JPH1023887A - キサンチンデヒドロゲナーゼ及び該酵素の製造方法 - Google Patents
キサンチンデヒドロゲナーゼ及び該酵素の製造方法Info
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- JPH1023887A JPH1023887A JP8196938A JP19693896A JPH1023887A JP H1023887 A JPH1023887 A JP H1023887A JP 8196938 A JP8196938 A JP 8196938A JP 19693896 A JP19693896 A JP 19693896A JP H1023887 A JPH1023887 A JP H1023887A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 耐熱性に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼ
を提供する。 【解決手段】 特定の理化学的性質を有するキサンチン
デヒドロゲナーゼを産生する能力を有するシュードモナ
ス属に属する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取
することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの製
造方法。
を提供する。 【解決手段】 特定の理化学的性質を有するキサンチン
デヒドロゲナーゼを産生する能力を有するシュードモナ
ス属に属する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取
することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの製
造方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は耐熱性のキサンチン
デヒドロゲナーゼ及びその製造方法に関する。本発明に
おけるキサンチンデヒドロゲナーゼは、耐熱性酵素によ
る核酸塩基交換反応を利用したヌクレオシド化合物の製
造において有用な酵素である。
デヒドロゲナーゼ及びその製造方法に関する。本発明に
おけるキサンチンデヒドロゲナーゼは、耐熱性酵素によ
る核酸塩基交換反応を利用したヌクレオシド化合物の製
造において有用な酵素である。
【０００２】
【従来の技術】従来、キサンチンデヒドロゲナーゼに関
する報告は次のようなものがある。Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、４１０
巻、１２−２０頁（１９７５年）、Ａｇｒｉ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．４３巻、７５３−７６０頁（１９７９
年）。しかしながら、及びで報告されているキサン
チンデヒドロゲナーゼの至適温度はそれぞれ３０℃と４
０℃であり、いずれも耐熱性が低く、耐熱性のキサンチ
ンデヒドロゲナーゼは今まで見い出されていなかった。
一般に、酵素を利用する反応では耐熱性酵素を用いるこ
とにより、反応温度を高く設定できるので、高濃度反応
が可能となり、また、反応速度の向上が図られ、さらに
雑菌汚染が少ない条件下で酵素を用いることができると
いう利点がある。
する報告は次のようなものがある。Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、４１０
巻、１２−２０頁（１９７５年）、Ａｇｒｉ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．４３巻、７５３−７６０頁（１９７９
年）。しかしながら、及びで報告されているキサン
チンデヒドロゲナーゼの至適温度はそれぞれ３０℃と４
０℃であり、いずれも耐熱性が低く、耐熱性のキサンチ
ンデヒドロゲナーゼは今まで見い出されていなかった。
一般に、酵素を利用する反応では耐熱性酵素を用いるこ
とにより、反応温度を高く設定できるので、高濃度反応
が可能となり、また、反応速度の向上が図られ、さらに
雑菌汚染が少ない条件下で酵素を用いることができると
いう利点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は耐熱性
に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼを提供することに
ある。
に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼを提供することに
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は上述の課題を
解決すべく耐熱性に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼ
を鋭意探索した結果、至適温度及び作用適温の範囲にお
いて従来知られているものと性質を異にする耐熱性キサ
ンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物を見い出し本
発明を完成するに至った。
解決すべく耐熱性に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼ
を鋭意探索した結果、至適温度及び作用適温の範囲にお
いて従来知られているものと性質を異にする耐熱性キサ
ンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物を見い出し本
発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は次の理化学的性質を有
するキサンチンデヒドロゲナーゼである。 （１）作用
するキサンチンデヒドロゲナーゼである。 （１）作用
【０００６】
【化２】
【０００７】（２）基質特異性 ヒポキサンチン、キサンチンに対して作用する。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは８．９付近であり、ｐＨ７〜９において６０
℃で３０分加熱しても失活しない。 （４）至適温度及び作用適温 至適温度は６０℃付近、作用適温は４０〜７０℃。
℃で３０分加熱しても失活しない。 （４）至適温度及び作用適温 至適温度は６０℃付近、作用適温は４０〜７０℃。
【０００８】（５）熱安定性 ｐＨ７における酵素活性の半減期は、４０℃において１
３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃において
２５時間である。 （６）阻害 Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、
Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受ける。 （７）活性化 電子受容体を必要とする。 （８）分子量 ゲルろ過法による分子量は１４１，０００。
３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃において
２５時間である。 （６）阻害 Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、
Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受ける。 （７）活性化 電子受容体を必要とする。 （８）分子量 ゲルろ過法による分子量は１４１，０００。
【０００９】（９）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブ
ユニットの分子量は５６，０００及び８４，０００。 （１０）ミカエリス定数 ミカエリス定数（Ｋｍ）はキサンチンに対して０．３２
７ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに対し
て０．０６０ｍＭ。 （１１）等電点 等電点電気泳動法による等電点（ｐＩ）は６．０。
ユニットの分子量は５６，０００及び８４，０００。 （１０）ミカエリス定数 ミカエリス定数（Ｋｍ）はキサンチンに対して０．３２
７ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに対し
て０．０６０ｍＭ。 （１１）等電点 等電点電気泳動法による等電点（ｐＩ）は６．０。
【００１０】及び、本発明は上述のキサンチンデヒドロ
ゲナーゼを産生する能力を有するシュードモナス属に属
する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取すること
を特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの製造方法で
ある。
ゲナーゼを産生する能力を有するシュードモナス属に属
する微生物を培養し、培養物から該酵素を採取すること
を特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの製造方法で
ある。
【００１１】以下、本発明のキサンチンデヒドロゲナー
ゼ及びその製造方法について説明する。本発明で用いら
れる該酵素の産生菌は、本発明における理化学的性質を
有するキサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物で
あれば特に制限されないが、好ましくは、本発明者によ
って土壌中から分離されたシュードモナス・エスピー
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０（以
下、本菌株という）である。
ゼ及びその製造方法について説明する。本発明で用いら
れる該酵素の産生菌は、本発明における理化学的性質を
有するキサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物で
あれば特に制限されないが、好ましくは、本発明者によ
って土壌中から分離されたシュードモナス・エスピー
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０（以
下、本菌株という）である。
【００１２】本菌株は通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１５１０４である。本菌株の菌学的性質をバージェ
イズ・マニュアル・オブ・システマテック・バクテリオ
ロジー第２巻に準じて検討した結果を以下に示す。 １．形態 桿菌：１．６〜３．２μm×０．６〜０．７μm ２．培養的性質 ニュートリエントブロス培地：５０℃、２日間培養 平板上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。コロ
ニーの形は円形。スラント上：黄色。光沢あり、透明、
盛り上がらない。生育は中程度。
業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１５１０４である。本菌株の菌学的性質をバージェ
イズ・マニュアル・オブ・システマテック・バクテリオ
ロジー第２巻に準じて検討した結果を以下に示す。 １．形態 桿菌：１．６〜３．２μm×０．６〜０．７μm ２．培養的性質 ニュートリエントブロス培地：５０℃、２日間培養 平板上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。コロ
ニーの形は円形。スラント上：黄色。光沢あり、透明、
盛り上がらない。生育は中程度。
【００１３】３．生化学的性質 （１）グラム染色 陰性 （２）嫌気的性質 生育せず （３）運動性 あり、単極毛 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）カタラーゼ 陰性 （６）ゼラチンの液化 液化能なし （７）ＯＦテスト 陰性 （８）グルコースからの酸の産生 産生せず
【００１４】 （９）ラクトースからの酸の産生 産生せず （１０）キシロースからの酸の産生 産生せず （１１）ガラクトースからの酸の産生 産生せず （１２）硝酸塩の還元 陽性 （１３）硝酸カリウムの脱窒能 陰性 （１４）無機窒素源の利用 ＮＯ3 を唯一の窒素源として 生育しない ＮＨ4 を唯一の窒素源として 生育した （１５）独立栄養の基質 ＣＯを唯一の炭素源として 生育しない
【００１５】 （１６）生育温度 ４０〜５５℃で生育 至適 ４８〜５３℃ （１７）尿素の加水分解 分解能なし （１８）クエン酸の利用 陰性 （１９）インドールの産生 陰性 （２０）ＧＣ含量 ６７．７％ 以上の菌学的性質に基づき、本菌株はシュードモナス属
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属することが判
明した。
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属することが判
明した。
【００１６】本菌株の培養は、シュードモナス属に属す
る微生物の通常行われる条件で行えばよい。大量に培養
するには液体培地を用い、浸盪培養又は通気攪拌培養に
より好気的条件下で行うことが好ましい。培地としては
炭素源及び窒素源としてトリプトン、ペプトン又は肉エ
キスを含む培地を用いることができる。本菌株が生育し
本酵素が十分に産生される条件下であれば、培養温度、
培養時間、培養のｐＨは特に制限されない。培養条件に
よって変動することもありうるが、培養温度は４５〜５
３℃、培養時間は１０〜１００時間、培養のｐＨは７〜
７．５で行うことが好ましい。
る微生物の通常行われる条件で行えばよい。大量に培養
するには液体培地を用い、浸盪培養又は通気攪拌培養に
より好気的条件下で行うことが好ましい。培地としては
炭素源及び窒素源としてトリプトン、ペプトン又は肉エ
キスを含む培地を用いることができる。本菌株が生育し
本酵素が十分に産生される条件下であれば、培養温度、
培養時間、培養のｐＨは特に制限されない。培養条件に
よって変動することもありうるが、培養温度は４５〜５
３℃、培養時間は１０〜１００時間、培養のｐＨは７〜
７．５で行うことが好ましい。
【００１７】培養物からキサンチンデヒドロゲナーゼを
採取する方法は、通常用いられる方法に従って行えばよ
い。例えば、遠心分離などによって集菌した菌体を超音
波破砕、ガラスビーズなどで機械的に破砕した後、遠心
分離などにより細胞片などの固形物を除き、粗酵素液を
得る。次に、硫安、芒硝などの塩析法、塩化マグネシウ
ム、塩化カルシウムなどによる金属凝集法、プロタミ
ン、エチレンイミンポリマーなどによる凝集法、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィーなどによるクロマ
トグラフィー法を用いて精製することができる。
採取する方法は、通常用いられる方法に従って行えばよ
い。例えば、遠心分離などによって集菌した菌体を超音
波破砕、ガラスビーズなどで機械的に破砕した後、遠心
分離などにより細胞片などの固形物を除き、粗酵素液を
得る。次に、硫安、芒硝などの塩析法、塩化マグネシウ
ム、塩化カルシウムなどによる金属凝集法、プロタミ
ン、エチレンイミンポリマーなどによる凝集法、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィーなどによるクロマ
トグラフィー法を用いて精製することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下本発明の実施の形態を実施例
により詳しく説明する。なお、キサンチンデヒドロゲナ
ーゼにおける酵素活性単位は、１分間当たり１μｍｏｌ
の尿酸を産生する酵素量を１ｕｎｉｔと定義する。ＮＡ
Ｄはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、ＮＡＤ
Ｐはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を、
ＮＢＴはニトロブルーテトラゾリウムを、ＩＮＴは３−
（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）
−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロリドを表す。
により詳しく説明する。なお、キサンチンデヒドロゲナ
ーゼにおける酵素活性単位は、１分間当たり１μｍｏｌ
の尿酸を産生する酵素量を１ｕｎｉｔと定義する。ＮＡ
Ｄはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、ＮＡＤ
Ｐはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を、
ＮＢＴはニトロブルーテトラゾリウムを、ＩＮＴは３−
（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）
−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロリドを表す。
【００１９】製造例 シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）Ｙ−５１０の培養及び集菌 ニュートリエントブロス（ディフコ社製）８ｇ、ヒポキ
サンチン１ｇ及び水１ＬからなるｐＨ７の培地を用い
た。２Ｌの三角フラスコに培地０．５Ｌを入れ滅菌した
後にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）
の菌体３×１０7 個を添加し、培養温度５０℃、２００
ｒｐｍで回転させつつ、１５〜２０時間培養した。培養
終了後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０
分）により集菌した。
ｓｐ．）Ｙ−５１０の培養及び集菌 ニュートリエントブロス（ディフコ社製）８ｇ、ヒポキ
サンチン１ｇ及び水１ＬからなるｐＨ７の培地を用い
た。２Ｌの三角フラスコに培地０．５Ｌを入れ滅菌した
後にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）
の菌体３×１０7 個を添加し、培養温度５０℃、２００
ｒｐｍで回転させつつ、１５〜２０時間培養した。培養
終了後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０
分）により集菌した。
【００２０】
実施例１ １．酵素の分離精製 製造例で得られた湿菌３０ｇを１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波で菌体を破砕した。
菌体破砕液５０ｍｌについて超遠心分離（３０，０００
ｇ、１０分）を行い、上清４０ｍｌを得た。上清に硫酸
プロタミンを０．２５重量％になるように添加し４℃で
撹拌した後、超遠心分離（３０，０００ｇ、１０分）を
行い上清４０ｍｌを得た。次に、上清に硫酸アンモニウ
ムを２５重量％になるように添加し、４℃で１５分撹拌
した後、２０分放置し遠心分離（１０，０００ｇ、２０
分）を行った。
緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波で菌体を破砕した。
菌体破砕液５０ｍｌについて超遠心分離（３０，０００
ｇ、１０分）を行い、上清４０ｍｌを得た。上清に硫酸
プロタミンを０．２５重量％になるように添加し４℃で
撹拌した後、超遠心分離（３０，０００ｇ、１０分）を
行い上清４０ｍｌを得た。次に、上清に硫酸アンモニウ
ムを２５重量％になるように添加し、４℃で１５分撹拌
した後、２０分放置し遠心分離（１０，０００ｇ、２０
分）を行った。
【００２１】上清にさらに硫酸アンモニウムを４５重量
％になるように添加し４℃で１５分撹拌した後、２０分
放置し遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）を行い沈殿
５ｇを得た。次いで、沈殿に１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７）５ｍｌを添加し、懸濁させた後、１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２Ｌを用いて２０時
間透析を行った。透析終了後、超遠心分離（３０，００
０ｇ、１０分）を行い、上清１２ｍｌを得た。
％になるように添加し４℃で１５分撹拌した後、２０分
放置し遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）を行い沈殿
５ｇを得た。次いで、沈殿に１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７）５ｍｌを添加し、懸濁させた後、１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２Ｌを用いて２０時
間透析を行った。透析終了後、超遠心分離（３０，００
０ｇ、１０分）を行い、上清１２ｍｌを得た。
【００２２】この上清を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）９０ｍｌ
を充填したカラム（φ２５×３３０ｍｍ）に添加した。
続いて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２０
０ｍｌと１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２００ｍ
ｌとでリン酸濃度が上昇するグラジエントをつくり、溶
出した。活性画分３０ｍｌを分取し、限外ろ過で３ｍｌ
に濃縮した。得られた溶液を、１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＳｕｐｅｒｒｏｓｅ１２
（ファルマシア社製）カラムでゲルろ過を行い、キサン
チンデヒドロゲナーゼ（以下、本酵素という）１３ｍｇ
を得た。
ｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）９０ｍｌ
を充填したカラム（φ２５×３３０ｍｍ）に添加した。
続いて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２０
０ｍｌと１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２００ｍ
ｌとでリン酸濃度が上昇するグラジエントをつくり、溶
出した。活性画分３０ｍｌを分取し、限外ろ過で３ｍｌ
に濃縮した。得られた溶液を、１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＳｕｐｅｒｒｏｓｅ１２
（ファルマシア社製）カラムでゲルろ過を行い、キサン
チンデヒドロゲナーゼ（以下、本酵素という）１３ｍｇ
を得た。
【００２３】２．理化学的性質 １で得られた本酵素の理化学的性質は以下のとおりであ
った。 （１）作用及び基質特異性 本酵素２μｇ、表１に示す０．５ｍＭの各種基質及び
０．５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、分解
した基質を定量した。結果を表１に示す。本酵素はヒポ
キサンチン、キサンチンに対してのみ作用した。
った。 （１）作用及び基質特異性 本酵素２μｇ、表１に示す０．５ｍＭの各種基質及び
０．５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、分解
した基質を定量した。結果を表１に示す。本酵素はヒポ
キサンチン、キサンチンに対してのみ作用した。
【００２４】
【表１】
【００２５】（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含
む、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６〜７．
５）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．７〜８．
７）又は５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜
１０．７）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、
生成した尿酸を定量した。結果を図１に示す。ｐＨ８．
９付近において高い酵素活性が認められた。また、本酵
素を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）又は５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で６０℃で３０分加
熱した後、残存する酵素活性を測定した。その結果、本
酵素はｐＨ７〜９において失活しなかった。
む、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６〜７．
５）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．７〜８．
７）又は５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜
１０．７）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、
生成した尿酸を定量した。結果を図１に示す。ｐＨ８．
９付近において高い酵素活性が認められた。また、本酵
素を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）又は５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で６０℃で３０分加
熱した後、残存する酵素活性を測定した。その結果、本
酵素はｐＨ７〜９において失活しなかった。
【００２６】（３）至適温度及び作用適温 本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を
図２に示す３０〜８０℃の各種温度で１０分間反応さ
せ、生成した尿酸を定量した。結果を図２に示す。至適
温度は６０℃付近であった。至適温度での酵素活性を１
００とすると４０〜７０℃の広い範囲で８０％以上の相
対活性が認められた。
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を
図２に示す３０〜８０℃の各種温度で１０分間反応さ
せ、生成した尿酸を定量した。結果を図２に示す。至適
温度は６０℃付近であった。至適温度での酵素活性を１
００とすると４０〜７０℃の広い範囲で８０％以上の相
対活性が認められた。
【００２７】（４）熱安定性 本酵素を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）又は
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で各々４０、５
０、６０℃においてインキュベートし、経過時間におけ
る残存する酵素活性を測定した。酵素活性は、本酵素２
μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で
１０分間反応させ、生成した尿酸を定量して求めた。結
果を図３に示す。酵素活性の各種温度における半減期
は、ｐＨ７でインキュベートした場合では、４０℃にお
いて１３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃に
おいて２５時間であった。
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で各々４０、５
０、６０℃においてインキュベートし、経過時間におけ
る残存する酵素活性を測定した。酵素活性は、本酵素２
μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で
１０分間反応させ、生成した尿酸を定量して求めた。結
果を図３に示す。酵素活性の各種温度における半減期
は、ｐＨ７でインキュベートした場合では、４０℃にお
いて１３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃に
おいて２５時間であった。
【００２８】（５）阻害 本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液
に、表２に示す０．１ｍＭの各種金属塩を添加し５０℃
で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量することによ
り金属イオンによる影響を調べた。結果を表２に示す。
Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、
Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受けた。
む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液
に、表２に示す０．１ｍＭの各種金属塩を添加し５０℃
で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量することによ
り金属イオンによる影響を調べた。結果を表２に示す。
Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、
Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受けた。
【００２９】
【表２】
【００３０】（６）活性化 本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び表３に示す１ｍＭ
の各種電子受容体を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、生成
した尿酸を定量した。その結果、電子受容体の中でも、
ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、フェナジンメトサルフェート、メチ
レンブルー、又は２，６−ジクロロインドフェノールを
必要とした。
の各種電子受容体を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、生成
した尿酸を定量した。その結果、電子受容体の中でも、
ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、フェナジンメトサルフェート、メチ
レンブルー、又は２，６−ジクロロインドフェノールを
必要とした。
【００３１】
【表３】
【００３２】（７）分子量 Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ１２（ファルマシア社製）を用いる
ゲルろ過法で分子量を測定した。標準蛋白質には、Ｆｅ
ｒｒｉｔｉｎ（分子量４４０，０００）、Ｌａｃｔａｔ
ｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（分子量１４０，００
０）、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（分
子量６７，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量４
３，０００）、Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ（分子量２０，１００）を用いた。その
結果、分子量は１４１，０００であった。
ゲルろ過法で分子量を測定した。標準蛋白質には、Ｆｅ
ｒｒｉｔｉｎ（分子量４４０，０００）、Ｌａｃｔａｔ
ｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（分子量１４０，００
０）、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（分
子量６７，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量４
３，０００）、Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ（分子量２０，１００）を用いた。その
結果、分子量は１４１，０００であった。
【００３３】（８）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動
法によりサブユニットの分子量を測定した。標準蛋白質
には、Ｍｙｏｓｉｎ（分子量２１２，０００）、α−Ｍ
ａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（分子量１７０，０００）、
β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（分子量１１６，００
０）、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（分子量７６，００
０）、Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（分子量５３，０００）を用いた。その結果、サブユニ
ットの分子量は５６，０００と８４，０００であった。
法によりサブユニットの分子量を測定した。標準蛋白質
には、Ｍｙｏｓｉｎ（分子量２１２，０００）、α−Ｍ
ａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（分子量１７０，０００）、
β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（分子量１１６，００
０）、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（分子量７６，００
０）、Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（分子量５３，０００）を用いた。その結果、サブユニ
ットの分子量は５６，０００と８４，０００であった。
【００３４】（９）ミカエリス定数 本酵素２μｇ、０．０３３〜０．５ｍＭキサンチン及び
０．０３３〜０．５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反
応させ、生成した尿酸を定量した。キサンチンに対する
ミカエリス定数（Ｋｍ）は０．３２７ｍＭ、ＮＡＤに対
するミカエリス定数は０．０６０ｍＭであった。
０．０３３〜０．５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反
応させ、生成した尿酸を定量した。キサンチンに対する
ミカエリス定数（Ｋｍ）は０．３２７ｍＭ、ＮＡＤに対
するミカエリス定数は０．０６０ｍＭであった。
【００３５】（１０）等電点 等電点電気泳動法により等電点（ｐＩ）を測定した。標
準蛋白質には、Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（等
電点３．５０）、Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ（等電点４．５５）、β−Ｌａｃｔｏ
ｇｌｏｂｕｌｉｎ（等電点５．２０）、Ｂｏｖｉｎｅ
Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＢ（等電点５．
８５）、Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒ
ａｓｅＢ（等電点６．５５）、Ｈｏｒｓｅ Ｍｙｏｇｌ
ｏｂｉｎ（等電点６．８５）、Ｌｅｎｔｉ Ｌｅｃｔｉ
ｎ（等電点８．１５、８．４５、８．６５）、Ｔｒｙｐ
ｓｉｎｏｇｅｎ（等電点９．３０）を用いた。その結
果、等電点（ｐＩ）は６．０であった。
準蛋白質には、Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（等
電点３．５０）、Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ（等電点４．５５）、β−Ｌａｃｔｏ
ｇｌｏｂｕｌｉｎ（等電点５．２０）、Ｂｏｖｉｎｅ
Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＢ（等電点５．
８５）、Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒ
ａｓｅＢ（等電点６．５５）、Ｈｏｒｓｅ Ｍｙｏｇｌ
ｏｂｉｎ（等電点６．８５）、Ｌｅｎｔｉ Ｌｅｃｔｉ
ｎ（等電点８．１５、８．４５、８．６５）、Ｔｒｙｐ
ｓｉｎｏｇｅｎ（等電点９．３０）を用いた。その結
果、等電点（ｐＩ）は６．０であった。
【００３６】
【発明の効果】本発明の耐熱性に優れたキサンチンデヒ
ドロゲナーゼを酵素を利用する反応に用いることによ
り、該反応の反応温度を高く設定することができ、高濃
度反応が可能となり、反応速度が向上するとともに、雑
菌汚染が少ない条件で酵素を利用する反応ができるとい
う効果を奏する。
ドロゲナーゼを酵素を利用する反応に用いることによ
り、該反応の反応温度を高く設定することができ、高濃
度反応が可能となり、反応速度が向上するとともに、雑
菌汚染が少ない条件で酵素を利用する反応ができるとい
う効果を奏する。
【図１】本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼの至適ｐ
Ｈを示す図である。
Ｈを示す図である。
【図２】本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼの至適温
度及び作用適温を示す図である。
度及び作用適温を示す図である。
【図３】本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼの熱安定
性を示す図である。
性を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 次の理化学的性質を有するキサンチンデ
ヒドロゲナーゼ。 （１）作用 【化１】 （２）基質特異性 ヒポキサンチン、キサンチンに対して作用する。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは８．９付近であり、ｐＨ７〜９において６０
℃で３０分加熱しても失活しない。 （４）至適温度及び作用適温 至適温度は６０℃付近、作用適温は４０〜７０℃。 （５）熱安定性 ｐＨ７における酵素活性の半減期は、４０℃において１
３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃において
２５時間である。 （６）阻害 Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、
Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受ける。 （７）活性化 電子受容体を必要とする。 （８）分子量 ゲルろ過法による分子量は１４１，０００。 （９）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブ
ユニットの分子量は５６，０００及び８４，０００。 （１０）ミカエリス定数 ミカエリス定数（Ｋｍ）はキサンチンに対して０．３２
７ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに対し
て０．０６０ｍＭ。 （１１）等電点 等電点電気泳動法による等電点（ｐＩ）は６．０。 - 【請求項２】 請求項１記載のキサンチンデヒドロゲナ
ーゼを産生する能力を有するシュードモナス属に属する
微生物を培養し、培養物から該酵素を採取することを特
徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの製造方法。 - 【請求項３】 請求項１記載のキサンチンデヒドロゲナ
ーゼを産生する能力を有するシュードモナス属に属する
微生物がシュードモナス・エスピー Ｙ−５１０（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５１０４）である請求項２記載のキサンチ
ンデヒドロゲナーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19693896A JP3735956B2 (ja) | 1996-07-09 | 1996-07-09 | キサンチンデヒドロゲナーゼ及び該酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19693896A JP3735956B2 (ja) | 1996-07-09 | 1996-07-09 | キサンチンデヒドロゲナーゼ及び該酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1023887A true JPH1023887A (ja) | 1998-01-27 |
| JP3735956B2 JP3735956B2 (ja) | 2006-01-18 |
Family
ID=16366159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19693896A Expired - Fee Related JP3735956B2 (ja) | 1996-07-09 | 1996-07-09 | キサンチンデヒドロゲナーゼ及び該酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3735956B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105734027A (zh) * | 2014-12-11 | 2016-07-06 | 清华大学 | 一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0921548A (ja) * | 1995-07-03 | 1997-01-21 | Sekisui Chem Co Ltd | 結露防止自動換気装置 |
-
1996
- 1996-07-09 JP JP19693896A patent/JP3735956B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0921548A (ja) * | 1995-07-03 | 1997-01-21 | Sekisui Chem Co Ltd | 結露防止自動換気装置 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105734027A (zh) * | 2014-12-11 | 2016-07-06 | 清华大学 | 一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用 |
| CN105734027B (zh) * | 2014-12-11 | 2019-03-05 | 清华大学 | 一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3735956B2 (ja) | 2006-01-18 |
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