JPH10206385A - マルチキャピラリー式塩基配列決定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 各試料での泳動状態をリアルタイムで容易に
把握できるようにする。 【解決手段】 泳動分離されたＤＮＡ断片が被検出部を
通過する際、励起・受光光学系が走査されて試料を標識
している蛍光物質からの蛍光が検出される。このとき、
検出された蛍光による信号は、末端塩基の種類に応じて
４組が得られる。その４組の信号の内で最大強度をも
ち、かつ一定のしきい値以上の信号に対応した塩基が、
各キャピラリーカラムでの塩基として認識され、サンプ
ルプレートのウエルの配列に対応した表示画面に、末端
塩基に応じた４種類の色別で表示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はサンガー反応を用
い、プライマー又はターミネータを蛍光物質で標識した
ＤＮＡフラグメント（断片）試料を電気泳動させ、泳動
途中でＤＮＡフラグメント試料からの蛍光を検出して塩
基配列を決定するオンライン式の塩基配列決定装置に関
し、特に、泳動ゲルを充填した複数のキャピラリーカラ
ムを用いて複数の試料を同時に電気泳動させるマルチキ
ャピラリー式塩基配列決定装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】人ゲノムのような長大な塩基配列をもつ
ＤＮＡの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大
処理能力をもったＤＮＡシーケンサが必要となる。その
１つの方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに
代わってゲルを充填したキャピラリーカラムを複数本配
列したマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサが提案され
ている。キャピラリーカラムは、スラブゲルに比べて、
試料の取扱いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳
動させて高感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高
電圧を印加すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広
がったり、温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キ
ャピラリーカラムではそのような問題は少なく、高電圧
を印加して高速泳動をさせても、バンドの広がりが少な
く高感度検出ができるのである。

【０００３】サンガー法によって処理すれば、その末端
がＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ
（シトシン）からなる４種類のＤＮＡフラグメント試料
が生成される。処理能力を上げるためには複数のキャピ
ラリーカラムで同時に電気泳動させる必要があるが、そ
の場合、末端塩基別の試料を異なるキャピラリーカラム
で泳動させると、キャピラリーカラム間の泳動速度の差
が塩基配列決定の誤差となる。そのため、各キャピラリ
ーカラムには４種類の末端塩基のＤＮＡフラグメントを
含んだ試料を注入し、複数のキャピラリーカラムで同時
に泳動させなければならない。その際、末端塩基の異な
る４種類のＤＮＡフラグメントを識別するために、２種
類以上の蛍光物質で標識することが行なわれている。

【０００４】末端塩基の異なるＤＮＡフラグメントを識
別するための標識物質としてＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲ
Ａ及びＲＯＸの４種類の発蛍光団をそれぞれ異なるＤＮ
Ａフラグメントに標識として用いる方法（Anal. Chem.
1994, 66, 1021-1026（以下、引用例１という）参照）
や、ＦＡＭとＪＯＥの２種類を比率を異ならせて用いる
ことによりコード化して４種類のＤＮＡフラグメントを
識別する方法（Anal.Chem. 1992, 64, 2149-2154（以
下、引用例２という）参照）が提案されている。いずれ
にしても、マルチキャピラリーＤＮＡシーケンサの処理
能力を上げるためには、多色蛍光標識によって識別でき
るようにした末端塩基の異なる４種類のＤＮＡフラグメ
ントを含む試料を各キャピラリーカラムに注入し、複数
のキャピラリーカラムで複数の試料を同時に泳動させる
ことが背景となっている。

【０００５】このようなマルチキャピラリー式塩基配列
決定装置では、末端塩基に対応して設定された蛍光波長
ごとの４種類の検出信号が得られる。泳動途中で各キャ
ピラリーカラムではいまどの塩基が検出されているかと
いう状態を表示するために、末端塩基別の４種類の信号
波形をそのまま表示装置の画面に表示している。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】多数のキャピラリーカ
ラムを用いて電気泳動を行なう場合、検出された波形を
そのまま表示していたのでは、どれがどのキャピラリー
カラムに対応する信号であるかがわからず、さらに各キ
ャピラリーカラムでいまどの塩基が検出されているのか
もわかりにくく、泳動状態を把握するのが容易ではない
という問題がある。そこで、本発明は多数のキャピラリ
ーカラムを用いて電気泳動を行なう場合に、各試料での
泳動状態をリアルタイムで容易に把握できるようにする
ことを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明のマルチキャピラ
リー式塩基配列決定装置では、そのマルチキャピラリー
アレイ泳動部は、キャピラリーアレイの一端側が試料注
入側となってキャピラリーカラム端が２次元的に配列さ
れて下向きに固定され、そのキャピラリーカラム端の下
方には、そのキャピラリーカラム端の配列と対応して試
料が収容されたウエルが２次元的に配列されてウエル内
に挿入された各キャピラリーカラム端に電圧が印加され
る試料容器、及び泳動用バッファ液が収容されて全キャ
ピラリーカラムに電圧が印加される泳動用リザーバが配
置されて試料容器と泳動用リザーバのいずれかが選択的
にキャピラリーカラム端と接触させられ、キャピラリー
アレイの他端側が電圧の印加される別のバッファ液に浸
されて、キャピラリーアレイの両端間に泳動電圧が印加
されるようになっており、表示装置は試料容器のウエル
の配列に対応した画面を有し、その画面の各ウエルの位
置を検出された末端塩基に応じて４種類の色別で表示し
ていくものである。

【０００８】

【実施例】図１は一実施例を概略的に示す斜視図であ
る。キャピラリーアレイ２は分離媒体のゲルが充填され
た複数のキャピラリーカラムが配列されたものであり、
その一端側（下端側）２ａが試料注入側となってカセッ
トホルダー４により二次元的に配列されて固定されてお
り、試料注入用サンプルプレート６４のウエル内の試料
又は泳動用の下側リザーバ６２のバッファ液と接触す
る。キャピラリーアレイ２の他端側（上端側）２ｂはキ
ャピラリーカラムが一列に配列されており、先端で上側
リザーバ５６のバッファ液と接触する。キャピラリーア
レイ２の他端側にはキャピラリーカラムが一列に配列さ
れてカセットホルダー６により支持されている被検出部
２ｃが設けられている。

【０００９】キャピラリーカラムは、石英ガラスやホウ
ケイ酸ガラス（例えばパイレックス）等を材質とするも
のであり、外形が２００〜３００μｍ、内径が７５〜１
００μｍのものである。キャピラリーカラムはその外周
をＳｉＯ₂など、紫外領域から近赤外領域の励起光によ
っては蛍光を発生しないか、発生しても蛍光測定の妨げ
にならない程度である無蛍光材質の被膜により被覆され
たものが好ましい。その場合には、被検出部２ｃでもキ
ャピラリーカラムの被膜を除去する必要がない。それに
対し、キャピラリーカラムが被膜として蛍光を発する樹
脂被膜をもったものである場合は、被検出部２ｃではそ
の被膜を除去しておくのが好ましい。キャピラリーアレ
イ２にはそのようなキャピラリーカラムが９６〜４８０
本配列されている。

【００１０】キャピラリーカラム内には分離媒体のゲル
として、ポリアクリルアミドゲル、リニアアクリルアミ
ドゲル、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）ゲルなどが
充填されている。各キャピラリーカラムには末端塩基別
に異なる螢光物質ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯ
Ｘ、ＡＢＩ、Ｒ６Ｇ、Ｒ−１１０などの螢光物質から選
ばれた４種類の蛍光物質により標識された４種類のＤＮ
Ａフラグメント、又は引用例２のように２種類の蛍光物
質を比率を異ならせて用いることによりコード化された
４種類のＤＮＡフラグメントを含む試料がそれぞれ注入
され、同時に電気泳動がなされる。

【００１１】標識蛍光物質を励起するための励起光源と
して、アルゴンガスレーザ装置８が設けられている。ア
ルゴンガスレーザ装置８は出力が４０〜１００ｍＷで、
マルチラインタイプであり、４８８ｎｍと５１４.５ｎ
ｍの２種類の波長のレーザ光を同時に発振する。励起・
受光光学系１０は後で図２により一例が示されるよう
に、被検出部２ｃのキャピラリーカラムに励起光のアル
ゴンレーザビームを照射し、試料からの蛍光を検出する
ものであり、キャピラリーアレイの配列面に平行で泳動
方向に直交する方向に走査される。レーザ装置８からの
励起光ビームが励起・受光光学系１０の走査によっても
ずれないようにするために、ここではレーザ装置８から
のレーザビームがカップラーにより結合された光ファイ
バ９を経て励起・受光光学系１０に導かれている。

【００１２】キャピラリーアレイ２を一定温度に保つた
めに、発泡ポリウレタンなどの断熱材で囲まれた泳動チ
ャンバー４２が設けられ、キャピラリーアレイ２はその
泳動チャンバー４２内に収容されている。泳動チャンバ
ー４２にはペルチェ素子が設けられて電子加熱冷却が行
なわれるようになっている。泳動チャンバー４２内には
温度センサーとして白金抵抗体や熱電対が設けられてお
り、その温度センサーの検出出力をペルチェ素子にフィ
ードバックしてＰＩＤ制御することにより、泳動チャン
バー４２内を一定温度に保つようになっている。

【００１３】キャピラリーアレイ２の下端２ａの下方に
は、泳動用リザーバ６２と試料容器としてのサンプルプ
レート６４が水平面内でＸＹＺ可動ステージ６８上に並
んで支持されている。可動ステージ６８は、リザーバ６
２とサンプルプレート６４のいずれかをキャピラリーア
レイ２の下端２ａの下方に位置決めする水平方向（Ｘ，
Ｙ方向）の移動と、サンプルプレート６４のウエルの試
料又はリザーバ６２内のバッファ液をキャピラリーアレ
イ２の下端２ａに接触させたり、下端２ａから引き離し
たりするための垂直方向（Ｚ方向）の移動を行なう。

【００１４】サンプルプレート６４は縦方向に２４個、
横方向に１６個のウエルが規則的に配列された３８４個
のウエルを備えており、キャピラリーアレイ２の下端２
ａのキャピラリー端の配列はそのサンプルプレート６４
のウエル配列に対応している。そのようなサンプルプレ
ート６４は、ウエルの底が貫通し、その貫通した底には
メンブレンが張られ、それぞれのウエルのメンブレン上
には試料が吸着されたものを使用することができる。そ
のサンプルプレート６４を他のリザーバに乗せ、そのリ
ザーバ６４中にバッファ液をいれてそのバッファ液をメ
ンブレンと接触させることにより、バッファ液を通して
キャピラリーアレイ２の下端２ａのキャピラリー端に試
料注入用の電圧を印加することができる。

【００１５】リザーバ６２には泳動用バッファ液が入れ
られ、そのバッファ液を通してキャピラリーアレイ２の
下端２ａのキャピラリー端に泳動用電圧を印加すること
ができる。サンプルプレート６４は貫通したウエルの底
に試料を吸着させたメンブレンを設けたもののほか、底
をもつウエルに試料を入れ、各ウエルに泳動電圧が印加
されるようにしたものでもよい。

【００１６】上側リザーバ５６のバッファ液には上側電
極５４が接触し、下側リザーバ６２のバッファ液とサン
プルプレート６４のウエルの試料には下側電極５８が切
り換えて接触するように設けられており、両電極５４，
５８には高圧電源６０から試料注入時又は泳動時の電圧
が印加される。その電圧は例えば３０ｋＶで、電流は１
０〜３０ｍＡである。

【００１７】励起・受光光学系１０による検出結果に基
づいて各キャピラリーカラムで検出された塩基を識別し
て塩基配列を決定するデータ処理装置５０と、そのデー
タ処理装置５０による識別結果を表示するＣＲＴなどの
表示装置５２が設けられている。

【００１８】励起・受光光学系１０の一例を図２（Ａ）
に詳細に示す。励起光源のレーザ装置８からのレーザビ
ームがカップラー９ａにより結合された光ファイバ９を
経てコリメータ９ｂからトンネルミラー１６に入射され
る。コリメータ９ｂは走査される励起・受光光学系１０
に固定されており、レーザ装置８は励起・受光光学系１
０の外部で固定されている。コリメータ９ｂはレーザビ
ーム１２を被検出部２ｃのキャピラリーアレイの面に垂
直に照射するように方向が定められている。１６は中央
部に穴をもち、その穴から励起光ビームを透過させ、鏡
面で蛍光を反射させるトンネルミラー、１８は励起光を
１本のキャピラリーカラムに集光して投光するととも
に、そのキャピラリーカラムを泳動中の試料から発生す
る蛍光を受光する集光レンズである。集光レンズ１８は
励起光の投光と蛍光の受光を同じレンズで行なうもので
あり、落射光学系を構成している。集光レンズ１８で集
光された蛍光はトンネルミラー１６の鏡面で反射され
る。

【００１９】２０はその反射光から励起光成分を遮蔽
し、蛍光を透過させる光学フィルター、２２は検出視野
を限定するためのピンホールスリット、２４は光学フィ
ルター２０を透過した蛍光をピンホールスリット２２の
位置に結像させる絞りレンズ２４である。キャピラリー
カラムでの蛍光発生点がピンホ−ルスリット２２の位置
に結像されることにより、共焦点光学系を構成してい
る。励起光除去のための光学フィルター２０としては、
エッジフィルターや色ガラスを利用することができる。
ピンホールスリット２２は検出視野を小さくして隣接す
るキャピラリーカラムからの迷光侵入を防ぐためのもの
である。

【００２０】一実施例として、４種類の蛍光物質で標識
されたＤＮＡフラグメント試料を電気泳動させる。その
場合に、ピンホールスリット２２での蛍光像を４つの光
束に分割するために、図２（Ｂ）に示されるレンズパネ
ル２６が配置されている。レンズパネル２４は単レンズ
をカットして張りあわせたものや、ガラスモールド成形
品として製作することができる。その４つに分割された
光束のそれぞれの光路上には図２（Ｃ）に示される各標
識蛍光物質用の異なる分光用フィルターからなるフィル
ターパネル２８が配置されている。フィルターパネル２
８は各標識蛍光物質に対応した４種類の波長特性の異な
るバンドパスフィルターがそれぞれの光路上にくるよう
に並列配置されたものである。各バンドパスフィルター
の透過波長は、塩基Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔを標識している蛍光
物質の発光波長に対応したものである。それぞれのバン
ドパスフィルターを透過した蛍光を検出するために、そ
れぞれの光路上には４つの光電子増倍管３０が配置され
ている。

【００２１】コリメータ９ｂ、トンネルミラー１６、集
光レンズ１８、光学フィルター２０、ピンホールスリッ
ト２２、絞りレンズ２４、レンズパネル２６、フィルタ
ーパネル２８及び光電子増倍管３０を含む励起・受光光
学系１０は、走査機構のステージに取りつけられてお
り、被検出部２ｃでの全てのキャピラリーカラムからの
蛍光を検出するために、被検出部２ｃでのキャピラリー
アレイの面に平行で、泳動方向と直交する一直線に沿っ
て往復方向に移動させられるようになっている。

【００２２】図には示されていないが、この電気泳動装
置には、試料注入及び泳動用の高圧電源のほか、レーザ
装置の電源装置や制御基板を備えている。その制御基板
は、図３に示されるように、ＣＰＵ８０、光電子増倍管
３０からの検出信号をデジタル信号に変換してＣＰＵ８
０に取り込むＡ／Ｄ変換器８２、ＣＰＵ８０からの指示
により各部と信号の授受を行なうＩ／Ｏインターフェー
ス８４、及び泳動チャンバー４２の温度制御を行なう温
度コントローラ８６を備えている。Ｉ／Ｏインターフェ
ース８４は、温度コントローラ８６、試料注入用及び泳
動用の高圧電源、走査機構３２のセンサー及びモータ、
Ｘ−Ｚサンプルステージ６８のセンサー及びモータ、レ
ーザ装置の電源、インターロック用安全スイッチ、表示
灯などと接続されている。ＣＰＵ８０は外部のパーソナ
ルコンピュータ８８と接続されている。パーソナルコン
ピュータ８８は図１に示されたデータ処理装置５０に対
応し、そのディスプレーは表示装置５２に対応する。

【００２３】次に、この実施例の動作について説明す
る。試料はサンガー反応を用いて調製されたＤＮＡ断片
試料であり、末端塩基の種類に応じてプライマー又はタ
ーミネータが異なる蛍光物質で標識されている。その試
料はサンプルプレート６６に用意する。キャピラリーア
レイ２の各キャピラリーカラムにはアクリルアミドモノ
マー溶液又はロングレンジャー（アクリルアミドを主成
分とするゲル原料で、アメリカＦＭＣ社の商品名）モノ
マー溶液を電気泳動ゲル組成に調製したものを真空ポン
プやアスピレーターを用いて負圧吸引し、ゲル重合させ
る。キャピラリーアレイ２をカセットホルダー４，６に
より図１の泳動装置の所定の位置に装着する。

【００２４】上下のリザーバ５６，６２にバッファ液を
入れて泳動装置に装着する。試料を入れたサンプルプレ
ート６４は貫通したウエルの底にメンブレンを張ってそ
こに試料を吸着させたものであるとして、そのサンプル
プレート６４を別のリザーバに装着して試料とそのリザ
ーバ内のバッファ液とを接触させる。

【００２５】その後、パーソナルコンピュータ８８から
シーケンス開始が入力されると、可動ステージ６８がサ
ンプルプレート６４をキャピラリーアレイ端２ａの下方
に移動させ、サンプルプレート６４を上昇させてキャピ
ラリーアレイ端２ａをサンプルプレート６６のウエル中
の試料に接触させる。その後、両電極５４，５８を通し
てサンプルプレート６６のウエル中の試料とリザーバ５
６のバッファ液と間に高圧が所定時間印加されて試料の
注入が行なわれる。

【００２６】試料注入後、可動ステージ６８が作動し、
泳動用リザーバ６２がキャピラリーアレイ端２ａの位置
に位置決めされてキャピラリーアレイ端２ａが泳動用リ
ザーバ６２のバッファ液に浸された後、両電極５４，５
８を通して両バッファ液間に高電圧が印加されて泳動が
開始される。泳動中はコンプレッションを起こさないよ
うに泳動チャンバー４２内を４０〜６０℃の一定温度に
なるように制御される。

【００２７】泳動分離されたＤＮＡ断片が被検出部２ｃ
を通過する際、励起・受光光学系１０が走査されて試料
を標識している蛍光物質からの蛍光が検出される。この
とき、フィルターパネル２８の４つのフィルターを通過
して４つの光電子増倍管３０で検出された蛍光による信
号は、それぞれ図４（Ａ）に示されるように得られる。
図４（Ａ）のような信号はＤＮＡフラグメント試料の末
端塩基の種類に応じて４組が得られる。それらの信号は
Ａ／Ｄ変換器を経てデータ処理装置であるパーソナルコ
ンピュータ８８に取り込まれる。これらの信号は、ＤＮ
Ａフラグメント試料を泳動させていないときの信号と対
比され、ＤＮＡフラグメント試料のみの信号が図４
（Ｂ）のように抽出される。その後、その４組の信号の
内で最大強度をもち、かつ一定のしきい値以上の信号に
対応した塩基が、各キャピラリーカラムでの塩基として
認識される。

【００２８】キャピラリーアレイ２の各々のキャピラリ
ーカラムの同定は、励起・受光光学系１０を走査する走
査機構にエンコーダを設けておき、そのエンコーダから
得られる出力パルスを用いて行なうことができる。その
ようにして求められたキャピラリーカラム位置と蛍光信
号から得られた塩基の種類が対比させられ、図２（Ｃ）
に示されるように、サンプルプレート６４のウエルの配
列に対応した表示画面に、末端塩基に応じた４種類の色
別で表示される。

【００２９】励起・受光光学系１０は図２に示されたも
のに限られるものではない、例えば、ピンホールスリッ
ト２２に結像した蛍光像を凹面グレーティングで分割と
分光を同時に行ない、分光の結像位置には、４つの標識
蛍光物質に対応した波長位置からの蛍光を受光するバン
ドルファイバ一端を配置し、そのバンドルファイバの他
端を４つの光電子増倍管に導くようにしてもよい。

【００３０】

【発明の効果】本発明では泳動信号を末端塩基に対応す
る４色に色分けし、試料容器に対応した表示画面のそれ
ぞれの試料の位置に表示させるようにしたので、泳動状
態のリアルタイムで正確な把握が容易になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】一実施例を概略的に示す斜視図である。

【図２】（Ａ）は一実施例における励起・受光光学系を
示す側面断面図、（Ｂ）はそこで用いられるレンズパネ
ルを示す斜視図、（Ｃ）はそこで用いられるフィルタパ
ネルを示す斜視図である。

【図３】一実施例における制御基板を示すブロック図で
ある。

【図４】一実施例の動作を示す図であり、（Ａ）は１つ
の光電子増倍管から得られる蛍光信号をしめす波形図、
（Ｂ）はその信号からＤＮＡフラグメント試料のみの信
号を抽出した信号の波形図、（Ｃ）は表示画面の例を示
す概略正面図である。

【符号の説明】

２ キャピラリーアレイ ２ｃ 被検出部 ８ アルゴンガスレーザ装置 １０ 励起・受光光学系 １２ レーザビーム ５０ データ処理装置 ５２ 表示装置 ５６，６２ リザーバ ６４ サンプルプレート ６８ 可動ステージ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 林崎 良英 茨城県つくば市高野台３丁目１番１ 理化 学研究所 ライフサイエンス筑波研究セン ター内 (72)発明者 柏木 克也 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会社島津製作所三条工場内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ゲルが充填された複数のキャピラリーカ
   ラムが配列され、複数種類の蛍光物質により識別可能に
   標識された４種類の末端塩基の異なるＤＮＡフラグメン
   トを含む複数の試料が１つずつ前記キャピラリーカラム
   に注入されて、全てのキャピラリーカラムで同時に電気
   泳動されるマルチキャピラリーアレイ泳動部と、前記マ
   ルチキャピラリーアレイ泳動部でキャピラリーカラムが
   １列に配列された被検出部においてキャピラリーアレイ
   の面に対し、その垂直方向から泳動方向と直交する１直
   線上に励起光を照射し、励起光により励起された試料か
   らの蛍光を受光し、その蛍光の波長特性を検出する励起
   ・受光光学系と、前記励起・受光光学系による検出結果
   に基づいて各キャピラリーカラムで検出された塩基を識
   別して塩基配列を決定するデータ処理装置と、そのデー
   タ処理装置による識別結果を表示する表示装置とを備え
   たマルチキャピラリー電気泳動装置において、 前記マルチキャピラリーアレイ泳動部は、キャピラリー
   アレイの一端側が試料注入側となってキャピラリーカラ
   ム端が２次元的に配列されて下向きに固定され、そのキ
   ャピラリーカラム端の下方には、そのキャピラリーカラ
   ム端の配列と対応して試料が収容されたウエルが２次元
   的に配列されてウエル内に挿入された各キャピラリーカ
   ラム端に電圧が印加される試料容器、及び泳動用バッフ
   ァ液が収容されて全キャピラリーカラムに電圧が印加さ
   れる泳動用リザーバが配置されて試料容器と泳動用リザ
   ーバのいずれかが選択的にキャピラリーカラム端と接触
   させられ、キャピラリーアレイの他端側が電圧の印加さ
   れる別のバッファ液に浸されて、キャピラリーアレイの
   両端間に泳動電圧が印加されるようになっており、 前記表示装置は前記試料容器のウエルの配列に対応した
   画面を有し、その画面の各ウエルの位置を検出された末
   端塩基に応じて４種類の色別で表示していくものである
   ことを特徴とするマルチキャピラリー式塩基配列決定装
   置。