン処理及び熱ショック処理 播種２日後の胃癌細胞株ＫＡＴＯ III の培地中に、最
終濃度１００μＭになるように前記式（Ｉ）で表される
アコニチン（松浦薬業）を添加し、２４時間培養した。
その後、４５℃にて１５分間熱ショック処理をしてか
ら、３７℃にて終夜培養した。対照試験は、アコニチン
を添加しないこと以外は前記と同様に実施した。

【００２６】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞
を、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／
ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／
ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ／ｌ；以下、
ＰＢＳ（−）と称する〕で洗浄した後、ライシスバッフ
ァー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エ
チルマレイミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペ
プスタチン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。
その後、４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心
を行った。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０
μｌに加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reag
ent Concentrate : バイオラッド，カタログ番号500-00
06）２００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した
後、５９５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行
った。

【００２７】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Natur
e", 283 : pp. 249-256, 1970)にて、等量のタンパク質
を含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング及びそれに
続くブロッキングを行った。すなわち、タンパク質転写
装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-3946）を用いて、室温
にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜
（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）にゲル
を密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッテ
ィングバッファーとしては、０．０２５Ｍトリス及び
０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．５に調整された
トリスグリシンバッファー（Tris Gly Running and Blo
tting Buffer；Enprotech, 米国マサチューセッツ州，
カタログ番号 SA100034)にメチルアルコールを２０％に
なるように加えて調製したバッファーを用いた。ブロッ
ティング後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク
（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、
インキュベートし非特異的結合をブロックした。

【００２８】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、抗ヒトＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体（Stre
ssGen, Victoria, B.C., Canada, カタログ番号 SPA-8
06）により、１次抗体反応を行った。この抗ヒトＨＳＰ
６０マウスモノクローナル抗体は、大腸菌を用いるリコ
ンビナントＤＮＡ法により作製したヒトＨＳＰ６０を免
疫原として作製した抗体であり（"J. Exp. Med." 175
, 1805-1810, 1992)、哺乳類ＨＳＰ６０（霊長類ＨＳ
Ｐ６０、マウスＨＳＰ６０、ラットＨＳＰ６０、及びハ
ムスターＨＳＰ６０）と特異的に反応する（"J. Exp. M
ed." 175 , 1805-1810, 1992)。この抗ヒトＨＳＰ６０
マウスモノクローナル抗体が認識するエピトープは、ヒ
トＨＳＰ６０アミノ酸配列の第３８３番目〜第４４７番
目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中に局在す
る（"J. Exp. Med." 175 , 1805-1810,1992)。１次抗
体反応後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替え
て２回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによっ
て行い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
（バイオ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５
分間ずつ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終
的に、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行っ
た。

【００２９】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（CAPPEL，カタログ番号55550)を、２
％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に
希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２
次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜
に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて
２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッ
キング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）
溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detectionreagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR, カタログ
番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ６
０の有無の検討を行った。

【００３０】その結果、対照試験、すなわち、アコニチ
ンを添加しなかった胃癌細胞株ＫＡＴＯ III では、分
子量約６０ｋＤのバンドが一本検出された。なお、分子
量は、前記抗ヒトＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体
との結合、及び分子量マーカー（卵白オバルブミン及び
ウシ血清アルブミン）により決定した。アコニチンを添
加した胃癌細胞株ＫＡＴＯ III では、対照試験に比べ
て分子量約６０ｋＤのバンドの濃度が有意に薄くなっ
た。すなわち、アコニチンは、ＨＳＰ６０の発現を抑制
する合成抑制剤の活性を有するものと結論することがで
きる。

【００３１】

【発明の効果】以上詳述したように、アコニチンは、細
胞内のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の発現
を抑制する合成抑制剤の活性を有する。従って、アコニ
チンを投与することにより、例えば、ＨＳＰ６０ファミ
リーに属するタンパク質が発症に関与する自己免疫疾患
（例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなど）の患者
の生理学的状態を有効に改善させ、前記病気を効果的に
治療することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｍ 9:00

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アコニチン又はその立体異性体を有効成
   分として含有することを特徴とする、分子量５７キロダ
   ルトンから６８キロダルトンまでの間の熱ショックタン
   パク質の合成抑制剤。
2. 【請求項２】 アコニチン又はその立体異性体を含有す
   る植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴と
   する、分子量５７キロダルトンから６８キロダルトンま
   での間の熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
3. 【請求項３】 ブシの抽出物を有効成分として含有する
   ことを特徴とする、分子量５７キロダルトンから６８キ
   ロダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑制
   剤。