JPH04135487A - グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法 - Google Patents
グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法Info
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- JPH04135487A JPH04135487A JP2256462A JP25646290A JPH04135487A JP H04135487 A JPH04135487 A JP H04135487A JP 2256462 A JP2256462 A JP 2256462A JP 25646290 A JP25646290 A JP 25646290A JP H04135487 A JPH04135487 A JP H04135487A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、臨床検査においてグルコースの定量に使用さ
れる、新規なグルコースデヒドロゲナーゼおよびその製
造法に関する。
れる、新規なグルコースデヒドロゲナーゼおよびその製
造法に関する。
（従来の技術）
近年、臨床検査の普及に伴いグルコース測定用としてグ
ルコースデヒドロゲナーゼの需要が高まってきている。
ルコースデヒドロゲナーゼの需要が高まってきている。
更に、臨床検査の分野の中でも、ドライケミストリイー
の分野では、特に熱安定性に優れたグルコースデヒドロ
ゲナーゼの開発が望まれている。
の分野では、特に熱安定性に優れたグルコースデヒドロ
ゲナーゼの開発が望まれている。
現在臨床検査用に市販されているグルコースデヒドロゲ
ナーゼは、バチルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）属由来のグル
コースデヒドロゲナーゼ（ＰＣＩ 、、１．１．４７）
及びクリットコツカス（Ｑｐ １ｐｃｏｃｃｕｓ）属
山来グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅｅｌ 、１．１．
１１９）である。前者のグルコースデヒドロゲナーゼ（
ＥＣＩ 、１．１．４７）は、β−Ｄ−グルコース＋Ｎ
ＡＤ （Ｐ）”−→Ｄ−δグルコノラクトン＋ＮＡＤ
（Ｐ） 十Ｈ＋の反応を触媒する酵素であり、後者のグ
ルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅｅｌ 、１．１．１１９
）は、Ｄ−グルコース＋ＮＡＤＰ”−→Ｄ−δ−グルコ
ノラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋の反応を触媒する酵素で
ある。臨床検査用としては、補酵素としてＮＡＤＰのみ
利用できるグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，
１，１１９）よりも、ＮＡＤＰとＮＡＤの両方を利用で
きるグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４
７）のほうが好ましい。
ナーゼは、バチルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ）属由来のグル
コースデヒドロゲナーゼ（ＰＣＩ 、、１．１．４７）
及びクリットコツカス（Ｑｐ １ｐｃｏｃｃｕｓ）属
山来グルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅｅｌ 、１．１．
１１９）である。前者のグルコースデヒドロゲナーゼ（
ＥＣＩ 、１．１．４７）は、β−Ｄ−グルコース＋Ｎ
ＡＤ （Ｐ）”−→Ｄ−δグルコノラクトン＋ＮＡＤ
（Ｐ） 十Ｈ＋の反応を触媒する酵素であり、後者のグ
ルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅｅｌ 、１．１．１１９
）は、Ｄ−グルコース＋ＮＡＤＰ”−→Ｄ−δ−グルコ
ノラクトン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋の反応を触媒する酵素で
ある。臨床検査用としては、補酵素としてＮＡＤＰのみ
利用できるグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，
１，１１９）よりも、ＮＡＤＰとＮＡＤの両方を利用で
きるグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４
７）のほうが好ましい。
しかし、現在市販されているグルコースデヒドロゲナー
ゼ（ＥＣＩ 、１．１．４７）は、いずれも熱に不安定
なものであり、臨床検査用酵素として、特にドライケミ
ストリイー用酵素としてより熱安定性の優しタグルコー
スデヒドロゲナーゼの開発が望まれていた。
ゼ（ＥＣＩ 、１．１．４７）は、いずれも熱に不安定
なものであり、臨床検査用酵素として、特にドライケミ
ストリイー用酵素としてより熱安定性の優しタグルコー
スデヒドロゲナーゼの開発が望まれていた。
なお、従来のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣＩ。
１．１．４７）の起源としてはバチルス（Ｂａｃ目１ｕ
ｓ）属をはじめ各種細菌由来のものや、動物肺由来のも
のが知られている（「酵素ハンドブック」第９版第１９
頁、朝食書店発行参照）が、シュードモナス属由来のＮ
ＡＤ （Ｐ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼは知
られていなかった。また、従来知られているシュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌が産生ずるグル
コースデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ （Ｐ）非依存性の
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣＩ 、１．９９．８
）であり（７Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、’ｖｏ１．９．９２−９８１９ＢＩｌｉ Ａｇｒ
ｊｃ、ＢＩｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４４（７）。
ｓ）属をはじめ各種細菌由来のものや、動物肺由来のも
のが知られている（「酵素ハンドブック」第９版第１９
頁、朝食書店発行参照）が、シュードモナス属由来のＮ
ＡＤ （Ｐ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼは知
られていなかった。また、従来知られているシュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌が産生ずるグル
コースデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ （Ｐ）非依存性の
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣＩ 、１．９９．８
）であり（７Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、’ｖｏ１．９．９２−９８１９ＢＩｌｉ Ａｇｒ
ｊｃ、ＢＩｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４４（７）。
１５０５１５１２１９８０） 、臨床分野では、使いに
くいものであった。
くいものであった。
（発明が解決しようとする課題）
本発明が解決しようとする課題は、熱安定性が高くかつ
ＮＡＤ （Ｐ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼお
よびその製造法を提供することである。
ＮＡＤ （Ｐ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼお
よびその製造法を提供することである。
（課題を解決するための手段）
本発明の要旨は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属由来であって、下記の反応を触媒するグルコー
スデヒドロゲナーゼおよびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）属に属し、下記の反応を触媒するグルコ
ースデヒドロゲナーゼを生産する菌を培養し、培養物か
ら該グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴
とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造法に存する。
ａｓ）属由来であって、下記の反応を触媒するグルコー
スデヒドロゲナーゼおよびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）属に属し、下記の反応を触媒するグルコ
ースデヒドロゲナーゼを生産する菌を培養し、培養物か
ら該グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴
とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造法に存する。
β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ （Ｐ） ＋−→Ｄ−δ−
グルコノラクトン＋ＮＡＤ （Ｐ） 十Ｈ”本発明に使
用する菌株は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属に属する菌株であるならばいずれでもよいが、特
に本発明者等が福井県敦賀市内の土壌より採取したシュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュ
ードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄ。
グルコノラクトン＋ＮＡＤ （Ｐ） 十Ｈ”本発明に使
用する菌株は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属に属する菌株であるならばいずれでもよいが、特
に本発明者等が福井県敦賀市内の土壌より採取したシュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュ
ードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ ｓｐ、）Ｆ Ｈ１２２７株が好ましい。
上記シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｓｐ、）Ｆ Ｈ１２２７株の菌学的性質を以下に示す
。
ｓｓｐ、）Ｆ Ｈ１２２７株の菌学的性質を以下に示す
。
（ａ）形 態
肉汁寒天培地に３０℃で２０時間培養して、大きさ（２
，５） Ｘ（０，７）の桿菌であり、ダラム染色は陰性
であり１．運動性がある。
，５） Ｘ（０，７）の桿菌であり、ダラム染色は陰性
であり１．運動性がある。
（ｂ）各培地における生育状況
（１） 肉汁寒天平板培養
３０°Ｃ１２４時間培養して、直径１−３關の円形のコ
ロニーを形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起は薄
い平田状、コロニーは均質不透明で淡い肌色で、可溶性
色素及び蛍光性色素は形成しない。
ロニーを形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起は薄
い平田状、コロニーは均質不透明で淡い肌色で、可溶性
色素及び蛍光性色素は形成しない。
■ 肉汁寒天斜面培養
３０℃、２４時間で斜面前面に良好に生育する。閉包は
淡い肌色である。
淡い肌色である。
（３） 肉汁液体培養
３０℃１６時間振盪培養にて良好に生育するが、静置培
養では殆ど生育しない。
養では殆ど生育しない。
に） 肉汁寒天穿刺培養
３０℃２４時間で、寒天上部は良好な生育を示すが、深
部は生育不良である。
部は生育不良である。
■ 生育温度
肉汁液体培地の振盪培養にて、２５−４２°Ｃまで生育
し、３７℃付近にて最も良好な生育を示す。
し、３７℃付近にて最も良好な生育を示す。
（６）生育ｐＨ
肉汁液体培地の振盪培養にてｐＨ６−８の間で良好な生
育を示す。
育を示す。
（Ｃ）生理学的性質
（１）硝酸塩の還元 ；陽性■ 脱窒反
応 ；陰性（３） β−ガラクト
シダーゼ ；陰性（６） アルギニンジヒドラタ
ーゼ ；陰性■ リジンデカルボキシラーゼ ；陰
性■ オルニチンデカルボキシラーゼ；陰性ω クエン
酸資化性 ：陰性■ 硫化水素産生能
；陰性（９） ウレアーゼ
；陰性（１０） ）リブトファンデアミナーゼ
；陰性（１１）ＶＰテスト ；陽性（
２）ゼラチン分解性 ；陽性（３）ＯＦテ
スト ；非発酵（４）カタラーゼ
；陽性（５）オキシダーゼ
；陰性（６）糖からの酸の生成 ；グル
コース、マンニトール、イノシトール、Ｄ−ソルビトイ
ノシトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ラムノース、サッ
カロース、Ｄ−メリビオース、Ｄ−アミグダリンからの
酸を生成しない。
応 ；陰性（３） β−ガラクト
シダーゼ ；陰性（６） アルギニンジヒドラタ
ーゼ ；陰性■ リジンデカルボキシラーゼ ；陰
性■ オルニチンデカルボキシラーゼ；陰性ω クエン
酸資化性 ：陰性■ 硫化水素産生能
；陰性（９） ウレアーゼ
；陰性（１０） ）リブトファンデアミナーゼ
；陰性（１１）ＶＰテスト ；陽性（
２）ゼラチン分解性 ；陽性（３）ＯＦテ
スト ；非発酵（４）カタラーゼ
；陽性（５）オキシダーゼ
；陰性（６）糖からの酸の生成 ；グル
コース、マンニトール、イノシトール、Ｄ−ソルビトイ
ノシトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ラムノース、サッ
カロース、Ｄ−メリビオース、Ｄ−アミグダリンからの
酸を生成しない。
Ｌ−アラビノースから酸を生成する。
（１７）色素の生成 ；可溶性、蛍光
性共になし く１８）酸素に対する態度 ；好気性（１９
） Ｔｗｅ ｅ ｎ分解性 ；陰性（２０）
ビタミン、アミノ酸の要求性 ；特になし上記菌学的性
質の同定のための実験法は、主として、長谷用武治編著
、「微生物の分類と同定」学会出版センター（１９７５
年）によって行った。
性共になし く１８）酸素に対する態度 ；好気性（１９
） Ｔｗｅ ｅ ｎ分解性 ；陰性（２０）
ビタミン、アミノ酸の要求性 ；特になし上記菌学的性
質の同定のための実験法は、主として、長谷用武治編著
、「微生物の分類と同定」学会出版センター（１９７５
年）によって行った。
また、分類同定の基準としてバーシーズ・マニュアル・
オブ・システマティック・バタテリオロジｖｏ１．１
（１９８４年）を参考にした。
オブ・システマティック・バタテリオロジｖｏ１．１
（１９８４年）を参考にした。
上記文献および上記菌学的諸性質から、ＦＨ１２２７株
はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属す
ると見なされる。さらにＦＨ１２２７株は、シュードモ
ナス・ビリディフラーバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｖｌ
ｒｌｄｌｆｌａｖａ ）とよく一致するが、色素の生成
能の点において相違が認められる。従って、本菌株は、
シュードモナス骨エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ、）ＦＨ１２２７株と命名した。本菌は、工業技術
院微生物工業研究所に微生物受託番号第１１６１８号と
して寄託されている。
はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属す
ると見なされる。さらにＦＨ１２２７株は、シュードモ
ナス・ビリディフラーバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｖｌ
ｒｌｄｌｆｌａｖａ ）とよく一致するが、色素の生成
能の点において相違が認められる。従って、本菌株は、
シュードモナス骨エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ、）ＦＨ１２２７株と命名した。本菌は、工業技術
院微生物工業研究所に微生物受託番号第１１６１８号と
して寄託されている。
本発明を実施するに当たっては、通常の栄養培地が使用
できる。培地の炭素源としては、グルコースを始め各種
の単糖や、コハク酸やリンゴ酸のような各種の有機酸が
利用できる。天然栄養源としては、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス等が利用でき、窒素源としては、硫安、塩
安等の無機窒素源も利用できる。無機塩類としては、リ
ン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マ
グネシウムが利用できる。これらの栄養源を単独で用い
ることも、また組み合わせて用いることもできる。
できる。培地の炭素源としては、グルコースを始め各種
の単糖や、コハク酸やリンゴ酸のような各種の有機酸が
利用できる。天然栄養源としては、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス等が利用でき、窒素源としては、硫安、塩
安等の無機窒素源も利用できる。無機塩類としては、リ
ン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マ
グネシウムが利用できる。これらの栄養源を単独で用い
ることも、また組み合わせて用いることもできる。
菌株を培養するに当たっては、通常振盪培養または通気
撹拌培養で行うことができる。一般に培養温度は２５−
３７℃、培地ｐＨ５，５−７，５であるのが好ましく、
通常１ｇ−２４時間培養を行うと菌体中にグルコースデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４７）が生成蓄積す
る。培養条件は、使用する菌株、培地組成に応じ、グル
コースデヒドロゲナーゼ（Ｆ Ｃ１，１，１，４７）の
生産量が最大になるように設定することは当然である。
撹拌培養で行うことができる。一般に培養温度は２５−
３７℃、培地ｐＨ５，５−７，５であるのが好ましく、
通常１ｇ−２４時間培養を行うと菌体中にグルコースデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４７）が生成蓄積す
る。培養条件は、使用する菌株、培地組成に応じ、グル
コースデヒドロゲナーゼ（Ｆ Ｃ１，１，１，４７）の
生産量が最大になるように設定することは当然である。
本発明によって生成蓄積されたグルコースデヒドロゲナ
ーゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）を採取するに当たって
は、培養液からの遠心分離、濾過等の操作によって菌体
を集めることが出来る。菌体の破砕方法としては、ビー
ズ破砕、超音波破砕、溶菌酵素処理等の方法を利用して
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣＩ。
ーゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）を採取するに当たって
は、培養液からの遠心分離、濾過等の操作によって菌体
を集めることが出来る。菌体の破砕方法としては、ビー
ズ破砕、超音波破砕、溶菌酵素処理等の方法を利用して
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣＩ。
１．１．４７）を取り出すことができ、菌株により、最
も抽出効率のよい方法を採用する事が望ましい。
も抽出効率のよい方法を採用する事が望ましい。
かくして得られた粗酵素液からグルコースデヒドロゲナ
ーゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）を単離するに当たって
は、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例
えば、ポリエチレンイミン処理、硫安塩析等電点沈殿、
イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法、疎水ク
ロマトグラフィー法等の方法−〇− を組み合わせて使用できる。例えば粗酵素液を遠心分離
し、上清を得る。これにポリエチレンイミンを添加し除
核酸後、上清を得る。更にその上清の硫安塩析画分（０
，５〜０．７飽和）を得る。
ーゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）を単離するに当たって
は、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例
えば、ポリエチレンイミン処理、硫安塩析等電点沈殿、
イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法、疎水ク
ロマトグラフィー法等の方法−〇− を組み合わせて使用できる。例えば粗酵素液を遠心分離
し、上清を得る。これにポリエチレンイミンを添加し除
核酸後、上清を得る。更にその上清の硫安塩析画分（０
，５〜０．７飽和）を得る。
セファデックスＧ−２５ゲル濾過法により脱塩しさらに
濃縮後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ ４Ｂイオン交換
体に吸着、溶出させる。活性画分はさらに、フェニルト
ヨパール６５０Ｍに吸着、溶出させる。この活性画分を
セファデックスＧ２５ゲル濾過法によって脱塩し、活性
画分を回収することによって、高度に精製されたグルコ
ースデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）を単
離することができる。
濃縮後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ ４Ｂイオン交換
体に吸着、溶出させる。活性画分はさらに、フェニルト
ヨパール６５０Ｍに吸着、溶出させる。この活性画分を
セファデックスＧ２５ゲル濾過法によって脱塩し、活性
画分を回収することによって、高度に精製されたグルコ
ースデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）を単
離することができる。
本発明により得られるグルコースデヒドロゲナーゼの理
化学的諸性質の一例は次のとおりである。
化学的諸性質の一例は次のとおりである。
（１） 作 用 ：
本発明の酵素は、１モルのβ−Ｄ−グルコースと１モル
のＮＡＤ （Ｐ）より、１モルのＤ−δ−グルコノラク
トンと１モルのＮＡＤ （Ｐ）Ｈ＋を生成する。
のＮＡＤ （Ｐ）より、１モルのＤ−δ−グルコノラク
トンと１モルのＮＡＤ （Ｐ）Ｈ＋を生成する。
■ 基質特異性：
下記第２表に示すとおりβ−Ｄ−グルコースと２−デオ
キシグルコースに特異的に作用する。
キシグルコースに特異的に作用する。
第 ２ 表
（３）至適ｐＨ：
本発明の酵素の至適Ｉ）Ｈは第１図で表されるとと＜１
）８８．５−９．０に高い活性を有している。
）８８．５−９．０に高い活性を有している。
（４）至適温度：
本発明の酵素の至適温度は第２図で表されるごとく５５
℃にある。
℃にある。
■ Ｉ）Ｈ安定性：
本発明の酵素を２０℃でそれぞれ１６時間処理したとき
のｐＨ安定性を第３図に示す。第３図より明らかなどと
＜ｐＨ６，０−７，５の間で安定である。
のｐＨ安定性を第３図に示す。第３図より明らかなどと
＜ｐＨ６，０−７，５の間で安定である。
（６）熱安定性：
本発明の酵素をｐＨ７，０でそれぞれの温度で１５分処
理したときの熱安定性を第４図に示す。
理したときの熱安定性を第４図に示す。
第４図から明らかなごとく、本発明の酵素は５０℃まで
安定である。
安定である。
■ 阻害剤：
下記第３表に示すことく、硝酸銀、塩化水銀、モノイオ
ドアセテートで阻害された。
ドアセテートで阻害された。
第
表
阻 害 剤
濃 度 相対活性（％）
無添加 １００．０硝酸銀
２． ＯＸＩＯ−３Ｍ ７．１塩化水銀
２． ＯＸＩＯ−３Ｍ ５．９モノイオド
アセテ−１−２，０ＸＩＯ−”Ｍ ０．４
（８）Ｋｍ値： 本発明の酵素β−Ｄ−グルコースに対するＫ ｍ値は、
１．３８Ｘ１０−２Ｍ（補酵素ＮＡＤ）または１．２５
Ｘ１０−２Ｍ（補酵素ＮＡＤＰ）である。
２． ＯＸＩＯ−３Ｍ ７．１塩化水銀
２． ＯＸＩＯ−３Ｍ ５．９モノイオド
アセテ−１−２，０ＸＩＯ−”Ｍ ０．４
（８）Ｋｍ値： 本発明の酵素β−Ｄ−グルコースに対するＫ ｍ値は、
１．３８Ｘ１０−２Ｍ（補酵素ＮＡＤ）または１．２５
Ｘ１０−２Ｍ（補酵素ＮＡＤＰ）である。
補酵素に対するＫｍ値は３．０８Ｘ １０−’Ｍ （Ｎ
ＡＤ）または４．０７ｘｌＯ−５Ｍ（ＮＡＤＰ）である
。
ＡＤ）または４．０７ｘｌＯ−５Ｍ（ＮＡＤＰ）である
。
（９）分子量：
本発明の酵素は、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲ
ル濾過法で約ｉｏｔ、ｏｏｏである。
ル濾過法で約ｉｏｔ、ｏｏｏである。
（１０）等電点：
本発明の酵素の等電点は、アンホライン等電点電気泳動
法で約４．５である。
法で約４．５である。
（１１）酵素活性測定法：
本発明の酵素活性の測定は、下記条件で１分間に１マイ
クロモルのＮＡＤＨを生成する酵素活性を１単位とする
。
クロモルのＮＡＤＨを生成する酵素活性を１単位とする
。
試薬：
（Ａ）０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液、
ｐＨ８，０
（Ｂ）１．５Ｍ Ｄ−グルコース溶液（２７，０２ｇ
のＤ−グルコースを１００−の蒸留水に溶解させる。） （Ｃ） ８０ｍｇ／ｍｆ ＮＡＤ溶液（８０−ｇのＮ
ＡＤ３水和物を１−の蒸留水に溶解させる。用時調製） （Ｄ）酵素溶液（酵素標品を、予め氷冷した５０ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７，０で０．８−１．２Ｕ／、ｎｌに希
釈する。） 手順： １、下記反応混液をキュベツト（ｄ”１ｃｍ）に調製し
、３７℃で約５分間予備加温する。
のＤ−グルコースを１００−の蒸留水に溶解させる。） （Ｃ） ８０ｍｇ／ｍｆ ＮＡＤ溶液（８０−ｇのＮ
ＡＤ３水和物を１−の蒸留水に溶解させる。用時調製） （Ｄ）酵素溶液（酵素標品を、予め氷冷した５０ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７，０で０．８−１．２Ｕ／、ｎｌに希
釈する。） 手順： １、下記反応混液をキュベツト（ｄ”１ｃｍ）に調製し
、３７℃で約５分間予備加温する。
（Ａ）液 ２． ６ｍｌ！
（Ｂ）液 ０．３−
（Ｃ）液 ０．１−
２、酵素溶液０．０５−を添加し、緩やかに混和後、水
を対照に３７℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍの
吸光度変化を５分間記録し、その２−５分の直線部分か
ら１分間当りの吸光度変化を求める。（へ〇Ｄテスト） ３、盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（リン酸緩衝
液１）Ｈ７，Ｏ）０．０５ｍ！加え、上記同様に操作を
行って、１分間当りの吸光度変化を求める。（ΔＯＤブ
ランク） 計算式： ％式％ ６．２２＝ＮＡＤＨのミリモル分子吸光計数（ｃＪ／μ
Ｍ）１．０＝光路長（ａｍ） （実施例） 以下に本発明によるグルコースデヒドロゲナーゼを実施
例を挙げて説明する。％は他に特記しない限り重量％（
Ｗ／Ｖ）である。
を対照に３７℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍの
吸光度変化を５分間記録し、その２−５分の直線部分か
ら１分間当りの吸光度変化を求める。（へ〇Ｄテスト） ３、盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（リン酸緩衝
液１）Ｈ７，Ｏ）０．０５ｍ！加え、上記同様に操作を
行って、１分間当りの吸光度変化を求める。（ΔＯＤブ
ランク） 計算式： ％式％ ６．２２＝ＮＡＤＨのミリモル分子吸光計数（ｃＪ／μ
Ｍ）１．０＝光路長（ａｍ） （実施例） 以下に本発明によるグルコースデヒドロゲナーゼを実施
例を挙げて説明する。％は他に特記しない限り重量％（
Ｗ／Ｖ）である。
実施例 １
培地へ組成 １．０％グルコース、０．３％酵母エキス
、０．３％ポリペプトン、０．３％肉エキス、０．１％
ＫＨ２ＰＯ４，０，２２％ＫＱ ＨＰＯ４，０，０５％
Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４７Ｈ２０，ｐＨ７，０ 培地Ｂ組成 １．０％ＤＬ−リンゴ酸、１．０％酵母エ
キス、０．３％ポリペプトン、０．２％肉エキス、０．
１％ＫＨ２ＰＯ４，０，２２％に２ ＨＰＯ４，０，２
％ＮａＣ１，０，０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、 ｐＨ６，０ 上記培地Ａ１００．ｆを５００ｍｆの坂ロフラスコに入
れ、１２１℃１５分間オートクレーブ殺菌する。シュー
ドモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、
）ＦＨ１２２７（微工研寄託第１１６１８号）の１白金
耳を、」二記培地Ａに接種し、３０℃２４時間振盪培養
し、種培養液とした。別に同条件にて殺菌した培地Ｂ６
ノを含む１０ノジヤーフアーメンターへ上記種培養液Ｅ
３０Ｌｌ！を接種した。４８０ｒｐｍ 、通気量２．ｆ
？／ｍｊｎ３０℃、ｐＨコントロール７．５で１８時間
培養した。得られた培養液のグルコースデヒドロゲナー
ゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）活性は、１．２Ｕ／ｉｆ
であった。培養液６ノを遠心分離し、菌体を集め５０
ｍ Ｍ ’Ｊン酸緩衝液１）Ｈ７，０に懸濁し、１ノと
してフレンチプレス破砕機（ミニラボ、大日本製薬製）
により破砕した。
、０．３％ポリペプトン、０．３％肉エキス、０．１％
ＫＨ２ＰＯ４，０，２２％ＫＱ ＨＰＯ４，０，０５％
Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４７Ｈ２０，ｐＨ７，０ 培地Ｂ組成 １．０％ＤＬ−リンゴ酸、１．０％酵母エ
キス、０．３％ポリペプトン、０．２％肉エキス、０．
１％ＫＨ２ＰＯ４，０，２２％に２ ＨＰＯ４，０，２
％ＮａＣ１，０，０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、 ｐＨ６，０ 上記培地Ａ１００．ｆを５００ｍｆの坂ロフラスコに入
れ、１２１℃１５分間オートクレーブ殺菌する。シュー
ドモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、
）ＦＨ１２２７（微工研寄託第１１６１８号）の１白金
耳を、」二記培地Ａに接種し、３０℃２４時間振盪培養
し、種培養液とした。別に同条件にて殺菌した培地Ｂ６
ノを含む１０ノジヤーフアーメンターへ上記種培養液Ｅ
３０Ｌｌ！を接種した。４８０ｒｐｍ 、通気量２．ｆ
？／ｍｊｎ３０℃、ｐＨコントロール７．５で１８時間
培養した。得られた培養液のグルコースデヒドロゲナー
ゼ（Ｅ Ｃ１，１，１，４７）活性は、１．２Ｕ／ｉｆ
であった。培養液６ノを遠心分離し、菌体を集め５０
ｍ Ｍ ’Ｊン酸緩衝液１）Ｈ７，０に懸濁し、１ノと
してフレンチプレス破砕機（ミニラボ、大日本製薬製）
により破砕した。
菌体破砕液に終濃度０．１２％のポリエチレンイミンと
０．１ＭＮａＣ１を添加し、室温で１５分分間中かに撹
拌放置した。この菌体破砕液を遠心分離し、上清を得た
。上清液に０．５飽和になるように硫安を加え遠心分離
し上清を得た。その」二清液に０．７飽和になるように
硫安を加え遠心分離し、沈殿物を得た。この沈殿物を５
０ ｍ Ｍ ＩＪン酸緩衝液、ｐＨ７，０，１４０−に
再溶解した。
０．１ＭＮａＣ１を添加し、室温で１５分分間中かに撹
拌放置した。この菌体破砕液を遠心分離し、上清を得た
。上清液に０．５飽和になるように硫安を加え遠心分離
し上清を得た。その」二清液に０．７飽和になるように
硫安を加え遠心分離し、沈殿物を得た。この沈殿物を５
０ ｍ Ｍ ＩＪン酸緩衝液、ｐＨ７，０，１４０−に
再溶解した。
再溶解液を５０ ｍ Ｍ ’Ｊン酸緩衝液、ｐＨ７，０
で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１，５１
）で脱塩した。脱塩液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
４Ｂカラム５０−に吸着させ、０−０．３ＭＮａＣ１の
グラジェントにて溶出した。溶出液に０．４飽和になる
ように硫安を加え不溶物を遠心分離し上清を得た。この
上清液を０．４飽和の硫安を含む５０ ｍ Ｍ リン酸
緩衝液、ｐＨ７，０にテＭｉ 衝化したフェニルトヨパ
ール６５０Ｍ １０Ｔｎ１に吸着させ、０．４−０飽和
硫安および０−１０％エチレングリコールのグラジェン
トにて溶出した。この溶山液を限外濾過にて濃縮し、５
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０にて緩衝化したセファ
デックスＧ−２５カラム（１００，Ｌ／りにて脱塩し、
活性画分を得た。活性画分の比活性は約１２０Ｕ／ ｍ
ｇ蛋白であった。得られたグルコースデヒドロゲナーゼ
の理化学的性質は、前記に示したとおりであった。
で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１，５１
）で脱塩した。脱塩液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
４Ｂカラム５０−に吸着させ、０−０．３ＭＮａＣ１の
グラジェントにて溶出した。溶出液に０．４飽和になる
ように硫安を加え不溶物を遠心分離し上清を得た。この
上清液を０．４飽和の硫安を含む５０ ｍ Ｍ リン酸
緩衝液、ｐＨ７，０にテＭｉ 衝化したフェニルトヨパ
ール６５０Ｍ １０Ｔｎ１に吸着させ、０．４−０飽和
硫安および０−１０％エチレングリコールのグラジェン
トにて溶出した。この溶山液を限外濾過にて濃縮し、５
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０にて緩衝化したセファ
デックスＧ−２５カラム（１００，Ｌ／りにて脱塩し、
活性画分を得た。活性画分の比活性は約１２０Ｕ／ ｍ
ｇ蛋白であった。得られたグルコースデヒドロゲナーゼ
の理化学的性質は、前記に示したとおりであった。
（発明の効果）
本発明により得られるグルコースデヒドロゲナーゼは、
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属から得ら
れるＮＡＤ （Ｐ）依存性の酵素である。熱安定性が５
０°Ｃまで安定であり、補酵素としてＮＡＤ。
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属から得ら
れるＮＡＤ （Ｐ）依存性の酵素である。熱安定性が５
０°Ｃまで安定であり、補酵素としてＮＡＤ。
ＮＡＤＰの両方を利用でき、臨床用酵素として有用であ
る。
る。
第１図は、本発明により得られたグルコースデヒドロゲ
ナーゼのｐＨと活性の関係を表す。・（６，Ｃ）−８，
０）はリン酸緩衝液を、Ｑ（７゜５−９．０）はトリス
塩酸緩衝液を、■（８，５１０，５）は炭酸緩衝液を示
す。第２図は、温度と活性の関係を表す。第３図は、２
０℃でそれぞれのｐ Ｈで１６時間処理した時の１）Ｈ
と活性の関係を表す。・（４，０−６，０）は酢酸緩衝
液を、Ｏ（６，０−８，０）はリン酸緩衝液を、■（７
，５−９，０）はトリス塩酸緩衝液を、口（８，５−１
０，５）は炭酸緩衝液を示す。第４図は、１）Ｈ７，Ｏ
でそれぞれの温度で１５分処理したときの温度と活性の
関係を表す。 特許出願人 東洋紡績株式会社
ナーゼのｐＨと活性の関係を表す。・（６，Ｃ）−８，
０）はリン酸緩衝液を、Ｑ（７゜５−９．０）はトリス
塩酸緩衝液を、■（８，５１０，５）は炭酸緩衝液を示
す。第２図は、温度と活性の関係を表す。第３図は、２
０℃でそれぞれのｐ Ｈで１６時間処理した時の１）Ｈ
と活性の関係を表す。・（４，０−６，０）は酢酸緩衝
液を、Ｏ（６，０−８，０）はリン酸緩衝液を、■（７
，５−９，０）はトリス塩酸緩衝液を、口（８，５−１
０，５）は炭酸緩衝液を示す。第４図は、１）Ｈ７，Ｏ
でそれぞれの温度で１５分処理したときの温度と活性の
関係を表す。 特許出願人 東洋紡績株式会社
Claims (3)
- （１）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由
来であって、下記の反応を触媒するグルコースデヒドロ
ゲナーゼ。 β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ（Ｐ）＾＋→Ｄ−δ−グル
コノラクトン＋ＮＡＤ（Ｐ）＋Ｈ＾＋ - （２）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に
属し、下記の反応を触媒するグルコースデヒドロゲナー
ゼを生産する菌を培養し、培養物から該グルコースデヒ
ドロゲナーゼを採取することを特徴とするグルコースデ
ヒドロゲナーゼの製造法。 β−Ｄ−グルコース＋ＮＡＤ（Ｐ）＾＋→Ｄ−δ−グル
コノラクトン＋ＮＡＤ（Ｐ）＋Ｈ＾＋ - （３）グルコースデヒドロゲナーゼを生産する菌がシュ
ードモナン・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ
．）ＦＨ１２２７株（微工研菌寄第１１６１８号）であ
る請求項２記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造法
。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2256462A JP2850515B2 (ja) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
| US07/761,280 US5298411A (en) | 1990-09-25 | 1991-09-17 | Glucose dehydrogenase from pseudomonas |
| EP91116001A EP0477788B1 (en) | 1990-09-25 | 1991-09-20 | Glucose dehydrogenase and method for its production |
| DE69110386T DE69110386T2 (de) | 1990-09-25 | 1991-09-20 | Glukose Dehydrogenase und Verfahren zu deren Herstellung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2256462A JP2850515B2 (ja) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04135487A true JPH04135487A (ja) | 1992-05-08 |
| JP2850515B2 JP2850515B2 (ja) | 1999-01-27 |
Family
ID=17292976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2256462A Expired - Lifetime JP2850515B2 (ja) | 1990-09-25 | 1990-09-25 | グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5298411A (ja) |
| EP (1) | EP0477788B1 (ja) |
| JP (1) | JP2850515B2 (ja) |
| DE (1) | DE69110386T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8581859B2 (en) | 2008-12-26 | 2013-11-12 | Sony Corporation | Display device |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6455288B1 (en) * | 1993-04-08 | 2002-09-24 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphate dehydrogenases |
| JP4107386B2 (ja) | 2000-10-31 | 2008-06-25 | 広司 早出 | 新規グルコース脱水素酵素及び該脱水素酵素の製造方法 |
| US7094585B2 (en) | 2002-04-26 | 2006-08-22 | Koji Sode | Glucose dehydrogenase β-subunit and DNA encoding the same |
| JP4578240B2 (ja) * | 2002-08-09 | 2010-11-10 | コデクシス， インコーポレイテッド | ４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体の生成のための酵素的プロセス |
| JP4102138B2 (ja) * | 2002-08-30 | 2008-06-18 | 広司 早出 | グルコース脱水素酵素の製造方法 |
| CA2535147A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-05-19 | Codexis, Inc. | Improved glucose dehydrogenase polypeptides and related polynucleotides |
| JP2007502111A (ja) * | 2003-08-11 | 2007-02-08 | コデクシス， インコーポレイテッド | ４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体およびビシナルなシアノ，ヒドロキシ置換カルボン酸エステルの生成のための酵素的プロセス |
| US7669438B2 (en) * | 2005-05-13 | 2010-03-02 | Anesthetic Gas Reclamation, Llc | Method and apparatus for anesthetic gas reclamation with compression stage |
| ITMI20120918A1 (it) | 2012-05-28 | 2013-11-29 | Prodotti Chimici Alimentari | Processo per la riduzione selettiva di acidi biliari, loro sali o derivati, in sistema bifasico |
| US9528133B2 (en) | 2012-09-21 | 2016-12-27 | Synthetic Genomics, Inc. | Compositions and methods for producing chemicals and derivatives thereof |
| BR112015006255A2 (pt) | 2012-09-21 | 2017-08-22 | Synthetic Genomics Inc | Métodos para a produção de produtos químicos e derivados dos mesmos |
| CN106414753A (zh) * | 2014-03-21 | 2017-02-15 | 合成基因组股份有限公司 | 用于生产化学品及其衍生物的组合物和方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5317677B2 (ja) * | 1973-09-25 | 1978-06-09 | ||
| FR2398046A1 (fr) * | 1977-07-18 | 1979-02-16 | Inst Francais Du Petrole | Synthese enzymatique de la l-carnitine |
| DE3278334D1 (en) * | 1981-10-23 | 1988-05-19 | Genetics Int Inc | Sensor for components of a liquid mixture |
| CA1211728A (en) * | 1982-06-28 | 1986-09-23 | Exxon Research And Engineering Company | Primary and secondary alcohol dehydrogenase enzymes and use thereof |
| CA1219040A (en) * | 1983-05-05 | 1987-03-10 | Elliot V. Plotkin | Measurement of enzyme-catalysed reactions |
| JPS60114193A (ja) * | 1983-11-22 | 1985-06-20 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規なマルトースデヒドロゲナーゼおよびその製法それを用いる分析法 |
| US4877733A (en) * | 1986-05-02 | 1989-10-31 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Glucose dehydrogenase and its production |
| JPH0265787A (ja) * | 1988-08-30 | 1990-03-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ（‐）‐テトラヒドロ葉酸の製造法 |
-
1990
- 1990-09-25 JP JP2256462A patent/JP2850515B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-09-17 US US07/761,280 patent/US5298411A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-20 DE DE69110386T patent/DE69110386T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-09-20 EP EP91116001A patent/EP0477788B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8581859B2 (en) | 2008-12-26 | 2013-11-12 | Sony Corporation | Display device |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5298411A (en) | 1994-03-29 |
| EP0477788B1 (en) | 1995-06-14 |
| DE69110386D1 (de) | 1995-07-20 |
| EP0477788A1 (en) | 1992-04-01 |
| DE69110386T2 (de) | 1995-11-09 |
| JP2850515B2 (ja) | 1999-01-27 |
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