JPH10160730A - 自動分析の方法および装置 - Google Patents

自動分析の方法および装置

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 第１の所定体積の第１の流体と第２の所定体
積の第２の流体とから作られる溶液を調整する方法およ
び装置を提供する。 【解決手段】 第２のハウジングと動作的に接続され且
つ該第２のハウジング内に実質的に配置された、第１の
流体と第２の流体とを収容するための第１のハウジング
に取り付けられたヒータを作動させるステップと、第１
のハウジングへ第２の所定体積の第２の流体を導入する
ステップと、第１の所定時間の間、原動機によって第１
のハウジングを振動させるステップと、第１のハウジン
グへ第１の所定体積の第１の流体を導入するステップ
と、溶液を作るために、第２の所定時間の間、原動機に
よって第１のハウジングを振動させるステップと、溶液
を第１のハウジングから取り出すステップとを具備して
成る方法により達成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】背景 本発明は、一般的に粒子分析に関し、詳細には「インピ
ーダンス」分析、「光散乱」分析、「蛍光」分析および
流動サイトメトリック（cytometric）法の一体化により
自動化血球（blood cell）分析を実施する方法および装
置に関する。また、本発明は、多目的試薬システムおよ
び全血（whole blood）サンプルの迅速分析に関する。
【０００２】ヒトの末梢血液は、通常、赤血球（ＲＢ
Ｃ）、血小板（ＰＬＴ）、白血球（ＷＢＣ）を含み、こ
れらはすべて、一般に血漿と称する導電性媒体中に浮遊
している。血漿は、タンパク質、陰イオン、陽イオンを
含んでいる。また、血漿は、血液凝固を促す成分も含
む。
【０００３】通常、成人の血液には、１立方ミリメート
ル当たりＲＢＣが約４，５００，０００個から５，００
０，０００個含まれている。成熟したRBCには核がな
く、一般に半径約７．５〜８ミクロン、厚さ約１．５〜
１．８ミクロンで両面が凹状になった円盤形をしてい
る。ＲＢＣがヘモグロビンを含むため、血液は赤色にな
る。ヘモグロビンは、酸素および二酸化炭素の運搬を助
けるとともに、血液のｐＨを維持する役目を担ってい
る。
【０００４】通常、成人の血液には、１立方ミリメート
ル当たり血小板が約２００，０００個から４００，００
０個含まれている。血小板は、両面が凸状になった多孔
質（cellular）の小さな粒子であり、大きさが平均７〜
８ミクロンある。一般に、血小板は、均質なマトリック
スに粒状の中央部分が埋め込まれた構造になっている。
【０００５】また、末梢血液には、診断指標として重要
な初期成熟レベルの赤血球が含まれている。このような
赤血球の例として、網赤血球（reticulocytes）と有核
赤血球がある。
【０００６】初期生成段階における赤血球は、主に核か
ら成り、赤芽球（erythroblast）と称される。赤芽球が
成熟するにつれて、核は小さくなり、仁を失って（anuc
leolate）、より球形に近づく。さらに成熟が進むと、
核は完全になくなる。未成熟な赤血球は、核を保持して
おり、有核赤血球（ＮＲＢＣ）と称される。様々な疾病
に罹患している患者の状態を把握する上で、これまでＮ
ＲＢＣのカウントが有効であった。ところが、末梢血液
中のＮＲＢＣに災いされて、白血球数のカウントが不正
確になることが珍しくない。これは、ＮＲＢＣ中に核が
あるため、ＮＲＢＣと小さな白血球の区別がつきにくい
ことが一因である。
【０００７】網赤血球は、成熟レベルがＮＲＢＣと成熟
したＲＢＣとのちょうど中間にあたる赤血球である。網
赤血球は、患者が貧血状態にあるかどうかを判断する手
段となる。貧血は、通常、血液からの赤血球の排出速度
が、赤血球の補充がつかないほど上昇するか、または赤
血球の形成および血液中への放出の速度が低下する結果
として起こる。貧血患者の網赤血球カウントの増加は、
赤血球が迅速に交代している指標であり、急性失血また
は溶血状態を示している。
【０００８】通常の人の血液では、ＷＢＣと称される白
血球の濃度が、赤血球の濃度よりもはるかに低い。ＷＢ
Ｃの正常濃度は、１マイクロリットル当たり約７０００
個である。ＷＢＣの大きさは様々であり、その大半は直
径が約７．５〜１２．５ミクロンである。ＷＢＣは、Ｒ
ＢＣよりも球形に近く、通常、ＲＢＣよりも幾分大き
い。一般にＷＢＣは、粒状のものと、非粒状のものとに
分類できる。粒状のＷＢＣには、好中球、好酸球、およ
び好塩基球の三つがあり、非粒状のＷＢＣには、単核細
胞とリンパ球とがある。これらのＷＢＣを、総称して
「五区分（five-part differential）」と称し、中でも
好中球およびリンパ球が重要である。
【０００９】通常、好中球は、全ＷＢＣの約５０％から
６０％を占める。好中球の細胞質には、染色可能な無数
の微細粒子が含まれている。一定の条件下で、好中球は
血管外に出て分解し、結合組織内に粒子を放出する。こ
の粒子は、ある種の酵素を豊富に含んでおり、この酵素
は活性化して人体の防衛機構に関わる。
【００１０】リンパ球は、ヒトのＷＢＣの約３０％を占
める。正常なリンパ球の核は、細胞の体積ほぼ全体を占
め、したがって、核を取り巻く細胞質は、非常に薄い殻
になっている。リンパ球の細胞質はリボ核酸を含み、こ
のため染料に染まる。
【００１１】リンパ球は血管外に出て、結合組織に入
り、やはり人体の防衛機構の一部を構成し、人体の免疫
反応で主要な役割を果たす。
【００１２】リンパ球には、現在、臨床上重要となって
いる三つの主要な「サブセット(subset)」、すなわち、
Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、および別名「大型粒状リンパ
球」あるいはＮＫ細胞と称するナチュラルキラー細胞
（Natural Killer cells）がある。各サブセットは、特
徴的な細胞表面マーカまたは抗原の有無によって区別さ
れる。またＢリンパ球は、表面の免疫性グロブリン（im
munoglobulin）濃度が高く、これに対してＴリンパ球に
は、免疫性グロブリンがほとんど、あるいはまったくな
い。Ｔリンパ球の特徴は、各種の表面マーカに対抗して
抗体が生成される点である。
【００１３】Ｔリンパ球は、表面マーカおよび全体機能
によって分類されている。「ヘルパー(helper)」Ｔ細胞
は、Ｂ細胞が一定の種類の抗体分子を生成するの助け、
またその他のＴ細胞の免疫反応を促進する。調節細胞で
ある「サプレッサ(suppressor)」Ｔ細胞は、その他のＴ
細胞やＢ細胞の反応性を抑制する。サプレッサＴ細胞に
は、いくつかのサブセットがあり、やはり特徴的な表面
マーカによって識別される。
【００１４】血球数のカウント、血球の大きさの測定、
血球の分類ができれば、ヒトの健康状態を判断する場合
に有用である。例えば、現在、循環ＣＤ４リンパ球（ヘ
ルパーＴ細胞は、細胞の表面にＣＤ４抗原が表現されて
いる）の濃度は、ＨＩＶ感染の指標として最も優れてい
る。ＣＤ４の濃度は、実験的治療への登録についての患
者の分類、抗ウィルス治療の開始時期の決定、臨床試験
の治療効果のモニタリングに利用される。ＣＤ４リンパ
球濃度は、ＨＩＶ感染患者にとって重要であるため、正
確に測定することが望ましい。
【００１５】現在の細胞分析技術には、細胞のカウント
および分類を行う方法が二つある。この二つは、一般に
「流動サイトメトリ(flow cytometry)」、「イメージサ
イトメトリ(image cytometry)」と呼ばれている。流動
サイトメトリ法は、流動セルの感知ゾーンに、1度に一
つずつ細胞を通す操作が主な作業であり、患者の試験負
荷が重要な尺度となる臨床用途に好適な技法である。そ
の大きな理由は、１秒間当たり分析可能な細胞数が少な
くとも１桁大きいからである。
【００１６】流動サイトメトリを組み込んだ計測法は、
さらに二つの方法に分けられ、一般に「従来の血液分析
法(conventional hematology)」と「蛍光サイトメトリ
(fluorescence cytometry)」とに分類される。
【００１７】一般に従来の血液分析法では、主にインピ
ーダンスおよび光散乱技法により大きさと形状のみによ
って細胞を識別するのに対して、蛍光サイトメトリで
は、大きさおよび形状に加えて、細胞の核酸含有量また
は表面の抗原あるいはその両者を利用するのが、二つの
方法の主な違いである。したがって、蛍光法を利用し
て、細胞の種類をさらに細かく分類することができる。
【００１８】前記二つの方法の第二の相違点は、従来の
血液分析法では、結果が絶対値で与えられるのに対し
て、蛍光サイトメトリでは、相対値で結果が出ることで
ある。従来の血液分析器では、体積および希釈度が正確
であり、したがって、細胞濃度の絶対値、または人の血
液１マイクロリットル当たりの細胞数の絶対値が測定で
きる。一方、蛍光サイトメトリ法では、相対濃度、すな
わち、様々な細胞の百分率がわかる。
【００１９】第三の違いは、血液分類法が、一般に自動
化されているのに対して、現在一般的に行われている蛍
光サイトメトリ法では、サンプル作成やサンプル分析が
せいぜい半自動化されている程度である。したがって、
蛍光サイトメトリ法は、従来の血液分析法に比べて作業
集約度が非常に高い。
【００２０】両方法とも、細胞ごとに分析を行う。よっ
て、全血液の細胞濃度が高いため、各細胞を分離し、流
動セル内で感知できるように、分析前に血液サンプルを
希釈する必要がある。
【００２１】自動血液分析を行う装置の例として、Ｃｅ
ｌｌ−Ｄｙｎョ３０００がある。この装置は、Ａｂｂｏ
ｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの前身であるＳｅｑｕ
ｏｉａ−Ｔｕｒｎｅｒが数年前から販売しているもので
ある。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎョ３０００では、「インピーダ
ンス」測定により、ＲＢＣおよびＰＬＴのカウントおよ
び大きさ判定を行い、「吸収」測定によりＲＢＣ（ＭＣ
Ｈ）中のヘモグロビン濃度を求め、さらには「光散乱」
測定によりＷＢＣおよび五区分のカウントおよび分類を
行っている。
【００２２】Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎョ３０００は自動的に血
液サンプルの作成を行い、細胞のパラメータを測定して
試験結果を出す。患者の全血液サンプルが分析装置に供
給されるとオペレータによる操作が実質的に不要になる
ように、サンプル作成は完全に自動化されている。上に
述べたように、種々の細胞について正確な「カウント」
を行うために、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎョ３０００では、サン
プル体積、試薬体積、希釈体積を正確に測定している。
細胞のカウントは、一般に、１マイクロリットルの血液
当たりの「事象(event)」の数ということになる。ここ
でいう事象とは、ＲＢＣ、ＰＬＴ、ＷＢＣ、およびこれ
らのクラス、サブクラスである。
【００２３】その他、血液分析測定を行う装置として
は、Ｃｏｕｌｔｅｒョ ＳＴＫＲ、ＳｙｓｍｅｘョＮＥ80
00、ＴｅｃｈｎｉｃｏｎョＨ−１などがある。これらの
装置では、散乱、インピーダンス、および吸収を組み合
わせて使用して細胞を識別、定量している。したがっ
て、前記の装置は、従来の血液分析装置に分類される。
【００２４】一方、蛍光流動サイトメータ（cytomete
r）では、光散乱による蛍光細胞分析の原理を採用して
いる。このため、一般に、細胞を適当な染料で着色する
か、細胞表面の抗原または抗体に蛍光色素の標識（labe
l）をつけ、特定の抗原抗体反応発生の指標とする必要
がある。
【００２５】蛍光流動サイトメトリでは、前もって着色
または蛍光標識をつけた粒子、通常は細胞を血液その他
の生物的液体サンプルに懸濁させた液体を、焦点を絞っ
た一本または複数本の光ビームでサンプル中の個々の粒
子を照明する流動セル（flowcell）を介して移動させ
る。１基または複数基の検出器で、光ビームと、流動セ
ルを通過する標識済み粒子との間の相互作用を検出す
る。一般に、検出器の一部は、蛍光放出を測定するよう
に設計してあり、その他の検出器は散乱強度またはパル
ス持続時間を測定する。したがって、流動セルを通過す
る各粒子は、検出器で測定した放出色、光の強度、その
他の特徴、すなわち散乱を軸とする特性空間（feature
space）に写像することができる。特性空間内の、重複
がない別々の領域に、サンプル内の様々な粒子を写像す
ることができ、各粒子を特性空間への写像にしたがって
分析できることが好ましい。この点で、流動サイトメト
リは従来の血液分析装置と異なり、特性空間軸の一部に
蛍光放出を含む。
【００２６】上述したように、リンパ球のサブクラス
は、健康状態の判断要素であり、したがって、このサブ
クラスおよびその他のパラメータを正確に測定すること
が望ましい。既知の血液分析装置および蛍光流動サイト
メトリの血液細胞分析能力は、大幅に向上したが、これ
らの装置には、一定のクラスの細胞についての正確なカ
ウント値を求めるのが容易ではないという問題がある。
【００２７】ＣＤ４の患者の細胞カウントは、このよう
な問題をかかえる一例である。現在の計測方法では、血
液分析装置および別の蛍光流動サイトメトリ計測装置で
測定した細胞パラメータからＣＤ４の患者の細胞カウン
トを計算している。この計算では、患者１人について１
週間間隔で行ったＣＤ４の絶対カウントを最大100％ま
で変動させることができる。例えば、1991年、Ｏｒｔｈ
ｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎ
ｃ．発行の Ｕｐｄａｔｅ，Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｉｎ Ｔ
ｈｅ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ，第５巻,No.2の１〜６ペ
ージを参照のこと。
【００２８】以下の論文に、現在の方法および装置を使
ったＣＤ４のカウントに関する上記以外の問題点が述べ
られている。
【００２９】・Ｌａｎｃｅｔ、第３４０巻、１９９２年
８月２２日、４８５ページ 異なる分析装置を利用した場合のＣＤ４カウント結果の
変動について述べている。この変動は、リンパ球のカウ
ント結果が異なったために生じたものと思われる。
【００３０】・Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｕｓ Dｉｓｅａｓｅｓ、１９９０年、第１６１巻、
３５６〜３５７ページ このリンパ球濃度の変動によるＣＤ４カウントの変動に
ついて述べている。リンパ球濃度の変動によって生じた
ＣＤ４カウントの変動は、患者の意欲に悪影響を及ぼ
す。
【００３１】・Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｃｑｕｉｒｅ
ｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒ
ｏｍｅｓ、１９９０年、第３巻、Ｎｏ. ２、１４４〜１
８１ページ ＨＩＶ陽性被験者と対照被験者について、ＣＤ４カウン
トが大きく変動したと報じている。ＣＤ４陽性のリンパ
球の割合は、比較的一定しているのに対して、ＷＢＣカ
ウントおよびリンパ球であるＷＢＣの割合は大きく変動
する。この変動は、標準的な分析方法が必要であること
を示している。
【００３２】・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ、１９８３年８月、第１４巻、Ｎｏ. ８、５０９〜５
１４ページ 自動血液分析装置における様々な誤測定およびその原因
について述べている。
【００３３】上記の各参照論文の開示全体を、参照によ
り本明細書に組み込むものとする。
【００３４】手作業によるサンプル作成は、厳密な管理
が不可能であり、オペレータの技能に左右されること
が、ＣＤ４カウントの変動原因の一つとしてあげられ
る。例えば、ＣＤ４のカウントを行う従来の方法では、
まず手始めに患者から試験管二本分の血液を採取する。
一方の試験管は血液分析装置にかけ、リンパ球の総カウ
ント、リンパ球のパーセンテージ、および総ＷＢＣカウ
ントを初めとして、血液サンプルに関するいくつかの測
定パラメータまたは計算パラメータあるいはその両者を
求める。二本目の試験管の血液サンプルは、蛍光流動サ
イトメトリ装置にかけて分析する。流動サイトメトリ試
験のサンプル作成作業は、手間がかかる作業であり、オ
ペレータの技能に左右される。この作業は、自動化や高
精度測定にはなじみにくいものである。
【００３５】流動サイトメトリ装置用のサンプルを作成
する場合、ピペットを使い、手作業によりサンプル用試
験管から分析用試験管に血液を移す。適切な蛍光色素標
識済みモノクロナール（monoclonal）抗体を添加する。
次にサンプル／抗体混合物を所定時間、所定温度でイン
キュベート（incubate）し、抗体／抗原結合が起こるよ
うにする。インキュベーションによる作業終了後、ＲＢ
Ｃ溶解剤を添加して、サンプル中のＲＢＣを破壊する。
溶解作業中はタイミングが重要である。十分な時間だけ
溶解反応を持続できない場合には、ＲＢＣがサンプル中
に残り、測定値にひずみが出る。溶解反応の継続時間が
長すぎる場合は、溶解剤がＷＢＣを侵す場合がある。
【００３６】溶解反応が完全に終了したことを確認した
後、サンプルを遠心分離し、洗浄して、溶解したＲＢＣ
により残った堆積物を除去する。サンプルが十分に清浄
になったことを確認するまで、遠心分離／洗浄作業を数
回実施する場合もある。堆積物、すなわち赤血球の「基
質(stroma)」は、通常の流動サイトメータの検出動作に
干渉する。ここまでで、サンプルにはＷＢＣが含まれる
ようになっており、抗体は、相補性表面抗原（compleme
ntary surface antigen）を備えた細胞に結合されてい
る。サンプルを固定液に再度懸濁してから、蛍光流動サ
イトメトリ装置に通す。
【００３７】蛍光流動サイトメトリ装置は、リンパ球サ
ブセットについては、百分率だけを計測する。サンプル
作成作業中に何度も手作業による希釈および減容作業を
実施するため、正確な測定体積の分離ができないという
ことが、百分率だけしか計測しない少なくとも一つの理
由になっている。したがって、蛍光流動サイトメトリ装
置は、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカ）とＣＤ４（ヘルパーＴマ
ーカ）の両方について陽性なリンパ球の百分率としてＣ
Ｄ４陽性ヘルパーＴ細胞を識別する。
【００３８】ＣＤ４のカウントを以下に式により算出す
る。
【００３９】（リンパ球の百分率／１００）×（ＷＢＣ
のカウント）＝リンパ球カウント （リンパ球内のヘルパーＴ細胞の百分率／１００）×リ
ンパ球カウント＝ＣＤ４カウント リンパ球のカウントおよびＷＢＣのカウントは、血液分
析計測装置により測定し、「リンパ球内のヘルパーＴ細
胞の百分率」の値は、流動サイトメータによる散乱およ
び蛍光の写像に基づく補正係数を掛けた後、蛍光装置で
測定する。
【００４０】リンパ球サブセットに関してカウント値を
計算する現在の方法には、いくつか問題点がある。まず
第一に、計算が、それぞれ独自の較正機能および全体分
離機能を備えた独立した測定装置で得られた値に基づい
ている。さらに、異なる計測装置により、試験方法が異
なる。
【００４１】血液分析計測装置の測定値が蛍光測定装置
の測定値と異なるだけでなく、血液分析装置が異なる
と、得られる結果も変わることがある。
【００４２】蛍光サイトメトリ試験におけるサンプル作
成の自動化の試みがこれまで行われてきたが、部分的に
しか成功していない。このようなシステムでは、密度勾
配遠心法による、その他の末梢血球からのリンパ球の分
離または赤血球の溶解あるいはその両方、遠心分離によ
る赤血球ゴースト（ghost）および細胞堆積物の除去、
適切な固定液を含有する等張性（isotonic）生理食塩水
に白血球を懸濁することによる残留白血球の形態の保全
などのサンプル作成作業を今だにオペレータが行わなけ
ればならない。これらの操作を行うには、オペレータが
手作業によりサンプルの体積を変化させ、自動機械式分
与装置で得られるサンプル体積精度に近い精度をだす必
要がある。
【００４３】独立した測定装置で測定を行う現在の技法
の問題点としてさらにあげられるのは、試験管二本を満
たすのに、比較的多量の血液が必要になることである。
これは、採取量が増えるほど、溶血（赤血球の破壊）を
起こす可能性が高くなるからである。また、一定の患者
からは、試験管二本分の採血を行わないほうが望ましい
場合や、採血が不可能な場合がある。
【００４４】白血球の分析では、ＲＢＣをすべて溶解す
ることが望ましい。ＲＢＣの数は、ＷＢＣを約７００か
ら１０００倍上回るため、少数の非溶解赤血球によって
白血球のカウントが大幅に狂う場合がある。赤血球の溶
解に利用する試薬の中には、インキュベーション期間が
長すぎて自動臨床分析装置では実用にならないものもあ
る。たとえば、K．Ａ．ＭｕｒｉｈｅａｄがＣｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ａｎｎ．N．Y．Ａｃｄ．
Ｓｃｉ、第４６８巻、１１３〜１２７ページ（１９８６
年）で推奨しているＴｒｉｓ緩衝塩化アンモニウム溶液
では、赤血球を溶解するには５分から１０分必要であ
り、自動化には不向きである。
【００４５】さらに、ある溶解試薬で不完全な溶血を行
うと、自動臨床電気光学システムのバックグラウンドカ
ウントが高くなるほどのヘモグロビンおよび粒状物質を
含む赤血球基質が生成する場合がある。通常、このよう
な基質が発生すると、分析対象であるＷＢＣを遠心分離
によって赤血球の基質から分離する必要があり、この操
作は、自動化に試薬システムを採用した場合の制約因子
となる。
【００４６】現在使用されている試薬システムでは、固
定したＷＢＣを鑑別分析（differential analysis）前
に細胞化学的に着色する必要がある。このような試薬シ
ステムでは、複数の試薬およびインキュベーション期間
を適当な時期に追加する必要があり、有核赤血球または
リンパ球サブセットの定量には一般的に適用できない場
合がある。さらに、最終的に得られたカウントの精度
が、試薬の添加、その他、血液サンプルの取り扱い操作
の各段階で低下する場合がある。
【００４７】溶解によってＮＲＢＣの核が破壊されない
ため、従来の血液分析装置による分析で、ＲＢＣの初期
段階である有核赤血球ＮＲＢＣが末梢血液から発見され
た場合、ＮＲＢＣを小さなリンパ球と混同することもあ
りえる。ＮＲＢＣの百分率が比較的低くても、ＲＢＣと
ＷＢＣとの数の比の影響により、ＷＢＣおよびリンパ球
のカウントに大きな誤差がでることがある。こうなる
と、新生児のサンプルや子供のサンプルでは障害にな
る。通常、新生児や子供の末梢血液サンプルにはＮＲＢ
Ｃが含まれる。このため、実験室では、新生児や子供の
サンプルの一部については、手作業によるスライド検査
を行う。従来の血液分析装置では、通常のリンパ球散乱
クラスタ（cluster）の展開に注目することにより、前
記のサンプルにフラグ（flag）を付けることしかできな
い。手作業の検査では、有核細胞１００個当たりのＮＲ
ＢＣの数がわかる。この百分率を利用して、以下のよう
に分析装置によるＷＢＣカウントを補正する。
【００４８】補正ＷＢＣカウント＝分析装置のカウント
（１−手作業により求めたＮＲＢＣ百分率／１００） ＮＲＢＣのカウントを正確かつ自動的に行う必要がある
ことは明らかである。
【００４９】そのほか、未成熟赤血球の一種として重要
なものに、「網赤血球」があり、この赤血球には、通
常、検出可能な量のＲＮＡが含まれている。手作業によ
り網赤血球を特定し、その数を数える方法では、染料で
ＲＮＡを沈殿させる必要がある。着色した血液から塗抹
標本（smear）を取り、手作業により顕微鏡で調べる。
沈殿させたＲＮＡは、細胞内の点または繊状として現わ
れる。顕微鏡下でＲＢＣを１０００個手作業により数
え、網赤血球となるＲＢＣの数を１０で割って網赤血球
の百分率を求める。以下の式により、ＲＢＣのカウント
から網赤血球のカウントを求める。
【００５０】網赤血球のカウント＝（ＲＢＣのカウン
ト）×（網状赤血球の百分率）／１００ 手作業によるこの方法の精度と確度は、理想には及ばな
い。網赤血球特定の可否やカウント技術のばらつきがか
なりある。したがって、上に述べた欠陥を解消する細胞
分析システムが必要である。
【００５１】発明の概要 全血液サンプルを分析する装置を提供する。この装置
は、サンプル中の細胞を分離し、識別する自動計測シス
テムであって、蛍光サイトメトリ分析装置と完全に一体
化した従来の血液分析装置を備えている。両分析装置
は、各分析装置から得られる分析結果を利用する制御装
置によって制御し、試験結果の絶対値報告、すなわち定
量報告を行う。さらに、全血液サンプルを分析する方法
も提供する。このような分析方法には、サンプルに対し
て従来の血液分析と蛍光サイトメトリ分析の両方を自動
的に実施する段階を含む方法もある。データを収集して
利用し、適宜、結果を定量報告する。
【００５２】さらに別の実施の形態では、サンプル容器
を受け取り、サンプルを吸引して、分与するサンプルハ
ンドラ、多角度光散乱および蛍光信号検出を行うサンプ
ル分析装置、および分析装置を完全に一体化した制御装
置を備える自動化計測システムを提供し、この計測シス
テムにより、従来の血液分析結果と蛍光サイトメトリ結
果の両方を定量報告できるようにするものである。さら
にこの計測システムによれば、一旦、報告メニューか
ら、実施予定の一連の試験を選択すると、必要な場合に
は順次以上の機能を実行することができ、オペレータが
作業に介入する必要がなく、また分析のある段階でサン
プルから細胞を分離する必要もない。
【００５３】好ましい実施の形態の詳細な説明 本発明の実施の形態は、分析装置システムおよび液体サ
ンプルの分析方法を含む。一般に、このような自動化計
測システムは、制御装置および蛍光サイトメータと完全
に一体化された従来の血液分析装置を備えている。計測
システムは、細胞の識別および分類を行うことができ、
血液分析装置で収集したデータを蛍光サイトメータで自
動的に利用してサンプルの処理、分析およびサンプル中
の細胞の分類を行い、定量的な結果と定性的な結果を報
告する。
【００５４】本明細書で開示する自動測定システムで
は、一つの分析装置プラットフォーム（platform）上で
従来の血液分析と蛍光サイトメトリとを組み合わせて実
施する。本発明以前には、従来の血液分析と蛍光サイト
メトリとを組み合わせることは不可能であった。このよ
うにして従来の血液分析と蛍光サイトメトリとを組み合
わせることは、双方にとって好都合である。蛍光サイト
メトリによって得られる情報は、完全な自動化および絶
対濃度の採用により向上する。血液分析によって得られ
る情報は、熱量測定、インピーダンス、および多角光散
乱の技術に蛍光サイトメトリを追加することによってよ
り向上し、すぐれた血液分析、および現在、手作業また
は独立した分析装置で行っている試験の完全自動化が可
能となる。
【００５５】本明細書による自動化には、サンプル、す
なわち全血、尿、唾液などを一度装置に導入してしまう
と、オペレータはサンプル作成作業やサンプル分析作業
に介入する必要がないという特徴がある。さらに、サン
プルの取り扱い、処理、および分析の手順および機能
は、オペレータが選択した試験にしたがって、測定装置
が自動的に実施する。各初期試験サンプルに関連したデ
ータ、その他の情報については、計測器の制御装置によ
りモニタリング、収集、および処理が行われる。
【００５６】一般に、本発明の実施の形態は、自動血液
分析装置と、流動サイトメトリ分析装置とを備え、この
流動サイトメトリ分析装置は、分析装置の監視および制
御、分析装置からのデータ収集および分析結果の報告を
行う制御装置と一体化されている。例示するように、分
析装置と制御装置とを一体化してあるので、オペレータ
は、全血サンプルに関するデータを制御装置に入力する
ことができる。制御装置により、オペレータは、サンプ
ル、一般的には全血サンプルに対して行う一連の試験を
選択する。オペレータは、集中サンプル取り扱い領域、
すなわち処理領域にある総合分析装置（integrated ana
lyzer）に全血サンプルをかける。制御装置により分析
装置が起動し、制御装置の指示にしたがって自動的に全
血サンプルの分析を行う。制御装置は、分析装置から得
られたデータを利用して分析結果を算出し、オペレータ
に対して分析結果を報告する。全血サンプルを総合分析
装置に導入した後は、オペレータが分析作業を行う必要
はない点に注意されたい。好ましい実施の形態では、全
血サンプルの作成が完全に自動化されているので、従来
の血液分析試験が最初に行われ、続いてインキュベート
されたサンプル試験が行われる。分析装置は制御装置と
一体化されているため、制御装置は、血液分析装置と、
流動サイトメトリ分析装置の両方からデータを受け取
る。したがって、制御装置は、両装置の患者の血液分析
結果を組み合わせてオペレータに報告することができ
る。さらに、希釈、サンプル作成、および分析の精度が
高く、これらの作業を自動的に繰り返し行うことができ
るため、絶対濃度も報告可能である。オペレータが測定
装置のプログラムを行い、サンプルを装置に導入した後
は、測定装置だけがサンプルに触れることになるので、
人為的ミスは完全に払拭されている。
【００５７】本発明の具体的な実施の形態については、
詳細な説明を行い内容を明らかにするが、その他の実施
の形態も可能であることを銘記されたい。また、記載し
た実施の形態の要素を適宜組み合わせることもできる。
【００５８】１．システムの概要 図１は、細胞分析システム６０のブロック線図である。
このシステム６０は、分析装置モジュール６４、データ
ステーション（data station）ジュール６８、および圧
縮空気ユニット７２を備えている。分析装置モジュール
６４は、ＨＤＬＣ（高レベルデータリンク）プロトコル
を実行するシリアルデータリンク（link)７６により、
データステーションモジュール６８と作動可能に接続さ
れている。圧縮空気ユニット７２は、シリアルデータリ
ンク８４および管路ネットワーク８０により、分析装置
モジュール６４と作動可能に接続されている。
【００５９】分析装置モジュール６４が行う作業として
は、サンプル、希釈液、および試薬の吸引、サンプルの
希釈、データの測定、収集、データステーションモジュ
ール６８への測定データの送信、試薬の管理、不要物の
廃棄がある。典型的な分析装置モジュール６４が備えて
いる要素としては、専用電源、インピーダンストランス
デューサ、ＨＧＢトランスデューサ、光流動セルトラン
スデューサ（光散乱および蛍光）、光検出装置、電子装
置、試薬槽、フルイディクス（fluidics）システム、血
液分析試験および蛍光サイトメトリ試験用の全自動総合
サンプルプロセッサ、インキュベーションシステムまた
は冷却システムあるいはその両方などがある。代表的な
分析装置モジュールは、Ｍｏｔｏｒｏｌａ製６８３０２
型マイクロコンピュータなどを含み、分析装置６４の機
械要素の制御および分析装置のフローシーケンスの実行
を行う。
【００６０】圧縮空気ユニット７２は、液体を分析装置
モジュール６４に移動する空気源を内蔵している。圧縮
空気ユニット７２は、シリアルデータリンク８４を介し
て分析装置モジュール６４から指示を受ける。
【００６１】データステーションモジュール６８は、分
析装置モジュール６４の全般的制御を行い、測定データ
を有意味な試験結果に変換し、測定データおよび試験結
果を保存するとともに、報告値をプリントし、オフライ
ンのホストコンピュータ（図示せず）と双方向の通信を
行う。代表的なデータステーションモジュール６８の構
成要素には、８０３８６型または８０４８６型のマイク
ロコンピュータ、カラーディスプレイ、３．５インチデ
ィスクドライブ、少なくとも５４０メガバイトのハード
ディスク、パソコン型キーボード、ポインティング装
置、およびＬＡＮ接続などがある。データステーション
６８は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＳＲＡＭなどの
メモリを含み、測定データの操作、パラメータの計算、
およびヒストグラム、撒布図、その他の多次元プロット
を含め、各種フォーマットによる計算結果の報告を行え
るだけのソフトウェアアルゴリズムを備えている。
【００６２】２．迅速溶解多目的試薬システム 細胞分析システム６０では、白血球（ＷＢＣ）や有核赤
血球（ＮＲＢＣ）を初めとする有核末梢血球の迅速な分
析に適した多目的試薬システムを採用している。多目的
試薬システムは、ほぼ完全かつ迅速に赤血球を溶解する
と同時に、白血球の構造およびリンパ球表面抗原の抗原
性を実質上保存する。
【００６３】多目的試薬システムについては、本出願の
譲受人が所有する１９９４年８月２９日出願の「Ｍｕｌ
ｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ
Ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ
Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ（全血サンプルの迅速溶解
を目的とした多目的試薬システム）」と題する米国特許
出願第０８／２９７６６２号に詳細な記載がある。この
出願の開示全体を、参照により本明細書に組み込む。
【００６４】多目的試薬システムの一つの実施の形態
は、１リットル当たり約３〜約７グラムの非第四アンモ
ニウム塩、炭素原子１個ないし４個を備えた脂肪族アル
デヒド（aliphatic aldehyde）約０．０４〜約０．１重
量体積％（すなわち、グラム／１００ｍｌ）、脂肪族ア
ルデヒドに対してほぼ不活性な非リン酸塩緩衝液約１０
〜２０ｍＭ、および水を含む。試薬システムのｐＨは、
約５．５〜約７．５の範囲にあり、試薬システムの浸透
圧モル濃度（osmolality）は、約１６０から約３１０
（ｍＯｓｍ／Ｌ）である。試薬システムの屈折率は生理
食塩水と同じであり、約１．３３３から約１．３３６の
範囲にあることが好ましい。非リン酸塩緩衝液は、脂肪
酸アルデヒドに対して不活性である。すなわち、非リン
酸塩緩衝液は脂肪族アルデヒドと反応しない。したがっ
て、一般に、非リン酸塩緩衝液は一級アミノ基を含有し
ないはずである。
【００６５】多目的試薬システムのさらに別の実施の形
態は、塩化アンモニウム約１３５ｍＭ、ホルムアルデヒ
ド約０．０７５体積％、酢酸塩緩衝液約２０ｍＭ、重炭
酸カリウム約１０ｍＭ、サポ ニン（saponin）約
０．０１重量体積％（すなわち、グラム／１００ｍｌ）
などを含む。試薬システムのｐＨは、約６．２に調整
し、試薬システムの浸透圧モル濃度は、約２６７ないし
約２７０ｍＯｓｍ／Ｌに調整する。
【００６６】白血球の鑑別カウント、有核赤血球、リン
パ球の免疫表現型(immunophenotyping)の自動決定には
多目的試薬システムを使用する。有核末梢全血球の迅速
分析法は手順として、前記多目的試薬システムと抗凝固
化(anticoagulated)全血サンプルとを混合（血液を１０
倍から１００倍に希釈）する段階、温度２５〜４６℃に
おいて希釈液と血液との混合物を少なくとも１０秒間撹
拌する段階、および本発明による自動化細胞分析システ
ムにより有核末梢血球を分析する段階を含む。
【００６７】末梢白血球の鑑別分析で多目的試薬システ
ムを使用する方法は、試薬１種類により赤血球の溶解と
白血球の固定とを並行して迅速に行う方法であり、この
方法では、白血球が光散乱特性を維持する。一般に、細
胞は光学的な観測チャンバを通過する。このチャンバで
は、所定の角度で各細胞が吸収または散乱した光の種類
を光電測定により記録する。
【００６８】多目的試薬システムの最初の構成要素は、
非第四アンモニウム塩である。ジアンモニウム塩および
トリアンモニウム塩は使用しないことが好ましい。各種
モノアンモニウム塩、特にハロゲン化塩を、１リットル
当たり約３グラムから約７グラム使用することができ、
好ましくは１リットル当たり約５グラムとする。このよ
うな非第四アンモニウム塩の例としては、ＮＨ4Ｘがあ
る。式中、Ｘはハロゲン元素を示す。例えば、ＮＨ4Ｃ
ｌなどが非第四アンモニウム塩に当たる。
【００６９】多目的試薬システムの第二の構成要素とし
て、短鎖脂肪族アルデヒドがある。このような脂肪族ア
ルデヒドは、炭素原子を１個から４個有することが好ま
しい。代表的なアルデヒドとしては、ホルムアルデヒド
およびポリマのパラホルムアルデヒドがある。比と濃度
が適切な場合、アルデヒドは、非第四モノアンモニウム
塩および緩衝液と一体となって、迅速かつほぼ完全に赤
血球を溶解する。さらに、アルデヒドは、白血球を固定
し、白血球の薄膜をほぼ完全に保護する。ホルムアルデ
ヒド、またこれに匹敵するアルデヒドの含有量は、約
０．０４〜約０．１０体積％、好ましくは０．０８〜
０．１体積％である。
【００７０】多目的試薬システムの第三の構成要素は、
非リン酸塩緩衝液であり、この液は試薬システムの構成
要素であるアルデヒドに対してほぼ不活性である。した
がって、緩衝液は、一次アミノ基を含有しない。緩衝液
は、有効緩衝力がｐＨ約６．０から約７．５、浸透圧モ
ル濃度が約２３０から約３１０（ｍＯｓｍ／Ｌ）となる
のがよい。効果的な有機緩衝液の例としては、酢酸塩緩
衝液、琥珀酸塩緩衝液、マレイン酸塩緩衝液、およびク
エン酸塩緩衝液などがある。効果的な生物緩衝液の例と
しては、２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸（Ｍ
ＥＳ）緩衝液、３−（Ｎ−モルホリン）プロパンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシル）ピ
ペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）ＨＥＰＥＳ
緩衝液などがある。酢酸塩緩衝液、またはその他の適当
な緩衝液の濃度は、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、好まし
くは約２０ｍＭである。
【００７１】多目的血液希釈液の選択可能成分として、
表面活性剤がある。表面活性剤としては、サポニンが好
ましく、これはｑｕｉｌｌａｊａの木の皮などの抽出源
から分離され、パウダとして製品化されている植物抽出
物である。製品化されているサポニンの化学的純度は、
ロットごとに異なるが、サポニンは第四アンモニウム塩
よりも赤血球に対して選択的に作用する傾向が強い。サ
ポニンなどの表面活性剤の含有量は約１０〜約２００ｍ
ｇ／Ｌ、好ましくは約１００ｍｇ／Ｌである。サポニン
は、多目的試薬システムのその他の成分と一体となっ
て、全血中の赤血球をほぼ完全に溶解する。
【００７２】通常の血液サンプルの赤血球部分は、周囲
温度で約２０秒以内に溶解される。ところが、溶解が困
難な血液サンプル（例えば、嬰児、腎臓透析患者、多発
性骨髄腫患者、糖尿病患者、尿毒症患者などから採取し
た血液サンプル）は、試薬システムとともに最長約２０
秒、約３８℃から約４０℃の温度に保ち、完全に赤血球
を溶解する必要がある。血液サンプルを多目的試薬シス
テムとあわせて、この程度の温度にインキュベートして
も、白血球の薄膜が効果的に保護され、リンパ球表面の
抗原の働きが維持される。一方、サポニンだけを赤血球
の溶解に使用した場合、上記の濃度の約１０倍から２０
倍の濃度で使用する必要がある。このような濃度になる
と、白血球が損傷を受ける可能性があるため、試薬の溶
解作用を素早く抑制して白血球の構造を保護しなければ
ならない。多目的試薬システムの構成成分が一体となっ
て、赤血球を溶解すると同時に白血球を穏やかに固定す
るのが、この試薬システムの実施の形態の特徴である。
したがって、比較的長いインキュベーション期間でも、
白血球はほぼ完全に保護される。実際、例えば慢性リン
パ球白血病患者などに見られる、損傷しやすい白血球
が、最長約２０分のインキュベーション期間中、多目的
試薬システム内で安定化される。
【００７３】多目的試薬システムの任意の追加成分とし
ては、アルカリ塩があり、重炭酸塩の一価のアルカリ塩
が好ましい。重炭酸塩の一価のアルカリ塩は、希釈液の
不可欠な要素ではないが、このアルカリ塩を希釈液に添
加すると、試薬システムの赤血球溶解性を低下させるこ
となく浸透圧モル濃度を高めることができる。その他多
数の化合物、例えば、塩化ナトリウム緩衝液、塩化カリ
ウム緩衝液、リン酸塩緩衝液などは、試薬システムの浸
透圧モル濃度を上昇させるのに使用した場合、試薬シス
テムの溶解性を低下させる。重炭酸塩の代表的な一価の
アルカリ塩には、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、
重炭酸リチウムなどがある。重炭酸カリウム、その他の
アルカリ重炭酸塩の含有量は、約０．００５〜約０．０
１５重量体積％、好ましくは、約０．０１重量体積％で
ある。
【００７４】多目的試薬システムの、さらに別の任意成
分として、血小板抗凝集（anti-clumping）剤がある。
例えば、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）を試薬
システムに添加してサンプル／試薬混合物内での血小板
の凝集を弱めることができる。ＥＤＴＡ四ナトリウム、
またはその他のＥＤＴＡ塩の含有量は、１リットル当た
り約２０〜約２００ｍｇ、好ましくは、１リットル当た
り約１００ｍｇである。
【００７５】多目的試薬システムのさらに別の実施の形
態では、リンパ球の部分母集団（subpopulation）の定
量分析についても配慮している。多目的試薬システムま
たは血液希釈液を添加する前に、（特定のリンパ球表面
抗原を対象とした）フルオロクロム共役モノクロナール
（fluorochrome-conjugated monoclonal）抗体を全血サ
ンプルと混合して、リンパ球の下位分類を行う。血液サ
ンプルに添加した標識済み抗体部分の濃度は、個々の抗
体製剤によって異なるが、一般に、市販の抗体製剤につ
いては、血液の体積の１／２から１／１０である。試薬
システムを添加し、赤血球を溶解した後、リンパ球−抗
体反応の生成物を自動流動サイトメトリシステムにかけ
て分析する。当技術分野で一般的になっている遠心分離
および洗浄により、溶解済み細胞からリンパ球を「分
離」する必要はない。
【００７６】本明細書に開示する試薬システムは、イソ
チオシアン酸フルオレッセン(fluorescein isothiocyan
ate)（ＦＩＴＣ）およびフィコエリトリン(phycoerythr
in)（ＰＥ）など、抗体にフルオロクロム標識を付ける
蛍光マーカを「抑制(quench)」することはない。リンパ
球の下位分類は、ＡＩＤＳなどの疾病の治療における診
断手段となっている。リンパ球の部分母集団や単球や好
中球など、その他の白血球部分の表面要素や特性を把握
することと併せて、血球母集団に付着した表面マーカを
識別できる能力が重要である。
【００７７】３．有核赤血球の識別と試薬 細胞分析システム６０では、先に述べた迅速溶解試薬シ
ステムなど、溶解試薬による独自の三重トリガ法（trip
le triggering method）を利用した、全血サンプル中の
ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮＲＢＣの自動同時分析法を採
用している。１９９４年１２月１５日出願の「Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｉｍｕｌｔａｎ
ｅｏｕｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｔｅ
ｄ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ（有核赤血球の迅
速同時分析法）」と題する米国特許出願第０８／３５６
９３２号に記載されている前記方法によれば、ＮＲＢＣ
を含む全血サンプルからＮＲＢＣの正確なカウントおよ
びＷＢＣ／Ｄｉｆｆデータを同時に求めることが可能に
なる。米国特許出願第０８／３５６９３２号の内容をす
べて参照により本明細書に組み込むものとする。
【００７８】ＮＲＢＣ法の要点は、堆積物（蛍光および
非蛍光堆積物）から発生する信号を三重トリガ法によっ
て阻止し、ＡＬＬトリガ以下でＦＬ３トリガ以上の信号
を識別し、ＮＲＢＣとしてカウントすることができる点
である。したがって、蛍光核堆積物の影響がほとんどな
い正確なＮＲＢＣカウントを求めることができる。本発
明の方法を利用すれば、損傷を受けやすい芽細胞（blas
t cell）および死細胞（非発芽可能細胞）も検出するこ
とができる。
【００７９】三重トリガ法では、ＮＲＢＣの裸核を染色
する適切な核染料を添加した血液希釈液と血液サンプル
とを混合することによって、ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮ
ＲＢＣのカウントを同時に行うことが可能である。前記
の血液希釈液は、迅速にＲＢＣを分解し、ＷＢＣを保護
する。このような希釈液については、上に述べた。照明
を施した光流動セルに、一度にほぼ細胞１個ずつの割合
で希釈液／サンプル混合物を通す。この操作により、細
胞が照明光を散乱し、染色されている核は蛍光を発す
る。散乱光信号および蛍光信号は既知の手段で検出す
る。検出信号の処理に三重トリガ法を併用して、ＷＢ
Ｃ、ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ、およびＮＲＢＣの識別および定
量を行うことができる。
【００８０】三重トリガ法の他に類を見ない特徴は、溶
解済みの網赤血球から出たＲＮＡ、ハウエル−ジョリー
小体（Howell Jolly Body）、網状血小板、大型血小
板、ＷＢＣと巨核球の断片（Megakaryocytic fragmen
t）から出たＤＮＡ、パラサイト（parasite）、ＲＢＣ
の断片など、その他の細胞堆積物の干渉を受けずに、Ｗ
ＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣの自動同時分析を正確、迅速
に行える点である。
【００８１】三重トリガ法によれば、ＮＲＢＣとして特
定された信号からＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析前にＷＢＣ信号
全体を差し引くことにより、ＮＲＢＣを含む血液サンプ
ル中のＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を正確に行うことができ
る。ＮＲＢＣを染色するには、染料が１種類だけ必要で
ある。ＷＢＣの下位分類の光散乱特性の違いにより、Ｗ
ＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を行うことができる。
【００８２】ＮＲＢＣ法では、軸光損失(Axial Light L
oss)（ＡＬＬ）、中間角散乱(Intermediate Angle Scat
ter)（ＩＡＳ）、赤色蛍光（ＦＬ３）の３次元空間内に
おいて、独自の三重トリガ法により、上記の目的をすべ
て達成する。
【００８３】ＮＲＢＣ法を行うには、順方向中間角散乱
（ＩＡＳ）３８４と、微小角順方向散乱（ＳＡＳ）また
は軸光損失（ＡＬＬ、別名、順方向吸光(forward extin
ction)）３８２とを測定するために、１基または複数基
の検出器３８０（図１９、図２０、および図２１）を順
方向光路に配置することが好ましい。
【００８４】レーザビームの前方を通過し、フォトダイ
オードによって検出される細胞に起因する光エネルギー
の減少が、通常、ＡＬＬである。光損失は、一般に散乱
が原因で起こり、その定義は、「レーザビーム内を細胞
が通過するために生じる、レーザビームの光路内の検出
器に到達する光エネルギーの減少」である（一般にＡＬ
Ｌは、約０°ないし約１°の角度で検出される）。一
方、微小角順方向散乱（ＳＡＳ）は、レーザビームを通
過する細胞による散乱によって、入射レーザビームの外
側（ただし、１°ないし３°の微小角の範囲内）の検出
器に達する光エネルギーである。レーザビームが検出器
に進入しないようにするには、一般に、ビームストップ
を設ける。ＡＬＬ測定システムは、レーザ照明の入射円
錐内の光を集光するのに対して、微小角散乱システム
は、前記円錐外の光を集光する。ＡＬＬ測定システムで
は、対象とする信号が、定常状態のレーザ信号から差し
引かれる負の信号であるのに対して、微小角順方向散乱
測定の信号は、非常に低い背景光レベルにおける微小な
正の信号である。中間角順方向散乱（ＩＡＳ）は、微小
角順方向散乱に類似しているが、光が入射レーザビーム
から大きな角度で散乱される点が異なる。さらに具体的
に述べると、ＩＡＳは、レーザビームの入射線すなわち
中心線から約３°ないし１０°のリング内で散乱される
光に関係している。好ましい実施の形態では、レーザの
軸から水平方向約０．３°未満、垂直方向約１．２°未
満の角度の範囲内でＡＬＬが集光され、レーザの軸から
約３°ないし約１０°の角度でＩＡＳが集光される。
【００８５】ＮＲＢＣの細胞質が完全に溶解されるた
め、核が染色されやすくなり、そのため、ＮＲＢＣを効
果的かつ迅速に染色して正確な検出およびカウントを行
うのに、きわめて濃度の低い染料で済む点が、本明細書
に開示するシステムのその他の技術的特徴である。この
ため、ＮＲＢＣ検出で、Ｓ／Ｎ比を１００以上という高
い値にすることができる。このシステムが、迅速にＷＢ
Ｃ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣの同時分析を行うのに必要な活
性染料の濃度は、わずかに１ないし２μg／ｍｌであ
り、従来の技術に比べて少なくとも１／５０の濃度にな
っている。
【００８６】本発明で使用する活性染料（死細胞または
損傷細胞だけを染色する核染料）は、核酸と結合しない
場合、吸光率が比較的高く、蛍光強度が低い活性染料で
ある。活性染料のスペクトル特性、すなわち、最大吸光
（ＥＸ）（ｎｍ）／最大放出（ＥＭ）（ｎｍ）は、本シ
ステムで使用するレーザ光源に適合していなければなら
ない。
【００８７】本明細書に開示するシステムの活性染料
は、以下の特性を備えていることが望ましい。
【００８８】吸光率が高い。
【００８９】量子収量が高い。
【００９０】核酸との結合性が高い。
【００９１】核酸と結合しない場合の蛍光強度が低い。
【００９２】スペクトル特性と光源との適合性（例え
ば、アルゴンレーザ光源で最大ＥＸが〜４８８ｎｍ、最
大ＥＭが〜６３０ｎｍ） 本明細書に開示するシステムで適当な光源と併用するの
に適した核染料は多数ある。本明細書で述べるシステム
に使用できる市販染料としては、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹ
Ｏ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−
１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、その他種々
の染料がある。最大ＥＸが異なる染料が、Ｈｅ−Ｎｅラ
ンプ、キセノンランプ、水銀ランプなど、適切な光源に
より活性化できることは、当業者にとって周知の事実で
ある。
【００９３】市販の染料でアルゴンレーザと併用できる
適当な染料には、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、臭化エ
チジウム（ＥＢｒ）、エチジウムホモダイマ−１（Ｅｔ
ｈＤ−１）、エチジウムホモダイマ−２（ＥｔｈＤ−
２）、ジエチレントリアミン（ＤＴＡ）がある。
【００９４】ＮＲＢＣ法のある用途では、ＰＩを生体染
料として使用する。
【００９５】サンプル吸入プローブで、等張性溶解試
薬、約８５０マイクロリットルが入ったＷＢＣカップ１
３８に全血サンプルの一部、約２５マイクロリットルを
移す。上に述べた溶解試薬を用いて、血液サンプルの赤
血球分画およびＮＲＢＣの細胞質を溶解し、ＮＲＢＣの
核を露出させる。この試薬システムの特徴は、多目的を
達成する１試薬／１操作段階の作業を実現できることで
ある。この試薬は、損傷しやすいすべての白血球の構造
を保護できる程度に作用が穏やかであるとともに、赤血
球をすべて効果的に溶解する。白血球の構造保護と赤血
球の溶解という二つの目標を、溶解時間の延長が必要に
なる場合もあるヘモグロビン異常のサンプル中でも達成
できる。
【００９６】三重トリガ法と併用する溶解剤の組成とは
無関係に、この試薬は、低濃度の生体核染料をさらに含
むか、または低濃度の生体核染料と結合しており、この
染料は、末梢血液中に存在するＮＲＢＣに効果的な標識
付けを行う。本明細書で述べる分析装置と併用するため
に、屈折率が、ほぼ０．１％未満の誤差でシース（shea
th）溶液の屈折率と一致するように溶解作用を調整する
ことが好ましい。
【００９７】通常、溶解試薬とサンプルの混合液は、Ｗ
ＢＣカップ１３８に約１１秒間だけ入れておく。混合物
をＷＢＣカップ内で溶解し、４２ー±３℃で混合する。
この時点で、ＷＢＣカップの内容物をパイプで光流動セ
ル１７０に直接導き、検出を行う。
【００９８】細胞の流れが流動セル１７０を通過し、溶
解剤の添加により希釈されて、レーザに照射された単一
体積（volume single）のファイルを希釈液／シース溶
液に囲まれたサンプル流の層流となって通過すると同時
に、測定が始まる。
【００９９】ここで、軸光損失（ＡＬＬ）および中間角
散乱（ＩＡＳ）を検出する複合フォトダイオード３８０
と、赤色蛍光を検出するフォトマルチプライア（photom
ultiplier）管と、ＡＬＬ、ＩＡＳ、およびＦＬ３（赤
色蛍光）で構成される三次元特性空間にあり、図２に示
した独自の三重トリガ回路によって細胞の存在が検出さ
れる。三重トリガ回路では、ＡＮＤ／ＯＲ論理により、
デジタル化信号の適合性の判定を行う。適合していると
判断された信号は、ＩＡＳトリガよりも大きく、さらに
はＡＬＬトリガまたはＦＬ３トリガのいずれか一方より
も大きくなっている必要がある。この独自のトリガ回路
と、バランスのとれた固定剤を含む溶解特性とを組み合
わせると、露出したＮＲＢＣ核を短時間で染色し、その
数を正確に数え、さらにはＷＢＣの鑑別細胞カウントか
ら除外することができ、この場合にＤＮＡの断片、ＲＢ
Ｃの基質、および血小板などの背景に起因する、蛍光、
非蛍光両方の一般的な干渉を受けることがない。
【０１００】以上のようにしてトリガした細胞が、前記
の照明領域内を通過する際、検出器３８０、４００、４
０１、および４０４でパルスが発生する。このパルスを
フィルタにかけ、増幅し、デジタル化し、さらにＡＬ
Ｌ、ＩＡＳ、ＦＬ３、ＰＳＳ（偏光側方散乱）、および
ＤＳＳ（復偏光側方散乱）から成る対応５次元特性空間
にリストモード（list mode）で保存する。流動セル１
７０による通常のカウント時間は、１０秒である。通常
のＷＢＣカウント７０００個／血液容量１マイクロリッ
トルの場合、先に述べた流量および希釈比において得ら
れる事象カウント率は５０００となる。カウントが低い
サンプルでは、このカウント時間を自動的に延長して、
測定の統計データを向上させることができる。測定時間
の終了時に、サンプルの流れをパイプで排出し、プロー
ブの洗浄、乾燥を行って、次のサンプル測定に備える。
【０１０１】ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＦＬ３、ＰＳＳ、および
ＤＳＳより成る前記特性空間のリストモードデータにア
ルゴリズムを適用し、３０秒未満の処理時間で以下の種
類の細胞のカウントまたはフラグ付けあるいはその両方
を行う。
【０１０２】カウントを行う細胞 百分率 フラグ付けまたは計数 白血球濃度 （ＷＢＣ） 好中球濃度 ＷＢＣの好中球 リンパ球濃度 ＷＢＣのリンパ球 単核細胞濃度 ＷＢＣの単核細胞 好酸球濃度 ＷＢＣの好酸球 好塩基球濃度 ＷＢＣの好塩基球 ＮＲＢＣ ＷＢＣの有核赤血球 バンド濃度 （ＢＡＮＤ） 芽細胞濃度 （ＢＬＳＴ） 未成熟粒子濃度 （ＩＧ） 変異リンパ球濃度 （ＶＡＲＬ） 以下で説明するように、ＡＬＬ信号およびＩＡＳ信号
は、ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を行う目的で検出、収集し、
染色済みＮＲＢＣ核から生成するＦＬ３信号は、ＮＲＢ
Ｃ分析を目的として検出、収集する。図４２に示す三重
トリガ回路は、ＡＮＤ／ＯＲ論理を利用して、前記の信
号がデジタル化に適しているかどうかを判断する。ＩＡ
Ｓトリガよりも大きく、さらにはＡＬＬトリガまたはＦ
Ｌ３トリガのいずれか一方よりも大きくなければ、デジ
タル化に適した信号だとは判断されない。
【０１０３】様々な構成要素および図４２で識別した発
生信号または利用信号は、以下の標識に対応している。
【０１０４】 ９００−ＡＬＬ電圧コンパレータ ９０２−ＡＬＬ信号 ９０４−ＡＬＬしきい電圧（Ｖｔｈ１） ９０６−ＡＬＬ電圧コンパレータ出力 ９１０−ＦＬ３信号 ９１２−ＦＬ３しきい電圧（Ｖｔｈ２） ９１４−ＦＬ３電圧コンパレータ ９１６−ＦＬ３電圧コンパレータ出力 ９１８−ＩＡＳ信号 ９２０−ＩＡＳしきい電圧（Ｖｔｈ３） ９２２−ＩＡＳ電圧コンパレータ ９２４−ＩＡＳ電圧コンパレータ出力 ９２６−ＯＲゲート ９２８−ＯＲゲート出力 ９３０−ＡＮＤゲート ９３２−有効トリガ出力 各チャンネルから生成するリアルタイム信号は、電圧コ
ンパレータの入力端子にある。電圧コンパレータ９０
０、９１４、および９２２は、「＋入力」（９０２、９
１０、および９１８）を「−入力」（９０４、９１２、
および９２０）および合成出力（９０６、９１６、およ
び９２４）と比較する機能を果たす。「＋入力」の電圧
が「−入力」よりも高い場合は、出力が高くなる。「＋
入力」の電圧が「−入力」よりも低い場合は、出力が低
くなる。
【０１０５】しきい電圧は、システムのパラメータによ
って決まる独立の電圧である。
【０１０６】コンパレータ９００および９１４の出力
は、ＯＲゲート９２６に入力され、その結果、ＯＲゲー
ト出力９２８が発生する。ＯＲゲートは、入力を比較す
る機能を果たす。入力の一方、または双方が高い場合、
出力も高くなる。
【０１０７】ＯＲゲート９２８の出力およびコンパレー
タ９２２および９２４の出力は、ＡＮＤゲート９３０に
入力される。ＡＮＤゲートは、入力を比較し、やはり有
効トリガ出力である出力９３２を生成する働きをする。
両方の入力が高い場合に限って、出力は高くなる。
【０１０８】ＩＡＳ信号９１８がしきい電圧９２０より
も大きく、ＡＬＬ信号９０２がしきい電圧９０４より大
きいか、またはＦＬ３信号９１０がしきい電圧９１２よ
り大きいか、あるいはＡＬＬ信号９０２、ＦＬ３信号９
１０ともしきい電圧９０４、９１２よりそれぞれ大きい
場合に限り、有効トリガ出力９３２が高くなる。
【０１０９】上記のトリガ回路を利用して、ＮＲＢＣ
は、先に述べた三次元空間内に独自にクラスタ（cluste
r）を形成する（図４０Ａから図４０Ｃ、図４１Ａ、お
よび図４１Ｂを参照）。このＮＲＢＣは、光ＷＢＣ鑑別
分析中に簡単に数を数えることができ、しかもＷＢＣの
カウントから的確に除外できる。このようにして、ＷＢ
Ｃ１００個当たりのＮＲＢＣのカウント、および血液１
μｌ中の絶対ＮＲＢＣ数が報告される。したがって、Ｎ
ＲＢＣの数がＷＢＣの総数から差し引かれ、血液サンプ
ル中にＮＲＢＣが存在する場合でも、ＷＢＣの正確なカ
ウントおよび鑑別分析を行うことができる。ＤＮＡの断
片、ＲＢＣの基質、血小板、ハウエル−ジョリー小体、
好塩基性斑点（Basophilic Stippling）、溶解網赤血球
から出たＲＮＡ、ＷＢＣおよび巨核球の断片から出たＤ
ＮＡに起因する蛍光および非蛍光の背景ノイズは、ほぼ
排除される。染色したＮＲＢＣの核は、本明細書に開示
する（ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＦＬ３上の）三重トリガ法によ
り、各種背景ノイズ信号から分離される。ＮＲＢＣ核か
ら生成し、ＡＬＬとＦＬ３との関係を表わすグラフ上で
ＦＬ３トリガ以上のＦＬ３＋信号だけが、ＮＲＢＣとし
てのカウントの対象となる（図４０Ａから図４０Ｃ、図
４１Ａ、および図４１Ｂ）。
【０１１０】４．網赤血球法と試薬 安定した水性試薬成分を利用して網赤血球の検出および
カウントを行うのが、細胞分析システム６０の特徴の一
つである。この試薬は、網赤血球を染色することができ
る非対称シアニン（cyanine）染料と、イミダゾール緩
衝液、４−（２−ヒドロキシル）−１−ピペラジンエタ
ンスルホン酸（「ヘペス(Hepes)」）緩衝液、ビス（２
−ヒドロキシル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
（「ビス−トリス(Bis-Tris」）緩衝液、トリスヒドロ
キシルメチルアミノメタン（「トリス(Tris)」）緩衝液
から選択し、１価または２価のアルカリ塩で浸透圧モル
濃度を約２３０から約３４０（ｍＯｓm／Ｌ）に調整し
た、ｐＨ約６．０から８．０の緩衝液約２０ｍＭから約
５０ｍＭと、薄膜への浸透を促進し、等張性水溶液中の
シアニン染料を安定させる非イオン性表面活性剤（表面
活性剤に応じて約５ｍｇ／ｄｌから約１．０ｇ／ｄｌ）
とを含む。染料は、ＤＮＡやＲＮＡと結合した場合に、
周期的に置換され、強力な蛍光を発することが好まし
い。試薬は、周期的置換非対称シアニン染料、約０．１
μｇ／ｍｌから約０．３μｇ／ｍｌを含むことがさらに
好ましい。
【０１１１】網赤血球およびＣＢＣ差を迅速かつ連続的
に検出し、計数を行う方法では、本発明に試薬システム
を利用している。このような方法では、インキュベーシ
ョンの段階を別に設ける必要がないという特徴がある。
最小、１０秒から６０秒のインキュベーション期間があ
れば十分である。
【０１１２】本明細書に開示する方法および試薬は、１
９９５年４月２１日出願の米国特許出願第０８／４２６
４０８号、標題「網赤血球の迅速分析の構成および方法
（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ＲａｐｉｄＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒ
ｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ）」の主題になっている。こ
の出願は、本発明の譲受人の所有にかかる。参照によ
り、前記出願の内容をすべて本明細書に組み込むものと
する。
【０１１３】前記の方法によれば、全血サンプル中の網
赤血球の数を数え上げると同時に、サンプルの独立した
アリコート（aliquot）を区別して、全血球（ＣＢＣ）
分析を行うことができる。この方法は、サンプルの網赤
血球アリコートを染色試薬と結合させながら、サンプル
の一つまたは複数のアリコートを自動分析装置内の様々
な位置に導いて分析および区別を行う段階を含む。
【０１１４】試薬／網赤血球アリコートを組み合わせ
て、自動分析装置６０の光流動セル１７０に導く。次
に、試薬／網赤血球アリコートを、照明を施した感知ゾ
ーン３００に、ほぼ一度に細胞一つずつの割合で通し、
蛍光および光の事象の散乱を発生させる。この事象を検
出し、前記サンプル中に存在する網赤血球の数を事象か
ら求める。
【０１１５】試薬システムを併用できる非対称染料は、
以下の特性を備えている。
【０１１６】１．最大吸収：４８８＋２０ｎｍ ２．核酸との結合性が高い。
【０１１７】３．量子収量が高い。：≧０．１ ４．モル吸光係数：≧１０，０００ ５．ＲＮＡおよびＤＮＡとの結合時の蛍光増加：≧２０ ６．薄膜透過率：＜２分 通常、本明細書で開示する水性試薬および網赤血球カウ
ント法は、水性環境では非常に不安定である。しかし、
本明細書に開示する試薬の組成によれば、完成した試薬
の安定性および貯蔵寿命が向上する。
【０１１８】試薬システムの好ましい実施の形態では、
成分として、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎ
ｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の専売染料であるＳｙｂｒ
１１を約０．０５〜０．５μｇ／ｍｌ、イミダゾール
緩衝液を約２０ｍＭ〜５０ｍＭ、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ
−グルコンアミドプロピル）コルアミド（ＢＩＧＣＨＡ
Ｐ）を約５〜２０ｍｇ／ｄｌ、Ｐｒｏｃｌｉｎョ３００
（５−クロロ−２−メチル−４−イソシアゾリン−３−
オン（one）＋２−メチル−４−イソシアゾリン−３−
オン）を約０．０２〜０．０５５％含む。１Ｎの塩酸で
ｐＨを約６．８〜７．２に調整し、塩化ナトリウムで浸
透圧モル濃度を約２７０〜３１０（ｍＯｓｍ／Ｌ）に調
整する。
【０１１９】試薬システムの主成分は染料である。試薬
システムの主要成分となるような染料としては、参照に
より本明細書に組み込んだ「CYCLIC-SUBSTITUTED UNSYM
METRIC DYES（環式置換非対称染料）」と題するＷＯ９
４／２４２１３号に開示されている非対称シアニン染料
などがある。さらに、本発明で使用する染料は、ＤＮＡ
やＲＮＡとの結合時に強力な蛍光を発する。このような
有用な染料は、ＲＮＡおよびＤＮＡとの結合性および量
子収量が高くなければならない。本明細書で開示し、特
許請求を行う特性を示す各種非対称シアニン染料を、試
薬システムの主成分として使用できるものと思われる。
このような染料の例としては、やはりＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（米国オレゴン州Ｅｕｇｅ
ｎｅ）（ＭＰＩ）から市販されているＳｙｂｒ１１、Ｓ
ｙｂｒ１４、Ｓｙｂｒ１６などがあるが、これに限定さ
れるものではない。Ｓｙｔｏ１２など、その他の非対称
シアニン染料もＭＰＩから市販され、本発明を実施する
のに有用である。Ｓｙｔｏ１２は、中性の非対称シアニ
ン染料であり、ピリジン環構造またはキノリン環構造に
至るメチン橋に結合された置換ベンザゾリム環構造を含
む。
【０１２０】試薬システムの成分としては、その他に、
ｐＫａが約６．０〜８．０で、（ＲＮＡやＤＮＡを染色
するのに）必要な、水溶液中のシアニン染料濃度を長時
間維持することができる緩衝液がある。このような緩衝
液は、シアニン染料や、シアニン染料を安定させるため
に本発明で使用する非イオン性表面活性剤と反応しては
ならない。代表的な緩衝液としては、イミダゾール、ヘ
ペス、ビス−トリス、トリスなどがある。
【０１２１】試薬システムのさらに別の成分として、非
イオン性表面活性剤がある。使用する表面活性剤の種
類、または非イオン性表面活性剤の組み合わせにより、
その濃度は約５ｍｇ／ｄｌから約１ｇ／ｄｌとなる。表
面活性剤は、シアニン染料の細胞膜への浸透速度（３０
秒以内）を増大させるものと考えられる。さらに、等張
性水溶液中のシアニン染料の溶解度および安定性も、表
面活性剤によって増大する。ただし、このような表面活
性剤は、低濃度であっても、沈殿したり、シアニン染料
と反応したり、ＲＢＣを溶解することがあってはならな
い。このような表面活性剤の例としては、ＢＩＧＣＨＡ
Ｐ、ｎ−ドデシル−Ｄ−マルトシド、ポリオキシプロピ
レン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー（Ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃョＦ１２７）、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マル
トシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデ
シル−Ｄ−グルコピラノシド、およびｎ−デシル−Ｄ−
グルコピラノシドなどがある。
【０１２２】試薬システムのさらに別の成分として、試
薬の浸透圧モル濃度を約２３０（ｍＯｓｍ／Ｌ）から約
３４０（ｍＯｓｍ／Ｌ）に調整し、網赤血球を含む赤血
球や白血球の溶解を防止する１価または２価のアルカリ
塩がある。このような塩は、シアニン染料と反応した
り、溶液中に沈殿したりしてはならない。塩の例として
は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣ
ｌ2、ＺｎＣｌ2、その他がある。
【０１２３】任意の成分として、試薬内の細菌の生育を
防止する保存料がある。このような保存料により、細胞
や、染色済み細胞の光散乱特性や蛍光放出特性が変化し
てはならない。保存料の例としは、Ｐｒｏｃｌｉｎョ３
００、Ｐｒｏｃｌｉｎョ１５０、ナトリウムアジド、そ
の他がある。
【０１２４】しかし、本発明を実施する方法は、一般
に、全血サンプルを試薬と混合して網赤血球のＲＮＡを
染色する段階と、照明を施した光流動セルに、ほぼ一度
に細胞１個の割合で混合物を通す段階と、混合物の光散
乱と放出蛍光を検出する段階と、サンプル／試薬混合物
を独立したインキュベーションの段階にかける或はイン
キュベーション期間をかけることなくサンプル中の網赤
血球の量を判定する段階とを備えている。
【０１２５】上に述べた複数パラメータ血液分析装置
で、全血サンプルを分析して網赤血球の百分率および絶
対カウントを求めるには、サンプル吸引プローブによ
り、希釈液／シース溶液（等張性食塩水）約７８５６μ
ｌが入ったＲＢＣカップ１３４に全血サンプル約１８．
７５μｌを加えて、液体を混合する。希釈したサンプル
を、次にシース付きインピーダンスアパチャ１７４に移
動し、電気的にサンプル中の絶対ＲＢＣカウントを求め
る。標準時間で、希釈サンプル約２００μｌを、本明細
書に開示する試薬が６００μｌ入ったＲｅｔｉｃカップ
１３６に移し、カップ内でサンプルを混合する。作成し
た（混合）サンプルを、次にシース付光流動セル１７０
に移して検出を行う。細胞の流れが、後述する希釈液−
シース溶液に囲まれたサンプル層流となって、ほぼ一度
に細胞１個の割合で流動セルを通過すると同時に測定が
開始される。
【０１２６】図１４Ａおよび図１４Ｂのサイトグラム
（cytogram）の、ＩＡＳおよびＦＬ１で構成される二次
元特性空間内に示すように、この時点で、３°から１０
°の円錐内で光を検出する中間角散乱フォトダイオード
３８０と、グリーンの蛍光ＦＬ１を検出するフォトマル
チプライア管（ＰＭＴ）４００で細胞を検出する。細胞
が照明を施した前記の部分を通過する際、パルスが生成
され、このパルスは検出器で検出される。このパルスを
フィルタにかけ、増幅し、デジタル化して、ＩＡＳおよ
びＦＬ１で構成される対応二次元特性空間にリストモー
ドで保存する。細胞のカウントは８秒間実施する。血液
１マイクロリットル当たりのＲＢＣカウントが５，００
０，０００個と正常である場合、上に述べた流量および
希釈率で得られる事象カウント率は、１秒当たり５９５
０となる。次に、ＩＡＳおよびＦＬ１で構成される前記
の特性空間のリストモードデータにアルゴリズムを適用
し、以下のパラメータを２０秒の計算時間内に測定す
る。
【０１２７】１．ＲＢＣゲート：ＲＢＣ母集団をゲート
にかけてＷＢＣおよび血小板を除外する。網赤血球は残
すが、ＷＢＣおよび血小板は除く。
【０１２８】２．網赤血球の百分率：ゲートにかけたＲ
ＢＣ母集団を、そのＦＬ１信号の大きさにしたがって再
分析する。ＦＬ１のヒストグラムに対数フィットを行
い、成熟ＲＢＣに属する領域を画定し、ＦＬ１信号が前
記領域上にくる細胞を、網赤血球として標識する。網赤
血球の百分率は、網赤血球のカウントをＲＢＣの総数で
割って求める。
【０１２９】３．網赤血球の絶対カウント：網赤血球の
百分率に、ＣＢＣモードから得られた、サンプルのＲＢ
Ｃ絶対数を掛けて求める。
【０１３０】４．網赤血球の成熟指標（ＲＭＩ）：ＲＭ
Ｉは、ＦＬ１信号の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）が、通常の網
赤血球母集団の平均蛍光を１以上上回る網赤血球の百分
率として表わされる。
【０１３１】この説明は、あくまで便宜上のものであっ
て、本発明のＲＭＩの表現報告は、本明細書に述べるア
ルゴリズムにのみ限定されるものではない。
【０１３２】５．その他の網赤血球染料および分析 本明細書で開示するその他の網赤血球染料は、周囲温度
で光に対して安定であり、非結合染料よりも結合染料の
蛍光増進が改善され、ＤＮＡよりもＲＮＡに対して選択
性を示し、網赤血球細胞のゲーティング（gating）を向
上させ、細胞の薄膜への浸透が早く、最大光吸収波長が
アルゴンレーザ（約４８８ｎｍ）の最大放出波長にほぼ
一致している。
【０１３３】好ましい染料は、以下の一般構造式を有す
る分子クラスに属する。
【０１３４】
【化１】
【０１３５】上式中、 ｘ＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（ＣＨ3）2２ Ｒ1＝炭素原子１個ないし６個を有するアルキル Ｒ2＝炭素原子１個ないし６個を有するアルキル Ｒ3＝縮合ベンゼン、（炭素原子１個ないし６個を有す
る）アルキルメトキシ、または水素 Ｒ4＝炭素原子１個ないし６個を有するアルキルメトキ
シ、または水素 ｎ＝0または１から６の整数 この種の染料を、本明細書では「２，２’−染料」と称
する。
【０１３６】上に示した網赤血球染料の好ましい実施の
形態において、 ｘは硫黄 Ｒ3およびＲ4は両方とも水素 ｎ＝0 Ｒ1およびＲ2は両方ともエチル であることが好ましい。
【０１３７】この染料は、Ｋｏｃｈ−ｌｉｇｈｔ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ １９８５，
１９８８／８９の５３ページに、ヨウ化物の塩として記
載され、１，３’−ジエチル−２，２’−キノリルチア
シアニンヨーダイドと呼ばれている。また、日本感光色
素研究所のカタログの７ページにも記載されている。便
宜上、以下、特に好ましい実施の形態であるこの染料を
「ＤＥ２２ＱＴＣ」と呼び、上に述べた染料クラス全体
を「２，２’−染料」と呼ぶ。
【０１３８】一般に、以上の染料は塩の形で使用する。
塩としては、特にヨウ化物が便利である。本明細書で上
記の染料に言及する場合、塩の形の染料をかならず含む
ものと理解されたい。
【０１３９】一つの実施の形態において、ＲＮＡを含有
する物質の染色に便利な試薬は、ＲＮＡ含有物質を染色
することができる２，２’−染料を含む。
【０１４０】別の実施の形態で明らかにしているＲＮＡ
含有物染色法では、ＲＮＡ含有物を染色することができ
る２，２’−染料の染色水溶液を、染色溶液の染料がＲ
ＮＡ含有物に浸透するのに十分な時間だけ前記ＲＮＡ含
有物に接触させる。
【０１４１】さらに別の実施の形態で明らかにしてい
る、流動サイトメトリを利用した全血サンプル中の網赤
血球のカウント法では、ＲＮＡ含有物を染色することが
できる２，２’−染料の染色水溶液を、染色溶液の染料
がＲＮＡ含有物と平衡状態になるのに十分な時間だけ前
記ＲＮＡ含有物に接触させる。染色したサンプルを次に
流動サイトメトリ分析装置の光感知領域に通し、光感知
領域内で入射光ビームによる照明を行う。サンプル溶液
中の網赤血球の蛍光が光感知領域を通過する際に、測定
される。
【０１４２】２，２’−染料は、チアゾールオレンジ中
よりも水溶液中の方が安定性が高いのがこの染料の重要
な利点である。この特性は、４℃の暗所および周囲温度
（約２５℃）の明るい場所で５日間保存した、ＤＥ２２
ＱＴＣ、チアゾールオレンジ（双方とも等張性希釈液に
０．１μｇ／ｍｌの濃度で溶解）、および「Ｒｅｔｉｃ
−ＣＯＵＮＴ」を利用して調べたものである。
【０１４３】ＤＮＡよりもＲＮＡが結合物質である場
合、２，２’−染料は、非常に強い蛍光を発し、ＤＥ２
２ＱＴＣを使用すれば、これまで網赤血球分析には採用
されていなかった方法により、重量／重量ベースで赤血
球を血小板および白血球と分離することが容易になる。
染料は、３０分の通常の試験中に血小板を強力に染色
し、かつ同時に白血球を予想通り染色することによっ
て、蛍光と順方向散乱との関係を示すグラフ中で両グル
ープの細胞をすべての赤血球から画然と区別する。迅速
染色は、その他多数の染料が示さない特性である。例え
ば、チアゾールオレンジでは、数時間後には染色が行わ
れるが、血小板は３０分間ではさほど染色されない。
【０１４４】ＤＥ２２ＱＴＣは、ＲＮＡやＤＮＡと結合
した場合の最大吸収がほぼ４８８ｎｍ、ストークスシフ
ト（Stokes shift）が約３３ｎｍである。したがって、
この染料は標準的なアルゴンイオンレーザと併用するこ
とができ、きわめて都合がよい。さらに、容易に入手で
きる蛍光分析用光フィルタを使用することができ、装置
を改造する必要がない。
【０１４５】２，２’−染料は、網赤血球を蛍光マーカ
で染色する必要がある従来のどんな分析方法とも併用可
能である。特に、２，２’−染料は、アルゴンイオンレ
ーザ流動サイトメトリにおける網赤血球の検出およびカ
ウントなど、現在、チアゾールオレンジを使用するのが
望ましいとされている分析に使用することができる。
【０１４６】２，２’−染料を使用して網赤血球を検
出、識別する場合、インキュベーションサイト、関連温
度制御装置、およびサンプルハンドラを装置内に設け、
分析装置と作動可能に接続して、本明細書に開示する測
定システムの自動化を図る必要がある。
【０１４７】６．ＨＧＢ試薬 本明細書で述べるヘモグロビン（ＨＧＢ）試薬は、１９
９４年３月１１日出願の「Ｃｙａｎｉｄｅ−ｆｒｅｅ
Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｔｈｅ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｍｏｇｌｏ
ｂｉｎ（シアンを含有しないヘモグロビン検出用試薬お
よび検出方法）」と題する米国特許出願第０８／２１２
６２６号に開示されている。前記出願は、本出願の所有
者との共有になっており、前記出願を参照により本明細
書にその全体を組み込む。
【０１４８】シアンを含有しない試薬は、検出可能な色
原体（chromogenic）構造が形成され、検出、測定が行
えるように、迅速に赤血球を溶解し、かつヘモグロビン
と結合して錯体を作る必要がある。試薬の作用によって
生じる色原体が、その他の血液成分の干渉を受けないと
考えられるとともに、すでに実用化されている自動血液
分析装置のスペクトル範囲の波長で測定可能なため、本
明細書に開示する試薬は、数週間にわたって安定性があ
り、特に好都合である。比較のために、シアン結合ヘモ
グロビン法では、通常、５４０ｎｍにおける吸収を測定
する。約５４４ｎｍで吸収が最大となる本発明によれ
ば、赤褐色の色原体が形成される。
【０１４９】本発明において有用なＨＧＢ試薬は、イミ
ダゾールやイミダゾールの誘導体など、配位子形成（li
gand-forming）化合物の水溶液である。配位子形成化合
物は、濃度０．１Ｍから２．０Ｍのイミダゾールで存在
する。本発明の試薬から出たイミダゾールは、サンプル
中の赤血球から放出されたヘモグロビンと結合する。本
発明で有用なその他の配位子形成化合物としては、Ｎ−
ヒドロキシアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシルアミン、ピ
リジン、オキサゾール、チオゾール、ピラゾール、ピリ
ミジン、プリン、キノリン、イソキノリンなどがある。
酸化鉄ヘム（oxidized iron heme）を拘束できる負イオ
ンには、シアン酸塩、フッ化物、アジ化合物、亜硝酸
塩、水酸化物、酢酸塩、蟻酸塩などがあり、こららの負
イオンの塩として許容できるものには、ナトリウム，カ
リウム、アンモニウムなどがある。
【０１５０】また、試薬は、強力な赤血球溶解力を備え
た表面活性剤を含有している。酸化ラウリルジメチルア
ミンオキシド（米国イリノイ州Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄの
Ｓｔｅｐａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製Ａ
ｍｍｏｎｉｘ Ｌ．Ｏ．）、オクチルフェノキシポリエ
トキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００）、およ
びその他の強力な洗剤を溶解試薬の表面活性剤成分とし
て使用することができる。表面活性剤の濃度は、約０．
１％から１．０％（重量／体積）とする。試薬のｐＨ
は、１１から１４、好ましくは１２．５に調整する。ｐ
Ｈの調整には、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムな
ど、１価の塩基を使用する。
【０１５１】ＨＧＢの検出法（本明細書の第８Ｅ節およ
び例２で詳述）によれば、溶解試薬と全血サンプルを約
５０：１から１０００：１の割合で混合する。サンプル
と試薬を迅速に混合して、赤血球溶解を行い、ヘモグロ
ビンを色原体に変換することができる。次にサンプルと
試薬の混合物を吸光分光光度計にかけ、この装置で色原
体の光学濃度を測定する。配位子がイミダゾールの場
合、５４０ｎｍから５５０ｎｍで測定を行うことができ
る。サンプル中のヘモグロビンの総濃度は、変換した色
原体の光学濃度に関係する。
【０１５２】７．等張性希釈−シース試薬 本発明の細胞分析システム６０では、シース流の表面張
力を最小限に抑えるとともに、赤血球および血小板の迅
速分析を行うのに適した非イオン性表面活性剤を含む緩
衝処理済み等張性溶液を使用する。試薬システムは、ほ
ぼ完全に気泡の発生を抑え、インピーダンスおよび光流
動セルの両方のシース流の流れを円滑にする。本明細書
に開示する希釈−シース試薬は、小赤血球と血小板との
分離を促進すると同時に、赤血球および血小板の母集団
の構造をほぼ完全に保護するので、正確なカウントおよ
び体積測定ができる。
【０１５３】一つの実施の形態においては、ｐＫａが約
６．０から８．０である緩衝処理済み等張性塩溶液、約
１０ｍＭから約５０ｍＭにより、試薬のｐＨを約７．０
から約７．６の範囲に維持することができる。また、血
小板の集合を防止するため、濃度が約０．１ｇ／ｌから
約０．４ｇ／ｌであるＥＤＴＡの１価の塩が存在する。
さらに、表面張力を低下させる非イオン性表面活性剤の
ほか、試薬の浸透圧モル濃度を約２７０ｍＯｓｍ／Ｌか
ら３２０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲に調整するのに十分な１価
の塩も利用して、気泡の形成を防止し、小赤血球と血小
板との分離を促進する。この塩は、ｎ−ドデシル−Ｄ−
マルトシド、ｎ−テトラデシル−Ｄ−マルトシド、デカ
ノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシル−Ｄ−グ
ルコピラノシド、およびｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノ
シドのうちから選択する。そのほか、細菌の成長および
水の脱イオン化を防止する保存料も存在する。
【０１５４】好ましい実施の形態では、試薬の成分とし
て、二塩基性リン酸ナトリウムが約２．４５ｇ／ｌ、一
塩基性リン酸カリウムが約０．４０ｇ／ｌ、ＥＤＴＡ二
ナトリウムが約０．２０ｇ／ｌ、塩化ナトリウムが約
８．０５ｇ／ｌ、塩化カリウムが約０．４０ｇ／ｌ、ｎ
−ドデシル−Ｄ−マルトシドが約０．０１２ｇ／ｌ、プ
ロクリン（proclin）３００が約０．０３ｇ／ｌを含
み、ｐＨを７．４に、また浸透圧モル濃度を３１５ｍＯ
ｓｍ／Ｌに調整してある。
【０１５５】最も好ましい実施の形態では、血液サンプ
ル１７．５マイクロリットルを希釈シース試薬７４００
マイクロリットルと迅速に混合し（希釈率１：４２
０）、流体力学的に焦点を絞った（シースした）インピ
ーダンストランスデューサに希釈したサンプル０．５マ
イクロリットルを１２秒間通して赤血球のカウント、体
積測定、および血小板のカウントを行い、さらにシース
光流動セルに希釈したサンプル２．５マイクロリットル
を６秒間通して、正確に血小板の数を数える。損傷しや
すい異常細胞の断片から発生するノイズ信号は、細胞分
析システム６０の血小板アルゴリズムにより血小板母集
団を無視して、光血小板カウントから除く。細胞分析シ
ステム６０が対象とする正常および異常血液サンプルの
赤血球および血小板の分布の代表例を、図４５Ａから図
４５Ｆおよび図４６、図４７に示す。
【０１５６】８．分析装置のモジュール Ａ．自動サンプル移送 分析装置６４には、処理を行うために、サンプル試験管
を自動的に分析装置６４に移送するオートローダ（図示
せず）が設けられている。このようなオートローダは、
各種サイズのサンプル試験管最高１００個を保持するホ
ルダを備えている。サンプルの吸引を目的として、サン
プル試験管を順次分析装置６４にかけるプレゼンタ（pr
esenter）が、オートローダと作動可能に連結されてい
る。サンプルの吸引直前にサンプルを混合するミキサ
も、オートローダと作動可能に連結されている。各試験
管のバーコードラベルを読み取るバーコードリーダも作
動可能にオートローダおよびシステム制御装置と連結さ
れ、サンプルに関する情報をシステム制御装置に入力す
る。
【０１５７】Ｂ．自動サンプル処理および測定 図３は、図１に示した細胞分析システム６０で使用する
自動サンプル処理領域１１０の実施の形態の平面図を示
す図である。処理領域１１０は、細胞分析システム６０
の分析装置部分６４の一部である。処理領域１１０は、
サンプルカップ領域１１４およびインキュベーション領
域１１８を備えている。
【０１５８】図３に示すように、インキュベーション領
域１１８は、試薬モジュール１２２およびサブセット／
表現型分類（subset/phenotyping）インキュベーション
トレイ１２４を収容する温度調整ブロック１２０を備え
ている。温度調整ブロック１２０は、温度調整ブロック
１２０上にあるインキュベーショントレイ１２４および
試薬モジュール１２２の加熱または冷却あるいはその両
方を行う温度制御装置（図示せず）を備えている。
【０１５９】試薬モジュール１２２は、抗体試薬が入る
凹部１２８を備えている。図示した実施の形態では、各
試薬モジュール１２２が、試薬凹部１２８がついたハウ
ジングを備えており、前記凹部の数は６つが好ましく、
特定の試薬パネル包装される。各パネルの試薬は、各パ
ネルに関連した試験に関して、ほぼ等量の試薬が各凹部
１２８から使用されるように選択される。パネルに関連
した試験に６種未満の試薬が必要である場合には、余分
な凹部１２８を栓（図示せず）でふさぐ。また、各試薬
モジュール１２２には、不揮発性ＲＡＭなどの、メモリ
が対応させてあり、モジュールのＩＤ番号と使用情報を
保存するようになっている。試薬モジュール１２２は、
温度調整ブロック１２０内に所定の方向に向けて配置し
た開口部（図示せず）に収まるように調整することが好
ましい。これにより、分析装置６４の中央処理装置（Ｃ
ＰＵ）は、各試薬モジュール１２２内の各凹部１２８の
位置と、使用情報からわかる内容物の体積とを保存する
ことができる。
【０１６０】図示した実施の形態において、サブセット
／表現型分類インキュベーショントレイ１２４は、形状
がほぼ矩形であり、その上に数列のインキュベーション
サイト１３２が形成されている。各インキュベーション
サイト１３２は、血液サンプルと抗体との混合物を保持
することができ、免疫／表現型試験に備えて混合物をイ
ンキュベートする。サブセット／表現型分類トレイ１２
４は、着脱可能に温度調整ブロック１２０内の開口部
（図示せず）に収まっており、温度調整ブロック１２０
の温度制御装置によりトレイの温度が制御される。
【０１６１】サンプルカップ領域１１４は、１列になっ
たサンプルカップを備えている。好ましい実施の形態で
は、これらのカップに、“ＲＢＣ”カップ１３４、“Ｒ
ＥＴＩＣ”カップ１３６、“ＷＢＣ”カップ１３８、
“移動”カップ１４０、“ＨＧＢ”カップ１４２、およ
び“洗浄”カップ１４４が設けられている。各サンプル
カップは、液体を受けるために、上部が開いている。サ
ンプルを測定流動セル／トランスデューサに移動するた
めに、ＲＢＣカップ１３４、ＲＥＴＩＣカップ１３６、
ＷＢＣカップ１３８、およびＨＧＢカップ１４２の底部
は、チューブ網１８２（図５に図示）に接続されてい
る。希釈液、試薬、溶解液などの流体をチューブ網１８
２を介してカップに流し込むことも可能であり、これ
は、各種カップの壁部に形成したポート（図示せず）に
チューブ網１８２を接続すれば行うことができる。この
ポートの位置およびポート内径を適切に設定すると、供
給機構により流体が運動する結果、混合が行われる。供
給機構は、チューブ網１８２と連結した希釈用注射器で
あることが好ましい。
【０１６２】ＲＢＣは、例えば先に述べた迅速溶解多目
的試薬システムを使用してＷＢＣ１３８カップ内で溶解
される。したがって、ＷＢＣカップ１３８は、迅速溶解
液とサンプルとの混合物を、好ましくは約４０℃に加熱
する温度制御装置またはヒータを備えている。さらに、
ＷＢＣカップ１３８は、溶解液と全血の組合せとをモー
タ駆動により渦混合するボルテクサ（vortexer）６１０
（図３７）を備えている。
【０１６３】説明を明瞭にするために、図３７から図３
９を参照してサンプル作成の実施の形態について述べ
る。
【０１６４】図３７に示した実施の形態は、装置６１０
である。一般に、装置６１０は、混合装置６１２、流体
分与装置６１４、および混合制御装置６１６を備えてい
る。前記混合装置については、１９９４年１２月１５日
出願の米国特許出願第０８／３５６４１２号に詳しい説
明、および特許請求が行われており、この出願の内容を
すべて参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１６５】混合装置６１２は、流体分与装置（dispen
ser）６１４に作動可能に結合され、流体分与装置６１
４が全血サンプルや細胞懸濁液など、第一の流体を混合
装置６１２に導入できるようになっている。流体分与装
置６１４は、導体６１８により混合制御装置６１６と電
気的に接続されており、混合制御装置６１６が、流体分
与装置６１４の作動を監視および調整できるようになっ
ている。混合制御装置６１６に電気エネルギーを供給す
るために、混合制御装置６１６は、コンジット（condui
t）６２２により電気エネルギー源６２０と電気的に接
続されている。実施の形態において、ピペッタである流
体分与装置６１４は、装置６１０が提供する適当な流体
の供給源と作動可能に接続されている。混合制御装置６
１６は、例えばコンピュータであって、メモリを内蔵
し、装置６１０の作動を制御する適切なルーチンを実行
する。
【０１６６】混合装置６１２の図示した実施の形態は、
第一のハウジング、すなわち内部ハウジング６２４、第
二のハウジング、すなわち外部ハウジング６２６、およ
び結合部材６２７を備えている。内部ハウジング６２４
および外部ハウジング６２６は、ほぼ円筒形状であっ
て、流体分与装置６１４から内部ハウジング６２４の内
部６２８に流体を導入しやすくするために、開放端部を
備えている。内部ハウジング６２４と外部ハウジング６
２６は、ほぼ同軸状に配設されており、内部ハウジング
６２４は外部ハウジング６２６のほぼ内部に配設されて
いる。
【０１６７】図３７および図３９に示す結合部材６２７
は、内部部材６２４および外部部材６２６の開放端部を
ほぼ取り囲み、作動可能に両者を連結している。結合部
材６２７は、第一のほぼ環状な突起６３０および第二の
ほぼ環状な突起６３４を備え、突起６３０は、内部部材
６２４にあって、その開放端部に隣接するほぼ環状なノ
ッチ（notch）６３２と掛合し、突起６３４は、外部部
材６２６にあって、その開放端部に隣接するほぼ環状な
ノッチ６３６と掛合する。突起６３０をノッチ６３２の
内部に保持しやすくするために、ほぼ環状な突起６３０
の外径面をほぼ取り囲むＯリング６３８を設けてある。
Ｏリング６３８は、基本的にスプリングクランプとして
の働きをし、突起６３０をノッチ６３２の内部にほぼ固
定する。装置６１０の作動中、Ｏリング６３８は、内部
ハウジング６２４の開放端部を外部ハウジング６２６の
開放端部に対してほぼ固定する。
【０１６８】内部ハウジング６２４は、内部ハウジング
６２４の内部６２８に流体を導入し、かつ内部６２８か
ら流体を排出する構造を備えている。具体的に述べる
と、内部ハウジング６２４は、流体流入口６４２および
流体流出口６４４を備えている。一つ の実施の形態に
おいて、流体流入口６４２および流体流出口６４４は、
例えば、ステンレス製チューブでできている。また、別
の実施の形態においては、流体流入口６４２が、内部ハ
ウジング６２４に隣接した、コイルなどのコンジットを
備えており、熱エネルギーが、内部ハウジング６２４か
らコンジットに伝達されて、内部ハウジング６２４の内
部６２８に流体が導入される前に、流体に熱が加えられ
るようになっている。実施の形態における流体流入口６
４２は、内部ハウジング６２４の遠端部から軸方向に約
１．４３インチ片寄っている。流体流出口６４４は、内
部ハウジング６２４の近端部６４６のほぼ中央に配設さ
れている。流体が内部ハウジング６２４の内部６２８か
ら流体流出口６４４に流れ込むのを容易にするために、
近端部６４６は内部ハウジングの軸方向壁部から流体流
出口６４４に向かって傾斜させてある。
【０１６９】流体流入口６４２は、適当なコンジット６
４８で、溶解液や希釈液など、内部ハウジング６２４の
内部６２８に導入される第二の流体の供給源６５０に流
体接続されている。供給源６５０からコンジット６４８
を経由して流体流入口６４２および内部ハウジング６２
４の内部６２８まで流体を積極的に流すように、供給源
６５０には、注射器ポンプなどの機構を設けてある。流
体流出口６４４は、適切なコンジット６５２でタンク６
５４に流体接続されている。タンク６５４も、装置６１
０を作動可能に接続した分析装置の他の一部になってい
る。その他の実施の形態において、タンク６５４は、内
部ハウジング６２４の内部６２８から流出する流体を、
処理作業にその流体が必要となるまで蓄える。
【０１７０】内部ハウジング６２４の内部６２８の流体
を希望の温度に保持することが望ましい実施の形態もあ
る。この流体は、流体分与装置６１４から供給される流
体、または供給源６５０から供給される流体、あるいは
その両方から供給される流体を混合した流体である。内
部ハウジング内部の流体を希望の温度に保つために、加
熱要素６５６を作動可能に内部ハウジング６２４に取り
付けてある。図示した実施の形態では、加熱要素６５６
は、電気式加熱要素であり、内部ハウジング６２４の外
径面の一部をほぼ取り囲み、これに接触している。加熱
要素６５６が発生する熱エネルギーは、このようにし
て、内部ハウジング６２４に伝達され、さらに内部ハウ
ジング６２４から内容物、すなわち内部ハウジング６２
４の内部６２８の流体に伝達される。
【０１７１】加熱要素６５６は、導体６５８により、ヒ
ータ制御装置６６０に電気的に接続されている。加熱要
素６５６により所望量の熱エネルギーが生成され、内部
ハウジング６２４に加えられるように、ヒータ制御装置
６６０は、加熱要素６５６に適切な電気エネルギーを供
給する。
【０１７２】加熱要素６５６および内部ハウジング６２
４に関連した温度を監視するために、センサ６６４が、
加熱要素６５６および内部ハウジング６２４に作動可能
に熱接続されている。実施の形態においては、内部ハウ
ジング６２４の外部形状がほぼ一定かつ滑らかになるよ
うに内部ハウジング６２４に凹部を形成して、センサ６
６４を収容している。実施の形態において、センサ６６
４は、抵抗温度検出器である。
【０１７３】一般に、ヒータ制御装置６６０は、内部ハ
ウジング６２４と関連した温度を示す電気信号と基準信
号とを比較し、比較結果を利用して加熱要素６５６を駆
動させる働きをする。
【０１７４】内部ハウジング６２４は、内部ハウジング
の内部６２８の流体を希望の熱エネルギーレベルに維持
するだけでなく、流体分与装置６１４から供給される第
一の流体と、供給源６５０から供給される第二の流体と
を、必要があれば混合する操作も行う。流体の混合を容
易にするために、内部ハウジング６２４の近端部は原動
機６８６（prime mover）に作動可能に接続され、内部
ハウジング６２４が原動機６８６の動きに応答して動く
ようになっている。外部ハウジング６２６の近端部は、
締結具６８７により原動機６８６に固定されている。実
施の形態では、原動機６８６が、カリフォルニア、Ｃｕ
ｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ所在のＳＫＣシナノケンシ（Shinan
o Kenshi Corp.）が発売しているモデルＮｏ．ＬＣ２２
−１０７などの直流電動モータになっている。この実施
の形態の原動機６８６の回転数は、約３，０００ｒｐｍ
である。
【０１７５】リンケージ（linkage）アセンブリ６８８
により、原動機６８６は、作動可能に、すなわち駆動可
能に内部ハウジング６２４と接続されている。リンケー
ジアセンブリ６８８は、駆動部材６９０（第３８図）お
よびベアリング６９２を備えている。駆動部材６９０の
シャフト６９６は、シャフト６９６の溝の周囲に保持し
たロックワッシャなど、適当な手段により、ベアリング
６９２と接続されている。ベアリング６９２は、比較的
柔軟なエラストマ製（elastomeric）Ｏリング６９４に
より、内部ハウジング６２４の近端部と比較的柔軟に弾
性的、機械的に結合されている。エラストマ製Ｏリング
６９４は、内部ハウジング６２４の近端部の運動（例え
ば、偏心運動）によって発生する中心線の角変位を弾性
的に補償する。第３８図に示すように、シャフト６９６
は、駆動部材６９０の中心線からずれている。
【０１７６】駆動部材６９０は、駆動シャフトを収容す
る孔６９８を備えている。この駆動シャフトは、原動機
６８６の駆動シャフトの動きにより、駆動部材６９０が
相補的に運動するように、原動機６８６と連動して回転
することができる。孔６９８にほぼ直角に位置するもう
一つの孔７００が、締結具を収容する駆動部材６９０に
設けられており、この締結具は、駆動部材６９０が原動
機６８６の駆動シャフトと連動するように、原動機６８
６の駆動シャフトに支持される。
【０１７７】内部ハウジング６２４は、原動機６８６の
作動に応答して作動する。内部ハウジング６２４の動作
は、原動機６８６の駆動シャフトの回転運動と異なる。
シャフト６９６の配置の片寄りと、結合部材６２７によ
り形成される、内部ハウジング６２４の開放端部と外部
ハウジング６２６の開放端部との間の接合箇所とによっ
て、内部ハウジング６２４の動作が部分的に決まる。し
たがって、内部ハウジング６２４および外部ハウジング
６２６の開放端部は、ほぼ静止したままであり、結合部
材６２７のエラストマ的性質によって柔軟性に対応する
相対運動が得られる。しかし、内部ハウジング６２４の
近端部は、原動機６８６の駆動シャフトの動作に応答し
て動作する駆動部材のシャフト６９６と自由に連動す
る。シャフト６９６は、駆動部材６９０上に片寄って配
設されているため、一般にシャフト６９６の動作は、ほ
ぼ偏心した経路を経る。したがって、一般に、内部ハウ
ジング６２４は原動機６８６の動作に応答して「振動」
する。内部ハウジング６２４は、原動機６８６に応答し
て、外部ハウジング６２６に対して相対的に自由に回転
することはない点に注意されたい。
【０１７８】原動機６８６の作動を制御し、したがっ
て、内部ハウジング６２４の動作を制御するために、制
御装置７０２を設けている。具体的には、導体７０４に
より制御装置７０２は原動機６８６に電気的に接続され
ている。センサ７０６が内部ハウジング６２４と作動可
能に接続されており、また導体７０８により制御装置７
０２と電気的に接続されており、制御装置７０２に内部
ハウジング６２４の動作を示すフィードバック信号を供
給する。制御装置７０２は、導体７０１により混合制御
装置６１６と、また導体７０３により供給源６２０と電
気的に接続されている。したがって、制御装置７０２お
よび混合制御装置６１６は、原動機６８６の作動を積極
的に調整して、内部ハウジング６２４に所期の動作をさ
せる。
【０１７９】本実施の形態では、磁界を発生させてセン
サ７０６との相互作用を起こすために、駆動部材６９０
に磁石７１０（第３８図）を設けている。一つの実施の
形態において磁石７１０は、エポキシ樹脂接着剤をはじ
めとする接着剤など、適切な手段により駆動部材６９０
の凹部内７１２に保持されている。磁石７１０は、その
Ｓ極がセンサ７０６に対向するように、凹部７１２内で
方向を定めてある。したがって、駆動部材６９０が、原
動機６８６の作動に応答して作動すると、磁石７１０
は、センサ７０６内に周期的電気信号を発生させる。電
気信号はほぼ周期的で、その周波数は、原動機６８６の
駆動シャフトの回転周波数にほぼ等しい。
【０１８０】装置６１０の動作例を示す。以下の記述は
説明のみを目的とするものであることに注意されたい。
【０１８１】説明を明瞭にするために、装置６１０は、
停止しているものとする（すなわち、どこにも通電され
ていない）。オペレータが混合制御装置６１６を操作し
て、装置６１０の運転を開始する。全血、生物的サンプ
ルなど、適当な第一の流体が流体分与装置６１４に供給
される。血液希釈液、溶解液など、適当な第二の流体
が、供給源６５０から供給される。
【０１８２】ヒータ制御装置６６０が、電気エネルギー
の供給源６２０を加熱要素６５６に接続するように、混
合制御装置６１６は、導体６６２を介してヒータ制御装
置６６０に電気信号を送信する。供給源６２０から供給
される電気的エネルギーは、導体６６８および６５８に
そって加熱要素６５６まで流れる。加熱要素６５６によ
り、電気的エネルギーは熱エネルギーに変換される。加
熱要素６５６内の熱エネルギーは、内部ハウジング６２
４に伝達される。一つの実施の形態では、センサ６６４
が、内部ハウジング６２４に関連した温度が約４３℃
（±１．５℃）であることを検出するまで、加熱要素６
５６に電気エネルギーが供給される。第一の流体が全血
である場合、約４５℃未満の温度レベルで、血球表面の
抗原は、実質的に変成することはなく、また血液のタン
パク質は、実質的に凝固しない。多量の血球表面抗原が
変成したり、多量の血液タンパク質が凝固したりする
と、抗原やタンパク質が、装置６１０と、その関連機器
を部分的に覆うことになる。装置と関連機器を覆った抗
原やタンパク質は、不規則に移動し、装置６１０および
関連機器の作動を阻害する。
【０１８３】ヒータ制御装置６６０は、電気エネルギー
の供給源６２０から加熱要素６５６まで流れる電気エネ
ルギーを調整して、内部ハウジング６２４に関連した希
望温度を維持する。したがって、ヒータ制御装置６６
０、したがって加熱要素６５６は、装置６１０や、その
関連機器の作動中、ほぼ連続して作動する。
【０１８４】内部ハウジング６２４が、これに関連する
所望温度になると、混合制御装置６１６は、導体７０１
にそって制御装置７０２に電気信号を送信する。この電
気信号に応答して、制御装置７０２は、原動機６８６を
電気エネルギーの供給源６２０に電気的に接続し、原動
機６８６への通電を行う。原動機６８６は、内部ハウジ
ング６２４を作動、すなわち振動させる。
【０１８５】所定体積の第二の流体、たとえば溶解液約
１２７５マイクロリットル（μｌ）が、注射器ポンプな
ど、適当な機構により、供給源６５０からコンジット６
４８に供給される。第二の流体は、内部ハウジング６２
４の流体流入口６４２を通過して内部ハウジング６２４
の内部６２８に向かう。必要な場合には、所定体積の第
二の流体が内部ハウジング６２４の内部６２８に供給さ
れる前または後に、原動機６８６への通電を行うことも
ある点に注意されたい。所定体積の第二の流体は、原動
機６８６の作動に応答し、第一の所定時間、すなわち約
５秒間内部ハウジング６２４の動きに合わせて移動す
る。第一の所定時間経過後、第二の流体の熱エネルギー
は、内部ハウジング６２４とほぼ同じになる。
【０１８６】混合制御装置６１６は、導体６１８にそっ
て流体分与装置６１４に電気信号を送信する。流体分与
装置６１４は、所定体積の第一の流体、例えば全血約３
７．５μｌを内部ハウジング６２４の内部６２８に導入
する働きをする。一つの実施の形態において、流体分与
装置６１４は、結合部材６２７の開口部６４０に向かっ
て移動する排出ノズルを備えたピペッタである。排出ノ
ズルが開口部に対して適切な位置にくると、所定体積の
第一の流体が内部ハウジング６２４の内部６２８に供給
される。
【０１８７】所定体積の第一の流体が内部ハウジング６
２４の内部６２８に導入されると、原動機６８６の作動
に応答して、第二の所定時間、すなわち約１１秒間、第
一の流体および第二の流体が内部ハウジング６２４内に
供給される。原動機６８６は、装置６１０に関連した共
振周波数とは異なる周波数で作動するのが好ましい。
【０１８８】実施の形態では、上に述べたように、第一
の流体は全血、第二の流体は溶解液であり、原動機６８
６の作動に応答して、内部ハウジング６２４内で流体が
動くことにより、第一および第二の流体はほぼ完全に混
合される。第一の流体と第二の流体との比は、約１：３
５である。全血中の赤血球は、比較的迅速に溶解され、
白血球は比較的すみやかに固定される。すなわち、白血
球の構造がほぼ保護される。第二の流体と内部ハウジン
グ６２４は、ほぼ同じ熱エネルギーレベルにあるので、
第二の所定時間経過後、第一の流体も、ほぼ同じ熱エネ
ルギーレベルに達する。
【０１８９】第一および第二の流体が、適切な時間、内
部ハウジング６２４の内部６２８に供給された後、原動
機６８６が停止する。第一および第二の流体の混合物
は、流体流出口６４４およびコンジット６５２を介し
て、タンク６５４に供給される。前記混合物の移動は、
注射器ポンプなど、流体流出口６４４と作動可能に接続
した適切な手段により行われる。混合物は、さらに処理
を施されるか、必要になるまでタンク６５４に蓄えられ
る。装置６１０は、いつでも運転を継続できる状態にな
っている。
【０１９０】図４は、図３に示したサンプル処理領域１
１０のさらに詳細な図である。図４に示すように、サン
プル処理領域１１０は、通気／吸引（vent/aspirate）
プローブアセンブリ１４８およびインキュベーションプ
ローブアセンブリ１５２を備えている。通気／吸引プロ
ーブアセンブリ１４８（図４Ａに図示）は、通気ニード
ル１５４、吸引プローブ１５６、吸引プローブアセンブ
リ１４８をスライドアセンブリ１６０にそって移動させ
る駆動アセンブリ１５８、通気ニードル１５４を同じス
ライドアセンブリ１６０にそって移動させる駆動アセン
ブリ１５９、および垂直駆動アセンブリ１６１を備えて
いる。通気ニードル１５４および吸引プローブ１５６が
サンプル試験管およびサンプルカップの直上に配置でき
るように、スライドアセンブリ１６０をサンプルカップ
の上部に配置してある。
【０１９１】吸引プローブ１５６が、サンプル試験管や
サンプルカップ内に入り、流体の吸引、注入を行えるよ
うに、吸引プローブ１５６は、吸引プローブ駆動アセン
ブリ１５８によりサンプルカップやサンプル試験管上を
移動する。吸引プローブ１５６が、あらかじめ内容物を
排出してある容器や、その他の封止してあるサンプル試
験管（図示せず）に接近すると、まず通気駆動アセンブ
リ１５９がサンプル試験管上の通気ニードル１５４を移
動させる。ピストンアセンブリ（図示せず）により、通
気／吸引プローブアセンブリ１４８を下方に移動させ、
その結果、通気ニードル１５４がサンプル試験管のキャ
ップを突き破る。通気ニードル１５４がキャップに挿入
されたままになっている間に、垂直駆動アセンブリ１６
１により、吸引プローブ１５６が通気ニードル１５４を
通ってサンプル試験管内に進入し、サンプルを吸引す
る。
【０１９２】細胞分析システム６０は、様々なサイズの
サンプル試験管から流体を吸引し、また各種の封止を施
した試験管に対応できる柔軟性を備えていることが好ま
しい。したがって、垂直駆動アセンブリ１６１には、吸
引プローブ１５６が試験管の底部に達したことを感知
し、吸引プローブ１５６を停止させて、それ以上降下さ
せないスイッチを設けてある。次に、垂直駆動アセンブ
リ１６１が吸引プローブ１５６を上昇させ、血液の吸引
を開始する。
【０１９３】インキュベーションプローブアセンブリ１
５２（図４Ｂに図示）は、インキュベーションプローブ
１６０、第二の駆動アセンブリ１６８を第一のスライド
アセンブリ１６６にそって移動させる第一のインキュベ
ーションプローブ駆動アセンブリ１６４、垂直駆動アセ
ンブリ１６９およびインキュベーションプローブ１６０
を第二のスライドアセンブリ１７０にそって移動させる
第二のインキュベーションプローブ駆動アセンブリ１６
８を備えている。以上の構成により、インキュベーショ
ンプローブ１６０は、直交方向に移動し、サンプル処理
領域１１０にある当該のサンプル処理カップの直上に配
置される。またサブセット／表現型分類トレイ１２４に
あるインキュベーションサイト１３２のいずれか、また
は各試薬モジュール１２２にある６つの試薬凹部１２８
のいずれか、またはインキュベーション洗浄１４４の上
部にインキュベーションプローブ１６０を配置すること
ができる。
【０１９４】垂直駆動アセンブリ１６９により、インキ
ュベーションプローブ１６０は垂直に移動し、その結
果、インキュベーションプローブ１６０は、サンプルカ
ップ、インキュベーションサイト１３２、あるいは試薬
凹部１２８内に進入し、流体の吸引、注入を行う。
【０１９５】図５は、分析装置によるサンプルの処理を
さらに詳細に示す図である。図５に示すように、サンプ
ル処理カップ１３２、１３４、１３６、１３８、１４
０、１４２が移動チューブ１８２のネットワークを介し
て流動セル／トランスデューサ１７０、１７４、１７８
に接続されている。ＲＢＣカップ１３４、ＲＥＴＩＣカ
ップ１３６、およびＷＢＣカップ１３８は、それぞれイ
ンピーダンストランスデューサ１７４および光流動セル
１７０と連絡し、流体が流れるようになっている。ＨＧ
Ｂカップ１４２は、ＨＧＢトランスデューサ１７８と連
絡し、流体が流れるようになっている。
【０１９６】図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃは、それぞ
れ注入、洗浄、吸引操作中のインキュベーションプロー
ブ１６０を示す図である。プローブ１６０は、中央チュ
ーブ１８４と、外部チューブ１８６で構成されている。
インキュベーションプローブ１６０は、中央チューブ１
８４を介して流体の吸引、注入を行う。インキュベーシ
ョンプローブ１６０は、中央チューブ１８４で吸引を行
いながら、中央チューブ１８４と外部チューブ１８６と
の間に形成される環状領域を介して洗浄流体を噴き出
し、サンプルカップまたはインキュベーションサイトあ
るいはその両方を洗浄するのにも使用する。
【０１９７】開示した実施の形態においては、希釈液、
モノクロナール（monoclonal）抗体（ＭＡｂ）試薬、数
種の溶解試薬、および網赤血球染料を分析装置モジュー
ル６４に供給する。ただし、モノクロナール抗体試薬は
必要な場合に供給する。希釈液、溶解試薬、および網赤
血球染料は、分析装置６４に接続した溜め（reservoi
r）１９２および１９６（図７、図８、および図９に図
示）を介して供給する。希釈液および溶解試薬用の溜め
１９２は、バルク保存容器１９３にも接続する。流動ス
クリプト（flow script）から、溜めを満たす要求があ
った場合、溜め１９２のレベル感知スイッチ（図示せ
ず）が、溜めに流体が満たされているかどうかを確認す
る。制御装置が、この時点で溜めに流体を注入できると
判断した場合、圧縮空気制御ライン１８９は、正圧から
水銀柱約１５インチの真空状態に切り替わる。溜め１９
２が一杯になっていることをレベル感知スイッチが感知
するまで、前記真空状態によって、バルク保存容器１９
３から溜め１９２に流体が流れる。溜め１９２が一杯に
なっていることをレベル感知スイッチが感知すると、圧
縮空気制御ライン１８９は正圧にもどり、バルク保存容
器１９３から溜め１９２への流体の流れが止まる。Ｍａ
ｂ試薬は、使い捨てのパッケージ済み試薬モジュール１
２２（図３および図４に図示）から供給される。
【０１９８】分析装置６４には、バルク容器のいずれか
が空になったことを判断する流体センサ（図示せず）が
設けられている。このセンサは、バルク保存容器１９３
と溜め１９２との間のチューブに入り込んだ気泡を検知
する。分析装置６４は、データステーションモジュール
６８にバルク保存容器が空になったことを知らせ、次に
このモジュールがオペレータに対して空容器についての
信号を出す。続いてオペレータは、空容器を充填済み容
器と交換し、次に容器交換が済んだことをユーザインタ
フェースを介してデータステーション６８に知らせる。
すでに開始されているサンプル処理は、溜めに十分試薬
が残っている状態で継続するが、容器交換が済むまで、
分析装置６４は、サンプル試験管からそれ以上サンプル
を吸引しない。
【０１９９】吸引プローブ１５６およびインキュベーシ
ョンプローブ１６０による吸引および分与は、複数のピ
ストンポンプ１９０によって行われる。図７および図８
は、吸引プローブ１５６およびインキュベーションプロ
ーブ１６０が、ピストンポンプ１９０および試薬溜め１
９２に接続されている様子を示す図である。流体の移動
量および流量は、分析装置６４およびデータステーショ
ン１９８によって制御される。
【０２００】図７に示すように、吸引プローブ１５６
は、バルブ１９４およびピストンポンプ１９０を介して
希釈液溜め１９２に接続されている。図８は、インキュ
ベーションプローブ１６０が、バルブ２００およびピス
トンポンプ１９０を介して希釈液溜め１９２に接続され
ている状態を示す図である。
【０２０１】ピストンポンプ１９０は回転可能であっ
て、各ピストンが回転するごとに、所定体積の流体を吸
引することができる逆転可能ポンプであることが好まし
い。各ピストンポンプ１９０は、ピストンが一定方向に
回転するにしたがって流体を吸引し、逆方向に回転する
と流体を注入する。米国特許出願第４９４１８０９号公
報、第５０１５１５７号公報、第５０２０９８０号公
報、および第５０４４８８９号公報に適切なピストンポ
ンプが開示されている。参照により、これら特許の開示
をすべて本明細書に組み込むものとする。
【０２０２】図９は、網赤血球染料溜め１９６がバルブ
２０２、２０３および網赤血球染料注射器１９１を介し
て網赤血球カップ１３６に接続されている様子を示す図
である。
【０２０３】計量した希釈液も、希釈液注射器（図示せ
ず）およびチューブ網１８２を介してサンプルカップに
供給される。希釈液注射器および網赤血球染料注射器１
９１は、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、図１１Ｂ、お
よび図１２に示す供給注射器２０４、２０６、２０８と
ほぼ同じものである。希釈液注射器は、チューブ網１８
２に接続されてもよい。
【０２０４】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、図１１
Ｂ、および図１２は、いつでも測定が行えるようになっ
ているサンプルをサンプルカップから流動セル／トラン
スデューサ１７０、１７４、１７８に供給する様子を示
す図である。
【０２０５】図１０Ａは、ポンプ２２０を介してサンプ
ルをサンプルカップ２１６からインピーダンストランス
デューサ１７４の近くにバルク移動（bulk transfer）
する様子を示す図である。図１０Ｂは、ＲＢＣ供給注射
器２０４からインピーダンストランスデューサ１７４に
サンプルを計量供給する様子を示す図である。サンプル
カップ２１６は、チューブ１８２によりＲＢＣ注射器２
０４、インピーダンストランスデューサ１７４、および
蠕動ポンプ２２０に接続されている。第一のバルブ２１
０は、サンプルカップ２１６より下流のチューブ１８２
に配置され、第二のバルブ２１２は、蠕動ポンプ２２０
より上流のチューブ１８２に配置されている。ＲＢＣ注
射器２０４から流れる流体の流量および前記注射器の一
般的な動作は、分析装置の電子機器およびソフトウェア
によって自動的に制御されている。
【０２０６】図１０Ａに示すように第一および第二のバ
ルブ２１０、２１２が開いている状態で、蠕動ポンプ２
２０が作動すると、サンプルカップ２１６からインピー
ダンストランスデューサ１７４の近くへサンプルがバル
ク移動する。図１０Ｂに示すように第一および第二のバ
ルブ２１０、２１２が閉じた状態でＲＢＣ注射器２０４
のプランジャ２２４が規定速度で所定距離だけ移動する
と、ＲＢＣ注射器２０４からインピーダンストランスデ
ューサ１７４にサンプルが計量供給される。
【０２０７】図１１Ａは、ポンプ２３２を介して、サン
プルカップ２３０から光流動セル１７０の近くにサンプ
ルがバルク移動する様子を示す図である。ポンプ２３２
は、ポンプ２２０とほぼ同じものである。図１１Ｂは、
ＷＢＣ供給注射器２０６によりサンプルが光流動セル１
７０に計量供給される様子を示す図である。サンプルカ
ップ２３０は、チューブ１８２により、ＷＢＣ注射器２
０６、光流動セル１７０、および蠕動ポンプ２３２に接
続されている。第一のバルブ２３６は、サンプルカップ
２３０より下流のチューブ１８２に配置され、第二のバ
ルブ２３８は、蠕動ポンプ２３２より上流のチューブ１
８２に配置されている。
【０２０８】図１１Ａに示すように第一および第二のバ
ルブ２３６、２３８が開いている状態で、ポンプ２３２
が作動して、ある量のサンプルを光流動セル１７０の近
くに移動させると、サンプルカップ２３０から光トラン
スデューサ１７０の近くへサンプルがバルク移動する。
図１１Ｂに示すように第一および第二のバルブ２３６、
２３８が閉じた状態でＷＢＣ注射器２０６のプランジャ
２４０が規定速度で所定距離だけ移動すると、ＷＢＣ注
射器２０６から光流動セル１７０にサンプルが計量供給
される。
【０２０９】図１２は、ＨＧＢサンプルカップ１４２か
らＨＧＢトランスデューサ１７８にサンプルがバルク移
動する様子を示す図である。チューブ１８２により、Ｈ
ＧＢサンプルカップ１４２は、ＨＧＢトランスデューサ
１７８およびポンプ２４６に接続されている。ポンプ２
４６は、ポンプ２２０とほぼ同じものである。バルブ２
４８は、ＨＧＢサンプルカップ１４２より下流のチュー
ブ１８２に配置されている。バルブ２４８が開いた状態
で蠕動ポンプ２４６が作動すると、ＨＧＢサンプルカッ
プ１４２からＨＧＢトランスデューサ１７８にサンプル
がバルク移動する。
【０２１０】Ｃ．光流動セル／トランスデューサ 各細胞の光学的特性を検出し、有意味な情報に変換する
ために、流動している流体内で光流動セル１７０により
細胞は相互に分離される。図１５および図１６は、細胞
分析システム６０と併用する流動セル１７０を示す図で
ある。
【０２１１】一つの実施の形態において（図４３に図
示）、光流動セル１７０は、無色透明な水晶ブロックで
あって、断面寸法が約１６０μｍ×４００μｍで、薄く
細長い矩形の内部流動チャンバ３００（図１６）を備え
ている。約３０°の角度を持つ、ほぼ円錐型の経路が、
流動チャンバ３００の一端から当該流動チャンバ内に収
束している。希釈されたサンプル流は、移動するシース
流３０４の中心に位置するノズル２７０から流動チャン
バ３００に注入される。サンプルは、サンプルの流れの
軸に直交する、約５μｍ×８０μｍの微小断面に集束
し、流動チャンバ３００の中心に限って流れるようにな
っており、この方法をハイドロダイナミック（hydro-dy
namic）または流体集束法（fluid focusing）と呼ぶ。
集束させたサンプルの流れの軸の所定位置で、サンプル
の流れに直交するように、レーザビームを流動チャンバ
３００に入射させる。以下の第８節、Ｆに述べるよう
に、レーザビームがサンプルの流れと交差する箇所で、
レーザビームは、流れの軸に平行な長さ約１７μｍの部
分に集束する。したがって、サンプルの流れとレーザビ
ームが集束する、流動チャンバ３００の中心部にサンプ
ル照明領域ができ、この領域の縦、横、高さの寸法の
内、二つがサンプルの流れによって決まり、三つ目がレ
ーザビームの程度によって決まる。この照明領域は、寸
法が、約５μｍ×８０μｍ×１７μｍであって、流動セ
ル１７０の感知領域になっている。各細胞は、この領域
を通過する際に検出され、制御装置がデータを収集、処
理し、結果を報告する。図４３を参照。
【０２１２】図３１から図３６を参照して、以下、ノズ
ル２７０の詳細について述べる。
【０２１３】図３２に示すように、本明細書に開示する
実施の形態は、流体ノズル２７０と、分析装置で使用す
る流体８１２の導入方法に関する。
【０２１４】図３１に示す実施の形態では、流体ノズル
２７０は、コンジット、すなわち流体８１２の流動ガイ
ド８１４と、流体８１２内にある細胞、粒子などの対象
物を検出する流動セル１７０とに動作可能に接続されて
いる。図示した実施の形態では、流動ガイド８１４は、
アクリルを初めとするポリマーなど、適切な材料から形
成されたコンジットを備え、流体ノズル２７０を収容す
る孔８１８が設けられている。流体ノズル２７０は、流
動ガイド８１４とほぼ同心に配置し、流体８１２を流体
ノズル２７０から孔８１８に導きやすくしてある。適切
な供給源から供給される所望の流体８４４が、コンジッ
ト８２０を介して孔８１８に注入できるように、コンジ
ット８２０は、孔８１８と流体が流れるように接続され
ている。流動セル１７０は、上に述べたような光流動セ
ルであって、流体８１２が流動セル１７０を介して流体
ノズル２７０から流れる際に、流体８１２に含まれる対
象物の測定を行う。白血球の鑑別分析、血小板分析、ま
たは網赤血球分析あるいはこれらすべてを行うのに、流
動セル１７０を利用する実施の形態もある。このような
実施の形態では、相互に独立した処理経路内で各分析の
準備操作を行い、一つの流動セル１７０で分析を実施す
る。
【０２１５】図３２および図３３に、流体ノズル２７０
の構造をさらに明瞭に図示する。一般に、流体ノズル２
７０は、マニフォールド８２２と、流体が流れるように
マニフォールド(manifold)８２２と接続された複数のコ
ンジットとを備えている。コンジットの数を選択して、
特定の流体ノズル２７０を利用しやすくすることができ
る。具体的にいえば、実施の形態では、第一のコンジッ
ト２６２、第二のコンジット２６４、および第三のコン
ジット２６６を、流体が流れるようにマニフォールド８
２２の一部と接続されている。コンジット２６２、２６
４、および２６６は流体８１２の入口として使用でき
る。したがって、コンジット２６２、２６４、および２
６６は、流体が流れるように所望の流体８１２の適当な
供給源と接続されている。
【０２１６】ある実施の形態において、マニフォールド
８２２は、アクリルなど、適切なポリマーで作製されて
おり、長さが約０．７インチある。コンジット２６２、
２６４、および２６６は３１６ステンレス鋼など、適当
な金属でできている。コンジット２６２は、軸方向長さ
が約１．１４インチ、内径が約０．０２３インチ、外径
が約０．０６２５インチある。コンジット２６４および
２６６は、軸方向長さが約０．５インチ、内径が約０．
０１９インチ、外径が約０．０６２５インチある。コン
ジット２６２、２６４、および２６６の外面は、エポキ
シ樹脂などの接着剤で被覆され、マニフォールド８２２
に設けた補助孔８３０、８３２、および８３４にそれぞ
れ挿入されている。図示した実施の形態では、コンジッ
ト２６２、２６４、および２６６が、マニフォールド８
２２上で軸方向および円周方向にずれている。コンジッ
ト２６６は、マニフォールド８２２の端部８３１から約
０．０７インチだけ軸方向に逸れている。コンジット２
６４は、端部８３１から約０．２６インチ逸れており、
コンジット２６６は、端部８３１から軸方向に約０．４
５インチ逸れている。円周方向には、コンジット２６２
および２６６が、それぞれコンジット２６４から約６０
°逸れている。したがって、コンジット２６２は、コン
ジット２６６から約１２０°逸れている。
【０２１７】マニフォールド８２２は、コンジット２６
２、２６４、および２６６をそれぞれコンジット２７
２、２７４、および２７６と流体が流れるように接続し
ている。コンジット２７２、２７４、および２７６は、
やはりマニフォールド８２２と作動可能に接続されてい
る。マニフォールド８２２により、コンジット２７２、
２７４、および２７６の内いずれか一本を、ある流体専
用とするか、またはノズル２７０と接続した装置で前記
一本のコンジットの試験を行うことができる。
【０２１８】コンジット２７２、２７４、および２７６
は、流動ガイド８１４とほぼ同軸状にかつほぼ同心状に
配設されている。ノズル２７０から流動セル１７０への
流体８１２の流れの位置精度が所期の値になるように、
流動ガイド８１４および流動セル１７０に対するコンジ
ット２７２、２７４、および２７６の配置を選択するこ
とができる。マニフォールド８２２は、ほぼ同軸状に配
設したコンジット２７２、２７４、および２７６を収容
する孔４２を備えている。コンジット２６２、２６４、
および２６６内の流体８１２は、マニフォールド８２２
を流れて、それぞれコンジット２７２、２７４、および
２７６に入る。コンジット２７２、２７４、および２７
６は、全体がほぼ直線になっている。ところで、コンジ
ット２７２、２７４、および２７６の同軸状の配置を保
つために、コンジット２７２と２７４の間、およびコン
ジット２７４と２７６の間に半径方向のスペーサ（図示
せず）を設けた実施の形態もある。このスペーサは、流
体８１２の動きがコンジット２７２、２７４、および２
７６内の流体８１２の動きに干渉しないように、例えば
外径面の逃げや経路を設けて構成されている。図示した
実施の形態では、コンジット２７２、２７４、および２
７６の遠端部が軸方向に相互に逸れているが、必ずしも
そうなっている必要はない。
【０２１９】実施の形態において、コンジット２７２
は、３０４ステンレス鋼、＃３（総硬質）焼戻し皮下注
射針など、適切な金属でできている。コンジット２７２
は、軸方向の長さが約２．５５インチ、内径が約０．０
１３インチ、外径が約０．０２５インチある。コンジッ
ト２７４も３０４ステンレス鋼、＃３（総硬質）焼戻し
皮下注射針など、適切な金属でできており、軸方向の長
さが約２．２６インチ、内径が約０．０３８インチ、外
径が約０．０５０インチある。コンジット２７６もやは
り３０４ステンレス鋼、皮下注射針など、適切な金属で
できており、軸方向の長さが約１．９７インチ、内径が
約０．０６２インチ、外径が約０．０７８インチある。
【０２２０】一つの実施の形態において、流動ガイド８
１４は、点Ａの内径が約０．２５インチ、点Ｂの内径が
約０．１１８インチあるテーパ付部分を備えている。第
３１図に点Ａおよび点Ｂを示してある。例えば、流体８
１２を希望通りに流体集束させ、流動ガイド８１４と流
体８１２が接触の可能性を減少させ、流動セル１７０の
光学系や作動を最適化するために、関連コンジット２７
２、２７４、２７６と、流動ガイド８１４の対応寸法の
間の関係をあらかじめ定めておく。寸法の関係が、流量
の差に関係する実施の形態もある。具体的にいえば、実
施の形態において、流動ガイド８１４の関連部分の縦方
向断面は、関連流量差に比例する。
【０２２１】例示的実施の形態では、テーパ付部分が約
６０°の傾きを画定する。また、流体ノズル２７０の遠
端部に隣接した流動セル１７０の流体搬送部分が、内径
約０．１１８インチで約３０°の傾きを画定する。流動
セル１７０に対する、流体８１２の流動の位置精度が希
望通りになるように、寸法を選択することができる。
【０２２２】流体ノズル２７０の構造について詳細に説
明したので、以下、流体ノズル２７０で流体を導入する
方法について詳しく述べる。
【０２２３】血液、血液成分など、流動セル１７０で処
理を行う流体８１２の供給源は、流体が流れるようにコ
ンジット２６２、２６４、または２６６と接続され、流
体８１２が供給源から選択されたコンジット２６２、２
６４、または２６６に流れる。コンジット２６２、２６
４、２６６のうち、残りのコンジットは、流体８１２の
供給源と流体が流れるように接続されておらず、したが
って、これら残りのコンジットには、流体８１２が供給
されない。流体８１２は、粒子、細胞など、流動セル１
７０で検出可能な対象物を含む。
【０２２４】水、緩衝液、希釈液、その他、流体８１２
と反応して悪影響を及ぼさない流体など、別の流体８４
４の供給源が、コンジット８２０と接続されており、他
の流体８４４が供給源からコンジット８２０および流動
ガイド８１４に流れるようになっている。コンジット８
２０から流動ガイド８１４に流入する流体８４４は、図
３４から図３６に示すように、コンジット２７２、２７
４、および２７６の一部を取り囲む。コンジット２７
２、２７４、および２７６が片寄って配置されているた
め、流体８４４の流れが途切れることが少なくなる。流
動ガイド８１４を貫通する流路の縦方向断面が徐々に狭
くなっているため、流動ガイド８１４内部で流体が拡散
する可能性は低くなる。必要な場合には、流体８１２
が、コンジット２７２、２７４、および２７６の内、い
ずれか一本を流れる際に、例えば、比較的低い適当な圧
力をコンジット２７２、２７４、および２７６の残り二
本のコンジットに加えて、前記二本のコンジットを流体
８４４で洗浄、すなわち「バックフラッシュ(back-flus
hed)」することができる。あるいは、各コンジット２７
２、２７４、および２７６を介して流体８１２を連続的
に導入した後、コンジット２７２、２７４、および２７
６に適当な流体を通して、この三つのコンジットをすべ
て同時に洗浄することも可能である。したがって、コン
ジット２７２、２７４、および２７６をほぼ同時に洗浄
できるため、流体８１２を迅速に導入する準備をすると
ともに、ノズル２７０の洗浄に必要な損失時間を短縮す
ることによって、流動セル１７０のスループット(throu
gh put)を増大させることができる。また、流動セル１
７０に接続した分析装置のスループットも、これに相応
して増大させることができる。
【０２２５】実施の形態では、流体８４４の流量が、流
体８１２の流量よりも大きい。例えば、一つの実施の形
態では、流体８１２の流量が、約２．５μｌ／秒、流体
８４４の流量が、約３００μｌ／秒となっている。この
流量の差により、流体８１２の流れは、流動セル１７０
に向かって導かれる。すなわち、流動セル１７０に集束
することになる。一般に、流動セル１７０による流体８
１２内の対象物の検出が容易になるように、流量差をあ
らかじめ定めることが可能である。
【０２２６】コンジット２７２、２７４、２７６のいず
れかで導入した流体８１２は、流動セル１７０に対して
ほぼ同じ位置に集束されるため、流体８１２を導入する
のに、コンジット２７２、２７４、または２７６のいず
れを選択するかにかかわらず、流量差を利用して流体の
集束させる点に変わりはない。このため、同一の流動セ
ル１７０を利用して、各コンジット２７２、２７４、２
７６から別々の流体８１２を供給することができ、また
流体ノズル２７０を接続した分析装置で実施する各種試
験でも同じ流動セル１７０を使用することができる。し
たがって、各コンジット２７２、２７４、２７６は、流
体が流れるように、流体８１２の、それぞれ独立した供
給源に接続され、ある供給源から供給される流体８１２
が、別の供給源から供給される流体８１２と混ざりあう
ことがないようになっている。これにより、流体８１２
の混合または汚れあるいはその両方が発生する確率を低
くすることができる。各コンジット２７２、２７４、２
７６から供給される流体８１２を流動セル１７０でほぼ
並行して処理し、流体ノズル２７０、およびこのノズル
を接続した分析装置のスループットを向上させることが
できる。
【０２２７】流体ノズル２７０のこの特徴は、実験的に
確認されている。図３４から図３６に図示した実験にお
いて、流体ノズル２７０の実施の形態を有限要素法によ
って解析し、ノズル２７０に関連した流体の特性を明ら
かにした。この実施の形態では、コンジット２７２の内
径が約０．０１３インチになっている。コンジット２７
４の遠端部は、コンジット２７２の遠端部から約０．２
９インチ逸れている。コンジット２７２および２７４
は、内径が約０．０２５インチ、外径が約０．０３７イ
ンチの、ほぼ環状の流路を画定する。コンジット２７６
の遠端部は、コンジット２７４の遠端部から約０．２９
インチ逸れている。コンジット２７４および２７６は、
内径が約０．０４９インチ、外径が約０．０６１インチ
の、ほぼ環状の流路を画定する。
【０２２８】米国イリノイ州のＦｌｕｉｄ Ｄｙｎａｍ
ｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｏｆ Ｅｖａｎ
ｓｔｏｎから市販のＦＩＤＡＰコンピュータプリグラ
ム、バージョン６．０１を使用して、有限要素解析を行
った。コンジット２７２、２７４、２７６を流れる流体
の定常線対称モデル、および流動セル１７０を流れる流
体の定常三次元モデルを解析して、流動セル１７０に対
して流体的に集束させた流体８１２の位置が、流体８１
２の導入に使用するコンジット２７２、２７４、２７６
とは無関係であることを明らかにした。流体８４４の流
量は、常に約３００μｌ／秒であり、選択したコンジッ
ト２７２、２７４、または２７６を流れる流体８１２の
流量は、約２．５μｌ／秒から約２．０μｌ／秒の範囲
にあった。流体はニュートン流体であり、固体表面での
すべりはないという境界条件を仮定して、解析を行っ
た。
【０２２９】一つの実施の形態において、白血球の鑑別
分析、血小板の分析、および網赤血球の分析のシミュレ
ーションを行うために、個別の流体分析を３度行った。
図３４に示すように、白血球鑑別分析用流体８１２をコ
ンジット２７２を介して流量約２．５μｌ／秒で導入す
る。また、第３５図に示すように、血小板分析用流体８
１２をコンジット２７４を介して流量約２．５μｌ／秒
で導入する。さらに、図３６に示すように、網赤血球分
析用流体８１２をコンジット２７６を介して流量約２．
０μｌ／秒で導入する。図３４から図３６を比較してみ
ると、流体分析により得られた各コンジット２７２、２
７４、２７６の流線から明らかなように、流体８１２の
前の流れにより流体８１２は汚染されず、また流動セル
１７０に対する流体８１２の流体的な集束位置は、コン
ジット２７２、２７４、２７６のいずれを選択しても影
響を受けない。
【０２３０】コンジット２７２、２７４、２７６のいず
れを選択しても流動セル１７０に対する流体８１２の流
体的な集束位置に影響がないことは、コンジット２７
２、２７４、２７６を順次流れる、直径７μｍの小球を
含んだ流体８１２の流れを光学的に測定しても、実験的
に確認できる。小球を含む流体８１２は、流量約２μｌ
／秒で導入する。
【０２３１】変動係数 整合指数［％］ ＡＬＬ ＩＡＳ ＤＳＳ コンジット２７２ ４．７ ３．２ ２．６ ４．３ ３．１ ２．２ コンジット２７４ ５．０ ３．６ ２．０ ４．６ ４．２ ２．６ コンジット２７６ ４．３ ３．１ ２．４ ５．１ ２．８ ２．７ 上記の変動係数から明らかなように、測定した三つの光
学特性（ＡＬＬ：軸光損失、ＩＡＳ：中間角光散乱、Ｄ
ＳＳ：復偏光側方散乱）の変動係数は（ＣＶ）、コンジ
ット２７２、２７４、２７６すべてについてほぼ同じで
あった。光学的応答がこのように類似していることか
ら、流体ノズル２７０を、洗浄前に流体８１２の複数の
測定に使用し、流動セル１７０、および流動セル１７０
と接続した分析装置のスループット、すなわち分析能力
を向上させることが可能であることが確認できる。洗浄
前に行う流体８１２の測定の回数または流体８１２の導
入の回数は、流体ノズル２７０を設けたコンジットの数
に対応する。本明細書に述べた実施の形態では、必要な
コンジットの数にかかわらず、ほぼすべてのコンジット
をほぼ同時に洗浄することが可能である。
【０２３２】流体８１２が、コンジット２７２、２７
４、および２７６の一部と作用する特性、すなわち前記
一部に付着する特性を十分備えている場合、コンジット
２７２、２７４、または２７６内の第一の流体の残り
が、同じコンジット２７２、２７４、または２７６を通
過した第二の流体と混じる。コンジット２６２、２６
４、および２６６についても、同じことが考えられる。
第一の流体の残りと第二の流体とが混じると、流動セル
１７０の精度が低下する恐れがある。
【０２３３】特定のコンジット２７２、２７４、または
２７６を、特定の流体８１２や流動セル１７０で行う試
験の専用として、以上のような問題を解決することが可
能である。専用とするコンジット２７２、２７４、２７
６の数は、流体ノズル２７０によって導入する流体８１
２の特性によって決まる。コンジット２７２、２７４、
２７６のうち少なくとも一つを分離することによって、
ある流体８１２の残りが別の流体８１２と混じりにくく
することができる。例えば、あるコンジット２７２、２
７４、または２７６を、オーラミンＯ（auramine O）な
ど、比較的明るい蛍光マーカを含む流体８１２を使用し
た試験専用とし、別のコンジット２７２、２７４、また
は２７６を、比較的暗い蛍光マーカを含む流体を使用し
た試験専用とすることができる。コンジット２７２、２
７４、または２７６内に流体が存在すると、流体ガイド
８１４を通って流れる流体８４４は、共通の流動セル１
７０に向かって流体８１２の流れを集束させるのと並行
して流体８１２の拡散の可能性を低下させられるだけの
体積および流れを確保できる。したがって、流動セル１
７０の精度や感度を損なうことなく、同一の流動セル１
７０によって、２種類の試験を順次行うことができる。
【０２３４】流体が上昇して矩形断面の流動セル１７０
に入ると、その速度が迅速に増大し、その結果、サンプ
ルの流れは、流体力学的に、断面積の約５μｍ×８０μ
ｍの中心部分に集束する。図２２に示す広角コンデンサ
レンズの焦点方向の寸法が５μｍと小さいため、焦点の
ぼけが最小限度に抑えられ、したがって、流れの中の異
なる位置になる蛍光細胞の明るさが等しくなる。また、
流動チャンバ３００の幅が、サンプルのながれよりはる
かに大きいため、流動チャンバ３００は、簡単には詰ま
らず、さらに狭小な感知領域によって得られる解像度に
匹敵する解像度が得られる。
【０２３５】集束レンズ（図１９に図示）は、レーザビ
ームを流動チャンバ３００に集束させ、検出器（図２０
および図２１に図示）は、流動チャンバ３００を通過す
る細胞の光散乱特性または蛍光特性あるいはその両方を
検出する。これらの特性は、本明細書の第８節、Ｆで詳
細に説明する。
【０２３６】Ｄ．インピーダンストランスデューサ 細胞分析装置６０では、赤血球および血小板のカウント
を行うのに、インピーダンストランスデューサ１７４を
使用する。第１７図に示すのは、流体力学的集束を利用
し、インピーダンスに基づいて細胞のカウントおよび細
胞のサイズ分けを行うインピーダンストランスデューサ
１７４の好適な実施の形態である。インピーダンスに基
づく細胞のカウントの基本は、粒子が小さなオリフィス
３１４を通過する際に示す電気抵抗の変化を検出するこ
とである。インピーダンストランスデューサ１７４の二
つのチャンバ３１０および３１２内の電解液（緩衝食塩
水など）によって、伝導が行われる。
【０２３７】サンプル導入ノズル３１６および流体力学
的集束によって、細胞は、インピーダンストランスデュ
ーサ１７４のオリフィス３１４まで導かれる。各細胞が
オリフィス３１４を通過する際、チャンバ３１０、３１
２およびオリフィス３１４内の流路の電気抵抗が増大す
る。オリフィス３１４のどちらかの側のチャンバ３１０
および３１２の内部に、後述する二本の電極を配設し、
この二本の電極に電流源３１７を接続してあるため、上
に述べた抵抗の増大が電圧パルスとして現われる。サン
プル導入ノズル３１６は、上流側電極の役目を兼ねてい
る。第二の電極３１８は、オリフィス３１４の下流側に
配置されている。パルスの数は、細胞のカウントを示
し、各パルスの振幅は、細胞の体積と関係する。パルス
の振幅の周波数分布をグラフ化して、体積のヒストグラ
ムを作成する。このヒストグラムを利用して、ＭＣＶ
（平均細胞体積）やＲＤＷ（赤血球分布幅）など、ＲＢ
ＣやＰＬＴのパラメータを求める。
【０２３８】インピーダンストランスデューサ１７４
は、アクリルや類似のポリマーなど、非導電性かつ無色
透明な材料で作製することが好ましい。トランスデュー
サ１７４内の第二の電極３１８の極性で電解液が腐食性
ガスを発生し、なんらかの電極材料を溶解するため、第
二の電極は、プラチナ製にすることが好ましい。電極３
１８には、耐腐食性抵抗を備えたその他の材料を使用し
てもよい。本明細書のトランスデューサ１７４の作動に
影響を与えることなく、トランスデューサ１７４の上流
側のチャンバ３１０の容積を小さくすることもできる。
サンプル導入ノズル３１６は、オリフィス３１４から約
１．５ｍｍ以内に配置することが好ましい。作動中、シ
ース流速度（オリフィス通過時に約１０ｍ／秒）を比較
的高く保つとともに、ノズル３１６とオリフィス３１４
との間の距離を維持する必要がある。
【０２３９】非流体力学的に焦点を合わせたインピーダ
ンストランスデューサを通過する細胞の約３０％は、流
動セルのオリフィスの中心ではなく、オリフィスの縁部
近くを通過する。これにより、オリフィスが詰まり、測
定値が狂う場合がある。細胞分析装置６０のインピーダ
ンストランスデューサ１７４内で流体力学的集束を行
い、オリフィスの閉塞を抑え、測定精度を向上させるこ
とができる。
【０２４０】インピーダンストランスデューサ１７４内
での流体力学的集束は、以下のような手順で行う。ＲＢ
Ｃ供給注射器２０４（図１０Ａおよび図１０Ｂに図示）
が、約０．３３３μｌ／秒の割合で、インピーダンスト
ランスデューサ１７４のノズル３１６にサンプルを供給
する。サンプル流は、インピーサンストランスデューサ
のノズル３１６から流出する際、ＲＢＣシース流３１５
により速度約１０ｍ／秒まで加速される。サンプルの体
積流量は、速度と断面積との積であるため、サンプルが
加速するにつれて、断面積は減少するが、約０．３３３
μｌ／秒で一定していることが好ましい。好ましい実施
の形態では、１０m／秒まで加速すると、サンプルの流
れの直径が約６．５μｍまで減少する。
【０２４１】赤血球がオリフィスを出たと同時に赤血球
を「捕捉(catch)」するために、インピーダンストラン
スデューサ１７４には、オリフィス３１４のすぐ下流に
排出チューブ３１４ａが設けられている。オリフィス３
１４から出た後で廃棄されない赤血球は、オリフィスの
近くに戻る場合がある。このような赤血球は、血小板の
測定に悪影響を与える信号、さらには赤血球の測定にも
わずかながら障害を与える信号を発生する。測定済み細
胞の捕捉を促すために、細胞が排出チューブ３１４ａ内
を流れやすくするだけの目的で、（ポートＥを介して）
第二の流れを生成する。
【０２４２】インピーダンストランスデューサ１７４に
は、数箇所のポート（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）も設けられ
ている。ポートＡは、オリフィス３１４の上流側から空
気（またはその他のガス）を逃がす通気口である。ポー
トＢは、トランスデューサ１７４の上流側の流体を排出
させるためにチャンバ３１０に空気を注入する注入口で
ある。シース流入ポートとともに、ポートＤは、トラン
スデューサの上流側の排出口である。ポートＣは、トラ
ンスデューサ１７４の下流側の流体を排出させるために
チャンバ３１２に空気を注入する注入口である。また、
ポートＣは、トランスデューサ１７４の下流側からガス
を逃がす通気口ともなる。ポートＥは、第二の流れの排
出口および流入口である。ポートＧは、廃棄流体の流出
口である。本実施の形態では使用しないが、ポートＨ
は、トランスデューサ１７４の上流側に追加の流体を流
入させる接線方向流入点を設けるために使用する。
【０２４３】Ｅ．ＨＧＢトランスデューサ ＨＧＢトランスデューサ１７８は、血液サンプル中の細
胞の吸光を測定して、血液サンプルのＨＧＢレベルを決
定する。第１８図に、ＨＧＢトランスデューサ１７８か
ら出る分析信号を検出する回路のブロック線図ととも
に、ＨＧＢトランスデューサ１７８を示す。一つの実施
の形態において、ＨＧＢ濃度は、ｇ／ｄｌ単位で測定す
る。前記濃度は、グリーンの波長領域（約５４０ｎｍ）
にあるサンプルが吸収する光の量に比例する。
【０２４４】ＨＧＢトランスデューサ１７８は、ＨＧＢ
トランスデューサチャンバ３３８内の液体の吸光に関連
した電気信号を生成する。吸光量は、ヘモグロビンを含
む準備されたサンプルおよび無色透明な基準液につい
て、ＨＧＢトランスデューサ１７８内で測定する。前記
２種類の液体の吸光測定中にトランスデューサから生成
した電気信号の差は、準備されたサンプル中のヘモグロ
ビン含有量にほぼ比例する。
【０２４５】例えば、透明なＨＧＢトランスデューサチ
ャンバ３３８を、発光ダイオードなどの光源３２２と、
フォトダイオードなどの検出器３２６との間に配置する
（第１８図）。好ましくは、定格約５４０ｎｍの干渉フ
ィルタ３２６を、ＨＧＢトランスデューサ３３８と検出
器３２４との間に配置する。検出器３２４の出力電流
は、吸収した光エネルギーにほぼ比例し、電流／電圧増
幅器３３２で増幅される。ＨＧＢ信号のアナログ信号処
理については、電子システムと関連させて、本明細書の
第８節、Ｆで述べる。
【０２４６】流入してくるＨＧＢ溶解試薬の速度を利用
して、ＨＧＢカップ１４２内で全血を混合し、好ましく
は、希釈比を１９０：１とする。例えば、蠕動性のポン
プ２４６を使用し、ＨＧＢカップ１４２に接続したチュ
ーブ網１８２を介してＨＧＢカップ １４２からサンプ
ルを吸引し、ＨＧＢトランスデューサチャンバ３３８に
注入する。ＨＧＢカップ１４２をＨＧＢ溶解試薬で洗浄
し、サンプルの残りが、以後処理されるサンプルと極力
混じらないようにする。ＨＧＢ試薬をＨＧＢトランスデ
ューサに直接入れて、ＨＧＢの基準値を求める。
【０２４７】Ｆ．光ベンチ 図１９に、光ベンチ３５０の平面図を示す。光ベンチ３
５０は、分析装置モジュール６４に搭載されており、レ
ーザ光源３５２、ミラー３５４および３５６、レンズ３
５８および３６０、流動セル１７０（実施の形態では溶
融シリカ）、複数の検出器４００、４０２、および４０
４を備えている。レーザビーム３６８は、後部ミラー３
５４、前部ミラー３５６、ビーム調整器３７０によって
導かれ、一対の円筒状レンズ３５８およびレーザ集束レ
ンズ３６０により成形され集束される。
【０２４８】レーザ３５２は、ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｖｅ
ｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ）モードで作
動する、垂直方向に偏光された４８８ｎｍの光フィード
バック装備空冷アルゴンレーザ（単相２１１４Ｂ-１２
５ＬＡＢまたは同等品）であることが好ましい。このモ
ードでは、光の強度がガウス分布になっており、同位相
である。レーザビーム３６８は、レーザ回路内の光フィ
ードバックシステムにより、約１０ｍＷに保持される。
【０２４９】レーザ３５２と光流動セル１７０との間の
光学要素は、光流動セル１７０の流動チャンバ３００に
おけるガウス焦点ビームの腰部（waist）は、ほぼ楕円
形で、高さが約１７μｍ、幅が約６４μｍある。ビーム
の腰部とは、軸に直交する所与の方向でビーム断面寸法
が最小になる、レーザビームの軸に沿った位置で画定さ
れる。図１９に示す好ましい実施の形態では、直交する
二つの対称な平面、すなわち垂直面と水平面を特徴と
し、この両面はレーザビームの光軸を含む。したがっ
て、ビームの軸に沿ったどの位置でも、ビームの程度
は、直交する二つの寸法、すなわち、水平方向の寸法と
垂直方向の寸法によって規定される。垂直方向の寸法
は、光軸に直交する垂直面内にあって、強度が、ビーム
中心で発生する最大強度の１／ｅ2倍になる点の間の直
線距離となる。対応する水平寸法は、水平寸法と同様に
定義されるが、水平面内にある点が異なる。このような
ビームは、垂直ビーム拡張子(expander)の働きをする一
対の円筒状レンズ３５８によって実現される。上流側レ
ンズの焦点距離は、約−１８．８ｍｍ、下流側レンズの
焦点距離は、約＋７５．４ｍｍであることが好ましい。
垂直腰部および水平腰部が流動チャンバ３００で一致す
るように、レンズ３５８は、共焦状態からわずかにずれ
ている。集束レンズ３６０は球状で、焦点距離が約７
９．５ｍｍあることが好ましい。
【０２５０】ビーム微調整機構３７０は、レーザ集束レ
ンズ３６０と流動セル１７０との間に位置する。この機
構は、角度が１０°と小さい一対の楔で構成され、サン
プルの流れに対してレーザビームをわずかに横方向に移
動させるのに使用する調整可能な空気スペースを設けて
ある。この楔は、レーザビームの軸に対して直角な入り
口面および出口面により、その方向が定められている。
空気スペースは、３２ピッチのネジで、レーザの軸と平
行な方向に調整することができる。楔の材料としてＢＫ
７ガラスを使用した場合、空気スペースと横方向のビー
ムの変位との比は、１０．５／１である。３２ピッチの
ネジを完全に一回転させた場合、照明光の入射角は変化
することなく、サンプルの流れに対してレーザビームが
横方向に±７５μｍ移動する。横方向ビーム変位の解像
度は、±１μｍ未満である。このシステムを、順方向お
よび側方角集光光学系と併せて使用すれば、以後の光学
系の調整状態に影響を及ぼすことなく、レーザビームと
サンプルの流れとを最適かつ容易に調整することができ
る。
【０２５１】流動セル１７０の流動チャンバ３００の縦
横比は、約２．５ｘであることが好ましい。光流動セル
１７０内での流体力学集束により、縦横比が約１５ｘで
ある、ほぼ楕円形のサンプル中心流ができる。サンプル
の流量が約２．０μｌ／秒である場合、その結果生じる
サンプルの流れは、ほぼ楕円形の円筒状になる。サンプ
ルの流れの長さおよび幅は、約８０μｍ×５．０μｍと
なる。約５．０μｍの流れの幅は、約８０μｍの水平焦
点腰部に対応する。したがって、流れの内部の最大強度
変動は、約１％となる。
【０２５２】細胞が公称流速、約８ｍ／秒でレーザビー
ム３６８内を通過する場合、垂直焦点腰部が約１７μｍ
であるため、常にパルス幅は、細胞の大きさにしたがっ
て、約２．０〜３．５マイクロ秒の範囲となる。
【０２５３】検出器３８０、４００、４０２、および４
０４は、流動セル１７０を通過する細胞の影響を測定す
る。検出器３８０、４００、４０２、および４０４は、
少なくとも７つの光学パラメータを測定できることが好
ましい。１基または複数基の検出器を順方向光路に配置
して、順方向中間角散乱と、微小角順方向散乱または軸
光損失（ＡＬＬ、別名、順方向吸光）とを測定すること
が好ましい。一般に、ＡＬＬは、レーザビームの前方を
通過する細胞による光エネルギーの減少であり、フォト
ダイオードによって測定する。光損失は、一般に散乱が
原因で生じる。ビーム内を細胞が通過することによって
起こる、レーザビームの光路内にある検出器に到達する
光エネルギーの減少であるＡＬＬを、測定対象パラメー
タの一つにすることが好ましい。一方、微小角順方向散
乱は、ビーム内を通過する細胞が光を散乱するために、
入射レーザビーム外（ただし、１°〜３°の微小角の範
囲内）の検出器に到達する光エネルギーである。レーザ
ビームが検出器内に入らないようにするためには、一般
に、ビームストップを設ける。ＡＬＬの測定システム
は、レーザ光の入射円錐内の光を集光し、微小角散乱シ
ステムは、前記円錐外部の光を集光する。ＡＬＬ測定シ
ステムで対象となる信号は、定常状態のレーザ信号から
差し引かれる負の信号であるが、微小角順方向散乱測定
では、非常に低い背景光レベルに負荷される微小な正の
信号である。中間角順方向散乱（ＩＡＳ）は、微小角順
方向散乱に類似しているが、光が、入射レーザビームか
ら大きな角度で散乱される点が異なる。さらに具体的に
述べると、ＩＡＳは、レーザビームの入射線または中心
線から約３°ないし１０°の範囲内にあるリング内で散
乱される光に関係する。好ましい実施の形態では、ＡＬ
Ｌは、レーザの軸から水平方向に約０．３°未満、垂直
方向に約１．２°未満の角度の範囲内で集光される。ま
た、ＩＡＳは、レーザの軸から約３°ないし１０°の範
囲内の角度で集光される。
【０２５４】図１９および図２０に示す好ましい順方向
路光学システムは、球形の平凸レンズ３７６と、レンズ
の後部焦点面にある２要素フォトダイオード３８０とを
備えている。この好ましい構成では、２要素フォトダイ
オード３８０内の各点が、細胞の位置には関わりなく、
流動チャンバ３００内を通過する細胞から出る光の特定
の集光角度に写像される。したがって、内部要素３８２
は、ほぼ矩形であることが好ましく、したがって、レー
ザビームの発散の非対称度に写像され、ＡＬＬの測定を
行う。外部要素３８４は、ほぼ円形のリングであること
が好ましく、したがって、ＩＡＳの測定に必要な順方向
散乱の集光角度の範囲に写像される。
【０２５５】このような順方向路の構成は、光流動セル
１７０およびレーザビームの微調整とは無関係である。
所望の集光構成を実現するために、２要素検出器の横方
向位置を集光レンズ３７６と合わせる。要素３７０によ
って光流動セル１７０を変化させるか、または入射レー
ザビーム３６８を再調整しても、検出器３８０の角度受
容は影響を受けず、したがって、順方向路の光学系を再
調整する必要もない。要素３７０は、角度の再分布を行
わずにビームを再配置するだけである。
【０２５６】あるいは、２要素シングルユニット検出器
３８０を、２基の独立した検出器に替えることもでき
る。この場合には、適切な直径の中心穴が付いたミラー
をレンズ３７６の背面に配置する。このミラーは、ＩＡ
Ｓを検出器のいずれかに向けて反射する。ミラーの中心
穴と一致し、レーザビームだけを通過させるような形状
になったスリットが、ミラーの裏側にある第二の検出器
にＡＬＬ測定用の光を伝える。
【０２５７】以上述べた構成は、どちらも微小角集光シ
ステムの変形である。この構成では、オブスキュレーシ
ョン（obscuration）バーが不必要であり、このバーと
関連した調整も不必要である。好ましい第一の実施の形
態の場合、検出器は両方とも、一つのチップに組み込む
ことができる。ミラーは必要ない。ＡＬＬ信号によって
内部ＡＬＬ要素３８２が飽和するのを防止するには、図
２０に示すような中性濃度（neutral density）フィル
タ３８６を組み込むことが望ましい。フィルタ３８６
は、内部ＡＬＬ要素３８２を中性濃度２．０のコーティ
ング（入射光の約１％を伝えるコーティング）で被覆し
て設けることが好ましい。外部ＩＡＳ要素３８４は、反
射防止コーティングで被覆することができる。
【０２５８】一つの実施の形態においては、図１９およ
び図２１に示すように、残りの検出器４００、４０２、
４０４は、三個のフォトマルチプライヤ管(photomultip
lier)（ＰＭＴ）で、側方散乱（入射レーザビームにほ
ぼ垂直な軸を備えた円錐内で発生する散乱光）または蛍
光（入射レーザビームとは異なる波長で細胞から放出さ
れる光）を検出する。ＰＭＴ４００の光路に配置した移
動可能な偏光子４３６は、復偏光側方散乱（ＤＳＳ）お
よび偏光側方散乱（ＰＳＳ）をそれぞれ検出するＰＭＴ
４００および４０１を構成するのに対して、移動可能な
フィルタ（４３０、４３２、４３４）では、細胞からの
規定波長の蛍光放出を検出することができる。グリーン
の蛍光ＦＬ１は、約５１５〜５４５ｎｍの範囲で検出さ
れる。また、黄色の蛍光ＦＬ２は、約５６５〜５９５ｎ
ｍの範囲で検出される。さらに、赤の蛍光ＦＬ３は、約
６１５〜６４５ｎｍの範囲で検出される。必要な波長の
光を効率的に伝達、反射し、効率的な検出を可能にする
二色性ビームスプリッタ４０１および４０３により、側
方散乱および蛍光放出は、前記のＰＭＴまで導かれる。
【０２５９】図２２に示すような浸漬集光（immersion
collection）システムを利用すると、蛍光を測定する場
合、ＰＭＴ４００、４０２、４０４の感度が、向上す
る。この例では、浸漬集光システムは、屈折率整合層４
１６により、第一のレンズ４１４を流動セル１７０に光
学的に接続する。したがって、広角度にわたる集光が可
能になる。好ましい実施の形態において、この集光角
は、サンプルの流れの場合、約１３０°であり、開口数
０．５の代表的な空気スペースコンデンサシステムで
は、約４４°に相当する。蛍光を発する粒子から収集し
た蛍光エネルギーが、（１−ｃｏｓＵ）に比例すること
は、数学的に証明することができる。前式中、Ｕは、収
集円錐角の１／２である。したがって、好ましい実施の
形態の、集光角１３０°のシステムは、集光角４４°の
システムに比べてほぼ８倍のエネルギーを収集する。出
力が低いレーザまたは弱い蛍光マーカあるいはその両方
により蛍光検出が可能になるだけの差がある。また、再
度一点に光を集束させずに、大きく異なる波長で所与の
光路を利用することができるように、前記集光角１３０
°のシステムには、色補正も行われている。したがっ
て、光学フィルタ４３０、４３２、４３４を挿入する
か、または取り外すかすることによって、一つのＰＭＴ
で、数種の波長を検出することができる。
【０２６０】図２１、図２２、および第２４図に示した
浸漬集光システムは、所与のＰＭＴのカソード面が、対
物アパチャストップ４１０（図２２に図示）に接し、流
動セル１７０の流動チャンバ３００に対して無限遠に位
置するように、端部動原体型（telocentric）になって
いる。この構成により、ＰＭＴが相互にかつ、流動チャ
ンバ３００に対して正確に整列する必要が軽減される。
【０２６１】図２２に示すように、コンデンサ４１２
は、屈折率整合ゲル層４１６によって水晶流動セル１７
０に光学的に接続した平半球（plano-hemispherical）
型の第一の要素４１４を備えていることが好ましい。一
般に、コンデンサ４１２は、光学レンズシステムであ
り、広角度集光については、収差補正（aberration cor
rection）が十分であるが、高解像度顕微鏡観察で利用
する回折限界撮像（diffraction limited imaging）に
ついては収差補正が不十分である。手頃なゲルは、Ｄｏ
ｗ Ｃｏｒｎｉｎｇから発売されている（確認番号＃０
２−３０６７）。表１に、コンデンサの好ましい実施の
形態の仕様を示す。
【０２６２】表１ Ｒ１−＞∞ ｔ12＝１．８２（ＳｉＯ2窓） Ｒ2−＞∞ ｔ23＝３．９１３（ＦＫ５−フリントクラウン(flint c
rown)グラス＃４８７７０４） Ｒ3＝−３．９１３ ｄ34＝０．９２９（空気スペース） Ｒ4＝−５４．７ ｔ45＝５．１４（ＦＫ５） Ｒ5＝−９．７５３ ｄ56＝３．３４８（空気スペース） Ｒ6＝４５．７ ｔ67＝２．０（ＳＦ５−稠密フリントグラス＃６７３３
２２） Ｒ7＝１６．８５３ ｔ78＝７．９（ＢＫ７） Ｒ8＝−２４．０２８ ｄ89＝０．６５３（空気スペース） Ｒ9＝３５．６４９ ｔ910＝２．０（ＳＦ５） Ｒ10＝１３．０１４ ｔ1011＝６．９５（ＢＫ７） Ｒ11＝−１２０．９５ Ａ＝３．９１３＋０．０２／−０．１２ Ｂ＝１．８２±０．０２ Ｃ＝０．１６±０．０２ Ｄ＝０．９２９ ＰＭＴ光学システムは、モジュール形式になっているこ
とが好ましい図２３および図２４に、ＰＭＴ光学システ
ムを示す。各ＰＭＴモジュールは、ＰＭＴを一つまたは
二つと、スリット／フィールド（slit/field）レンズア
センブリ４２０を備え、このアセンブリは、スリット４
２２およびフィールドレンズ４２４、４２５を備えてい
る（図２３および図２４）。スリット４２２は、流動チ
ャンバ３００と接しており、ＰＭＴ４００のカソードの
背景光を最小限に抑える。フィールドレンズ４２４（焦
点距離が約−１２．０ｍｍであることが好ましい）およ
び４２５（焦点距離が約１５．０ｍｍであることが好ま
しい）は、先に述べた端部動原体型を構成する。光学フ
ィルタ４３０、４３２、４３４および偏光子４３６は、
ＰＭＴの光路に挿入して、検出した光の波長または偏光
あるいはその両方を変化させる。また、以下の寸法は、
図２４に関するものである。
【０２６３】 システムは、第三のＰＭＴモジュールが簡単に追加でき
るように設計されている点に一言触れておく。この第三
のモジュールを利用すると、適当な二色ミラーおよびバ
ンドパスフィルタを追加することにより、ＰＭＴを６つ
もシステムに組み込むことができる。例えば、四つの蛍
光検出器ならびに偏光側方散乱（ＰＳＳ）および復偏光
側方散乱（ＤＳＳ）の同時測定を必要とする精密な分析
を考えることができる。
【０２６４】例示的な一つの実施の形態においては、Ａ
ＬＬは実質上方形のフォトダイオードとＮ．Ｄ．２．０
フィルタによって測定される（図２０参照）。ＩＡＳ
は、フィルタなしの外側リングフォトダイオードで測定
される。ＰＳＳはフィルタなしのＨａｍａｍａｔｚｕ
Ｒ９２８ ＰＭＴ（４０２）で測定される。ＤＳＳはＲ
９２８ ＰＭＴ（４００）と水平偏光器（４３６）で測
定される。ＦＬ１はＲ９２８ ＰＭＴ（４００）と５３
０／３０フィルタ（約５３０ｎｍに中心をもつ帯域が約
３０ｎｍの帯域フィルタ、４３０）。ＦＬ２はＲ９２８
ＰＭＴ４０２と５８０／３０帯域フィルタ（４３２）
で測定される。ＦＬ３はＲ９２８ ＰＭＴ（４０４）と
６３０／３０帯域フィルタ（４３４）で測定される。
【０２６５】９．空気圧ユニット 細胞分析システム６０の好ましい実施の形態では、空気
圧ユニット７２は専用の電源をもつ独立のユニットであ
る。この構造により、分析装置モジュール６４とデータ
ステーションモジュール６８の重量と寸法と消費電力が
低下する。
【０２６６】空気圧ユニット７２は、圧力ポンプと真空
ポンプを含んでいる。このユニットは、約８．５ｐｓｉ
の調節済み圧力、約１２から１５ｐｓｉの別の圧力、約
４０ｐｓｉの高い圧力、および約１５インチ水銀柱の真
空を提供する。
【０２６７】真空圧は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、
ＳＲＡＭなど適切なメモリ内に存在する分析装置ソフト
ウェアによって制御される。
【０２６８】１０．データステーション／コンピュータ データステーションモジュール６８は、ディスプレイ端
末、ディスクドライブ、ハードディスク、キーボード、
ポインティング装置、およびＬＡＮ接続を含む８０３８
６または８０４８６ベースのＰＣ互換コンピュータであ
ることが好ましい。一つの実施の形態において、ディス
プレイ端末は、カラーであり、ディスクドライブは、
３．５インチ、ハードディスクのメモリは少なくとも５
４０メガバイト、キーボードは、パソコン形式になって
いる。データステーション６８は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、Ｓ
ＲＡＭ、ＥＰＲＯＭなどのメモリを備えており、測定デ
ータの処理、パラメータの計算、ヒストグラム、撒布
図、その他多次元のグラフを含め、各種フォーマットに
よる処理結果の報告を行えるだけのソフトウェアアルゴ
リズムを内蔵している。
【０２６９】細胞分析システム６０のデータステーショ
ン６８は、様々な細胞分析にアルゴリズムを適用するメ
モリやその他のデバイスを備えている。このアルゴリズ
ムは、分析モジュール６４が生成する多数のデータ点を
分析し、臨床関連情報を得るために利用する。本明細書
に開示する血液／免疫総合分析装置は、ソフトウェアを
実行するプラットフォームを一つだけ提供し、血液およ
び免疫サンプル処理および測定だけでなく、データ解析
も自動化する分析装置となる。
【０２７０】データステーション６８は、関連サンプル
記録の集まりであるデータ保存場所となる。図２８は、
好ましいデータ保存場所を示すもので、データ記録、患
者病歴、品質管理（ＱＣ）ファイル、標準基準粒子ファ
イル、組み合わせ複写ファイル、バル（Ｂｕｌｌ）のア
ルゴリズム（Ｘ−Ｂ）バッチ、移動平均ファイル、およ
び較正ファイルを含んでいる。
【０２７１】１１．電子システム 分析装置モジュール６４、データステーションモジュー
ル６８、圧縮空気ユニット７２には、電子装置がある。
分析装置６４は、データ収集、フルイディクス、動作制
御のハードウェアプラットフォームとなる。一つの実施
の形態では、データステーション６８は、汎用コンピュ
ータであって、ユーザインタフェースの働きをするとと
もに、収集データの処理、報告、保存を行う。圧縮空気
ユニット７２は、真空源および圧力源を制御する。
【０２７２】好ましい実施の形態では、分析装置モジュ
ール、データステーションモジュール、および圧縮空気
ユニットが物理的に独立しており、各ユニットへの電力
供給は、別々のＡＣ電源から行われる。データステーシ
ョン６８および圧縮空気ユニット７２は、独立したシリ
アル通信チャンネル７６および８４を介して、分析装置
６４と連絡している。
【０２７３】図２５は、分析装置６４の電子ハードウェ
アコンポーネントの一部を示すブロック線図である。こ
れらのコンポーネントには、中央処理モジュール５００
（ＣＰＭ）、データ収集システム５０２、および動作制
御サブシステム５０４などがある。ＣＰＭ５００は、デ
ータ収集サブシステム５０２、動作制御サブシステム５
０４、および通信機能を制御する。
【０２７４】ＣＰＭ５００の好ましい実施の形態の仕様
を、以下に示す。
【０２７５】＊Ｍｏｔｏｒｏｌａ ６８３０２インテグ
ラルマルチプロトコルプロセッサ、２０ＭＨｚクロック ＊１ＭＢダイナミックＲＡＭ、４ＭＢまで１ＭＢ刻みで
拡張可能 ＊１２８ＫＢ ＥＰＲＯＭ ＊２ＫＢ不揮発性ＲＡＭ ＊ＤＭＡコントローラ、収集したパルスデータをアナロ
グ／デジタルコンバータからＣＰＭ ＲＡＭに高速１６
ビット転送 ＊バッファ付８ビットバス、データ収集制御および診断
機能 ＊モータプロセッシングモジュール（ＭＰＭ）シリアル
リンク 二本 ＊周辺シリアンルリンク 一本 ＊圧縮空気ユニットシリアルリンク 一本 ＊ＨＤＬＣシリアルリンク 一本 ＊ＨＤＬＣシリアルリンク専用ダイレクトメモリアクセ
ス（ＤＭＡ）チャンネル ＊バーコードリーダ用ＲＳ−２３２ポート １個 ＊診断端末用ＲＳ−２３２ポート １個 図２６は、図２５に示したデータ収集サブシステム５０
２の詳細を示すブロック線図である。細胞、すなわちサ
ンプルの特性は、ＨＧＢトランスデューサ１７８、イン
ピーダンストランスデューサ１７４、光流動セル１７０
で電気信号に変換される。一般に、インピーダンストラ
ンスデューサ１７４および光流動セル１７０は、出力信
号として電気パルスを生成する。また、ＨＧＢトランス
デューサ１７６は低周波信号を出力する。各流動セル／
トランスデューサの出力は、データ収集サブシステム５
０２によって別々に処理される。
【０２７６】インピーダンストランスデューサ１７４お
よび光流動セル１７０から出力される出力信号は、複数
の検出器５１０から出力される。この検出器は、光ベン
チ３５０のＰＭＴおよびフォトダイオードまたはインピ
ーダンストランスデューサ１７４の電気回路で構成され
ている。各検出器出力は、前置増幅器（preamplifier）
モジュール５１２および信号処理モジュール５１４を介
してアナログ／デジタルコンバータ（ＡＤＣ）モジュー
ル５１６に供給される。信号処理モジュール５１４は、
パルスの高さなど、パルスの特性を測定する回路を備え
ている。ＡＤＣコンバータ５１６は、マルチプレクスコ
ンバータであって、信号処理モジュール５１４から出る
アナログ出力を、パルスの特性を表わすデジタル値に変
換する。デジタル値は、ディレクトメモリアクセス（Ｄ
ＭＡ）５１８を介してＣＰＭ５００に転送される。ＣＰ
Ｍ５００は、情報を処理し、高レベルデータリンク制御
（ＨＤＬＣ、すなわち通信プロトコル）データリンク７
６を介してデータをデータステーション６８に送る。デ
ータ収集サブシステム５０２は、トリガレベル、ゲーテ
ィングレベル、レーザ出力など、様々なパラメータ設定
に必要なアナログ電圧も生成する。
【０２７７】ＨＧＢトランスデューサ１７８から出る出
力は、ＨＧＢ検出器／アナログ多重化基板３２８を介し
て直接ＡＤＣモジュール５１６に供給される。一般に、
ＨＧＢ基板３２８は、トランスレジスタンス増幅器３３
２および電流源３３４を備えている（第１８図）。ＨＧ
Ｂ基板３２８およびそのコンポーネントについては、本
明細書の第８節、Ｆでさらに詳細に説明する。
【０２７８】Ａ．ＡＤＣモジュール ＡＤＣモジュール５１６は、アナログ／デジタルコンバ
ータを内蔵している。ＡＤＣモジュール５１６は、信号
処理モジュール５１４から出力されるアナログ電圧、お
よびＡＤＣモジュール５１６自体の内部の補助電圧を測
定するために多重化されている。
【０２７９】各電圧測定値のデジタル報告は、関連識別
タグを有している。データの流れの中で、このタグは、
タグに後続する特定の測定値を識別する。タグはすべて
７ビットの長さがあり、最大１２８個のパラメータを見
込んでいる。
【０２８０】信号処理モジュール５１４は、前置増幅器
５１２から出力される各信号ごとに一つずつ割り当てら
れたピークホールド回路を内蔵している。ピークホール
ド回路は、入力信号として電気パルスを受信し、パルス
発生中に検出された最大電圧に等しい定電圧を発生す
る。ＡＤＣモジュール５１６内のプログラム可能なタグ
シーケンサは、一度に一つずつピークホールド回路を指
定し、測定対象値（定出力電圧）をＡＤＣモジュールに
伝達する。ＡＤＣモジュールは、前記特殊信号をアナロ
グ形（電圧）からデジタル値に変換する。この変換に十
分な時間をとってから、タグシーケンサは、次の測定対
象値を保持する次のピークホールド回路を指定する。測
定信号を識別する対応タグが、変換が終了毎にデータに
付加される。このようにして、タグシーケンサは、各入
力に時間スロットを割り当てることによって、ＡＤＣモ
ジュールを時分割する。この変換の結果は、ＤＭＡ５１
８を介してＣＰＭ５００上の主メモリに転送される。Ｄ
ＭＡを利用して、ＣＰＵが介入することなく、高速でデ
ータを転送する。
【０２８１】Ｂ．インピーダンストランスデューサ前置
増幅器 前置増幅器５１２は、プログラム可能な低ノイズ定電流
源を内蔵している。この電流源から発生する定電流は、
２つの経路に分割される。一方の電流経路は、インピー
ダンストランスデューサ内の電極を通り、もう一方の経
路は、前置増幅器５１２につながっている。両電流の和
は一定なため、前記電極を流れる電流の変化（インピー
ダンストランスデューサ１７４を細胞が通過することに
起因する変化）は、前置増幅器５１２の出力電圧の変化
として反映される。
【０２８２】Ｃ．インピーダンストランスデューサによ
る信号処理 インピーダンストランスデューサ前置増幅器から出る出
力は、それぞれプログラム可能な１２ビットのゲインを
有する、二つのそれぞれ独立した経路、基線リストアラ
（baseline restorer）、パルス検出器、およびピーク
ホールド回路を通る。一方の経路は、ＲＢＣパルスの検
出用であり、もう一方の経路は、ＰＬＴパルスの検出用
である。したがって、同じパルスが、以下のような異な
る二つの基準にしたがって同時に選別にかけられる。
【０２８３】パルスのピーク値が、所与のしきい値を超
えている場合、そのパルスは有効であると見なされる。
データ収集サブシステム５０２は、レベルしきい値およ
び傾きしきい値（slope threshold）を認識する。傾き
しきい値は、時間的に非常に接近して到着した二つのパ
ルスを数えることによって、ハードウェアカウンタのデ
ッドタイムを短縮する。
【０２８４】細胞には種類ごとに識別基準が必要であ
る。ＲＢＣパルスは、あるレベルおよび傾きを超えなけ
ればならない。次のパルスに備えて検出器をリセットす
るには、ＲＢＣパルスが、ある負の傾き以上になってい
る必要がある。
【０２８５】ＰＬＴパルスは、ＲＢＣパルスと同じ順序
で発生する。ただし、ＰＬＴのほうが小さいので、ＰＬ
ＴをＲＢＣと区別することができる。パルスが下位レベ
ルのしきい値以上であって、上位レベルのしきい値以下
である場合、そのパルスは、検出済みＰＬＴとして分類
される。さらに、パルスが有効ＰＬＴと見なされるため
には、所定の正の傾きを超えている必要がある。次のパ
ルスに備えて検出器をリセットするには、ＲＢＣパルス
が、ある負の傾き以上になっている必要がある。
【０２８６】パルスが検定基準を満たしている場合、ト
リガ信号が、ピークホールド回路に送られ、続いてＡＤ
Ｃ変換が始まる。インピーダンストランスデューサ１７
４から出るトリガパルスのカウントは、１６ビット専用
カウンタ２基で行われる。一方のカウンタは、ＲＢＣ用
であり、もう一方のカウンタはＰＬＴ用である。
【０２８７】背景ＤＣ要素を増幅済み信号から除くため
に、インピーダンストランスデューサの前置増幅器から
出ている各出力経路には、基線保持回路が含まれてい
る。この回路によって生成されるオフセット電圧をモニ
タして、診断手段とする。
【０２８８】Ｄ．光前置増幅器 検出器５１０により、光流動セル１７０から放出される
光は、様々な角度で収集される。この検出器は、フォト
ダイオード（ＰＤ１およびＰＤ２）とフォトマルチプラ
イヤ（ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、およびＰＭＴ３）とを備え
ている。このような信号のダイナミックレンジはきわめ
て広く、したがって、広い範囲にわたってゲイン調整を
行うことができる。ＰＭＴについては、ＰＭＴ自体にか
かるダイノード電圧（約２００V〜１１００Ｖ）を制御
して、ゲイン調整を行うことが好ましい。このような操
作により、約１０５の範囲にわたってゲインを調整する
ことができる。ＰＭＴの光前置増幅器は、ＰＭＴから電
流出力をゲインが固定した電圧に変換する。
【０２８９】前置増幅器を使用すると、２の累乗刻みで
各フォトダイオード（ＰＤ）のゲインをプログラムする
ことができる。ＰＤ前置増幅器は、ＰＤ出力電流を電圧
に変換する。
【０２９０】Ｅ．光信号処理 前置増幅器の光出力は、別々の５つの経路すなわちチャ
ンネルを通る。各チャンネルは、基線リストアラ、パル
ス検出器、ピークホールド回路、および１２ビットのプ
ログラム可能なゲイン（ピーク補足後）を含む。ピーク
値が所定のプログラム可能しきい値を超えた場合、
「光」パルスは、有効であると見なされる。有効なパル
スは、デジタルトリガパルスを生成する。トリガパルス
は、チャンネル（ＰＤ１、ＰＤ２、ＰＭＴ１、ＰＭＴ
２、ＰＭＴ３）を選択して論理的に組み合わせたものの
一つとなるようにプログラムすることができる。各チャ
ンネルには、独自のプログラム可能下位しきい値があ
る。
【０２９１】５つのチャンネルについて、トリガパルス
は、ピーク補足、および後続する補足ピーク値のＡＤＣ
変換を開始する。ゲーティング基準を要求して、トリガ
を判定する。例えば、ＰＤ１、ＰＤ２、またはＰＭＴ２
の信号が所定のゲートしきい値を超えた場合、トリガは
無効となる。
【０２９２】パルス信号からＤＣ成分を除いてＤＣ背景
オフセットを低下させるために、基線リストアラ回路が
設けられている。この回路の応答時間は、平均パルスの
幅よりも遅い。前記回路が生成するオフセット電圧をモ
ニタして、診断手段とする。
【０２９３】光流動セル１７０から出るトリガパルスの
カウントは、１６ビットの専用カウンタ２基で行う。一
方のカウンタは、ゲート済み細胞（ゲーティング基準に
より排除されなかった細胞）用であり、もう一方は、下
位しきい値要件を満たす細胞の総数を数えるカウンタで
ある。
【０２９４】Ｆ．ＨＧＢ信号の処理 図１８は、単純化したヘモグロビン（ＨＧＢ）検出シス
テムのブロック線図である。作成したサンプル中に含ま
れるヘモグロビンの濃度は、例えば、ｇ／ｄｌ単位で測
定される。この濃度は、サンプルによる、グリーンの波
長域（約５４０ｎｍ）にある光の吸光量に比例する。
【０２９５】光路は電流制御光ダイオード３２２、トラ
ンスデューサチャンバ３３８、フィルタ３２６（約５４
０ｎｍ）、およびフォトダイオード３２４で構成されて
いる。
【０２９６】フォトダイオードの出力電流は、受光され
た光エネルギーに比例し、トランスレジスタンス増幅器
３３２で増幅される。トランスレジスタンス増幅器３３
２の出力は、ＡＤＣモジュール５１６に送られる。
【０２９７】トランスデューサチャンバ３３８で透明な
基準溶液を測定する場合に発生する電圧と、ヘモグロビ
ンを含む調製サンプルを測定する場合に発生する電圧と
の差が、ヘモグロビンの濃度を表わす。
【０２９８】Ｇ．タイムスタンプ 信号処理モジュール５１４では１６ビットのカウンタ
（図示せず）を利用して、分解能が約０．５ｍｓのタイ
ムスタンプを生成する。タイムスタンプ値は、各自動シ
ーケンス反復により発生し、ＡＤＣモジュール５１６で
得られる有効データとともに保存する。
【０２９９】Ｈ．動作制御 図２７は、動作制御サブシステム５０４の実施の形態を
示すブロック線図である。分析装置６４の流れシーケン
スおよび自動サンプル処理操作は、動作制御サブシステ
ム５０４により制御される。
【０３００】図示したように、動作制御サブシステム５
０４は、モータ処理モジュール５２０（ＭＰＭ）、バル
ブ制御モジュール５２２（ＶＣＭ）、流体センサモジュ
ール５２４（ＦＳＭ）、およびデジタル入力モジュール
５２６（ＤＩＭ）を備えている。ＭＰＭ５２０は、二つ
の独立したシリアルリンク５３０、５３２（５００Ｋ
Ｂ）を介してＣＰＭ５００と通信を行う。各ＭＰＭ５２
０は、ステッパモータ５３４を最大１２基、制御するこ
とが好ましい。ＶＣＭ５２２は、分析装置６４のバルブ
すべてを制御する。ＤＩＭ５２６は、デジタル入力（ス
イッチ、光センサ、および磁気センサ）をすべて監視す
る。ＦＳＭ５２４は、流体センサをすべて監視する。
【０３０１】ＶＣＭ５２２、ＤＩＭ５２６、およびＦＳ
Ｍ５２４は、好ましくは半二重差分（half-duplex diff
erential）シリアル周辺バスを介してＣＰＭ５００と通
信を行うインテリジェントモジュールである。このバス
には、さらに周辺モジュールを追加することができる。
【０３０２】１２．ソフトウェア ソフトウェアは、分析装置の流れシーケンス、事象のタ
イミングおよびシーケンス、データ収集、および測定デ
ータの有意味な数値への変換など、細胞分析装置６０の
主な動作を制御する。ソフトウェアは、ＲＡＭ、ＲＯ
Ｍ、ＥＰＲＯＭ、ＳＲＡＭなど、分析装置６０内の適当
なメモリに存在している。図２に円で示すように、ソフ
トウェアの要素は、６つのドメイン（domain）に分割さ
れていることが好ましい。
【０３０３】オペレータインタフェースドメイン９０
は、データステーションに取り付けたすべてのオペレー
タ制御入力装置、データステーションの報告すべての定
義および生成、およびプリント出力すべての定義を初め
とする、データステーション６８とユーザとの相互作用
を調整する。
【０３０４】データステーションの操作ソフトウェア９
２は、サンプル処理、データ管理、セキュリティ、分析
装置モジュールおよび実験室情報システム（ＬＩＳ）と
の通信、およびプリント出力の生成を制御する。
【０３０５】アルゴリズムソフトウェア９６は、所望の
組み合わせの応用数学的演算手順を内蔵している。アル
ゴリズムは、サンプルデータの解析、グラフィックデー
タや数値データへのリストモードデータの変換、および
グループ分けした数値結果の統計解析に応用される。こ
のアルゴリズムは、個々の細胞の種類や状態を特定する
クラスタリング（clustering）技法を備えていることが
好ましい。
【０３０６】分析装置操作ソフトウェア（ＡＯＳ）９８
は、分析装置のモジュールの電子装置（ハードウェ
ア）、データ収集、およびデータステーションモジュー
ルへの通信を制御する。また、ＡＯＳ９８は、分析装置
の流れシーケンスなど、分析装置の作動のタイミング設
定およびスケジュール設定も制御する。
【０３０７】流れシーケンス（ＦＳＱ）ソフトウェア１
００は、自動サンプル処理プロトコルおよび血液／免疫
総合試験の実行を含み、分析装置６４に流体を流す役目
をする機械要素を制御する。
【０３０８】ファームウェア１０２は、分析装置６４や
圧縮空気ユニット７２の各種ハードウェアモジュールの
ＥＰＲＯＭ常駐デバイスコントローラ網を備えている。
【０３０９】オペレータインタフェース（ＯＩ）、デー
タステーション操作ソフトウェア（ＤＳＯＳ）、および
アルゴリズムでは、プラットフォームとしてデータステ
ーションモジュール６８を使用する。ＡＯＳ９８、ＦＳ
Ｑソフトウェア１００、およびファームウェア１０２
は、分析装置６４に常駐し、プラットフォームとして使
用する。好ましいソフトウェアは、多重タスク、マルチ
スレッド（multithreaded）のアプリケーションであ
る。
【０３１０】ＡＯＳ９８は、ＣＰＭ５００内に常駐し、
分析装置６４の作動の詳細を制御する主制御装置になっ
ている。ＡＯＳ９８は、ステッパモータのタイミング設
定、アナログ／デジタル変換、真空／圧力閉ループのモ
ニタ／制御、バルブ制御、およびデジタルセンサ入力の
役目を果たすスレーブ（slave）マイクロコントローラ
のいくつかと通信を行う。さらに、ＡＯＳは、接続相手
であるデータステーション６８との、データ、ステータ
ス、および制御に関する通信も行う。ＡＯＳ９８は、Ｍ
ｏｔｏｒｏｌａ ６８３０２ＣＰＵチップ上で実行する
ことが好ましい。ＡＯＳのファームウェアは、外部ＥＰ
ＲＯＭに保存されており、ダウンロードされたＡＯＳと
流れシーケンスは、オンボードＲＡＭに保存されてい
る。第２９図および第３０図に、ＡＯＳ操作の実施の形
態を示す。
【０３１１】ＡＯＳ９８は、流れシーケンスを実行する
多重タスク特性を備えている。ＡＯＳは、データステー
ションから流れシーケンスをダウンロードし、メモリに
保存する。データステーション６８からの指示により、
ＡＯＳは、所望のサンプル試験に必要な流れシーケンス
を実行する。
【０３１２】各流れシーケンスには、スケジュールにし
たがった、複数のアナライザ要素の作業が必要になる。
図１３Ａから図１３Ｆは、一つのユニットで血液分析サ
ンプルおよび免疫サンプルの作成および測定を統合、自
動化する流れシーケンスの例のタイミング線図である。
最上部の水平軸は、図を見るとわかるように秒単位で時
間を表し、左端の垂直軸には、分析装置６４のサンプル
処理および測定要素を示してある。線図の桝目は分析装
置要素の作動を示すものである。図１３Ａから図１３Ｆ
の左側垂直軸に沿って示した各要素は、流れシーケンス
にしたがって特定の作業を行う。要素は、作業を終了す
ると下流の要素が現在のサンプルに対する作業を終了す
るのを待たずに、次の指示を探し始める。
【０３１３】ＡＯＳは、一組のカウント関連ハードウェ
ア設定点およびパラメータを維持する。カウントの種類
（ＣＢＣ ＷＢＣ、ＣＢＣ ＯＰＬＴなど）ごとに、一
組を対応させる。また、診断目的ごとに一組を対応させ
る。ＡＯＳは、データステーション６８からダウンロー
ドした、このカウント関連ハードウェア設定点およびパ
ラメータの組のいずれかを収容する。データステーショ
ン６８または流れシーケンスソフトウェアから出るコマ
ンドにしたがって、いずれかの組が起動される（すなわ
ち、ハードウェアを構成するのに使用される）。
【０３１４】カウント関連ハードウェア設定点およびパ
ラメータのほか、ＡＯＳは、カウントとは無関係な事象
パラメータの集合を維持する。ＡＯＳは、データステー
ション６８から供給されるこのパラメータを修正したパ
ラメータを収容する。カウント関連のパラメータの場合
とは対照的に、ＡＯＳは、この値を直接ロードする。
【０３１５】流れシーケンスを開始する際、ＡＯＳ９８
は、サンプルを吸引できることを明らかにする。これ
は、オペレータによるプッシュボタン操作またはオート
ローダ機構から出るコマンドに基づいて行われる。サン
プルについて、分析装置６４が収集している情報は、す
べてデータステーション６８に送付される。データステ
ーション６８は、サンプルに対して実施すべき測定に関
する情報に応答する。この応答に従い、さらには分析装
置６４の状態（すなわち、試薬、インキュベーション、
流れシーケンス吸引可能／不可能フラグ）と関連して、
ＡＯＳは、サンプルの吸引を進めるかどうか判断する。
吸引が行われるかどうかにかかわらず、ＡＯＳは、デー
タステーション６８にサンプルの状態を知らせる。
【０３１６】流れシーケンスにインキュベーションの段
階が必要な場合は、ＡＯＳにより、流れシーケンスは、
サンプル処理領域１１０の未使用サイト１３２をインキ
ュベーション用として「割り当てる(allocate)」ことが
できるようになる。サンプルの種類（したがって、イン
キュベーション終了時に作動する適切な流れシーケン
ス）が、割り当て作業の一部として規定される。インキ
ュベーションが開始されると、ＡＯＳはインキュベーシ
ョンサイト１３２に関連したインキュベーションタイマ
を始動する。サンプル識別子、サンプルの種類、および
インキュベーション時間も、各インキュベーションサイ
ト１３２と関連している。ＡＯＳは、作動しているイン
キュベーションタイマを定期的に更新し、保温時間の終
了を認識する。インキュベーション時間が終了すると、
ＡＯＳは、その試験の流れシーケンスを引き続き実行す
る。ＡＯＳは、各インキュベートされたサンプルの総イ
ンキュベーション時間およびインキュベーションサイト
番号（位置）を各サンプルに対する各試験の蓄積データ
の一部として報告する。インキュベートされたサンプル
を処理し、インキュベーションサイトを洗浄、乾燥した
後、サイトに再びサンプルを配分できることが流れシー
ケンスによりＡＯＳに対して通知される。
【０３１７】適切なインキュベーショントレイ１２４が
ない場合、ＡＯＳ９８はインキュベーション領域１１８
へのサンプルの吸引を阻止する。インキュベーショント
レイ１２４または試薬モジュール１２２での変更は、デ
ータステーション６８に伝達される。吸引が不可能な場
合は、ＡＯＳはデータステーション６８に注意メッセー
ジを送る。
【０３１８】データステーションの要求の際、ＡＯＳ
は、分析装置６４のすべてのサイトの現在のインキュベ
ーション状態を通知する。この情報には、インキュベー
ション時間、サイトの状態（清潔／汚損）、サイトの使
用回数が含まれる。
【０３１９】流れシーケンスインタプリタ（interprete
r）１００は、複数の流れシーケンスを同時に実行する
ことができる。流れシーケンスインタプリタの働きによ
り、流れシーケンスは様々な「フラグ」の設定および試
験中の作動を調整する。流れシーケンスのロジックは、
同時に進行しているその他の流れシーケンスにより設
定、解除されるフラグの状態に基づいて決定を行う。
【０３２０】流れシーケンスインタプリタは、固定また
は可変のサンプル事象のカウント時間をサポートする。
可変事象のカウント時間は、ソフトウェアまたはハード
ウェアの設定点により設定される。可変事象のカウント
時間は、流れシーケンスにより規定される上限を設ける
ことが好ましい。
【０３２１】流れシーケンスインタプリタの働きによ
り、流れシーケンスは事象カウントおよびデータ収集時
間を開始する。データ収集時間中に生成されたデータ
は、ＡＯＳにより自動的にデータステーション６８に送
付される。データステーション６８に送付されたデータ
には、少なくともサンプル識別子、ハードウェアカウン
タ、リストモードデータ、およびインキュベーション時
間（ない場合もある）を含むことが好ましい。カウント
の種類には、以下のものがあることが好ましい。
【０３２２】−ＣＢＣ 網赤血球に関連した測定値を除
くあらゆる血液分析測定値を含む完全血液カウント −ＲＥＴＩＣＳ −ＳＵＢＳＥＴ／ＰＨＥＮＯＴＹＰＥ ＡＯＳにより、分析装置６４は、流動セル／トランスデ
ューサ１７０、１７４、１７８でカウントを重複して行
うことができる。したがって、分析装置の作動を多重化
およびパイプライン化すると、装置のスループットが最
大になる。
【０３２３】分析装置６４を廃棄物（図示せず）および
バルク試薬保存（１９３）用の外部容器に接続する。Ａ
ＯＳは廃棄物容器が一杯になる時期やバルク試薬保存容
器１９３が空になる時期を検出するセンサをモニタす
る。状態が改善されるまで、ＡＯＳ９８は、さらにサン
プルが吸引されるのを防止する。
【０３２４】ＡＯＳは、各抗体試薬モジュール１２２内
の不揮発性シリアルアクセスメモリの読み出し、修正を
行う。各抗体試薬モジュールメモリには、少なくとも以
下の情報が保存されている。
【０３２５】− ロット番号 − 使用期限 − 試験の種類（パネル番号） − モジュール番号 − モジュールで使用する凹部の数 − モジュールの用途 − 初期化済みフラグ − 冗長／エラー制御 抗体試薬モジュール１２２からの読み取りは、通常の分
析装置の初期化の一部として行われる。読み取り後、モ
ジュール１２２の状態に影響を及ぼす操作は、モジュー
ルのメモリに記録される。
【０３２６】ＡＯＳ９８は、分析装置のステッパモータ
５３４の制御を行うモータプロセッサモジュール５２０
と通信を行う。初期化の際に、ＡＯＳは、モータプロセ
ッサモジュール５２０をリセットする。ＡＯＳは、分析
装置６４の各モータの位置を追跡し、制御モータプロセ
ッサモジュール５２０でこの情報を確認する。位置の食
い違いは、データステーション６８に通知される。
【０３２７】電源投入自己試験が問題なく終了すると、
分析装置６４は、データステーション６８からダウンロ
ードされたＡＯＳ操作ソフトウェアを受け入れる。ソフ
トウェアのダウンロードの終了時点で、スタートアドレ
スが、実行を開始するアドレスを指定するデータステー
ション６８から供給される。
【０３２８】１３．サンプル処理の例 Ａ．一般的なサンプル処理 以下のパラグラフでは、細胞分析システム６０の作動例
を詳細に説明する。以下の説明を参照することにより、
システム６０の詳細の理解が深まる。理解を助けるため
に具体例について述べるが、システム６０は、本発明の
趣旨から逸脱することなく、その他の方法を実行する場
合もあることを忘れないようにしていただきたい。
【０３２９】細胞分析システム６０の自動サンプル処理
プロトコルは、サンプル作成、サンプル測定、およびサ
ンプル分析の３段階にわけて考えることができる。各段
階のプロトコルは、試験に左右される。例えば、ＷＢＣ
差の準備、測定、および分析は、血小板、網赤血球、リ
ンパ球サブセットなどの作成、測定、および分析とは異
なる。ただし、一般的は手順は、各段階に共通である。
【０３３０】第一の段階である自動サンプル作成では、
分析装置６４が、サンプルを吸引し、指定のカップにサ
ンプルを移し、必要に応じて希釈液または試薬あるいは
その両方とサンプルを混合して、測定用のサンプルを作
成する。サンプルの作成には、サンプルを希釈すること
だけが必要であり、希釈手段は、ＲＢＣを溶解する溶解
液でもある。網赤血球試験の場合と同様に、サンプル作
成段階には、二つの操作を伴う。すなわち、第一の操作
である希釈液／シース試薬による予備希釈と、既知の量
の蛍光染料を添加する第二の希釈操作を伴う。
【０３３１】リンパ球サブセット試験など、その他の試
験では、作成段階に多数の操作を伴い、試薬によるイン
キュベーションの延長が必要である。インキュベーショ
ンの延長を行う場合、吸引プローブアセンブリ１４８
は、サンプルを移動カップ１４０に注入し、そのあと、
次のサンプルを吸引する準備位置に戻る。作成作業の残
りの操作は、インキュベーションプローブアセンブリ１
５２が実行する。これらの操作には、インキュベーショ
ンサイト１３２で、サンプルを一つまたは複数の部分に
分割する操作、分割した各部分に特定のＭａｂ試薬を添
加する操作、および保温操作などがある。このような操
作の大半は、通気／吸引プローブアセンブリ１４８が後
続するサンプルの処理を行っている間に、インキュベー
ションプローブ１５２によって行われる。
【０３３２】インキュベーションが完了すると、インキ
ュベーションプローブアセンブリ１５２は、インキュベ
ートしたサンプルの一部と溶解試薬を混合してサンプル
作成段階を終了し、前記サンプルの一部をいつでも光流
動セルに送って測定が行えるように赤血球を除去する。
【０３３３】いつでも測定を行えるようになっているサ
ンプルがサンプルカップに入っている場合に、第二段階
である測定段階が始まる。次にサンプルは、サンプルカ
ップの底部から所望の測定トランスデューサ１７０、１
７４、および１７８に接続されたチューブ網１８２を介
して送られる。トランスデューサを出たサンプルは、廃
棄物容器（図示せず）に送られる。各試験ごとに、適切
な検出器で信号を感知し、さらに増幅、処理、デジタル
化を行って、当該試験に対応するリストモードファイル
に保存する。
【０３３４】第三の段階である分析段階は、リストモー
ドデータによって始まる。様々な粒子および細胞の種類
を、各試験に適した検出器に対応する軸を備えた特性空
間に写像するアルゴリズムをデータに適用し、特有の母
集団クラスタを特定して各クラスタ内の細胞数を数え
る。最終的な出力は、グラフィック報告または数値報告
あるいはその両方となり、細胞の体積、ヘモグロビン含
有量、母集団の種類、または細胞のその他の特性の尺
度、または関数となる。通常、出力は、絶対値と百分率
の両方で定量される。例えば、細胞のサブタイプの母集
団は、親細胞に対する百分率として報告され、また、血
液１マイクロリットル当たりの事象としてカウントが行
われる。インキュベートしたサンプルの分析を行う場
合、必ず、最初に従来の血液分析試験の分析が行われ
る。インキュベートしたサンプルの測定が終了すると、
インキュベートしたサンプルの分析が行われ、総合分析
が終了する。
【０３３５】サンプル処理におけるサンプル作成段階お
よび測定段階の試験プロトコルは、複雑さが異なる各種
流れシーケンスによって自動的に実行される。インキュ
ベーションの延長を伴う試験では、流れシーケンスによ
り、インキュベーション試験と非インキュベーション試
験が一体となり、その結果、分析装置６４は、サンプル
をインキュベートする時には、後続する試験を必ず行う
ことができる。インキュベートしたサンプルがいつでも
測定できる状態にある場合、サンプルの処理はそれ以上
行われず、インキュベートしたサンプルの測定および分
析が実施される。
【０３３６】Ｂ．ヘモグロビンサンプルの処理 図５および図１２を参照すれば、以下の説明の理解が、
なお一層深まる。例えば、サンプル１６６の一部、約１
８．７５マイクロリットルを、吸引プローブ１５６によ
りＨＧＢカップ１４２に注入し、このカップでサンプル
は、多量のＨＧＢ溶解試薬と混合され、希釈率は、約２
００：１となる。溶解時間約２０秒の経過後、カップ内
には希釈されたヘモグロビンだけが残り、このヘモグロ
ビンは、蠕動ポンプ２４６により、ライン１８２を通っ
てヘモグロビントランスデューサ１７８に送られ、測定
が行われる。トランスデューサチャンバ３３８内のヘモ
グロビンサンプルの光透過率は、発光ダイオード光源１
２２およびフォトダイオード３２４により測定される。
Ｔで表わされる透過率は、増幅、処理、デジタル化さ
れ、保存される。この透過率は、次に分析段階でアルゴ
リズムＡ＝ｌｏｇ（１／Ｔ）により、吸光量に変換さ
れ、さらに、所定の較正器により、ヘモグロビン濃度Ｈ
ＧＢ、すなわちサンプル１デシリットル当たりのグラム
数に変換される。ＲＢＣインピーダンス試験の結果とヘ
モグロビン試験を併せて利用すると、以下の測定パラメ
ータおよび較正パラメータを決定することができる。
【０３３７】ＨＧＢ＝（ヘモグロビン濃度） ＭＣＨ＝ＨＧＢ×１０／ＲＢＣ（平均細胞ヘモグロビ
ン） ＭＣＨＣ＝ＨＧＢ×１００／ＨＣＴ（平均細胞ヘモグロ
ビン濃度） 上式中、ＲＢＣは、赤血球のカウント（１μｌ当たりの
ＲＢＣ数）、ＨＣＴは、ヘマトクリット（hematocrit）
値（赤血球から成る血液サンプルの体積百分率）であ
り、両方ともインピーダンストランスデューサ１７４で
測定する。
【０３３８】Ｃ．ＲＢＣおよび血小板サンプルの処理 第４図および図５を参照されたい。サンプル１６６の一
部、約１８．７５マイクロリットルを、吸引プローブ１
５６によりカップ１３４に注入し、このカップでサンプ
ルは、希釈液／シース試薬と混合され、希釈率は、約４
２０：１となる。希釈液／シース試薬は、インピーダン
ス流動セル１７４および光流動セル１７０内の層流シス
テムにおけるシースキャリアとしても、またサンプル希
釈液としても妥当であり、その結果、ＲＢＣおよび血小
板は、各トランスデューサ内の一つのファイルを移動す
る。成分には、小さい赤血球と大きな血小板との明確な
区別が可能になる表面活性剤などがある。
【０３３９】ＲＢＣカップ１３４内での混合が終了した
後、希釈サンプルは、ポンプ２２０、バルブ２１０、２
１２、注射器アセンブリ２０４、２２４によりインピー
ダンストランスデューサ１７４（図１０Ａおよび図１０
Ｂ）に送られる。インピーダンストランスデューサ１７
４（図１７）で、血小板のサイズ分類およびカウントが
行われる。また、血小板は、光トランスデューサ１７０
にも送られ、ここでカウントが行われる（図１６）。光
トランスデューサ内の照明領域が小さく、またノイズが
低いため、光による血小板のカウントは精度が高い。光
トランスデューサ１７０での血小板のカウント値は、患
者データとして報告され、インピーダンストランスデュ
ーサでのカウントは、装置の性能をモニタする診断ツー
ルとして使用される。
【０３４０】インピーダンストランスデューサ１７４
は、血小板の大きさのパラメータを報告するために使用
される。血小板をノイズと区別する下位しきい値、およ
び血小板をＲＢＣと区別する上位しきい値を設定する。
パルスの振幅をフィルタにかけ、増幅、デジタル化し
て、リストモード事象として保存する。このデータか
ら、以下の血小板の大きさのパラメータの計算、および
血小板のヒストグラムの報告にアルゴリズムを適用す
る。
【０３４１】血小板カウント（ＰＬＴ） 平均血小板体積（ＭＰＶ） 血小板分布幅（ＰＤＷ） 血小板ｃｒｉｔ（ＰＣＴ＝ＭＰＶ×ＰＬＴ） 血小板濃度（装置の診断に使用） 希釈サンプルは、ＲＢＣカップ１３４から、バルブ２３
６、２３８、ポンプ２３２、および注射器２４０、２０
６により、光トランスデューサに送られる。血小板は、
ＰＳＳ（偏光側方散乱）光パラメータおよびＩＡＳ（中
間角散乱）光パラメータを利用して、二次元特性空間で
判定される。検出器３８４および４０２から生成するパ
ルスは、処理、デジタル化され、アルゴリズムによる処
理を目的としてリストモードファイルに保存される。血
小板測定のサンプル流量は、約２．５マイクロリットル
／秒であり、流動セルによるカウント時間は、通常の患
者の場合、約６秒である。カウントの統計値を向上させ
るため、このカウント時間は、低カウントサンプルにつ
いては自動的に延長される。光トランスデューサから得
られるカウントは、血小板濃度（ＰＬＴ）である。
【０３４２】インピーダンストランスデューサ１７４
は、ＲＢＣの大きさおよびカウントのパラメータを決定
するのにも利用される。インピーダンストランスデュー
サ１７４内で血小板を検出するのに使用する上位しきい
値は、ＲＢＣカウント用の下位しきい値ともなる。この
しきい値を超えるパルスを処理、デジタル化し、ＲＢＣ
リストモードファイルに保存する。以下のＲＢＣパラメ
ータの計算、およびＲＢＣのヒストグラムの報告にアル
ゴリズムを適用する。
【０３４３】赤血球濃度（ＲＢＣ） 平均細胞体積（ＭＣＶ） 赤血球分布幅（ＲＤＷ） ヘマトクリット（ＨＣＴ）Ｄ．ＷＢＣ示差サンプルの処理 図４および図５を参照して説明すると、患者サンプル１
６６の一部、約３７．５マイクロリットルを、サンプル
吸引プローブ１５６により、ＷＢＣ溶解液約８５０マイ
クロリットルが入ったＷＢＣカップ１３８に注入する。
【０３４４】溶解は、多目的を達成する一試薬／一段階
操作であり、損傷しやすい白血球の構造を保護し、同時
に赤血球をほぼすべて効率的に溶解するには、十分であ
る。この二つの目的は、溶解時間を１１秒以上に延長し
なければならないヘモグロビン異常のサンプルでも達成
できる。好ましい実施の形態において、溶解液は、末梢
血液に含まれることがある有核赤血球（ＮＲＢＣ）を効
果的に標識する、低濃度の活性核染料を含有している。
屈折率がシースの屈折率に適合して約０．１％未満とな
るように、溶解の化学作用をあらかじめ定めてある。
【０３４５】通常、溶解液とサンプルとの混合物は、カ
ップ１３８内に約１１秒間とどまり、カップ内でサンプ
ルは溶解され、高温で撹拌される。好ましい実施の形態
では、溶温度を４２℃±３℃に制御する。ここで、カッ
プ１３８の内容物を、パイプで直接光流動セル１７０に
送る。
【０３４６】図１９および図２０を参照して説明する
と、細胞が希釈液／シース３０４（図１６に図示）に取
り囲まれたサンプル層流になって一つのファイル内のレ
ーザ照明を通過するように、溶解液の添加により希釈さ
れた細胞の流れが、光トランスデューサ１７０を通過す
ると同時に測定が始まる。照明領域は、流体力学的に一
点に集束させた細胞の流れにより、流れの軸に対して垂
直な２方向を取り囲まれ、また約１７ミクロンのレーザ
ビームの垂直ビーム腰部により、流れの軸に平行な１方
向を取り囲まれている。この試験時のサンプルの流量
は、約２．５マイクロリットル／秒であり、ＷＢＣおよ
びＮＲＢＣ細胞の対応照明感知体積は、寸法が約８０μ
ｍ×５μｍ×１７μｍの楕円形の円柱に近い。約１７μ
ｍの寸法は、円柱の軸にそって測定したものである。
【０３４７】照明領域内にある細胞は、フォトダイオー
ド３８２および３８４、フォトマルチプライヤ管４０
４、および三次元の特性空間内で作動する独自の三重し
きい値トリガ回路によって検出される。すなわち、前記
回路は、三つのパラメータＡＬＬ（軸光損失）、ＩＡＳ
（中間角散乱）、およびＦＬ３（赤色蛍光）を処理し、
ＡＮＤ／ＯＲ論理を利用して信号を検定し、デジタル化
を行う。検定に通った信号は、ＩＡＳしきい値よりも大
きく、かつＡＬＬしきい値またはＦＬ３しきい値よりも
大きくなければならない。この独自のトリガ回路と溶解
特性（ＮＲＢＣ核を迅速に染色させる平衡固定剤を含
む）を組み合わせると、ＷＢＣ示差細胞のカウントを正
確に行い、ＮＲＢＣのカウントを前記カウントから除外
することができる。この試験では、ＤＮＡの断片、ＲＢ
Ｃの基質、および血小板から放出される背景信号など、
通常よくある蛍光、非蛍光両方の背景信号の干渉を受け
ずに、ＷＢＣ母集団およびＮＢＲＣのカウントを行う。
【０３４８】三重しきい値についての基準を満たす細胞
が照明領域を通過する場合、検出器３８２、３８４、４
００、４０２、４０４からパルスが生成される。このパ
ルスの振幅をフィルタにかけ、増幅し、デジタル化し、
さらにＡＬＬ、ＩＡＳ、ＦＬ３、ＰＳＳ（偏光側方散
乱）、およびＤＳＳ（復偏光側方散乱）からなる対応五
次元特性空間にリストモードで保存する。流動セル１７
０による通常のカウント時間は、約１０秒である。上記
の流量および希釈率で、血液１マイクロリットル中のＷ
ＢＣの通常のカウントが約７０００の場合、得られる事
象カウント率は、約５０００となる。カウントが低いサ
ンプルの場合、このカウント時間を自動的に延長して、
測定の統計的精度を向上させることができる。測定時間
の終了時に、サンプルの流れをパイプで廃棄物に導き、
プローブ１５６の汚れを除去し、乾燥させて次のサンプ
ルを処理する準備をする。
【０３４９】リストモードデータ（ＡＬＬ、ＩＡＳ、Ｆ
Ｌ３、ＰＳＳ、およびＤＳＳ）の内、検定を通った５つ
のパラメータにアルゴリズムが適用され、約３０秒未満
の処理時間内に、以下のタイプの細胞の定量化またはフ
ラグ付けあるいはその両方が行われる。その対象となる
ものには、白血球濃度（ＷＢＣ）、好中球濃度（ＮＥ
Ｕ）および百分率（％Ｎ）、リンパ球濃度（ＬＹＭＰ
Ｈ）および百分率（％Ｌ）、単核細胞濃度（ＭＯＮＯ）
および百分率（％Ｍ）、好酸球濃度（ＥＯＳ）および百
分率（％Ｅ）、好塩基球濃度（ＢＡＳＯ）および百分率
（％Ｂ）、有核赤血球（ＮＲＢＣ）およびＷＢＣの百分
率（％ＮＲＢＣ）、ブラスト濃度（ＢＬＳＴ）、未成熟
顆粒球濃度（ＩＧ）、変異リンパ球濃度（ＶＡＲＬ）、
バンド濃度（ＢＡＮＤ）がある。
【０３５０】Ｅ．リンパ球サブセットサンプルの処理 図３、図４、および図５に示すように、好ましい実施の
形態では、リンパ球サブセット試験のサンプル処理に
は、以下の手順が必要である。まず、吸引プローブ１５
６が、サブセット試験に足りるだけの量の全血サンプル
を吸引し、移動カップ１４０に注入する。必要な血液量
は、約５０Ｎマイクロリットルである。ここでＮは、試
験に必要なＭａｂ（モノクローナル抗体）対の数であ
る。標準パネルでは、Ｎは５となり、したがって、カッ
プ１４０への必要注入量は、約２５０マイクロリットル
である。次に吸引プローブ１５６は洗浄され、以後のサ
ンプルを処理するために、サンプルステーション１６６
に戻される。一方、インキュベーションプローブアセン
ブリ１５２が、引き続きサブセットサンプルの処理を行
う。
【０３５１】インキュベーションプローブ１６０は、移
動カップ１４０から血液を吸引し、インキュベーション
トレイ１２４にある５つのシーケンスカップ１３２にそ
れぞれ約４０マイクロリットルずつを注入する。次にイ
ンキュベーションプローブ１６０は洗浄されて試薬モジ
ュール１２２に移動され、第一のＭａｂ対１２８を約２
０マイクロリットル排出し、第一の対応する保温カップ
１３２に注入する。インキュベーションプローブ１６０
は再度洗浄を受けた後、試薬モジュール１２２に戻さ
れ、第二のＭａｂ対１２８から別に試薬約２０マイクロ
リットルを第二の対応するインキュベーションカップ１
３２に移す。必要なインキュベーションカップのそれぞ
れに、インキュベーション用の血液とＭａｂとの混合物
が注入されるまで、上記の操作が継続される。
【０３５２】次にインキュベーションプローブ１６０
は、洗浄、乾燥され、第一のＭａｂ／血液サンプルのイ
ンキュベーションが終了するのを待つ。インキュベート
されたサブセットサンプルが以下述べる処理を受けるま
で、サンプル吸引アセンブリ１４８の作動はすべて一時
中止される。インキュベーションプローブ１６０は、Ｗ
ＢＣ溶解試薬、約６７０マイクロリットルが入ったＷＢ
Ｃカップ１３８に、第一のインキュベートされたサブセ
ット１３２を約３０マイクロリットルを注入する。イン
キュベートされたサンプルを約４２℃±３℃で約１１秒
間溶解し、撹拌すると、第一のインキュベートされたＭ
ａｂ／血液対は、いつでも測定できる状態になる。この
時点で、カップ１３８の内容物をパイプで直接光流動セ
ル１７０に送る。
【０３５３】細胞の流れが、流動セル１７０のレーザに
照らされた領域とぶつかると、測定が始まる。データ
は、システムの電子装置および分析装置のソフトウェア
を介して、光検出器３８２、３８４、４００、および４
０２から得られる。このデータは、各Ｍａｂ／血液試薬
混合物ごとに、リストモードで保存される。サンプル
は、流れの中の細胞が、一つのファイルのレーザ照明領
域を通過するように希釈されている。各細胞は、四つの
特性、すなわちＡＬＬ（軸光損失）、ＩＡＳ（中間角散
乱）、ＦＬ１（グリーンの蛍光）、およびＦＬ２（オレ
ンジの蛍光）を示すパルスによって検出される。各パル
スの振幅を増幅し、デジタル化し、適切な空間軸上にリ
ストモードで保存する。
【０３５４】分析は、サブセットの百分率の計算に使用
する保存四次元データにアルゴリズムを適用することか
ら始まる。第一のサブセット測定のカウント時間が経過
した後、プローブ１６０は、洗浄、乾燥され、次のイン
キュベートされたサブセット１３２に戻り、サブセット
の測定、分析がすべて終了するまで処理を繰り返す。百
分率および血液１マイクロリットル当たりの絶対カウン
トが得られる最終分析は、上記のサブセット測定および
ＷＢＣ示差血液分析測定がすべて一体になったものであ
る。
【０３５５】流動セル１７０による通常のカウント時間
は、約１０秒である。カウントの小さいサンプルの場
合、このカウント時間を自動的に延長して、測定の統計
的精度を向上させることができる。
【０３５６】サンプルの測定が終了した後、サンプル吸
引アセンブリ１４８は再度作動し、いつでも次のサンプ
ルの処理が行えるようになる。
【０３５７】本明細書に開示する自動サンプル作成で
は、各種の免疫および表現形分類試験に使用する様々な
抗体パネルを採用している。リンパ球サブセットについ
ては、各パネルが、２色抗体セットを５つ備えているこ
とが好ましい。各抗体セットは、ＦＩＴＣ（蛍光イソチ
オシアネート）などで標識した抗体（Ｍａｂ）、および
ＰＥ（フィコエリトリン）などで標識した第二のＭａｂ
を備えている。抗体は、クラスタ指定（ＣＤ）番号で識
別さる。例をあげると、パネルには、少なくとも以下の
リンパ球サブセットＭａｂが含まれている。
【０３５８】ＨＩＶ患者のＣＤ４陽性細胞をモニタする
のに使用できる簡略化したパネルも提案されている。こ
のパネルには、少なくとも以下のＭａｂが含まれてい
る。
【０３５９】
【表１】
【０３６０】その他の表現型分類Ｍａｂ試験では、Ｍａ
ｂ対の数Ｎは、１でもよく、したがって、必要なサンプ
ル量は、約５０マイクロリットルである。Ｍａｂはどん
な組み合わせでも使用できる。必要なＭａｂ試薬の量
が、サンプルに対して行った血液分析測定から得られる
ＷＢＣカウントの推定値に基づいている試験もある。例
えば、白血球増加症や白血球減少症の極端な症例の場
合、Ｍａｂ抗体の血液に対する割合を調整して、十分な
抗体結合を確保するか、または過剰な脱抗体背景を防止
する必要がある。血液分析測定には、保温が不必要なた
め、リンパ球サブセットサンプルの調整が終了するより
前に、サンプルは流動セルトランスデューサの凹部を通
過する。したがって、データステーションは、血液分析
の推定カウントを計算し、分析装置６４が、これらの試
験を実施するために、当該サンプルにより必要に応じて
Ｍａｂのと血液との比を調整できるようにすることがで
きる。
【０３６１】Ｆ．網赤血球サンプルの処理 網赤血球の試験の実施に関する第４ａ図および図５を参
照して説明すると、吸引プローブ１５６は、ＲＢＣカッ
プ１３４内でＲＢＣと血小板希釈液との混合を終了する
と、約４２０：１に希釈した血液約２００マイクロリッ
トルを吸引し、ｒｅｔｉｃカップ１３６に注入する。ｒ
ｅｔｉｃカップ１３６には、ｒｅｔｉｃ試薬が約６００
μｌ入っていおり、その結果、希釈率は約１６８０：１
となる。
【０３６２】好ましい実施の形態の試薬は、アルゴンレ
ーザの最大吸光波長が４８０ｎｍに近く、量子収量が高
い蛍光染料を含有している。好ましい試薬は、迅速かつ
一次元の蛍光ヒストグラムでＷＢＣとの混同が防止され
るように、ＤＮＡおよびＲＮＡを迅速に染色する。前記
染料は非常に感度が高く、分析装置６４で細胞内のＲＮ
Ａの断片二つを検出することができる。この方法は、網
赤血球カウント、約９０％まで線形である。
【０３６３】適切なインキュベーション期間（上に述べ
た好ましい試薬の場合約２５秒）の経過後、または混合
の終了直後、希釈血液とｒｅｔｉｃ試薬との混合物は、
光流動セル１７０に送られる。別々のインキュベーショ
ン操作が必要でない場合、この移動操作の時期は、網赤
血球を染色する十分なインキュベーション時間、すなわ
ち２５秒のインキュベーション時間が得られるように設
定できる。
【０３６４】成熟赤血球および網赤血球を含む母集団
が、流動セル１７０のレーザ照明領域を通過する際に、
フォトダイオード３８４、およびグリーンの蛍光フィル
タ４３０でＦＬ１向けに構成したフォトマルチプライヤ
管４００により、サンプルの散乱特性および蛍光特性を
測定する。パルスの振幅をフィルタにかけ、増幅、デジ
タル化し、さらにＩＡＳおよびＦＬ１で構成される二次
元特性空間にリストモードデータとして保存する。流動
セルによる測定時間は、約８秒であり、サンプルの流量
は、約２マイクロリットル／秒である。血液１マイクロ
リットル当たりのＲＢＣが約５，０００，０００個であ
る場合、好ましい実施の形態での測定値は、約５０，０
００事象となり、これは、網赤血球濃度１％の場合の網
赤血球事象５００個に相当する。
【０３６５】適用するアルゴリズムは、ＷＢＣおよび血
小板を除外し、負のＲＢＣヒストグラムに重ねた正の蛍
光事象によって網赤血球のカウントを行う。この方法で
は、蛍光の強度により、網赤血球成熟指数（maturity i
ndex）ＲＭＩを特徴づける。好ましい実施の形態におい
て、標準血液分析試験および網赤血球に関連したサンプ
ルの処理時間は、約４５秒である。網赤血球試験の場
合、以下のパラメータ、すなわち、網赤血球濃度（ＲＥ
ＴＣ）、網赤血球百分率（ＲＢＣの％Ｒ）網赤血球の成
熟指数（ＲＭＩ）が報告される。
【０３６６】核染色のインキュベーション時間を延長す
る別の方法でも、先に述べたリンパ球サブセットの処理
で使用したのと同様にインキュベーションプローブ１６
０および吸引プローブ１５６を両方使用して、網赤血球
の測定を行うことができる。
【０３６７】本明細書で述べた実施の形態の用途を、例
示のため多数掲げる。以下の記載は例示を目的として行
うが、網羅的なものではない。特に以下で述べるのは、
本明細書に開示した実施の形態を利用して行う、総合血
球分析、ヘモグロビン分析、赤血球および血小板分析、
白血球示差分析、網赤血球分析、リンパ球免疫表現型分
類分析、Ｔヘルパーセットの測定、Ｔサプレッササブセ
ットの分析、ＴおよびＢリンパ球の測定の方法である。
ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＳＲＡＭ、またはその他
の適切なメモリデバイス上にあり、記載した手順を実行
するのに使用するソフトウェアを適当に参照する。ソフ
トウェアのソースコードは、請求項の記載の直前にある
アペンデックス（APPENDIX）ＡおよびアペンデックスＢ
に示してある。例で触れるステップ番号は、ソフトウェ
アのソースコードの適切な行にある「ステップ」番号と
してもう一度掲げてある。図４４Ａから図４４Ｆ、およ
び図６３Ａから図６３Ｆを併せて参照すれば、ソフトウ
ェアの諸部分についてより容易に理解できよう。
【０３６８】実施の形態１：統合血液細胞分析 本発明の一つの実施の形態を用いて全血サンプルの細胞
分析を行うことができる。かかる分析手順の一例はこの
通りである。このサンプル処理の諸段階はアペンデック
スＡにあるようなソフトウエアによって制御される。デ
ータ分析の諸段階はアペンデックスＢにあるようなソフ
トウエアによって制御される。
【０３６９】１ − オペレータが全血サンプルを入れ
たサンプル管をサンプル管ホルダに入れる。
【０３７０】２ − 通気アセンブリが下がってサンプ
ル管のキャップを貫く（ステップＡ１）。
【０３７１】３ − 吸引プローブを下げてサンプル管
内に入れる（ステップＡ２）。
【０３７２】４ − ７５μｌの血液を吸引プローブ内
に吸引する（ステップＡ３）。
【０３７３】５ − 吸引プローブを管から引き上げ、
上げる途中で清掃する（ステップＡ４）。
【０３７４】６ − 吸入プローブが完全に引き上げら
れたかどうかを識別する（ステップＡ５）。
【０３７５】７ − 吸入プローブがＨＧＢカップの真
上の点に移動する（ステップＡ６）。
【０３７６】８ − 通気アセンブリが上昇してサンプ
ル管キャップから引っ込む（ステップＡ７の完了）。
【０３７７】９ − 吸入プローブをＨＧＢカップに向
かって少し下げる（ステップＡ８）。
【０３７８】１０ − １８．７５μｌの血液をＨＧＢ
分析のためＨＧＢカップ中に入れる（ステップＡ９）。
【０３７９】１１ − 吸入プローブがＷＢＣカップの
真上の位置に移動する（ステップＡ１０）。
【０３８０】１２ − １８．７５μｌの血液をＷＢＣ
分析のためＷＢＣカップ中に入れる（ステップＡ１
１）。
【０３８１】１３ − 吸入プローブがＲＢＣカップの
真上の位置に移動する（ステップＡ１２）。
【０３８２】１４ − 吸入プローブを下げてＲＢＣカ
ップ内に入れる（ステップＡ１３）。
【０３８３】１５ − 吸入プローブに希釈液を供給す
る弁を開く（ステップＡ１４）。
【０３８４】１６ − ２０００μｌの希釈液を残りの
１８．７５μｌの血液とともにＲＢＣ分析と血小板分析
のため吸入プローブを通してＲＢＣカップ中に入れる
（ステップＡ１５）。
【０３８５】１７ − １０００μｌの血液／希釈液混
合物をＲＢＣカップから吸入プローブ中へ吸入する（ス
テップＡ１６）。
【０３８６】１８ − 吸入プローブを持ち上げ清掃に
する（ステップＡ１７）。
【０３８７】１９ − 吸入プローブをＲＥＴＩＣカッ
プの真上の位置に移動させる（ステップＡ１８）。
【０３８８】２０ − 吸入プローブをＲＥＴＩＣカッ
プに向かって少し下降させる（ステップＡ１９）。
【０３８９】２１ − 網赤血球分析のため２００μｌ
の血液／希釈液混合物を吸入プローブからＲＥＴＩＣカ
ップ中へ入れる（ステップＡ２０）。６００μｌのｒｅ
ｔｉｃ試薬を同時に固定ポートからＲＥＴＩＣカップ中
に入れる。
【０３９０】１８ − 通気アセンブリをそのホーム位
置に戻す（ステップＡ２１）。
【０３９１】１９ − 吸入プローブを洗浄カップに移
動する（ステップＡ２２）。
【０３９２】２０ − 吸入プローブを下げて洗浄カッ
プ中に入れる（ステップＡ２３）２１ − 吸入プロー
ブを洗う（ステップＡ２４）。
【０３９３】２２ − 吸入プローブを持ち上げる（ス
テップＡ２５）。
【０３９４】２３ − 吸入プローブをそのホーム位置
に戻す（ステップＡ２６）。
【０３９５】２４ − この計器は以下の例（トップレ
ベルアルゴリズムファイルｍｃＣＢＣＡｌｇｏｒｉｔｈ
ｍ．ｃｃ）において詳述するように、ＨＧＢ、ＷＢＣ、
ＲＢＣ、血小板および網赤血球分析のためのサンプル処
理とデータ分析を行う。
【０３９６】２５ − 分析の結果は図４５Ａから図４
５Ｆに示すように記憶し報告される。
【０３９７】実施の形態２：ヘモグロビン（ＨＧＢ）分
析 本発明の一つの実施の形態を用いて全血サンプルのヘモ
グロビン分析を行うことができる。かかる分析手順の一
例は次の通りである。このサンプル処理の諸段階はアペ
ンデックスＡにあるようなソフトウエアによって制御さ
れる。 データ分析の諸段階はアペンデックスＢにある
ようなソフトウエアによって制御される。
【０３９８】１ − １５９０μｌのＨＧＢ溶解物をＨ
ＧＢカップ中に入れる（ステップＨ１）。
【０３９９】２ − １８．７５μｌの全血を実施の形
態１の手順の一部として吸引プローブからＨＧＢカップ
中に入れる（ステップＡ９）。
【０４００】３ − ４２７３μｌのＨＧＢ溶解物を流
体の混合が起きるようにＨＧＢカップ中に入れる（ステ
ップＨ２）。
【０４０１】４ − 細胞が溶解するまで約７秒待つ。
【０４０２】５ − 溶解したＨＧＢサンプルを計器配
管中を移動させてＨＧＢトランスデューサへの移動を容
易にする（ステップＨ３）。
【０４０３】６ − 溶解したＨＧＢサンプルをＨＧＢ
トランスデューサにポンプで送る（ステップＨ４）。
【０４０４】７ − ＨＧＢカップを排出して洗浄する
（ステップＨ５）。
【０４０５】８ − ＨＧＢカップをＨＧＢ溶解物で充
填して基準サンプルを形成する（ステップＨ６）。
【０４０６】９ − ＨＧＢトランスデューサ中の透光
率を読み取る（ステップＨ７）。トランスデューサは溶
解ＨＧＢサンプルを含み、この段階は血液サンプルと溶
解物との混合の約１５−２０秒後に起こる。
【０４０７】１０ − 基準サンプルを計器配管中を移
動させてＨＧＢトランスデューサへの移動を容易にする
（ステップＨ８）。
【０４０８】１１ − 基準サンプルをＨＧＢトランス
デューサ中に押し込む（ステップＨ９）。
【０４０９】１２ − ＨＧＢ溶解物を注入するのに使
用したシリンジポンプをリセットする（ステップＨ１
０）。
【０４１０】１３ − ＨＧＢカップを空にする（ステ
ップＨ１１）。
【０４１１】１４ − ＨＧＢ溶解物シリンジポンプの
バックラッシュ（backlash）を除去する（ステップＨ１
２）。
【０４１２】１５ − ＨＧＢトランスデューサ内の基
準サンプルの透光率を読み取る。（ステップＨ１３）。
【０４１３】１６ − サンプルと基準サンプルからの
データをステップ１７−２２で記述する。後続の分析の
ためにファイルに記憶し、アルゴリズムファイルｍｃＲ
ＢＣＡｌｇｏｒｉｔｈｍ．ｃｃによって実行する。
【０４１４】１７ − 分析変数およびフラグを初期化
する（サブルーチンＰａｒａｍＤｅｆａｕｌｔｓおよび
サブルーチンＣｌａｓｓＦｌａｇＤｅｆａｕｌｔｓ）。
【０４１５】１８ − ＨＧＢデータをデータファイル
からローカルメモリに転送する。（サブルーチン Ｇｅ
ｔＨＧＢＤａｔａ）。
【０４１６】１９ − ヘモグロビン濃度を次式によっ
て計算する。
【０４１７】ＨＧＢ＝ ｌｏｇ（基準測定値／サンプル
測定値）×０．６４×（較正係数）（サブルーチンＤｏ
ＨＧＢＡｎａｌｙｓｉｓ）。
【０４１８】２０ − 後述するＲＢＣ分析によって求
めたパラメータＲＢＣ（赤血球細胞濃度）およびＨＣＴ
（ヘマトクリット値）を用いて細胞ＨＧＢパラメータを
計算する（サブルーチンＤｏＨＧＢＡｎａｌｙｓｉ
ｓ）。
【０４１９】平均細胞ヘモグロビン ＭＣＨ＝ＨＧＢ／ＲＢＣ （単位変換係数） 平均細胞ヘモグロビン濃度 ＭＣＨＣ＝ＨＧＢ×（単位変換係数）／ＨＣＴ ２１ − 異常なあるいは疑わしい結果がある場合、Ｈ
ＧＢフラグをたてる（サブルーチンＳｅｔＨｇｂＦｌａ
ｇｓ）。
【０４２０】２２ − 分析結果とフラグをメモリへ戻
し（サブルーチンＳｅｎｄＮｕｍＲｅｓｕｌｔｓおよび
サブルーチンＳｅｎｄＡｌｅｒｔＲｅｓｕｌｔｓ）、表
示装置に報告する。
【０４２１】実施の形態３：赤血球（ＲＢＣ）および血
小板（ＰＬＴ）分析 １７．５μｌの血液サンプルを本発明の試薬７４００μ
ｌ（１：４２０希釈溶液）と迅速に混合し、０．５μｌ
の希釈サンプルを赤血球のカウントと容積測定および血
小板のカウントのため１２秒間流体力学的に集束された
（シースされた）インピーダンストランスデューサ１７
４を通過させる。さらに、２．５μｌの希釈サンプルは
正確で精密な血小板カウントのため６秒間シースされた
光学的流動セル１７０を通過させる。血小板アルゴリズ
ムで血小板母集団の境界を正確に定めることにより、脆
い異常細胞の分画からのノイズ信号を光学的血小板カウ
ントから除外する。
【０４２２】本発明の一つの実施の形態を使用して全血
サンプルの赤血球（ＲＢＣ）および血小板（ＰＬＴ）分
析を上述のように行った。かかる分析手順の一例は次の
通りである。サンプル処理の諸段階はアペンデックスＡ
に述べられているようなソフトウエアで制御される。デ
ータ分析の諸段階はアペンデックスＢに述べられている
ようなソフトウエアによって制御される。
【０４２３】１ − ＲＢＣカップを空にする（ステッ
プＲＢＣ１）。
【０４２４】２ − ２．２ｍｌのＲＢＣ希釈液をＲＢ
Ｃ希釈液シリンジでＲＢＣカップに入れる（ステップＲ
ＢＣ２）。
【０４２５】３ − １８．７５μｌの全血と２０００
μｌのＲＢＣ希釈液を、第一の実施の形態で述べたよう
に吸引プローブでＲＢＣカップ中に入れる（ステップＡ
１５）。
【０４２６】４ − ３．２ｍｌの希釈液をＲＢＣ希釈
液シリンジでＲＢＣカップ中に入れる（ステップＲＢＣ
３）。
【０４２７】５ − 血液と希釈液の混合物をＲＢＣ蠕
動性ポンプでインピーダンストランスデューサの近傍へ
移動させる（ステップＲＢＣ４）。
【０４２８】６ − ＲＢＣ供給シリンジを充填する
（ステップＲＢＣ５）。
【０４２９】７ − 希釈液を光学トランスデューサ中
に流し始める（ステップＲＢＣ６）。
【０４３０】８ − 血液と希釈液の混合物を光学的蠕
動ポンプで光学トランスデューサの近傍に移動させる
（ステップＲＢＣ７）。
【０４３１】９ − 血液と希釈液の混合物をＲＢＣ配
送（delivery）シリンジでインピーダンストランスデュ
ーサに向かって進める（ステップＲＢＣ８）。
【０４３２】１０ − 血液と希釈液の混合物を光学的
配送シリンジを使用して約５２マイクロリットル／秒で
光学トランスデューサ中に送る（ステップＲＢＣ９）。
【０４３３】１１ − 光学トランスデューサ中の流速
を約２．５マイクロリットル／秒に減速する（ステップ
ＲＢＣ１０）。
【０４３４】１２ − 血液と希釈液の混合物をＲＢＣ
配送シリンジを使用してインピーダンストランスデュー
サ中に約０．５マイクロリットル／秒で送る（ステップ
ＲＢＣ１１）。
【０４３５】１３ − 光学トランスデューサからデー
タを収集する（ステップＲＢＣ１２）。
【０４３６】ハードウエアゲートを設けて血小板に対応
するデータのみを収集する。
【０４３７】１４ − インピーダンストランスデュー
サからデータを収集する（ステップＲＢＣ１３）。
【０４３８】ハードウエアゲートを使用して、血小板に
関するデータ（＜３５ ｆＬ）および赤血球に関するデ
ータ（＞３０ ｆＬ）を収集し、インピーダンススパイ
クの大きさに基づいて分離する。
【０４３９】１５ − ＲＢＣカップを空にする（ステ
ップＲＢＣ１４）。
【０４４０】１６ − ＲＢＣ希釈液シリンジをリセッ
トする（ステップＲＢＣ１５）。
【０４４１】１７ − ＲＢＣカップを希釈液で充填す
る（ステップＲＢＣ１６）。
【０４４２】１８ − ＲＢＣカップを空にする（ステ
ップＲＢＣ１７）。
【０４４３】１９ − ＲＢＣ希釈液シリンジからバッ
クラッシュを除去する（ステップＲＢＣ１８）。
【０４４４】２０ − 光学トランスデューサへのＲＢ
Ｃ管路を洗浄する（ステップＲＢＣ１９）。
【０４４５】２１ − インピーダンストランスデュー
サを逆流水洗する（ステップＲＢＣ２０）。
【０４４６】２２ − 他のＲＢＣ管路を水洗する（ス
テップＲＢＣ２１）。
【０４４７】２３ − ＲＢＣ配送シリンジをリセット
する（ステップＲＢＣ２２）。
【０４４８】２４ − ＲＢＣ配送シリンジからバック
ラッシュを除去する。
【０４４９】２５ − インピーダンストランスデュー
サおよび光学トランスデューサからのデータを、後続の
赤血球分析（ステップ２６−３４、アルゴリズムファイ
ルｍｃＲＢＣＡｌｇｏｒｉｔｈｍ．ｃｃによって実行）
および血小板分析（ステップ３５−５０、アルゴリズム
ファイルｍｃＰＬＴＡｌｇｏｒｉｔｈｍ．ｃｃ）に使用
するためファイルにセーブする。
【０４５０】２６ − フラグとパラメータを初期化す
る（サブルーチンＰａｒａｍＤｅｆａｕｌｔｓおよびサ
ブルーチンＣｌａｓｓＦｌａｇＤｅｆａｕｌｔｓ）。
【０４５１】２７ − 赤血球インピーダンスデータを
ファイルから取り出し、局所記憶する（サブルーチンＧ
ｅｔＲＢＣＤａｔａ）。
【０４５２】２８ − 赤血球インピーダンス値の２５
６区域（bin）ヒストグラム（度数プロット）を作成す
る（サブルーチンｍｍＨｉｓｔ２５６）。
【０４５３】２９ − このヒストグラムのための区域
しきい値を次のように設定する（サブルーチンＢｉｎＣ
ｕｔ）： ａ． ヒストグラムモードを決定する。
【０４５４】ｂ． そのモードのどちらかの側で、母集
団がそのモードの母集団の０．０４倍より小さい第一の
区域を識別する。これらの境界を判別値（ｄｉｓｃｒｉ
ｍｉｎａｎｔ）と呼び、その間の値のみを分布パラメー
タＲＤＷ（赤血球分布幅）およびＭＣＶ（平均細胞体
積）の計算に使用する。
【０４５５】ｃ． 低い方の区域しきい値の左（即ち赤
血球体積のより低い値にたいして）に最初の谷あるいは
ゼロカウント区域が存在する場合は、それを識別し、カ
ウントしきい値として設定する。このしきい値より大き
い値は赤血球によるものと見なす。
【０４５６】３０− ＲＢＣ（赤血球濃度）を計算する
（サブルーチンＣａｌｃＲｅｄＣｏｎｃ）。
【０４５７】ＲＢＣ＝（事象数）×（ＲＢＣである部
分）×（希釈率）×（一致補正係数）×（較正係数）／
（流量×測定時間）； ここで事象数は、ステップ１４においてハードウエアゲ
ートによって検出された細胞数、ＲＢＣである比率は、
カウントしきい値の右のヒストグラムカウントを全ヒス
トグラムカウントで割った商である。
【０４５８】一致補正係数は細胞の二重カウントを補正
するものであり、２−exp（未補正ＲＢＣ濃度×トラン
スデューサ体積／希釈率）に等しい。
【０４５９】３１ − ＭＣＶとＲＤＷを計算する（サ
ブルーチンＣａｌｃＲｅｄＤｉｓｔ）： ＭＣＶ＝（判別値間のヒストグラムの平均）×（区域あ
たり０．８ｆＬ）×（較正係数） ＲＤＷ＝ＲＢＣ体積の標準偏差／平均細胞体積（判別内
の） ３２ −ＲＢＣ関連のフラグを異常分析結果を示すよう
に設定する（サブルーチンＳｅｔＲｂｃＦｌａｇｓ）。
【０４６０】３３ − 数値結果とフラグＲＢＣ結果を
記憶及び報告のためシステムに戻す（サブルーチンＳｅ
ｎｄＮｕｍＲｅｓｕｌｔｓおよびＳｅｎｄＡｌｅｒｔＲ
ｅｓｕｌｔｓ）。ＲＢＣの数値結果の例を図４５Ａから
図４５Ｆに示す。
【０４６１】３４ − ＲＢＣ体積値を記憶し報告する
ためヒストグラムを生成する（サブルーチンＭａｋｅＤ
ｉｓｐｌａｙＨｉｓｔ）。ＲＢＣ体積ヒストグラムの例
を図４５Ａから図４５Ｆおよび図４６に示す。
【０４６２】３５ − フラグとパラメータを初期化す
る（サブルーチンＰａｒａｍＤｅｆａｕｌｔｓおよびＣ
ｌａｓｓＦｌａｇＤｅｆａｕｌｔｓ）。
【０４６３】３６ − 光学的データおよびインピーダ
ンス血小板データをファイルから取り出し局所に記憶す
る（サブルーチンＧｅｔＰＬＴｉＤａｔａおよびサブル
ーチンＧｅｔＰＬＴｏＤａｔａ）。インピーダンスデー
タは血小板体積を表すインピーダンス値からなる。光学
的データは偏光側方散乱（ＰＳＳ）光学値および中間角
散乱（ＩＡＳ）光学値からなる。
【０４６４】３７ − インピーダンス血小板データの
２６５区域ヒストグラムを生成する（サブルーチンｍｍ
Ｈｉｓｔ２５６）。これは０から３５ｆＬまでに及ぶ体
積値を表す。
【０４６５】３８ − ヒストグラムモードの両側に次
のように区域しきい値を設定する（サブルーチンＢｉｎ
Ｃｕｔ）： ａ：モードの両側でモードのカウントの０．０４倍より
小さいカウントの第一の区域を識別する。
【０４６６】ｂ：元のしきい値より先にある第二のピー
クが存在するならば、それをそのピークとそのモードの
間の谷と共に識別する。
【０４６７】ｃ：第二のピークが存在し、谷の中のカウ
ントがそのモードのカウントの０．０２倍より小さいな
らば、しきい値をその谷に移動させる。
【０４６８】３９ − ＰＬＴｉ、インピーダンス値に
基づいた血小板濃度（サブルーチンＣａｌｃＰＬＴｉＣ
ｏｎｃ）： ＰＬＴｉ＝（事象数）ラ（血小板である比率）×（希釈
率）×（較正係数）／（流量×測定時間）； ここで事象数は、ステップ１４においてハードウエアゲ
ートで検出された細胞数、血小板である比率とは、左し
きい値より右のヒストグラムカウントを全ヒストグラム
カウントで割った商である。
【０４６９】４０ − 血小板分布パラメータＭＰＶ
（平均血小板体積）とＰＤＷ（血小板分布幅）を計算す
る（サブルーチンＣａｌｃＰＬＴＤｉｓｔ）： ＭＰＶ＝（しきい値間のヒストグラム値の平均区域数）
×（区域あたり０．１３７ ｆＬ）×（較正係数） ＰＤＷ＝（しきい値間の血小板体積値の標準偏差）／
（平均血小板体積） ４１ − インピーダンス関連の血小板フラグを異常分
析結果に設定する（サブルーチンＳｅｔＰＬＴｉＦｌａ
ｇｓ）。
【０４７０】４２ − 光学的血小板データにｌｏｇ
（ＰＳＳ）＝８．０のノイズゲートを適用する（サブル
ーチンＰＬＴｏＮｏｉｓｅＧａｔｅ）。
【０４７１】４３ − 残りの光学的血小板データに次
のように回帰帯域ゲートを適用する（サブルーチンＰＬ
ＴｏＲｅｇｒｅｓｓＢａｎｄＧａｔｅ）： ａ．分析平面ｌｏｇ（ＩＡＳ）対ｌｏｇ（ＰＳＳ）にお
いてノイズゲートより上の光学的血小板データに対し線
形回帰およびこの回帰の標準誤差推定値を計算する。
【０４７２】ｂ．上方回帰帯域ゲートを回帰線に平行に
２．０標準誤差だけ上に引く。
【０４７３】ｃ．下方回帰帯域ゲートを回帰線に平行に
２．５標準誤差だけ下に引く。
【０４７４】４４ − ノイズゲートより上で回帰帯域
ゲート間の光学的血小板データを上方母集団があるかど
うか検査する（サブルーチンＰＬＴｏＦｉｎｄＵｐｐｅ
ｒＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ）： ａ．残りの点をステップ４３の回帰線上に投影する。
【０４７５】ｂ．２５６区域ヒストグラムを生成し、平
均化により６４区域に減らし、７ピンボックスカー（bo
xcar）フィルタで濾過し、補間によって２５６区域に拡
張する。
【０４７６】ｃ．ヒストグラムの下部２／３中でモード
を識別する。
【０４７７】ｄ．第二のピークを求めてヒストグラムの
上部１／４を探す。
【０４７８】ｅ．ヒストグラムの上部１／４に第二のピ
ークが存在するならば、このモードと第二のピークの間
の谷に上方母集団ゲートを設定する。そうでなければ、
上方母集団ゲートはヒストグラムの右端に設定する。こ
のゲートより上にあるあらかじめ除外されなかった細胞
が「上方母集団」である。このゲートより下にあるあら
かじめ除外されなかった細胞が「下方母集団」である。
【０４７９】ｆ．この上方母集団を一組の基準と比較し
て小赤血球を含むかどうか判定する。含むならば、警告
フラグが設定される。
【０４８０】４５ − 光学的に決定された血小板濃度
（ＰＬＴｏ）を計算する（サブルーチンＣａｌｃＰＬＴ
ｏＰａｒａｍｓ）： ＰＬＴｏ＝（事象数）×（血小板である比率）×（希釈
度）／（流量×測定時間） ここで事象数は、ｌｏｇ（ＩＡＳ）対ｌｏｇ（ＰＳＳ）
平面中の四角のハードウエアゲート内のハードウエアに
よってカウントされた光学的事象数である、血小板であ
る比率は、上方母集団のカウントを上方母集団と下方母
集団のカウントの合計で割った商である。
【０４８１】４６ − ｐｌａｔｅｌｅｔｃｒｉｔ（Ｐ
ＣＴ、あるいは全血の血小板からなる分画）を計算する
（サブルーチンＣａｌｃＰＣＴ）： ＰＣＴ＝ＰＬＴｏ×ＭＰＶ×（単位変換係数） ４７ − 光学的に決定された血小板パラメータに関連
するフラグを異常結果を示すように設定する（サブルー
チンＳｅｔＰＬＴｏＦｌｇｓ)。
【０４８２】４８ − 光学的に決定された血小板パラ
メータに関連する数値結果とフラグを記憶及び報告のた
めシステムに戻す（サブルーチンＳｅｎｄＮｕｍＲｅｓ
ｕｌｔｓおよびＳｅｎｄＡｌｅｒｔＲｅｓｕｌｔｓ）。
血小板の数値結果の例を図４５Ａから図４５Ｆ、図４７
および図４８に示す。
【０４８３】４９− 血小板インピーダンス値のヒスト
グラムを記憶及び報告のため生成する（サブルーチンＭ
ａｋｅＤｉｓｐｌａｙＨｉｓｔ）。血小板インピーダン
スヒストグラムの例を図４７に示す。
【０４８４】５０− 血小板光学値とゲートの撒布図を
記憶及び報告のため生成する（サブルーチンＳｅｎｄＳ
ｃａｔＲｅｓｕｌｔｓ）。血小板撒布図の例を図４５Ａ
から図４５Ｆ、図４７および第４８図に示す。
【０４８５】実施の形態 ４：白血球（ＷＢＣ）の示差
分析 本発明の一つの実施の形態を用いて全血サンプルの白血
球（ＷＢＣ）示差分析を行うことができる。かかる分析
手順の一例は次の通りである。サンプル処理の諸段階は
アペンデックスＡにあるようなソフトウエアで制御され
る。データ分析の諸段階はアペンデックスＢにあるよう
なソフトウエアで制御される。
【０４８６】１− ＷＢＣカップモータがカップの混合
運動を開始する（ステップＷ１）。
【０４８７】２− １２７５マイクロリットルのＷＢＣ
溶解液をＷＢＣ希釈シリンジでＷＢＣカップ中に入れる
（ステップＷ２）。
【０４８８】３− ３７．５マイクロリットルの全血を
吸引プローブで ＷＢＣカップ中に入れる（実施の形態
１のステップＡ９）。
【０４８９】４− ＷＢＣ希釈シリンジをリセットする
（ステップＷ３）。
【０４９０】５− ＷＢＣ希釈シリンジを移動させてバ
ックラッシュを除去する（ステップＷ４）。
【０４９１】６− 血液サンプルとＷＢＣ溶解液の混合
の後約９．４秒待つ。
【０４９２】７− 光学トランスデューサ中のシース流
を開始化する（実施の形態３のステップＲＢＣ６）。
【０４９３】８− 血液と溶解液の混合物をＨＧＢ蠕動
ポンプを使用して光学トランスデューサ管へ移動させる
（ステップＷ５）。
【０４９４】９− ＷＢＣカップを空にして洗浄する
（ステップＷ６）。
【０４９５】１０− ＷＢＣサンプルが光学トランスデ
ューサ中を通って流れるように弁を再調整する（ステッ
プＷ７）。
【０４９６】１１− 光学的配送シリンジを使用して約
２７．６マイクロリットル／秒でＷＢＣサンプルが光学
トランスデューサを通って流れ始める（ステップＷ
８）。
【０４９７】１２− ＷＢＣサンプルの流量を約２．５
マイクロリットル／秒まで減少させる（ステップＷ
９）。
【０４９８】１３− 光学的ＷＢＣデータを光学トラン
スデューサで収集する（ステップＷ１０）。
【０４９９】１４− 光学的配送シリンジをリセットす
る（ステップＷ１１）。
【０５００】１５− 光学的配送シリンジからバックラ
ッシュを除去する（ステップＷ１２）。
【０５０１】１６− 光学トランスデューサからのデー
タを後続のＷＢＣ示差分析に使用するためにファイルに
セーブする（ステップ１７−ＸＸ、アルゴリズムファイ
ルｍｃＷＢＣＡｌｇｏｒｉｔｈｍ．cｃによって実行さ
れる）。
【０５０２】１７− ＷＢＣデータをファイルから取り
出し、局所に記憶する（サブルーチンＧｅｔＷＢＣＤａ
ｔａ）。このデータは各検出事象について、軸光損失
（ＡＬＬ）値、中間角散乱（ＩＡＳ）値、偏光側方散乱
（ＰＳＳ）値、復偏光側方散乱（ＤＳＳ）値および赤色
蛍光（ＦＬ３）値からなる。
【０５０３】ステップ１８−２２ 有核赤血球（ＮＲＢ
Ｃ）を識別する １８− ＦＬ３値の２５６区域ヒストグラムを生成する
（サブルーチンｍｍＨｉｓｔ２５６）。
【０５０４】１９− ｌｏｇ（ＦＬ３）＝１００の近傍
の谷を識別することによって事象を「高ＦＬ３」と「低
ＦＬ３」に分割する（サブルーチンＦｉｎｄＦｌ３Ｃｅ
ｌｌｓ）。この分割の一例を第４９Ａ図と第４９Ｂ図に
示す。
【０５０５】２０− 高ＦＬ３細胞のＡＬＬ値のヒスト
グラムを生成する（サブルーチンｍｍＨｉｓｔ２５
６）。このヒストグラムの一例を第５０Ａ図と第５０Ｂ
図に示す。
【０５０６】２１− ＡＬＬ＝７５より小さい値にピー
クが存在するなら識別する（サブルーチンＡｎａｌｙｚ
ｅＦｌ３Ｃｅｌｌｓ）。存在しないならばＮＲＢＣは報
告されない。
【０５０７】２２− ＡＬＬ＜７５でピークが存在する
ならＰＳＳしきい値（約４５）より大きいＰＳＳ値を有
する事象はＮＲＢＣに分類され、それ以上の分析を受け
ない。
【０５０８】ステップ２３−２６ 好中球と好酸球を識
別する ２３− ＰＳＳ対ＡＬＬ面上の全事象のプロットを使用
して好中性球ピークと単核細胞ピークである二つの最大
ピークを識別する（サブルーチンＦｉｎｄＭＧＬｉｎ
ｅ）。
【０５０９】２４− この二つのピークの間に一本の線
を引く。この線に沿った最小値から出発して、果粒細胞
（線の上）と単核細胞（線の下）の間に分割線を引く
（サブルーチンＦｉｎｄＭＧＬｉｎｅ、続き）。この分
割線の一例を第５１Ａ図と第５１Ｂ図に示す。
【０５１０】２５− 顆粒細胞（線の上）について、ア
ークタンゼント（ＤＳＳ／ＰＳＳ）値のヒストグラムを
生成する（サブルーチンＦｉｎｄＮＥＬｉｎｅ）。
【０５１１】２６− ステップ２５のヒストグラムを検
索して角度１０°と３１°の値の間の谷を求める（サブ
ルーチンＦｉｎｄＮＥＬｉｎｅ続き）。角の値がこの谷
より大きいアークタンゼント（ＤＳＳ／ＰＳＳ）の細胞
は好酸球に分類され、角の値がこの谷より小さいアーク
タンゼント（ＤＳＳ／ＰＳＳ）の有する細胞は好中性球
に分類される。このヒストグラムと角分割線の一例を第
５２Ａ図と第５２Ｂ図に示す。
【０５１２】サブルーチン２７−２８ 単核細胞と間質
細胞（stroma）を識別する ２７− 残りの細胞からＡＬＬ値の２５６区域ヒストグ
ラムを生成する（サブルーチンｍｍＨｉｓｔ２５６）。
【０５１３】２８− ＡＬＬヒストグラムを検索して、
高領域（区域１００−１６０）と低領域（区域４５−７
５）に二つの谷を探す。上の谷より上にある細胞は単核
細胞に分類される。下の谷より下にある細胞は間質細胞
に分類される（サブルーチンＦｉｎｄＬｙｍｐｈＬｉｎ
ｅｓ）。ＡＬＬヒストグラムと分割線の一例を第５３図
に示す。
【０５１４】ステップ２９−３０ リンパ球を識別する
のに使用する。
【０５１５】２９− 残りの細胞から、ＩＡＳ値の２５
６区域ヒストグラムを生成する（サブルーチンｍｍＨｉ
ｓｔ２５６）。
【０５１６】３０− 区域７０と１１０の間に谷がある
ならそれを識別する。そのような谷が存在しないなら、
ＩＡＳ値の平均値とＩＡＳ値の標準偏差の２．５倍との
和に等しい値のところに分割線を引く。この谷または線
の左側にある細胞はリンパ球に分類される。この分割の
一例を図５４に示す。
【０５１７】ステップ３１−３２ 好塩基球を識別する
のに使用する。
【０５１８】３１− 残りの細胞から、ＡＬＬ値の２５
６区域ヒストグラムを生成する（サブルーチンｍｍＨｉ
ｓｔ２５６）。
【０５１９】３２− ＡＬＬヒストグラムに谷があるな
ら、ステップ２８で決定されたリンパ球−間質細胞とリ
ンパ球−単核球分離線からの距離の１／４と３／４の間
でそれを識別する。そのような谷が存在しないなら、こ
の距離の半分のところにデフォールト（default）の分
割線を引く。ＡＬＬ値がこの線より上の細胞は好塩基球
に分類される。ＡＬＬ値がこの線より下の事象はノイズ
に分類される（サブルーチンＦｉｎｄＢａｓｏＬｉｎｅ
ｓ）。この分割の一例を第５５図に示す。
【０５２０】３３− 分類された各母集団についてヒス
トグラムと統計を生成する（サブルーチンＤｏＰｏｐＳ
ｔａｔｓ）。
【０５２１】３４− 異常分析結果に対する警告フラグ
を設定する（サブルーチンＳｅｔＦｌａｇｓ）。具体的
には、このステップは溶解抵抗性を有するＲＢＣの存在
と芽細胞に対する統計学的チェックを実行することが含
まれる。以下の統計の加重組合せがしきい値より高い
（約３．８７４）ならば芽細胞警告フラグが設定され
る。
【０５２２】
【表２】
【０５２３】３５− 全数値結果と警告フラグが、記憶
及び報告のためシステムに戻される（サブルーチンＳｅ
ｎｄＮｕｍＲｅｓｕｌｔｓおよびサブルーチンＳｅｎｄ
ＦｌａｇＲｅｓｕｌｔｓ）。
【０５２４】３６−撒布図のセットを生成し記憶及び報
告のためシステムに送る（サブルーチンＳｅｎｄＳｃａ
ｔＲｅｓｕｌｔｓ）。典型的報告は、図４５Ａから図４
５Ｆに示すようにＡＬＬ対ＩＡＳ、ＤＳＳ対ＰＳＳおよ
びＡＬＬ対ＦＬ３である。
【０５２５】実施の形態５：網赤血球分析 本発明の一つの実施の形態を使用して全血サンプルの網
赤血球分析を行うことができる。かかる分析手順の一例
は次の通りである。サ−ンプル処理の諸段階はアペンデ
ックスＡに示すようなソフトウエアによって制御され
る。データ分析の諸段階はアペンデックスＢに示すよう
なソフトウエアによって制御される。この分析によって
生成された分散プロットを図１４Ａと図１４Ｂに示す。
【０５２６】１− 分析は空のＲＢＣカップから始め
る。
【０５２７】２− ２２００マイクロリットルのＲＢＣ
希釈液をＲＢＣ希釈液シリンジを用いてＲＢＣカップ中
に入れる（ステップＲＢＣ２）。
【０５２８】３− １８．７５マイクロリットルの全血
と２０００マイクロリットルのＲＢＣ希釈液とを吸引プ
ローブを通して実施の形態１に記述したようにＲＢＣカ
ップ中に入れる（ステップＡ１５）。
【０５２９】４− ３６５６マイクロリットルの希釈液
をＲＢＣ希釈液シリンジでＲＢＣカップ中に入れる（ス
テップＲＢＣ３）。約４２０：１の希釈率が得られる。
【０５３０】５− ５００マイクロリットルの血液／希
釈液混合物をＲＢＣカップから吸引プローブ中に吸引す
る（ステップＡ１６）。
【０５３１】６− 吸引プローブを引き上げて清掃する
（ステップＡ１７）。
【０５３２】７− 吸引プローブをＲＥＴＩＣカップの
真上の位置に移動する（ステップＡ１８）。
【０５３３】８− 吸引プローブをＲＥＴＩＣカップの
方へ少し下げる（ステップＡ１９）。
【０５３４】９− ２００マイクロリットルの血液／希
釈液混合物を網赤血球分析のため吸引プローブからＲＥ
ＴＩＣカップ中に入れる（ステップＡ２０）。
【０５３５】１０− ６００マイクロリットルの網赤血
球着色剤を網赤血球希釈液シリンジを用いて固定ポート
を通してＲＥＴＩＣカップ中に入れる（ステップＲ
１）。約１６８０：１の希釈率が得られる。
【０５３６】１１− 網赤血球希釈液シリンジをリセッ
トする（ステップＲ２）。
【０５３７】１２− 網赤血球サンプルをＲＢＣ蠕動ポ
ンプを使用して光学的流動セルの近傍へ送る（ステップ
Ｒ３）。
【０５３８】１３− キャリーオーバ（carryover）を
防止するためＷＢＣサンプル管中に光学的流動セルへの
逆流を短時間開始する（ステップＲ４）。
【０５３９】１４− ＲＥＴＩＣカップを空にする（ス
テップＲ５）。
【０５４０】１５− 液体管死容積（dead volume）を
除去するため光学的配送シリンジを使用して７８マイク
ロリットル／秒で光学的流動セル中に網赤血球サンプル
を流し始める（ステップＲ６）。
【０５４１】１６− 光学的フローセルを通る網赤血球
サンプルの流れを約２．０マイクロリットル／秒の速さ
まで減少させる（ステップＲ７）。
【０５４２】１７− ＲＥＴＩＣカップを希釈液で充填
して洗浄する（ステップＲ８）。
【０５４３】１８− 光学トランスデューサ中で網赤血
球データを収集する（ステップＲ９）。ハードウエアゲ
ートが、中間角散乱（ＩＡＳ）値が特定のしきい値より
大きい各光学的事象に対するデータを収集する。
【０５４４】１９− ＲＥＴＩＣカップを空にして洗浄
し再び空にする（ステップＲ１０）。
【０５４５】２０− 光学的配送シリンジをリセットす
る（ステップＲ１１）。
【０５４６】２１− 網赤血球サンプル供給管を洗浄す
る（ステップＲ１２）。
【０５４７】２２− 光学的配送シリンジからバックラ
ッシュを除去する（ステップＲ１３）。
【０５４８】２３− 後続の分析のため網赤血球光学デ
ータをファイルに記憶する。ステップ２４− ３３の分
析はアルゴリズムファイルｍｒＲＥＴＣＡｌｇｏｒｉｔ
ｈｍ．ｃｃで制御される。
【０５４９】２４− ファイルからデータを取り出して
局所に記憶する（サブルーチンＧｅｔＲＥＴＣＤａｔ
ａ）。このデータは中間角散乱（ＩＡＳ）値と緑色蛍光
（ＦＬ１）値からなる。
【０５５０】２５− ｌｏｇ（ＩＡＳ）値の２５６区域
ヒストグラムを生成する（サブルーチンｍｍＨｉｓｔ２
５６）。
【０５５１】２６− チャネル１５０と１９０の間に谷
があるならそれを識別する。この谷（谷がないならば１
７０）より低いｌｏｇ（ＩＡＳ）値を有する細胞は血小
板と考えられ、その後の分析から除外される（サブルー
チンＦｉｎｄＰＬＴｓ）。このヒストグラムと分割線の
一例を第５６図に示す。
【０５５２】２７− 残りの細胞から、ｌｏｇ（ＦＬ
１）値の２５６区域ヒストグラムを生成する（サブルー
チンｍｍＨｉｓｔ２５６）。
【０５５３】２８− 谷が存在するなら、このヒストグ
ラムの上部領域内でそれを識別する（区域１７５と２２
５の間に）。この谷（谷が存在しないときは２００）よ
りも大きいｌｏｇ（ＦＬ１）値を有する細胞はＷＢＣと
見られ、分析から除外される（サブルーチンＦｉｎｄＷ
ＢＣｓ）。
【０５５４】２９− 大きい（ＲＢＣ）ピークの右の谷
を探してｌｏｇ（ＦＬ１）ヒストグラムを検索する。そ
のような谷が存在するなら、その右の細胞を網赤血球と
して分類する。谷がないならば、チャネル１２０（デフ
ォールト網赤血球カーソル）に分割線をおく。この分割
線より右の細胞は網赤血球として分類される（サブルー
チンＦｉｎｄＲＥＴＣｓ）。このヒストグラムと分割線
の例を図４５Ｆと図５７に示す。
【０５５５】３０− 網赤血球成熟指数（ＲＭＩ）を計
算する。この値は、「高ＦＬ１」領域にあり、網赤血球
下限（ステップ２９で確立）に一定値（約２４）を加え
た値よりも高いｌｏｇ（ＦＬ１）ヒストグラム区域を有
するものとして定義された網赤血球の百分率に等しい
（サブルーチンＧｅｔＦｉｏｎａｌＣｏｕｎｔｓ）。
【０５５６】３１− 数値結果を記憶及び報告のためシ
ステムに戻す（サブルーチンＳｅｎｄＮｕｍＲｅｓｕｌ
ｔｓ）。
【０５５７】３２− 記憶及び報告のため撒布図を生成
する（サブルーチンＳｅｎｄＳｃａｔＲｅｓｕｌｔ
ｓ）。網赤血球撒布図の一例を図１４Ａおよび図５８に
示す。
【０５５８】３３− ｌｏｇ（ＦＬ１）値のヒストグラ
ムを記憶及び報告のため生成する（サブルーチンＳｅｎ
ｄＨｉｓｔＲｅｓｕｌｔｓ）。網赤血球ヒストグラムの
例を第１４Ｂ図、図４５Ｆおよび図５９に示す。
【０５５９】実施の形態６：リンパ球免疫表現型分析 本発明の一つの実施の形態を用いて全血サンプルのリン
パ球免疫表現型分析を行うことができる。かかる分析手
順の一例は次の通りである。サンプル処理の諸段階はア
ペンデックスＡに示すようなソフトウエアによって制御
される。
【０５６０】１．１００マイクロリットルの全血を吸引
プローブで吸引し移動カップ中に入れる（サブルーチン
ｓｕｂａｓｐ．f）。この量は、必要ならそのサンプル
について所望の免疫表現型検定をすべて実行するのに十
分な血液を供給するように調節できる。
【０５６１】２．インキュベーションプローブは移動カ
ップから約７０マイクロリットルを吸引して適当な数の
保温カップ中に入れる（サブルーチン ｓｕｂｐｒｅ
ｐ．f）。
【０５６２】３．免疫表現型抗体試薬などの試薬をイン
キュベーションプローブで吸引し適当な保温カップ中に
入れる（サブルーチンｓｕｂｉｎｃ．ｆ）。
【０５６３】４．インキュベーションのため適当な時間
待つ。
【０５６４】５．約６７０マイクロリットルのｗｂｃ希
釈液をＷＢＣカップに加える。この段階とこれに続くサ
ンプル処理の諸段階（５から８）はサブルーチンｓｕｂ
ｖｕ．ｆにあるようなソフトウエアによって制御され
る。
【０５６５】６．インキュベーション後に、約３０マイ
クロリットルのサンプルをインキュベーションプローブ
で吸引しＷＢＣカップ中に入れる。
【０５６６】７．サンプルと希釈液の混合物をＷＢＣカ
ップで約５秒間混合する。
【０５６７】８．この混合物を光学的性質を測定するた
め光学トランスデューサ中に送る。測定された特性とし
ては軸光損失（ＡＬＬ）、中間角散乱（ＩＡＳ）、およ
び二つの蛍光値（ＦＬ１とＦＬ２）が含まれる。
【０５６８】９．データを後続の分析のために記憶す
る。一般の分析段階にはここに挙げたものが含まれる。
【０５６９】１０．ＡＬＬ値対ＩＡＳ値のプロットを作
成し、極座標二変量領域（polar bivariate region）に
分割する。それらの領域は原点から派生する半径と円弧
で境界付けられる。原点は変更しても良いが、通常は最
大ＡＬＬ限界及びゼロＩＡＳ点に位置する。第６０Ａ図
参照。
【０５７０】１１．ｌｏｇ（ＦＬ２）対lｏｇ（ＦＬ
１）の第二ののプロットを作成し、極座標二変量領域に
分割する。この分割の原点は通常（０、０）にある。Ａ
ＬＬ対ＩＡＳプロットとｌｏｇ（ＦＬ２）対ｌｏｇ（Ｆ
Ｌ１）プロットの両方を図６０Ａと図６０Ｂに示す。
【０５７１】１２．リンパ球ピークを探して両方のプロ
ットを反時計回りに次いで半径方向外側に検索する。し
きい値はピークの高さの１／１０に設定される。関連の
データポイントがこのしきい値内にある細胞はリンパ球
であると見なされる。
【０５７２】１３．各プロットのリンパ球事象数をカウ
ントし、相互に及び血液内リンパ球カウントと比較して
可能な誤差を検出する。
【０５７３】１４．統計分析で、最も特異的にリンパ球
を識別するＩＡＳ値とＡＬＬ値の限界が更に精密にする
であろう。この輪郭で、ＡＬＬ対ＩＡＳ分析空間内に楕
円面、多角形または他の幾何領域を形成することができ
る。
【０５７４】１５．異なる抗体試薬で処理した同じサン
プルの分析を続けることができる。そのＩＡＳ値および
ＡＬＬ値がリンパ球識別によって決定された限界内にあ
る場合のみ、細胞は分析の対象と見なされる（ステップ
１０から１４）。
【０５７５】実施の形態６Ａ：Ｔヘルパーサブセットの
測定 本発明の一つの実施の形態を用いて以下と同様の手続き
に従ってＴヘルパー細胞であるリンパ球の比率を測定す
る。
【０５７６】１．全血サンプルの一部分を、ＷＢＣ上の
ＣＤ４５レセプタに結合して、二つの蛍光検出器（ＦＬ
１あるいはＦＬ２）の一方によって検出可能な蛍光を発
する、蛍光標識された抗体と、ＷＢＣ上のＣＤ１３とＣ
Ｄ１４レセプタの両方に結合して二つの蛍光検出器のも
う一方の検出器で検出可能な蛍光を発する、蛍光標識さ
れた抗体を含む試薬混合物と共にインキュベーションす
る。この実施の形態においては、ＣＤ４５抗体がフルオ
レセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合し、Ｃ
Ｄ１３とＣＤ１４抗体がヒコエリスリン（ＰＥ）に結合
する。通常のインキュベーションは周囲温度で約１５分
行われる。
【０５７７】２．同じ全血サンプルの第二の部分を、Ｗ
ＢＣ上のＣＤ３レセプタに結合して二つの蛍光検出器
（ＦＬ１あるいはＦＬ２）の一方によって検出可能な蛍
光を発する、蛍光標識された抗体と、ＷＢＣ上のＣＤ４
レセプタに結合して二つの蛍光検出器のもう一方によっ
て検出可能な蛍光を発する蛍光標識された抗体とを含む
試薬混合物と共にインキュベートする。この実施の形態
においては、ＣＤ３抗体はＦＩＴＣと結合し、ＣＤ４抗
体はＰＥと結合する。
【０５７８】３．最初にインキュベートした全血サンプ
ルを実施の形態６に記述したのと同じ方法で分析する。
この分析で、ＣＤ４５レセプタの存在とＣＤ１３とＣＤ
１４レセプタの不在を特徴とするリンパ球に対応するＩ
ＡＳ値およびＡＬＬ値の領域（リンパ球ゲート）が得ら
れる。ＣＤ１３／ＣＤ１４活性およびＣＤ４５活性に対
応する蛍光レベルのプロットとその結果得られるリンパ
球の名称を図６１Ａに示す。同じ細胞に対するＩＡＳ値
とＡＬＬ値のプロットおよびその結果得られるリンパ球
ゲートを図６１Ｂに示す。
【０５７９】４．リンパ球ゲート手順の純度は、リンパ
球ゲート内の全細胞のうち、ＦＬ１とＦＬ２検出器で検
出された蛍光のレベルによって示されるように、ＣＤ４
５レセプタの存在とＣＤ１３及びＣＤ１４レセプタの不
在を証明する分画を計算することによって決定すること
ができる。リンパ球ゲート内の細胞に対するＣＤ１３／
ＣＤ１４活性およびＣＤ４５活性に対応する蛍光レベル
のプロットを図６１Ｃに示す。
【０５８０】５．第二のインキュベートされた血液サン
プルを実施の形態６の段階１から８に記述したのと同様
な方法で分析する。そのＩＡＳ値及びＡＬＬ値がリンパ
球ゲート内にある各細胞は、ＦＬ１とＦＬ２の検出レベ
ルと、非結合性でＰＥとＦＩＴＣで標識されたと見なさ
れる抗体混合物と共にインキュベートされた対照細胞の
蛍光レベルとの比較に基づいて、試薬混合物（ＣＤ３と
ＣＤ４）内の二つの抗体のそれぞれについて正あるいは
負として特徴づけられる。この対照細胞（負反応を示
す）の蛍光レベルを図６１Ｄに示す。
【０５８１】６．Ｔヘルパー細胞であるリンパ球の分画
はＣＤ３に対して正、ＣＤ４に対して正であるリンパ球
ゲート内の細胞の分画として決定される。両方に対して
正である分画を示すリンパ球ゲート内の細胞のＣＤ３活
性及びＣＤ４活性に対応する蛍光レベルのプロットを図
６１Ｅに示す。
【０５８２】７．Ｔヘルパー細胞の濃度は、ＣＤ３に対
して正、ＣＤ４に対して正である（ステップ６で決定）
リンパ球の分画に、実施の形態４で記述したＷＢＣ示差
分析で求められたリンパ球カウントを乗じた値として判
定できる。
【０５８３】実施の形態６Ｂ：Ｔサプレッササブセット
の測定 同様な手順を用いて、ＣＤ３とＣＤ８の両方に対して正
であることを特徴とするＴサプレッサ細胞のリンパ球サ
ブセットを定量することができる。
【０５８４】１．全血サンプルの一部分を、実施の形態
６Ａのステップ１におけると同様に、ＷＢＣ上のＣＤ４
５レセプタに結合する蛍光標識された抗体と、ＷＢＣ上
のＣＤ１３及びＣＤ１４の両方のレセプタに結合する蛍
光標識された抗体とを含む試薬混合物と共にインキュベ
ーションする。このインキュベートされたサンプルの分
析は、実施の形態６Ａのステップ３及び４に記述したよ
うに行われ、リンパ球ゲートが得られる。典型的インキ
ュベーションは周囲温度で約１５分間行われる。
【０５８５】２．同じ全血サンプルの第二の部分を、Ｗ
ＢＣ上のＣＤ３レセプタに結合して二つの蛍光検出器
（ＦＬ１またはＦＬ２）の一方で検出可能な蛍光を発す
る蛍光標識された抗体と、ＷＢＣ上のＣＤ８レセプタに
結合してこの二つの蛍光検出器のもう一方で検出可能な
蛍光を発する蛍光標識された抗体とを含む試薬混合物と
共にインキュベートする。この実施の形態では、ＣＤ３
抗体がＦＩＴＣに、ＣＤ８抗体がＰＥに結合する。
【０５８６】３．第二のインキュベートされた血液サン
プルを実施の形態６のステップ１から８に記述したのと
同様な方法で分析する。そのＩＡＳ値とＡＬＬ値がリン
パ球ゲート内にある各細胞は、検出されたＦＬ１とＦＬ
２のレベルの比較に基づいて蛍光レベルを制御するよう
に試薬混合物（ＣＤ３とＣＤ８）内の二つの抗体の各々
について正または負として特徴づけられる。
【０５８７】４．Ｔサプレッサ細胞であるリンパ球の分
画はＣＤ３に対して正、ＣＤ８に対して正であるリンパ
球ゲート内の細胞の分画として決定される。リンパ球ゲ
ート内の細胞のＣＤ３活性及びＣＤ８活性に対応し、両
方が正である分画を示す蛍光レベルのプロットを第６１
Ｆ図に示す。
【０５８８】５．Ｔサプレッサ細胞の濃度はＣＤ３に対
して正、ＣＤ８に対して正であるリンパ球の分画数（ス
テップ５で決定）に実施の形態４で記述したＷＢＣ示差
分析で求められたリンパ球カウントを乗じた値として決
定することができる。
【０５８９】実施の形態６Ｃ：ＴおよびＢリンパ球の測
定 ＴおよびＢリンパ球の数は実施の形態６Ａおよび６Ｂで
記述したのと同様な手順を用いて測定することができ
る。リンパ球ゲートを作成するのに使用した第一のイン
キュベートされたサンプルは、実施の形態６Ａおよび６
Ｂと同じＣＤ４５標識抗体とＣＤ１３／ＣＤ１４標識抗
体の混合物である。血液サンプルの第二の部分はＣＤ３
抗体（ＦＩＴＣで標識された）とＣＤ１９抗体（ＰＥで
標識された）の混合物と共にインキュベートされる。Ｔ
細胞とＢ細胞の分画は、ＣＤ３に対して正、ＣＤ１９に
対して負である細胞の分画（Ｔ細胞）と、ＣＤ３に対し
て負、ＣＤ１９に対して正である細胞の分画（Ｂ細胞）
から決定される。Ｔ細胞とＢ細胞を示すＣＤ３活性およ
びＣＤ１９活性に対応する蛍光レベルのプロットを図６
１Ｇに示す。
【０５９０】これら実施の形態に述べたリンパ球サブセ
ット測定の有効性は、本発明の実施の形態を用いた分析
結果を従来の手動フローサイトメトリ検定の結果と比較
することで実証される。本発明の実施の形態（ＢＢ３と
名付ける）とＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ によるＦ
ＡＣＳｃａｎ ｓｙｓｔｅｍ による従来の分析のその
ような比較の結果を図６２Ａから図６２Ｄに示す。
【０５９１】図６２Ａから図６２Ｄ中のプロットはＣＤ
３とＣＤ４の両方に対して正（図６２Ａ）、ＣＤ３とＣ
Ｄ８の両方に対して正（図６２Ｂ）、ＣＤ１９に対して
正（図６２Ｃ）およびＣＤ３のみに対して正（図６２
Ｄ）であるリンパ球の分画間の相関関係を示す。
【０５９２】実施の形態７：ＮＲＢＣ分析 ２５μｌの全血臨床サンプルを、上記で開示した細胞分
析計器システム内で、ＷＢＣカップ１３８内で４２Ｃに
予熱した６７５マイクロリットルの多目的試薬と、オン
ラインで混合する。このサンプル／試薬を混合し１１秒
間保温する。この混合物を次いで流動セル１７０に移
し、そこで約８秒半かけてＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣ
分析を行う。図４０Ａから図４０Ｃおよび図４１Ａと図
４１Ｂにそれぞれ５６ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣと１４０
ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを含むサンプルに対するこの分
析の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の趣旨にしたがって構成した細胞分析シ
ステムのブロック線図である。
【図２】図１に示した細胞分析システムと併用するソフ
トウェアサブシステムの実施の形態のブロック線図であ
る。
【図３】図１に示した細胞分析システムのサンプル処理
領域の実施の形態を示す図である。
【図４Ａ】図３に示したサンプル処理領域のさらに詳細
な図である。
【図４Ｂ】図４に示したシステムの通気／吸引アセンブ
リの正面図である。
【図４Ｃ】図４のシステムに使用するインキュベーショ
ンプローブアセンブリの見取図である。
【図５】図１に示した細胞分析システムの液体分与シス
テムの実施の形態を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃは、沈殿、洗
浄、および吸引時の細胞分析システムのインキュベーシ
ョンプローブを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃは、沈殿、洗
浄、および吸引時の細胞分析システムのインキュベーシ
ョンプローブを示す図である。
【図６Ｃ】図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃは、、沈殿、
洗浄、および吸引時の細胞分析システムのインキュベー
ションプローブを示す図である。
【図７】図１に示した細胞分析装置の吸引／沈殿システ
ムの実施の形態を示す線図である。
【図８】図１に示した細胞分析システムのインキュベー
ション移動システムの実施の形態を示す線図である。
【図９】図１に示した細胞分析システムの網赤血球染料
供給システムの実施の形態を示す線図である。
【図１０Ａ】図１に示した細胞分析システムのインピー
ダンスサンプル供給システムの実施の形態を示す線図で
ある。図中、バルブは開いた状態になっており、多量の
サンプルがポンプ２２０を経由してインピーダンストラ
ンスデューサの近傍に移動中である。
【図１０Ｂ】図１０Ａに示したインピーダンスサンプル
供給システムの線図である。図中、バルブは閉じてお
り、一定量のサンプルが計量され、インピーダンストラ
ンスデューサに移動中である。
【図１１Ａ】図１に示した細胞分析システムの光サンプ
ル供給システムの実施の形態を示す線図である。図中、
バルブは開いた状態になっており、多量のサンプルがポ
ンプ２３２を経由して流動セル近傍に移動中である。
【図１１Ｂ】図１１Ａに示した光サンプル供給システム
の線図である。図中、バルブは閉じた状態になってお
り、一定量のサンプルを計量し、光流動セルトランスデ
ューサに移動中である。
【図１２】図１に示した細胞分析システムのＨＧＢサン
プル供給システムの実施の形態を示す線図である。
【図１３Ａ】図１に示した細胞分析システムの一体自動
血液／免疫サンプル処理法の実施の形態を示すタイミン
グ線図である。
【図１３Ｂ】図１に示した細胞分析システムの一体自動
血液／免疫サンプル処理法の実施の形態を示すタイミン
グ線図である。
【図１３Ｃ】図１に示した細胞分析システムの一体自動
血液／免疫サンプル処理法の実施の形態を示すタイミン
グ線図である。
【図１３Ｄ】図１に示した細胞分析システムの一体自動
血液／免疫サンプル処理法の実施の形態を示すタイミン
グ線図である。
【図１３Ｅ】図１に示した細胞分析システムの一体自動
血液／免疫サンプル処理法の実施の形態を示すタイミン
グ線図である。
【図１３Ｆ】図１に示した細胞分析システムの一体自動
血液／免疫サンプル処理法の実施の形態を示すタイミン
グ線図である。
【図１４Ａ】以下の第４節に述べる網赤血球の分離作業
の説明用の図である。
【図１４Ｂ】以下の第４節に述べる網赤血球の分離作業
の説明用の図である。
【図１５】図１に示した細胞分析システムの光流動セル
トランスデューサの実施の形態を示す線図である。
【図１６】図１５に示した光流動セルの断面図である。
【図１７】図１の細胞分析システムのインピーダンスト
ランスデューサの実施の形態を示す線図である。
【図１８】図１に示した細胞分析システムのＨＧＢトラ
ンスデューサの実施の形態を示す線図である。
【図１９】図１に示した細胞分析システムの光ベンチ
（optics bench）の実施の形態を示す線図である。
【図２０】図１９に示した光ベンチの順方向経路収集シ
ステムを示す線図である。
【図２１】図１９に示した光ベンチの側方散乱収集シス
テムを示す線図である。
【図２２】図１９に示した光ベンチのコンデンサ（cond
enser)の線図である。
【図２３】図１９に示した光ベンチの、流動セルからカ
ソードに至る光線の広がり（rayfan）の線図である。
【図２４】図１９に示したた光ベンチのＰＭＴレンズ構
成を示す線図である。
【図２５】図１に示した細胞分析システムの分析装置モ
ジュールの実施の形態を示すブロック線図である。
【図２６】図２５に示したデータ収集モジュールの実施
の形態を示すブロック線図である。
【図２７】図２５に示した分析装置モジュールの詳細を
示すブロック線図である。
【図２８】図１に示した細胞分析システムのデータ保存
場所を示す線図である。
【図２９】図２８に示したソフトウェアアーキテクチャ
の実施の形態を示す状態線図である。
【図３０】図２８に示したソフトウェアアーキテクチャ
の実施の形態を示す状態線図である。
【図３１】液体を導入するノズルを備えた装置の全体正
面図である。
【図３２】図３１のノズルの見取図である。
【図３３】図３２に示したノズルの一部の断面図であ
り、図３２に示したコンジットを相互に平行に配設して
明瞭化をはかっている。
【図３４】図３２に示したノズルの一部の断面図であ
り、液体の導入状態を示す図である。
【図３５】図３４にほぼ類似した断面図であり、液体の
導入状態を示す図である。
【図３６】図３５にほぼ類似した断面図であり、液体の
導入状態を示す図である。
【図３７】本明細書に述べるサンプル作成装置の略図で
ある。
【図３８】図３７の装置の一部の部分断面図である。
【図３９】図３７の装置のさらに別の一部の部分断面図
である。
【図４０Ａ】図細胞分析システムの実施の形態により得
られたＮＲＢＣの報告データを示す図である。
【図４０Ｂ】図細胞分析システムの実施の形態により得
られたＮＲＢＣの報告データを示す図である。
【図４０Ｃ】図細胞分析システムの実施の形態により得
られたＮＲＢＣの報告データを示す図である。
【図４１Ａ】細胞分析システムの実施の形態により得ら
れたＮＲＢＣの報告データを示す図である。
【図４１Ｂ】細胞分析システムの実施の形態により得ら
れたＮＲＢＣの報告データを示す図である。
【図４２】以下の第２節に述べる三重トリガ回路の略ブ
ロック線図である。
【図４３】レーザビームおよび液体流動の構成および相
互作用を示す図である。
【図４４Ａ】図１の細胞分析システムの実施の形態の一
部を示す正面図である。
【図４４Ｂ】図１の細胞分析システムの実施の形態の一
部を示す正面図である。
【図４４Ｃ】図１の細胞分析システムの実施の形態の一
部を示す正面図である。
【図４４Ｄ】図１の細胞分析システムの実施の形態の一
部を示す正面図である。
【図４４Ｅ】図１の細胞分析システムの実施の形態の一
部を示す正面図である。
【図４４Ｆ】図１の細胞分析システムの実施の形態の一
部を示す正面図である。
【図４５Ａ】細胞分析システムの実施の形態によって得
られた報告データを示す図である。
【図４５Ｂ】細胞分析システムの実施の形態によって得
られた報告データを示す図である。
【図４５Ｃ】細胞分析システムの実施の形態によって得
られた報告データを示す図である。
【図４５Ｄ】細胞分析システムの実施の形態によって得
られた報告データを示す図である。
【図４５Ｅ】細胞分析システムの実施の形態によって得
られた報告データを示す図である。
【図４５Ｆ】細胞分析システムの実施の形態によって得
られた報告データを示す図である。
【図４６】細胞分析システムの実施の形態によって得ら
れたＲＢＣ体積ヒストグラムを示す図である。
【図４７】細胞分析システムの実施の形態により得られ
た血小板の撒布図（scattergram）である。
【図４８】細胞分析システムの実施の形態により得られ
た血小板の撒布図（scattergram）である。
【図４９Ａ】細胞分析システムの実施の形態により検出
した事象区分を示す図である。
【図４９Ｂ】細胞分析システムの実施の形態により検出
した事象区分を示す図である。
【図５０Ａ】細胞分析システムの実施の形態によって検
出した高ＦＬ３細胞のＡＬＬ値を示す図である。
【図５０Ｂ】細胞分析システムの実施の形態によって検
出した高ＦＬ３細胞のＡＬＬ値を示す図である。
【図５１Ａ】細胞分析システムの実施の形態で引いた、
顆粒球と単核細胞との分割線の例である。
【図５１Ｂ】細胞分析システムの実施の形態で引いた、
顆粒球と単核細胞との分割線の例である。
【図５２Ａ】細胞分析システムの実施の形態により作成
したヒストグラムおよび角分割線の例を示す図である。
【図５２Ｂ】細胞分析システムの実施の形態により作成
したヒストグラムおよび角分割線の例を示す図である。
【図５３】細胞分析システムの実施の形態により得られ
たＡＬＬヒストグラムおよび分割線の例を示す図であ
る。
【図５４】細胞分析システムの実施の形態によるＩＡＳ
値の平均値にＩＡＳ値の標準偏差の２．５倍を加えた値
の所で引いた区分線を示す図である。
【図５５】細胞分析システムの実施の形態により作成し
たリンパ球−基質分離線およびリンパ球−単球分離線か
らの距離の１／４と３／４の間で引いた区分線を示す図
である。
【図５６】細胞分析システムの実施の形態により作成し
たヒストグラムおよび分割線を示す図である。
【図５７】細胞分析システムの実施の形態により作成し
た、さらに別のヒストグラムおよび分割線を示す図であ
る。
【図５８】細胞分析システムの実施の形態によって引い
た網赤血球の撒布図の例を示す図である。
【図５９】細胞分析システムの実施の形態により引いた
網赤血球のヒストグラムの例を示す図である。
【図６０Ａ】例６に示すデータ処理の例を示す図であ
る。
【図６０Ｂ】例６に示すデータ処理の例を示す図であ
る。
【図６１Ａ】細胞分析システムの実施の形態によって集
積されたデータの例を示す図である。
【図６１Ｂ】細胞分析システムの実施の形態によって集
積されたデータの例を示す図である。
【図６１Ｃ】細胞分析システムの実施の形態によって集
積されたデータの例を示す図である。
【図６１Ｄ】細胞分析システムの実施の形態によって集
積されたデータの例を示す図である。
【図６１Ｅ】細胞分析システムの実施の形態によって集
積されたデータの例を示す図である。
【図６１Ｆ】細胞分析システムの実施の形態によって集
積されたデータの例を示す図である。
【図６１Ｇ】細胞分析システムの実施の形態によって集
積されたデータの例を示す図である。
【図６２Ａ】ＣＤ３、ＣＤ４の両方について陽性である
リンパ球分画（fraction）、ＣＤ３、ＣＤ８の両方につ
いて陽性であるリンパ球分画、ＣＤ１９について陽性で
あるリンパ球分画、およびＣＤ３についてのみ陽性であ
るリンパ球分画の間の相関を示す図である。
【図６２Ｂ】ＣＤ３、ＣＤ４の両方について陽性である
リンパ球分画（fraction）、ＣＤ３、ＣＤ８の両方につ
いて陽性であるリンパ球分画、ＣＤ１９について陽性で
あるリンパ球分画、およびＣＤ３についてのみ陽性であ
るリンパ球分画の間の相関を示す図である。
【図６２Ｃ】ＣＤ３、ＣＤ４の両方について陽性である
リンパ球分画（fraction）、ＣＤ３、ＣＤ８の両方につ
いて陽性であるリンパ球分画、ＣＤ１９について陽性で
あるリンパ球分画、およびＣＤ３についてのみ陽性であ
るリンパ球分画の間の相関を示す図である。
【図６２Ｄ】ＣＤ３、ＣＤ４の両方について陽性である
リンパ球分画（fraction）、ＣＤ３、ＣＤ８の両方につ
いて陽性であるリンパ球分画、ＣＤ１９について陽性で
あるリンパ球分画、およびＣＤ３についてのみ陽性であ
るリンパ球分画の間の相関を示す図である。
【図６３Ａ】第１３節Ｆに述べるバルブおよびその機能
を示す表である。
【図６３Ｂ】第１３節Ｆに述べるバルブおよびその機能
を示す表である。
【図６３Ｃ】第１３節Ｆに述べるバルブおよびその機能
を示す表である。
【図６３Ｄ】第１３節Ｆに述べるバルブおよびその機能
を示す表である。
【図６３Ｅ】第１３節Ｆに述べるバルブおよびその機能
を示す表である。
【図６３Ｆ】第１３節Ｆに述べるバルブおよびその機能
を示す表である。
【符号の説明】
６２４、 第１のハウジング ６２６、 第２のハウジング ６２７、 結合部材 ６４２、 流体流入口 ６４４、 流体流出口 ６５６、 ヒータ ６６４、 センサ ６８６、 原動機 ６８８、 リンケージアセンブリ ７０６、 センサ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター・イー・ロバン アメリカ合衆国、カリフオルニア・94301、 パロ・アルト、ローウエル・アベニユー・ 273 (72)発明者 ヤング・ラン・キム アメリカ合衆国、カリフオルニア・94086、 サニーベール、ラ・メサ・テラス・934・ ジー (72)発明者 ロデリツク・ウオルトン・ラルー アメリカ合衆国、カリフオルニア・95472、 セバストポル、フイオリ・レーン・12322 (72)発明者 ジヨン・ポール・スチユアート アメリカ合衆国、カリフオルニア・94040、 マウント・ビユー、オーテガ・アベニユ ー・215

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第１の所定体積の第１の流体と第２の所
    定体積の第２の流体とから作られる溶液を調製する方法
    であって、該方法が、（a）第２のハウジングと動作的
    に接続され且つ該第２のハウジング内に実質的に配置さ
    れた、前記第１の流体と前記第２の流体とを収容するた
    めの第１のハウジングに取り付けられたヒータであっ
    て、前記第１のハウジングとともに移動可能なヒータ
    を、前記第１のハウジングに熱エネルギーを加えるため
    に作動させるステップと、（b）前記第１のハウジング
    へ前記第２の所定体積の前記第２の流体を導入するステ
    ップと、（c）前記第１のハウジング内の前記第２の所
    定体積の前記第２の流体を移動させるために、第１の所
    定時間の間、原動機によって前記第１のハウジングを振
    動させ、一方、前記第２のハウジングは前記原動機に関
    して実質的に静止したままであるステップと、（d）前
    記第１のハウジングへ前記第１の所定体積の第１の流体
    を導入するステップと、（e）前記第１のハウジング内
    の前記第１の所定体積の前記第１の流体と前記第２の所
    定体積の前記第２の流体とを移動させ、溶液を作るため
    に、第２の所定時間の間、前記原動機によって前記第１
    のハウジングを振動させ、一方、前記第２のハウジング
    は前記原動機に関して実質的に静止したままであるステ
    ップと、（f）前記第１の所定体積の前記第１の流体と
    前記第２の所定体積の前記第２の流体とから作られた前
    記溶液を、前記第１のハウジングから取り出すステップ
    とを具備して成る方法。
  2. 【請求項２】 前記第１の所定体積が約２５μｌであ
    る、請求項１に記載された方法。
  3. 【請求項３】 前記第１の流体が全血サンプルである、
    請求項１に記載された方法。
  4. 【請求項４】 前記第２の所定体積が約８７５μｌであ
    る、請求項１に記載された方法。
  5. 【請求項５】 前記第２の流体が血液希釈液である、請
    求項１に記載された方法。
  6. 【請求項６】 前記第１の所定時間が約５秒間である、
    請求項１に記載された方法。
  7. 【請求項７】 前記第２の所定時間が約１１秒間であ
    る、請求項１に記載された方法。
  8. 【請求項８】 前記第１の流体が赤血球と白血球を含む
    全血であり、前記第２の流体が血液希釈液である請求項
    １に記載の方法であって、（g）前記赤血球を溶解する
    ステップと、（h）前記白血球を固定するステップとを
    更に具備して成る方法。
  9. 【請求項９】 （g）前記第１のハウジングから取り出
    された、前記第１の所定体積の前記第１の流体と前記第
    ２の所定体積の前記第２の流体とを貯えるステップを更
    に具備して成る請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第１のハウジングに加えられる熱
    エネルギーは約摂氏４３度である、請求項１に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 （g）前記第１の流体と前記第２の流
    体との少なくとも１つに前記第１のハウジングから熱エ
    ネルギーを加えるステップを更に具備して成る請求項１
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 流体を調製する方法であって、該方法
    が、（a）第２のハウジングと動作的に接続され且つ該
    第２のハウジング内に実質的に配置された第１のハウジ
    ング内に前記流体を入れるステップと、（b）前記第１
    のハウジング取り付けられたヒータであって、前記第１
    のハウジングとともに移動可能であるヒータによって、
    前記第１のハウジングと該第１のハウジング内の流体と
    に熱エネルギーを加えるステップと、（c）前記第１の
    ハウジング内に収容された前記流体を移動するために、
    原動機によって前記第１のハウジングを振動させ、一
    方、前記第２のハウジングは前記原動機に関して実質的
    に静止したままであるステップとを具備して成る方法。
  13. 【請求項１３】 （d）前記第１のハウジングから流体
    を取り出すステップを更に具備して成る請求項１２に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 （d）前記第１のハウジング内に入れ
    る前に、前記流体に熱エネルギーを加えるステップを更
    に具備して成る請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 流体を調製する装置であって、該装置
    が、（a）流体を収容するための第１のハウジングと、
    （b）第２のハウジングであって、前記第１のハウジン
    グが実質的に該第２のハウジング内に配置されるよう
    に、前記第１のハウジングと動作的に接続された前記第
    ２のハウジングと、（c）前記第１のハウジングが原動
    機に応じて動き、前記第２のハウジングが前記原動機に
    関して実質的に静止したままであるように、前記第２の
    ハウジングに固定して取り付けられるとともに前記第１
    のハウジングに動作的に接続された前記原動機と、
    （d）前記第１のハウジングに熱エネルギーを加えるた
    めに前記第１のハウジングと熱的に接続されるとともに
    前記第１のハウジングとともに移動可能であるヒータ
    と、（e）前記第１のハウジングに流体を供給するため
    に前記第１のハウジングと流体接続された流体流入口
    と、（f）前記第１のハウジングから流体を取り出すた
    めに前記第１のハウジングと流体接続された流体流出口
    とを具備して成る装置。
  16. 【請求項１６】 （g）前記第１のハウジングの一つの
    開放端部と前記第２のハウジングの一つの開放端部とを
    動作的に接続する結合部材を更に具備して成る請求項１
    ５に記載の装置。
  17. 【請求項１７】 前記結合部材がエラストマ材料製であ
    る、請求項１６に記載の装置。
  18. 【請求項１８】 （g）前記第１のハウジングに結合さ
    れた熱エネルギーを検出するために第１のハウジングに
    熱的に接続されるとともに前記第１のハウジングととも
    に移動可能であるセンサを更に具備して成る請求項１５
    に記載の装置。
  19. 【請求項１９】 （g）前記流体流入口と流体接続され
    た血液希釈液の供給源を更に具備して成る請求項１５に
    記載の装置。
  20. 【請求項２０】 （g）前記原動機の動作を検出するた
    めに前記原動機と動作的に結合されたセンサを更に具備
    して成る請求項１５に記載の装置。
  21. 【請求項２１】 （g）前記原動機と前記第１のハウジ
    ングとを駆動的に接続するリンケージアセンブリであっ
    て、前記原動機に応じて前記第１のハウジングが実質的
    に偏心して動くように構成されている前記リンケージア
    センブリを更に具備して成る請求項１５に記載の装置
  22. 【請求項２２】 （g）前記第１のハウジング内に流体
    を導入するために前記第１のハウジングと動作的に結合
    する流体導入装置を更に具備して成る請求項１５に記載
    の装置。
  23. 【請求項２３】 （h）前記流体導入装置によって前記
    第１のハウジング内に全血が導入されるように、前記流
    体導入装置と流体接続された全血の供給源を更に具備し
    て成る請求項２２に記載の装置。
  24. 【請求項２４】 （g）前記第１のハウジングに全血を
    供給するために前記第１のハウジングと動作的に接続さ
    れた全血の供給源と、（h）前記第１のハウジングに血
    液希釈液を供給するために前記第１のハウジングと動作
    的に接続された血液希釈液の供給源とを更に具備して成
    る請求項１５に記載の装置。
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