JPH104987A - ホルモン受容体組成物および方法 - Google Patents
ホルモン受容体組成物および方法Info
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- JPH104987A JPH104987A JP9076419A JP7641997A JPH104987A JP H104987 A JPH104987 A JP H104987A JP 9076419 A JP9076419 A JP 9076419A JP 7641997 A JP7641997 A JP 7641997A JP H104987 A JPH104987 A JP H104987A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なホルモン受容体蛋白質を提供するこ
と。 【解決手段】 ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホ
ルモン受容体およびエストロケン関連受容体からなる群
より選択されるホルモン受容体に特有のホルモン結合特
性および／または転写活性化特性を有する蛋白質。
と。 【解決手段】 ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホ
ルモン受容体およびエストロケン関連受容体からなる群
より選択されるホルモン受容体に特有のホルモン結合特
性および／または転写活性化特性を有する蛋白質。
Description
【０００１】発明の分野 本発明はホルモン受容体蛋白質およびそれらをコードす
る遺伝子、組換えＤＮＡ法その他の遺伝子工学的技術に
よるこれら受容体および遺伝子の修飾、ならびにこれら
受容体および遺伝子（修飾されていないものおよび修飾
されたもの）の利用に関する。より詳細には本発明はス
テロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン受容体、ならび
に関連遺伝子に関する。きわめて詳細には本発明はヒト
のグルココルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲
状腺ホルモンの受容体、ならびにそれらに対する遺伝子
に関する。さらに本発明は受容体ＤＮＡクローンにより
コードされるホルモン受容体蛋白質の機能性を測定する
ための新規なバイオアッセイ系、および受容体蛋白質と
複合体を形成したホルモンによってその転写が活性化さ
れる遺伝子の発現を誘導および制御するための新規な方
法に関する。
る遺伝子、組換えＤＮＡ法その他の遺伝子工学的技術に
よるこれら受容体および遺伝子の修飾、ならびにこれら
受容体および遺伝子（修飾されていないものおよび修飾
されたもの）の利用に関する。より詳細には本発明はス
テロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン受容体、ならび
に関連遺伝子に関する。きわめて詳細には本発明はヒト
のグルココルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲
状腺ホルモンの受容体、ならびにそれらに対する遺伝子
に関する。さらに本発明は受容体ＤＮＡクローンにより
コードされるホルモン受容体蛋白質の機能性を測定する
ための新規なバイオアッセイ系、および受容体蛋白質と
複合体を形成したホルモンによってその転写が活性化さ
れる遺伝子の発現を誘導および制御するための新規な方
法に関する。
【０００２】発明の背景 ヒトその他の哺乳動物、鳥類および魚類を含む複雑な真
核生物における発育および恒常性の転写調節は、ステロ
イドホルモンおよび甲状腺ホルモンを含む種々の調節物
質によって制御されている。これらのホルモンは系統発
生的に異なる生物における発育および分化に強い影響を
与え、それらの作用はそれらと受容体と呼ばれる特異的
な高親和性結合蛋白質との相互作用の結合として媒介さ
れる。一般にジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら（１９７
２）；ゴルスキー（Ｇｏｒｓｋｉ）ら（１９７６）；ヤ
マモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９７６）；オマレイ
（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ）ら（１９６９）；ヘイワード（Ｈ
ａｙｗａｒｄ）ら（１９８２）；およびアスバーナー
（Ａｓｂｕｒｎｅｒ）ら（１９７８）を参照されたい。
それぞれ幾つかの群の同系ステロイドホルモン（すなわ
ちエストロゲン（エストロゲン受容体）、ゲスターゲン
（プロゲステロン受容体）、グルココルチコイド（グル
ココルチコイド受容体）、アンドロゲン（アンドロゲン
受容体）、アルドステロン（ミネラルコルチコイド受容
体）のうちの１種、または同系甲状腺ホルモン（甲状腺
ホルモン受容体）に対して特に特異的である受容体蛋白
質が知られており、組織特異的な様式で分布している。
ホルビッツら（Ｈｏｒｗｉｔｚ）ら（１９７８）および
パルミテール（Ｐａｍｉｔｅｒ）ら（１９７６）を参照
されたい。ホルモンと受容体の相互作用については、ス
テロイドホルモンまたは甲状腺ホルモンが拡散の促進に
より細胞に入り、その特異的受容体蛋白質に結合し、蛋
白質のアロステリック変化を開始することが知られてい
る。この変化の結果、ホルモン／受容体−複合体はクロ
マチン上の特定の特異的部位に高い親和性で結合するこ
とができる。ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９７
２）およびジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら（１９６８）
を参照されたい。ステロイドホルモンおよび甲状腺ホル
モンの一次効果の多くが、特異的細胞型における一組の
遺伝子の転写の増大を伴うことも知られている。ペテル
コフスキー（Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ）ら（１９６８）
およびマックナイト（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ）ら（１９６
８）を参照されたい。さらにステロイドホルモンおよび
甲状腺ホルモンに応答する（クロマチンとホルモン受容
体／ホルモン−複合体との相互作用により）遺伝子の転
写の可活性化（結果的に発現の増大）は複合体が遺伝子
に付随するエンハンサーに結合することによって行われ
ることも証明されている（ホーリー（Ｋｈｏｕｒｙ）
ら、１９８３）を参照されたい。いずれにしろ多数のス
テロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン応答性転写制御
ユニット（それらのうちあるものはエンハンサーを含む
ことが示されている）が同定されている。これらには下
記のものが含まれる。マウス乳腺腫瘍ウィルス５’側長
鎖末端反復（ＭＴＶ ＬＴＲ）：グルココルチコイド、
アルドステロンおよびアンドロゲンホルモンに応答；哺
乳動物成長ホルモン遺伝子に対する転写制御遺伝子：グ
ルココルチコイド、エストロゲンおよび甲状腺ホルモン
に応答；哺乳動物プロラクチン遺伝子およびプロゲステ
ロン受容体遺伝子に対する転写制御ユニット：エストロ
ゲンに応答；鳥類卵アルブミン遺伝子に対する転写制御
ユニット：プロゲステロンに応答；哺乳動物メタロチオ
ネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）遺伝子転写
制御ユニット：グルココルチコイドに応答；ならびに哺
乳動物肝α２ｕ−グロブリン遺伝子転写制御ユニット：
アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモンおよびグ
ルココルチコイドに応答。（本明細書の実験の部Ｉの序
文を参照されたい）。ステロイドホルモンおよび甲状腺
ホルモン受容体の十分な理解およびいっそうの実用に対
する障害は、これらの特性を調べるのに十分な量および
十分な程度に純粋な形で入手できないことであった。こ
れはそれらをコードするＤＮＡ遺伝子セグメントについ
ても同じであった。これらのＤＮＡセグメントを入手で
きないため、受容体コード遺伝子のインビトロ操作およ
びインビボ発現が妨げられ、結果的にこれらの操作およ
び発現が与えられる知見が得られなかった。 他の刊行物 本明細書に示される情報のうち若干は公表されている。
実験の部Ｉに示される研究は下記に公表されている。Ｈ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ，Ｃ．，Ｏｎｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｃｅｒｅｌｌｉ，Ｇ．，
Ｏｒｏ，Ａ．，Ｌｅｂｏ，Ｒ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，
Ｅ．Ｂ．，Ｒｏｓｅｎｆｅｉｄ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｅ
ｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，“機能性ヒトグルココルチコイド
受容体ｃＤＮＡの一次構造と発現”Ｎａｔｕｒｅ，（Ｌ
ｏｎｄｏｎ），３１８：６３５−６４１（Ｄｅｃｅｍｂ
ｅｒ，１９８５）。実験の部ＩＩに示される研究は下記
に公表されている。Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．，Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ，Ｍ．
Ｇ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，“ヒトグルココ
ルチコイド受容体の機能区”、Ｃｅｌｌ，４６：６４５
−６５２（Ａｕｇｕｅｔ，１９８６）。実験の部ＩＩＩ
に示される研究は下記に公表されている。Ｗｅｉｎｂｅ
ｒｇｅｒ，Ｃ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｏｎ
ｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｌｅｂｏ，Ｒ．，Ｇｒｕｏｌ，Ｄ．
Ｊ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，“ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子は
甲状腺ホルモンをコードする“Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ
ｏｎ），３２４：６４１−６４６（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，
１９８６）。実験の部ＩＶに示される研究は下記に公表
されている。Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．，Ｗｅｉｎｂｅｒ
ｇｅｒ，Ｃ．，Ｃｅｒｅｌｌｉ，Ｇ．，Ｇｌａｓｅｒ，
Ｔ．Ｍ．，Ｈａｎｄｅｌｉｎ，Ｂ．Ｌ．，Ｈｏｕｓｅｍ
ａｎ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄＥｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，“ヒト
ミネラルコルチコイド受容体相補的ＤＮＡのクローニン
グ：グルココルチコイド受容体との構造的および機能的
関連”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：２６８−２７５（Ｊｕ
ｌｙ，１９８７）。実験の部Ｖに示される研究は以下の
とおり印刷中である。Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．，Ｙａｎ
ｇ，Ｎ．，Ｓｅｇｕｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，
Ｒ．Ｍ．，“新しい一群のステロイドホルモン受容体の
同定”。実験の部ＶＩに示される研究は以下のとおり印
刷中である。Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．，Ｆｒａｎｃｏ，
Ｒ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ａｌｂｅｒｔ，
Ｖ．Ｒ．，Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ
ｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，“ラット成長ホルモン遺伝子のｃ
−ｅｒｂ−Ａ部位は甲状腺ホルモンによるトランザクシ
ョンを媒介する”。実験の部ＶＩＩに示される研究は下
記に公表されている。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃａｔｈｅｒ
ｉｎｅ Ｃ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃａｒｙ，Ｌｅ
ｂｏ，Ｒｏｇｅｒ，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｒｏｎａｉｄ
Ｍ．，“哺乳動物中枢神経系に発現される新規な甲状
腺ホルモン受容体の同定”、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：
１６１０−１６１４（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９８
７）。
核生物における発育および恒常性の転写調節は、ステロ
イドホルモンおよび甲状腺ホルモンを含む種々の調節物
質によって制御されている。これらのホルモンは系統発
生的に異なる生物における発育および分化に強い影響を
与え、それらの作用はそれらと受容体と呼ばれる特異的
な高親和性結合蛋白質との相互作用の結合として媒介さ
れる。一般にジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら（１９７
２）；ゴルスキー（Ｇｏｒｓｋｉ）ら（１９７６）；ヤ
マモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９７６）；オマレイ
（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ）ら（１９６９）；ヘイワード（Ｈ
ａｙｗａｒｄ）ら（１９８２）；およびアスバーナー
（Ａｓｂｕｒｎｅｒ）ら（１９７８）を参照されたい。
それぞれ幾つかの群の同系ステロイドホルモン（すなわ
ちエストロゲン（エストロゲン受容体）、ゲスターゲン
（プロゲステロン受容体）、グルココルチコイド（グル
ココルチコイド受容体）、アンドロゲン（アンドロゲン
受容体）、アルドステロン（ミネラルコルチコイド受容
体）のうちの１種、または同系甲状腺ホルモン（甲状腺
ホルモン受容体）に対して特に特異的である受容体蛋白
質が知られており、組織特異的な様式で分布している。
ホルビッツら（Ｈｏｒｗｉｔｚ）ら（１９７８）および
パルミテール（Ｐａｍｉｔｅｒ）ら（１９７６）を参照
されたい。ホルモンと受容体の相互作用については、ス
テロイドホルモンまたは甲状腺ホルモンが拡散の促進に
より細胞に入り、その特異的受容体蛋白質に結合し、蛋
白質のアロステリック変化を開始することが知られてい
る。この変化の結果、ホルモン／受容体−複合体はクロ
マチン上の特定の特異的部位に高い親和性で結合するこ
とができる。ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９７
２）およびジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら（１９６８）
を参照されたい。ステロイドホルモンおよび甲状腺ホル
モンの一次効果の多くが、特異的細胞型における一組の
遺伝子の転写の増大を伴うことも知られている。ペテル
コフスキー（Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ）ら（１９６８）
およびマックナイト（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ）ら（１９６
８）を参照されたい。さらにステロイドホルモンおよび
甲状腺ホルモンに応答する（クロマチンとホルモン受容
体／ホルモン−複合体との相互作用により）遺伝子の転
写の可活性化（結果的に発現の増大）は複合体が遺伝子
に付随するエンハンサーに結合することによって行われ
ることも証明されている（ホーリー（Ｋｈｏｕｒｙ）
ら、１９８３）を参照されたい。いずれにしろ多数のス
テロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン応答性転写制御
ユニット（それらのうちあるものはエンハンサーを含む
ことが示されている）が同定されている。これらには下
記のものが含まれる。マウス乳腺腫瘍ウィルス５’側長
鎖末端反復（ＭＴＶ ＬＴＲ）：グルココルチコイド、
アルドステロンおよびアンドロゲンホルモンに応答；哺
乳動物成長ホルモン遺伝子に対する転写制御遺伝子：グ
ルココルチコイド、エストロゲンおよび甲状腺ホルモン
に応答；哺乳動物プロラクチン遺伝子およびプロゲステ
ロン受容体遺伝子に対する転写制御ユニット：エストロ
ゲンに応答；鳥類卵アルブミン遺伝子に対する転写制御
ユニット：プロゲステロンに応答；哺乳動物メタロチオ
ネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）遺伝子転写
制御ユニット：グルココルチコイドに応答；ならびに哺
乳動物肝α２ｕ−グロブリン遺伝子転写制御ユニット：
アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモンおよびグ
ルココルチコイドに応答。（本明細書の実験の部Ｉの序
文を参照されたい）。ステロイドホルモンおよび甲状腺
ホルモン受容体の十分な理解およびいっそうの実用に対
する障害は、これらの特性を調べるのに十分な量および
十分な程度に純粋な形で入手できないことであった。こ
れはそれらをコードするＤＮＡ遺伝子セグメントについ
ても同じであった。これらのＤＮＡセグメントを入手で
きないため、受容体コード遺伝子のインビトロ操作およ
びインビボ発現が妨げられ、結果的にこれらの操作およ
び発現が与えられる知見が得られなかった。 他の刊行物 本明細書に示される情報のうち若干は公表されている。
実験の部Ｉに示される研究は下記に公表されている。Ｈ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ，Ｃ．，Ｏｎｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｃｅｒｅｌｌｉ，Ｇ．，
Ｏｒｏ，Ａ．，Ｌｅｂｏ，Ｒ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，
Ｅ．Ｂ．，Ｒｏｓｅｎｆｅｉｄ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ Ｅ
ｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，“機能性ヒトグルココルチコイド
受容体ｃＤＮＡの一次構造と発現”Ｎａｔｕｒｅ，（Ｌ
ｏｎｄｏｎ），３１８：６３５−６４１（Ｄｅｃｅｍｂ
ｅｒ，１９８５）。実験の部ＩＩに示される研究は下記
に公表されている。Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．，Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ，Ｍ．
Ｇ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，“ヒトグルココ
ルチコイド受容体の機能区”、Ｃｅｌｌ，４６：６４５
−６５２（Ａｕｇｕｅｔ，１９８６）。実験の部ＩＩＩ
に示される研究は下記に公表されている。Ｗｅｉｎｂｅ
ｒｇｅｒ，Ｃ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｏｎ
ｇ，Ｅ．Ｓ．，Ｌｅｂｏ，Ｒ．，Ｇｒｕｏｌ，Ｄ．
Ｊ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，“ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子は
甲状腺ホルモンをコードする“Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ
ｏｎ），３２４：６４１−６４６（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，
１９８６）。実験の部ＩＶに示される研究は下記に公表
されている。Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．，Ｗｅｉｎｂｅｒ
ｇｅｒ，Ｃ．，Ｃｅｒｅｌｌｉ，Ｇ．，Ｇｌａｓｅｒ，
Ｔ．Ｍ．，Ｈａｎｄｅｌｉｎ，Ｂ．Ｌ．，Ｈｏｕｓｅｍ
ａｎ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄＥｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，“ヒト
ミネラルコルチコイド受容体相補的ＤＮＡのクローニン
グ：グルココルチコイド受容体との構造的および機能的
関連”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：２６８−２７５（Ｊｕ
ｌｙ，１９８７）。実験の部Ｖに示される研究は以下の
とおり印刷中である。Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．，Ｙａｎ
ｇ，Ｎ．，Ｓｅｇｕｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，
Ｒ．Ｍ．，“新しい一群のステロイドホルモン受容体の
同定”。実験の部ＶＩに示される研究は以下のとおり印
刷中である。Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．，Ｆｒａｎｃｏ，
Ｒ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ａｌｂｅｒｔ，
Ｖ．Ｒ．，Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎ
ｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，“ラット成長ホルモン遺伝子のｃ
−ｅｒｂ−Ａ部位は甲状腺ホルモンによるトランザクシ
ョンを媒介する”。実験の部ＶＩＩに示される研究は下
記に公表されている。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃａｔｈｅｒ
ｉｎｅ Ｃ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃａｒｙ，Ｌｅ
ｂｏ，Ｒｏｇｅｒ，ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｒｏｎａｉｄ
Ｍ．，“哺乳動物中枢神経系に発現される新規な甲状
腺ホルモン受容体の同定”、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：
１６１０−１６１４（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９８
７）。
【０００３】定 義 本明細書および請求の範囲においては、ここで以下のと
おり明確に定義された技術的な句および用語が用いられ
るであろう。ここで用いるＧＲはグルココルチコイド受
容体を意味する。開示されたＤＮＡ ｈＧＲがグルココ
ルチコイド受容体ＧＲをコードする。ここで用いるＭＲ
はミネラルコルチコイド受容体を意味する。開示された
ＤＮＡ ｈＭＲがミネラルコルチコイド受容体ＭＲをコ
ードする。ここで用いるＴＲは甲状腺ホルモン受容体を
意味する。開示されたヒトＤＮＡｃ−ｅｒｂ−Ａ，ｈＥ
ＲＢＡ８．７およびｈＦＡ８、ならびにラットｒｂｅＡ
１２がすべて甲状腺ホルモン受容体をコードする。ここ
で用いるｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２はエストロゲン関
連受容体蛋白質をコードするＤＮＡを表わす。ここで用
いるグルココルチコイドホルモンにはコルチゾル、ヒド
ロコルチゾン（ＨＣ）、およびコルチコステロン（Ｃ
Ｓ）が含まれ、その同族体にはデキサメタゾン（Ｄｅ
ｘ）、デオキシコルチコステロン（Ｄｏｃ）およびトリ
アムシノロンアセトニドが含まれる。ここで用いるミネ
ラルコルチコイドにはアルドステロン（Ａｌｄｏ）、な
らびにコルチコステロン（ＣＳ）、およびデオキシコル
チコステロン（Ｄｏｃ）が含まれる。ここで用いる甲状
腺ホルモンにはチロキシン（Ｔ４）およびトリヨードチ
ロニン（Ｔ３）が含まれる。ここで用いるエストロゲン
にはエストラジオール−１７ベータが含まれ、その同族
体にはジエチルスチルベストロールが含まれる。ここで
用いるゲスターゲンにはプロゲステロン（Ｐｒｏｇ）が
含まれ、その同族体にはプロメゲストンが含まれる。こ
こで用いるアンドロゲンにはジヒドロキジテストステロ
ンが含まれ、その同族体にはメチルトリエノロンが含ま
れる。ここで用いるＭＴＶは乳腺腫瘍ウィルスを意味
し；ＭＭＴＶはマウス乳腺腫瘍ウィルスを意味する。こ
こで用いるＲＳＶはラウス肉腫ウィルスを意味し；ＳＶ
はサルウィルスを意味する。ここで用いるＣＡＴはクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味す
る。ここで用いるＣＯＳはＴ抗原（Ｔａｇ）を発現する
サル腎細胞を意味する。グルッツマン，セル，２３：１
７５（１９８１）を参照されたい。ＣＯＳ細胞は本発明
のバイオアッセイ系に有用である。ここで用いるＣＶ−
１は“ＣＶ−１”と呼ばれる細胞系に由来するマウス腎
細胞を意味する。ＣＶ−１はＣＯＳの親細胞系である。
ＳＶ４０ Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現すべく形質転換され
たＣＯＳ細胞と異なり、ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現し
ない。ＣＶ−１細胞はＣＯＳ細胞と同様に本発明のバイ
オアッセイ系および方法に有用である。ここで、ある蛋
白質が“ホルモン受容体に特有のホルモン結合性”をも
つと述べた場合、これはある種に由来するホルモンまた
はその合成同族体とその種に由来する同系の受容体との
結合親和性に関する標準アッセイ法のいずれにおいて
も、ホルモンまたはその合成同族体に対する当該蛋白質
の親和性が当該ホルモンまたはその同族体とその種に由
来する同系の受容体との親和性の少なくとも約１０％で
あることを意味する。ここで、ある蛋白質（Ｘ）の転写
活性化特性が、あるホルモン受容体（Ｒ）の特性に“特
有”であると述べた場合、これは下記を意味する。すな
わち、たとえば本発明の”シス−トランス”受容体機能
性バイオアッセイ系（発明の記述の項を参照されたい；
またこのアッセイ法をｈＧＲの機能性発現の証明に用い
ることに関する実験の部ＩＩ、特に第ＩＩ−１図、なら
びに“結果”および“実験法”と表示した小区分も参照
されたい）などのアッセイ法において試験する場合、遺
伝子（Ｇ）（その転写はホルモンまたはホルモン同族体
と複合体形成した受容体の結合によって活性化される）
からの発現率が、受容体（Ｒ）の代わりに蛋白質（Ｘ）
を用いた場合、受容体（Ｒ）自体が用いられた場合に示
されるものの少なくとも約１０％である。ただし、“受
容体（Ｒ）”および“蛋白質（Ｘ）”いずれの場合も、
関与する細胞は同一濃度のホルモンまたはその同族体中
に装入される。ここで、ある蛋白質が“あるホルモン受
容体に特有のホルモン結合特性または転写活性化特性”
をもつと述べた場合、これはそのホルモン受容体自体が
この定義に包含されることを意味する。ここで、ある遺
伝子（Ｇ）の転写が“ホルモン（Ｈ）またはホルモン同
族体（ａＨ）によって実質的に活性化される”と述べた
場合、これは遺伝子（Ｇ）が位置する付近のクロマチン
へのホルモン／受容体［（Ｈ）または（ａＨ）／（Ｒ）
または（ｒ）］複合体の結合によって遺伝子（Ｇ）の転
写が誘導されることを意味する。この定義において
（Ｒ）は“野生型”または未変化のホルモン受容体を表
わすものとする。後者の（ｒ）という表示は、機能性の
“工学的に処理された”もしくは“修飾された”受容体
蛋白質、または“野生型”受容体遺伝子のｍＲＮＡ変異
型によりコードされた蛋白質を意味するものとする。こ
こで用いるＧＲＥはグルココルチコイド応答要素を意味
し、ＴＲＥは甲状腺ホルモン受容体エンハンサー様ＤＮ
Ａ配列を意味する。ＧＲＥはＧＲと相互作用によりグル
ココルチコイド応答性を与えるエンハンサー様ＤＮＡ配
列である。ペイバーら、セル，３５：３８１（１９８
３）およびシーデライトら、ネイチャー，３０４：７４
９（１９８３）を参照されたい。ＴＲＥはそれらがＴＲ
との相互作用により甲状腺ホルモン応答性を与える点以
外はＧＲＥと同様である。ここで用いる“転写制御ユニ
ット”、“転写制御要素”、“ホルモン応答性プロモー
ター／エンハンサー要素”および“転写剌激作用を媒介
するＤＮＡ配列”という語は同じことを意味し、入れ換
えて用いることができる。ここで“作用性レポーター遺
伝子に機能性結合した作用性ホルモン応答性フロモータ
ー／エンハンサー要素”という句において“作用性（ｏ
ｐｅｒａｔｉｖｅ）”という語はそれらのＤＮＡ配列
（“ホルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素”
および“レポーター遺伝子”という語で表わされる）が
作用性であること、すなわちそれらの意図する目的に対
して作用することを意味し；“機能性（ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌｌｙ）”という語はそれら２セグメントが結合し
たのちホルモン／受容体−複合体によって適宜活性化さ
れた際に、“ホルモン応答性プロモーター”が“作動開
始した（ｔｕｒｎｅｄｏｎ）”、すなわち活性化された
結果、レポーター遺伝子が発現することを意味する。こ
こで用いる“受容体陰性”という語は細胞中に受容体が
検出されないか、または検出されたとしてもごく少量
（すなわちかろうじて検出できる量）の受容体が存在す
るにすぎないことを意味する。ここで用いる本発明のＤ
ＮＡの“変異体”とは“野生型”のまたは修飾されてい
ない配列と異なるべく遺伝子工学的に処理された本発明
のＤＮＡを意味する。この種の遺伝子工学的処理には野
性型配列中への新たなヌクレオチドの挿入、野生型配列
からのヌクレオチドの失欠、または野生型配列における
ヌクレオチドの置換が含まれる。本明細書および請求の
範囲において用いられる“実質的な配列相同”という語
は、ここに開示され、特許請求された実際の配列からの
配列の変動がごくわずかであるＤＮＡまたはＲＮＡ配列
は請求の範囲に示された範囲内に含まれることを意味す
る。ここに示される各種アミノ酸配列を構成するアミノ
酸は下記の３文字または１文字の略語によって表示でき
る。 ここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレ
オチドは当技術分野でルーチンに用いられている通常の
１文字表示（Ａ，Ｇ，Ｔ，ＣまたはＵ）による。本明細
書の本文および請求の範囲においてギリシャ文字につい
ての言及はアルファ、ベータなどと記載される。図面に
おいては時には対応するギリシャ文字記号が用いられ
る。発現プラスミドｐＧＥＭ３はプロメガ・バイオテ
ク、５３７１１ワイオミング州マジソン，サウス・フィ
ッシュ・ハッチェリー・ロード２８００から市販されて
いる。寄 託 プラスミドｐＲＳｈＧＲ−アルファ、ｐＲＳｈＭＲ、ｐ
ｅＡ１０１、ｒｂｅＡ１２およびＧＭＣＡＴ（これらは
すべて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１中）、プラス
ミドｐＥ４およびｐＨＫＡ（これらは両者とも大腸菌Ｄ
Ｈ５中）、ならびにプラスミドｐｈＨ３，ｐｈＥＲＢＡ
８．７およびｐｈＦＡ８はアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション、米国マリーランド州ロックビル
（ＡＴＣＣ）に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認
に関するブタペスト条約、およびこの条約に基づく規則
の条件下に寄託されている。上記プラスミドの試料は上
記の条約および規則の条件下で、または米国そのほか本
出願もしくは本出願の優先権を主張する出願がなされる
か、もしくはその出願に対する特許権が付与される他の
すべての国の特許法および規則に従ってそれらを受ける
べく合法的権利を有する企業事務所および他の個人が現
在および将来入手できる。上記１０種の寄託物に対する
ＡＴＣＣ寄託番号は下記のとおりである。
おり明確に定義された技術的な句および用語が用いられ
るであろう。ここで用いるＧＲはグルココルチコイド受
容体を意味する。開示されたＤＮＡ ｈＧＲがグルココ
ルチコイド受容体ＧＲをコードする。ここで用いるＭＲ
はミネラルコルチコイド受容体を意味する。開示された
ＤＮＡ ｈＭＲがミネラルコルチコイド受容体ＭＲをコ
ードする。ここで用いるＴＲは甲状腺ホルモン受容体を
意味する。開示されたヒトＤＮＡｃ−ｅｒｂ−Ａ，ｈＥ
ＲＢＡ８．７およびｈＦＡ８、ならびにラットｒｂｅＡ
１２がすべて甲状腺ホルモン受容体をコードする。ここ
で用いるｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２はエストロゲン関
連受容体蛋白質をコードするＤＮＡを表わす。ここで用
いるグルココルチコイドホルモンにはコルチゾル、ヒド
ロコルチゾン（ＨＣ）、およびコルチコステロン（Ｃ
Ｓ）が含まれ、その同族体にはデキサメタゾン（Ｄｅ
ｘ）、デオキシコルチコステロン（Ｄｏｃ）およびトリ
アムシノロンアセトニドが含まれる。ここで用いるミネ
ラルコルチコイドにはアルドステロン（Ａｌｄｏ）、な
らびにコルチコステロン（ＣＳ）、およびデオキシコル
チコステロン（Ｄｏｃ）が含まれる。ここで用いる甲状
腺ホルモンにはチロキシン（Ｔ４）およびトリヨードチ
ロニン（Ｔ３）が含まれる。ここで用いるエストロゲン
にはエストラジオール−１７ベータが含まれ、その同族
体にはジエチルスチルベストロールが含まれる。ここで
用いるゲスターゲンにはプロゲステロン（Ｐｒｏｇ）が
含まれ、その同族体にはプロメゲストンが含まれる。こ
こで用いるアンドロゲンにはジヒドロキジテストステロ
ンが含まれ、その同族体にはメチルトリエノロンが含ま
れる。ここで用いるＭＴＶは乳腺腫瘍ウィルスを意味
し；ＭＭＴＶはマウス乳腺腫瘍ウィルスを意味する。こ
こで用いるＲＳＶはラウス肉腫ウィルスを意味し；ＳＶ
はサルウィルスを意味する。ここで用いるＣＡＴはクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味す
る。ここで用いるＣＯＳはＴ抗原（Ｔａｇ）を発現する
サル腎細胞を意味する。グルッツマン，セル，２３：１
７５（１９８１）を参照されたい。ＣＯＳ細胞は本発明
のバイオアッセイ系に有用である。ここで用いるＣＶ−
１は“ＣＶ−１”と呼ばれる細胞系に由来するマウス腎
細胞を意味する。ＣＶ−１はＣＯＳの親細胞系である。
ＳＶ４０ Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現すべく形質転換され
たＣＯＳ細胞と異なり、ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現し
ない。ＣＶ−１細胞はＣＯＳ細胞と同様に本発明のバイ
オアッセイ系および方法に有用である。ここで、ある蛋
白質が“ホルモン受容体に特有のホルモン結合性”をも
つと述べた場合、これはある種に由来するホルモンまた
はその合成同族体とその種に由来する同系の受容体との
結合親和性に関する標準アッセイ法のいずれにおいて
も、ホルモンまたはその合成同族体に対する当該蛋白質
の親和性が当該ホルモンまたはその同族体とその種に由
来する同系の受容体との親和性の少なくとも約１０％で
あることを意味する。ここで、ある蛋白質（Ｘ）の転写
活性化特性が、あるホルモン受容体（Ｒ）の特性に“特
有”であると述べた場合、これは下記を意味する。すな
わち、たとえば本発明の”シス−トランス”受容体機能
性バイオアッセイ系（発明の記述の項を参照されたい；
またこのアッセイ法をｈＧＲの機能性発現の証明に用い
ることに関する実験の部ＩＩ、特に第ＩＩ−１図、なら
びに“結果”および“実験法”と表示した小区分も参照
されたい）などのアッセイ法において試験する場合、遺
伝子（Ｇ）（その転写はホルモンまたはホルモン同族体
と複合体形成した受容体の結合によって活性化される）
からの発現率が、受容体（Ｒ）の代わりに蛋白質（Ｘ）
を用いた場合、受容体（Ｒ）自体が用いられた場合に示
されるものの少なくとも約１０％である。ただし、“受
容体（Ｒ）”および“蛋白質（Ｘ）”いずれの場合も、
関与する細胞は同一濃度のホルモンまたはその同族体中
に装入される。ここで、ある蛋白質が“あるホルモン受
容体に特有のホルモン結合特性または転写活性化特性”
をもつと述べた場合、これはそのホルモン受容体自体が
この定義に包含されることを意味する。ここで、ある遺
伝子（Ｇ）の転写が“ホルモン（Ｈ）またはホルモン同
族体（ａＨ）によって実質的に活性化される”と述べた
場合、これは遺伝子（Ｇ）が位置する付近のクロマチン
へのホルモン／受容体［（Ｈ）または（ａＨ）／（Ｒ）
または（ｒ）］複合体の結合によって遺伝子（Ｇ）の転
写が誘導されることを意味する。この定義において
（Ｒ）は“野生型”または未変化のホルモン受容体を表
わすものとする。後者の（ｒ）という表示は、機能性の
“工学的に処理された”もしくは“修飾された”受容体
蛋白質、または“野生型”受容体遺伝子のｍＲＮＡ変異
型によりコードされた蛋白質を意味するものとする。こ
こで用いるＧＲＥはグルココルチコイド応答要素を意味
し、ＴＲＥは甲状腺ホルモン受容体エンハンサー様ＤＮ
Ａ配列を意味する。ＧＲＥはＧＲと相互作用によりグル
ココルチコイド応答性を与えるエンハンサー様ＤＮＡ配
列である。ペイバーら、セル，３５：３８１（１９８
３）およびシーデライトら、ネイチャー，３０４：７４
９（１９８３）を参照されたい。ＴＲＥはそれらがＴＲ
との相互作用により甲状腺ホルモン応答性を与える点以
外はＧＲＥと同様である。ここで用いる“転写制御ユニ
ット”、“転写制御要素”、“ホルモン応答性プロモー
ター／エンハンサー要素”および“転写剌激作用を媒介
するＤＮＡ配列”という語は同じことを意味し、入れ換
えて用いることができる。ここで“作用性レポーター遺
伝子に機能性結合した作用性ホルモン応答性フロモータ
ー／エンハンサー要素”という句において“作用性（ｏ
ｐｅｒａｔｉｖｅ）”という語はそれらのＤＮＡ配列
（“ホルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素”
および“レポーター遺伝子”という語で表わされる）が
作用性であること、すなわちそれらの意図する目的に対
して作用することを意味し；“機能性（ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌｌｙ）”という語はそれら２セグメントが結合し
たのちホルモン／受容体−複合体によって適宜活性化さ
れた際に、“ホルモン応答性プロモーター”が“作動開
始した（ｔｕｒｎｅｄｏｎ）”、すなわち活性化された
結果、レポーター遺伝子が発現することを意味する。こ
こで用いる“受容体陰性”という語は細胞中に受容体が
検出されないか、または検出されたとしてもごく少量
（すなわちかろうじて検出できる量）の受容体が存在す
るにすぎないことを意味する。ここで用いる本発明のＤ
ＮＡの“変異体”とは“野生型”のまたは修飾されてい
ない配列と異なるべく遺伝子工学的に処理された本発明
のＤＮＡを意味する。この種の遺伝子工学的処理には野
性型配列中への新たなヌクレオチドの挿入、野生型配列
からのヌクレオチドの失欠、または野生型配列における
ヌクレオチドの置換が含まれる。本明細書および請求の
範囲において用いられる“実質的な配列相同”という語
は、ここに開示され、特許請求された実際の配列からの
配列の変動がごくわずかであるＤＮＡまたはＲＮＡ配列
は請求の範囲に示された範囲内に含まれることを意味す
る。ここに示される各種アミノ酸配列を構成するアミノ
酸は下記の３文字または１文字の略語によって表示でき
る。 ここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレ
オチドは当技術分野でルーチンに用いられている通常の
１文字表示（Ａ，Ｇ，Ｔ，ＣまたはＵ）による。本明細
書の本文および請求の範囲においてギリシャ文字につい
ての言及はアルファ、ベータなどと記載される。図面に
おいては時には対応するギリシャ文字記号が用いられ
る。発現プラスミドｐＧＥＭ３はプロメガ・バイオテ
ク、５３７１１ワイオミング州マジソン，サウス・フィ
ッシュ・ハッチェリー・ロード２８００から市販されて
いる。寄 託 プラスミドｐＲＳｈＧＲ−アルファ、ｐＲＳｈＭＲ、ｐ
ｅＡ１０１、ｒｂｅＡ１２およびＧＭＣＡＴ（これらは
すべて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１中）、プラス
ミドｐＥ４およびｐＨＫＡ（これらは両者とも大腸菌Ｄ
Ｈ５中）、ならびにプラスミドｐｈＨ３，ｐｈＥＲＢＡ
８．７およびｐｈＦＡ８はアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション、米国マリーランド州ロックビル
（ＡＴＣＣ）に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認
に関するブタペスト条約、およびこの条約に基づく規則
の条件下に寄託されている。上記プラスミドの試料は上
記の条約および規則の条件下で、または米国そのほか本
出願もしくは本出願の優先権を主張する出願がなされる
か、もしくはその出願に対する特許権が付与される他の
すべての国の特許法および規則に従ってそれらを受ける
べく合法的権利を有する企業事務所および他の個人が現
在および将来入手できる。上記１０種の寄託物に対する
ＡＴＣＣ寄託番号は下記のとおりである。
【０００４】発明の要約 一観点においては本発明は、セグメントのプラスまたは
センスストランドが、グルココルチコイド受容体、ミネ
ラロコルチコイド受容体および甲状腺ホルモン受容体よ
りなる群から選ばれるホルモン受容体蛋白質に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質の一次配列をコードするトリプレットの配列を含
む二重鎖ＤＮＡセグメントからなる。本発明のこの観点
によれば、この二重鎖ＤＮＡセグメントは受容体蛋白質
中に発現されうるものである。他の観点においては本発
明は、本発明による二重鎖ＤＮＡのセンスストランドで
ある一重鎖ＤＮＡ、および本発明の二重鎖ＤＮＡの転写
により形成されたＲＮＡからなる。他の観点においては
本発明は、本発明のＤＮＡの実例であるＤＮＡを含むプ
ラスミドからなる。これらのプラスミドはアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに特許の目的で寄託
されている。本発明のプラスミドには下記の群から選ば
れるプラスミドが含まれる。ｐＲＳｈＧＲ−アルファ
（ＡＴＣＣ＃６７２００），ｐＲＳｈＭＲ（ＡＴＣＣ＃
６７２０１），ｐｅＡ１０１（ＡＴＣＣ＃６７２４
４），ｒｂｅＡ１２（ＡＴＣＣ＃６７２８１），ＧＭＣ
ＡＴ（ＡＴＣＣ＃６７２８２），ｐＥ４（ＡＴＣＣ＃６
７３０９），ｐＨＫＡ（ＡＴＣＣ＃６７３１０），ｐｈ
ＥＲＢＡ８．７（ＡＴＣＣ＃４０３７４），ｐｈＦＡ８
（ＡＴＣＣ＃４０３７２），およびｐｈＨ３（ＡＴＣＣ
＃４０３７３）。さらに他の観点においては本発明は、
本発明のＤＮＡにより形質転換された細胞、好ましくは
哺乳動物細胞からなる。本発明のこの観点によれば、形
質転換を行うＤＮＡはこの細胞において発現可能であ
り、これによりこのＤＮＡがコードする受容体の量が細
胞中において増加する。さらに本発明は、本発明のＤＮ
Ａにより形質転換された、酵母細胞および細菌細胞、た
とえば大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を
含む細胞からなる。さらに本発明は、本発明のＤＮＡの
発現、または本発明のｍＲＮＡの翻訳によって形成され
た新規な受容体からなる。本発明のこの観点によれば、
受容体は“修飾されていない”本発明のＤＮＡおよびｍ
ＲＮＡの蛋白質生成物であるか、または受容体ＤＮＡ配
列における工学的変異の結果、対応する天然の“野生
型”もしくは同系の受容体（新規受容体ときわめて大幅
なアミノ酸配列相同を有する既知配列の天然受容体）と
１もしくは２以上のアミノ酸配列の相違を有する、修飾
された、もしくは遺伝子工学的に処理された蛋白質生成
物であろう。好ましくはこれらの受容体は“修飾されて
いないもの”または“工学的に処理されたもの”のいず
れであっても、対応する天然の同系受容体のホルモン結
合活性の少なくとも１０％、および／または転写活性化
活性の少なくとも１０％を有するであろう。本発明はま
た本発明のＤＮＡ（またはｍＲＮＡ）から得たホルモン
受容体蛋白質の機能性を測定するための新規方法からな
る。ここでは“シス−トランス”バイオアッセイ法と呼
ぶこの新規方法は２種のプラスミド、すなわち“発現”
プラスミドおよび“レポーター”プラスミドを用いる。
本発明によれば発現プラスミドは、本発明の受容体ＤＮ
Ａまたはその工学的処理による変異体を含有しており、
それを適切な受容体陰性宿主細胞中において発現しうる
いかなるプラスミドであってもよい。また本発明によれ
ばレポータープラスミドは作動性レポーター遺伝子に機
能性結合した作動性ホルモン応答性プロモーター／エン
ハンサー要素を含有するいかなるプラスミドであっても
よい。本発明の“シス−トランス”バイオアッセイを実
施する際には、発現プラスミド（本発明の“受容体”Ｄ
ＮＡを含有する）およびレポータープラスミドを適切な
受容体陰性宿主細胞中へ共トランスフェクションするト
ランスフェクションされた宿主細胞は、次いでレポータ
ープラスミドのホルモン応答性プロモーター／エンハン
サー要素を活性化しうるホルモンまたはその同族体の存
在下および不在下に培養される。次いでトランスフェク
ションおよび培養された宿主細胞を、レポーター遺伝子
配列の生成物の誘導（すなわち存在）について監視す
る。最後に本発明に従って受容体蛋白質（発現プラスミ
ド上の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、そしてトラ
ンスフェクションおよび培養された宿主細胞中で産生さ
れたもの）の発現およびステロイド結合能を測定する。
（この“シス−トランス”バイオアッセイ系の模式図に
ついては第ＩＩ−１図を参照されたい。） “シス−トランス”バイオアッセイ系は本発明の受容体
ＤＮＡが形質転換された宿主細胞中において発現したか
否かを判定するために特に有用である。これは本発明の
受容体が対応する天然の同系受容体の結合活性の少なく
とも約１０％を含有するか否か、および本発明の受容体
が対応する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なく
とも１０％を有するか否かを判定するためにも有用であ
る。最後に、その転写が受容体との複合体を形成したホ
ルモンによって活性化される遺伝子（Ｇ）の転写を活性
化するのに必要な、かつそれに十分な条件は、（Ｇ）と
同じ細胞中にホルモンおよびその受容体が存在すること
であることが、本発明のＤＮＡを用いて見出された。こ
の知見から遺伝子工学的に処理された細胞において目的
蛋白質を生成するための改良された組成物および方法を
得ることが可能となった。これらの方法のうち２種類が
本発明方法である。第１はその転写が受容体との複合体
を形成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写
を誘導する方法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処
理し、次いでその転写が受容体蛋白質との複合体を形成
したホルモンによって活性化される遺伝子によりコード
される蛋白質の生成を増加させ、かつ制御する方法であ
る。これら２方法につき論じる際に、その転写が受容体
蛋白質との複合体を形成したホルモンによって活性化さ
れる遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子（Ｇ）を活性
化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をいずれも（ａ
Ｈ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機能性修飾体
は（ｒ）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）が位置する
細胞を（Ｃ）、遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質
を（Ｐ）と呼ぶ。本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝
子（Ｇ）を含有する細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において
発現可能であり、かつ受容体（Ｒ）またはそれから修飾
された機能性形態（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡに
よって形質転換し；そして細胞（Ｃ）におけるホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度を少なくとも遺
伝子（Ｇ）の発現の誘導を保証するのに十分な程度にま
で高める。細胞を工学的に処理したのち蛋白質（Ｐ）を
生成させる方法によれば、ホルモン（Ｈ）が受容体
（Ｒ）との複合体を形成した状態で結合することがで
き、これにより遺伝子（Ｇ）の転写を誘導する転写制御
要素の制御下に置かれる状態に、蛋白質（Ｐ）をコード
する遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置する。この蛋白
質製造法によれば、ホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）
の双方が細胞（Ｃ）中に存在する。受容体（Ｒ）の存在
は、受容体（Ｒ）またはその機能性の修飾された形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより細胞（Ｃ）を
形質転換することによって保証される。ホルモン（Ｈ）
またはその合成同族体（ａＨ）の存在は、ホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）を含有する浸漬液中に
形質転換した細胞（Ｃ）を浸漬することによって保証さ
れる。次いで本方法に従って、形質転換した細胞（Ｃ）
を浸漬するために用いられる浸漬液中の（Ｈ）または
（ａＨ）の濃度を制御することによって、遺伝子（Ｇ）
の転写が制御される。こうして遺伝子（Ｇ）の転写を制
御することによって、細胞（Ｃ）における蛋白質（Ｐ）
の生成を制御することができる。この教示に基づいて当
業者が認識するように、転写がホルモン／受容体−複合
体によって活性化される遺伝子（Ｇ）によりコードされ
る蛋白質（Ｐ）の生成が遺伝子（Ｇ）の位置する細胞
（Ｃ）内にホルモン（Ｈ）およびその受容体を確実に存
在させ、次いで細胞（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）
またはその同族体の濃度を制御するだけで制御される状
態に、細胞を工学的に処理することが可能となるであろ
う。
センスストランドが、グルココルチコイド受容体、ミネ
ラロコルチコイド受容体および甲状腺ホルモン受容体よ
りなる群から選ばれるホルモン受容体蛋白質に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質の一次配列をコードするトリプレットの配列を含
む二重鎖ＤＮＡセグメントからなる。本発明のこの観点
によれば、この二重鎖ＤＮＡセグメントは受容体蛋白質
中に発現されうるものである。他の観点においては本発
明は、本発明による二重鎖ＤＮＡのセンスストランドで
ある一重鎖ＤＮＡ、および本発明の二重鎖ＤＮＡの転写
により形成されたＲＮＡからなる。他の観点においては
本発明は、本発明のＤＮＡの実例であるＤＮＡを含むプ
ラスミドからなる。これらのプラスミドはアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに特許の目的で寄託
されている。本発明のプラスミドには下記の群から選ば
れるプラスミドが含まれる。ｐＲＳｈＧＲ−アルファ
（ＡＴＣＣ＃６７２００），ｐＲＳｈＭＲ（ＡＴＣＣ＃
６７２０１），ｐｅＡ１０１（ＡＴＣＣ＃６７２４
４），ｒｂｅＡ１２（ＡＴＣＣ＃６７２８１），ＧＭＣ
ＡＴ（ＡＴＣＣ＃６７２８２），ｐＥ４（ＡＴＣＣ＃６
７３０９），ｐＨＫＡ（ＡＴＣＣ＃６７３１０），ｐｈ
ＥＲＢＡ８．７（ＡＴＣＣ＃４０３７４），ｐｈＦＡ８
（ＡＴＣＣ＃４０３７２），およびｐｈＨ３（ＡＴＣＣ
＃４０３７３）。さらに他の観点においては本発明は、
本発明のＤＮＡにより形質転換された細胞、好ましくは
哺乳動物細胞からなる。本発明のこの観点によれば、形
質転換を行うＤＮＡはこの細胞において発現可能であ
り、これによりこのＤＮＡがコードする受容体の量が細
胞中において増加する。さらに本発明は、本発明のＤＮ
Ａにより形質転換された、酵母細胞および細菌細胞、た
とえば大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を
含む細胞からなる。さらに本発明は、本発明のＤＮＡの
発現、または本発明のｍＲＮＡの翻訳によって形成され
た新規な受容体からなる。本発明のこの観点によれば、
受容体は“修飾されていない”本発明のＤＮＡおよびｍ
ＲＮＡの蛋白質生成物であるか、または受容体ＤＮＡ配
列における工学的変異の結果、対応する天然の“野生
型”もしくは同系の受容体（新規受容体ときわめて大幅
なアミノ酸配列相同を有する既知配列の天然受容体）と
１もしくは２以上のアミノ酸配列の相違を有する、修飾
された、もしくは遺伝子工学的に処理された蛋白質生成
物であろう。好ましくはこれらの受容体は“修飾されて
いないもの”または“工学的に処理されたもの”のいず
れであっても、対応する天然の同系受容体のホルモン結
合活性の少なくとも１０％、および／または転写活性化
活性の少なくとも１０％を有するであろう。本発明はま
た本発明のＤＮＡ（またはｍＲＮＡ）から得たホルモン
受容体蛋白質の機能性を測定するための新規方法からな
る。ここでは“シス−トランス”バイオアッセイ法と呼
ぶこの新規方法は２種のプラスミド、すなわち“発現”
プラスミドおよび“レポーター”プラスミドを用いる。
本発明によれば発現プラスミドは、本発明の受容体ＤＮ
Ａまたはその工学的処理による変異体を含有しており、
それを適切な受容体陰性宿主細胞中において発現しうる
いかなるプラスミドであってもよい。また本発明によれ
ばレポータープラスミドは作動性レポーター遺伝子に機
能性結合した作動性ホルモン応答性プロモーター／エン
ハンサー要素を含有するいかなるプラスミドであっても
よい。本発明の“シス−トランス”バイオアッセイを実
施する際には、発現プラスミド（本発明の“受容体”Ｄ
ＮＡを含有する）およびレポータープラスミドを適切な
受容体陰性宿主細胞中へ共トランスフェクションするト
ランスフェクションされた宿主細胞は、次いでレポータ
ープラスミドのホルモン応答性プロモーター／エンハン
サー要素を活性化しうるホルモンまたはその同族体の存
在下および不在下に培養される。次いでトランスフェク
ションおよび培養された宿主細胞を、レポーター遺伝子
配列の生成物の誘導（すなわち存在）について監視す
る。最後に本発明に従って受容体蛋白質（発現プラスミ
ド上の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、そしてトラ
ンスフェクションおよび培養された宿主細胞中で産生さ
れたもの）の発現およびステロイド結合能を測定する。
（この“シス−トランス”バイオアッセイ系の模式図に
ついては第ＩＩ−１図を参照されたい。） “シス−トランス”バイオアッセイ系は本発明の受容体
ＤＮＡが形質転換された宿主細胞中において発現したか
否かを判定するために特に有用である。これは本発明の
受容体が対応する天然の同系受容体の結合活性の少なく
とも約１０％を含有するか否か、および本発明の受容体
が対応する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なく
とも１０％を有するか否かを判定するためにも有用であ
る。最後に、その転写が受容体との複合体を形成したホ
ルモンによって活性化される遺伝子（Ｇ）の転写を活性
化するのに必要な、かつそれに十分な条件は、（Ｇ）と
同じ細胞中にホルモンおよびその受容体が存在すること
であることが、本発明のＤＮＡを用いて見出された。こ
の知見から遺伝子工学的に処理された細胞において目的
蛋白質を生成するための改良された組成物および方法を
得ることが可能となった。これらの方法のうち２種類が
本発明方法である。第１はその転写が受容体との複合体
を形成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写
を誘導する方法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処
理し、次いでその転写が受容体蛋白質との複合体を形成
したホルモンによって活性化される遺伝子によりコード
される蛋白質の生成を増加させ、かつ制御する方法であ
る。これら２方法につき論じる際に、その転写が受容体
蛋白質との複合体を形成したホルモンによって活性化さ
れる遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子（Ｇ）を活性
化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をいずれも（ａ
Ｈ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機能性修飾体
は（ｒ）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）が位置する
細胞を（Ｃ）、遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質
を（Ｐ）と呼ぶ。本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝
子（Ｇ）を含有する細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において
発現可能であり、かつ受容体（Ｒ）またはそれから修飾
された機能性形態（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡに
よって形質転換し；そして細胞（Ｃ）におけるホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度を少なくとも遺
伝子（Ｇ）の発現の誘導を保証するのに十分な程度にま
で高める。細胞を工学的に処理したのち蛋白質（Ｐ）を
生成させる方法によれば、ホルモン（Ｈ）が受容体
（Ｒ）との複合体を形成した状態で結合することがで
き、これにより遺伝子（Ｇ）の転写を誘導する転写制御
要素の制御下に置かれる状態に、蛋白質（Ｐ）をコード
する遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置する。この蛋白
質製造法によれば、ホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）
の双方が細胞（Ｃ）中に存在する。受容体（Ｒ）の存在
は、受容体（Ｒ）またはその機能性の修飾された形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより細胞（Ｃ）を
形質転換することによって保証される。ホルモン（Ｈ）
またはその合成同族体（ａＨ）の存在は、ホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）を含有する浸漬液中に
形質転換した細胞（Ｃ）を浸漬することによって保証さ
れる。次いで本方法に従って、形質転換した細胞（Ｃ）
を浸漬するために用いられる浸漬液中の（Ｈ）または
（ａＨ）の濃度を制御することによって、遺伝子（Ｇ）
の転写が制御される。こうして遺伝子（Ｇ）の転写を制
御することによって、細胞（Ｃ）における蛋白質（Ｐ）
の生成を制御することができる。この教示に基づいて当
業者が認識するように、転写がホルモン／受容体−複合
体によって活性化される遺伝子（Ｇ）によりコードされ
る蛋白質（Ｐ）の生成が遺伝子（Ｇ）の位置する細胞
（Ｃ）内にホルモン（Ｈ）およびその受容体を確実に存
在させ、次いで細胞（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）
またはその同族体の濃度を制御するだけで制御される状
態に、細胞を工学的に処理することが可能となるであろ
う。
【０００５】発明の説明 本発明は一部は、グルココルチコイド、ミネラルコルチ
コイドおよび甲状腺ホルモンの受容体に特有のホルモン
結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡセグメントに関する。本発明のこの
観点によれば、これらのＤＮＡセグメントは適切な宿主
細胞において発現され、これによりグルココルチコイ
ド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容
体、または受容体様蛋白質を生成しうるものである。本
発明は本発明のＤＮＡのセンスストランドの転写の結果
生成したｍＲＮＡにも関する。本発明のＤＮＡはここで
は以下のとおり呼ばれるＤＮＡによって例示される。ヒ
トグルココルチコイド受容体ＤＮＡ（ｈＧＲ）；ヒト甲
状腺ホルモン受容体ＤＮＡ（ｈＴＲ：ｈＴＲアルファお
よびｈＴＲベータ；ｈＴＲアルファはたとえばｈＥＲＢ
Ａ８．７およびｈＦＡ８である；ｈＴＲベータはたとえ
ば細胞性のもの、すなわち“ｃ−ｅｒｂ−Ａ”であ
る）；ラット甲状腺ホルモン受容体（ｒｂｅＡ１２）、
これはヒト甲状腺ホルモン受容体アルファのラット同族
体である；ヒトミネラルコルチコイド受容体（ｈＭ
Ｒ）；ならびに新規なヒトステロイドホルモン受容体
（ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２）。センスストランドｃ
ＤＮＡヌクレオチド配列、およびこれらによりコードさ
れる推定一次蛋白質配列は以下の図に示される。第Ｉ−
２（１）および１−２（２）図：ｈＧＲについて；第Ｉ
ＩＩ−１（Ｂ）−１およびＩＩＩ−１（Ｂ）−２図：ヒ
トｃ−ｅｒｂ−Ａについて、ならびに第ＩＩＩ−７図：
ｈＥＲＢＡ８．７およびｈＦＡ８について；第ＩＶ−２
（Ｂ）−１およびＩＶ−２（Ｂ）−２図：ｈＭＲについ
て；第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）−２、なら
びにＶ−２（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図：それ
ぞれｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２について；ならびに第
ＶＩＩ−１（Ｂ）図：ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂ
ｅＡ１２について。ＤＮＡ、たとえばｈＧＲ、ヒトｃ−
ｅｒｂ−Ａ、ｈＥＲＢＡ８．７、ｈＦＡ８、ｈＭＲ、ｈ
ＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２は本発明の好ましいＤＮＡで
ある。同様にこれらおよび他の本発明のＤＮＡを保有す
るプラスミドも好ましい。好ましいプラスミドは以下の
ものが含まれる。ｐＲＳｈＧＲ−アルファ，ｐＲＳｈＭ
Ｒ，ｐｅＡ１０１，ｒｂｅＡ１２，ＧＭＣＡＴ，ｐＥ
４，ｐＨＫＡ，ｐｈＥＲＢＡ８．７，ｐｈＦＡ８，およ
びｐｈＨ３。ｐＲＳｈＧＲ−アルファのほかに好ましい
ＤＮＡにはｐＲＳｈＧＲ−アルファの修飾体も好まれ、
これらはここでは下記のように表示される。Ｉ９，Ｉ３
７，Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６
２，Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０
３，Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４
８，Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，および
Ｉ６８４。ここで“Ｉ”は“挿入配列（Ｉｎｓｅｒ
ｔ）”を表わし、“Ｉ”に続く数字はＤＮＡ修飾の表示
を表わす。修飾されたｐＲＳｈＧＲ系ＤＮＡのうちきわ
めて好ましいものは、ヒトグルココルチコイド受容体に
特有な転写活性化特性の少なくとも１０％を有する蛋白
質をコードするものである。これらのＤＮＡには、Ｉ
９，Ｉ３７，Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１
４，Ｉ２６２，Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８
４，Ｉ４０３，Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４
０，Ｉ４４８，Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５
０，およびＩ６８４が含まれる。ｐＲＳｈＧＲ−アルフ
ァの構造は本明細書の“実験の部ＩＩ”と表示される部
分に詳述されている。（特に項目ＩＩ．Ｆ．（ｂ）、
“組換えプラスミド”を参照されたい）。実験の部ＩＩ
には上記の章に述べたｐＲＳｈＧＲ−アルファ修飾体の
構造および特性についても詳述されている。第Ｉ−２
（１）およびＩ−２（２）図に示したｈＧＲに対するｃ
ＤＮＡ配列に関しては、図示された配列の５’末端の２
個のＣはＲＳＶ−ＬＴＲを含むセグメントの３’末端に
図示したセグメントを結合させるＫｐｎＩ部位の部分で
ある。図示した配列の３’末端のＴは、図示したセグメ
ントがＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントに
結合する地点の５’側へ数個の塩基の位置にある。ｐＲ
ＳｈＭＲは本質的にｐＲＳｈＧＲ−アルファと同じ様式
で構成され、本質的にｐＲＳｈＧＲ−アルファと等し
い。言い換えると、挿入部位におけるわずかな修飾を除
いて、第ＩＶ−２（Ａ）図に示したｈＭＲセグメント
が、第Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図に配列を示し
たｈＧＲに置換している。ｐＲＳｈＧＲと同様にｐＲＳ
ｈＭＲはラウス肉腫ウィルス由来のプロモーターおよび
ＳＶ４０複製開始点の制御下に受容体蛋白質ＤＮＡコー
ド配列を含有する。実験の部ＩＶの参考文献部分の脚注
４１を参照されたい。第ＩＶ−４（Ａ）図も参照し、第
ＩＩ−１図と比較されたい。第ＩＶ−２（Ｂ）−１およ
びＩＶ−２（Ｂ）−２図に示したｈＭＲ配列に関して
は、このセグメントの５’末端にあるＡＧはＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位から数塩基対下流にあり、これによってｈＭＲ
セグメントはＲＳＶ−ＬＴＲ含有セグメントに結合して
いる。第ＩＶ−２（Ｂ）−２図に示したセグメントの
３’末端のＡＡはＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセ
グメントの５’末端から塩基数個上流にある。プラスミ
ドｐｅＡ１０１はヒト甲状腺ホルモン受容体ｃ−ｅｒｂ
−Ａのコード領域全体を保有する。（ｃ−ｅｒｂ−Ａに
対する遺伝子はヒト染色体３に局在する；この受容体遺
伝子によりコードされる蛋白質生成物をここではｈＴＲ
ベータと呼ぶ。実験の部ＩＩＩを参照し、実験の部ＶＩ
Ｉと比較されたい）。プラスミドｐｅＡ１０１はｐｈｅ
Ａ１２（第ＩＩＩ−１（Ａ）図参照）からのＥｃｏＲＩ
断片を発現ベクターｐＧＥＭ３（プロメガ・バイオテ
ク）のＥｃｏＲＩ部位に適正な向きに挿入することによ
り構成された。この構造についての詳細は実験の部ＩＩ
Ｉ、項目ＩＩＩ．１の第ＩＩＩ−４法と表示する項目を
参照されたい。ヒト染色体３に局在しているｈＴＲ受容
体のほかに、本発明者らはプラスミドｐｅＡ１０１によ
り推定される蛋白質配列と異なる第２の甲状腺ホルモン
受容体を見出した。本発明者らはこの新規な予想されな
かった甲状腺ホルモン受容体をラットおよびヒトの双方
から単離し、特性を調べた。ラットの場合、この新規な
甲状腺ホルモン受容体はプラスミドｒｂｅＡ１２のＤＮ
Ａによりコードされる。（ｒｂｅＡ１２に関するＤＮＡ
および推定一次蛋白質配列を第ＶＩＩ−１（Ｂ）図に示
す。）ヒトの場合、この新規な甲状腺ホルモン受容体は
プラスミドクローンｈＥＲＢＡ８．７およびその関連ク
ローンｈＦＡ８によりコードされる。（ｈＥＲＢＡの配
列については第ＩＩＩ−７図を参照されたい。）ｈＥＲ
ＢＡ８．７およびｈＦＡ８は同一遺伝子からのｃＤＮＡ
生成物である。クローンｈＦＡ８のＤＮＡ配列は下記の
点を除いてｈＥＲＢＡ８．７（第ＩＩＩ−７図に示す）
と等しい。ｈＦＡ８の配列は第ＩＩＩ−７図に示す配列
より短い。より詳細には、ｈＥＲＢＡ８．７のヌクレオ
チド１（Ｇ）から５１４（Ａ）までがｈＦＡ配列にはな
い。さらにｈＦＡ８配列は塩基対位置１１３８のグアニ
ン（Ｇ）から塩基対１２４４のグアニン（Ｇ）に及ぶ欠
失を有する。この欠失によってアミノ酸３６８（Ｇｌ
ｕ）から４０６（Ｇｌｎ）までがｈＦＡ８クローンによ
りコードされるポリペプチドから失われる。前記のよう
に本発明の最初の甲状腺ホルモン受容体は染色体３に局
在している。実験の部ＶＩＩに示すように、新規な甲状
腺ホルモン受容体に対するヒト遺伝子はヒト染色体１７
に局在している。ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂｅＡ
１２は染色体１７からのヒト遺伝子生成物のラット型同
族体を表わす。それらは異なる遺伝子坐によりコードさ
れるので、染色体１７遺伝子生成物はｈＴＲアルファと
して分類され、染色体３遺伝子生成物はｈＴＲベータと
して分類されている。関連性は高いが、アルファおよび
ベータ遺伝子生成物はそれらの一次アミノ酸配列におい
て特異的変化を含む。またアルファおよびベータ生成物
は特徴的に異なる発現パターンを示す。甲状腺ホルモン
の作用は多岐にわたり、それらの受容体に依存してい
る。本発明者らが甲状腺ホルモン受容体をクローニング
する以前はこの受容体は精製または生化学的特性の解明
はなされていなかった。科学文献にも多種の甲状腺ホル
モン受容体遺伝子生成物の存在を示唆する証拠は全くな
かった。多種の受容体が存在することは、これら受容体
のうち１種類のみを選択的に活性化する甲状腺ホルモン
同族体を開発する基礎として有用である。これは広範な
臨床的威力をもつと思われるので、興味ある重要な知見
である。本発明者らが特性を明らかにした最初の甲状腺
ホルモン受容体はｐｅＡ１２、すなわち現在ヒト甲状腺
ホルモン受容体ベータと呼ばれる受容体であった。本発
明者らは分子ハイブリダイゼーションによってラット脳
ｃＤＮＡライブラリーを関連配列につきスクリーニング
するためにこのベータクローンを用いた。これによって
プラスミドｒｂｅＡ１２が同定され、のちにこれがアル
ファ群の新規な甲状腺ホルモン受容体として同定され
た。このラットｒｂｅＡ１２はｒｂｅＡ１２遺伝子生成
物に対するヒト同族体をクローニングするための分子ハ
イブリダイゼーションプローブとして用いられた。この
ヒト生成物はクローンｈＥＲＢＡ８．７およびｈＦＡ８
によりコードされる。他の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮ
Ａ（ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂｅＡ１２、ならび
にヒト甲状腺ホルモン受容体ｈＥＲＢＡ８．７およびｈ
ＦＡ８）はそれらのｃＤＮＡをｃ−ｅｒｂ−Ａについて
行ったと同様に適正な向きで発現ベクターｐＧＥＭ３中
へ挿入することによって発現させることができる。ここ
でプラスミドＧＭＣＡＴについて述べると、これはクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）に対する細胞遺伝子に結合したＭＴＶＬＴＲを含む
レポータープラスミドである。この結合の結果、ｐＧＭ
ＣＡＴを用いてＭＴＶプロモーターの転写活性を評価す
るための酵素アッセイを行うことができる。ＭＴＶプロ
モーターは数種のグルココルチコイド応答要素（ＧＲ
Ｅ）を含むので、レポータープラスミドｐＧＭＣＡＴは
グルココルチコイドまたはミネラルコルチコイドレポー
ターＤＮＡ（現在知られているか、またはのちに見出さ
れた）を保有する発現プラスミドと共に適切な宿主細胞
中へ共トランスフェクションすることができる。（この
ような共トランスフェクションは本発明の“シス−トラ
ンス”機能性バイオアッセイ系の一部である。本発明の
この観点についてはのちに詳述する。）共トランスフェ
クションした宿主細胞においてＣＡＴ活性が検出された
ことは、受容体発現プラスミドにより産生されたポリペ
プチドが機能性であること、すなわち受容体蛋白質に特
有の転写活性化特性を有することを示す。プラスミドｐ
ＧＭＣＡＴはＡＴＣＣに特許の目的で寄託され、ＡＴＣ
Ｃ＃６７２８２を得た。（ｐＧＭＣＡＴの模式図につい
ては第ＩＶ−５（Ａ）図を参照されたい。） プラスミドｐＧＨＣＡＴは本発明に有用な他のレポータ
ープラスミドの一例である。ｐＧＨＣＡＴはクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対
する細菌遺伝子に機能性結合した成長ホルモンプロモー
ターの一部を含む。この結合のため、ｐＧＨＣＡＴを用
いて成長ホルモン（ＧＨ）プロモーターの転写活性を評
価するための酵素アッセイを行うことができる。ＧＨプ
ロモーターは甲状腺ホルモン応答要素（ＴＲＥ）を含む
ので、レポータープラスミドｐＧＨＣＡＴは甲状腺ホル
モンレポーターＤＮＡ（現在知られているか、またはの
ちに見出された）を保有する発現ベクターと共に適切な
宿主細胞中へ共トランスフェクションすることができ
る。（このような共トランスフェクションも本発明の
“シス−トランス”レポーター機能性バイオアッセイ系
の一部である。本発明のこの観点についてはのちに詳述
する。）ｐＧＨＣＡＴをＴＲ発現プラスミド（これはた
とえばｈＴＲアルファまたはｈＴＲベータＤＮＡを保有
する）と共に用いて適切な宿主細胞を共トランスフェク
ションした場合、共トランスフェクションした宿主細胞
におけるＣＡＴ活性の検出は、甲状腺ホルモン受容体
（ＴＲ）発現プラスミドにより産生されたポリペプチド
が機能性であること、すなわち甲状腺ホルモン受容体蛋
白質に特有の転写活性化特性を有することを示すために
用いられる。プラスミドｐＥ４およびｐＨＫＡは、ここ
ではｈＥＲＲ１と呼ばれるエストロゲン関連受容体をコ
ードするｃＤＮＡに関係する。（実験の部Ｖ、特に第Ｖ
−１（Ａ）および（Ｂ）図を参照されたい。）プラスミ
ドｐＥ４は第Ｖ−１（Ａ）図においてラムダｈＫＥ４と
よばれるｃＤＮＡセグメントを保有し；ｐＨＫＡは同図
においてラムダｈＫＡ１と呼ばれるセグメントを保有す
る。ｐＥ４およびｐＨＫＡ共方ともＡＴＣＣに特許の目
的で寄託されている。これら２種のプラスミドを後記に
従って結合させて、エストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１
に対する全コード配列を含む単一プラスミド（ｐＧＭＥ
ＲＲ１）を得ることができる。２種のｃＤＮＡクローン
ｐＥ４およびｐＨＫＡを結合させるための好ましい方法
は、各ｃＤＮＡに存在する特異的制限酵素部位に対し各
末端において相補的である合成リンカーを利用する。よ
り詳細には、ラムダｈＫＡ１およびラムダｈＫＥ４から
の挿入配列をＥｃｏＲＩ断片としてプラスミドベクター
ｐＧＭ３（プロメガ・バイオテク）中へクローニングす
る；本発明者らはこれらをそれぞれｐＧＭＫＡおよびｐ
ＧＭＫＥと命名した。次いでｐＧＭＫＡをＮａｒＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ｈＥＲＲ１をコードす
る断片をアガロースゲルから精製する（断片１）。ｐＧ
ＭＫＥをＤｒａＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断
し、ｈＥＲＲ１の５’末端領域およびベクター配列をコ
ードする断片をアガロースゲルから精製する（断片
２）。第３に、互いに相補的な２種の合成オリゴヌクレ
オチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは下記
のものである。 オリゴＩ：ＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧ
ＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡ
ＧＣＣＧＧＣＧＧＧ； オリゴＩＩ：ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣ
ＣＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＴ。最後に断片１および
２ならびにオリゴＩおよびＩＩを当業者に周知の標準法
に従って互いにリゲートさせ、次いで細菌ＤＨ５株中へ
形質転換する。得られたコロニーをここではｐＧＭＥＲ
Ｒ１と呼ばれるＤＮＡ構造物につきスクリーニングす
る。プラスミドｐＧＭＥＲＲ１を用いてｈＥＲＲ１を発
現させることができる。ｐＧＭＥＲＲ１の模式図につい
ては第Ｉ−６（Ａ）図を参照されたい。プラスミドｐｈ
Ｈ３は、ヒト心臓ラムダｇｔｌｌ ｃＤＮＡライブラリ
ーから、ラムダｈＫＡ１の５’部分を表わす、ニックト
ランスレーションされた７００−ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｍａＩ断片を用いて単離されたラムダｈＨ３クローンに
関連する。（ラムダｈＫＥ４およびラムダｈＫＡ１クロ
ーンはヒト腎ラムダｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーから
単離された；実験の部Ｖ．Ｈ，特に第Ｖ−１およびＶ−
２図法と表示される項目を参照されたい。）ラムダｈＨ
３クローンはここではｈＥＲＲ２と呼ばれるエストロゲ
ン関連受容体をコードするｃＤＮＡを保有する。ｐｈＨ
３からのｃＤＮＡをｐＧＭ３中へ挿入してｐＧＭＥＲＲ
２を形成することができる。その図は第Ｉ−６（Ｂ）図
に示されている。受容体様ポリペプチドｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２の機能上および構造上の特性を実験の部Ｖ
に示す。本発明者らが本発明のＤＮＡを用いて得た知見
の１つは、同一種内の各種ホルモン受容体間の、また特
定のいずれかの受容体については種間の著しい配列相同
である。（たとえばｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子生成物、
ヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａポリペプチド、ならびにヒトグ
ルココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキ
シ末端部分を比較した第ＩＩＩ−２図；ステロイドおよ
び甲状腺ホルモン受容体を比較した第ＩＩＩ−６図；ミ
ネラルコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容体
のアミノ酸相同を比較した第ＩＶ−３図；ｈＧＲ，ｈＭ
ＲおよびｈＰＲ間のアミノ酸比較を示した第ＩＶ−８
図；ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンおよび
ヒトグルココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域を
比較した第Ｖ−３図；ならびにｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ
２，ｈＥＲ，ｈＧＲおよびヒト甲状腺ホルモン受容体ｈ
Ｔ３Ｒベータ間のアミノ酸の比較を示す第Ｖ−５図を参
照されたい。）この相同性があるため本発明のＤＮＡお
よびＲＮＡは、ホルモンと複合体を形成したのちクロマ
チンＤＮＡに結合することにより転写を活性化するホル
モン受容体をコードする遺伝子を実質的にいかなる種か
らも検出および単離することができる。本発明のＤＮＡ
およびＲＮＡ、特にＡＴＣＣに特許の目的で寄託された
好ましいＤＮＡを用いることにより、当業者は多大な試
験を行うことなくゲノムライブラリーをスクリーニング
して、本発明の範囲に含まれる他のグルココルチコイ
ド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモン受容体
を見出すことができる。本発明のこの観点は本発明者ら
によりエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲ
Ｒ２（実験例Ｖ、特に項目Ａ、序、および項目Ｂ、受容
体ｈＥＲＲに対するｃＤＮＡクローンの項を参照された
い）、ならびにラット甲状腺ホルモン受容体およびヒト
甲状腺ホルモン受容体ＴＲアルファ（実験の部ＶＩＩ、
特に項目Ｃ、第２甲状腺ホルモン受容体ＤＮＡの単離、
ならびに第ＶＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図を参照され
たい）が見出されたことにより説明される。本発明のＤ
ＮＡおよびセンスストランドＤＮＡはたとえば本発明の
誘導法および蛋白質製造法と組合わせて使用して、大量
の実質的に純粋な受容体蛋白質を製造することができ
る。さらに、こうして製造された実質的に純粋な受容体
蛋白質を周知の方法により診断アッセイ法に使用して、
各種の体液および組織試料における特定のホルモンの存
在を調べることができる。さらに本発明の受容体蛋白質
を結合アッセイ法、たとえば実験の部ＩＩＩに述べるｐ
ｅＡ１０１によりコードされる受容体へのＴ３の結合に
関する方法、または後述する本発明の“シス−トラン
ス”受容体機能性バイオアッセイ法により、受容体作用
薬および受容体拮抗薬をスクリーニングするのに用いる
ことができる。最後に、本発明の受容体蛋白質は実質的
に純粋な形で製造されるので、それらを結晶化し、Ｘ線
回折法によりそれらの構造を調べることができる。当業
者に周知のように、これらの測定は“合成”または修飾
された受容体蛋白質同族体を工学的に製造する際にきわ
めて有用である。ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにこれら
により製造された新規な受容体蛋白質のほかに、本発明
は以下の３種の一般法を開示する。一方法は受容体蛋白
質の機能性を測定するためのバイオアッセイ法に関す
る。他の二方法はそれらの転写がクロマチンＤＮＡに結
合したホルモン−受容体−複合体により活性化される遺
伝子の発現を誘導および制御する方法に関する。これら
３種の一般法それぞれにつき別個に述べる。本発明者ら
が“シス−トランス”バイオアッセイ系と呼ぶ、受容体
機能性を試験するための新規なバイオアッセイ系は２種
のプラスミド、すなわち“発現”プラスミドおよび“レ
ポーター”プラスミドを使用する。本発明によれば発現
プラスミドは本発明の受容体ＤＮＡまたはそれらの変異
体を適切な受容体陰性宿主細胞において発現しうるいか
なるプラスミドであってもよい。同様に本発明によれば
レポータープラスミドは作動性レポーター遺伝子に機能
性結合した作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハ
ンサー要素を含むいかなるプラスミドであってもよい。
（ここで用いる用語の説明については本明細書の定義の
項を参照されたい。）プラスミドｐＧＭＣＡＴおよびｐ
ＧＨＣＡＴは作動性レポーター遺伝子に機能性結合した
作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素
を含むレポータープラスミドの例であり、従って本発明
の受容体機能性バイオアッセイに使用できる。ｐＧＭＣ
ＡＴの場合、作動性ホルモン応答性プロモーター／エン
ハンサー要素はＭＴＶ ＬＴＲであり；ｐＧＨＣＡＴの
場合、これは成長ホルモン受容体の機能性部分である。
ｐＧＭＣＡＴおよびｐＧＨＣＡＴの双方において作動性
レポーター遺伝子はクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対する細菌性遺伝子であ
る。本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオア
ッセイを実施する際には、発現プラスミドおよびレータ
ープラスミドを適切な受容体陰性宿主細胞中へ共トラン
スフェクションする。トランスフェクションされた宿主
細胞は次いでホルモンまたは同族体の存在下または不在
下で培養され、レポータープラスミドのホルモン応答性
プロモーター／エンハンサー要素を活性化することがで
きる。トランスフェクションおよび培養された宿主細胞
を次いでレポーター遺伝子配列の生成物の誘導（すなわ
ち存在）につき監視する。最後に、ホルモン受容体蛋白
質またはそれらの変異体（発現プラスミド上の受容体Ｄ
ＮＡ配列によりコードされ、トランスフェクションおよ
び培養された宿主細胞において産生されたもの）の発現
および／またはステロイド結合能を本発明に従って測定
する。（この“シス−トランス”バイオアッセイ系の模
式図については第ＩＩ−１図を参照されたい。）本発明
の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセイ系を
好ましい形態においてグルココルチコイドまたはミネラ
ルコルチコイド受容体の機能性の測定に用いる場合、プ
ラスミドは選択可能なマーカー、たとえばａｍｐ遺伝子
を保有するであろう。さらに、好ましい形態においては
レポータープラスミドはＭＴＶＬＴＲまたは成長ホルモ
ンプロモーターの機能性部分をホルモン応答性プロモー
ター／エンハンサー要素として含むであろう。ＭＴＶ
ＬＴＲが好ましいのは、グルココルチコイドホルモンが
ＭＴＶ ＬＴＲ内の特異的部位において転写開始の効率
を高めることによりＭＴＶ ＤＮＡの転写速度を剌激す
ることが知られているからである。さらにグルココルチ
コイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッピングされたＤ
ＮＡ配列に特異的に結合し、従って異種プロモーターに
対するグルココルチコイドの応答性を与えることができ
る。（実験の部ＩＩ、特に項目Ｃ．（ａ）、アッセイ系
および実験様式を参照されたい。）またミネラルコルチ
コイド受容体がグルココルチコイド受容体と機能的関連
を示すこと、およびｈＭＲのＤＮＡ結合区がＭＴＶＬＴ
Ｒを認識することも知られている。（実験の部ＩＶ、特
に項目Ｅ．：発現およびホルモンの結合、および項目
Ｆ．：転写活性化を参照されたい。）成長ホルモンプロ
モーターが好ましいのは、その活性化が甲状腺ホルモン
−受容体−複合体による結合に応答するからである。本
発明の“シス−トランス”バイオアッセイ系に用いるた
めに好ましい宿主細胞はＣＯＳ細胞およびＣＶ−１細胞
である。（本発明のバイオアッセイ系に用いられる好ま
しい宿主細胞については、実験の部ＩＩ、項目Ｃ．
（ａ）アッセイ系および実験様式を参照されたい。）Ｃ
ＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）細胞はＳＶ４０Ｔ抗原（Ｔａ
ｇ）を発現するマウス腎細胞であり；ＣＶ−１はＳＶ４
０ Ｔａｇを発現しない。ＣＶ−１細胞は内在性グルコ
コルチコイドもしくはミネラルコルチコイドまたは他の
既知のステロイドホルモンもしくは甲状腺ホルモンの受
容体をいずれも欠如するので好都合である。従って適宜
な発現ベクターを用いる遺伝子転写によりこれらの宿主
細胞を受容体陰性から受容体陽性へ転換させることが可
能である。ＣＯＳ−１誘導体系にＴａｇが存在すること
によって、導入された発現プラスミドを複製し、アッセ
イ期間中に生成する受容体の量を相対的に高めることが
できる。ＳＶ４０複製開始点（ｏｒｉ）を含む発現プラ
スミドは、ＳＶ４０Ｔａｇを発現するいかなる宿主細胞
においても高いコピー数にまで増殖することができる。
従ってＳＶ４０“ｏｒｉ”を保有する本発明の発現プラ
スミドはＣＯＳ細胞において複製しうるが、ＣＶ−１細
胞においては複製されない。高いコピー数によって与え
られる高い発現が望ましいが、これは開示されたバイオ
アッセイ系にとって決定的なものではない。いずれかの
特定の細胞系を“宿主”として用いることも決定的なも
のではない。上記発現ベクターはきわめて有効であるの
で、本発明者らによればこのアッセイ法は本発明者らが
試験したすべての宿主において作動した。ＣＶ−１細胞
が好ましいのは、それが遺伝子転移の研究に好都合であ
り、感受性の、かつ十分に報告された宿主細胞系を提供
するからにすぎない。“シス−トランス”バイオアッセ
イ系は、本発明の受容体ＤＮＡが転移した宿主細胞中に
発現したか否かを判定するために特に有用である。これ
は本発明の受容体が対応する天然の同系受容体の結合活
性の少なくとも約１０％を有するか否か、またこの受容
体が対応する天然の同系受容体の転写活性化活性の少な
くとも１０％を有するか否かを判定する際にも有用であ
る。第ＩＩ−１図は本発明の“シス−トランス”受容体
機能性バイオアッセイ系をｈＧＲ ｃＤＮＡによりコー
ドされる受容体ポリペプチドの機能性の測定に用いる方
法につき模式的に示す。このバイオアッセイ法の詳細、
および受容体の機能性を試験するための定量性バイオア
ッセイ系としてのその有効性は実験の部ＩＩに開示およ
び論述される。（特に項目Ｆ．実験法；および項目Ｃ
（ｂ）、機能性ｈＧＲの発現を参照されたい。）同実験
の部に示されるように、ホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素の活性化を証明するために採用できる
ＣＡＴ酵素アッセイ法のほかに、転移宿主細胞のウェス
ターンブロット分析法を採用して、対照として用いられ
る同系受容体から移動性に関して区別できない受容体ポ
リペプチドの合成を証明することができる。さらに本発
明の“シス−トランス”バイオアッセイ系を採用して、
特異的ホルモンによる受容体（トランスフェクションお
よび培養された宿主細胞において産生されたもの）の活
性化、ならびにそれらのホルモン結合能および特性を調
べることができる。実験の部ＩＩに証明されるように、
これがｈＥＲについて行われた場合本発明のｈＧＲは機
能性であり、同系受容体の場合と同じ特異性および濃度
でグルココルチコイドホルモンと結合することが示され
た。最後に本発明者らは要約の項に示すように本発明の
ＤＮＡを用いて、その転写が受容体との複合体を形成し
たホルモンにより活性化される遺伝子（Ｇ）の転写活性
化に必要かつ十分な条件は、（Ｇ）が存在する細胞
（Ｃ）中にホルモンおよびその受容体が存在することで
あることを見出した。（ホルモン（Ｈ）および受容体
（Ｒ）が遺伝子（Ｇ）の転写に作用する様式は完全には
理解されていない。しかし受容体（Ｒ）はホルモン
（Ｈ）と複合体を形成した場合、特異的ＤＮＡ部位、す
なわち当技術分野で“転写制御要素”または“転写刺激
を媒介するＤＮＡ配列”と呼ばれ、遺伝子（Ｇ）が位置
する付近のクロマチン上に存在するものに結合すると考
えられる。ホルモン／受容体−すなわち（Ｈ）／（Ｒ）
−複合体によるこの結合は、まだ解明されていない様式
で、遺伝子（Ｇ）に対するプロモーターを“始動させる
（ｔｕｒｎ ｏｎ）”かまたは何らかの他の方法で活性
化し、これにより（Ｇ）遺伝子の転写を刺激するホルモ
ン依存性“スイッチ”として作用すると思われる。） 本発明者らの知見によって、遺伝子工学的に処理された
細胞において目的蛋白質を産生させるための改良された
組成物および方法が得られた。これらの方法２種が本発
明方法である。第１はその転写が受容体との複合体を形
成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘
導する方法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理
し、次いでその転写が受容体との複合体を形成したホル
モンによって活性化される遺伝子によりコードされる蛋
白質の生成を増大および制御する方法である。これら２
方法につき述べる際にも、受容体蛋白質との複合体を形
成したホルモンにより転写が活性化される遺伝子を遺伝
子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子（Ｇ）を活性化するホルモンを
（Ｈ）、その同族体をいずれも（ａＨ）と呼ぶ。受容体
蛋白質は（Ｒ）、その機能性修飾体は（ｒ）と呼ばれ
る。最後に、遺伝子（Ｇ）が存在する細胞を（Ｃ）と呼
び、遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質を（Ｐ）と
呼ぶ。本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子（Ｇ）を
含む細胞（Ｃ）が、細胞（Ｃ）において発現可能であ
り、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換され
る。そして細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）の濃度ま
たは同族体（ａＨ）の濃度を少なくとも遺伝子（Ｇ）の
発現を確実に誘導するのに十分な水準にまで高める。実
験の部ＩＩに示したように本発明の誘導法を採用した場
合、意外にも遺伝子（Ｇ）が位置する細胞に（Ｈ）およ
び（Ｒ）が存在することによって遺伝子（Ｇ）の転写が
誘導されるだけでなく、蛋白質（Ｐ）の産生が５００〜
１０００倍高められた。この知見はこの誘導法が転写を
誘導するためにだけでなく、これを増大および制御する
ためにも採用されることを本発明者らに示した。この知
見から、細胞を工学的に処理し、次いでその転写が受容
体との複合体を形成したホルモンにより活性化される遺
伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質の生成を制御する
本発明方法も開発された。この方法についてはのちによ
り詳細に述べる。本発明の誘導法は細胞に与えられるホ
ルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度を調節す
るだけで蛋白質（Ｐ）の生成を増大させ、および制御す
るためにも採用できる。（当業者に自明のとおり、細胞
（Ｃ）を本発明のＤＮＡで形質転換すると、細胞（Ｃ）
において（Ｒ）または（ｒ）の適切な供給が保証される
ので、（Ｒ）または（ｒ）の欠如はもはや遺伝子（Ｇ）
の転写における制限因子とはならない。このため、培養
液中の（Ｈ）または（ａＨ）の量を増加させるだけで遺
伝子（Ｇ）の転写を増加させ、結果的に細胞（Ｃ）にお
いて産生される蛋白質の量を増加させることができるで
あろう。） 本発明の誘導法は下記の条件を満たす限り、ホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）のうちのいずれかと複
合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモ
ン受容体が結合することによって活性化される転写制御
要素による転写制御下にあるいかなる遺伝子（Ｇ）の発
現をも誘導するために採用できる：（１）受容体
（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えたその機
能的な修飾された形態（ｒ）をコードするＤＮＡを使用
できる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞である；
（３）細胞（Ｃ）がホルモン（Ｈ）または同族体（ａ
Ｈ）との複合体形成のために必要な（Ｒ）−または
（ｒ）−コード化ＤＮＡを発現すべく形質転換されう
る。当業者は寄託された本発明のＤＮＡのいずれをもプ
ローブとして用いて、現在入手できない（Ｒ）−または
（ｒ）−コード化ＤＮＡのゲノムライブラリーを多大な
実験なしに探査することができる。これらのＤＮＡが見
出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細胞
（Ｃ）において発現可能である場合には細胞（Ｃ）の形
質転換に使用できる。培養細胞を形質転換する方法は周
知であり、当業者が多大な実験なしに用いることができ
る。同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に（Ｈ）が存
在する場合その基礎水準はどの程度であるか、また遺伝
子（Ｇ）の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の生成を誘導お
よび制御するためには（Ｈ）または（ａＨ）の濃度はど
の程度でなければならないかを当業者は判定できる。培
養細胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液に（Ｈ）または
（ａＨ）を添加することにより、必要な濃度の（Ｈ）を
形質転換細胞（Ｃ）に供給することができる。本発明に
より、遺伝子（Ｇ）の転写に必要かつ十分な条件は遺伝
子（Ｇ）が存在する細胞（Ｃ）に（Ｈ）または（ａＨ）
および（Ｒ）または（ｒ）が存在することであり、遺伝
子（Ｇ）の転写、従って蛋白質（Ｐ）の生成は形質転換
細胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液中の（Ｈ）または
（ａＨ）の量を増加させるだけで誘導および制御できる
ことが教示された。当業者に自明のとおりこれらの知見
に基づいて細胞を工学的に処理し、その結果遺伝子
（Ｇ）が位置する細胞（Ｃ）中にホルモン（Ｈ）および
その受容体を確実に存在させ、次いで細胞（Ｃ）中に存
在するホルモン（Ｈ）またはその同族体の濃度を制御す
るだけで、その転写がホルモン／受容体−複合体により
活性化される遺伝子によってコードされる蛋白質の生成
を制御することができる。この概念は本発明による細胞
の工学的処理および蛋白質の製造のための方法の基礎で
ある。本発明による細胞の工学的処理法および蛋白質の
製法によれば、（１）細胞（Ｃ）を遺伝子（Ｇ）が含有
されるべく工学的に処理し、その結果遺伝子（Ｇ）の転
写は適宜なホルモン／受容体、（Ｈ）／（Ｒ）、複合体
が結合し、これにより遺伝子（Ｇ）の転写が活性化され
る転写制御要素による制御下に置かれ；（２）この時点
で転写制御要素による制御下にある遺伝子（Ｇ）が含有
される細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発現可能であ
り、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能的形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換し；
（３）最後に、細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）また
はその同族体の濃度を調節して、形質転換細胞（Ｃ）の
浸漬に用いる培養液から細胞が利用しうるホルモン
（Ｈ）の量を増大および制御することにより、遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく効果的に増大およ
び制御される。このように遺伝子（Ｇ）の転写を増大お
よび制御することにより、蛋白質（Ｐ）の生成も増大お
よび制御される。上記の誘導法の場合、本発明による細
胞の工学的処理および蛋白質製造のための方法において
はホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）の双方が細胞
（Ｃ）中に存在する。また誘導法の場合、受容体（Ｒ）
またはその機能的な修飾された形態（ｒ）の存在が本発
明の（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡにより細胞
（Ｃ）を形質転換することにより保証される。前記のよ
うに、培養細胞を形質転換する方法は周知であり、当業
者が多大な実験なしに用いることができる。適宜な濃度
の（Ｈ）または（ａＨ）を含有する浸漬液中に形質転換
細胞（Ｃ）を浸漬するだけで、（Ｈ）またはその同族体
（ａＨ）の存在を保証し、かつ（Ｈ）または（ａＨ）の
濃度を制御することができる。適宜な濃度、すなわち一
定量の蛋白質を生成するために細胞（Ｃ）が必要とする
（Ｈ）または（ａＨ）の濃度は、一定の条件下で多大の
実験なしに当業者が判定することができる。同様に当業
者に自明のとおり、細胞（Ｃ）を本発明のＤＮＡにより
形質転換することによって細胞（Ｃ）における適切な
（Ｒ）または（ｒ）の供給が保証され、従って（Ｒ）ま
たは（ｒ）の欠如が遺伝子（Ｇ）の転写における制限因
子となることはない。このため、培養液中の（Ｈ）また
は（ａＨ）の量を増加させるだけで、細胞（Ｃ）中に産
生される蛋白質の（Ｐ）の量を増加させることができる
であろう。本発明の誘導法の場合と同様に、本発明によ
る細胞の工学的処理および蛋白質の製造のための方法は
下記の条件を満たす限り、細胞（Ｃ）に挿入することが
でき、その結果ホルモン（Ｈ）またはその同族体のいず
れかと複合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状
腺ホルモン受容体（Ｒ）の結合によって活性化される転
写制御要素による転写制御下に置かれるいかなる遺伝子
（Ｇ）の発現の制御にも採用することができる：（１）
受容体（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えた
その機能的な修飾された形態（ｒ）をコードするＤＮＡ
を使用できる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞であ
る；（３）（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡは遺
伝子（Ｇ）が存在する細胞において発現可能である。こ
の場合も多大な実験なしに当業者は寄託された本発明の
ＤＮＡのいずれをもプローブとして用いて、現在入手で
きない（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡのゲノム
ライブラリーを探査することができる。これらのＤＮＡ
が見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細胞
（Ｃ）において発現可能である場合には本発明の工学的
蛋白質製造法に使用できる。同様に多大な実験なしに、
細胞（Ｃ）に（Ｈ）が存在する場合その基礎水準はどの
程度であるか、また遺伝子（Ｇ）の転写を、従って蛋白
質（Ｐ）の生成を誘導および制御するためには（Ｈ）ま
たは（ａＨ）の濃度はどの程度でなければならないかを
当業者は判定できる。培養細胞（Ｃ）の浸漬に用いられ
る培養液に（Ｈ）または（ａＨ）を添加することによ
り、目的量の蛋白質（Ｐ）を確実に生成させるのに必要
な濃度の（Ｈ）を形質転換細胞（Ｃ）に供給することが
できる。本発明の種々の観点を以下の７実験例に詳述
し、例示する。実験の部Ｉはヒトグルココルチコイド受
容体に関する。より詳細にはこの例はｈＧＲ ｃＤＮＡ
の一次構造、およびこれまで報告されたｈＧＲ蛋白質と
機能的に区別できないポリペプチドへのその発現を示
す。実験の部ＩＩはｈＧＲの機能区に関する。この例に
示されるように、ＧＲは少なくとも４個の機能区を含
み、それらのうち２個は予想されたものであり、予想さ
れたＤＮＡ−およびステロイド−結合区に対応し、それ
らのうち２個は予想されなかったものであり、転写に対
し強い作用をもつ。実験の部ＩＩＩは甲状腺ホルモン受
容体ｃ−ｅｒｂ−Ａに関する。この実験例に示すよう
に、ｃ−ｅｒｂ−Ａは本発明者らがここでｈＴＲアルフ
ァと呼ぶ甲状腺ホルモン受容体をコードする。本発明者
らが予想外に第２の甲状腺ホルモン受容体を見出したこ
とと合わせて（実験例ＶＩＩ参照）、実験の部ＩＩＩに
示されたｃ−ｅｒｂに関するデータは甲状腺ホルモン受
容体蛋白質についてのより詳細な知見を得るのにきわめ
て有用であろう。実験の部ＩＶはヒトミネラルコルチコ
イド受容体に関する。これは本発明者らが示すようにグ
ルココルチコイド受容体に対し構造的および機能的類似
性をもつ。実験Ｖは本発明者らがｈＥＲＲ１およびｈＥ
ＲＲ２と呼ぶ新規な予想されなかった一群のステロイド
ホルモン受容体を示す。これらの受容体は新規なステロ
イドホルモン系の存在に対する最初の証拠を与える。新
規な“シス−トランス”バイオアッセイ系に関する本明
細書の記述と合わせて、この新規なエストロゲン関連受
容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２は新規なホルモンの同
定へ系統的に導くアッセイ系を開発するための基礎を与
えるであろう。このような新規な系の同定は広範な生理
学的および臨床上の重要性をもつと思われる。実験の部
ＶＩにはラット甲状腺ホルモン受容体ｃ−ｅｒｂ−Ａオ
リゴヌクレオチドにおいて本発明者らがＴ３調節に必要
であることを見出した部位に関する本発明者らのデータ
を若干示す。これらの知見は、実験の部ＩＩＩ、および
ヒト染色体１７に結合した新規な予想されなかった甲状
腺ホルモン受容体に関する実験ＶＩＩの記述と合わせ
て、甲状腺ホルモン受容体蛋白質の特性を開明する際に
有用であろう。これ以上詳述しなくても当業者は以上の
記述および以下の実験の部によって本発明を最大限に利
用することができると考えられる。実験の部に示した材
料は特に指示しない限り例示の目的で示されたものであ
り、従って何らかの形で請求の範囲の記載を限定するも
のと解すべきではない。
コイドおよび甲状腺ホルモンの受容体に特有のホルモン
結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡセグメントに関する。本発明のこの
観点によれば、これらのＤＮＡセグメントは適切な宿主
細胞において発現され、これによりグルココルチコイ
ド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容
体、または受容体様蛋白質を生成しうるものである。本
発明は本発明のＤＮＡのセンスストランドの転写の結果
生成したｍＲＮＡにも関する。本発明のＤＮＡはここで
は以下のとおり呼ばれるＤＮＡによって例示される。ヒ
トグルココルチコイド受容体ＤＮＡ（ｈＧＲ）；ヒト甲
状腺ホルモン受容体ＤＮＡ（ｈＴＲ：ｈＴＲアルファお
よびｈＴＲベータ；ｈＴＲアルファはたとえばｈＥＲＢ
Ａ８．７およびｈＦＡ８である；ｈＴＲベータはたとえ
ば細胞性のもの、すなわち“ｃ−ｅｒｂ−Ａ”であ
る）；ラット甲状腺ホルモン受容体（ｒｂｅＡ１２）、
これはヒト甲状腺ホルモン受容体アルファのラット同族
体である；ヒトミネラルコルチコイド受容体（ｈＭ
Ｒ）；ならびに新規なヒトステロイドホルモン受容体
（ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２）。センスストランドｃ
ＤＮＡヌクレオチド配列、およびこれらによりコードさ
れる推定一次蛋白質配列は以下の図に示される。第Ｉ−
２（１）および１−２（２）図：ｈＧＲについて；第Ｉ
ＩＩ−１（Ｂ）−１およびＩＩＩ−１（Ｂ）−２図：ヒ
トｃ−ｅｒｂ−Ａについて、ならびに第ＩＩＩ−７図：
ｈＥＲＢＡ８．７およびｈＦＡ８について；第ＩＶ−２
（Ｂ）−１およびＩＶ−２（Ｂ）−２図：ｈＭＲについ
て；第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）−２、なら
びにＶ−２（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図：それ
ぞれｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２について；ならびに第
ＶＩＩ−１（Ｂ）図：ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂ
ｅＡ１２について。ＤＮＡ、たとえばｈＧＲ、ヒトｃ−
ｅｒｂ−Ａ、ｈＥＲＢＡ８．７、ｈＦＡ８、ｈＭＲ、ｈ
ＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２は本発明の好ましいＤＮＡで
ある。同様にこれらおよび他の本発明のＤＮＡを保有す
るプラスミドも好ましい。好ましいプラスミドは以下の
ものが含まれる。ｐＲＳｈＧＲ−アルファ，ｐＲＳｈＭ
Ｒ，ｐｅＡ１０１，ｒｂｅＡ１２，ＧＭＣＡＴ，ｐＥ
４，ｐＨＫＡ，ｐｈＥＲＢＡ８．７，ｐｈＦＡ８，およ
びｐｈＨ３。ｐＲＳｈＧＲ−アルファのほかに好ましい
ＤＮＡにはｐＲＳｈＧＲ−アルファの修飾体も好まれ、
これらはここでは下記のように表示される。Ｉ９，Ｉ３
７，Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６
２，Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０
３，Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４
８，Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，および
Ｉ６８４。ここで“Ｉ”は“挿入配列（Ｉｎｓｅｒ
ｔ）”を表わし、“Ｉ”に続く数字はＤＮＡ修飾の表示
を表わす。修飾されたｐＲＳｈＧＲ系ＤＮＡのうちきわ
めて好ましいものは、ヒトグルココルチコイド受容体に
特有な転写活性化特性の少なくとも１０％を有する蛋白
質をコードするものである。これらのＤＮＡには、Ｉ
９，Ｉ３７，Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１
４，Ｉ２６２，Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８
４，Ｉ４０３，Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４
０，Ｉ４４８，Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５
０，およびＩ６８４が含まれる。ｐＲＳｈＧＲ−アルフ
ァの構造は本明細書の“実験の部ＩＩ”と表示される部
分に詳述されている。（特に項目ＩＩ．Ｆ．（ｂ）、
“組換えプラスミド”を参照されたい）。実験の部ＩＩ
には上記の章に述べたｐＲＳｈＧＲ−アルファ修飾体の
構造および特性についても詳述されている。第Ｉ−２
（１）およびＩ−２（２）図に示したｈＧＲに対するｃ
ＤＮＡ配列に関しては、図示された配列の５’末端の２
個のＣはＲＳＶ−ＬＴＲを含むセグメントの３’末端に
図示したセグメントを結合させるＫｐｎＩ部位の部分で
ある。図示した配列の３’末端のＴは、図示したセグメ
ントがＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントに
結合する地点の５’側へ数個の塩基の位置にある。ｐＲ
ＳｈＭＲは本質的にｐＲＳｈＧＲ−アルファと同じ様式
で構成され、本質的にｐＲＳｈＧＲ−アルファと等し
い。言い換えると、挿入部位におけるわずかな修飾を除
いて、第ＩＶ−２（Ａ）図に示したｈＭＲセグメント
が、第Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図に配列を示し
たｈＧＲに置換している。ｐＲＳｈＧＲと同様にｐＲＳ
ｈＭＲはラウス肉腫ウィルス由来のプロモーターおよび
ＳＶ４０複製開始点の制御下に受容体蛋白質ＤＮＡコー
ド配列を含有する。実験の部ＩＶの参考文献部分の脚注
４１を参照されたい。第ＩＶ−４（Ａ）図も参照し、第
ＩＩ−１図と比較されたい。第ＩＶ−２（Ｂ）−１およ
びＩＶ−２（Ｂ）−２図に示したｈＭＲ配列に関して
は、このセグメントの５’末端にあるＡＧはＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位から数塩基対下流にあり、これによってｈＭＲ
セグメントはＲＳＶ−ＬＴＲ含有セグメントに結合して
いる。第ＩＶ−２（Ｂ）−２図に示したセグメントの
３’末端のＡＡはＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセ
グメントの５’末端から塩基数個上流にある。プラスミ
ドｐｅＡ１０１はヒト甲状腺ホルモン受容体ｃ−ｅｒｂ
−Ａのコード領域全体を保有する。（ｃ−ｅｒｂ−Ａに
対する遺伝子はヒト染色体３に局在する；この受容体遺
伝子によりコードされる蛋白質生成物をここではｈＴＲ
ベータと呼ぶ。実験の部ＩＩＩを参照し、実験の部ＶＩ
Ｉと比較されたい）。プラスミドｐｅＡ１０１はｐｈｅ
Ａ１２（第ＩＩＩ−１（Ａ）図参照）からのＥｃｏＲＩ
断片を発現ベクターｐＧＥＭ３（プロメガ・バイオテ
ク）のＥｃｏＲＩ部位に適正な向きに挿入することによ
り構成された。この構造についての詳細は実験の部ＩＩ
Ｉ、項目ＩＩＩ．１の第ＩＩＩ−４法と表示する項目を
参照されたい。ヒト染色体３に局在しているｈＴＲ受容
体のほかに、本発明者らはプラスミドｐｅＡ１０１によ
り推定される蛋白質配列と異なる第２の甲状腺ホルモン
受容体を見出した。本発明者らはこの新規な予想されな
かった甲状腺ホルモン受容体をラットおよびヒトの双方
から単離し、特性を調べた。ラットの場合、この新規な
甲状腺ホルモン受容体はプラスミドｒｂｅＡ１２のＤＮ
Ａによりコードされる。（ｒｂｅＡ１２に関するＤＮＡ
および推定一次蛋白質配列を第ＶＩＩ−１（Ｂ）図に示
す。）ヒトの場合、この新規な甲状腺ホルモン受容体は
プラスミドクローンｈＥＲＢＡ８．７およびその関連ク
ローンｈＦＡ８によりコードされる。（ｈＥＲＢＡの配
列については第ＩＩＩ−７図を参照されたい。）ｈＥＲ
ＢＡ８．７およびｈＦＡ８は同一遺伝子からのｃＤＮＡ
生成物である。クローンｈＦＡ８のＤＮＡ配列は下記の
点を除いてｈＥＲＢＡ８．７（第ＩＩＩ−７図に示す）
と等しい。ｈＦＡ８の配列は第ＩＩＩ−７図に示す配列
より短い。より詳細には、ｈＥＲＢＡ８．７のヌクレオ
チド１（Ｇ）から５１４（Ａ）までがｈＦＡ配列にはな
い。さらにｈＦＡ８配列は塩基対位置１１３８のグアニ
ン（Ｇ）から塩基対１２４４のグアニン（Ｇ）に及ぶ欠
失を有する。この欠失によってアミノ酸３６８（Ｇｌ
ｕ）から４０６（Ｇｌｎ）までがｈＦＡ８クローンによ
りコードされるポリペプチドから失われる。前記のよう
に本発明の最初の甲状腺ホルモン受容体は染色体３に局
在している。実験の部ＶＩＩに示すように、新規な甲状
腺ホルモン受容体に対するヒト遺伝子はヒト染色体１７
に局在している。ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂｅＡ
１２は染色体１７からのヒト遺伝子生成物のラット型同
族体を表わす。それらは異なる遺伝子坐によりコードさ
れるので、染色体１７遺伝子生成物はｈＴＲアルファと
して分類され、染色体３遺伝子生成物はｈＴＲベータと
して分類されている。関連性は高いが、アルファおよび
ベータ遺伝子生成物はそれらの一次アミノ酸配列におい
て特異的変化を含む。またアルファおよびベータ生成物
は特徴的に異なる発現パターンを示す。甲状腺ホルモン
の作用は多岐にわたり、それらの受容体に依存してい
る。本発明者らが甲状腺ホルモン受容体をクローニング
する以前はこの受容体は精製または生化学的特性の解明
はなされていなかった。科学文献にも多種の甲状腺ホル
モン受容体遺伝子生成物の存在を示唆する証拠は全くな
かった。多種の受容体が存在することは、これら受容体
のうち１種類のみを選択的に活性化する甲状腺ホルモン
同族体を開発する基礎として有用である。これは広範な
臨床的威力をもつと思われるので、興味ある重要な知見
である。本発明者らが特性を明らかにした最初の甲状腺
ホルモン受容体はｐｅＡ１２、すなわち現在ヒト甲状腺
ホルモン受容体ベータと呼ばれる受容体であった。本発
明者らは分子ハイブリダイゼーションによってラット脳
ｃＤＮＡライブラリーを関連配列につきスクリーニング
するためにこのベータクローンを用いた。これによって
プラスミドｒｂｅＡ１２が同定され、のちにこれがアル
ファ群の新規な甲状腺ホルモン受容体として同定され
た。このラットｒｂｅＡ１２はｒｂｅＡ１２遺伝子生成
物に対するヒト同族体をクローニングするための分子ハ
イブリダイゼーションプローブとして用いられた。この
ヒト生成物はクローンｈＥＲＢＡ８．７およびｈＦＡ８
によりコードされる。他の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮ
Ａ（ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂｅＡ１２、ならび
にヒト甲状腺ホルモン受容体ｈＥＲＢＡ８．７およびｈ
ＦＡ８）はそれらのｃＤＮＡをｃ−ｅｒｂ−Ａについて
行ったと同様に適正な向きで発現ベクターｐＧＥＭ３中
へ挿入することによって発現させることができる。ここ
でプラスミドＧＭＣＡＴについて述べると、これはクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）に対する細胞遺伝子に結合したＭＴＶＬＴＲを含む
レポータープラスミドである。この結合の結果、ｐＧＭ
ＣＡＴを用いてＭＴＶプロモーターの転写活性を評価す
るための酵素アッセイを行うことができる。ＭＴＶプロ
モーターは数種のグルココルチコイド応答要素（ＧＲ
Ｅ）を含むので、レポータープラスミドｐＧＭＣＡＴは
グルココルチコイドまたはミネラルコルチコイドレポー
ターＤＮＡ（現在知られているか、またはのちに見出さ
れた）を保有する発現プラスミドと共に適切な宿主細胞
中へ共トランスフェクションすることができる。（この
ような共トランスフェクションは本発明の“シス−トラ
ンス”機能性バイオアッセイ系の一部である。本発明の
この観点についてはのちに詳述する。）共トランスフェ
クションした宿主細胞においてＣＡＴ活性が検出された
ことは、受容体発現プラスミドにより産生されたポリペ
プチドが機能性であること、すなわち受容体蛋白質に特
有の転写活性化特性を有することを示す。プラスミドｐ
ＧＭＣＡＴはＡＴＣＣに特許の目的で寄託され、ＡＴＣ
Ｃ＃６７２８２を得た。（ｐＧＭＣＡＴの模式図につい
ては第ＩＶ−５（Ａ）図を参照されたい。） プラスミドｐＧＨＣＡＴは本発明に有用な他のレポータ
ープラスミドの一例である。ｐＧＨＣＡＴはクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対
する細菌遺伝子に機能性結合した成長ホルモンプロモー
ターの一部を含む。この結合のため、ｐＧＨＣＡＴを用
いて成長ホルモン（ＧＨ）プロモーターの転写活性を評
価するための酵素アッセイを行うことができる。ＧＨプ
ロモーターは甲状腺ホルモン応答要素（ＴＲＥ）を含む
ので、レポータープラスミドｐＧＨＣＡＴは甲状腺ホル
モンレポーターＤＮＡ（現在知られているか、またはの
ちに見出された）を保有する発現ベクターと共に適切な
宿主細胞中へ共トランスフェクションすることができ
る。（このような共トランスフェクションも本発明の
“シス−トランス”レポーター機能性バイオアッセイ系
の一部である。本発明のこの観点についてはのちに詳述
する。）ｐＧＨＣＡＴをＴＲ発現プラスミド（これはた
とえばｈＴＲアルファまたはｈＴＲベータＤＮＡを保有
する）と共に用いて適切な宿主細胞を共トランスフェク
ションした場合、共トランスフェクションした宿主細胞
におけるＣＡＴ活性の検出は、甲状腺ホルモン受容体
（ＴＲ）発現プラスミドにより産生されたポリペプチド
が機能性であること、すなわち甲状腺ホルモン受容体蛋
白質に特有の転写活性化特性を有することを示すために
用いられる。プラスミドｐＥ４およびｐＨＫＡは、ここ
ではｈＥＲＲ１と呼ばれるエストロゲン関連受容体をコ
ードするｃＤＮＡに関係する。（実験の部Ｖ、特に第Ｖ
−１（Ａ）および（Ｂ）図を参照されたい。）プラスミ
ドｐＥ４は第Ｖ−１（Ａ）図においてラムダｈＫＥ４と
よばれるｃＤＮＡセグメントを保有し；ｐＨＫＡは同図
においてラムダｈＫＡ１と呼ばれるセグメントを保有す
る。ｐＥ４およびｐＨＫＡ共方ともＡＴＣＣに特許の目
的で寄託されている。これら２種のプラスミドを後記に
従って結合させて、エストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１
に対する全コード配列を含む単一プラスミド（ｐＧＭＥ
ＲＲ１）を得ることができる。２種のｃＤＮＡクローン
ｐＥ４およびｐＨＫＡを結合させるための好ましい方法
は、各ｃＤＮＡに存在する特異的制限酵素部位に対し各
末端において相補的である合成リンカーを利用する。よ
り詳細には、ラムダｈＫＡ１およびラムダｈＫＥ４から
の挿入配列をＥｃｏＲＩ断片としてプラスミドベクター
ｐＧＭ３（プロメガ・バイオテク）中へクローニングす
る；本発明者らはこれらをそれぞれｐＧＭＫＡおよびｐ
ＧＭＫＥと命名した。次いでｐＧＭＫＡをＮａｒＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ｈＥＲＲ１をコードす
る断片をアガロースゲルから精製する（断片１）。ｐＧ
ＭＫＥをＤｒａＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断
し、ｈＥＲＲ１の５’末端領域およびベクター配列をコ
ードする断片をアガロースゲルから精製する（断片
２）。第３に、互いに相補的な２種の合成オリゴヌクレ
オチドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドは下記
のものである。 オリゴＩ：ＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧ
ＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡ
ＧＣＣＧＧＣＧＧＧ； オリゴＩＩ：ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣ
ＣＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＴ。最後に断片１および
２ならびにオリゴＩおよびＩＩを当業者に周知の標準法
に従って互いにリゲートさせ、次いで細菌ＤＨ５株中へ
形質転換する。得られたコロニーをここではｐＧＭＥＲ
Ｒ１と呼ばれるＤＮＡ構造物につきスクリーニングす
る。プラスミドｐＧＭＥＲＲ１を用いてｈＥＲＲ１を発
現させることができる。ｐＧＭＥＲＲ１の模式図につい
ては第Ｉ−６（Ａ）図を参照されたい。プラスミドｐｈ
Ｈ３は、ヒト心臓ラムダｇｔｌｌ ｃＤＮＡライブラリ
ーから、ラムダｈＫＡ１の５’部分を表わす、ニックト
ランスレーションされた７００−ｂｐ ＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｍａＩ断片を用いて単離されたラムダｈＨ３クローンに
関連する。（ラムダｈＫＥ４およびラムダｈＫＡ１クロ
ーンはヒト腎ラムダｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーから
単離された；実験の部Ｖ．Ｈ，特に第Ｖ−１およびＶ−
２図法と表示される項目を参照されたい。）ラムダｈＨ
３クローンはここではｈＥＲＲ２と呼ばれるエストロゲ
ン関連受容体をコードするｃＤＮＡを保有する。ｐｈＨ
３からのｃＤＮＡをｐＧＭ３中へ挿入してｐＧＭＥＲＲ
２を形成することができる。その図は第Ｉ−６（Ｂ）図
に示されている。受容体様ポリペプチドｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２の機能上および構造上の特性を実験の部Ｖ
に示す。本発明者らが本発明のＤＮＡを用いて得た知見
の１つは、同一種内の各種ホルモン受容体間の、また特
定のいずれかの受容体については種間の著しい配列相同
である。（たとえばｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子生成物、
ヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａポリペプチド、ならびにヒトグ
ルココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキ
シ末端部分を比較した第ＩＩＩ−２図；ステロイドおよ
び甲状腺ホルモン受容体を比較した第ＩＩＩ−６図；ミ
ネラルコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容体
のアミノ酸相同を比較した第ＩＶ−３図；ｈＧＲ，ｈＭ
ＲおよびｈＰＲ間のアミノ酸比較を示した第ＩＶ−８
図；ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンおよび
ヒトグルココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域を
比較した第Ｖ−３図；ならびにｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ
２，ｈＥＲ，ｈＧＲおよびヒト甲状腺ホルモン受容体ｈ
Ｔ３Ｒベータ間のアミノ酸の比較を示す第Ｖ−５図を参
照されたい。）この相同性があるため本発明のＤＮＡお
よびＲＮＡは、ホルモンと複合体を形成したのちクロマ
チンＤＮＡに結合することにより転写を活性化するホル
モン受容体をコードする遺伝子を実質的にいかなる種か
らも検出および単離することができる。本発明のＤＮＡ
およびＲＮＡ、特にＡＴＣＣに特許の目的で寄託された
好ましいＤＮＡを用いることにより、当業者は多大な試
験を行うことなくゲノムライブラリーをスクリーニング
して、本発明の範囲に含まれる他のグルココルチコイ
ド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモン受容体
を見出すことができる。本発明のこの観点は本発明者ら
によりエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲ
Ｒ２（実験例Ｖ、特に項目Ａ、序、および項目Ｂ、受容
体ｈＥＲＲに対するｃＤＮＡクローンの項を参照された
い）、ならびにラット甲状腺ホルモン受容体およびヒト
甲状腺ホルモン受容体ＴＲアルファ（実験の部ＶＩＩ、
特に項目Ｃ、第２甲状腺ホルモン受容体ＤＮＡの単離、
ならびに第ＶＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図を参照され
たい）が見出されたことにより説明される。本発明のＤ
ＮＡおよびセンスストランドＤＮＡはたとえば本発明の
誘導法および蛋白質製造法と組合わせて使用して、大量
の実質的に純粋な受容体蛋白質を製造することができ
る。さらに、こうして製造された実質的に純粋な受容体
蛋白質を周知の方法により診断アッセイ法に使用して、
各種の体液および組織試料における特定のホルモンの存
在を調べることができる。さらに本発明の受容体蛋白質
を結合アッセイ法、たとえば実験の部ＩＩＩに述べるｐ
ｅＡ１０１によりコードされる受容体へのＴ３の結合に
関する方法、または後述する本発明の“シス−トラン
ス”受容体機能性バイオアッセイ法により、受容体作用
薬および受容体拮抗薬をスクリーニングするのに用いる
ことができる。最後に、本発明の受容体蛋白質は実質的
に純粋な形で製造されるので、それらを結晶化し、Ｘ線
回折法によりそれらの構造を調べることができる。当業
者に周知のように、これらの測定は“合成”または修飾
された受容体蛋白質同族体を工学的に製造する際にきわ
めて有用である。ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにこれら
により製造された新規な受容体蛋白質のほかに、本発明
は以下の３種の一般法を開示する。一方法は受容体蛋白
質の機能性を測定するためのバイオアッセイ法に関す
る。他の二方法はそれらの転写がクロマチンＤＮＡに結
合したホルモン−受容体−複合体により活性化される遺
伝子の発現を誘導および制御する方法に関する。これら
３種の一般法それぞれにつき別個に述べる。本発明者ら
が“シス−トランス”バイオアッセイ系と呼ぶ、受容体
機能性を試験するための新規なバイオアッセイ系は２種
のプラスミド、すなわち“発現”プラスミドおよび“レ
ポーター”プラスミドを使用する。本発明によれば発現
プラスミドは本発明の受容体ＤＮＡまたはそれらの変異
体を適切な受容体陰性宿主細胞において発現しうるいか
なるプラスミドであってもよい。同様に本発明によれば
レポータープラスミドは作動性レポーター遺伝子に機能
性結合した作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハ
ンサー要素を含むいかなるプラスミドであってもよい。
（ここで用いる用語の説明については本明細書の定義の
項を参照されたい。）プラスミドｐＧＭＣＡＴおよびｐ
ＧＨＣＡＴは作動性レポーター遺伝子に機能性結合した
作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素
を含むレポータープラスミドの例であり、従って本発明
の受容体機能性バイオアッセイに使用できる。ｐＧＭＣ
ＡＴの場合、作動性ホルモン応答性プロモーター／エン
ハンサー要素はＭＴＶ ＬＴＲであり；ｐＧＨＣＡＴの
場合、これは成長ホルモン受容体の機能性部分である。
ｐＧＭＣＡＴおよびｐＧＨＣＡＴの双方において作動性
レポーター遺伝子はクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対する細菌性遺伝子であ
る。本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオア
ッセイを実施する際には、発現プラスミドおよびレータ
ープラスミドを適切な受容体陰性宿主細胞中へ共トラン
スフェクションする。トランスフェクションされた宿主
細胞は次いでホルモンまたは同族体の存在下または不在
下で培養され、レポータープラスミドのホルモン応答性
プロモーター／エンハンサー要素を活性化することがで
きる。トランスフェクションおよび培養された宿主細胞
を次いでレポーター遺伝子配列の生成物の誘導（すなわ
ち存在）につき監視する。最後に、ホルモン受容体蛋白
質またはそれらの変異体（発現プラスミド上の受容体Ｄ
ＮＡ配列によりコードされ、トランスフェクションおよ
び培養された宿主細胞において産生されたもの）の発現
および／またはステロイド結合能を本発明に従って測定
する。（この“シス−トランス”バイオアッセイ系の模
式図については第ＩＩ−１図を参照されたい。）本発明
の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセイ系を
好ましい形態においてグルココルチコイドまたはミネラ
ルコルチコイド受容体の機能性の測定に用いる場合、プ
ラスミドは選択可能なマーカー、たとえばａｍｐ遺伝子
を保有するであろう。さらに、好ましい形態においては
レポータープラスミドはＭＴＶＬＴＲまたは成長ホルモ
ンプロモーターの機能性部分をホルモン応答性プロモー
ター／エンハンサー要素として含むであろう。ＭＴＶ
ＬＴＲが好ましいのは、グルココルチコイドホルモンが
ＭＴＶ ＬＴＲ内の特異的部位において転写開始の効率
を高めることによりＭＴＶ ＤＮＡの転写速度を剌激す
ることが知られているからである。さらにグルココルチ
コイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッピングされたＤ
ＮＡ配列に特異的に結合し、従って異種プロモーターに
対するグルココルチコイドの応答性を与えることができ
る。（実験の部ＩＩ、特に項目Ｃ．（ａ）、アッセイ系
および実験様式を参照されたい。）またミネラルコルチ
コイド受容体がグルココルチコイド受容体と機能的関連
を示すこと、およびｈＭＲのＤＮＡ結合区がＭＴＶＬＴ
Ｒを認識することも知られている。（実験の部ＩＶ、特
に項目Ｅ．：発現およびホルモンの結合、および項目
Ｆ．：転写活性化を参照されたい。）成長ホルモンプロ
モーターが好ましいのは、その活性化が甲状腺ホルモン
−受容体−複合体による結合に応答するからである。本
発明の“シス−トランス”バイオアッセイ系に用いるた
めに好ましい宿主細胞はＣＯＳ細胞およびＣＶ−１細胞
である。（本発明のバイオアッセイ系に用いられる好ま
しい宿主細胞については、実験の部ＩＩ、項目Ｃ．
（ａ）アッセイ系および実験様式を参照されたい。）Ｃ
ＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）細胞はＳＶ４０Ｔ抗原（Ｔａ
ｇ）を発現するマウス腎細胞であり；ＣＶ−１はＳＶ４
０ Ｔａｇを発現しない。ＣＶ−１細胞は内在性グルコ
コルチコイドもしくはミネラルコルチコイドまたは他の
既知のステロイドホルモンもしくは甲状腺ホルモンの受
容体をいずれも欠如するので好都合である。従って適宜
な発現ベクターを用いる遺伝子転写によりこれらの宿主
細胞を受容体陰性から受容体陽性へ転換させることが可
能である。ＣＯＳ−１誘導体系にＴａｇが存在すること
によって、導入された発現プラスミドを複製し、アッセ
イ期間中に生成する受容体の量を相対的に高めることが
できる。ＳＶ４０複製開始点（ｏｒｉ）を含む発現プラ
スミドは、ＳＶ４０Ｔａｇを発現するいかなる宿主細胞
においても高いコピー数にまで増殖することができる。
従ってＳＶ４０“ｏｒｉ”を保有する本発明の発現プラ
スミドはＣＯＳ細胞において複製しうるが、ＣＶ−１細
胞においては複製されない。高いコピー数によって与え
られる高い発現が望ましいが、これは開示されたバイオ
アッセイ系にとって決定的なものではない。いずれかの
特定の細胞系を“宿主”として用いることも決定的なも
のではない。上記発現ベクターはきわめて有効であるの
で、本発明者らによればこのアッセイ法は本発明者らが
試験したすべての宿主において作動した。ＣＶ−１細胞
が好ましいのは、それが遺伝子転移の研究に好都合であ
り、感受性の、かつ十分に報告された宿主細胞系を提供
するからにすぎない。“シス−トランス”バイオアッセ
イ系は、本発明の受容体ＤＮＡが転移した宿主細胞中に
発現したか否かを判定するために特に有用である。これ
は本発明の受容体が対応する天然の同系受容体の結合活
性の少なくとも約１０％を有するか否か、またこの受容
体が対応する天然の同系受容体の転写活性化活性の少な
くとも１０％を有するか否かを判定する際にも有用であ
る。第ＩＩ−１図は本発明の“シス−トランス”受容体
機能性バイオアッセイ系をｈＧＲ ｃＤＮＡによりコー
ドされる受容体ポリペプチドの機能性の測定に用いる方
法につき模式的に示す。このバイオアッセイ法の詳細、
および受容体の機能性を試験するための定量性バイオア
ッセイ系としてのその有効性は実験の部ＩＩに開示およ
び論述される。（特に項目Ｆ．実験法；および項目Ｃ
（ｂ）、機能性ｈＧＲの発現を参照されたい。）同実験
の部に示されるように、ホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素の活性化を証明するために採用できる
ＣＡＴ酵素アッセイ法のほかに、転移宿主細胞のウェス
ターンブロット分析法を採用して、対照として用いられ
る同系受容体から移動性に関して区別できない受容体ポ
リペプチドの合成を証明することができる。さらに本発
明の“シス−トランス”バイオアッセイ系を採用して、
特異的ホルモンによる受容体（トランスフェクションお
よび培養された宿主細胞において産生されたもの）の活
性化、ならびにそれらのホルモン結合能および特性を調
べることができる。実験の部ＩＩに証明されるように、
これがｈＥＲについて行われた場合本発明のｈＧＲは機
能性であり、同系受容体の場合と同じ特異性および濃度
でグルココルチコイドホルモンと結合することが示され
た。最後に本発明者らは要約の項に示すように本発明の
ＤＮＡを用いて、その転写が受容体との複合体を形成し
たホルモンにより活性化される遺伝子（Ｇ）の転写活性
化に必要かつ十分な条件は、（Ｇ）が存在する細胞
（Ｃ）中にホルモンおよびその受容体が存在することで
あることを見出した。（ホルモン（Ｈ）および受容体
（Ｒ）が遺伝子（Ｇ）の転写に作用する様式は完全には
理解されていない。しかし受容体（Ｒ）はホルモン
（Ｈ）と複合体を形成した場合、特異的ＤＮＡ部位、す
なわち当技術分野で“転写制御要素”または“転写刺激
を媒介するＤＮＡ配列”と呼ばれ、遺伝子（Ｇ）が位置
する付近のクロマチン上に存在するものに結合すると考
えられる。ホルモン／受容体−すなわち（Ｈ）／（Ｒ）
−複合体によるこの結合は、まだ解明されていない様式
で、遺伝子（Ｇ）に対するプロモーターを“始動させる
（ｔｕｒｎ ｏｎ）”かまたは何らかの他の方法で活性
化し、これにより（Ｇ）遺伝子の転写を刺激するホルモ
ン依存性“スイッチ”として作用すると思われる。） 本発明者らの知見によって、遺伝子工学的に処理された
細胞において目的蛋白質を産生させるための改良された
組成物および方法が得られた。これらの方法２種が本発
明方法である。第１はその転写が受容体との複合体を形
成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘
導する方法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理
し、次いでその転写が受容体との複合体を形成したホル
モンによって活性化される遺伝子によりコードされる蛋
白質の生成を増大および制御する方法である。これら２
方法につき述べる際にも、受容体蛋白質との複合体を形
成したホルモンにより転写が活性化される遺伝子を遺伝
子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子（Ｇ）を活性化するホルモンを
（Ｈ）、その同族体をいずれも（ａＨ）と呼ぶ。受容体
蛋白質は（Ｒ）、その機能性修飾体は（ｒ）と呼ばれ
る。最後に、遺伝子（Ｇ）が存在する細胞を（Ｃ）と呼
び、遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質を（Ｐ）と
呼ぶ。本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子（Ｇ）を
含む細胞（Ｃ）が、細胞（Ｃ）において発現可能であ
り、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換され
る。そして細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）の濃度ま
たは同族体（ａＨ）の濃度を少なくとも遺伝子（Ｇ）の
発現を確実に誘導するのに十分な水準にまで高める。実
験の部ＩＩに示したように本発明の誘導法を採用した場
合、意外にも遺伝子（Ｇ）が位置する細胞に（Ｈ）およ
び（Ｒ）が存在することによって遺伝子（Ｇ）の転写が
誘導されるだけでなく、蛋白質（Ｐ）の産生が５００〜
１０００倍高められた。この知見はこの誘導法が転写を
誘導するためにだけでなく、これを増大および制御する
ためにも採用されることを本発明者らに示した。この知
見から、細胞を工学的に処理し、次いでその転写が受容
体との複合体を形成したホルモンにより活性化される遺
伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質の生成を制御する
本発明方法も開発された。この方法についてはのちによ
り詳細に述べる。本発明の誘導法は細胞に与えられるホ
ルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度を調節す
るだけで蛋白質（Ｐ）の生成を増大させ、および制御す
るためにも採用できる。（当業者に自明のとおり、細胞
（Ｃ）を本発明のＤＮＡで形質転換すると、細胞（Ｃ）
において（Ｒ）または（ｒ）の適切な供給が保証される
ので、（Ｒ）または（ｒ）の欠如はもはや遺伝子（Ｇ）
の転写における制限因子とはならない。このため、培養
液中の（Ｈ）または（ａＨ）の量を増加させるだけで遺
伝子（Ｇ）の転写を増加させ、結果的に細胞（Ｃ）にお
いて産生される蛋白質の量を増加させることができるで
あろう。） 本発明の誘導法は下記の条件を満たす限り、ホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）のうちのいずれかと複
合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモ
ン受容体が結合することによって活性化される転写制御
要素による転写制御下にあるいかなる遺伝子（Ｇ）の発
現をも誘導するために採用できる：（１）受容体
（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えたその機
能的な修飾された形態（ｒ）をコードするＤＮＡを使用
できる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞である；
（３）細胞（Ｃ）がホルモン（Ｈ）または同族体（ａ
Ｈ）との複合体形成のために必要な（Ｒ）−または
（ｒ）−コード化ＤＮＡを発現すべく形質転換されう
る。当業者は寄託された本発明のＤＮＡのいずれをもプ
ローブとして用いて、現在入手できない（Ｒ）−または
（ｒ）−コード化ＤＮＡのゲノムライブラリーを多大な
実験なしに探査することができる。これらのＤＮＡが見
出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細胞
（Ｃ）において発現可能である場合には細胞（Ｃ）の形
質転換に使用できる。培養細胞を形質転換する方法は周
知であり、当業者が多大な実験なしに用いることができ
る。同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に（Ｈ）が存
在する場合その基礎水準はどの程度であるか、また遺伝
子（Ｇ）の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の生成を誘導お
よび制御するためには（Ｈ）または（ａＨ）の濃度はど
の程度でなければならないかを当業者は判定できる。培
養細胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液に（Ｈ）または
（ａＨ）を添加することにより、必要な濃度の（Ｈ）を
形質転換細胞（Ｃ）に供給することができる。本発明に
より、遺伝子（Ｇ）の転写に必要かつ十分な条件は遺伝
子（Ｇ）が存在する細胞（Ｃ）に（Ｈ）または（ａＨ）
および（Ｒ）または（ｒ）が存在することであり、遺伝
子（Ｇ）の転写、従って蛋白質（Ｐ）の生成は形質転換
細胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液中の（Ｈ）または
（ａＨ）の量を増加させるだけで誘導および制御できる
ことが教示された。当業者に自明のとおりこれらの知見
に基づいて細胞を工学的に処理し、その結果遺伝子
（Ｇ）が位置する細胞（Ｃ）中にホルモン（Ｈ）および
その受容体を確実に存在させ、次いで細胞（Ｃ）中に存
在するホルモン（Ｈ）またはその同族体の濃度を制御す
るだけで、その転写がホルモン／受容体−複合体により
活性化される遺伝子によってコードされる蛋白質の生成
を制御することができる。この概念は本発明による細胞
の工学的処理および蛋白質の製造のための方法の基礎で
ある。本発明による細胞の工学的処理法および蛋白質の
製法によれば、（１）細胞（Ｃ）を遺伝子（Ｇ）が含有
されるべく工学的に処理し、その結果遺伝子（Ｇ）の転
写は適宜なホルモン／受容体、（Ｈ）／（Ｒ）、複合体
が結合し、これにより遺伝子（Ｇ）の転写が活性化され
る転写制御要素による制御下に置かれ；（２）この時点
で転写制御要素による制御下にある遺伝子（Ｇ）が含有
される細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発現可能であ
り、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能的形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換し；
（３）最後に、細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）また
はその同族体の濃度を調節して、形質転換細胞（Ｃ）の
浸漬に用いる培養液から細胞が利用しうるホルモン
（Ｈ）の量を増大および制御することにより、遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく効果的に増大およ
び制御される。このように遺伝子（Ｇ）の転写を増大お
よび制御することにより、蛋白質（Ｐ）の生成も増大お
よび制御される。上記の誘導法の場合、本発明による細
胞の工学的処理および蛋白質製造のための方法において
はホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）の双方が細胞
（Ｃ）中に存在する。また誘導法の場合、受容体（Ｒ）
またはその機能的な修飾された形態（ｒ）の存在が本発
明の（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡにより細胞
（Ｃ）を形質転換することにより保証される。前記のよ
うに、培養細胞を形質転換する方法は周知であり、当業
者が多大な実験なしに用いることができる。適宜な濃度
の（Ｈ）または（ａＨ）を含有する浸漬液中に形質転換
細胞（Ｃ）を浸漬するだけで、（Ｈ）またはその同族体
（ａＨ）の存在を保証し、かつ（Ｈ）または（ａＨ）の
濃度を制御することができる。適宜な濃度、すなわち一
定量の蛋白質を生成するために細胞（Ｃ）が必要とする
（Ｈ）または（ａＨ）の濃度は、一定の条件下で多大の
実験なしに当業者が判定することができる。同様に当業
者に自明のとおり、細胞（Ｃ）を本発明のＤＮＡにより
形質転換することによって細胞（Ｃ）における適切な
（Ｒ）または（ｒ）の供給が保証され、従って（Ｒ）ま
たは（ｒ）の欠如が遺伝子（Ｇ）の転写における制限因
子となることはない。このため、培養液中の（Ｈ）また
は（ａＨ）の量を増加させるだけで、細胞（Ｃ）中に産
生される蛋白質の（Ｐ）の量を増加させることができる
であろう。本発明の誘導法の場合と同様に、本発明によ
る細胞の工学的処理および蛋白質の製造のための方法は
下記の条件を満たす限り、細胞（Ｃ）に挿入することが
でき、その結果ホルモン（Ｈ）またはその同族体のいず
れかと複合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状
腺ホルモン受容体（Ｒ）の結合によって活性化される転
写制御要素による転写制御下に置かれるいかなる遺伝子
（Ｇ）の発現の制御にも採用することができる：（１）
受容体（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えた
その機能的な修飾された形態（ｒ）をコードするＤＮＡ
を使用できる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞であ
る；（３）（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡは遺
伝子（Ｇ）が存在する細胞において発現可能である。こ
の場合も多大な実験なしに当業者は寄託された本発明の
ＤＮＡのいずれをもプローブとして用いて、現在入手で
きない（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡのゲノム
ライブラリーを探査することができる。これらのＤＮＡ
が見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細胞
（Ｃ）において発現可能である場合には本発明の工学的
蛋白質製造法に使用できる。同様に多大な実験なしに、
細胞（Ｃ）に（Ｈ）が存在する場合その基礎水準はどの
程度であるか、また遺伝子（Ｇ）の転写を、従って蛋白
質（Ｐ）の生成を誘導および制御するためには（Ｈ）ま
たは（ａＨ）の濃度はどの程度でなければならないかを
当業者は判定できる。培養細胞（Ｃ）の浸漬に用いられ
る培養液に（Ｈ）または（ａＨ）を添加することによ
り、目的量の蛋白質（Ｐ）を確実に生成させるのに必要
な濃度の（Ｈ）を形質転換細胞（Ｃ）に供給することが
できる。本発明の種々の観点を以下の７実験例に詳述
し、例示する。実験の部Ｉはヒトグルココルチコイド受
容体に関する。より詳細にはこの例はｈＧＲ ｃＤＮＡ
の一次構造、およびこれまで報告されたｈＧＲ蛋白質と
機能的に区別できないポリペプチドへのその発現を示
す。実験の部ＩＩはｈＧＲの機能区に関する。この例に
示されるように、ＧＲは少なくとも４個の機能区を含
み、それらのうち２個は予想されたものであり、予想さ
れたＤＮＡ−およびステロイド−結合区に対応し、それ
らのうち２個は予想されなかったものであり、転写に対
し強い作用をもつ。実験の部ＩＩＩは甲状腺ホルモン受
容体ｃ−ｅｒｂ−Ａに関する。この実験例に示すよう
に、ｃ−ｅｒｂ−Ａは本発明者らがここでｈＴＲアルフ
ァと呼ぶ甲状腺ホルモン受容体をコードする。本発明者
らが予想外に第２の甲状腺ホルモン受容体を見出したこ
とと合わせて（実験例ＶＩＩ参照）、実験の部ＩＩＩに
示されたｃ−ｅｒｂに関するデータは甲状腺ホルモン受
容体蛋白質についてのより詳細な知見を得るのにきわめ
て有用であろう。実験の部ＩＶはヒトミネラルコルチコ
イド受容体に関する。これは本発明者らが示すようにグ
ルココルチコイド受容体に対し構造的および機能的類似
性をもつ。実験Ｖは本発明者らがｈＥＲＲ１およびｈＥ
ＲＲ２と呼ぶ新規な予想されなかった一群のステロイド
ホルモン受容体を示す。これらの受容体は新規なステロ
イドホルモン系の存在に対する最初の証拠を与える。新
規な“シス−トランス”バイオアッセイ系に関する本明
細書の記述と合わせて、この新規なエストロゲン関連受
容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２は新規なホルモンの同
定へ系統的に導くアッセイ系を開発するための基礎を与
えるであろう。このような新規な系の同定は広範な生理
学的および臨床上の重要性をもつと思われる。実験の部
ＶＩにはラット甲状腺ホルモン受容体ｃ−ｅｒｂ−Ａオ
リゴヌクレオチドにおいて本発明者らがＴ３調節に必要
であることを見出した部位に関する本発明者らのデータ
を若干示す。これらの知見は、実験の部ＩＩＩ、および
ヒト染色体１７に結合した新規な予想されなかった甲状
腺ホルモン受容体に関する実験ＶＩＩの記述と合わせ
て、甲状腺ホルモン受容体蛋白質の特性を開明する際に
有用であろう。これ以上詳述しなくても当業者は以上の
記述および以下の実験の部によって本発明を最大限に利
用することができると考えられる。実験の部に示した材
料は特に指示しない限り例示の目的で示されたものであ
り、従って何らかの形で請求の範囲の記載を限定するも
のと解すべきではない。
【０００６】実験の部Ｉ 機能性ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡの一次構
造および発現Ｉ．Ａ．概要 ヒトリンパ様細胞および線維芽細胞ｃＤＮＡクローンか
ら推定したヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の
全アミノ酸配列を報告する。この配列はこの受容体の構
造上の種々の特性を明らかにする。これには主免疫原
区、およびＤＮＡ結合区の一部をなすと思われるシステ
ィン／アルギニン／リジンに富む領域が含まれる。分析
量の全長蛋白質を生成するためのＳＰ６転写ベクター系
の使用につき記述し、無細胞転写された蛋白質が免疫原
性であり、かつ天然のグルココルチコイド受容体に特有
のステロイド結合特性を備えていることを証明する。ワ
インバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（１９８５
ｂ）はｈＧＲ配列と発癌遺伝子ｖ−ｅｒｂ−Ａの配列の
相同性を報告している。Ｉ．Ｂ．序論 グルココルチコイド受容体は多種の培養細胞系に広く分
布し、発現しているので、グルココルチコイドによる遺
伝子発現の制御は転写調節のモデルとして広く研究され
ている。多数のグルココルチコイド応答性転写ユニット
が確認されており、これにはマウス乳腺腫瘍ウィルス
（ＭＭＴＶ）（リンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）ら、１
９７５；パークス（Ｐａｒｋｓ）ら、１９７４）、マウ
スおよびヒトメタロチオネイン（ハーガー（Ｈａｇｅ
ｒ）ら、１９８１；カーリン（Ｋａｒｉｎ）ら、１９８
０）、ラットアルファ２Ｍ−グロブリン（クルツ（Ｋｕ
ｒｔｚ）ら、１９７７）ならびにラットおよびヒト成長
ホルモン（スピンドラー（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ）ら、１９
８２；エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、１９８２；ロビンス
（Ｒｏｂｉｎｓ）ら、１９８２）の遺伝子が含まれる。
これらの遺伝子数種の転写刺激を媒介するＤＮＡ配列の
位置が決定された。ＭＭＴＶについては、これらの配列
は転写開始部位の上流にある別個のゲノム領域であり、
これらは方向および位置と無関係にそれらの作用を及ぼ
すと思われる（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら、
１９８３；オストロフスキー（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ）
ら、１９８４）。ステロイド／受容体−複合体はこれら
の調節配列に結合すると思われ、精製された受容体を用
いて特異的結合部位が決定された（ゴビンダ（Ｇｏｖｉ
ｎｄａ）ら、１９８２；シャイデライト（Ｓｃｈｅｉｄ
ｅｒｅｉｔ）ら、１９８３；プファール（Ｐｆａｈｌ）
１９８２；ペイバール（Ｐａｙｖａｒ）ら、１９８
３）。数種の応答性遺伝子のフットプリンティング分析
に基づいて、コア配列５’ＴＧＴ／ＣＴＣＴ３’を共有
するコンセンサスＤＮＡ結合配列が提唱された（カーリ
ン（Ｋａｒｉｎ）ら、１９８４）。グルココルチコイド
応答要素（ＧＲＥ）がその位置および方向を変えてもな
おプロモーター誘導性を保持しうることは、これがエン
ハンサーと命名される一群のシス作用性調節配列に類似
することを示唆する（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅ
ｒ）ら、１９８３）。最初にウィルス中に、次いで細胞
遺伝子中に見出されたこれらの配列はインビボにおける
効果的な転写のために必要である（ライモニス（Ｌａｉ
ｍｏｎｉｓ）ら、１９８２；ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓ
ｔ）ら、１９８１；ベルジ（Ｂａｅｒｊｉ）ら、１９８
３）。エンハンサーは組織特異性転写制御により調節作
用を媒介するトランス作用性因予により認識されること
が示された。エンハンサー因子は十分には解明されてい
ないが、グルココルチコイド受容体はこれら推定遺伝子
活性化蛋白質の一例であると考えられる。放射性標識さ
れた高親和性グルココルチコイド同族体、たとえばデキ
サメサゾンおよびトリアムシノロンアセトニドの入手が
容易であるため、精製法が開発され、その結果ほぼ純粋
なラットおよびヒト受容体が単離された（シモンズ（Ｓ
ｉｍｏｎｓ）ら、１９８１；ゲーリング（Ｇｅｈｒｉｎ
ｇ）ら、１９８３）。受容体はショ糖濃度勾配液中を二
量体として移動するが、変性作用性ＳＤＳ−ポリアクリ
アミドゲル上での分析によれば相対分子量（Ｍｔ）−９
４，０００（９４Ｋ）の単一ポリペプチドが検出される
（ウェストパール（Ｗｅｓｔｐａｈｌ）ら、１９８２；
ランゲ（Ｗｒａｎｇｅ）ら、１９７９）。その天然のポ
リペプチドはステロイド結合およびＤＮＡ配列認識に対
する固有の特異性を備えている。精製されたラットおよ
びヒト受容体に対して産生されたモノクローナル抗体お
よびポリクローナル抗体（オクレット（Ｏｋｒｅｔ）
ら、１９８１；ハーモン（ＨａｒＭｏｎ）ら、１９８
４；ガメッチュ（Ｇａｍｅｔｃｈｕ）ら、１９８４）を
プローブとして用いて、ステロイド−およびＤＮＡ−結
合領域と別個の分子部分上にある主免疫原領域を確認す
ることができた（カールステッドーデューク（Ｃａｒｌ
ｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ）ら、１９８２；ランゲ（Ｗｒａ
ｎｇｅ）ら、１９８４；デルウェーク（Ｄｅｌｌｗｅ
ｇ）ら、１９８２）。この分子の構造につきさらに情報
を得るために、またこれが遺伝子の転写を調節する分子
機構の分析に着手するために、本発明者らは受容体ｃＤ
ＮＡ配列のクローニングを試みた。受容体特異性抗体を
プローブとして用いて、本発明者らはヒトまたはラット
グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ挿入配列を含むクロ
ーンを分離した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、１９８５ａ；ミースフェルド（Ｍｉｅｓｆｅｌ
ｄ）ら、１９８４）。Ｉ．Ｃ．結果 （ａ）グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ 先きに報告されたように（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂ
ｅｒｇｅｒ）ら、１９８５ａ）ヒトリンパ様細胞系ＩＭ
−９から得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として用いてフ
ァージ発現ベクターラムダｇｔｌｌにおいてｃＤＮＡク
ローンのライブラリーを構成した。このライブラリーを
まず精製グルココルチコイド受容体に対する家兎ポリク
ローナル抗血清によりスクリーニングした結果、約２．
５×１０５プラークから免疫陽性の候補クローン数種が
分離された。これらのクローンから得たベータガラクト
シダーゼ融合蛋白質を用いて受容体エピトープ特異性抗
体をアフィニティ精製し、次いでこれを採取し、細胞抽
出物の蛋白質ブロットへの結合により同定した。ヒトグ
ルココルチコイド受容体の抗原決定因子を発現する挿入
配列を含むクローン３種を分離した。これらのクローン
の挿入配列は異なるサイズであったが交差ハイブリダイ
ズした。それはそれらが恐らく受容体の主免疫原区の境
界を定めると思われる共通配列を含むことを示す。合わ
せてこれらのクローンは１．４ｋｂｐの長さに及んだ
が、明らかに受容体全体をコードするのに十分なほど長
くはなかった。これはＭｔ９４Ｋのポリペプチドをコー
ドするために約２，５００個のヌクレオチドを必要とす
ると推定された。他のｃＤＮＡクローンを分離するため
に本発明者らは最初のライブラリーを再びスクリーニン
グし、かつオカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびバーグ
（Ｂｅｒｇ）（１９８３）により報告されたベクターに
おいてヒト線維芽細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用い
て得た第２のライブラリー（オカヤマにより供与）をも
試験した。免疫陽性ｃＤＮＡ挿入配列（ｈＧＲ１．２）
の１種をプローブとして用いて１２クローンを分離し
た。これらは合わせて４．０ｋｂｐ以上となった。これ
らのクローンのヌクレオチド配列をマキサム（Ｍａｘａ
ｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９７７）
の方法により、第Ｉ−１（Ａ）図に示した手法に従って
調べた。ＲＮＡブロット分析から全長クローンを得るた
めには５〜７ｋｂのｃＤＮＡ挿入配列が必要であろうと
いうことが示された。配列分析から重複クローンＯＢ７
およびｈＧＲ５．１６はアミノ酸７２０個のオープンリ
ーディングフレームに及ぶことが示されたが、これは完
全な受容体をコードするのに十分な長さではない。従っ
て約２×１０６個の形質転換体を含む第２の線維芽細胞
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定翻訳開
始部位の上流１５０ｂｐに及ぶ大型の挿入配列を含むク
ローン（ＯＢ１０）を得た（第Ｉ−１（Ａ）図参照）。
配列分析により２種の蛋白質の形態（アルファおよびベ
ータと命名）が予想された。これらはアミノ酸７２７に
おいて異なり、それらのカルボキシ末端にそれぞれアミ
ノ酸５０個および１５個の付加的な異なるオープンリー
ディングフレームを含む（第Ｉ−１（Ｂ）図参照）。ク
ローンＯＢ７により表わされるアルファ形はグルココル
チコイド受容体の主要な形態である。各種ライブラリー
から分離された８種のｃＤＮＡクローンがこの配列を含
むからである。（ｂ）ｃＤＮＡおよび蛋白質の配列 第Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図はクローンｈＧＲ
１．２、ｈＧＲ５．１６、ＯＢ７およびＯＢ１０を用い
て判定された、ヒトアルファグルココルチコイド受容体
をコードする４，８００ヌクレオチド配列を示す。翻訳
開始部位はヌクレオチド１３３−１３５に対応するメチ
オニンコドンに帰属すると判定された。これがフレーム
内ターミネーターＴＧＡ（ヌクレオチド１２１−１２
３）から下流に現われる最初のＡＴＧトリプレットだか
らである。しかしアミノ末端ペプチド配列に関する情報
がなければ開始部位の明確な決定はまだ不可能である。
７７７位のリジンに特異的なコドンの後に翻訳終止コド
ンＴＧＡがある。残りのコード化配列は多数の重複クロ
ーンに包含され、ＯＢ７はポリ（Ａ）付加部位に続く
４．３ｋｂの挿入配列を含み、ＯＢ１０は推点イニシエ
ーターであるメチオニンを含む。クローンＯＢ７および
ＯＢ１０の３’領域は制限エンドヌクレアーゼおよびｃ
ＤＮＡ配列分析の双方により示されるようにヌクレオチ
ド２，３１４において異なる。この分岐点においてアル
ファ受容体にはさらに５０個のアミノ酸をコードする独
自の配列が続き、一方ベータ受容体にはわずか１５個の
アミノ酸をコードする配列が続く（第Ｉ−３（Ｂ）
図）。ＯＢ７の３’側非翻訳領域はヌクレオチド２，３
２５個の長さであり、一方ＯＢ１０の場合はヌクレオチ
ド１，４３３個である。直接的な配列比較により（第Ｉ
−２（１）、Ｉ−２（２）およびＩ−３（Ｂ））、また
はストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーション
分析により（データは示されていない）示されるよう
に、これら２領域間には有意の相同性はない。さらに本
発明者らはヒト一次線維芽細胞ライブラリーから他のｃ
ＤＮＡクローン、ＯＢ１２（データは示されていない）
を分離した。これはＯＢ７と等しい配列を含むがヌクレ
オチド３，１０１におけるポリアデニル化信号を使用し
（第Ｉ−１（Ｂ）およびＩ−２（１）およびＩ−２
（２）図）、より短い３’側非翻訳領域を生じる。ＯＢ
７の３’側非翻訳領域に特異的なプローブを用いてヒト
胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに
より、大部分のクローンはＯＢ７の第１ポリ（Ａ）部位
において終止することが明らかになった。従ってメッセ
ンジャーＲＮＡの相違は択一的ポリアデニル化および択
一的ＲＮＡスプライシング双方による見掛けの結果であ
る（後記参照）。ヒト線維芽細胞ライブラリーが双方の
ｃＤＮＡを含んでいたという事実は、双方の形の受容体
が同一細胞内に存在する可能性を示唆する。（ｃ）アルファーおよびベーター受容体蛋白質の分析 配列分析によって、アルファ形およびベータ形双方のヒ
トグルココルチコイド受容体はそれぞれ残基７７７個お
よび７４２個の長さであることが明らかになった。これ
ら２形態は残基７２７までは等しく、その後でこれらは
相違する。インビボにおける受容体の水準を調べるため
に、数種のヒトおよびマウス細胞系からの細胞質抽出物
を、ヒトグルココルチコイド受容体に対するポリクロー
ナル抗体を用いるイムノブロット分析法により検査した
（ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）１９８４）。アルファーお
よびベーター受容体ｃＤＮＡをＳｐｂ転写ベクターに挿
入してインビトロ翻訳用の合成ｍＲＮＡを作成した（第
Ｉ−４（Ａ）図）。これらのＲＮＡを別個に家兎網赤血
球溶解系に添加し、非標識生成物をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析
した。これら２種のＲＮＡは、移動の相違が２種の形態
の予想ポリペプチド長さと一致する異なる翻訳生成物の
合成をプログラムする（第Ｉ−４（Ｂ）図、レーン２、
３）。未処理ＩＭ−９細胞、および１μＭトリアムシノ
ロンアセトニド処理したＩＭ−９細胞からの細胞質抽出
物が９４Ｋ受容体（７９Ｋ形は推定受容体分解生成物を
表わす）に対するマーカー（第Ｉ−４（Ｂ）図、レーン
４、５）として用いられる（ランゲ（Ｗｒａｎｇｅ）
ら、１９８４）。ステロイド処理後に、受容体／クロマ
チンの結合がより強くなること、従って受容体が核へ転
位することと対応して、９４Ｋバンドの強度が低下する
点を留意されたい。アルファ形は受容体陰性の９４Ｋバ
ンドと共に移動し、一方ベータ形はより速やかに移動す
る（第Ｉ−４（Ｂ）図参照、レーン２、３をレーン４、
５と比較されたい）。各種のヒトおよびマウス細胞系か
らの細胞質抽出物を比較することにより、アルファ受容
体のみが存在することが明らかになった（第Ｉ−４
（Ｂ）図、レーン６〜９参照）。興味深いことに、ステ
ロイド誘導性細胞溶解に対する抵抗性に関して選択され
たマウスＡＤＲ６リンパ腫細胞系（ダニエルソン（Ｄａ
ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９８４）はステロイド結合活性
をもたず、免疫反応性受容体を示さない（第Ｉ−４
（Ｂ）図、レーン７）。従ってイムノブロット分析法に
よる多種の受容体ｃＤＮＡクローンおよび受容体蛋白質
の解明に基づいて、本発明者らはグルココルチコイド受
容体の主要な生理学的形態はアルファ（９４Ｋ）種であ
ると結論する。（ｄ）インビトロにおけるｈＧＲの発現 クローニングされた受容体が機能性であるという他の証
拠を提示するために、本発明者らはインビトロ翻訳生成
物がコルチコステロイドを選択的に結合しうる能力を調
べた。従って家兎の網赤血球溶解物をインビトロ合成し
たアルファまたはベータｈＧＲ ＲＮＡの添加前または
添加後に、放射性標識された合成グルココルチコイド同
族体３Ｈ−トリアムノシロンアセトニド（３Ｈ−ＴＡ）
と共にインキュベートした。第Ｉ−５図に示すようにｈ
ＧＲ ＲＮＡによりプログラムされた溶解物は選択的に
ステロイド結合能を獲得した。意外にもインビトロ合成
したベータ受容体は競合性３Ｈ−ＴＡを結合しなかっ
た。インビトロ合成したアルファーｈＧＲは、過剰の非
標識コルチゾルまたはデキサメサゾンの添加によって競
合する可能性のある放射性標識ステロイドを結合した。
しかし３Ｈ−ＴＡの結合は過剰の非標識エストロゲンま
たはテストステロンによっては効果的に競合されなかっ
た。これに対し過剰のプロゲステロンは有効な競合体と
なり、これは先に報告されたプロゲステロンの抗グルコ
コルチコイド活性と一致する（ルソー（Ｒｏｕｓｓｅａ
ｕ）ら、１９７２）。これらの結果を確認するために、
ヒトリンパ様細胞の抽出物から調製された天然グルココ
ルチコイド受容体を用いて競合実験を反復した。インビ
トロ翻訳された受容体および天然のインビボ受容体の双
方とも、ステロイドの結合、および過剰の非標識ステロ
イド同族体との競合に関してほぼ等しい特性を示す（第
Ｉ−５図参照）。（ｅ）少なくとも２種の遺伝子に対するｈＧＲ配列地図 ヒトグルココルチコイド受容体は染色体５に機能的にマ
ッピングされている。受容体欠損マウスＴ細胞（ＥＬ
４）をヒト受容体含有Ｔ細胞（ＣＥＭ−Ｃ７）と融合さ
せることにより構成された体細胞ハイブリッドの分析か
ら、野生型ＣＥＭ−Ｃ７受容体を発現する分離体はヒト
染色体５を保持するが、デキサメサゾン耐性分離体はこ
の染色体を失っていることが示された（ゲーリング（Ｇ
ｅｈｒｉｎｇ）ら、１９８５）。本発明のｃＤＮＡクロ
ーンの信頼性を確認するために、本発明者らはヒト染色
体５のみを保有する、チャイニーズハムスター／ヒト体
細胞ハイブリッド（ＨＨＷ４５４）を用いて受容体ｃＤ
ＮＡ配列をマッピングした。ヒト胎盤ＨＨＷ４５４ハイ
ブリッド細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞から抽出したＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎ
ｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、０．８
％アガロースゲル上で分離した。ニトロセルロースへ移
したＤＮＡ断片をヌクレオチド５７０〜１，６４０から
誘導される受容体コード領域の一部（第Ｉ−１（Ａ）図
のｈＧＲ１．２を参照されたい）により試験した。ハイ
ブリッド細胞系からのＤＮＡは、６．８および１７ｋｂ
ｐのＣＨＯ特異性ＥｃｏＲＩバンドのほかに３．０およ
び５．０ｋｂｐのヒト特異性バンドをも含む（ホレンバ
ーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５の図６ａ、
レーン２、３を参照されたい）。（ここに実験の部Ｉと
して示した研究はホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒ
ｇ）ら、１９８５として公表された。図６および７は同
報文中に示され、本明細書には示されていない。）意外
にも９．５ｋｂｐのＤＮＡ断片は全ヒトＤＮＡ中に見出
されたが、ハイブリッド系には見出されなかった（ホレ
ンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６
ａ、レーン１を参照されたい）。同様にＨｉｎｄＩＩＩ
消化によって染色体５ハイブリッド細胞ＤＮＡ中に存在
しない７．５ｋｂｐのバンドが示された（ホレンバーグ
（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６ａ、レー
ン４を参照されたい）。これらの結果は、受容体ｃＤＮ
Ａはヒト染色体５にマッピングされるが、このゲノムの
他のいずれかの位置に付加的な受容体関連配列があるこ
とを示す。これらの配列をマッピングするために、デュ
アルレーザー蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使
用し、ＤＩＰＩ／クロモマイシン（ヘキスト３３２５８
クロモマイシンと併用）により染色した分裂期染色体懸
濁液を識別した；この方法により２４種のヒト染色体を
２２画分に分離することができた（レボ（Ｌｅｂｏ）
ら、１９８４）。染色体を直接にニトロセルロース上に
識別したのち、染色体ＤＮＡを変性し、ｈＧＲ ｃＤＮ
Ａプローブにハイブリダイズした。染色体５の配置確認
のほかに、染色体１６上に付加的配列が見出された（ホ
レンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図
６ｂを参照されたい）。この配置を確認するために、マ
ウス赤白血病細胞、およびヒト染色体１６を含むマウス
赤白血病細胞系（ボーデ（Ｂｏｄｅ）ら、１９８１参
照）からのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ｈＧ
Ｒ ｃＤＮＡにより調べた（ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６ｃを参照されたい）；
予想されたようにハイブリッド中に見出され、対照中に
は見出されなかった唯一のＤＮＡが７．５ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片であり、これにより染色体１６の帰属が確立した
（ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８
５、図６ｃ、レーン１、２を参照されたい）。ＯＢ７お
よびＯＢ１０の３’側非翻訳領域からのＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｂａＩ断片を用いた他のサザーンブロット分析により、
染色体５のみへのハイブリダイゼーションが明らかにな
った（データは示されていない）。本発明者らは、アル
ファーおよびベーター受容体ｃＤＮＡは共に恐らく染色
体５上の単一遺伝子によってコードされると結論し、こ
れら２形態のｃＤＮＡが択一的スプライシングにより生
じることを示唆する。さらに本発明者らは、染色体１６
上に位置する他の遺伝子は少なくともヌクレオチド５７
０〜１，６４０においてグルココルチコイド受容体遺伝
子との相同性を有すると結論する。これらの染色体１６
上の配列が関連ステロイド受容体遺伝子、処理された遺
伝子もしくは偽遺伝子、またはグルココルチコイド受容
体に対する遺伝子と共通の区域を共有する遺伝子のいず
れを表わすかは明らかでない。ゲノムクローニングおよ
びＤＮＡ配列決定により解答が得られるであろう。グル
ココルチコイド受容体をコードするｍＲＮＡのサイズを
測定するために、ヒト線維芽細胞系ＨＴ１０８０から分
離された細胞質ｍＲＮＡを用いてノーザンブロットハイ
ブリダイゼーション実験を行った（ボーデ（Ｂｏｄｅ）
ら、１９８１）。ｈＧＲ１．２コード化配列をプローブ
として用いて、５．６、６．１および７．１ｋｂｐの多
数のｍＲＮＡを検出した。これらの細胞をグルココルチ
コイドと共に２４時間処理すると受容体ｍＲＮＡが２〜
３倍減少し、潜在的な負のフィードバック調節が示唆さ
れた。Ｉ．Ｄ．考察 グルココルチコイド受容体の構造分析は、この調節分子
が遺伝子の転写に作用を及ぼす機構を洞察するための前
提条件である。ここに本発明者らはｃＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列分析から推定したヒトグルココルチコ
イド受容体の一次配列を提示した。ｈＧＲ ｃＤＮＡの
分離によって、少なくとも２形態のポリペプチドをコー
ドする多数のｍＲＮＡの存在が明らかになった。これら
の推定蛋白質はそれらのカルボキシ末端において、アル
ファーｈＧＲの場合は５０個アミノ酸、ベーターｈＧＲ
の場合は１５個のアミノ酸の置換によって異なる。アル
ファグルココルチコイド受容体は数種のヒト細胞系およ
びｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された主要な形態
である。しかしノースロップ（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ）ら
（１９８５）による最近の報文では、これら２形態の受
容体がマウスリンパ様細胞において明らかにされてい
る。マウスダブレット種に対するアルファーおよびベー
ターｈＧＲの関係は未確認である。ベーターｈＧＲの細
胞分布および潜在的機能も明らかでないが、変異型受容
体が組織特異性の機能に用いられている可能性はある。
本発明者らは現在それらの組織特異性発現を解明するた
めに各形態のヒト受容体に特異的な合成ペプチドに対す
る抗血清を生成している。免疫陽性ファージＤＮＡ挿入
配列ｈＧＲ１．２Ａをプローブとして用いて選ばれたｃ
ＤＮＡには、ヌクレオチド３１０１にあるＡＡＴＡＡＡ
を用いてポリアデニル化がより早期に信号化されている
点以外はＯＢ７と同様な３’末端を含むものがある。こ
れらのクローンはヒト線維芽細胞および胎盤双方のライ
ブラリーから分離された（データは示されていない）。
択一的ポリ（Ａ）部位の選択は多くの真核転写ユニット
の特色である（ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）１９８
２）。ある場合にはポリ（Ａ）部位の選択によって特定
のポリペプチド生成物が定められる（アマラ（Ａｍａｒ
ａ）ら、１９８２；ローゼンフィールド（Ｒｏｓｅｎｆ
ｅｌｄ）ら、１９８３；アルト（Ａｌｔ）ら、１９８
０；シュワルツバウエル（Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ）
ら、１９８３）が、他の場合にはいずれかのポリ（Ａ）
部位の選択によってポリペプチドの一次構造に何ら変化
が生じない（ゼッツエル（Ｓｅｔｚｅｒ）ら、１９８
２）。受容体の転写に際してポリ（Ａ）部位の選択は
（１）特定の組織におけるｍＲＮＡの安定性を変える
か、（２）スプライシングを変化させるか、または
（３）ランダムであり、生理学的結果を生じない。ここ
に記載したインビトロ翻訳実験から、クローニングされ
た分子が完全なグルココルチコイド受容体をコードする
という直接的証明が得られる。第１にインビトロ翻訳生
成物はサイズが天然のグルココルチコイド受容体と等し
く、受容体特異性抗血清と免疫学的に反応する。第２
に、インビトロ翻訳された蛋白質は、合成グルココルチ
コイドであるトリアムシノロンアセトニドを選択的に結
合させるという点で、機能的にグルココルチコイド受容
体として作用する。この結合グルココルチコイド、グル
ココルチコイド同族体およびプロゲステロンにより特異
的に競合されるが、性ステロイドであるテストステロン
およびエストロゲンによっては競合されない。この点に
関して、インビトロ翻訳された受容体はヒトリンパ様細
胞から得たインビボ受容体と等しい挙動を示し、クロー
ニングされた分子に関する機能の第１の証拠を与える。
ステロイド結合性の獲得は何ら特定の修飾を要しないと
思われるが、これが必要であったとしてもこれらの修飾
はインビトロ翻訳混合物中で行われる。ここに示した結
果は真核細胞の転写調節蛋白質とその標的遺伝子の分子
レベルでの相互作用を研究するために必要な情報を提供
した。これらの構造研究から、グルココルチコイド受容
体、その遺伝子、およびそのＲＮＡ生成物を分析しうる
基礎が得られる。さらにインビトロで受容体を発現しう
ることにより、特異的インビトロ突然変異生成の結果を
速やかに試験しうる新規な方法が得られる。最後に突然
変異生成および蛋白質結合双方の実験によるグルココル
チコイドおよび特異的調節要素に応答する遺伝子の分離
から、この蛋白質が誘導性真核遺伝子調節の分析に対す
るきわめて有用なモデルとして役立つことが示唆され
る。Ｉ．Ｅ．実験の部Ｉに述べた図に関する詳細な説明 第Ｉ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ配列決定法およ
びｃＤＮＡクローンの模式図。Ａ．アルファグルココル
チコイド受容体に対する複合ｃＤＮＡを最上部に示し、
非コード化配列（直線）およびコード化配列（点彩部
分）を示す。共通の６ヌクレオチド制限酵索部位を示
す。配列を決定するために用いた重複ｃＤＮＡ挿入配列
が示され、配列決定された領域の下方の矢印は配列決定
の方向および範囲を表わす。ＯＢ１０の３’末端の破線
は相違する配列を示す。数字はＯＢ１０において５’側
寄りの転写された配列に対するヌクレオチドの位置を意
味する。Ｂ．アルファ形およびベータ形の受容体をコー
ドするｃＤＮＡ（それぞれＯＢ７およびＯＢ１０）。Ｏ
Ｂ７の５’末端（破線）はＯＢ１０クローンにより与え
られる。蛋白質コード化情報は幅広い棒により表わさ
れ；非翻訳配列は細い棒により示される。ヌクレオチド
およびアミノ酸はコード化配列のそれぞれ上方および下
方に番号が示される。共通ＤＮＡ配列はヌクレオチド
２，３１３（アミノ酸残基７２７）にまで及び、この地
点でアルファ形とベータ形の受容体が分かれ、アルファ
ｃＤＮＡ（ＯＢ１２，ＯＢ７）は１５０個のヌクレオチ
ド（５０個のアミノ酸）のオープンリーディングフレー
ムへと続き、ベータｃＤＮＡ（ＯＢ１０）は４５個のヌ
クレオチド（１５個のアミノ酸）へと続く（第Ｉ−３
（Ｂ）図参照）。これらのクローンにおいてポリ（Ａ）
のすぐ上流にヘキサヌクレオチド信号（ＡＡＴＡＡＡ）
が示されており、ＯＢ７の最初のヘキサヌクレオチドは
ＯＢ１２においてポリ（Ａ）として作用する。第Ｉ−１（Ａ）および（Ｂ）図の方法 挿入配列ｈＧＲ１．２、ｈＧＲ２．９およびｈＧＲ５．
１６を前記に従ってラムダｇｔｌｌ ＩＭ−９リンパ様
細胞ｃＤＮＡライブラリーから分離した（ワインバーガ
ー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。２種のク
ローンがｐｃＤにおいてＨ．オクヤマにより（オクヤマ
（Ｏｋａｙａｍａ）ら、１９８３）、ＧＭ６３７ヒト線
維芽細胞（ＯＢ７）および一次ヒト線維芽細胞（ＯＢ１
０）からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを用いて構成されたｃ
ＤＮＡライブラリーから分離された。スクリーニングは
３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いるニックトランスレーションに
より放射性標識されたｈＧＲ１．２−ｃＤＮＡを用いて
行われた。マキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９７７）の化学的開裂法により
配列が決定された。第Ｉ−２（１）および（２）図 ヒトグルココルチコイド受容体のｃＤＮＡおよび推定蛋
白質配列。完全なアルファコード化配列およびＯＢ７の
３’側非翻訳領域を図示し、推定アミノ酸を長いオープ
ンリーディングフレームの上方に示す。ヌクレオチド１
２１−１２３における上流フレーム内終止コドンおよび
ＯＢ７における推定の付加的ポリアデニル化信号に下線
を施した。第Ｉ−３（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトグルココルチコイド受容体ベータｃＤＮＡの３’側
の制限地図およびヌクレオチド配列。Ａ．共通の６ヌク
レオチド制限酵素部位をＯＢ１０の３’側非翻訳領域に
つき示す。ベータ形（ＯＢ１０）のヌクレオチド２，２
８１から３，８２０までのｃＤＮＡ配列をアルファ形
（ＯＢ７）の３’末端コード化部分に見られる蛋白質コ
ード化情報と比較したもの。各ｃＤＮＡによりコードさ
れるアミノ酸をヌクレオチド配列の上方に示す。ＯＢ１
０の３’側非翻訳配列における推定ポリアデニル化信号
（ＡＡＴＡＡＡ）に下線を施した。第Ｉ−４（Ａ）および（Ｂ）図 インビトロにおいて翻訳されたｈＧＲと細胞抽出物から
のインビボｈＧＲのイムノブロット比較。Ａ．ｈＧＲ
ｃＤＮＡ配列インビトロ転写のために構成されたベクタ
ー。完全なアルファ（ｐＧＲ１０７）およびベータ（ｐ
ＧＲ１０８）コード化配列はｐＧＥＭ１中のＳＰ６プロ
モーターの転写制御下に置かれた。ベクター配列、非コ
ード化ｃＤＮＡ配列、およびコード化配列はそれぞれ細
い直線、太い棒、および四角で囲った領域により示され
る。約６０個のヌクレオチドのポリ（Ａ）領域をＡｐｉ
により示す。異なるコード化配列は斜線領域および点彩
領域により示される。Ｂ．インビトロ翻訳生成物および
細胞抽出物のウェスタンブロット分析。ＲＮＡを添加し
て（レーン１）またはｐＧＲ１０８から（ベータ、レー
ン２）もしくはｐＧＲ１０７から（アルファ、レーン
３）合成されたＲＮＡを添加して家兎の網赤血球溶解系
において合成した非標識翻訳生成物を７．５％ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル上で分画した。他のレーンは下
記のものである。ＩＭ−９（レーン４）、１μＭトリア
ムシノロンアセトニドで処理したＩＭ−９（レーン
５）、ＨｅＬａ（レーン６）、ＡＤＲ６．Ｍ１８９０．
ＡＤＩマウスリンパ腫（レーン７）、Ｓ４９マウスリン
パ腫（レーン８）およびＥＬ４リンパ腫（レーン９）か
らの細胞質抽出物。蛋白質をニトロセルロースに移し、
抗ｈＧＲ抗体、次いで１２５Ｉ標識黄色ぶどう球菌（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）蛋白質Ａに
より前記に従って試験した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎ
ｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。第Ｉ−４（Ａ）および（Ｂ）図の方法 第Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図に示したアルファ
コード化配列全体を含む発現ベクターを構成するため
に、ＯＢ７の３’側コード化配列をＯＢ１０の５’側コ
ード化配列に融合させた。ＯＢ７をＥｃｏＲＩにより部
分的に消化し、ＸｂａＩによって完全に消化し、１．２
０ｋｂｐの断片をゲル精製してＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消
化ＯＢ１０とリゲートさせて、中間体ｐＯＢ１０７を得
た。５’側ポリ（Ｇ）領域（１１個のヌクレオチド、ｎ
ｔ）および３’側ポリ（Ａ）領域（約６０個のｎｔ）を
含む全ｐＯＢ１０７ ｃＤＮＡ配列を部分ＰｓｔＩ／完
全ＢａｍＨＩ消化により切断した。得られた３．５ｋｂ
ｐの断片をゲル精製し、ｐＧＥＭ１（プロメガ・バイオ
テク）のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位間に挿入してｐ
ＧＲ１０７を得た。プラスミドｐＧＲ１０８は直接にｐ
ＯＢ１０から、部分ＰｓｔＩ／完全ＢａｍＨＩ消化し、
得られたｃＤＮＡ挿入配列をｐＧＥＭ１の対応する部位
へ挿入することにより構成された。キャップ付きＳＰ６
転写体はＰｖｕＩＩ−直線化されたｐＧＲ１０７および
ｐＧＲ１０８からクリーブ（Ｋｒｉｅｇ）およびメルト
ン（Ｍｅｌｔｏｎ）（１９８４）の記載に従って合成さ
れ、ＧＴＰ濃度を４００μＭから１００μＭに低下させ
かつｍ７ＧｐｐＧ（ファルマシア）を５００μＭにまで
添加することにより同時キャッピングが行われた。転写
体をＰ６０クロマトグラフィーにより精製し、ミクロコ
ッカスヌクレアーゼ処理した家兎網赤血球溶解物（プロ
メガ・バイオテク）により、製造業者が指示する条件で
翻訳した。ステロイド処理細胞からのＩＭ−９サイトゾ
ルの調製は先きに報告されたとおりである（ワインバー
ガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。サイズ
マーカーはホスフォリラーゼＢ（９７Ｋ）、ウジ血清ア
ルブミン（６６Ｋ）および卵アルブミン（４５Ｋ）であ
った。第Ｉ−５図 インビトロ翻訳されたアルファーｈＧＲのステロイド結
合性。ＩＭ−９サイトゾル抽出物（点彩した棒）および
ＳＰ６産生アルファーｈＧＲＲＮＡを含む網赤血球溶解
物（ＧＲ１０７；無地の棒）への結合を示す。各棒は１
００倍過剰の各種ステロイド競合体を用いて測定した結
合３Ｈ−トリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）を表わ
す；非標識ＴＡを競合体として用いて１００％の競合が
測定された。各値は３回測定の平均を表わし、誤差の棒
はＰ＜０．０５を示す。ステロイド系競合体はデキサメ
サゾン（Ｄｅｘ）、コルチゾル（Ｃｏｒｔ）、プロゲス
テロン（Ｐｒｏｇ）、テストステロン（Ｔｅｓｔ）、お
よびエストラジオール（Ｏｅｓｔ）である。第Ｉ−５図の方法 結合アッセイは１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４，
１００ｍＭ・ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭモ
リブデン酸ナトリウム、１０ジチオトレイトール、１５
０ｍＭ３Ｈ−ＴＡ（２０Ｃｉｍｍｏｌ−１；アメルシャ
ム）を含有する１００μｌ、および翻訳混合物１０μｌ
または新鮮なＩＭ−９シストゾル１００μｇ中で行なわ
れた。非標識競合体（１５μＭ）を指示に従って添加し
た。０℃で２時間後に５０％デキストラン被覆活性炭５
μｌにより５分ずつ２回抽出して未結合ステロイドを除
去し、計数した。アルファグルココルチコイド受容体
（ＧＲ１０７）に対する非競合値および完全競合値はそ
れぞれ４９０および２９０ｃ．ｐ．ｍ．であった。転写
体を添加せずに、またはベータ受容体ＳＰ６ＲＮＡ（Ｇ
Ｒ１０８）を用いてプログラムした網赤血球溶解物翻訳
混合物は競合性３Ｈ−ＴＡ結合を含まなかった。他の図 ここに実験の部Ｉとして提示した科学研究はＮａｔｕｒ
ｅ，３１８：６３５−６４１（１９８５）に発表され
た。そのＮａｔｕｒｅの報文はこの実験例に含まれない
２図を含む。それらの図は図６、ｈＧＲ ｃＤＮＡの染
色体マッピング分析；図７、ｈＧＲ ｃＤＮＡのノーザ
ーンブロット分析である。
造および発現Ｉ．Ａ．概要 ヒトリンパ様細胞および線維芽細胞ｃＤＮＡクローンか
ら推定したヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の
全アミノ酸配列を報告する。この配列はこの受容体の構
造上の種々の特性を明らかにする。これには主免疫原
区、およびＤＮＡ結合区の一部をなすと思われるシステ
ィン／アルギニン／リジンに富む領域が含まれる。分析
量の全長蛋白質を生成するためのＳＰ６転写ベクター系
の使用につき記述し、無細胞転写された蛋白質が免疫原
性であり、かつ天然のグルココルチコイド受容体に特有
のステロイド結合特性を備えていることを証明する。ワ
インバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（１９８５
ｂ）はｈＧＲ配列と発癌遺伝子ｖ−ｅｒｂ−Ａの配列の
相同性を報告している。Ｉ．Ｂ．序論 グルココルチコイド受容体は多種の培養細胞系に広く分
布し、発現しているので、グルココルチコイドによる遺
伝子発現の制御は転写調節のモデルとして広く研究され
ている。多数のグルココルチコイド応答性転写ユニット
が確認されており、これにはマウス乳腺腫瘍ウィルス
（ＭＭＴＶ）（リンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｄ）ら、１
９７５；パークス（Ｐａｒｋｓ）ら、１９７４）、マウ
スおよびヒトメタロチオネイン（ハーガー（Ｈａｇｅ
ｒ）ら、１９８１；カーリン（Ｋａｒｉｎ）ら、１９８
０）、ラットアルファ２Ｍ−グロブリン（クルツ（Ｋｕ
ｒｔｚ）ら、１９７７）ならびにラットおよびヒト成長
ホルモン（スピンドラー（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ）ら、１９
８２；エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、１９８２；ロビンス
（Ｒｏｂｉｎｓ）ら、１９８２）の遺伝子が含まれる。
これらの遺伝子数種の転写刺激を媒介するＤＮＡ配列の
位置が決定された。ＭＭＴＶについては、これらの配列
は転写開始部位の上流にある別個のゲノム領域であり、
これらは方向および位置と無関係にそれらの作用を及ぼ
すと思われる（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら、
１９８３；オストロフスキー（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ）
ら、１９８４）。ステロイド／受容体−複合体はこれら
の調節配列に結合すると思われ、精製された受容体を用
いて特異的結合部位が決定された（ゴビンダ（Ｇｏｖｉ
ｎｄａ）ら、１９８２；シャイデライト（Ｓｃｈｅｉｄ
ｅｒｅｉｔ）ら、１９８３；プファール（Ｐｆａｈｌ）
１９８２；ペイバール（Ｐａｙｖａｒ）ら、１９８
３）。数種の応答性遺伝子のフットプリンティング分析
に基づいて、コア配列５’ＴＧＴ／ＣＴＣＴ３’を共有
するコンセンサスＤＮＡ結合配列が提唱された（カーリ
ン（Ｋａｒｉｎ）ら、１９８４）。グルココルチコイド
応答要素（ＧＲＥ）がその位置および方向を変えてもな
おプロモーター誘導性を保持しうることは、これがエン
ハンサーと命名される一群のシス作用性調節配列に類似
することを示唆する（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅ
ｒ）ら、１９８３）。最初にウィルス中に、次いで細胞
遺伝子中に見出されたこれらの配列はインビボにおける
効果的な転写のために必要である（ライモニス（Ｌａｉ
ｍｏｎｉｓ）ら、１９８２；ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓ
ｔ）ら、１９８１；ベルジ（Ｂａｅｒｊｉ）ら、１９８
３）。エンハンサーは組織特異性転写制御により調節作
用を媒介するトランス作用性因予により認識されること
が示された。エンハンサー因子は十分には解明されてい
ないが、グルココルチコイド受容体はこれら推定遺伝子
活性化蛋白質の一例であると考えられる。放射性標識さ
れた高親和性グルココルチコイド同族体、たとえばデキ
サメサゾンおよびトリアムシノロンアセトニドの入手が
容易であるため、精製法が開発され、その結果ほぼ純粋
なラットおよびヒト受容体が単離された（シモンズ（Ｓ
ｉｍｏｎｓ）ら、１９８１；ゲーリング（Ｇｅｈｒｉｎ
ｇ）ら、１９８３）。受容体はショ糖濃度勾配液中を二
量体として移動するが、変性作用性ＳＤＳ−ポリアクリ
アミドゲル上での分析によれば相対分子量（Ｍｔ）−９
４，０００（９４Ｋ）の単一ポリペプチドが検出される
（ウェストパール（Ｗｅｓｔｐａｈｌ）ら、１９８２；
ランゲ（Ｗｒａｎｇｅ）ら、１９７９）。その天然のポ
リペプチドはステロイド結合およびＤＮＡ配列認識に対
する固有の特異性を備えている。精製されたラットおよ
びヒト受容体に対して産生されたモノクローナル抗体お
よびポリクローナル抗体（オクレット（Ｏｋｒｅｔ）
ら、１９８１；ハーモン（ＨａｒＭｏｎ）ら、１９８
４；ガメッチュ（Ｇａｍｅｔｃｈｕ）ら、１９８４）を
プローブとして用いて、ステロイド−およびＤＮＡ−結
合領域と別個の分子部分上にある主免疫原領域を確認す
ることができた（カールステッドーデューク（Ｃａｒｌ
ｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ）ら、１９８２；ランゲ（Ｗｒａ
ｎｇｅ）ら、１９８４；デルウェーク（Ｄｅｌｌｗｅ
ｇ）ら、１９８２）。この分子の構造につきさらに情報
を得るために、またこれが遺伝子の転写を調節する分子
機構の分析に着手するために、本発明者らは受容体ｃＤ
ＮＡ配列のクローニングを試みた。受容体特異性抗体を
プローブとして用いて、本発明者らはヒトまたはラット
グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ挿入配列を含むクロ
ーンを分離した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、１９８５ａ；ミースフェルド（Ｍｉｅｓｆｅｌ
ｄ）ら、１９８４）。Ｉ．Ｃ．結果 （ａ）グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ 先きに報告されたように（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂ
ｅｒｇｅｒ）ら、１９８５ａ）ヒトリンパ様細胞系ＩＭ
−９から得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として用いてフ
ァージ発現ベクターラムダｇｔｌｌにおいてｃＤＮＡク
ローンのライブラリーを構成した。このライブラリーを
まず精製グルココルチコイド受容体に対する家兎ポリク
ローナル抗血清によりスクリーニングした結果、約２．
５×１０５プラークから免疫陽性の候補クローン数種が
分離された。これらのクローンから得たベータガラクト
シダーゼ融合蛋白質を用いて受容体エピトープ特異性抗
体をアフィニティ精製し、次いでこれを採取し、細胞抽
出物の蛋白質ブロットへの結合により同定した。ヒトグ
ルココルチコイド受容体の抗原決定因子を発現する挿入
配列を含むクローン３種を分離した。これらのクローン
の挿入配列は異なるサイズであったが交差ハイブリダイ
ズした。それはそれらが恐らく受容体の主免疫原区の境
界を定めると思われる共通配列を含むことを示す。合わ
せてこれらのクローンは１．４ｋｂｐの長さに及んだ
が、明らかに受容体全体をコードするのに十分なほど長
くはなかった。これはＭｔ９４Ｋのポリペプチドをコー
ドするために約２，５００個のヌクレオチドを必要とす
ると推定された。他のｃＤＮＡクローンを分離するため
に本発明者らは最初のライブラリーを再びスクリーニン
グし、かつオカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびバーグ
（Ｂｅｒｇ）（１９８３）により報告されたベクターに
おいてヒト線維芽細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用い
て得た第２のライブラリー（オカヤマにより供与）をも
試験した。免疫陽性ｃＤＮＡ挿入配列（ｈＧＲ１．２）
の１種をプローブとして用いて１２クローンを分離し
た。これらは合わせて４．０ｋｂｐ以上となった。これ
らのクローンのヌクレオチド配列をマキサム（Ｍａｘａ
ｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９７７）
の方法により、第Ｉ−１（Ａ）図に示した手法に従って
調べた。ＲＮＡブロット分析から全長クローンを得るた
めには５〜７ｋｂのｃＤＮＡ挿入配列が必要であろうと
いうことが示された。配列分析から重複クローンＯＢ７
およびｈＧＲ５．１６はアミノ酸７２０個のオープンリ
ーディングフレームに及ぶことが示されたが、これは完
全な受容体をコードするのに十分な長さではない。従っ
て約２×１０６個の形質転換体を含む第２の線維芽細胞
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定翻訳開
始部位の上流１５０ｂｐに及ぶ大型の挿入配列を含むク
ローン（ＯＢ１０）を得た（第Ｉ−１（Ａ）図参照）。
配列分析により２種の蛋白質の形態（アルファおよびベ
ータと命名）が予想された。これらはアミノ酸７２７に
おいて異なり、それらのカルボキシ末端にそれぞれアミ
ノ酸５０個および１５個の付加的な異なるオープンリー
ディングフレームを含む（第Ｉ−１（Ｂ）図参照）。ク
ローンＯＢ７により表わされるアルファ形はグルココル
チコイド受容体の主要な形態である。各種ライブラリー
から分離された８種のｃＤＮＡクローンがこの配列を含
むからである。（ｂ）ｃＤＮＡおよび蛋白質の配列 第Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図はクローンｈＧＲ
１．２、ｈＧＲ５．１６、ＯＢ７およびＯＢ１０を用い
て判定された、ヒトアルファグルココルチコイド受容体
をコードする４，８００ヌクレオチド配列を示す。翻訳
開始部位はヌクレオチド１３３−１３５に対応するメチ
オニンコドンに帰属すると判定された。これがフレーム
内ターミネーターＴＧＡ（ヌクレオチド１２１−１２
３）から下流に現われる最初のＡＴＧトリプレットだか
らである。しかしアミノ末端ペプチド配列に関する情報
がなければ開始部位の明確な決定はまだ不可能である。
７７７位のリジンに特異的なコドンの後に翻訳終止コド
ンＴＧＡがある。残りのコード化配列は多数の重複クロ
ーンに包含され、ＯＢ７はポリ（Ａ）付加部位に続く
４．３ｋｂの挿入配列を含み、ＯＢ１０は推点イニシエ
ーターであるメチオニンを含む。クローンＯＢ７および
ＯＢ１０の３’領域は制限エンドヌクレアーゼおよびｃ
ＤＮＡ配列分析の双方により示されるようにヌクレオチ
ド２，３１４において異なる。この分岐点においてアル
ファ受容体にはさらに５０個のアミノ酸をコードする独
自の配列が続き、一方ベータ受容体にはわずか１５個の
アミノ酸をコードする配列が続く（第Ｉ−３（Ｂ）
図）。ＯＢ７の３’側非翻訳領域はヌクレオチド２，３
２５個の長さであり、一方ＯＢ１０の場合はヌクレオチ
ド１，４３３個である。直接的な配列比較により（第Ｉ
−２（１）、Ｉ−２（２）およびＩ−３（Ｂ））、また
はストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーション
分析により（データは示されていない）示されるよう
に、これら２領域間には有意の相同性はない。さらに本
発明者らはヒト一次線維芽細胞ライブラリーから他のｃ
ＤＮＡクローン、ＯＢ１２（データは示されていない）
を分離した。これはＯＢ７と等しい配列を含むがヌクレ
オチド３，１０１におけるポリアデニル化信号を使用し
（第Ｉ−１（Ｂ）およびＩ−２（１）およびＩ−２
（２）図）、より短い３’側非翻訳領域を生じる。ＯＢ
７の３’側非翻訳領域に特異的なプローブを用いてヒト
胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに
より、大部分のクローンはＯＢ７の第１ポリ（Ａ）部位
において終止することが明らかになった。従ってメッセ
ンジャーＲＮＡの相違は択一的ポリアデニル化および択
一的ＲＮＡスプライシング双方による見掛けの結果であ
る（後記参照）。ヒト線維芽細胞ライブラリーが双方の
ｃＤＮＡを含んでいたという事実は、双方の形の受容体
が同一細胞内に存在する可能性を示唆する。（ｃ）アルファーおよびベーター受容体蛋白質の分析 配列分析によって、アルファ形およびベータ形双方のヒ
トグルココルチコイド受容体はそれぞれ残基７７７個お
よび７４２個の長さであることが明らかになった。これ
ら２形態は残基７２７までは等しく、その後でこれらは
相違する。インビボにおける受容体の水準を調べるため
に、数種のヒトおよびマウス細胞系からの細胞質抽出物
を、ヒトグルココルチコイド受容体に対するポリクロー
ナル抗体を用いるイムノブロット分析法により検査した
（ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）１９８４）。アルファーお
よびベーター受容体ｃＤＮＡをＳｐｂ転写ベクターに挿
入してインビトロ翻訳用の合成ｍＲＮＡを作成した（第
Ｉ−４（Ａ）図）。これらのＲＮＡを別個に家兎網赤血
球溶解系に添加し、非標識生成物をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析
した。これら２種のＲＮＡは、移動の相違が２種の形態
の予想ポリペプチド長さと一致する異なる翻訳生成物の
合成をプログラムする（第Ｉ−４（Ｂ）図、レーン２、
３）。未処理ＩＭ−９細胞、および１μＭトリアムシノ
ロンアセトニド処理したＩＭ−９細胞からの細胞質抽出
物が９４Ｋ受容体（７９Ｋ形は推定受容体分解生成物を
表わす）に対するマーカー（第Ｉ−４（Ｂ）図、レーン
４、５）として用いられる（ランゲ（Ｗｒａｎｇｅ）
ら、１９８４）。ステロイド処理後に、受容体／クロマ
チンの結合がより強くなること、従って受容体が核へ転
位することと対応して、９４Ｋバンドの強度が低下する
点を留意されたい。アルファ形は受容体陰性の９４Ｋバ
ンドと共に移動し、一方ベータ形はより速やかに移動す
る（第Ｉ−４（Ｂ）図参照、レーン２、３をレーン４、
５と比較されたい）。各種のヒトおよびマウス細胞系か
らの細胞質抽出物を比較することにより、アルファ受容
体のみが存在することが明らかになった（第Ｉ−４
（Ｂ）図、レーン６〜９参照）。興味深いことに、ステ
ロイド誘導性細胞溶解に対する抵抗性に関して選択され
たマウスＡＤＲ６リンパ腫細胞系（ダニエルソン（Ｄａ
ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９８４）はステロイド結合活性
をもたず、免疫反応性受容体を示さない（第Ｉ−４
（Ｂ）図、レーン７）。従ってイムノブロット分析法に
よる多種の受容体ｃＤＮＡクローンおよび受容体蛋白質
の解明に基づいて、本発明者らはグルココルチコイド受
容体の主要な生理学的形態はアルファ（９４Ｋ）種であ
ると結論する。（ｄ）インビトロにおけるｈＧＲの発現 クローニングされた受容体が機能性であるという他の証
拠を提示するために、本発明者らはインビトロ翻訳生成
物がコルチコステロイドを選択的に結合しうる能力を調
べた。従って家兎の網赤血球溶解物をインビトロ合成し
たアルファまたはベータｈＧＲ ＲＮＡの添加前または
添加後に、放射性標識された合成グルココルチコイド同
族体３Ｈ−トリアムノシロンアセトニド（３Ｈ−ＴＡ）
と共にインキュベートした。第Ｉ−５図に示すようにｈ
ＧＲ ＲＮＡによりプログラムされた溶解物は選択的に
ステロイド結合能を獲得した。意外にもインビトロ合成
したベータ受容体は競合性３Ｈ−ＴＡを結合しなかっ
た。インビトロ合成したアルファーｈＧＲは、過剰の非
標識コルチゾルまたはデキサメサゾンの添加によって競
合する可能性のある放射性標識ステロイドを結合した。
しかし３Ｈ−ＴＡの結合は過剰の非標識エストロゲンま
たはテストステロンによっては効果的に競合されなかっ
た。これに対し過剰のプロゲステロンは有効な競合体と
なり、これは先に報告されたプロゲステロンの抗グルコ
コルチコイド活性と一致する（ルソー（Ｒｏｕｓｓｅａ
ｕ）ら、１９７２）。これらの結果を確認するために、
ヒトリンパ様細胞の抽出物から調製された天然グルココ
ルチコイド受容体を用いて競合実験を反復した。インビ
トロ翻訳された受容体および天然のインビボ受容体の双
方とも、ステロイドの結合、および過剰の非標識ステロ
イド同族体との競合に関してほぼ等しい特性を示す（第
Ｉ−５図参照）。（ｅ）少なくとも２種の遺伝子に対するｈＧＲ配列地図 ヒトグルココルチコイド受容体は染色体５に機能的にマ
ッピングされている。受容体欠損マウスＴ細胞（ＥＬ
４）をヒト受容体含有Ｔ細胞（ＣＥＭ−Ｃ７）と融合さ
せることにより構成された体細胞ハイブリッドの分析か
ら、野生型ＣＥＭ−Ｃ７受容体を発現する分離体はヒト
染色体５を保持するが、デキサメサゾン耐性分離体はこ
の染色体を失っていることが示された（ゲーリング（Ｇ
ｅｈｒｉｎｇ）ら、１９８５）。本発明のｃＤＮＡクロ
ーンの信頼性を確認するために、本発明者らはヒト染色
体５のみを保有する、チャイニーズハムスター／ヒト体
細胞ハイブリッド（ＨＨＷ４５４）を用いて受容体ｃＤ
ＮＡ配列をマッピングした。ヒト胎盤ＨＨＷ４５４ハイ
ブリッド細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞から抽出したＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎ
ｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、０．８
％アガロースゲル上で分離した。ニトロセルロースへ移
したＤＮＡ断片をヌクレオチド５７０〜１，６４０から
誘導される受容体コード領域の一部（第Ｉ−１（Ａ）図
のｈＧＲ１．２を参照されたい）により試験した。ハイ
ブリッド細胞系からのＤＮＡは、６．８および１７ｋｂ
ｐのＣＨＯ特異性ＥｃｏＲＩバンドのほかに３．０およ
び５．０ｋｂｐのヒト特異性バンドをも含む（ホレンバ
ーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５の図６ａ、
レーン２、３を参照されたい）。（ここに実験の部Ｉと
して示した研究はホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒ
ｇ）ら、１９８５として公表された。図６および７は同
報文中に示され、本明細書には示されていない。）意外
にも９．５ｋｂｐのＤＮＡ断片は全ヒトＤＮＡ中に見出
されたが、ハイブリッド系には見出されなかった（ホレ
ンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６
ａ、レーン１を参照されたい）。同様にＨｉｎｄＩＩＩ
消化によって染色体５ハイブリッド細胞ＤＮＡ中に存在
しない７．５ｋｂｐのバンドが示された（ホレンバーグ
（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６ａ、レー
ン４を参照されたい）。これらの結果は、受容体ｃＤＮ
Ａはヒト染色体５にマッピングされるが、このゲノムの
他のいずれかの位置に付加的な受容体関連配列があるこ
とを示す。これらの配列をマッピングするために、デュ
アルレーザー蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使
用し、ＤＩＰＩ／クロモマイシン（ヘキスト３３２５８
クロモマイシンと併用）により染色した分裂期染色体懸
濁液を識別した；この方法により２４種のヒト染色体を
２２画分に分離することができた（レボ（Ｌｅｂｏ）
ら、１９８４）。染色体を直接にニトロセルロース上に
識別したのち、染色体ＤＮＡを変性し、ｈＧＲ ｃＤＮ
Ａプローブにハイブリダイズした。染色体５の配置確認
のほかに、染色体１６上に付加的配列が見出された（ホ
レンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図
６ｂを参照されたい）。この配置を確認するために、マ
ウス赤白血病細胞、およびヒト染色体１６を含むマウス
赤白血病細胞系（ボーデ（Ｂｏｄｅ）ら、１９８１参
照）からのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ｈＧ
Ｒ ｃＤＮＡにより調べた（ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６ｃを参照されたい）；
予想されたようにハイブリッド中に見出され、対照中に
は見出されなかった唯一のＤＮＡが７．５ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片であり、これにより染色体１６の帰属が確立した
（ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８
５、図６ｃ、レーン１、２を参照されたい）。ＯＢ７お
よびＯＢ１０の３’側非翻訳領域からのＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｂａＩ断片を用いた他のサザーンブロット分析により、
染色体５のみへのハイブリダイゼーションが明らかにな
った（データは示されていない）。本発明者らは、アル
ファーおよびベーター受容体ｃＤＮＡは共に恐らく染色
体５上の単一遺伝子によってコードされると結論し、こ
れら２形態のｃＤＮＡが択一的スプライシングにより生
じることを示唆する。さらに本発明者らは、染色体１６
上に位置する他の遺伝子は少なくともヌクレオチド５７
０〜１，６４０においてグルココルチコイド受容体遺伝
子との相同性を有すると結論する。これらの染色体１６
上の配列が関連ステロイド受容体遺伝子、処理された遺
伝子もしくは偽遺伝子、またはグルココルチコイド受容
体に対する遺伝子と共通の区域を共有する遺伝子のいず
れを表わすかは明らかでない。ゲノムクローニングおよ
びＤＮＡ配列決定により解答が得られるであろう。グル
ココルチコイド受容体をコードするｍＲＮＡのサイズを
測定するために、ヒト線維芽細胞系ＨＴ１０８０から分
離された細胞質ｍＲＮＡを用いてノーザンブロットハイ
ブリダイゼーション実験を行った（ボーデ（Ｂｏｄｅ）
ら、１９８１）。ｈＧＲ１．２コード化配列をプローブ
として用いて、５．６、６．１および７．１ｋｂｐの多
数のｍＲＮＡを検出した。これらの細胞をグルココルチ
コイドと共に２４時間処理すると受容体ｍＲＮＡが２〜
３倍減少し、潜在的な負のフィードバック調節が示唆さ
れた。Ｉ．Ｄ．考察 グルココルチコイド受容体の構造分析は、この調節分子
が遺伝子の転写に作用を及ぼす機構を洞察するための前
提条件である。ここに本発明者らはｃＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列分析から推定したヒトグルココルチコ
イド受容体の一次配列を提示した。ｈＧＲ ｃＤＮＡの
分離によって、少なくとも２形態のポリペプチドをコー
ドする多数のｍＲＮＡの存在が明らかになった。これら
の推定蛋白質はそれらのカルボキシ末端において、アル
ファーｈＧＲの場合は５０個アミノ酸、ベーターｈＧＲ
の場合は１５個のアミノ酸の置換によって異なる。アル
ファグルココルチコイド受容体は数種のヒト細胞系およ
びｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された主要な形態
である。しかしノースロップ（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ）ら
（１９８５）による最近の報文では、これら２形態の受
容体がマウスリンパ様細胞において明らかにされてい
る。マウスダブレット種に対するアルファーおよびベー
ターｈＧＲの関係は未確認である。ベーターｈＧＲの細
胞分布および潜在的機能も明らかでないが、変異型受容
体が組織特異性の機能に用いられている可能性はある。
本発明者らは現在それらの組織特異性発現を解明するた
めに各形態のヒト受容体に特異的な合成ペプチドに対す
る抗血清を生成している。免疫陽性ファージＤＮＡ挿入
配列ｈＧＲ１．２Ａをプローブとして用いて選ばれたｃ
ＤＮＡには、ヌクレオチド３１０１にあるＡＡＴＡＡＡ
を用いてポリアデニル化がより早期に信号化されている
点以外はＯＢ７と同様な３’末端を含むものがある。こ
れらのクローンはヒト線維芽細胞および胎盤双方のライ
ブラリーから分離された（データは示されていない）。
択一的ポリ（Ａ）部位の選択は多くの真核転写ユニット
の特色である（ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）１９８
２）。ある場合にはポリ（Ａ）部位の選択によって特定
のポリペプチド生成物が定められる（アマラ（Ａｍａｒ
ａ）ら、１９８２；ローゼンフィールド（Ｒｏｓｅｎｆ
ｅｌｄ）ら、１９８３；アルト（Ａｌｔ）ら、１９８
０；シュワルツバウエル（Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ）
ら、１９８３）が、他の場合にはいずれかのポリ（Ａ）
部位の選択によってポリペプチドの一次構造に何ら変化
が生じない（ゼッツエル（Ｓｅｔｚｅｒ）ら、１９８
２）。受容体の転写に際してポリ（Ａ）部位の選択は
（１）特定の組織におけるｍＲＮＡの安定性を変える
か、（２）スプライシングを変化させるか、または
（３）ランダムであり、生理学的結果を生じない。ここ
に記載したインビトロ翻訳実験から、クローニングされ
た分子が完全なグルココルチコイド受容体をコードする
という直接的証明が得られる。第１にインビトロ翻訳生
成物はサイズが天然のグルココルチコイド受容体と等し
く、受容体特異性抗血清と免疫学的に反応する。第２
に、インビトロ翻訳された蛋白質は、合成グルココルチ
コイドであるトリアムシノロンアセトニドを選択的に結
合させるという点で、機能的にグルココルチコイド受容
体として作用する。この結合グルココルチコイド、グル
ココルチコイド同族体およびプロゲステロンにより特異
的に競合されるが、性ステロイドであるテストステロン
およびエストロゲンによっては競合されない。この点に
関して、インビトロ翻訳された受容体はヒトリンパ様細
胞から得たインビボ受容体と等しい挙動を示し、クロー
ニングされた分子に関する機能の第１の証拠を与える。
ステロイド結合性の獲得は何ら特定の修飾を要しないと
思われるが、これが必要であったとしてもこれらの修飾
はインビトロ翻訳混合物中で行われる。ここに示した結
果は真核細胞の転写調節蛋白質とその標的遺伝子の分子
レベルでの相互作用を研究するために必要な情報を提供
した。これらの構造研究から、グルココルチコイド受容
体、その遺伝子、およびそのＲＮＡ生成物を分析しうる
基礎が得られる。さらにインビトロで受容体を発現しう
ることにより、特異的インビトロ突然変異生成の結果を
速やかに試験しうる新規な方法が得られる。最後に突然
変異生成および蛋白質結合双方の実験によるグルココル
チコイドおよび特異的調節要素に応答する遺伝子の分離
から、この蛋白質が誘導性真核遺伝子調節の分析に対す
るきわめて有用なモデルとして役立つことが示唆され
る。Ｉ．Ｅ．実験の部Ｉに述べた図に関する詳細な説明 第Ｉ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ配列決定法およ
びｃＤＮＡクローンの模式図。Ａ．アルファグルココル
チコイド受容体に対する複合ｃＤＮＡを最上部に示し、
非コード化配列（直線）およびコード化配列（点彩部
分）を示す。共通の６ヌクレオチド制限酵索部位を示
す。配列を決定するために用いた重複ｃＤＮＡ挿入配列
が示され、配列決定された領域の下方の矢印は配列決定
の方向および範囲を表わす。ＯＢ１０の３’末端の破線
は相違する配列を示す。数字はＯＢ１０において５’側
寄りの転写された配列に対するヌクレオチドの位置を意
味する。Ｂ．アルファ形およびベータ形の受容体をコー
ドするｃＤＮＡ（それぞれＯＢ７およびＯＢ１０）。Ｏ
Ｂ７の５’末端（破線）はＯＢ１０クローンにより与え
られる。蛋白質コード化情報は幅広い棒により表わさ
れ；非翻訳配列は細い棒により示される。ヌクレオチド
およびアミノ酸はコード化配列のそれぞれ上方および下
方に番号が示される。共通ＤＮＡ配列はヌクレオチド
２，３１３（アミノ酸残基７２７）にまで及び、この地
点でアルファ形とベータ形の受容体が分かれ、アルファ
ｃＤＮＡ（ＯＢ１２，ＯＢ７）は１５０個のヌクレオチ
ド（５０個のアミノ酸）のオープンリーディングフレー
ムへと続き、ベータｃＤＮＡ（ＯＢ１０）は４５個のヌ
クレオチド（１５個のアミノ酸）へと続く（第Ｉ−３
（Ｂ）図参照）。これらのクローンにおいてポリ（Ａ）
のすぐ上流にヘキサヌクレオチド信号（ＡＡＴＡＡＡ）
が示されており、ＯＢ７の最初のヘキサヌクレオチドは
ＯＢ１２においてポリ（Ａ）として作用する。第Ｉ−１（Ａ）および（Ｂ）図の方法 挿入配列ｈＧＲ１．２、ｈＧＲ２．９およびｈＧＲ５．
１６を前記に従ってラムダｇｔｌｌ ＩＭ−９リンパ様
細胞ｃＤＮＡライブラリーから分離した（ワインバーガ
ー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。２種のク
ローンがｐｃＤにおいてＨ．オクヤマにより（オクヤマ
（Ｏｋａｙａｍａ）ら、１９８３）、ＧＭ６３７ヒト線
維芽細胞（ＯＢ７）および一次ヒト線維芽細胞（ＯＢ１
０）からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを用いて構成されたｃ
ＤＮＡライブラリーから分離された。スクリーニングは
３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いるニックトランスレーションに
より放射性標識されたｈＧＲ１．２−ｃＤＮＡを用いて
行われた。マキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９７７）の化学的開裂法により
配列が決定された。第Ｉ−２（１）および（２）図 ヒトグルココルチコイド受容体のｃＤＮＡおよび推定蛋
白質配列。完全なアルファコード化配列およびＯＢ７の
３’側非翻訳領域を図示し、推定アミノ酸を長いオープ
ンリーディングフレームの上方に示す。ヌクレオチド１
２１−１２３における上流フレーム内終止コドンおよび
ＯＢ７における推定の付加的ポリアデニル化信号に下線
を施した。第Ｉ−３（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトグルココルチコイド受容体ベータｃＤＮＡの３’側
の制限地図およびヌクレオチド配列。Ａ．共通の６ヌク
レオチド制限酵素部位をＯＢ１０の３’側非翻訳領域に
つき示す。ベータ形（ＯＢ１０）のヌクレオチド２，２
８１から３，８２０までのｃＤＮＡ配列をアルファ形
（ＯＢ７）の３’末端コード化部分に見られる蛋白質コ
ード化情報と比較したもの。各ｃＤＮＡによりコードさ
れるアミノ酸をヌクレオチド配列の上方に示す。ＯＢ１
０の３’側非翻訳配列における推定ポリアデニル化信号
（ＡＡＴＡＡＡ）に下線を施した。第Ｉ−４（Ａ）および（Ｂ）図 インビトロにおいて翻訳されたｈＧＲと細胞抽出物から
のインビボｈＧＲのイムノブロット比較。Ａ．ｈＧＲ
ｃＤＮＡ配列インビトロ転写のために構成されたベクタ
ー。完全なアルファ（ｐＧＲ１０７）およびベータ（ｐ
ＧＲ１０８）コード化配列はｐＧＥＭ１中のＳＰ６プロ
モーターの転写制御下に置かれた。ベクター配列、非コ
ード化ｃＤＮＡ配列、およびコード化配列はそれぞれ細
い直線、太い棒、および四角で囲った領域により示され
る。約６０個のヌクレオチドのポリ（Ａ）領域をＡｐｉ
により示す。異なるコード化配列は斜線領域および点彩
領域により示される。Ｂ．インビトロ翻訳生成物および
細胞抽出物のウェスタンブロット分析。ＲＮＡを添加し
て（レーン１）またはｐＧＲ１０８から（ベータ、レー
ン２）もしくはｐＧＲ１０７から（アルファ、レーン
３）合成されたＲＮＡを添加して家兎の網赤血球溶解系
において合成した非標識翻訳生成物を７．５％ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル上で分画した。他のレーンは下
記のものである。ＩＭ−９（レーン４）、１μＭトリア
ムシノロンアセトニドで処理したＩＭ−９（レーン
５）、ＨｅＬａ（レーン６）、ＡＤＲ６．Ｍ１８９０．
ＡＤＩマウスリンパ腫（レーン７）、Ｓ４９マウスリン
パ腫（レーン８）およびＥＬ４リンパ腫（レーン９）か
らの細胞質抽出物。蛋白質をニトロセルロースに移し、
抗ｈＧＲ抗体、次いで１２５Ｉ標識黄色ぶどう球菌（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）蛋白質Ａに
より前記に従って試験した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎ
ｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。第Ｉ−４（Ａ）および（Ｂ）図の方法 第Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図に示したアルファ
コード化配列全体を含む発現ベクターを構成するため
に、ＯＢ７の３’側コード化配列をＯＢ１０の５’側コ
ード化配列に融合させた。ＯＢ７をＥｃｏＲＩにより部
分的に消化し、ＸｂａＩによって完全に消化し、１．２
０ｋｂｐの断片をゲル精製してＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消
化ＯＢ１０とリゲートさせて、中間体ｐＯＢ１０７を得
た。５’側ポリ（Ｇ）領域（１１個のヌクレオチド、ｎ
ｔ）および３’側ポリ（Ａ）領域（約６０個のｎｔ）を
含む全ｐＯＢ１０７ ｃＤＮＡ配列を部分ＰｓｔＩ／完
全ＢａｍＨＩ消化により切断した。得られた３．５ｋｂ
ｐの断片をゲル精製し、ｐＧＥＭ１（プロメガ・バイオ
テク）のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位間に挿入してｐ
ＧＲ１０７を得た。プラスミドｐＧＲ１０８は直接にｐ
ＯＢ１０から、部分ＰｓｔＩ／完全ＢａｍＨＩ消化し、
得られたｃＤＮＡ挿入配列をｐＧＥＭ１の対応する部位
へ挿入することにより構成された。キャップ付きＳＰ６
転写体はＰｖｕＩＩ−直線化されたｐＧＲ１０７および
ｐＧＲ１０８からクリーブ（Ｋｒｉｅｇ）およびメルト
ン（Ｍｅｌｔｏｎ）（１９８４）の記載に従って合成さ
れ、ＧＴＰ濃度を４００μＭから１００μＭに低下させ
かつｍ７ＧｐｐＧ（ファルマシア）を５００μＭにまで
添加することにより同時キャッピングが行われた。転写
体をＰ６０クロマトグラフィーにより精製し、ミクロコ
ッカスヌクレアーゼ処理した家兎網赤血球溶解物（プロ
メガ・バイオテク）により、製造業者が指示する条件で
翻訳した。ステロイド処理細胞からのＩＭ−９サイトゾ
ルの調製は先きに報告されたとおりである（ワインバー
ガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。サイズ
マーカーはホスフォリラーゼＢ（９７Ｋ）、ウジ血清ア
ルブミン（６６Ｋ）および卵アルブミン（４５Ｋ）であ
った。第Ｉ−５図 インビトロ翻訳されたアルファーｈＧＲのステロイド結
合性。ＩＭ−９サイトゾル抽出物（点彩した棒）および
ＳＰ６産生アルファーｈＧＲＲＮＡを含む網赤血球溶解
物（ＧＲ１０７；無地の棒）への結合を示す。各棒は１
００倍過剰の各種ステロイド競合体を用いて測定した結
合３Ｈ−トリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）を表わ
す；非標識ＴＡを競合体として用いて１００％の競合が
測定された。各値は３回測定の平均を表わし、誤差の棒
はＰ＜０．０５を示す。ステロイド系競合体はデキサメ
サゾン（Ｄｅｘ）、コルチゾル（Ｃｏｒｔ）、プロゲス
テロン（Ｐｒｏｇ）、テストステロン（Ｔｅｓｔ）、お
よびエストラジオール（Ｏｅｓｔ）である。第Ｉ−５図の方法 結合アッセイは１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４，
１００ｍＭ・ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭモ
リブデン酸ナトリウム、１０ジチオトレイトール、１５
０ｍＭ３Ｈ−ＴＡ（２０Ｃｉｍｍｏｌ−１；アメルシャ
ム）を含有する１００μｌ、および翻訳混合物１０μｌ
または新鮮なＩＭ−９シストゾル１００μｇ中で行なわ
れた。非標識競合体（１５μＭ）を指示に従って添加し
た。０℃で２時間後に５０％デキストラン被覆活性炭５
μｌにより５分ずつ２回抽出して未結合ステロイドを除
去し、計数した。アルファグルココルチコイド受容体
（ＧＲ１０７）に対する非競合値および完全競合値はそ
れぞれ４９０および２９０ｃ．ｐ．ｍ．であった。転写
体を添加せずに、またはベータ受容体ＳＰ６ＲＮＡ（Ｇ
Ｒ１０８）を用いてプログラムした網赤血球溶解物翻訳
混合物は競合性３Ｈ−ＴＡ結合を含まなかった。他の図 ここに実験の部Ｉとして提示した科学研究はＮａｔｕｒ
ｅ，３１８：６３５−６４１（１９８５）に発表され
た。そのＮａｔｕｒｅの報文はこの実験例に含まれない
２図を含む。それらの図は図６、ｈＧＲ ｃＤＮＡの染
色体マッピング分析；図７、ｈＧＲ ｃＤＮＡのノーザ
ーンブロット分析である。
【０００７】実験の部ＩＩ ヒトグルココルチコイド受容体の機能区ＩＩ．Ａ．概要 ＣＶ−１細胞においてｈＧＲ発現ベクターのトランスフ
ェクションにより産生されたヒトグルココルチコイド受
容体（ｈＧＲ）はＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写活性
化のために必要かつ十分な因子として機能する。誘導の
規模（５００〜１０００倍）から、ｈＧＲは転写“スイ
ッチ”として作用し、グルココルチコイド応答要素を含
む休止状態のプロモーターを活性化状態に変換するので
あろうということが明らかになった。ｈＧＲによるＭＴ
Ｖ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写の刺激はＣＶ−１細胞にお
いて制限的な転写因子に依存しない。ｈＧＲの挿入変異
体２７種の特性を調べることにより少なくとも４種の機
能区の位置が決定された。それらのうち２種は推定ＤＮ
Ａ−およびステロイド−結合区に対応する。他の２区は
転写に対するそれらの有効な作用のため、タウ（τ）と
呼ばれる。これは、この受容体における他の領域は完全
な転写活性化のために必要でるが、ステロイドまたはＤ
ＮＡの結合に特異的には関与していないという可能性を
示す。ＩＩ．Ｂ．序論 ２群のステロイドホルモン受容体の一次構造がそれらの
ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により解明され
た。実験の部Ｉに示すように、ヒトグルココルチコイド
受容体（ｈＧＲ）をコード化するｃＤＮＡの同定により
２形態の蛋白質、すなわちアミノ酸７７７個のもの（ア
ルファ）および７４２個のもの（ベータ）が明らかにな
った。これらはそれらのカルボキシル末端において異な
る。（実験の部Ｉの記載はホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎ
ｂｅｒｇ）ら、１９８５として発表された。）ヒトエス
トロゲン受容体はこれよりも若干小さな、アミノ酸５９
５個の蛋白質である（グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、１
９８６；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９８６）。アミ
ノ酸配列の比較により、これら２群の受容体間のみでな
く、鳥類赤芽球症ウィルスのｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子
生成物とも広範な相同性が明らかになった（ワインバー
ガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５；グリーン
（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、１９８６；グリーン（Ｇｒｅｅ
ｎ）ら、１９８６）。これはステロイド受容体遺伝予お
よびｃ−ｅｒｂ−Ａプロト発癌遺伝子が共通の原始的な
先祖由来の調節遺伝予に由来するという示唆を支持する
（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８
５）。クローニングされたｃＤＮＡから推定されたｈＧ
Ｒのアミノ酸配列（実験の部Ｉ参照）に基づいて、この
蛋白質の機能的および免疫学的に重要な領域の配置を提
示した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、
１９８５）。これらには、蛋白質のアミノ末端側半分に
位置する免疫区、他のＤＮＡ結合性蛋白質との構造的類
似性を示すＤＮＡ結合区、および分子のカルボキジル末
端付近に位置するグルココルチコイド結合区が含まれ
る。しかし各区の位置は仮定であり、転写自体の活性化
に関与する区は確認されていなかった。この研究におい
て本発明者らはｈＧＲ蛋白質に代替アミノ酸を導入する
ことによりｈＧＲ内に提唱されている機能区の部位を確
認し、かつ他の重要な領域を見出すことを試みた。本発
明者らはまずサル腎細胞における新規な発現系を開発し
た。この系では機能性ｈＧＲの合成がラウス肉腫ウィル
ス（ＲＳＶ）の長鎖末端リピートの制御下でのｃＤＮＡ
の転写によって方向づけられる。合成受容体の機能はク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）アッセイ（ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９８２
ａ）およびステロイドホルモン結合により測定した、マ
ウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＴＶ）ＬＴＲの転写誘導によ
って監視された。この新規な発現系によって本発明者ら
は挿入変異生成が受容体の種々の機能に与える影響を調
べることができ、これによってｈＧＲの機能区構造のよ
り詳細なモデルを提唱した。２７種の挿入変異体の分析
に基づく本発明者らの結果から、グルココルチコイド受
容体は別個の機能区からなることが確認された（ワイン
バーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。さ
らにこれらにより、提唱したＤＮＡ−およびステロイド
−結合区外の他の配列が確認され、これを前記のように
本発明者らは転写に対するそれらの有効な作用のためτ
と呼ぶ。ＩＩ．Ｃ．結果 （ａ）アッセイ系および実験様式 クローニングされたｃＤＮＡからの機能性ｈＧＲ（実験
の部Ｉ）の発現を調べるために用いたアッセイ系および
方法を第ＩＩ−１図に示す。これらの実験においては、
レポーター遺伝子に結合したグルココルチコイド応答性
プロモーター／エンハンサー要素を受容体陰性細胞に導
入した。従って原理的にこの構造物は転写不活性のはず
である。本発明者らのアッセイ法にはクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードす
る配列に融合させたＭＴＶ ＬＴＲを選択使用した（Ｅ
Ｃ２．３．１．２８）。グルココルチコイドホルモンが
ＭＴＶＬＴＲ内の独自の部位における転写開始の効率を
高めることにより（ウッカー（Ｕｃｋｅｒ）ら、１９８
３）ＭＴＶ ＤＮＡの転写速度を高めることは先に証明
されている。（ロンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｇ）ら、１
９８３）。さらにグルココルチコイド受容体はＭＴＶ
ＬＴＲ内にマッピングされたＤＮＡ配列に特異的に結合
し（ペイバー（Ｐａｙｖａｒ）ら、１９８３）、これが
グルココルチコイド応答性を異種プロモーターに与えう
る（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら、１９８
３）。ｐＭＴＶＣＡＴ（またはｐＧＭＣＡＴ）を受容体
発現プラスミドと共トランスフェクジョンすることによ
り、トランスフェクジョンされた細胞をグルココルチコ
イドホルモンで処理した際に活性を誘導しうる機能性受
容体が得られる。さらに生化学的実験、たとえば発現し
た受容体のステロイド結合活性およびウェスタンブロッ
ト分析を同時に行うことができる。ＲＳＶ ＬＴＲを全
長ｈＧＲ ｃＤＮＡ（ｐＲＳｈＧＲアルファ）に結合さ
せる発現ベクターをデザインして、広範な宿主細胞型に
おいて高水準の発現を得た。ベクターｐＲ．ＳｈＧＲア
ルファはｐＲＳＶＣＡＴ（ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）
ら、１９８２ｂ）の誘導体であり、ＣＡＴ遺伝子のコー
ド化配列がｈＧＲ ｃＤＮＡにより置換されている。Ｓ
Ｖ４０の複製開始点をこのベクターに導入し、これによ
り組換えプラスミドはＴ抗原（Ｔａｇ）を発現するＣＯ
Ｓ−１（ＣＯＳと呼ぶ）サル腎細胞において高いコピー
数にまで増殖可能となった（グルッツマン（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ）１９８１）。ＣＯＳ細胞および親細胞系ＣＶ−１
はグルココルチコイド受容体の水準が検出不可能である
という付加的な利点をも与える（未発表の所見ならびに
第ＩＩ−２およびＩＩ−３図）。（ｂ）機能性ｈＧＲの発現 上記のアッセイ法はステロイドホルモン受容体の作用機
構を研究する際に遭遇する主な難点の幾つかを克服する
ために企画された。これらの難点には受容体の細胞内水
準が低いこと、受容体の異質性の可能性があったこと、
および受容体の機能を試験する定量可能なバイオアッセ
イ系がなかったことが含まれる。従って本発明者らはｐ
ＲＳｈＧＲアルファでトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞が産生しうるｈＧＲの相対量をまず調べた。第ＩＩ
−２図（右のレーン）のトランスフェクションされたＣ
ＯＳ細胞のウェスタンブロット分析は、ＣＯＳ細胞がＩ
Ｍ９細胞系（左レーン）に存在するｈＧＲと移動性に関
して区別できない９４ｋｄのｈＧＲポリペプチドを合成
したことを証明する。さらに一時的にトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ細胞中に存在するｈＧＲの量はＩＭ９
細胞、すなわち細胞当たり１００，０００−２００，０
００の受容体を含むもの（ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）
ら、１９８４）に見出される水準よりも多い。この発現
系は高い細胞内ｈＧＲ水準を有する細胞を提供するだけ
でなく、ｈＧＲの機能研究を妨げる可能性のある受容体
ミクロ異質性の可能性をも除く。発現したｈＧＲの有効
な転写因子としての機能性を試験するために、ｐＭＴＶ
ＣＡＴおよびｐＲＳｈＧＲアルファを共トランスフェク
ションしたのちに得た細胞抽出物を用いてＣＡＴアッセ
イを行った。ＣＯＳおよび親細胞であるＣＶ−１細胞の
双方へのトランスフェクションを調べた。予想どおり
（アービン（Ａｌｗｉｎｅ）１９８５）ＣＯＳ中にＳＶ
４０ Ｔａｇが存在するとＭＴＶ ＬＴＲの基礎活性が
高まった（データは示されていない）。従って最大の誘
導を得るために、ＳＶ４０Ｔａｇを発現しないＣＶ−１
細胞を用いた。第ＩＩ−３図に示すように、ｐＭＴＶＣ
ＡＴを対照プラスミドと共トランスフェクションした場
合、ＣＶ−１細胞中にＣＡＴ活性は生じなかった。同様
にｐＭＴＶＣＡＴおよびｐＲＳｈＧＲアルファを共トラ
ンスフェクションした場合もＣＡＴ活性は生じなかっ
た。しかし同じく共トランスフェクションされたＣＶ−
１細胞をデキサメサゾン（ＤＥＸ）で処理すると、ＭＴ
Ｖ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写が開始される。ｐＭＴＶＣ
ＡＴにより生じるＣＡＴ活性の基礎水準はＣＶ−１細胞
においてかろうして検出しうる程度（しばしばゼロ）で
あるので、この誘導係数はきわめて大きい（約５００〜
１０００倍）。対照実験として本発明者らはベータ形の
ｈＧＲを共トランスフェクションした（実験の部Ｉ）。
これはステロイドを結合し得ないことが示されているも
のである（第ＩＩ−１表参照）。第ＩＩ−３図はｈＧＲ
ベータが本発明の発現アッセイ法において機能しないこ
とを証明する。また、ｈＧＲによる転写の活性化はグル
ココルチコイド応答性要素を含むプロモーターに限定さ
れる。ｐＭＴＶＣＡＴの代わりにｐＭＴＩａＣＡＴ、す
なわち重金属には応答するがグルココルチコイドには応
答しないヒトメタロチオネインＩａ遺伝子の調節領域を
含むプラスミドを用いた場合、トランスフェクションし
たＣＶ−１のホルモン処理後にＣＡＴ活性の誘導は認め
られなかった（データは示されていない）。これらの結
果は、細胞内でｈＧＲがステロイド依存性転写スイッチ
として機能するのに必要かつ十分な因子として作用する
ことを証明する。このアッセイに基づいて、ステロイド
による受容体の活性化を試験することができた。第ＩＩ
−４（Ａ）図に示したように、ＤＥＸはｈＧＲにより誘
導されたＣＡＴ活性に対し３ｎＭのＥＤ５０値を示す。
これは種々の生理学的作用においてＤＥＸにつき観察さ
れたＥＤ５０値（５ｎＭ）と一致する。共トランスフェ
クションされたＣＶ−１細胞を１００ｎＭのテストステ
ロン、エストラジオールおよびプロゲステロンで処理す
ることによりｈＧＲつ作用の特異性をさらに調べた。こ
れらのステロイドはプロゲステロン以外はＣＡＴ活性を
誘導し得なかった。プロゲステロンはＤＥＸにより生じ
た最大誘導の１％の値でｈＧＲの機能を刺激した（デー
タは示されていない）。これらの結果は、トランスフェ
クションされたＣＶ−１細胞が、天然受容体の特異性お
よび濃度において薬理学的リガンドと相互作用する機能
性ｈＧＲを合成することを示す。エンハンサー含有分子
と細胞成分との特異的相互作用に関する研究から、ＣＶ
−１細胞は特定のウィルス性エンハンサーの機能に必要
な細胞性因子を限定された量含有することが示された
（ショラー（Ｓｃｌｌｏｌｅｒ）およびグルス（Ｇｒｕ
ｓｓ）１９８４）。これらの細胞においてはトランスフ
ェクションされたｐＳＶ２ＣＡＴ（ゴルマン（Ｇｏｒｍ
ａｎ）ら、１９８２ａ）により生じるＣＡＴ活性はプラ
スミド０．３ｐｍｏｌ／ディッシュでプラトーに達す
る。同様に、ｈＧＲが限定因子と相互作用するならば漸
増する量のｐＲＳｈＧＲアルファのトランスフェクショ
ンにより誘導されるＣＡＴ活性を一定量のｐＭＴＶＣＡ
Ｔで飽和させることができるはずである。この実験では
２ｐｍｏｌ（５μｇ）のｐＭＴＶＣＡＴ ＤＮＡを使用
し、漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファＤＮＡを非特異
的キャリヤーＤＮＡと共に添加して、合計３０μｇ／デ
ィッシュを得た。第ＩＩ−４（Ｂ）図は０．０３ｐｍｌ
（１００ｎｇ）程度の少量のｐＲＳｈＧＲアルファ（デ
ィッシュ当たり）をトランスフェクションした際にＣＡ
Ｔ活性を検出しうること、およびＣＡＴ活性においてプ
ラトーに達することはないことを証明する。これらデー
タは、ｈＧＲによるＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子のトラン
スフェクションの刺激はＣＶ−１細胞中で限定する転写
因子に依存しないことを示唆する。（ｃ）ｈＧＲの機能区のマッピング ｈＧＲが遺伝子転写を調節する機構を理解するために
は、まずその機能区の解明が必要であった。グルココル
チコイド受容体の蛋白質分解に関する限定された研究
（カールスデット−デューク（Ｃａｒｌｓｄｅｄｔ−Ｄ
ｕｋｅ）１９８２；デルウェーク（Ｄｅｌｌｗｅｇ）
ら、１９８２；ランゲ（Ｗｒａｎｇｅ）ら、１９８４；
ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎ）ら、１９８４）、およ
びｈＧＲの一次構造の分析（実験の部Ｉ参照）に基づい
て、受容体の構造に対するモデルが提示されている（ワ
インバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８
５）。このモデルにより主要な３区域が確認される。す
なわちアミノ酸１４５から２８０に及ぶ免疫区、アミノ
酸４２１から４８１に及ぶＤＮＡ結合区、および蛋白質
のカルボキシル末端付近に位置するステロイド結合区で
ある。このモデルを試験するために本発明者らはグルコ
コルチコイド受容体コード化配列における２７種の部位
特異性挿入変異体をリンカースキャニング法により形成
した。次いでこれらの遺伝子工学的に形成された変異体
につき、遺伝子転写およびステロイドホルモン結合に対
するそれらの能力をアッセイした。ｈＧＲのリンカー挿
入変異体を形成するために、ＤＮＡ分子を高い頻度で開
裂させる制限酵素を用いて部分開裂することによりプラ
スミドｐＲＳｈＧＲアルファをまず線状化した。線状プ
ラスミドを分離し、ＢａｍＨＩリンカーを添加して、ｈ
ＧＲをコードするオープンリーディングフレームを再生
した。得られた変異体は３個または４個の付加的アミノ
酸を保有し、これらが野生型の蛋白質の配列を中断して
いる。この方法により本発明者らは一連のランダムなｈ
ＧＲ変異体を形成した（第ＩＩ−５図）。これらの変異
体が全長ｈＧＲを発現する能力をウェスタンブロット分
析により推定した。産生されたｈＧＲは３０％以上は異
ならないことが示され、従ってこれらの変異体はいずれ
も発現された蛋白質を不安定化しないと思われた。各変
異体の機能性を第ＩＩ−１表の野生型ｈＧＲのものと比
較した。２７種のｈＧＲ変異体のうち１２種により誘導
されるＣＡＴ活性は野生型の水準に匹敵した。ＣＡＴ活
性の誘導によりアッセイして機能が低下し、または完全
に失われている１５種のｈＧＲ変異体の分析により、こ
れらは別個の４群に属することが示された。いわゆる免
疫原区のアミノ酸１２０と２１５の間に位置する一群の
これら変異体が第１群を形成する。受容体分子のこの領
域には特異的機能は帰属されていないが、３種の変異体
（Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１４）は低いＣＡＴ活
性誘導能を示す。これらの変異体はステロイド結合能を
完全に維持した。意外ではないと思われるが、第２群の
欠損変異体は受容体の推定ＤＮＡ結合区に見出される。
この機能区はシスティンに富み、それぞれアミノ酸約２
５個の２反復単位からなり、これがＺｎ２＋リガンドに
より調整されたループ構造に折れ曲がっている（ミラー
（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９８５）。変異体Ｉ４２２の場
合は、配列モチーフＣｙｓ−Ｘ２−ＣｙｓがＣｙｓ−Ｘ
５−Ｃｙｓに変わっている。付加的アミノ酸の存在が受
容体の機能を完全に失わせている。変異体Ｉ４４０は第
１ループの形成に関与する他の２個のシスティン間に同
様にアミノ酸４個の挿入配列を有し、同様に検出可能な
水準のＣＡＴ活性を誘導できない。他方、変異体Ｉ４２
８ではループ自体の長さがアミノ酸１３個から１７個に
伸長している。著しく低下してはいるが、Ｉ４２８によ
るＣＡＴ活性の誘導はなお検出可能である。３種の変異
体すべてについてＤＮＡ結合区に存在するステロイド結
合容量は野生型の水準の範囲内にあることが示された。
突然変異により影響を受ける第３の領域はＤＮＡ結合区
に隣接した位置にある。変異体Ｉ４８８および１４９０
は低い水準のＣＡＴ活性を示すが、ステロイドを効果的
に結合する。第４群は受容体蛋白質の最後の２００個の
アミノ酸を包含する。５種の変異体は（Ｉ５８２，Ｉ５
８９，Ｉ５９９，Ｉ６２６およびＩ６９６）は検出可能
な水準のＣＡＴ活性を示さない。この機能活性の欠如は
それらがデキサメサゾンを全く結合し得ないことと関係
がある。これらの結果は、ステロイド結合領域が蛋白質
の大部分を包含することを示す。これらはすべてＣ末端
付近に集中している。分子のアミノ末端と異なりこの領
域は受容体の一次構造の変化に対してきわめて敏感であ
る。（ｄ）第ＩＩ−１表 ＣＶ−１またはＣＯＳ細胞をｐＲＳｈＧＲアルファ、ｐ
ＲＳｈＧＲベータ、または突然変異したｈＧＲアルファ
によりトランスフェクションし、ＣＡＴ活性およびステ
ロイド結合能につきアッセイした。トランスフェクショ
ン後にＣＶ−１細胞を１０ｎＭ−ＤＥＸの存在下で２日
間培養したのち、細胞溶解およびＣＡＴアッセイを行っ
た。ＣＯＳ細胞は普通の培地に維持された。これら２パ
ラメーターを野生型ｈＧＲ活性に対する％として定量し
た。ｈＧＲアルファに挿入されたアミノ酸を１文字コー
ドで表示する。ＮＴは試験しなかったことを意味する。
ｈＧＲアルファとｈＧＲベータのアミノ酸組成の相違を
第ＩＩ−５図および実験の部Ｉに示す。ＩＩ．Ｄ．考察 ｈＧＲ発現ベクターのトランスフェクションによりＣＶ
−１細胞中で産生されたｈＧＲがＭＴＲ−ＣＡＴ融合遺
伝子の転写活性化に必要かつ十分な因子であることを示
した。誘導の規模から、ｈＧＲは転写“スイッチ”とし
て作用し、これがグルココルチコイド応答要素を含む静
止状態のプロモーターを活性化状態に変換しうることが
明らかになった。構成性活性を示す他の転写因子と異な
り、ｈＧＲによる転写刺激は完全にグルココルチコイド
ホルモンの存在に依存性である（第ＩＩ−３およびＩＩ
−４（Ａ）図）。細胞内で蛋白質が大量に産生されるだ
けでは調節された遺伝予の転を誘導するのに十分ではな
い。ｈＧＲがホルモンによって活性化される機構は十分
には解明されていないがサイクリックＡＭＰ結合蛋白質
の場合と同様に、蛋白質内におけるアロステリック転移
を伴うものと思われる（マッケイ（Ｍｃｋａｙ）および
スタイツ（Ｓｔｅｉｔｚ）１９８１；ゲージス（Ｇａｇ
ｅｓ）およびアジヤ（Ａｄｈｙａ）１９８５）。本発明
者らは、ｈＧＲによる転写の活性化はＣＶ−１細胞中に
限定された量で存在する因子によって制限されないこと
を認めた（第ＩＩ−４（Ｂ）図）。これらの結果はグル
ココルチコイド応答性エンハンサーへのｈＧＲ−ステロ
イド−複合体の結合がプロモーター付近の一般的転写因
子の活性を高めるのに十分であることを示唆する。他の
数種の転写因子について同様な特性が報告されている。
たとえばＡｄｆ１、すなわちメラノガスター（Ｄ．ｍｅ
ｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるアルコールデヒドロゲ
ナーゼ（Ａｄｈ）の近位プロモーターを活性化する転写
因子は他の蛋白質因子の不在下でＡｄｈ鋳型ＤＮＡを結
合し、Ａｄｈ ＲＮＡ合成の開始を活性化するために内
在性ＲＮＡポリメラーゼＩｉ、および他の一般的転写因
子を含む画分を必要とするにすぎない（ヘーベライン
（Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎ）ら、１９８５）。ＳＶ４０エン
ハンサー／プロモーター要素を含む組換えプラスミドｐ
ＳＶ２ＣＡＴを用いる他の型の実験において、ショーラ
ー（Ｓｃｈｏｌｅｒ）およびグルス（Ｇｒｕｓｓ）（１
９８４）は、エンハンサー含有ＤＮＡの機能に細胞性分
子が必要であることを示した。彼らの実験によれば、Ｓ
Ｖ４０エンハンサー要素によるＣＡＴ遺伝子の活性化に
必要な限られた量の細胞性因子の存在が示された。しか
し一般的転写因子の枯渇は観察されなかった。これらの
データは特定の有効な転写因子の作用機作が一般的転写
因子の活性を高める因子自身、またはポリメラーゼ自身
によって誘導されるクロマチンの構造における変化をも
たらすらしいということを示唆しているモロー（Ｍｏｒ
ｅａｕ）ら、１９８１；ウェイジリク（Ｗａｓｙｌｙ
ｋ）ら、１９８３）。グルココルチコイド処理によって
ＭＴＶ ＬＴＲのセグメントを含むＤＮＡ領域に可逆的
および永続的双方の変化が生じることはすでに示されて
いる（ザレット（Ｚａｒｅｔ）およびヤマモト（Ｙａｍ
ａｍｏｔｏ）１９８４）。結合した受容体がプロモータ
ー活性を高める機構は完全に解明されている。しかしｈ
ＧＲを過剰に発現する系が得られれば、有効な転写因子
による分子基盤での転写活性化についての将来の研究が
容易になるであろう。２７種の挿入変異体の解明の結果
は、ヒトグルココルチコイド受容体が一連の機能区から
なるという本発明者らの先の示唆を支持し、拡大する。
ステロイド結合に影響を与える変異体がすべてカルボキ
シル末端に集中していることは注目に値する。この領域
がホルモンの特異性をコードする別個の機能区として機
能することが示唆されるほか、これらの結果はこの受容
体内に確認された他の機能区が別個の機能を果たすとい
可能性をも暗示する。従って、受容体が特定のＤＮＡ配
列を認識し、これと相互作用する能力は、エストロゲン
受容体および発癌遺伝子生成物ｖ−ｅｒｂ−Ａによって
高度に保持されているＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに富む領
域にあると思われる。これらの領域における突然変異は
受容体分子が転写を活性化する能力を低下させるという
のは論理的であると思われる。活性化はリガンドがアロ
ステリック形質転換を誘導する能力、および形質転換し
た分子がＤＮＡを認識し、これと相互作用する能力の双
方に依存するからである。ステロイド受容体構造の最初
のモデル（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）
ら、１９８５）に基づけば、これらは突然変異誘発の解
明に際し予想された結果であった。しかし予想されなか
った結果は、転写活性に影響を与える他の領域が少なく
とも２か所確認されたことである。これは、転写活性化
に必要であるがステロイドまたはＤＮＡの結合のいずれ
にも特異的に関与してはいない他の機能区が受容体中に
存在するという興味深い可能性を与える。変異体Ｉ１２
０，Ｉ２０４およびＩ２１４は野生型の親和性をもって
ステロイドと結合するが、転写活性が低下している。こ
れらの変異体は本発明者らがτ１と呼ぶこの機能区が完
全なｈＧＲ活性を得るために機能的に重要であり、かつ
必要であることを明瞭に証明している。興味深いこと
に、数系列のグルココルチコイド耐性細胞に見出された
非機能性の切除型変異体（すなわち４０ｋｄ）は野生型
受容体よりも効率的に核内に保持されるが、転写を活性
化し得ない（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、１９７
６；アンドレアセン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）およびゲー
リング（Ｇｅｈｒｉｎｇ）１９８１；ウェストファル
（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）ら、 われた受容体断片は明らかに蛋白質のアミノ末端であ
る。それらはホルモン結合能を保持しているからであ
る。本発明者らはτ１がｈＧＲの主免疫原区と一致する
ことを指摘した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、１９８５）。これは恐らくこれが分子の外表に
あることを示す。この機能区がその機能を果たす様式に
ついての考察には、受容体の二量化をもたらす自己相互
作用、ＲＮＡポリメラーゼＩＩなどの一般的転写因子と
の相互作用の可能性、および／または活性化された受容
体の残りの部分にアロステリック作用を及ぼすことによ
るＤＮＡ結合の調節が含まれる（デルウェーク（Ｄｅｌ
ｌｗｅｇ）ら、１９８２）、τ１は受容体のアミノ末
端、すなわちより小型のエストロゲン受容体とは共有さ
れない領域に含まれる。恐らくエストロゲン受容体が第
２の蛋白質との相互作用によりこの機能区と同等の機能
を得るか、またはτ１が他の調節分子との相互作用では
なくグルココルチコイド受容体自体の内部の他の残基と
相互作用するのであろう。転写活性化に影響を及ぼす他
のτ領域（τ２と呼ぶ）はエストロゲン受容体およびｖ
−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子中に存在する領域である。その
位置からも、これがステロイド−およびＤＮＡ−結合区
を結合させる“ちょうつがい”領域として作用するとい
う可能性が示唆される。従ってこれらの変異体は受容体
の活性化に必要なアロステリック形質転換を遮断するで
あろう。アミノ酸挿入配列により影響を受ける第３の領
域は、ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（１
９８５）により報告される推定ＤＮＡ結合区内に位置す
る。この機能区はＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに富む配列を
含む２個の反復単位からなり、ｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝
子およびエストロゲン受容体と比較して最も強く保守さ
れるものである（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、１９８５；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９８
６；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９８６）。これらの
反復単位はまず因子ＴＦ−ＩＩＩａ（ミラー（Ｍｉｌｌ
ｅｒ）ら、１９８５）に観察され、それ以来多数の他の
核酸結合性蛋白質中に配列相同性研究によって見出され
た（バーグ（Ｂｅｒｇ）１９８６）。因子ＴＦ ＩＩＩ
ａの実験的および理論的研究に基づいてミラー（Ｍｉｌ
ｌｅｒ）ら（１９８５）は蛋白質がＤＮＡ分子を結合す
る新規な機構を提示した。彼らのモデルにおいては各ユ
ニットは亜鉛イオンを中心とした“フィンガー状”構造
に折れ曲がっている。１本のフィンガーがＤＮＡの半回
転に結合する。変異体Ｉ４２２およびＩ４４０はフィン
ガーモデルの中心となるモチーフＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ
を乱すアミノ酸挿入配列を有する。これらの変異体は転
写活性化に関しては全く不活性であるが、それらグルコ
コルチコイド結合能は保持する。予備実験が示すよう
に、これらの変異体もホルモン処理後に核に転座するこ
とができず、インビトロにおいてＤＮＡを結合するこが
できない（エス・ホレンバーグ、未発表の所見）。これ
らの突然変異した受容体はｈＧＲ中に存在するフィンガ
ーモチーフの機能的重要性を証明する。この領域に位置
する第３の変異体Ｉ４２８は４個のアミノ酸の添加によ
りフィンガーが伸びている。Ｉ４２８の転写活性は大幅
に損われる（野生型水準の２％）が、なお検出可能であ
る。従って各ループは亜鉛結合モチーフよりも変化に耐
えると思われる。フィンガー様機能区がｈＧＲにおいて
機能的に重要であるという証明から、本発明者らはステ
ロイドホルモン結合体が原始的な祖先由来のＤＮＡ結合
蛋白質から進化した金属蛋白質であると提唱するに至っ
た。これらのデータを合わせると、受容体は調節機能区
の集合体からなり、これらは原始的なステロイドホルモ
ン受容体中へ進化の過程で侵入凝縮されたものと思わ
れ、これが哺乳動物ゲノム中に存在する一群の多数のホ
ルモン応答遺伝子を生じたことが示唆される。この分子
の転写活性はそれが遺伝学的スイッチとして作用する潜
在的能力をもつことを証明する。これは各種の進化上の
種族および恒常的機能の活性化におけるステロイドホル
モンの役割りと一致する。この突然変異の方式によれ
ば、希望する小規模または大規模の欠失変異体のいかな
る組をも好都合に形成することができ、機能を研究する
ために関連分子間の機能区を始動させることができる。
この実験例に記載した迅速かつ定量的な機能アッセイと
合わせて、τ、ＤＮＡ−およびステロイド−結合区の機
能性に関して特定の問題を提起することが可能となっ
た。ＩＩ．実験の部ＩＩに述べた図に関する詳細な説明 第ＩＩ−１図 ｈＧＲ機能アッセイ法の模式図 このアッセイ法においては、ｈＧＲアルファｃＤＮＡを
含む発現ベクターまたはそれから誘導される変異体を、
ＣＡＴ遺伝子を保有するプラスミドと共にＭＴＶ ＬＴ
Ｒの制御下にＣＶ−１またはＣＯＳ細胞中へ共トランス
フェクションする。次いで細胞をホルモンの存在下また
は不在下で培養する。ＣＶ−１細胞はＣＡＴ活性の誘導
を監視するために用いられ、ＣＯＳ細胞はステロイド結
合能およびｈＧＲ蛋白質の発現を測定するために用いら
れた。第ＩＩ−２図 ｈＧＲ蛋白質の発現 ＣＯＳ細胞を偽トランスフェクションし（中央レー
ン）、またはプラスミドｐＲＳｈＧＲアルファでトラン
スフェクションし（右レーン）、２日後にｈＧＲ蛋白質
の存在につき分析した。粗製の細胞質抽出物をＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより溶解し、ウェスタンブロットにより分析
した。ＩＭ９細胞からの細胞質抽出物を比較のため同一
ゲルに付与した（左レーン）。第ＩＩ−３図 ｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導 サブコンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞をｐＲＳＶｇ
ａｌ（対照）、ｐＲＳｈＧＲアルファ、またはｐＲＳｈ
ＧＲベータ、およびレポータープラスミドｐＭＴＶＣＡ
Ｔで共トランスフェクションし、１０ｎＭデキサメサゾ
ンの存在下（＋）または不在下（−）で２日間培養し
た。ＣＡＴアッセイは実験法（実験の部ＩＩ．Ｆ．）に
示したとおり行われた。Ｃ．クロラムフェニコール；Ａ
Ｃ、３−アセチルクロラムフェニコール。第ＩＩ−４図 ＤＥＸに対する用量応答性およびｐＲＳｈＧＲアルファ
の滴定 （Ａ）ｐＲＳｈＧＲアルファおよびｐＭＴＶＣＡＴ（各
プラスミド１０μｇ）で共トランスフェクションしたＣ
Ｖ−１細胞を漸増する濃度のデキサメサゾンの存在下に
培養した。ＤＥＸに対する見掛けのＥＤ５０値は３ｎＭ
であった。ＣＡＴ活性の水準を特定の実験において観察
された最大応答に対する％としてプロットした。ＤＥＸ
の不在下ではＣＡＴ活性は検出されなかった。 （Ｂ）滴定。漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファをサブ
コンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞中へ一定量のｐＭ
ＴＶＣＡＴ（５μｇ）と共に共トランスフェクションし
た。プラスミドｐＢＲ３２２をキャリヤーＤＮＡとして
用いて全体としてＤＮＡ３０μｇ／プレートを得た。１
０ｎＭ・ＤＥＸの存在下に細胞を２日間培養し、ＣＡＴ
活性を測定し、（Ａ）の場合と同様にプロットした。第ＩＩ−５図 ｈＧＲにおける機能区の位置 ｈＧＲを転写活性化に関与する推定機能区τ１およびτ
２（斜線を施した領域により示す）と共に模式的に示
す。ＤＮＡ結合区は点彩を施した四角で、ステロイド結
合区は点を施した四角により表わされる。ＢａｍＨＩリ
ンカー挿入配列は三角形および丸印で表わす。数字はそ
の後で挿入が起こるアミノ酸の位置を意味する（実験の
部Ｉ参照）。白地の記号はＣＡＴ活性により測定して野
生型水準のホルモン依存性転写活性を誘導しうる変異体
を表わす。黒地の記号は大幅に低下した、または無効に
なった機能を示す。棒は機能を示さないｈＧＲベータ中
に存在する異なるアミノ酸の位置を示す。ＩＩ．Ｆ．実験法 （ａ）培養条件 ＣＶ−１およびＣＯＳ−１細胞は３７０℃で、５％（ｖ
／ｖ）ウシ胎仔血清、アンピシリン４００μｇ／ｍｌ、
およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを補充した
ダルベッコの改良イーグル培地において増殖させた。良
好なトランスフェクション効率を得るために細胞を３日
毎に継代し、コンフルエンシーに到達させなかった。ト
ランスフェクションされた培養物は５％ＣＯ２下で３７
℃に保持された。（ｂ）組換えプラスミド プラスミドｐＲＳｈＧＲアルファおよびｐＲＳｈＧＲベ
ータ、すなわちＣＶ−１およびＣＯＳ細胞において２形
態のｈＧＲの合成を方向づけるものは、３個のＤＮＡ断
片から構成された。第１断片はｐＲＳＶＣＡＴゴルマン
（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９８２ｂ）から誘導され、ＲＳ
Ｖ ＬＴＲ，ｐＢＲ３２２配列、およびＳＶ４０ポリア
デニル化部位を含む。この断片を得るためにはｐＲＳＶ
ＣＡＴをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、各末端をＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片で処理することにより修復し
た。ＫｐｎＩリンカーを標準法によりこれらの末端に付
加し（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８
２）、このプラスミドを次いでＨｐａＩで切断し、これ
によってＣＡＴコード化配列を除去した。第２の断片は
ｈＧＲアルファまたはｈＧＲベータのいずれのコード化
配列をも含む。プラスミドｐＯＢ１１３およびｐＯＢ１
１７（エス．エム．ホレンバーグ、未発表の結果）、す
なわちそれぞれアルファ形およびベータ形のｈＧＲのコ
ード化配列全体を含むものをＢａｍＨＩで切断した。各
末端をクレノー断片で修復し、これらのプラスミドをＫ
ｐｎＩで切断した。第１および第２断片のリゲーション
によりプラスミドｐＲｈＧＲアルファおよびｐＲｈＧＲ
ベータを形成した。付加すべき第３の断片はプラスミド
ｐＳＶ２ＣＡＴから得たＳＶ ４０ＯＲＩを含むＰｖｕ
ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩからなる（ゴルマン（Ｇｏｒｍａ
ｎ）ら、１９８２ａ）。この断片の各末端をクレノー断
片で処理することにより修復し、これらにＮｄｅＩリン
カーを付加した。ＳＶ４０ ＯＲＩを含むこのＤＮＡ断
片を次いでｐＲｈＧＲアルファおよびｐＲｈＧＲベータ
中に存在する１個のＮｄｅＩ部位に導入した。最後にこ
れらのプラスミド中に存在する１個のＢａｍＨＩ部位を
破壊し、合成アダプターの挿入によりＸｈｏＩと置換し
た。得られたプラスミドはｐＲＳｈＧＲアルファおよび
ｐＲＳｈＧＲベータであった。プラスミドｐＭＴＶＣＡ
ＴおよびｐＭＴＩａＣＡＴはエス．ゴールド氏からの供
与であった。（ｃ）挿入突然変異形成 ｈＧＲアルファの野性型配列を乱すアミノ酸の挿入は下
記の方法により行われた。全長線状ｐＲＳｈＧＲアルフ
ァＤＮＡはＡｌｕＩ，ＤｐｎＩ，およびＢｓｔＮＩ制限
酵素による部分消化によって形成された。ＢｓｔＮＩに
より切断したＤＮＡの場合、各末端をまずクレノー断片
で修復した。次いでＤＮＡ分子をアガロースゲル電気泳
動により分画し、線状のプラスミドを抽出した。８−ま
たは１２−ｍｅｒのＢａｍＨＩリンカーを付加してｈＧ
Ｒアミノ酸配列の本来の解読フレームを再生した。ｈＧ
Ｒのコード化領域に１個のＢａｍＨＩリンカーを保有す
るプラスミドの配列を決定し（マクサム（Ｍａｘａｍ）
およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）１９８０）、リン
カーの位置およびｈＧＲ変異体の全体性を確認した。（ｄ）細胞トランスフェクションおよびＣＡＴアッセイ 組換えＤＮＡ構造体をリン酸カルシウム共沈法によりＣ
Ｖ−１細胞中へ（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、１９
７９）、またはＤＥＡＥ−デキストランによりＣＯＳ細
胞中へ（ディーンズ（Ｄｅａｎｓ）ら、１９８４）導入
した。トランスフェクションに用いた各プラスミド調製
物は２種の連続ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡濃度勾配により
精製された。ＣＡＴ遺伝子構造物でトランスフェクショ
ンしたのち、ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら（１９８２
ａ）の記載に従ってＣＶ−１細胞をＣＡＴアッセイ用に
調製した。これらのアッセイは全細胞抽出物の３分の１
を用いて、インキュベーション時間６時間で行われた。（ｅ）ウェスタンブロッド分布 ＣＯＳ細胞からの粗抽出物は１０−ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，０．５％トライトンＸ−１００を含有する緩衝液
を用いる細胞溶解により調製された。等量の蛋白質（１
００μｇ）を７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により溶解し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗
ｈＧＲ抗体ＧＲ８８４（ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）ら、
１９８４）により検査したのち１２５Ｉ標識−黄色ぶど
う球菌蛋白質Ａにより検出した。フィルターを風乾し、
フィルムに露光した。受容体の量をオートラジオグラフ
のスキャニングにより定量した。（ｆ）ステロイド結合のアッセイ ＣＯＳ細胞を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，５μｇ／
ｍｌアンチペイン、５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび
０．５ｍＭ・ＰＭＳＦを含有する低張緩衝液中でダウン
スホモジナイゼーションにより細胞溶解し、１５，００
０×ｇで１０分間遠心分離してサイトゾル画分を得た。
１００ｍＭ・ＮａＣｌに調整され、サイトゾル画分から
の蛋白質１０μｇおよび２×１０−８〔３Ｈ〕ＤＥＸ
（アメルシャム，９５Ｃｉ／ｍｍａｌ）を全容量２００
μｌに含有する低張緩衝液中でインキュベーションを行
った。非特異的結合は２×１０−６非標識ＤＥＸの添加
により測定された。反応は０℃で２時間行われ、次いで
５０％デキストラン被覆活性炭（１０：１活性炭：デキ
ストラン）２０μｌと共にインキュベーションし、１
５，０００×９で４℃において２分間、遠心分離した。
上層液をベックマンＬＳ−７８００液体シンチレーショ
ン分光光度計による液体シンチレーション法によって計
数した。各アッセイは通常２５００〜３０００ｃｐｍ〔
３Ｈ〕標識ステロイドを与えた。非標識ＤＥＸはこの結
合の７０％に対し競合した。
ェクションにより産生されたヒトグルココルチコイド受
容体（ｈＧＲ）はＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写活性
化のために必要かつ十分な因子として機能する。誘導の
規模（５００〜１０００倍）から、ｈＧＲは転写“スイ
ッチ”として作用し、グルココルチコイド応答要素を含
む休止状態のプロモーターを活性化状態に変換するので
あろうということが明らかになった。ｈＧＲによるＭＴ
Ｖ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写の刺激はＣＶ−１細胞にお
いて制限的な転写因子に依存しない。ｈＧＲの挿入変異
体２７種の特性を調べることにより少なくとも４種の機
能区の位置が決定された。それらのうち２種は推定ＤＮ
Ａ−およびステロイド−結合区に対応する。他の２区は
転写に対するそれらの有効な作用のため、タウ（τ）と
呼ばれる。これは、この受容体における他の領域は完全
な転写活性化のために必要でるが、ステロイドまたはＤ
ＮＡの結合に特異的には関与していないという可能性を
示す。ＩＩ．Ｂ．序論 ２群のステロイドホルモン受容体の一次構造がそれらの
ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により解明され
た。実験の部Ｉに示すように、ヒトグルココルチコイド
受容体（ｈＧＲ）をコード化するｃＤＮＡの同定により
２形態の蛋白質、すなわちアミノ酸７７７個のもの（ア
ルファ）および７４２個のもの（ベータ）が明らかにな
った。これらはそれらのカルボキシル末端において異な
る。（実験の部Ｉの記載はホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎ
ｂｅｒｇ）ら、１９８５として発表された。）ヒトエス
トロゲン受容体はこれよりも若干小さな、アミノ酸５９
５個の蛋白質である（グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、１
９８６；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９８６）。アミ
ノ酸配列の比較により、これら２群の受容体間のみでな
く、鳥類赤芽球症ウィルスのｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子
生成物とも広範な相同性が明らかになった（ワインバー
ガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５；グリーン
（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、１９８６；グリーン（Ｇｒｅｅ
ｎ）ら、１９８６）。これはステロイド受容体遺伝予お
よびｃ−ｅｒｂ−Ａプロト発癌遺伝子が共通の原始的な
先祖由来の調節遺伝予に由来するという示唆を支持する
（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８
５）。クローニングされたｃＤＮＡから推定されたｈＧ
Ｒのアミノ酸配列（実験の部Ｉ参照）に基づいて、この
蛋白質の機能的および免疫学的に重要な領域の配置を提
示した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、
１９８５）。これらには、蛋白質のアミノ末端側半分に
位置する免疫区、他のＤＮＡ結合性蛋白質との構造的類
似性を示すＤＮＡ結合区、および分子のカルボキジル末
端付近に位置するグルココルチコイド結合区が含まれ
る。しかし各区の位置は仮定であり、転写自体の活性化
に関与する区は確認されていなかった。この研究におい
て本発明者らはｈＧＲ蛋白質に代替アミノ酸を導入する
ことによりｈＧＲ内に提唱されている機能区の部位を確
認し、かつ他の重要な領域を見出すことを試みた。本発
明者らはまずサル腎細胞における新規な発現系を開発し
た。この系では機能性ｈＧＲの合成がラウス肉腫ウィル
ス（ＲＳＶ）の長鎖末端リピートの制御下でのｃＤＮＡ
の転写によって方向づけられる。合成受容体の機能はク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）アッセイ（ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９８２
ａ）およびステロイドホルモン結合により測定した、マ
ウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＴＶ）ＬＴＲの転写誘導によ
って監視された。この新規な発現系によって本発明者ら
は挿入変異生成が受容体の種々の機能に与える影響を調
べることができ、これによってｈＧＲの機能区構造のよ
り詳細なモデルを提唱した。２７種の挿入変異体の分析
に基づく本発明者らの結果から、グルココルチコイド受
容体は別個の機能区からなることが確認された（ワイン
バーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。さ
らにこれらにより、提唱したＤＮＡ−およびステロイド
−結合区外の他の配列が確認され、これを前記のように
本発明者らは転写に対するそれらの有効な作用のためτ
と呼ぶ。ＩＩ．Ｃ．結果 （ａ）アッセイ系および実験様式 クローニングされたｃＤＮＡからの機能性ｈＧＲ（実験
の部Ｉ）の発現を調べるために用いたアッセイ系および
方法を第ＩＩ−１図に示す。これらの実験においては、
レポーター遺伝子に結合したグルココルチコイド応答性
プロモーター／エンハンサー要素を受容体陰性細胞に導
入した。従って原理的にこの構造物は転写不活性のはず
である。本発明者らのアッセイ法にはクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードす
る配列に融合させたＭＴＶ ＬＴＲを選択使用した（Ｅ
Ｃ２．３．１．２８）。グルココルチコイドホルモンが
ＭＴＶＬＴＲ内の独自の部位における転写開始の効率を
高めることにより（ウッカー（Ｕｃｋｅｒ）ら、１９８
３）ＭＴＶ ＤＮＡの転写速度を高めることは先に証明
されている。（ロンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｇ）ら、１
９８３）。さらにグルココルチコイド受容体はＭＴＶ
ＬＴＲ内にマッピングされたＤＮＡ配列に特異的に結合
し（ペイバー（Ｐａｙｖａｒ）ら、１９８３）、これが
グルココルチコイド応答性を異種プロモーターに与えう
る（チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）ら、１９８
３）。ｐＭＴＶＣＡＴ（またはｐＧＭＣＡＴ）を受容体
発現プラスミドと共トランスフェクジョンすることによ
り、トランスフェクジョンされた細胞をグルココルチコ
イドホルモンで処理した際に活性を誘導しうる機能性受
容体が得られる。さらに生化学的実験、たとえば発現し
た受容体のステロイド結合活性およびウェスタンブロッ
ト分析を同時に行うことができる。ＲＳＶ ＬＴＲを全
長ｈＧＲ ｃＤＮＡ（ｐＲＳｈＧＲアルファ）に結合さ
せる発現ベクターをデザインして、広範な宿主細胞型に
おいて高水準の発現を得た。ベクターｐＲ．ＳｈＧＲア
ルファはｐＲＳＶＣＡＴ（ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）
ら、１９８２ｂ）の誘導体であり、ＣＡＴ遺伝子のコー
ド化配列がｈＧＲ ｃＤＮＡにより置換されている。Ｓ
Ｖ４０の複製開始点をこのベクターに導入し、これによ
り組換えプラスミドはＴ抗原（Ｔａｇ）を発現するＣＯ
Ｓ−１（ＣＯＳと呼ぶ）サル腎細胞において高いコピー
数にまで増殖可能となった（グルッツマン（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ）１９８１）。ＣＯＳ細胞および親細胞系ＣＶ−１
はグルココルチコイド受容体の水準が検出不可能である
という付加的な利点をも与える（未発表の所見ならびに
第ＩＩ−２およびＩＩ−３図）。（ｂ）機能性ｈＧＲの発現 上記のアッセイ法はステロイドホルモン受容体の作用機
構を研究する際に遭遇する主な難点の幾つかを克服する
ために企画された。これらの難点には受容体の細胞内水
準が低いこと、受容体の異質性の可能性があったこと、
および受容体の機能を試験する定量可能なバイオアッセ
イ系がなかったことが含まれる。従って本発明者らはｐ
ＲＳｈＧＲアルファでトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞が産生しうるｈＧＲの相対量をまず調べた。第ＩＩ
−２図（右のレーン）のトランスフェクションされたＣ
ＯＳ細胞のウェスタンブロット分析は、ＣＯＳ細胞がＩ
Ｍ９細胞系（左レーン）に存在するｈＧＲと移動性に関
して区別できない９４ｋｄのｈＧＲポリペプチドを合成
したことを証明する。さらに一時的にトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ細胞中に存在するｈＧＲの量はＩＭ９
細胞、すなわち細胞当たり１００，０００−２００，０
００の受容体を含むもの（ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）
ら、１９８４）に見出される水準よりも多い。この発現
系は高い細胞内ｈＧＲ水準を有する細胞を提供するだけ
でなく、ｈＧＲの機能研究を妨げる可能性のある受容体
ミクロ異質性の可能性をも除く。発現したｈＧＲの有効
な転写因子としての機能性を試験するために、ｐＭＴＶ
ＣＡＴおよびｐＲＳｈＧＲアルファを共トランスフェク
ションしたのちに得た細胞抽出物を用いてＣＡＴアッセ
イを行った。ＣＯＳおよび親細胞であるＣＶ−１細胞の
双方へのトランスフェクションを調べた。予想どおり
（アービン（Ａｌｗｉｎｅ）１９８５）ＣＯＳ中にＳＶ
４０ Ｔａｇが存在するとＭＴＶ ＬＴＲの基礎活性が
高まった（データは示されていない）。従って最大の誘
導を得るために、ＳＶ４０Ｔａｇを発現しないＣＶ−１
細胞を用いた。第ＩＩ−３図に示すように、ｐＭＴＶＣ
ＡＴを対照プラスミドと共トランスフェクションした場
合、ＣＶ−１細胞中にＣＡＴ活性は生じなかった。同様
にｐＭＴＶＣＡＴおよびｐＲＳｈＧＲアルファを共トラ
ンスフェクションした場合もＣＡＴ活性は生じなかっ
た。しかし同じく共トランスフェクションされたＣＶ−
１細胞をデキサメサゾン（ＤＥＸ）で処理すると、ＭＴ
Ｖ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写が開始される。ｐＭＴＶＣ
ＡＴにより生じるＣＡＴ活性の基礎水準はＣＶ−１細胞
においてかろうして検出しうる程度（しばしばゼロ）で
あるので、この誘導係数はきわめて大きい（約５００〜
１０００倍）。対照実験として本発明者らはベータ形の
ｈＧＲを共トランスフェクションした（実験の部Ｉ）。
これはステロイドを結合し得ないことが示されているも
のである（第ＩＩ−１表参照）。第ＩＩ−３図はｈＧＲ
ベータが本発明の発現アッセイ法において機能しないこ
とを証明する。また、ｈＧＲによる転写の活性化はグル
ココルチコイド応答性要素を含むプロモーターに限定さ
れる。ｐＭＴＶＣＡＴの代わりにｐＭＴＩａＣＡＴ、す
なわち重金属には応答するがグルココルチコイドには応
答しないヒトメタロチオネインＩａ遺伝子の調節領域を
含むプラスミドを用いた場合、トランスフェクションし
たＣＶ−１のホルモン処理後にＣＡＴ活性の誘導は認め
られなかった（データは示されていない）。これらの結
果は、細胞内でｈＧＲがステロイド依存性転写スイッチ
として機能するのに必要かつ十分な因子として作用する
ことを証明する。このアッセイに基づいて、ステロイド
による受容体の活性化を試験することができた。第ＩＩ
−４（Ａ）図に示したように、ＤＥＸはｈＧＲにより誘
導されたＣＡＴ活性に対し３ｎＭのＥＤ５０値を示す。
これは種々の生理学的作用においてＤＥＸにつき観察さ
れたＥＤ５０値（５ｎＭ）と一致する。共トランスフェ
クションされたＣＶ−１細胞を１００ｎＭのテストステ
ロン、エストラジオールおよびプロゲステロンで処理す
ることによりｈＧＲつ作用の特異性をさらに調べた。こ
れらのステロイドはプロゲステロン以外はＣＡＴ活性を
誘導し得なかった。プロゲステロンはＤＥＸにより生じ
た最大誘導の１％の値でｈＧＲの機能を刺激した（デー
タは示されていない）。これらの結果は、トランスフェ
クションされたＣＶ−１細胞が、天然受容体の特異性お
よび濃度において薬理学的リガンドと相互作用する機能
性ｈＧＲを合成することを示す。エンハンサー含有分子
と細胞成分との特異的相互作用に関する研究から、ＣＶ
−１細胞は特定のウィルス性エンハンサーの機能に必要
な細胞性因子を限定された量含有することが示された
（ショラー（Ｓｃｌｌｏｌｅｒ）およびグルス（Ｇｒｕ
ｓｓ）１９８４）。これらの細胞においてはトランスフ
ェクションされたｐＳＶ２ＣＡＴ（ゴルマン（Ｇｏｒｍ
ａｎ）ら、１９８２ａ）により生じるＣＡＴ活性はプラ
スミド０．３ｐｍｏｌ／ディッシュでプラトーに達す
る。同様に、ｈＧＲが限定因子と相互作用するならば漸
増する量のｐＲＳｈＧＲアルファのトランスフェクショ
ンにより誘導されるＣＡＴ活性を一定量のｐＭＴＶＣＡ
Ｔで飽和させることができるはずである。この実験では
２ｐｍｏｌ（５μｇ）のｐＭＴＶＣＡＴ ＤＮＡを使用
し、漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファＤＮＡを非特異
的キャリヤーＤＮＡと共に添加して、合計３０μｇ／デ
ィッシュを得た。第ＩＩ−４（Ｂ）図は０．０３ｐｍｌ
（１００ｎｇ）程度の少量のｐＲＳｈＧＲアルファ（デ
ィッシュ当たり）をトランスフェクションした際にＣＡ
Ｔ活性を検出しうること、およびＣＡＴ活性においてプ
ラトーに達することはないことを証明する。これらデー
タは、ｈＧＲによるＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子のトラン
スフェクションの刺激はＣＶ−１細胞中で限定する転写
因子に依存しないことを示唆する。（ｃ）ｈＧＲの機能区のマッピング ｈＧＲが遺伝子転写を調節する機構を理解するために
は、まずその機能区の解明が必要であった。グルココル
チコイド受容体の蛋白質分解に関する限定された研究
（カールスデット−デューク（Ｃａｒｌｓｄｅｄｔ−Ｄ
ｕｋｅ）１９８２；デルウェーク（Ｄｅｌｌｗｅｇ）
ら、１９８２；ランゲ（Ｗｒａｎｇｅ）ら、１９８４；
ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎ）ら、１９８４）、およ
びｈＧＲの一次構造の分析（実験の部Ｉ参照）に基づい
て、受容体の構造に対するモデルが提示されている（ワ
インバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８
５）。このモデルにより主要な３区域が確認される。す
なわちアミノ酸１４５から２８０に及ぶ免疫区、アミノ
酸４２１から４８１に及ぶＤＮＡ結合区、および蛋白質
のカルボキシル末端付近に位置するステロイド結合区で
ある。このモデルを試験するために本発明者らはグルコ
コルチコイド受容体コード化配列における２７種の部位
特異性挿入変異体をリンカースキャニング法により形成
した。次いでこれらの遺伝子工学的に形成された変異体
につき、遺伝子転写およびステロイドホルモン結合に対
するそれらの能力をアッセイした。ｈＧＲのリンカー挿
入変異体を形成するために、ＤＮＡ分子を高い頻度で開
裂させる制限酵素を用いて部分開裂することによりプラ
スミドｐＲＳｈＧＲアルファをまず線状化した。線状プ
ラスミドを分離し、ＢａｍＨＩリンカーを添加して、ｈ
ＧＲをコードするオープンリーディングフレームを再生
した。得られた変異体は３個または４個の付加的アミノ
酸を保有し、これらが野生型の蛋白質の配列を中断して
いる。この方法により本発明者らは一連のランダムなｈ
ＧＲ変異体を形成した（第ＩＩ−５図）。これらの変異
体が全長ｈＧＲを発現する能力をウェスタンブロット分
析により推定した。産生されたｈＧＲは３０％以上は異
ならないことが示され、従ってこれらの変異体はいずれ
も発現された蛋白質を不安定化しないと思われた。各変
異体の機能性を第ＩＩ−１表の野生型ｈＧＲのものと比
較した。２７種のｈＧＲ変異体のうち１２種により誘導
されるＣＡＴ活性は野生型の水準に匹敵した。ＣＡＴ活
性の誘導によりアッセイして機能が低下し、または完全
に失われている１５種のｈＧＲ変異体の分析により、こ
れらは別個の４群に属することが示された。いわゆる免
疫原区のアミノ酸１２０と２１５の間に位置する一群の
これら変異体が第１群を形成する。受容体分子のこの領
域には特異的機能は帰属されていないが、３種の変異体
（Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１４）は低いＣＡＴ活
性誘導能を示す。これらの変異体はステロイド結合能を
完全に維持した。意外ではないと思われるが、第２群の
欠損変異体は受容体の推定ＤＮＡ結合区に見出される。
この機能区はシスティンに富み、それぞれアミノ酸約２
５個の２反復単位からなり、これがＺｎ２＋リガンドに
より調整されたループ構造に折れ曲がっている（ミラー
（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９８５）。変異体Ｉ４２２の場
合は、配列モチーフＣｙｓ−Ｘ２−ＣｙｓがＣｙｓ−Ｘ
５−Ｃｙｓに変わっている。付加的アミノ酸の存在が受
容体の機能を完全に失わせている。変異体Ｉ４４０は第
１ループの形成に関与する他の２個のシスティン間に同
様にアミノ酸４個の挿入配列を有し、同様に検出可能な
水準のＣＡＴ活性を誘導できない。他方、変異体Ｉ４２
８ではループ自体の長さがアミノ酸１３個から１７個に
伸長している。著しく低下してはいるが、Ｉ４２８によ
るＣＡＴ活性の誘導はなお検出可能である。３種の変異
体すべてについてＤＮＡ結合区に存在するステロイド結
合容量は野生型の水準の範囲内にあることが示された。
突然変異により影響を受ける第３の領域はＤＮＡ結合区
に隣接した位置にある。変異体Ｉ４８８および１４９０
は低い水準のＣＡＴ活性を示すが、ステロイドを効果的
に結合する。第４群は受容体蛋白質の最後の２００個の
アミノ酸を包含する。５種の変異体は（Ｉ５８２，Ｉ５
８９，Ｉ５９９，Ｉ６２６およびＩ６９６）は検出可能
な水準のＣＡＴ活性を示さない。この機能活性の欠如は
それらがデキサメサゾンを全く結合し得ないことと関係
がある。これらの結果は、ステロイド結合領域が蛋白質
の大部分を包含することを示す。これらはすべてＣ末端
付近に集中している。分子のアミノ末端と異なりこの領
域は受容体の一次構造の変化に対してきわめて敏感であ
る。（ｄ）第ＩＩ−１表 ＣＶ−１またはＣＯＳ細胞をｐＲＳｈＧＲアルファ、ｐ
ＲＳｈＧＲベータ、または突然変異したｈＧＲアルファ
によりトランスフェクションし、ＣＡＴ活性およびステ
ロイド結合能につきアッセイした。トランスフェクショ
ン後にＣＶ−１細胞を１０ｎＭ−ＤＥＸの存在下で２日
間培養したのち、細胞溶解およびＣＡＴアッセイを行っ
た。ＣＯＳ細胞は普通の培地に維持された。これら２パ
ラメーターを野生型ｈＧＲ活性に対する％として定量し
た。ｈＧＲアルファに挿入されたアミノ酸を１文字コー
ドで表示する。ＮＴは試験しなかったことを意味する。
ｈＧＲアルファとｈＧＲベータのアミノ酸組成の相違を
第ＩＩ−５図および実験の部Ｉに示す。ＩＩ．Ｄ．考察 ｈＧＲ発現ベクターのトランスフェクションによりＣＶ
−１細胞中で産生されたｈＧＲがＭＴＲ−ＣＡＴ融合遺
伝子の転写活性化に必要かつ十分な因子であることを示
した。誘導の規模から、ｈＧＲは転写“スイッチ”とし
て作用し、これがグルココルチコイド応答要素を含む静
止状態のプロモーターを活性化状態に変換しうることが
明らかになった。構成性活性を示す他の転写因子と異な
り、ｈＧＲによる転写刺激は完全にグルココルチコイド
ホルモンの存在に依存性である（第ＩＩ−３およびＩＩ
−４（Ａ）図）。細胞内で蛋白質が大量に産生されるだ
けでは調節された遺伝予の転を誘導するのに十分ではな
い。ｈＧＲがホルモンによって活性化される機構は十分
には解明されていないがサイクリックＡＭＰ結合蛋白質
の場合と同様に、蛋白質内におけるアロステリック転移
を伴うものと思われる（マッケイ（Ｍｃｋａｙ）および
スタイツ（Ｓｔｅｉｔｚ）１９８１；ゲージス（Ｇａｇ
ｅｓ）およびアジヤ（Ａｄｈｙａ）１９８５）。本発明
者らは、ｈＧＲによる転写の活性化はＣＶ−１細胞中に
限定された量で存在する因子によって制限されないこと
を認めた（第ＩＩ−４（Ｂ）図）。これらの結果はグル
ココルチコイド応答性エンハンサーへのｈＧＲ−ステロ
イド−複合体の結合がプロモーター付近の一般的転写因
子の活性を高めるのに十分であることを示唆する。他の
数種の転写因子について同様な特性が報告されている。
たとえばＡｄｆ１、すなわちメラノガスター（Ｄ．ｍｅ
ｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）におけるアルコールデヒドロゲ
ナーゼ（Ａｄｈ）の近位プロモーターを活性化する転写
因子は他の蛋白質因子の不在下でＡｄｈ鋳型ＤＮＡを結
合し、Ａｄｈ ＲＮＡ合成の開始を活性化するために内
在性ＲＮＡポリメラーゼＩｉ、および他の一般的転写因
子を含む画分を必要とするにすぎない（ヘーベライン
（Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎ）ら、１９８５）。ＳＶ４０エン
ハンサー／プロモーター要素を含む組換えプラスミドｐ
ＳＶ２ＣＡＴを用いる他の型の実験において、ショーラ
ー（Ｓｃｈｏｌｅｒ）およびグルス（Ｇｒｕｓｓ）（１
９８４）は、エンハンサー含有ＤＮＡの機能に細胞性分
子が必要であることを示した。彼らの実験によれば、Ｓ
Ｖ４０エンハンサー要素によるＣＡＴ遺伝子の活性化に
必要な限られた量の細胞性因子の存在が示された。しか
し一般的転写因子の枯渇は観察されなかった。これらの
データは特定の有効な転写因子の作用機作が一般的転写
因子の活性を高める因子自身、またはポリメラーゼ自身
によって誘導されるクロマチンの構造における変化をも
たらすらしいということを示唆しているモロー（Ｍｏｒ
ｅａｕ）ら、１９８１；ウェイジリク（Ｗａｓｙｌｙ
ｋ）ら、１９８３）。グルココルチコイド処理によって
ＭＴＶ ＬＴＲのセグメントを含むＤＮＡ領域に可逆的
および永続的双方の変化が生じることはすでに示されて
いる（ザレット（Ｚａｒｅｔ）およびヤマモト（Ｙａｍ
ａｍｏｔｏ）１９８４）。結合した受容体がプロモータ
ー活性を高める機構は完全に解明されている。しかしｈ
ＧＲを過剰に発現する系が得られれば、有効な転写因子
による分子基盤での転写活性化についての将来の研究が
容易になるであろう。２７種の挿入変異体の解明の結果
は、ヒトグルココルチコイド受容体が一連の機能区から
なるという本発明者らの先の示唆を支持し、拡大する。
ステロイド結合に影響を与える変異体がすべてカルボキ
シル末端に集中していることは注目に値する。この領域
がホルモンの特異性をコードする別個の機能区として機
能することが示唆されるほか、これらの結果はこの受容
体内に確認された他の機能区が別個の機能を果たすとい
可能性をも暗示する。従って、受容体が特定のＤＮＡ配
列を認識し、これと相互作用する能力は、エストロゲン
受容体および発癌遺伝子生成物ｖ−ｅｒｂ−Ａによって
高度に保持されているＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに富む領
域にあると思われる。これらの領域における突然変異は
受容体分子が転写を活性化する能力を低下させるという
のは論理的であると思われる。活性化はリガンドがアロ
ステリック形質転換を誘導する能力、および形質転換し
た分子がＤＮＡを認識し、これと相互作用する能力の双
方に依存するからである。ステロイド受容体構造の最初
のモデル（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）
ら、１９８５）に基づけば、これらは突然変異誘発の解
明に際し予想された結果であった。しかし予想されなか
った結果は、転写活性に影響を与える他の領域が少なく
とも２か所確認されたことである。これは、転写活性化
に必要であるがステロイドまたはＤＮＡの結合のいずれ
にも特異的に関与してはいない他の機能区が受容体中に
存在するという興味深い可能性を与える。変異体Ｉ１２
０，Ｉ２０４およびＩ２１４は野生型の親和性をもって
ステロイドと結合するが、転写活性が低下している。こ
れらの変異体は本発明者らがτ１と呼ぶこの機能区が完
全なｈＧＲ活性を得るために機能的に重要であり、かつ
必要であることを明瞭に証明している。興味深いこと
に、数系列のグルココルチコイド耐性細胞に見出された
非機能性の切除型変異体（すなわち４０ｋｄ）は野生型
受容体よりも効率的に核内に保持されるが、転写を活性
化し得ない（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、１９７
６；アンドレアセン（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ）およびゲー
リング（Ｇｅｈｒｉｎｇ）１９８１；ウェストファル
（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）ら、 われた受容体断片は明らかに蛋白質のアミノ末端であ
る。それらはホルモン結合能を保持しているからであ
る。本発明者らはτ１がｈＧＲの主免疫原区と一致する
ことを指摘した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、１９８５）。これは恐らくこれが分子の外表に
あることを示す。この機能区がその機能を果たす様式に
ついての考察には、受容体の二量化をもたらす自己相互
作用、ＲＮＡポリメラーゼＩＩなどの一般的転写因子と
の相互作用の可能性、および／または活性化された受容
体の残りの部分にアロステリック作用を及ぼすことによ
るＤＮＡ結合の調節が含まれる（デルウェーク（Ｄｅｌ
ｌｗｅｇ）ら、１９８２）、τ１は受容体のアミノ末
端、すなわちより小型のエストロゲン受容体とは共有さ
れない領域に含まれる。恐らくエストロゲン受容体が第
２の蛋白質との相互作用によりこの機能区と同等の機能
を得るか、またはτ１が他の調節分子との相互作用では
なくグルココルチコイド受容体自体の内部の他の残基と
相互作用するのであろう。転写活性化に影響を及ぼす他
のτ領域（τ２と呼ぶ）はエストロゲン受容体およびｖ
−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子中に存在する領域である。その
位置からも、これがステロイド−およびＤＮＡ−結合区
を結合させる“ちょうつがい”領域として作用するとい
う可能性が示唆される。従ってこれらの変異体は受容体
の活性化に必要なアロステリック形質転換を遮断するで
あろう。アミノ酸挿入配列により影響を受ける第３の領
域は、ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（１
９８５）により報告される推定ＤＮＡ結合区内に位置す
る。この機能区はＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに富む配列を
含む２個の反復単位からなり、ｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝
子およびエストロゲン受容体と比較して最も強く保守さ
れるものである（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、１９８５；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９８
６；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９８６）。これらの
反復単位はまず因子ＴＦ−ＩＩＩａ（ミラー（Ｍｉｌｌ
ｅｒ）ら、１９８５）に観察され、それ以来多数の他の
核酸結合性蛋白質中に配列相同性研究によって見出され
た（バーグ（Ｂｅｒｇ）１９８６）。因子ＴＦ ＩＩＩ
ａの実験的および理論的研究に基づいてミラー（Ｍｉｌ
ｌｅｒ）ら（１９８５）は蛋白質がＤＮＡ分子を結合す
る新規な機構を提示した。彼らのモデルにおいては各ユ
ニットは亜鉛イオンを中心とした“フィンガー状”構造
に折れ曲がっている。１本のフィンガーがＤＮＡの半回
転に結合する。変異体Ｉ４２２およびＩ４４０はフィン
ガーモデルの中心となるモチーフＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ
を乱すアミノ酸挿入配列を有する。これらの変異体は転
写活性化に関しては全く不活性であるが、それらグルコ
コルチコイド結合能は保持する。予備実験が示すよう
に、これらの変異体もホルモン処理後に核に転座するこ
とができず、インビトロにおいてＤＮＡを結合するこが
できない（エス・ホレンバーグ、未発表の所見）。これ
らの突然変異した受容体はｈＧＲ中に存在するフィンガ
ーモチーフの機能的重要性を証明する。この領域に位置
する第３の変異体Ｉ４２８は４個のアミノ酸の添加によ
りフィンガーが伸びている。Ｉ４２８の転写活性は大幅
に損われる（野生型水準の２％）が、なお検出可能であ
る。従って各ループは亜鉛結合モチーフよりも変化に耐
えると思われる。フィンガー様機能区がｈＧＲにおいて
機能的に重要であるという証明から、本発明者らはステ
ロイドホルモン結合体が原始的な祖先由来のＤＮＡ結合
蛋白質から進化した金属蛋白質であると提唱するに至っ
た。これらのデータを合わせると、受容体は調節機能区
の集合体からなり、これらは原始的なステロイドホルモ
ン受容体中へ進化の過程で侵入凝縮されたものと思わ
れ、これが哺乳動物ゲノム中に存在する一群の多数のホ
ルモン応答遺伝子を生じたことが示唆される。この分子
の転写活性はそれが遺伝学的スイッチとして作用する潜
在的能力をもつことを証明する。これは各種の進化上の
種族および恒常的機能の活性化におけるステロイドホル
モンの役割りと一致する。この突然変異の方式によれ
ば、希望する小規模または大規模の欠失変異体のいかな
る組をも好都合に形成することができ、機能を研究する
ために関連分子間の機能区を始動させることができる。
この実験例に記載した迅速かつ定量的な機能アッセイと
合わせて、τ、ＤＮＡ−およびステロイド−結合区の機
能性に関して特定の問題を提起することが可能となっ
た。ＩＩ．実験の部ＩＩに述べた図に関する詳細な説明 第ＩＩ−１図 ｈＧＲ機能アッセイ法の模式図 このアッセイ法においては、ｈＧＲアルファｃＤＮＡを
含む発現ベクターまたはそれから誘導される変異体を、
ＣＡＴ遺伝子を保有するプラスミドと共にＭＴＶ ＬＴ
Ｒの制御下にＣＶ−１またはＣＯＳ細胞中へ共トランス
フェクションする。次いで細胞をホルモンの存在下また
は不在下で培養する。ＣＶ−１細胞はＣＡＴ活性の誘導
を監視するために用いられ、ＣＯＳ細胞はステロイド結
合能およびｈＧＲ蛋白質の発現を測定するために用いら
れた。第ＩＩ−２図 ｈＧＲ蛋白質の発現 ＣＯＳ細胞を偽トランスフェクションし（中央レー
ン）、またはプラスミドｐＲＳｈＧＲアルファでトラン
スフェクションし（右レーン）、２日後にｈＧＲ蛋白質
の存在につき分析した。粗製の細胞質抽出物をＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより溶解し、ウェスタンブロットにより分析
した。ＩＭ９細胞からの細胞質抽出物を比較のため同一
ゲルに付与した（左レーン）。第ＩＩ−３図 ｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導 サブコンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞をｐＲＳＶｇ
ａｌ（対照）、ｐＲＳｈＧＲアルファ、またはｐＲＳｈ
ＧＲベータ、およびレポータープラスミドｐＭＴＶＣＡ
Ｔで共トランスフェクションし、１０ｎＭデキサメサゾ
ンの存在下（＋）または不在下（−）で２日間培養し
た。ＣＡＴアッセイは実験法（実験の部ＩＩ．Ｆ．）に
示したとおり行われた。Ｃ．クロラムフェニコール；Ａ
Ｃ、３−アセチルクロラムフェニコール。第ＩＩ−４図 ＤＥＸに対する用量応答性およびｐＲＳｈＧＲアルファ
の滴定 （Ａ）ｐＲＳｈＧＲアルファおよびｐＭＴＶＣＡＴ（各
プラスミド１０μｇ）で共トランスフェクションしたＣ
Ｖ−１細胞を漸増する濃度のデキサメサゾンの存在下に
培養した。ＤＥＸに対する見掛けのＥＤ５０値は３ｎＭ
であった。ＣＡＴ活性の水準を特定の実験において観察
された最大応答に対する％としてプロットした。ＤＥＸ
の不在下ではＣＡＴ活性は検出されなかった。 （Ｂ）滴定。漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファをサブ
コンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞中へ一定量のｐＭ
ＴＶＣＡＴ（５μｇ）と共に共トランスフェクションし
た。プラスミドｐＢＲ３２２をキャリヤーＤＮＡとして
用いて全体としてＤＮＡ３０μｇ／プレートを得た。１
０ｎＭ・ＤＥＸの存在下に細胞を２日間培養し、ＣＡＴ
活性を測定し、（Ａ）の場合と同様にプロットした。第ＩＩ−５図 ｈＧＲにおける機能区の位置 ｈＧＲを転写活性化に関与する推定機能区τ１およびτ
２（斜線を施した領域により示す）と共に模式的に示
す。ＤＮＡ結合区は点彩を施した四角で、ステロイド結
合区は点を施した四角により表わされる。ＢａｍＨＩリ
ンカー挿入配列は三角形および丸印で表わす。数字はそ
の後で挿入が起こるアミノ酸の位置を意味する（実験の
部Ｉ参照）。白地の記号はＣＡＴ活性により測定して野
生型水準のホルモン依存性転写活性を誘導しうる変異体
を表わす。黒地の記号は大幅に低下した、または無効に
なった機能を示す。棒は機能を示さないｈＧＲベータ中
に存在する異なるアミノ酸の位置を示す。ＩＩ．Ｆ．実験法 （ａ）培養条件 ＣＶ−１およびＣＯＳ−１細胞は３７０℃で、５％（ｖ
／ｖ）ウシ胎仔血清、アンピシリン４００μｇ／ｍｌ、
およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを補充した
ダルベッコの改良イーグル培地において増殖させた。良
好なトランスフェクション効率を得るために細胞を３日
毎に継代し、コンフルエンシーに到達させなかった。ト
ランスフェクションされた培養物は５％ＣＯ２下で３７
℃に保持された。（ｂ）組換えプラスミド プラスミドｐＲＳｈＧＲアルファおよびｐＲＳｈＧＲベ
ータ、すなわちＣＶ−１およびＣＯＳ細胞において２形
態のｈＧＲの合成を方向づけるものは、３個のＤＮＡ断
片から構成された。第１断片はｐＲＳＶＣＡＴゴルマン
（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９８２ｂ）から誘導され、ＲＳ
Ｖ ＬＴＲ，ｐＢＲ３２２配列、およびＳＶ４０ポリア
デニル化部位を含む。この断片を得るためにはｐＲＳＶ
ＣＡＴをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、各末端をＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片で処理することにより修復し
た。ＫｐｎＩリンカーを標準法によりこれらの末端に付
加し（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８
２）、このプラスミドを次いでＨｐａＩで切断し、これ
によってＣＡＴコード化配列を除去した。第２の断片は
ｈＧＲアルファまたはｈＧＲベータのいずれのコード化
配列をも含む。プラスミドｐＯＢ１１３およびｐＯＢ１
１７（エス．エム．ホレンバーグ、未発表の結果）、す
なわちそれぞれアルファ形およびベータ形のｈＧＲのコ
ード化配列全体を含むものをＢａｍＨＩで切断した。各
末端をクレノー断片で修復し、これらのプラスミドをＫ
ｐｎＩで切断した。第１および第２断片のリゲーション
によりプラスミドｐＲｈＧＲアルファおよびｐＲｈＧＲ
ベータを形成した。付加すべき第３の断片はプラスミド
ｐＳＶ２ＣＡＴから得たＳＶ ４０ＯＲＩを含むＰｖｕ
ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩからなる（ゴルマン（Ｇｏｒｍａ
ｎ）ら、１９８２ａ）。この断片の各末端をクレノー断
片で処理することにより修復し、これらにＮｄｅＩリン
カーを付加した。ＳＶ４０ ＯＲＩを含むこのＤＮＡ断
片を次いでｐＲｈＧＲアルファおよびｐＲｈＧＲベータ
中に存在する１個のＮｄｅＩ部位に導入した。最後にこ
れらのプラスミド中に存在する１個のＢａｍＨＩ部位を
破壊し、合成アダプターの挿入によりＸｈｏＩと置換し
た。得られたプラスミドはｐＲＳｈＧＲアルファおよび
ｐＲＳｈＧＲベータであった。プラスミドｐＭＴＶＣＡ
ＴおよびｐＭＴＩａＣＡＴはエス．ゴールド氏からの供
与であった。（ｃ）挿入突然変異形成 ｈＧＲアルファの野性型配列を乱すアミノ酸の挿入は下
記の方法により行われた。全長線状ｐＲＳｈＧＲアルフ
ァＤＮＡはＡｌｕＩ，ＤｐｎＩ，およびＢｓｔＮＩ制限
酵素による部分消化によって形成された。ＢｓｔＮＩに
より切断したＤＮＡの場合、各末端をまずクレノー断片
で修復した。次いでＤＮＡ分子をアガロースゲル電気泳
動により分画し、線状のプラスミドを抽出した。８−ま
たは１２−ｍｅｒのＢａｍＨＩリンカーを付加してｈＧ
Ｒアミノ酸配列の本来の解読フレームを再生した。ｈＧ
Ｒのコード化領域に１個のＢａｍＨＩリンカーを保有す
るプラスミドの配列を決定し（マクサム（Ｍａｘａｍ）
およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）１９８０）、リン
カーの位置およびｈＧＲ変異体の全体性を確認した。（ｄ）細胞トランスフェクションおよびＣＡＴアッセイ 組換えＤＮＡ構造体をリン酸カルシウム共沈法によりＣ
Ｖ−１細胞中へ（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、１９
７９）、またはＤＥＡＥ−デキストランによりＣＯＳ細
胞中へ（ディーンズ（Ｄｅａｎｓ）ら、１９８４）導入
した。トランスフェクションに用いた各プラスミド調製
物は２種の連続ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡濃度勾配により
精製された。ＣＡＴ遺伝子構造物でトランスフェクショ
ンしたのち、ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら（１９８２
ａ）の記載に従ってＣＶ−１細胞をＣＡＴアッセイ用に
調製した。これらのアッセイは全細胞抽出物の３分の１
を用いて、インキュベーション時間６時間で行われた。（ｅ）ウェスタンブロッド分布 ＣＯＳ細胞からの粗抽出物は１０−ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，０．５％トライトンＸ−１００を含有する緩衝液
を用いる細胞溶解により調製された。等量の蛋白質（１
００μｇ）を７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により溶解し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗
ｈＧＲ抗体ＧＲ８８４（ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）ら、
１９８４）により検査したのち１２５Ｉ標識−黄色ぶど
う球菌蛋白質Ａにより検出した。フィルターを風乾し、
フィルムに露光した。受容体の量をオートラジオグラフ
のスキャニングにより定量した。（ｆ）ステロイド結合のアッセイ ＣＯＳ細胞を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，５μｇ／
ｍｌアンチペイン、５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび
０．５ｍＭ・ＰＭＳＦを含有する低張緩衝液中でダウン
スホモジナイゼーションにより細胞溶解し、１５，００
０×ｇで１０分間遠心分離してサイトゾル画分を得た。
１００ｍＭ・ＮａＣｌに調整され、サイトゾル画分から
の蛋白質１０μｇおよび２×１０−８〔３Ｈ〕ＤＥＸ
（アメルシャム，９５Ｃｉ／ｍｍａｌ）を全容量２００
μｌに含有する低張緩衝液中でインキュベーションを行
った。非特異的結合は２×１０−６非標識ＤＥＸの添加
により測定された。反応は０℃で２時間行われ、次いで
５０％デキストラン被覆活性炭（１０：１活性炭：デキ
ストラン）２０μｌと共にインキュベーションし、１
５，０００×９で４℃において２分間、遠心分離した。
上層液をベックマンＬＳ−７８００液体シンチレーショ
ン分光光度計による液体シンチレーション法によって計
数した。各アッセイは通常２５００〜３０００ｃｐｍ〔
３Ｈ〕標識ステロイドを与えた。非標識ＤＥＸはこの結
合の７０％に対し競合した。
【０００８】実験の部ＩＩＩ ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子は甲状腺ホルモン受容体をコード
するＩＩＩ．Ａ．概要および序論 ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の相補ＤＮＡ
はその塩基配列が決定されており（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒら、１９８５ｂおよび実験の部Ｉを参照）、機能的に
活性であることが分かっている（実験の部ＩＩを参
照）。興味あることには、その受容体の塩基配列解析に
より、それは鳥類の赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）のｖ−
ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物に関係のあることが見出され
た（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５を参照）。これ
はステロイド受容体とｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物が共通
の原子的原型（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ａｒｃｈｅｔｙ
ｐｅ）を共有し、そしてｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子産物も
またＤＮＡエンハンサー因子と結合するタンパク質であ
りうるという提案へ導いた。ヒトエストロゲン（Ｇｒｅ
ｅｎら、１９８６およびＧｒｅｅｎｅら、１９８６）、
ニワトリプロゲステロン（Ｊｅｌｔｓｃｈら、１９８６
およびＣｏｎｎｅｅｌｙら、１９８６）およびヒトアル
ドステロン（Ｊ．Ａｒｒｉｚａ，Ｃ．Ｗ．およびＲ．
Ｍ．Ｅ．，未発表データ）の最近の特性決定はこれらの
結論をさらに支持するものである。従って、我々はたと
えヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子が機能的に確実に固
定されなくとも、その遺伝子の配列を決定することから
始めた。これらの実験の進行中に、グルココルチコイド
受容体の機能的ドメイン（実験の部ＩＩを参照）の解説
において進歩が見られ、ｈＧＲのホルモン結合ドメイン
はカルボキシ末端の３００個のアミノ酸を包含する異常
に大きい領域であることが判明した。この全領域はｖ−
ｅｒｂ−Ａのカルボキシ末端とのわずかではあるが有意
な類似性を有し、それ故にステロイドホルモンの作用と
類似した転写調節作用を及ぼしうる分子の部類に我々の
関心が集中した。遺伝子発現の甲状腺ホルモン刺激の分
子機構はステロイドについて概略したものと類似してい
ると思われる（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら、１９８０を参
照）。甲状腺ホルモンは試験したすべての脊索動物種に
存在し、そして発生および分化（例えば両生類の変態）
に対して重要な作用を及ぼす（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら、
１９８０を参照）。ステロイドと同様に、甲状腺ホルモ
ンは受動拡散によって細胞に入り、高親和性核受容体と
結合し、その後遺伝子発現の迅速かつ選択的な活性化を
仲介する（Ｔａｔａら、１９６６およびＯｐｐｅｎｈｅ
ｉｍｅｒら、１９７２）。この仮説を支持する証拠は、
ラット下垂体前葉のソマトトロピン生成細胞および多数
の関連するラットソマトトロピン生成細胞株における成
長ホルモンおよびそのメッセンジャーＲＮＡの誘導の研
究からもたらされた（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７３およ
びＴａｔａら、１９７４）。甲状腺ホルモンはこれらの
細胞における成長ホルモン遺伝子の転写を速やかに増強
する（Ｍａｒｔｉａｌら、１９７７およびＥｖａｎｓ
ら、１９８２）。この転写増強は核甲状腺ホルモン−受
容体複合体のレベルが上昇することにより達成され、時
間および濃度に依存しているが、タンパク質合成とは無
関係である（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７６；Ｓｐｉｎｄ
ｌｅｒら、１９８２；およびＹａｆｆｅら、１９８４を
参照）。ステロイドホルモン作用と甲状腺ホルモン作用
との類似性は、ｅｒｂ−Ａタンパク質それ自体が甲状腺
ホルモン受容体でありうるという可能性を調べることへ
導いた。我々は初めにヒトｃ−ｅｒｂ−ＡのｃＤＮＡを
単離して、その配列を決定した。その塩基配列から、ス
テロイドホルモン受容体の推定上のＤＮＡ結合ドメイン
に類似したシステイン／リシン／アルギニンに富む領
域、およびそのステロイド結合ドメインとわずかに関連
したカルボキシ末端領域を含む４５６個のアミノ酸から
成るポリペプチドが推定された。クローン化したステロ
イド受容体のホルモン結合特性を調べるために開発され
た機能検定（実験の部Ｉを参照）を用いて、我々はヒト
ｃ−ｅｒｂ−ＡｃＤＮＡの翻訳産物が天然甲状腺ホルモ
ン受容体分子に特徴的な、固有の甲状腺ホルモン結合活
性を保持することを証明した。ＩＩＩ．Ｂ．ｃ−ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡの特性決定 ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡを単離するために、ｖ−
ｅｒｂ−Ａ遺伝子のみを含むＡＥＶゲノム領域から分離
した５００塩基対（ｂｐ）のＰｓｔＩＤＮＡフラグメン
ト（Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍら、１９８０）を３２Ｐ標識プ
ローブとして使用して、２つのヒト胎盤ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングした。それぞれ約１０６個のフ
ァージ組換え体の２つの独立したライブラリーを選択す
ることにより、２つの重複するラムダｇｔ１０ｃＤＮＡ
クローンが得られた。ｐＵＣ８サブクローンからのｃＤ
ＮＡクローンＥｃｏＲＩ挿入物ｐｈｅＡ４およびｐｈｅ
Ａ１２のそれぞれの制限地図を作成した（第ＩＩＩ−１
（Ａ）図）。これらの重複する１．５キロ塩基（ｋｂ）
ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列解析により、ヌク
レオチド番号３０１に推定上のイニシエーターメチオニ
ンコドンおよびヌクレオチド番号１６６９にターミネー
ターコドンを有する４５６個のアミノ酸の長いオープン
・リーディング・フレームを含むことが明らかになった
（第ＩＩＩ−１（Ｂ）−１図および第ＩＩＩ−１（Ｂ）
−２図）。ＡＴＧの７コドン上流には読み枠内のターミ
ネーターＴＡＡが存在してイニシエーターメチオニンに
対する支持を与えているが、２６コドン下流に存在する
別のメチオニンはこの割当てを不確かなものにする。共
通のポリアデニル化付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ，Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔら、１９７６を参照）はｐｈｅＡ１２の
ターミネーターとポリ（Ａ）領域の間の２７ヌクレオチ
ド中に存在しない。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡ翻訳
オープン・リーディング・フレーム内にコードされる相
対分子量５２０００（Ｍ１＝５２Ｋ）の推定上のポリペ
プチドは、ＡＥＶ中のウイルスｇａｇ配列（Ｄｅｂｕｉ
ｒｅら、１９８４）から下流の領域と８２％のアミノ酸
同一性を共有する。アミノ酸の比較において大きな相違
は見られなかった。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａアミノ酸配列は
ウイルスのアミノ酸残基３７から始まるウイルスタンパ
ク質と相同である（第ＩＩＩ−２図）。ｃ−ｅｒｂ−Ａ
のカルボキシ末端はｖ−ｅｒｂ−Ａのそれと次の点で相
違する：すなわち、２種のポリペプチドのアミノ酸配列
類似性がｃ−ｅｒｂ−Ａの残基４４５およびｖ−ｅｒｂ
−Ａの残基３８０で終止する（第ＩＩＩ−２図）。ヒト
ｃ−ｅｒｂ−Ａ核酸配列とｖ−ｅｒｂ−Ａのそれとを整
列させると、ヒト遺伝子の約７４％がアミノ酸の相同領
域（ｃ−ｅｒｂ−Ａのヌクレオチド５６３−１６３６，
データは示さず）においてウイルス遺伝子と同一である
ことが分かる。これらの比較は、染色体１７にマッピン
グされる他のヒトｅｒｂ−Ａ遺伝子に関する以前のデー
タ（Ｊａｎｓｓｏｎら、１９８３；Ｓｐｕｒｒら、１９
８４；およびＤａｙｔｏｎら、１９８４）と考え合わせ
ると、我々の分離したヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子が
別個のものであることを示す。２種の染色体１７ｅｒｂ
−Ａ遺伝子（我々は両方ともｈｃ−ｅｒｂ−Ａアルファ
と呼ぶよう提案する）のうちの１種はヌクレオチド配列
に関して８２％がｖ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子と類似してお
り、アミノ酸配列に関しては８９％が同一である（Ｄａ
ｙｔｏｎ，１９８４を参照）。従って、我々がｈｃ−ｅ
ｒｂ−Ａベータと呼ぶよう提案する胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａ
ｃＤＮＡは、ｈｃ−ｅｒｂ−Ａアルファ遺伝子よりも
ウイルスｅｒｂ−Ａ遺伝子との関連性がうすい。ウイル
スおよび細胞ｅｒｂ−Ａタンパク質産物とグルココルチ
コイド受容体とのアミノ酸配列の比較は、ｈＧＲのカル
ボキシ末端半分との段階的レベルの相同性を示す（第Ｉ
ＩＩ−２図）。最も高い類似性はｃ−ｅｒｂ−Ａアミノ
酸残基１０２から始まって６５個のアミノ酸から成るシ
ステインに富む配列に見られる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ
ら、１９８５を参照）。ｈＧＲと比較した場合には４７
％のアミノ酸同一性が見られ、そしてｃ−ｅｒｂ−Ａを
ヒトエストロゲン受容体（ｈＥＲ）のアミノ酸配列と比
較した場合には５２％の同一性が存在する（第ＩＩＩ−
２図）。我々はｈＧＲのこの領域がＤＮＡ結合ドメイン
４を表すと提案した。突然変異誘発および発現実験によ
り、転写活性化におけるその役割の直接的証拠が得られ
た（実験の部ＩＩを参照）。システインに富むドメイン
から下流の領域（ホルモン結合ドメインに相当する）に
は、ウイルスｅｒｂ−Ａ産物において先に述べたような
ｈＧＲおよびｈＥＲとの低下したしかし有意な（１７
％）相同性が存在する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９
８５；Ｇｒｅｅｎｅら、１９８６；およびＧｒｅｅｎ
ら、１９８６を参照）。ＩＩＩ．Ｃ．多重ｅｒｂ−Ａ遺伝子 制限エンドヌクレアーゼ消化ヒト胎盤ＤＮＡＩＩＩ．Ｄ．ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子の発現 種々のヒト細胞株またはヒト胎盤から分離した細胞質ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡと、ｐｈｅＡ４からの６５０ｂｐＢ
ａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメント（第ＩＩＩ−１（Ａ）
図）と、をハイブリダイズする）ザン・ブロット（Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ）は、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７
細胞中に最も豊富に存在する２０００ヌクレオチドの単
一のＲＮＡ種を明らかにした（第ＩＩＩ−４（Ａ）
図）。ｍＲＮＡの大きさは、我々がほぼ全長のｃ−ｅｒ
ｂ−ＡｃＤＮＡを分離したことを示す。ＨＴ１０８０細
胞は少量の２ｋｂ転写物を含み、一方それはＩＭ−９細
胞中に検出されない。ヒト胎盤は２．０ｋｂのＲＮＡに
加えて５，３および２．５ｋｂの多数のＲＮＡ種を含む
と思われる。多数の胎盤バンドが核前駆体、または単一
遺伝子からの成熟ｍＲＮＡ、もしくは他のｅｒｂ−Ａ遺
伝子の産物を表すかどうかは定かでない。ヒトｃ−ｅｒ
ｂ−Ａ ｃＤＮＡのタンパク質産物はｉｎ ｖｉｔｒｏ
翻訳により同定した。全ｃ−ｅｒｂ−Ａコード領域を含
むｃＤＮＡは両方の向きで発現ベクターｐＧＥＭ３のＥ
ｃｏＲＩ部位に挿入した。ウサギ網状赤血球溶解液中で
のタンパク質合成をプログラミングするために、これら
の鋳型からＴ７ポリメラーゼにより合成したキャップ
（ｃａｐ）をもつＲＮＡ転写物を使用し、そして３５Ｓ
−メチオニン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離した（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）。鋳型と
してｐｅＡ１０１ＤＮＡ（ｅｒｂ−Ａセンス転写物）を
用いたときにはＭｒ５５，５２および３５Ｋのタンパク
質が検出されたが（第ＩＩＩ−４（Ｂ）図，レーン３お
よび４）、ｐｅＡ１０２ＤＮＡ（ｅｒｂ−Ａアンチセン
ス転写物）を用いたときには検出されなかった（第ＩＩ
Ｉ−４（Ｂ）図，レーン２）。５５および５２Ｋの産物
はそれぞれメチオニン１および２７で翻訳を開始するポ
リペプチドに相当し（第ＩＩＩ−１（Ｂ）−１図）、３
５Ｋ産物はタンパク質分解産物でありうる。ＩＩＩ．Ｅ．甲状腺ホルモンの結合 ｈＧＲのカルボキシ末端とｈＥＲのカルボキジ末端（ホ
ルモン結合ドメインを定める；Ｋｒｕｓｔら、１９８６
を参照）の間の部分的アミノ酸配列相同性（４０％）並
びにステロイドリガンドの構造的類似性は、ステロイド
受容体が調節タンパク質の１つのファミリーから成ると
いう仮説を支持するものである。ｃ−ｅｒｂ−Ａのカル
ボキシ末端とステロイド受容体のカルボキシ末端との比
較的少ない相同性は、ｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子が恐らく
ステロイド受容体をコードしないことを示唆しており、
ｅｒｂ−Ａが他の分子に応答しうるという仮説に一致す
る。我々はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳がクローン化したステ
ロイド受容体のホルモン結合活性を同定する手段として
使えることを示した（実験の部Ｉを参照）。従って、推
定上のｃ−ｅｒｂ−Ａリガンドを同定するために、この
検定を利用した。ステロイドホルモンおよび甲状腺ホル
モンは基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼ
す。ｅｒｂ−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性
を引き出すために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物を１２５
Ｉ−３，５，３′−トリヨード−チロニン（１２５Ｉ−
Ｔ３）とホルモン結合反応条件下で混合した（Ｓａｍｕ
ｅｌｓら、１９７４を参照）。非特異的ホルモン結合は
同様な試料に５００倍過剰モル量の冷却Ｔ３を加えるこ
とにより調べた。驚いたことに、５５および５２Ｋポリ
ペプチドを含む混合物（ｐｅＡ１０１）は１２５Ｉ−Ｔ
３と結合したが、アンチセンスＲＮＡ−プログラム化溶
解液（ｐｅＡ１０２）はバックグラウンド結合のみを示
した。ホルモン結合はプロテアーゼに対して感受性であ
るが、ヌクレアーゼには非感受性である（データは示さ
ず）。クローン化ｅｒｂ−Ａタンパク質に対する手段と
して使えることを示した（実験の部Ｉを参照）。従っ
て、推定上のｃ−ｅｒｂ−Ａリガンドを同定するため
に、この検定を利用した。ステロイドホルモンおよび甲
状腺ホルモンは基本的に類似した機構によりそれらの作
用を及ぼす。ｅｒｂ−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありう
る可能性を引き出すために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物
を１２５Ｉ−３，５，３′−トリヨード−チロニン（１
２５Ｉ−Ｔ３）とホルモン結合反応条件下で混合した
（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４を参照）。非特異的ホル
モン結合は同様な試料に５００倍過剰モル量の冷却Ｔ３
を加えることにより調べた。驚いたことに、５５および
５２Ｋポリペプチドを含む混合物（ｐｅＡ１０１）は
１２５Ｉ−Ｔ３と結合したが、アンチセンスＲＮＡ−プ
ログラム化溶解液（ｐｅＡ１０２）はバックグラウンド
結合のみを示した。ホルモン結合はプロテアーゼに対し
て感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受性である
（データは示さず）。クローン化ｅｒｂ−Ａタンパク質
に対するＴ３親和性はスカッチャード分析により測定し
た（第ＩＩＩ−５（Ａ）図）。５×１０−１１ＭのＫｄ
値かが得られ、これはＨｅＬａ細胞の核抽出物における
Ｔ３結合（６×１０−１１Ｍ）とほとんど同じである
（データは示さず）。特殊な甲状腺ホルモン類似体は、
天然甲状腺ホルモン受容体へのＴ３結合に対し特徴的な
競合パターンを有する。我々はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成
したｅｒｂ−Ａ産物が天然および合成甲状腺ホルモンに
対して同じ固有の親和性を有するかどうか調べた。
１２５Ｉ−Ｔ３結合は３，５′，３′−トリヨードチロ
酢酸（ＴＲＩＡＣ）の場合に最も効果的に競合され、そ
れは３００ｐＭで１２５Ｉ−Ｔ３結合の５０％を阻害し
た（第ＩＩＩ−５（Ｂ）図）。さらに、Ｌ−チロキシン
（第ＩＩＩ−５（Ｂ）図）、Ｄ−Ｔ３およびｒＴ
３（３，３’，５’−トリヨード−Ｌ−チロニン）はＴ
３よりも弱く競合し（第ＩＩＩ−５（Ｃ）図）、一方１
００μＭのビタミンＤ３、アルドステロン、コルチゾ
ル、テストステロン、プロゲステロンまたはエストラジ
オールは競合せず（データは示さず）、ラット甲状腺ホ
ルモン受容体の生化学的性質と一致する（Ｓａｍｕｅｌ
ｓら、１９７４；Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７９；および
Ｌａｔｈａｍら、１９７６を参照）。高塩（０．４Ｍ
ＫＣｌ）ＨｅＬａ細胞核抽出物は甲状腺ホルモン（
１２５Ｉ−Ｔ３）結合活性を含むが、細胞質または低塩
（０．１ＭＫＣｌ）核抽出物には全く見られなかった
（データは示さず）。核抽出物における甲状腺ホルモン
結合の競合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製したｃ−ｅｒｂ
−Ａ含有溶解液のそれと定量的に類似していた（第ＩＩ
Ｉ−５（Ｂ）図および（Ｄ）図を比較されたい）。さら
に、検出不能なレベルのｃ−ｅｒｂ−Ａ ｍＲＮＡ（第
ＩＩＩ−４（Ａ）図、レーン４）を含むＩＭ−９細胞由
来の０．４Ｍ ＫＣｌ核抽出物を用いた甲状腺ホルモン
結合は、類似のＨｅＬａ細胞抽出物と比較したとき、ご
くわずかである。これらの結果はｃ−ｅｒｂ−Ａ甲状腺
ホルモン受容体であるという直接的証拠を提供する。ＩＩＩ．Ｆ．結論 ここで得られたデータは、ｃ−ｅｒｂ−Ａ産物を甲状腺
ホルモン受容体として同定するための３つの基準をもた
らす。第一に、ｃ−ｅｒｂ−Ａの全体的な構造相同性は
リガンド応答性調節タンパク質である可能性を示してい
る。第二に、発現されたタンパク質産物は天然および合
成甲状腺ホルモンに対して天然受容体と同じ固有の親和
性を有している。第三に、ｅｒｂ−Ａのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ翻訳産物の分子量はフォトアフィニティ標識ラット甲
状腺ホルモン受容体と類似している（Ｐａｓｃｕａｌ
ら、１９８２）。甲状腺ホルモン受容体としてのｅｒｂ
−Ａの本性は、成長ホルモン遺伝子のようなＴ３−応答
性遺伝子のその転写調節を証明することによりさらに実
証されるであろう。ｈＧＲおよびｈＭの分析により、こ
れらのタンパク質は一連の機能的ドメインから構成され
ていることが明らかになった。（実験の部ＩおよびＩ
Ｖ；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ；Ｃａｒｌｓ
ｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅら、１９８２；Ｄｅｌｌｗｅｇら、
１９８２；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、１９８４；およびＳｈ
ｅｒｍａｎら、１９７８を参照されたい。）これらはキ
セノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）５Ｓ遺伝子の第ＩＩＩＡ転
写因子および他の転写調節タンパク質（Ｍｉｌｌｅｒ
ら、１９８５；Ｂｅｒｇ，１９８５）に見られる反復し
たシステインに富む配列との構造的類似性を有するシス
テインに富む領域、並びにステロイド結合ドメインをコ
ードするカルボキシ末端領域（実験の部ＩＩ；Ｗｅｉｎ
ｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ；およびＫｕｍａｒら、１
９８６を参照）を含む。甲状腺ホルモン受容体に類似し
たこの範囲はそのホルモン結合領域がその分子のカルボ
キシ末端近傍に局在化することを予告するであろう（第
ＩＩＩ−６図）。推定上のＤＮＡ結合配列はシステイン
に富む領域に存在し（第ＩＩＩ−６図）、ｈＧＲおよび
ｈＥＲのＤＮＡ結合特性は局在化されると思われる（実
験の部ＩＩ；Ｋｕｍａｒら、１９８６；Ｓ．Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇおよびＲ．Ｍ．Ｅ．、未発表データを参
照）。ＩＩＩ．Ｇ．甲状腺ホルモン受容体および腫瘍形成 鳥類の赤芽球によるｖ−ｅｒｂ−Ａ産物の発現は、完全
に形質転換された表現型の維持のために必要とされる
（Ｇｒａｆら、１９８３；Ｆｒｙｋｂｅｒｇら、１９８
３；Ｓｅａｌｙら、１９８３；およびＫａｈｎら、１９
８６を参照）。ｖ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子を欠失したウイル
スに感染したニワトリは比較的悪性でない症状を呈する
が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてこれらの感染赤芽球は自
然に分化して、複合培地を補給したときだけ生育する。
しかしながら、ｅｒｂ−Ａ＋／ｅｒｂ−Ｂ＋ウイルスに
感染した細胞は増大した自己回復能を有し、比較的未分
化の表現型を呈する。ｖ−ｅｒｂ−Ａタンパク質の構造
的変化は異常な成長調節特性を及ぼす産物を生じさせる
であろう。例えば、カルボキシ末端における変化は甲状
腺ホルモン結合活性に影響を及ぼして、以前にヒトグル
ココルチコイド受容体のベータ型において示したよう
に、構成的に活性な分子をもたらすかも知れない（実験
の部ＩＩおよびＩＩＩ；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９
８５ａを参照）。この場合の変化はステロイド結合活性
を排除する。このドメインにおける挿入変異もまたステ
ロイド結合特性を不活性化する（実験の部ＩＩを参
照）。しかしながら、ホルモン結合領域の欠失は構成的
に活性な受容体を生じさせ、このことはこのドメインが
転写活性化において調節的役割を演じていることを示す
（Ｖ．ＧｉｇｕｅｒｅおよびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発表デー
タ）。これらのデータは、ｖ−ｅｒｂ−Ａがホルモンと
結合しそうもなく、むしろ甲状腺ホルモン受容体の構成
的に活性な形体であることを推測させる。甲状腺ホルモ
ン受容体としてのｅｒｂ−Ａの同定は、腫瘍の原因とな
る形質転換にエンハンサーおよびそれらの結合タンパク
質を巻き込む最初の直接的証拠を提供する。ＩＩＩ．Ｈ．調節遺伝子のスーパーファミリー ステロイド受容体とｖ−ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物との
類似性は、これらが原始的な受容体遺伝子から進化した
ものであると我々が提案するのに十分であった（Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ）。２つの驚くべき結果
がここに示した実験から得られた。第一は、ｅｒｂ−Ａ
原腫瘍遺伝子のファミリーの存在が甲状腺ホルモン受容
体と密接に関連した１種またはそれ以上の他の分子の存
在を暗示するということである。生理学的研究は第二の
クラスの甲状腺ホルモン受容体の存在を予告しなかっ
た。従ってこのファミリーの同定は発生およびホメオス
タシス調節の機構に新たな光を投げかけるかも知れな
い。これらの結果から得られた第二の驚くべき観察は、
甲状腺ホルモン受容体とステロイドホルモン受容体ファ
ミリーとの密接な関係である。この関係は、これらの分
子がすべてより複雑な真核生物の次第に高まる発生学的
および生理学的要求に適合すべく進化の過程で生じた調
節タンパク質のスーパーファミリーの一部でありうるこ
とを示している。ＩＩＩ．Ｉ．実験の部ＩＩＩに関連した図面の詳細な説
明 第ＩＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−ＡｃＤＮＡの制限地図および塩基
配列決定計画（Ａ）、並びにそのヌクレオチド配列およ
び推定上のアミノ酸配列（Ｂ）。ａ．複合制限地図に対
する２つのサブクローンｐｈｅＡ４およびｐｈｅＡ１２
の方向性。共通の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を線
状地図の上に示す。細線、非翻訳配列；斜線ボックス、
ｅｒｂ−Ａコード領域；矢印塩基配列を決定したＤＮＡ
フラグメント。ｂ．複合ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を５′→３′の方向で示す。ウイルスｅｒｂ
−Ａタンパク質２１に関する翻訳オープン・リーディン
グ・フレームをヌクレオチド配列の上に示す。アデノシ
ン残基（約１３０個）がｐｈｅＡ１２の３′末端に存在
する。翻訳配列の上の番号はアミノ酸残基を示し、そし
てヌクレオチド番号はその配列の右側に示す。第ＩＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図の方法 ２つのヒト胎盤ラムダｇｔ１０ＤＮＡライブラリー（Ｈ
ｕｙｎｈら、１９８５）のそれぞれからの組換えファー
ジ（約１０６個は）は、ｐＡＥＶ−１１（Ｖｅｎｎｓｔ
ｒｏｍら、１９８０）から単離した５００ｂｐ Ｐｓｔ
Ｉフラグメント（ニック・トランスレーションを行なっ
たもの；Ｒｉｇｂｙら、１９７７）を用いてスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーション混合物は５０％ホル
ムアミド、１×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．１
％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２
Ｐ標識ＰｓｔＩフラグメント（比活性＝１×１０８ｃｐ
ｍ／μｇ）を含んでいた。２通りのニトロセルロースフ
ィルターを３７℃で１８時間ハイブリダイズさせ、０．
１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ
Ｎａｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）で２０分ず
つ３回洗い、そして増感紙を用いて−７０℃でオートラ
ジオグラフィーにかけた。２つのハイブリダイゼーショ
ン陽性クローンが単離され、それをｐＣＵ８のＥｃｏＲ
Ｉ部位にサブクローニングし、その後化学的切断方法に
より塩基配列を決定した（Ｍａｘａｍら、１９７７）。第ＩＩＩ−２図 ｖ−ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物、ヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−
Ａポリペプチド、およびヒトグルココルチコイド受容体
並びにヒトエストロゲン受容体のカルボキシ末端部分の
アミノ酸配列比較。ｖ−ｅｒｂ−Ａタンパク質（上段の
配列）とヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａポリペプチド（第二段
の配列）との翻訳アミノ酸配列は、対応する残基を整列
させることにより比較した。３個以上のアミノ酸配列の
同時比較用のコンピュータプログラム（Ｊｏｈｎｓｏｎ
ら、１９８６）は、ｃ−ｅｒｂ−Ａ、ヒトグルココルチ
コイド受容体（第三段のｈＧＲ配列；実験の部Ｉ、第Ｉ
−２（１）およびＩ−２（２）図を参照）、およびヒト
エストロゲン受容体（下段のｈＥＲ配列；Ｇｒｅｅｎ
ら、１９８６を参照）のカルボキジ末端アミノ酸配列
を、各配列の所定のセグメントの漸進的評価に基づいて
整列させるべく用いられた。少なくとも３種のポリペプ
チド間で一致するアミノ酸残基をボックスで囲った。２
種のｅｒｂ−Ａポリペプチド間のアミノ酸の一致は、各
欄の上段配列の上に星印で示した。ステロイド受容体間
のアミノ酸配列の同一性は、配列の下に十字形の印で示
した。ハイフン、ギャップは比較の際にアミノ酸の同一
性の数を最大とするために挿入した。４種のポリペプチ
ド間に保存されたシステイン残基は黒地に白で印刷し
た。第ＩＩＩ−３（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 ｃ−ｅｒｂ−Ａ ＤＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡ
のサザン分析および染色体マッピング。Ａ．妊娠期間終
決後のヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、生成物を０．８％アガロースゲルで分離した。ＤＮ
Ａはニトロセルロース紙に移行させ（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ，１９７５）、ｐｈｅＡ４由来の４５０ｂｐ Ｓｓｔ
Ｉフラグメント（ニック・トランスレーションを行っ
て、比活性５×１０８ｃｐｍ／μｇとしたもの）を用い
て５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート
溶液、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮ
Ａ中でハイブリダイズさせた。フィルターを０．１×Ｓ
ＳＣ０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて洗い、その後増感紙
を用いて−７０℃でＸ線フィルムに露光した。ラムダＨ
ｉｎｄＩＩＩＤＮＡマーカー（Ｋｂでのサイズ）をオー
トラジオグラムの左側に並べる。Ｂ．非ストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下での上記セクションａ
と同じｃ−ｅｒｂ−Ａプローブを用いた胎盤ＤＮＡの分
析。同じ試料を含む類似のブロットをセクションａのよ
うにハイブリダイズさせた（但し、３５％ホルムアミド
を使用）。ハイブリダイズしたフィルターは２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ中で５５℃にて洗い、その後上記の
如くＸ線フィルムに露光した。Ｃ．ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ
遺伝子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレー
ザー・サイトフルオロメトリー（Ｌｅｂｏら、１９８
４）により分離し、セクションｂで説明した非ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件下に、ｐｈｅＡ４
由来の１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ挿入物をプローブとして
使用して検索した。第ＩＩＩ−４（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａの発現。Ａ．ヒト細胞株およびヒト
胎盤からのＲＮＡのノザン分析。ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７
およびＩＭ−９細胞からの細胞質ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ
（１２μｇ）、またはＨＴ１０８０もしくは胎盤からの
全ポリ（Ａ）ＲＮＡはホルムアルデヒドを含有する１％
アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロースに移行さ
せ（Ｔｈｏｍａｓ，１９８０）、そしてニック・トラン
スレーションを行った６５０ｂｐ ＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
ＩｐｈｅＡ４フラグメントを用いて検索した。細胞質Ｒ
ＮＡは等張緩衝液および０．５％ＮＰ４０を用いて細胞
株から分離し、一方胎盤ＲＮＡはグアニジンチオシアネ
ートを用いて新鮮な組織から抽出した（Ｃｈｉｒｇｗｉ
ｎら、１９７９）。レーン１，ＨｅＬａ；レーン２、Ｈ
Ｔ１０８０；レーン３，ヒト胎盤；レーン４，ＩＭ−
９；レーン５，ＭＣＦ−７。Ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの
ｅｒｂ−Ａポリペプチドの合成。Ｔ７ポリメラーゼによ
り触媒されたＲＮＡ転写物を用いて合成した３５Ｓ−メ
チオニン標識産物は１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、フルオログラフィー（ＥＮ３ＨＡ
ＮＣＥ，ニューイングランドヌクレアー）にかけた。レ
ーン１，対照（ｍＲＮＡ不含）；レーン２，ｐｅＡ１０
２（アンチセンスＲＮＡ，４μｌ）；レーン３，ｐｅＡ
１０１（センスＲＮＡ，１μｌ）；レーン４，ｐｅＡ１
０１（４μｌＲＮＡ）。タンパク質標準のサイズ：ウシ
血清アルブミン，６６．２Ｋ；卵アルブミン，４．５
Ｋ；およびカルボニックアンヒドラーゼ，３１Ｋ。第ＩＩＩ−４（Ａ）および（Ｂ）図の方法 ｃ−ｅｒｂ−Ａの全コード領域を含むｐｈｅＡ１２由来
のＥｃｏＲＩ挿入物は両方の向きでｐＧＥＭ３（Ｐｒｏ
ｗｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社）のＥｃｏＲＩ部位へ挿入し
た。プラスミドＤＮＡのｐｅＡ１０１およびｐｅＡ１０
２をＨｉｎｄＩＩＩで線状となし、０．８％アガロース
ゲル上で精製し、そしてＴ７ポリメラーゼにより触媒さ
れるｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ合成のための鋳型として使
用した（実験の部Ｉを参照）。Ｐ６０クロマトグラフィ
ー後に、全核酸物質（２μｇ）はウサギ網状赤血球溶解
液系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社）中で３５Ｓ−
メチニオン（２５μＣｉ，１１００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）
を用いて最終容量２５μｌにてタンパク質翻訳を行わせ
るべく使用した。第ＩＩＩ−５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）図 ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａポリペプチドへ
の甲状腺ホルモンの結合。Ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成
したｅｒｂ−Ａポリペプチドの１２５Ｉ−Ｔ３結合のス
カッチャード分析。ｅｒｂ−Ａポリペプチド（全容量２
７ｍｌ中のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳混合物からの２μｌ）は
異なる１２５Ｉ−Ｔ３濃度での結合した標識ホルモン量
および遊離の標識ホルモン量を測定するためにヒドロキ
シルアパタイトを用いて特異的甲状腺ホルモン結合活性
について検定した（Ｇｒｕｏｌ，１９８０）。Ｂ．ｉｎ
ｖｉｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａポリペプチドへの
１２５Ｉ−Ｔ３結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競
合。ｐｅＡ１０１（センス鎖）−プログラム化反応から
の試料（２μｌ）は、次第に増加する濃度の未標識甲状
腺ホルモンまたは類似体（標識ホルモンと競合する）と
共に１２５Ｉ−Ｔ３標識結合反応（Ｓａｍｕｅｌｓら、
１９７４）において使用した。特異的に結合した甲状腺
ホルモンを競合化合物の濃度に対してプロットする。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａポリペプチ
ドへの１２５Ｉ−Ｔ３結合に対するトリヨードチロニン
異性体の競合。結合反応は次第に増加する濃度のＴ３異
性体を加えて上記の通りに行った。ｅｒｂ−Ａに結合し
た甲状腺ホルモンは縦座標上にプロットする。Ｄ．０．
４Ｍ ＫＣｌ ＨｅＬａ細胞核抽出物への１２５Ｉ−Ｔ
３結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。ＨｅＬａ
細胞核は０．４Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液で抽出した（Ｓ
ａｍｕｅｌｓら、１９７４）。タンパク質抽出物（２５
μｇ）（バイオーラッドタンパク質検定法により測定）
は次第に増加する濃度の甲状腺ホルモンおよび類似体を
含む標準結合反応混合物中で０．６ｎＭ１２５１−Ｔ３
と混合した（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４；Ｌａｔｈａ
ｍら、１９７６）。第ＩＩＩ−５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）の方
法 標識１２５Ｉ−３，３′，５−トリヨード−Ｌ−チロニ
ン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製，２２
００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ，０．３ｎＭ最終）はＴ３−結合
緩衝液（０．２５Ｍシュークロース，０．２５Ｍ ＫＣ
ｌ，２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ
ＭｇＣｌ２，２ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭジチオトレイト
ール（ＤＴＴ））（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４）中で
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳混合物（第ＩＩＩ−４（Ａ）にて
説明）中で合成したｅｒｂ−Ａポリペプチドと最終容量
２５０μｌにて０℃で２時間混合した。特異的ホルモン
結合は１０００倍過剰の未標識ホルモンを加えることに
より測定し、セファデックスＧ−２５微粒子（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）０．９×４．０ｃｍカラムから排除容量
中に溶出される放射能を計数することにより検定した
（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４）。第ＩＩＩ−６図 ステロイドホルモン受容体と甲状腺ホルモン受容体との
模式図による比較。第ＩＩＩ−２図に示した受容体分子
のアミノ酸配列を模式図で表す。ＣＹＳ，受容体タンパ
ク質に見られる推定上のＤＮＡ結合ドメインをコードす
るシステインに富む領域（Ｃｙｓに富む領域の残基は：
ｃ−ｅｒｂ−Ａ，１０２−１６９；ｈＧＲ，４２１−４
８６；ｈＥＲ，１８５−２５０）；Ｃｏｒｔｉｓｏｌ，
ＥｓｔｒａｄｉｏｌおよびＴ３／Ｔ４，カルボキシル末
端のホルモン結合領域；ＩＭＭ，ヒトグルココルチコイ
ド受容体の免疫原領域。ボックスを分離する数学，垂直
破線間の受容体種同士のアミノ酸同一性のパーセンテー
ジ；ｈＥＲ，ヒトエストロゲン受容体；ｈＧＲ，ヒトグ
ルココルチコイド受容体；ｈｃ−ｅｒｂ−Ａベータ，ヒ
ト甲状腺ホルモン受容体。
するＩＩＩ．Ａ．概要および序論 ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の相補ＤＮＡ
はその塩基配列が決定されており（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅ
ｒら、１９８５ｂおよび実験の部Ｉを参照）、機能的に
活性であることが分かっている（実験の部ＩＩを参
照）。興味あることには、その受容体の塩基配列解析に
より、それは鳥類の赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）のｖ−
ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物に関係のあることが見出され
た（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５を参照）。これ
はステロイド受容体とｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物が共通
の原子的原型（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ａｒｃｈｅｔｙ
ｐｅ）を共有し、そしてｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子産物も
またＤＮＡエンハンサー因子と結合するタンパク質であ
りうるという提案へ導いた。ヒトエストロゲン（Ｇｒｅ
ｅｎら、１９８６およびＧｒｅｅｎｅら、１９８６）、
ニワトリプロゲステロン（Ｊｅｌｔｓｃｈら、１９８６
およびＣｏｎｎｅｅｌｙら、１９８６）およびヒトアル
ドステロン（Ｊ．Ａｒｒｉｚａ，Ｃ．Ｗ．およびＲ．
Ｍ．Ｅ．，未発表データ）の最近の特性決定はこれらの
結論をさらに支持するものである。従って、我々はたと
えヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子が機能的に確実に固
定されなくとも、その遺伝子の配列を決定することから
始めた。これらの実験の進行中に、グルココルチコイド
受容体の機能的ドメイン（実験の部ＩＩを参照）の解説
において進歩が見られ、ｈＧＲのホルモン結合ドメイン
はカルボキシ末端の３００個のアミノ酸を包含する異常
に大きい領域であることが判明した。この全領域はｖ−
ｅｒｂ−Ａのカルボキシ末端とのわずかではあるが有意
な類似性を有し、それ故にステロイドホルモンの作用と
類似した転写調節作用を及ぼしうる分子の部類に我々の
関心が集中した。遺伝子発現の甲状腺ホルモン刺激の分
子機構はステロイドについて概略したものと類似してい
ると思われる（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら、１９８０を参
照）。甲状腺ホルモンは試験したすべての脊索動物種に
存在し、そして発生および分化（例えば両生類の変態）
に対して重要な作用を及ぼす（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら、
１９８０を参照）。ステロイドと同様に、甲状腺ホルモ
ンは受動拡散によって細胞に入り、高親和性核受容体と
結合し、その後遺伝子発現の迅速かつ選択的な活性化を
仲介する（Ｔａｔａら、１９６６およびＯｐｐｅｎｈｅ
ｉｍｅｒら、１９７２）。この仮説を支持する証拠は、
ラット下垂体前葉のソマトトロピン生成細胞および多数
の関連するラットソマトトロピン生成細胞株における成
長ホルモンおよびそのメッセンジャーＲＮＡの誘導の研
究からもたらされた（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７３およ
びＴａｔａら、１９７４）。甲状腺ホルモンはこれらの
細胞における成長ホルモン遺伝子の転写を速やかに増強
する（Ｍａｒｔｉａｌら、１９７７およびＥｖａｎｓ
ら、１９８２）。この転写増強は核甲状腺ホルモン−受
容体複合体のレベルが上昇することにより達成され、時
間および濃度に依存しているが、タンパク質合成とは無
関係である（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７６；Ｓｐｉｎｄ
ｌｅｒら、１９８２；およびＹａｆｆｅら、１９８４を
参照）。ステロイドホルモン作用と甲状腺ホルモン作用
との類似性は、ｅｒｂ−Ａタンパク質それ自体が甲状腺
ホルモン受容体でありうるという可能性を調べることへ
導いた。我々は初めにヒトｃ−ｅｒｂ−ＡのｃＤＮＡを
単離して、その配列を決定した。その塩基配列から、ス
テロイドホルモン受容体の推定上のＤＮＡ結合ドメイン
に類似したシステイン／リシン／アルギニンに富む領
域、およびそのステロイド結合ドメインとわずかに関連
したカルボキシ末端領域を含む４５６個のアミノ酸から
成るポリペプチドが推定された。クローン化したステロ
イド受容体のホルモン結合特性を調べるために開発され
た機能検定（実験の部Ｉを参照）を用いて、我々はヒト
ｃ−ｅｒｂ−ＡｃＤＮＡの翻訳産物が天然甲状腺ホルモ
ン受容体分子に特徴的な、固有の甲状腺ホルモン結合活
性を保持することを証明した。ＩＩＩ．Ｂ．ｃ−ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡの特性決定 ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡを単離するために、ｖ−
ｅｒｂ−Ａ遺伝子のみを含むＡＥＶゲノム領域から分離
した５００塩基対（ｂｐ）のＰｓｔＩＤＮＡフラグメン
ト（Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍら、１９８０）を３２Ｐ標識プ
ローブとして使用して、２つのヒト胎盤ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングした。それぞれ約１０６個のフ
ァージ組換え体の２つの独立したライブラリーを選択す
ることにより、２つの重複するラムダｇｔ１０ｃＤＮＡ
クローンが得られた。ｐＵＣ８サブクローンからのｃＤ
ＮＡクローンＥｃｏＲＩ挿入物ｐｈｅＡ４およびｐｈｅ
Ａ１２のそれぞれの制限地図を作成した（第ＩＩＩ−１
（Ａ）図）。これらの重複する１．５キロ塩基（ｋｂ）
ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列解析により、ヌク
レオチド番号３０１に推定上のイニシエーターメチオニ
ンコドンおよびヌクレオチド番号１６６９にターミネー
ターコドンを有する４５６個のアミノ酸の長いオープン
・リーディング・フレームを含むことが明らかになった
（第ＩＩＩ−１（Ｂ）−１図および第ＩＩＩ−１（Ｂ）
−２図）。ＡＴＧの７コドン上流には読み枠内のターミ
ネーターＴＡＡが存在してイニシエーターメチオニンに
対する支持を与えているが、２６コドン下流に存在する
別のメチオニンはこの割当てを不確かなものにする。共
通のポリアデニル化付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ，Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔら、１９７６を参照）はｐｈｅＡ１２の
ターミネーターとポリ（Ａ）領域の間の２７ヌクレオチ
ド中に存在しない。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡ翻訳
オープン・リーディング・フレーム内にコードされる相
対分子量５２０００（Ｍ１＝５２Ｋ）の推定上のポリペ
プチドは、ＡＥＶ中のウイルスｇａｇ配列（Ｄｅｂｕｉ
ｒｅら、１９８４）から下流の領域と８２％のアミノ酸
同一性を共有する。アミノ酸の比較において大きな相違
は見られなかった。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａアミノ酸配列は
ウイルスのアミノ酸残基３７から始まるウイルスタンパ
ク質と相同である（第ＩＩＩ−２図）。ｃ−ｅｒｂ−Ａ
のカルボキシ末端はｖ−ｅｒｂ−Ａのそれと次の点で相
違する：すなわち、２種のポリペプチドのアミノ酸配列
類似性がｃ−ｅｒｂ−Ａの残基４４５およびｖ−ｅｒｂ
−Ａの残基３８０で終止する（第ＩＩＩ−２図）。ヒト
ｃ−ｅｒｂ−Ａ核酸配列とｖ−ｅｒｂ−Ａのそれとを整
列させると、ヒト遺伝子の約７４％がアミノ酸の相同領
域（ｃ−ｅｒｂ−Ａのヌクレオチド５６３−１６３６，
データは示さず）においてウイルス遺伝子と同一である
ことが分かる。これらの比較は、染色体１７にマッピン
グされる他のヒトｅｒｂ−Ａ遺伝子に関する以前のデー
タ（Ｊａｎｓｓｏｎら、１９８３；Ｓｐｕｒｒら、１９
８４；およびＤａｙｔｏｎら、１９８４）と考え合わせ
ると、我々の分離したヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子が
別個のものであることを示す。２種の染色体１７ｅｒｂ
−Ａ遺伝子（我々は両方ともｈｃ−ｅｒｂ−Ａアルファ
と呼ぶよう提案する）のうちの１種はヌクレオチド配列
に関して８２％がｖ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子と類似してお
り、アミノ酸配列に関しては８９％が同一である（Ｄａ
ｙｔｏｎ，１９８４を参照）。従って、我々がｈｃ−ｅ
ｒｂ−Ａベータと呼ぶよう提案する胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａ
ｃＤＮＡは、ｈｃ−ｅｒｂ−Ａアルファ遺伝子よりも
ウイルスｅｒｂ−Ａ遺伝子との関連性がうすい。ウイル
スおよび細胞ｅｒｂ−Ａタンパク質産物とグルココルチ
コイド受容体とのアミノ酸配列の比較は、ｈＧＲのカル
ボキシ末端半分との段階的レベルの相同性を示す（第Ｉ
ＩＩ−２図）。最も高い類似性はｃ−ｅｒｂ−Ａアミノ
酸残基１０２から始まって６５個のアミノ酸から成るシ
ステインに富む配列に見られる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ
ら、１９８５を参照）。ｈＧＲと比較した場合には４７
％のアミノ酸同一性が見られ、そしてｃ−ｅｒｂ−Ａを
ヒトエストロゲン受容体（ｈＥＲ）のアミノ酸配列と比
較した場合には５２％の同一性が存在する（第ＩＩＩ−
２図）。我々はｈＧＲのこの領域がＤＮＡ結合ドメイン
４を表すと提案した。突然変異誘発および発現実験によ
り、転写活性化におけるその役割の直接的証拠が得られ
た（実験の部ＩＩを参照）。システインに富むドメイン
から下流の領域（ホルモン結合ドメインに相当する）に
は、ウイルスｅｒｂ−Ａ産物において先に述べたような
ｈＧＲおよびｈＥＲとの低下したしかし有意な（１７
％）相同性が存在する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９
８５；Ｇｒｅｅｎｅら、１９８６；およびＧｒｅｅｎ
ら、１９８６を参照）。ＩＩＩ．Ｃ．多重ｅｒｂ−Ａ遺伝子 制限エンドヌクレアーゼ消化ヒト胎盤ＤＮＡＩＩＩ．Ｄ．ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子の発現 種々のヒト細胞株またはヒト胎盤から分離した細胞質ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡと、ｐｈｅＡ４からの６５０ｂｐＢ
ａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメント（第ＩＩＩ−１（Ａ）
図）と、をハイブリダイズする）ザン・ブロット（Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ）は、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７
細胞中に最も豊富に存在する２０００ヌクレオチドの単
一のＲＮＡ種を明らかにした（第ＩＩＩ−４（Ａ）
図）。ｍＲＮＡの大きさは、我々がほぼ全長のｃ−ｅｒ
ｂ−ＡｃＤＮＡを分離したことを示す。ＨＴ１０８０細
胞は少量の２ｋｂ転写物を含み、一方それはＩＭ−９細
胞中に検出されない。ヒト胎盤は２．０ｋｂのＲＮＡに
加えて５，３および２．５ｋｂの多数のＲＮＡ種を含む
と思われる。多数の胎盤バンドが核前駆体、または単一
遺伝子からの成熟ｍＲＮＡ、もしくは他のｅｒｂ−Ａ遺
伝子の産物を表すかどうかは定かでない。ヒトｃ−ｅｒ
ｂ−Ａ ｃＤＮＡのタンパク質産物はｉｎ ｖｉｔｒｏ
翻訳により同定した。全ｃ−ｅｒｂ−Ａコード領域を含
むｃＤＮＡは両方の向きで発現ベクターｐＧＥＭ３のＥ
ｃｏＲＩ部位に挿入した。ウサギ網状赤血球溶解液中で
のタンパク質合成をプログラミングするために、これら
の鋳型からＴ７ポリメラーゼにより合成したキャップ
（ｃａｐ）をもつＲＮＡ転写物を使用し、そして３５Ｓ
−メチオニン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離した（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）。鋳型と
してｐｅＡ１０１ＤＮＡ（ｅｒｂ−Ａセンス転写物）を
用いたときにはＭｒ５５，５２および３５Ｋのタンパク
質が検出されたが（第ＩＩＩ−４（Ｂ）図，レーン３お
よび４）、ｐｅＡ１０２ＤＮＡ（ｅｒｂ−Ａアンチセン
ス転写物）を用いたときには検出されなかった（第ＩＩ
Ｉ−４（Ｂ）図，レーン２）。５５および５２Ｋの産物
はそれぞれメチオニン１および２７で翻訳を開始するポ
リペプチドに相当し（第ＩＩＩ−１（Ｂ）−１図）、３
５Ｋ産物はタンパク質分解産物でありうる。ＩＩＩ．Ｅ．甲状腺ホルモンの結合 ｈＧＲのカルボキシ末端とｈＥＲのカルボキジ末端（ホ
ルモン結合ドメインを定める；Ｋｒｕｓｔら、１９８６
を参照）の間の部分的アミノ酸配列相同性（４０％）並
びにステロイドリガンドの構造的類似性は、ステロイド
受容体が調節タンパク質の１つのファミリーから成ると
いう仮説を支持するものである。ｃ−ｅｒｂ−Ａのカル
ボキシ末端とステロイド受容体のカルボキシ末端との比
較的少ない相同性は、ｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子が恐らく
ステロイド受容体をコードしないことを示唆しており、
ｅｒｂ−Ａが他の分子に応答しうるという仮説に一致す
る。我々はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳がクローン化したステ
ロイド受容体のホルモン結合活性を同定する手段として
使えることを示した（実験の部Ｉを参照）。従って、推
定上のｃ−ｅｒｂ−Ａリガンドを同定するために、この
検定を利用した。ステロイドホルモンおよび甲状腺ホル
モンは基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼ
す。ｅｒｂ−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性
を引き出すために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物を１２５
Ｉ−３，５，３′−トリヨード−チロニン（１２５Ｉ−
Ｔ３）とホルモン結合反応条件下で混合した（Ｓａｍｕ
ｅｌｓら、１９７４を参照）。非特異的ホルモン結合は
同様な試料に５００倍過剰モル量の冷却Ｔ３を加えるこ
とにより調べた。驚いたことに、５５および５２Ｋポリ
ペプチドを含む混合物（ｐｅＡ１０１）は１２５Ｉ−Ｔ
３と結合したが、アンチセンスＲＮＡ−プログラム化溶
解液（ｐｅＡ１０２）はバックグラウンド結合のみを示
した。ホルモン結合はプロテアーゼに対して感受性であ
るが、ヌクレアーゼには非感受性である（データは示さ
ず）。クローン化ｅｒｂ−Ａタンパク質に対する手段と
して使えることを示した（実験の部Ｉを参照）。従っ
て、推定上のｃ−ｅｒｂ−Ａリガンドを同定するため
に、この検定を利用した。ステロイドホルモンおよび甲
状腺ホルモンは基本的に類似した機構によりそれらの作
用を及ぼす。ｅｒｂ−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありう
る可能性を引き出すために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物
を１２５Ｉ−３，５，３′−トリヨード−チロニン（１
２５Ｉ−Ｔ３）とホルモン結合反応条件下で混合した
（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４を参照）。非特異的ホル
モン結合は同様な試料に５００倍過剰モル量の冷却Ｔ３
を加えることにより調べた。驚いたことに、５５および
５２Ｋポリペプチドを含む混合物（ｐｅＡ１０１）は
１２５Ｉ−Ｔ３と結合したが、アンチセンスＲＮＡ−プ
ログラム化溶解液（ｐｅＡ１０２）はバックグラウンド
結合のみを示した。ホルモン結合はプロテアーゼに対し
て感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受性である
（データは示さず）。クローン化ｅｒｂ−Ａタンパク質
に対するＴ３親和性はスカッチャード分析により測定し
た（第ＩＩＩ−５（Ａ）図）。５×１０−１１ＭのＫｄ
値かが得られ、これはＨｅＬａ細胞の核抽出物における
Ｔ３結合（６×１０−１１Ｍ）とほとんど同じである
（データは示さず）。特殊な甲状腺ホルモン類似体は、
天然甲状腺ホルモン受容体へのＴ３結合に対し特徴的な
競合パターンを有する。我々はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成
したｅｒｂ−Ａ産物が天然および合成甲状腺ホルモンに
対して同じ固有の親和性を有するかどうか調べた。
１２５Ｉ−Ｔ３結合は３，５′，３′−トリヨードチロ
酢酸（ＴＲＩＡＣ）の場合に最も効果的に競合され、そ
れは３００ｐＭで１２５Ｉ−Ｔ３結合の５０％を阻害し
た（第ＩＩＩ−５（Ｂ）図）。さらに、Ｌ−チロキシン
（第ＩＩＩ−５（Ｂ）図）、Ｄ−Ｔ３およびｒＴ
３（３，３’，５’−トリヨード−Ｌ−チロニン）はＴ
３よりも弱く競合し（第ＩＩＩ−５（Ｃ）図）、一方１
００μＭのビタミンＤ３、アルドステロン、コルチゾ
ル、テストステロン、プロゲステロンまたはエストラジ
オールは競合せず（データは示さず）、ラット甲状腺ホ
ルモン受容体の生化学的性質と一致する（Ｓａｍｕｅｌ
ｓら、１９７４；Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７９；および
Ｌａｔｈａｍら、１９７６を参照）。高塩（０．４Ｍ
ＫＣｌ）ＨｅＬａ細胞核抽出物は甲状腺ホルモン（
１２５Ｉ−Ｔ３）結合活性を含むが、細胞質または低塩
（０．１ＭＫＣｌ）核抽出物には全く見られなかった
（データは示さず）。核抽出物における甲状腺ホルモン
結合の競合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製したｃ−ｅｒｂ
−Ａ含有溶解液のそれと定量的に類似していた（第ＩＩ
Ｉ−５（Ｂ）図および（Ｄ）図を比較されたい）。さら
に、検出不能なレベルのｃ−ｅｒｂ−Ａ ｍＲＮＡ（第
ＩＩＩ−４（Ａ）図、レーン４）を含むＩＭ−９細胞由
来の０．４Ｍ ＫＣｌ核抽出物を用いた甲状腺ホルモン
結合は、類似のＨｅＬａ細胞抽出物と比較したとき、ご
くわずかである。これらの結果はｃ−ｅｒｂ−Ａ甲状腺
ホルモン受容体であるという直接的証拠を提供する。ＩＩＩ．Ｆ．結論 ここで得られたデータは、ｃ−ｅｒｂ−Ａ産物を甲状腺
ホルモン受容体として同定するための３つの基準をもた
らす。第一に、ｃ−ｅｒｂ−Ａの全体的な構造相同性は
リガンド応答性調節タンパク質である可能性を示してい
る。第二に、発現されたタンパク質産物は天然および合
成甲状腺ホルモンに対して天然受容体と同じ固有の親和
性を有している。第三に、ｅｒｂ−Ａのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ翻訳産物の分子量はフォトアフィニティ標識ラット甲
状腺ホルモン受容体と類似している（Ｐａｓｃｕａｌ
ら、１９８２）。甲状腺ホルモン受容体としてのｅｒｂ
−Ａの本性は、成長ホルモン遺伝子のようなＴ３−応答
性遺伝子のその転写調節を証明することによりさらに実
証されるであろう。ｈＧＲおよびｈＭの分析により、こ
れらのタンパク質は一連の機能的ドメインから構成され
ていることが明らかになった。（実験の部ＩおよびＩ
Ｖ；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ；Ｃａｒｌｓ
ｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅら、１９８２；Ｄｅｌｌｗｅｇら、
１９８２；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、１９８４；およびＳｈ
ｅｒｍａｎら、１９７８を参照されたい。）これらはキ
セノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）５Ｓ遺伝子の第ＩＩＩＡ転
写因子および他の転写調節タンパク質（Ｍｉｌｌｅｒ
ら、１９８５；Ｂｅｒｇ，１９８５）に見られる反復し
たシステインに富む配列との構造的類似性を有するシス
テインに富む領域、並びにステロイド結合ドメインをコ
ードするカルボキシ末端領域（実験の部ＩＩ；Ｗｅｉｎ
ｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ；およびＫｕｍａｒら、１
９８６を参照）を含む。甲状腺ホルモン受容体に類似し
たこの範囲はそのホルモン結合領域がその分子のカルボ
キシ末端近傍に局在化することを予告するであろう（第
ＩＩＩ−６図）。推定上のＤＮＡ結合配列はシステイン
に富む領域に存在し（第ＩＩＩ−６図）、ｈＧＲおよび
ｈＥＲのＤＮＡ結合特性は局在化されると思われる（実
験の部ＩＩ；Ｋｕｍａｒら、１９８６；Ｓ．Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇおよびＲ．Ｍ．Ｅ．、未発表データを参
照）。ＩＩＩ．Ｇ．甲状腺ホルモン受容体および腫瘍形成 鳥類の赤芽球によるｖ−ｅｒｂ−Ａ産物の発現は、完全
に形質転換された表現型の維持のために必要とされる
（Ｇｒａｆら、１９８３；Ｆｒｙｋｂｅｒｇら、１９８
３；Ｓｅａｌｙら、１９８３；およびＫａｈｎら、１９
８６を参照）。ｖ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子を欠失したウイル
スに感染したニワトリは比較的悪性でない症状を呈する
が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてこれらの感染赤芽球は自
然に分化して、複合培地を補給したときだけ生育する。
しかしながら、ｅｒｂ−Ａ＋／ｅｒｂ−Ｂ＋ウイルスに
感染した細胞は増大した自己回復能を有し、比較的未分
化の表現型を呈する。ｖ−ｅｒｂ−Ａタンパク質の構造
的変化は異常な成長調節特性を及ぼす産物を生じさせる
であろう。例えば、カルボキシ末端における変化は甲状
腺ホルモン結合活性に影響を及ぼして、以前にヒトグル
ココルチコイド受容体のベータ型において示したよう
に、構成的に活性な分子をもたらすかも知れない（実験
の部ＩＩおよびＩＩＩ；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９
８５ａを参照）。この場合の変化はステロイド結合活性
を排除する。このドメインにおける挿入変異もまたステ
ロイド結合特性を不活性化する（実験の部ＩＩを参
照）。しかしながら、ホルモン結合領域の欠失は構成的
に活性な受容体を生じさせ、このことはこのドメインが
転写活性化において調節的役割を演じていることを示す
（Ｖ．ＧｉｇｕｅｒｅおよびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発表デー
タ）。これらのデータは、ｖ−ｅｒｂ−Ａがホルモンと
結合しそうもなく、むしろ甲状腺ホルモン受容体の構成
的に活性な形体であることを推測させる。甲状腺ホルモ
ン受容体としてのｅｒｂ−Ａの同定は、腫瘍の原因とな
る形質転換にエンハンサーおよびそれらの結合タンパク
質を巻き込む最初の直接的証拠を提供する。ＩＩＩ．Ｈ．調節遺伝子のスーパーファミリー ステロイド受容体とｖ−ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物との
類似性は、これらが原始的な受容体遺伝子から進化した
ものであると我々が提案するのに十分であった（Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ）。２つの驚くべき結果
がここに示した実験から得られた。第一は、ｅｒｂ−Ａ
原腫瘍遺伝子のファミリーの存在が甲状腺ホルモン受容
体と密接に関連した１種またはそれ以上の他の分子の存
在を暗示するということである。生理学的研究は第二の
クラスの甲状腺ホルモン受容体の存在を予告しなかっ
た。従ってこのファミリーの同定は発生およびホメオス
タシス調節の機構に新たな光を投げかけるかも知れな
い。これらの結果から得られた第二の驚くべき観察は、
甲状腺ホルモン受容体とステロイドホルモン受容体ファ
ミリーとの密接な関係である。この関係は、これらの分
子がすべてより複雑な真核生物の次第に高まる発生学的
および生理学的要求に適合すべく進化の過程で生じた調
節タンパク質のスーパーファミリーの一部でありうるこ
とを示している。ＩＩＩ．Ｉ．実験の部ＩＩＩに関連した図面の詳細な説
明 第ＩＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−ＡｃＤＮＡの制限地図および塩基
配列決定計画（Ａ）、並びにそのヌクレオチド配列およ
び推定上のアミノ酸配列（Ｂ）。ａ．複合制限地図に対
する２つのサブクローンｐｈｅＡ４およびｐｈｅＡ１２
の方向性。共通の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を線
状地図の上に示す。細線、非翻訳配列；斜線ボックス、
ｅｒｂ−Ａコード領域；矢印塩基配列を決定したＤＮＡ
フラグメント。ｂ．複合ｅｒｂ−Ａ ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を５′→３′の方向で示す。ウイルスｅｒｂ
−Ａタンパク質２１に関する翻訳オープン・リーディン
グ・フレームをヌクレオチド配列の上に示す。アデノシ
ン残基（約１３０個）がｐｈｅＡ１２の３′末端に存在
する。翻訳配列の上の番号はアミノ酸残基を示し、そし
てヌクレオチド番号はその配列の右側に示す。第ＩＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図の方法 ２つのヒト胎盤ラムダｇｔ１０ＤＮＡライブラリー（Ｈ
ｕｙｎｈら、１９８５）のそれぞれからの組換えファー
ジ（約１０６個は）は、ｐＡＥＶ−１１（Ｖｅｎｎｓｔ
ｒｏｍら、１９８０）から単離した５００ｂｐ Ｐｓｔ
Ｉフラグメント（ニック・トランスレーションを行なっ
たもの；Ｒｉｇｂｙら、１９７７）を用いてスクリーニ
ングした。ハイブリダイゼーション混合物は５０％ホル
ムアミド、１×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．１
％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２
Ｐ標識ＰｓｔＩフラグメント（比活性＝１×１０８ｃｐ
ｍ／μｇ）を含んでいた。２通りのニトロセルロースフ
ィルターを３７℃で１８時間ハイブリダイズさせ、０．
１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ
Ｎａｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）で２０分ず
つ３回洗い、そして増感紙を用いて−７０℃でオートラ
ジオグラフィーにかけた。２つのハイブリダイゼーショ
ン陽性クローンが単離され、それをｐＣＵ８のＥｃｏＲ
Ｉ部位にサブクローニングし、その後化学的切断方法に
より塩基配列を決定した（Ｍａｘａｍら、１９７７）。第ＩＩＩ−２図 ｖ−ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物、ヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−
Ａポリペプチド、およびヒトグルココルチコイド受容体
並びにヒトエストロゲン受容体のカルボキシ末端部分の
アミノ酸配列比較。ｖ−ｅｒｂ−Ａタンパク質（上段の
配列）とヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａポリペプチド（第二段
の配列）との翻訳アミノ酸配列は、対応する残基を整列
させることにより比較した。３個以上のアミノ酸配列の
同時比較用のコンピュータプログラム（Ｊｏｈｎｓｏｎ
ら、１９８６）は、ｃ−ｅｒｂ−Ａ、ヒトグルココルチ
コイド受容体（第三段のｈＧＲ配列；実験の部Ｉ、第Ｉ
−２（１）およびＩ−２（２）図を参照）、およびヒト
エストロゲン受容体（下段のｈＥＲ配列；Ｇｒｅｅｎ
ら、１９８６を参照）のカルボキジ末端アミノ酸配列
を、各配列の所定のセグメントの漸進的評価に基づいて
整列させるべく用いられた。少なくとも３種のポリペプ
チド間で一致するアミノ酸残基をボックスで囲った。２
種のｅｒｂ−Ａポリペプチド間のアミノ酸の一致は、各
欄の上段配列の上に星印で示した。ステロイド受容体間
のアミノ酸配列の同一性は、配列の下に十字形の印で示
した。ハイフン、ギャップは比較の際にアミノ酸の同一
性の数を最大とするために挿入した。４種のポリペプチ
ド間に保存されたシステイン残基は黒地に白で印刷し
た。第ＩＩＩ−３（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 ｃ−ｅｒｂ−Ａ ＤＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡ
のサザン分析および染色体マッピング。Ａ．妊娠期間終
決後のヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、生成物を０．８％アガロースゲルで分離した。ＤＮ
Ａはニトロセルロース紙に移行させ（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ，１９７５）、ｐｈｅＡ４由来の４５０ｂｐ Ｓｓｔ
Ｉフラグメント（ニック・トランスレーションを行っ
て、比活性５×１０８ｃｐｍ／μｇとしたもの）を用い
て５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート
溶液、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮ
Ａ中でハイブリダイズさせた。フィルターを０．１×Ｓ
ＳＣ０．１％ＳＤＳ中で６０℃にて洗い、その後増感紙
を用いて−７０℃でＸ線フィルムに露光した。ラムダＨ
ｉｎｄＩＩＩＤＮＡマーカー（Ｋｂでのサイズ）をオー
トラジオグラムの左側に並べる。Ｂ．非ストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下での上記セクションａ
と同じｃ−ｅｒｂ−Ａプローブを用いた胎盤ＤＮＡの分
析。同じ試料を含む類似のブロットをセクションａのよ
うにハイブリダイズさせた（但し、３５％ホルムアミド
を使用）。ハイブリダイズしたフィルターは２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ中で５５℃にて洗い、その後上記の
如くＸ線フィルムに露光した。Ｃ．ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ
遺伝子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレー
ザー・サイトフルオロメトリー（Ｌｅｂｏら、１９８
４）により分離し、セクションｂで説明した非ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件下に、ｐｈｅＡ４
由来の１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ挿入物をプローブとして
使用して検索した。第ＩＩＩ−４（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａの発現。Ａ．ヒト細胞株およびヒト
胎盤からのＲＮＡのノザン分析。ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７
およびＩＭ−９細胞からの細胞質ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ
（１２μｇ）、またはＨＴ１０８０もしくは胎盤からの
全ポリ（Ａ）ＲＮＡはホルムアルデヒドを含有する１％
アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロースに移行さ
せ（Ｔｈｏｍａｓ，１９８０）、そしてニック・トラン
スレーションを行った６５０ｂｐ ＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ
ＩｐｈｅＡ４フラグメントを用いて検索した。細胞質Ｒ
ＮＡは等張緩衝液および０．５％ＮＰ４０を用いて細胞
株から分離し、一方胎盤ＲＮＡはグアニジンチオシアネ
ートを用いて新鮮な組織から抽出した（Ｃｈｉｒｇｗｉ
ｎら、１９７９）。レーン１，ＨｅＬａ；レーン２、Ｈ
Ｔ１０８０；レーン３，ヒト胎盤；レーン４，ＩＭ−
９；レーン５，ＭＣＦ−７。Ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの
ｅｒｂ−Ａポリペプチドの合成。Ｔ７ポリメラーゼによ
り触媒されたＲＮＡ転写物を用いて合成した３５Ｓ−メ
チオニン標識産物は１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、フルオログラフィー（ＥＮ３ＨＡ
ＮＣＥ，ニューイングランドヌクレアー）にかけた。レ
ーン１，対照（ｍＲＮＡ不含）；レーン２，ｐｅＡ１０
２（アンチセンスＲＮＡ，４μｌ）；レーン３，ｐｅＡ
１０１（センスＲＮＡ，１μｌ）；レーン４，ｐｅＡ１
０１（４μｌＲＮＡ）。タンパク質標準のサイズ：ウシ
血清アルブミン，６６．２Ｋ；卵アルブミン，４．５
Ｋ；およびカルボニックアンヒドラーゼ，３１Ｋ。第ＩＩＩ−４（Ａ）および（Ｂ）図の方法 ｃ−ｅｒｂ−Ａの全コード領域を含むｐｈｅＡ１２由来
のＥｃｏＲＩ挿入物は両方の向きでｐＧＥＭ３（Ｐｒｏ
ｗｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社）のＥｃｏＲＩ部位へ挿入し
た。プラスミドＤＮＡのｐｅＡ１０１およびｐｅＡ１０
２をＨｉｎｄＩＩＩで線状となし、０．８％アガロース
ゲル上で精製し、そしてＴ７ポリメラーゼにより触媒さ
れるｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ合成のための鋳型として使
用した（実験の部Ｉを参照）。Ｐ６０クロマトグラフィ
ー後に、全核酸物質（２μｇ）はウサギ網状赤血球溶解
液系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社）中で３５Ｓ−
メチニオン（２５μＣｉ，１１００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）
を用いて最終容量２５μｌにてタンパク質翻訳を行わせ
るべく使用した。第ＩＩＩ−５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）図 ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａポリペプチドへ
の甲状腺ホルモンの結合。Ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成
したｅｒｂ−Ａポリペプチドの１２５Ｉ−Ｔ３結合のス
カッチャード分析。ｅｒｂ−Ａポリペプチド（全容量２
７ｍｌ中のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳混合物からの２μｌ）は
異なる１２５Ｉ−Ｔ３濃度での結合した標識ホルモン量
および遊離の標識ホルモン量を測定するためにヒドロキ
シルアパタイトを用いて特異的甲状腺ホルモン結合活性
について検定した（Ｇｒｕｏｌ，１９８０）。Ｂ．ｉｎ
ｖｉｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａポリペプチドへの
１２５Ｉ−Ｔ３結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競
合。ｐｅＡ１０１（センス鎖）−プログラム化反応から
の試料（２μｌ）は、次第に増加する濃度の未標識甲状
腺ホルモンまたは類似体（標識ホルモンと競合する）と
共に１２５Ｉ−Ｔ３標識結合反応（Ｓａｍｕｅｌｓら、
１９７４）において使用した。特異的に結合した甲状腺
ホルモンを競合化合物の濃度に対してプロットする。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａポリペプチ
ドへの１２５Ｉ−Ｔ３結合に対するトリヨードチロニン
異性体の競合。結合反応は次第に増加する濃度のＴ３異
性体を加えて上記の通りに行った。ｅｒｂ−Ａに結合し
た甲状腺ホルモンは縦座標上にプロットする。Ｄ．０．
４Ｍ ＫＣｌ ＨｅＬａ細胞核抽出物への１２５Ｉ−Ｔ
３結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。ＨｅＬａ
細胞核は０．４Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液で抽出した（Ｓ
ａｍｕｅｌｓら、１９７４）。タンパク質抽出物（２５
μｇ）（バイオーラッドタンパク質検定法により測定）
は次第に増加する濃度の甲状腺ホルモンおよび類似体を
含む標準結合反応混合物中で０．６ｎＭ１２５１−Ｔ３
と混合した（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４；Ｌａｔｈａ
ｍら、１９７６）。第ＩＩＩ−５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）の方
法 標識１２５Ｉ−３，３′，５−トリヨード−Ｌ−チロニ
ン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社製，２２
００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ，０．３ｎＭ最終）はＴ３−結合
緩衝液（０．２５Ｍシュークロース，０．２５Ｍ ＫＣ
ｌ，２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ
ＭｇＣｌ２，２ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭジチオトレイト
ール（ＤＴＴ））（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４）中で
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳混合物（第ＩＩＩ−４（Ａ）にて
説明）中で合成したｅｒｂ−Ａポリペプチドと最終容量
２５０μｌにて０℃で２時間混合した。特異的ホルモン
結合は１０００倍過剰の未標識ホルモンを加えることに
より測定し、セファデックスＧ−２５微粒子（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）０．９×４．０ｃｍカラムから排除容量
中に溶出される放射能を計数することにより検定した
（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４）。第ＩＩＩ−６図 ステロイドホルモン受容体と甲状腺ホルモン受容体との
模式図による比較。第ＩＩＩ−２図に示した受容体分子
のアミノ酸配列を模式図で表す。ＣＹＳ，受容体タンパ
ク質に見られる推定上のＤＮＡ結合ドメインをコードす
るシステインに富む領域（Ｃｙｓに富む領域の残基は：
ｃ−ｅｒｂ−Ａ，１０２−１６９；ｈＧＲ，４２１−４
８６；ｈＥＲ，１８５−２５０）；Ｃｏｒｔｉｓｏｌ，
ＥｓｔｒａｄｉｏｌおよびＴ３／Ｔ４，カルボキシル末
端のホルモン結合領域；ＩＭＭ，ヒトグルココルチコイ
ド受容体の免疫原領域。ボックスを分離する数学，垂直
破線間の受容体種同士のアミノ酸同一性のパーセンテー
ジ；ｈＥＲ，ヒトエストロゲン受容体；ｈＧＲ，ヒトグ
ルココルチコイド受容体；ｈｃ−ｅｒｂ−Ａベータ，ヒ
ト甲状腺ホルモン受容体。
【０００９】実験の部ＩＶ ヒトミネラロコルチコイド受容体相補ＤＮＡのクローニ
ング：グルココルチコイド受容体との構造的および機能
的類似性ＩＶ．Ａ．概要 推定上の１０７キロダルトンのポリペプチドをコードす
る新しい遺伝子を単離するために、ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）相補ＤＮＡとの低ストリンジェン
トハイブリダイゼーションを使用した。発現試験によ
り、高親和性でもってアルドステロンと結合し、そして
アルドステロンに応答して遺伝子転写を活性化するその
能力が証明され、それによりヒトミネラロコルチコイド
受容体（ｈＭＲ）としてのその本性が確立される。この
分子はまたグルココルチコイドに対して高い親和性を示
し、グルココルチコイド応答性プロモーターを刺激す
る。ｈＭＲおよびｈＧＲは一緒になって、ホルモン結合
特性、標的遺伝子相互作用および組織特異的発現パター
ンが組合わされた様式で使用され、複雑な生理学的コン
トロールを達成する予期せぬ機能的多様性をもたらす。ＩＶ．Ｂ．序論 視床下部−下垂体−副腎軸はいろいろな神経内分泌の入
力信号を統合して、副腎コルチコステロイドの合成およ
び分泌を調節している。これらのステロイドホルモンは
数組の標的遺伝子の転写を直接的に調節する細胞内受容
体タンパク質との相互作用によって成長、発生およびホ
メオスタジスに影響を及ぼす（１，２）。２つの受容体
系がコルチコステロイドのために定められ、これらはグ
ルココルチコイド受容体（ＧＲ）およびミネラロコルチ
コイド受容体（ＭＲ）と名づけられた。初期の機能検定
により、コルチコステロイドは肝臓へのグルコーゲン貯
蔵を促進するそれらの作用によりグルココルチコイド、
または腎臓によるナトリウム貯留を促進するそれらの作
用によりミネラロコルチコイドのいずれかに類別され
た。しかしながら、それぞれのステロイドクラスはその
同族受容体とのみ相互作用するように制限されておら
ず、とりわけグルココルチコイドは実質上のミネラロコ
ルチコイド活性を示すことができる（１−３）。今や、
ＭＲはグルココルチコイドとミネラロコルチコイドの両
方に対して有意なｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性を有すること
が明らかである（３，４）。グルココルチコイドの循環
濃度はアルドステロン（代表的なミネラロコルチコイ
ド）よりも数段高いので、ＭＲのグルココルチコイド活
性化は機能的に意義がある。腎および腸のような組織の
分泌上皮はアルドステロンに応答して電解質と水のバラ
ンスを調節しているが、別の機構はこれらの組織にミネ
ラロコルチコイドに対する感受性を付与することが可能
である（５）。他の組織において発現されるＭＲの機能
的役割は全く明らかになっていないが、脳での生理学的
応答はＭＲとグルココルチコイドとの相互作用の結果と
して起こる（５−７）。高親和性の放射性標識リガンド
の利用可能性にもかかわらず、ＭＲは精製が困難であ
り、その生化学的性質はＧＲに比べて十分に理解されて
いない。ＭＲの研究に分子生物学の技術を応用すること
により、ＭＲの生化学的同定が容易となり、終局的にそ
の転写制御下にある遺伝子およびそれらの産物がホメオ
スタシスにおいて演ずる役割が理解されるであろう。グ
ルココルチコイド（実験の部Ｉおよび文献８，９を参
照）、エストロゲン（１０）、およびプロゲステロン
（１１）受容体の分子クローニングはそれらの一次アミ
ノ酸構造の決定およびこのファミリーの調節タンパク質
に共通の機能的ドメインの推定を可能にした。グルココ
ルチコイド（実験の部ＩＩおよび文献１２を参照）およ
びエストロゲン（１３）受容体の実験的解析はシステイ
ン、リシンおよびアルギニンに富む中央に位置するＤＮ
Ａ結合ドメイン、およびステロイドホルモンが作用する
カルボキシル末端領域を明らかにした。ＧＲの機能的研
究は、カルボキジル末端ヘのホルモン結合が、受容体と
ＤＮＡとの相互作用および転写の活性化を可能にすべく
ＤＮＡ結合領域をアンマスキング（ｕｎｍａｓｋｉｎ
ｇ）すると示唆した（１４，１５）。ステロイド受容体
および甲状腺ホルモン受容体のシステインに富むＤＮＡ
結合領域の比較は、これらの分子間に高度の関連性を示
す（１６）。不変のシステイン残基は、Ｚｎ２＋金属原
子の配位がキセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）５Ｓ遺伝子第
ＩＩＩＡ転写因子について提案されたものに類似したＤ
ＮＡ結合の構造的形状を維持するという仮説へ導いた
（１７）。また、ステロイド受容体ファミリーのステロ
イド結合領域も、共通の原始的前駆物質からの種々の受
容体クラスの進化と矛盾しない実質的保存（ｃｏｎｓｅ
ｒｖａｔｉｏｎ）を示す（１１，１６）。我々はヒトグ
ルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）に密接に関連した遺
伝子産物を単離するために、ステロイドホルモン受容体
間の構造的類似性を利用した。ｈＧＲプローブとの非ス
トリンジェントハイブリダイゼーションにより、ｈＧＲ
のシステインに富む配列と高度に関連したヒトゲノムＤ
ＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡをプローブと
して使用して、我々はシステインに富む領域からカルボ
キシル末端までのｈＧＲと強い相同性を有する分子をコ
ードする相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得た。細胞内で発現
させたとき、この分子は高い親和性でもってアルドステ
ロンと結合し、しかもマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）のロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）のアル
ドステロン応答性転写を活性化する。このヒトミネラロ
コルチコイド受容体のリガンドおよびＤＮＡ配列特異性
とｈＧＲのそれらとのオーバーラップは、これらの調節
分子に対して伝統的に割り当てられている別々の役割が
再考されるべきであることを示唆している。ＩＶ．Ｃ．ｈＭＲ ｃＤＮＡの分離 グルココルチコイド受容体関連遺伝子を同定するため
に、ヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画化し、そしてその分
画をｈＧＲ１．２（ＤＮＡ結合ドメインをコードする配
列を含むｈＧＲ ｃＤＮＡの１１００ｂｐフラグメン
ト）とハイブリダイズさせた（実験の部Ｉおよび文献１
５を参照）。サザンブロット分析は低ストリンジェント
ハイブリダイゼージョン条件に特有の数本のバンドを示
した（第ＩＶ−１，（Ａ）および（Ｂ）図を比較された
い）。２．５キロ塩基対（Ｋｂｐ）のＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメント（第ＩＶ−１（Ｂ）図中に星印で示したも
の）は他のハイブリッド形成バンドからよく分割され、
直接的ゲノムクローニングに適していると判定された。
ヒト胎盤からのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡはアガロース
ゲル上で大きさに基づいて分画化し、そしてゲノムライ
ブラリーの構築のために２．５Ｋｂｐ領域を分離した。
その後、このラムダｇｔ１０ライブラリーはプローブと
してｈＧＲ１．２を用いて低ストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でスクリーニングした。１つの陽
性ゲノムクローン（ラムダＨＧＨ）からの挿入物はニッ
クトランスレーションを行って、高ストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でのサザンブロットにおい
てプローブとして使用した（第ＩＶ−１（Ｃ）図）。
２．５Ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩシグナルは非ストリンジ
ェント条件下で見られたものに相当し、所望のゲノムフ
ラグメントの一部が分離されたことを示している。ラム
ダＨＧＨ由来の挿入物の塩基配列解析は、イントロン配
列によってはさまれた１４０塩基対（ｂｐ）のエクソン
を明らかにした（（第ＩＶ−１（Ｄ）図）。この全エク
ソンは相同性のｈＧＲ ｃＤＮＡ配列と６８％のヌクレ
オチド同一性を有するが、１０４個のヌクレオチドのう
ち８５個を保存する領域がその交差ハイブリダイゼーシ
ョン特性を与えるものと思われる。この高度に保存され
た領域はｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの一部に対応する
（１５）。ラムダＨＧＨエクソンは１６個の非交換残基
から始まってその後にステロイドホルモン受容体に特徴
的な高度に保存されたシステイン残基の最初の残基が続
く４６個のアミノ酸をコードしている（８−１１）。次
の３０個の残基のうち、２８個がｈＧＲと同一である。
これらの分析は、ｈＧＲｃＤＮＡ配列中に存在するもの
と関連があるが、それとは明らかに異なる配列を含むゲ
ノムフラグメントが分析されたことを示す（実験の部Ｉ
を参照）。ラムダＨＧＨからの挿入物は、このｈＧＲ関
連遺伝子に対応するクローンについて、ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用
した。ミネラロコルチコイド受容体はこの種の遺伝子に
よってコードされる候補物質であると考えられた。腎臓
はミネラロコルチコイド応答性組織であることが知られ
ているので、数人のヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。１１個の陽性クローンが１０６組変
えファージ当たり３〜４の頻度でこれらのラムダｇｔ１
０ライブラリーから分離された。２つの重複するクロー
ン、ラムダｈＫ２およびラムダｈＫ１０、をヌクレオチ
ド配列分析にかけ、合わせて５８２３ヌクレオチドに及
ぶことが見出された（第ＩＶ−２（Ａ），ＩＶ−２
（Ｂ）−１およびＩＶ−２（Ｂ）−２図）。ラムダＨＧ
Ｈのエクソン−イントロン境界はこれらのｃＤＮＡクロ
ーンの塩基配列を決定することにより証明した。ラムダ
ｈＫ１０（ヌクレオチド１から３７５０まで）は大きい
オープン・リーディング・フレームを含み、完全な一次
アミノ酸配列を予告している。ラムダｈＫ２からのＤＮ
Ａ挿入物はヌクレオチド８０２から５８２３にまで伸長
しているが、２２３５から２５８６までの３５１ｂｐ内
部欠失を有している。３個の別のクローンも試験し、欠
失領域がラムダｈＫ１０と同じ構造であることを確かめ
た。ラムダｈＫ２における欠失はクローニングアーチフ
ァクト（人工産物）を表すか、あるいはまれなメッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のスプライシングエラー（切
り継ぎの誤り）を表すと思われる（１８）。ヌクレオチ
ド３７５０の下流側の報告された３′非翻訳領域の配列
はラムダｈＫ２から誘導される。これらの２つのｃＤＮ
Ａの複合配列をｈＭＲと名づける（第ＩＶ−２（Ａ）
図）。読み枠内終止コドン（１３６位）の下流側に最初
の読み枠内ＡＴＧ（２２３位）があり、ｈＭＲは少なく
とも２１６ヌクレオチドの５′非翻訳領域を有してい
る。この最初のＡＴＧをとりまく配列はＫｏｚａｋ（１
９）によって示されたコンセンサス配列と一致する。こ
の推定されたイニシエーターメチオニンコドンは、９８
４個のアミノ酸をコードする大きいオープン・リーディ
ング・フレームの最初の部分をなす。終止コドン（３１
７５位）に続いて、７０ヌクレオチドーポリ（Ａ）（ポ
リアデニル化）尾部の１７ヌクレオチド上流にポリアデ
ニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有する２．６Ｋｂの
３′非翻訳領域が存在する。長い３′非翻訳領域はステ
ロイドホルモン受容体のｍＲＮＡに特徴的な性質である
（実験の部Ｉおよび文献９−１１を参照）。ＩＶ．Ｄ．ＤＮＡ−およびホルモン−結合領域 ｈＭＲ ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、ｈ
ＧＲと密接に関連したステロイドホルモン受容体の構造
的特性を有する。ｈＭＲの推定上のアミノ酸配列とｈＧ
Ｒのそれとの比較により、ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン
およびステロイド結合ドメインの両方と高度に相同であ
ることが立証された。ｈＭＲ遺伝子は７７７残基のｈＧ
Ｒよりもはるかに大きく、９８４個のアミノ酸からなる
タンパク質（推定分予量１０７ＫＤ）をコードする。こ
の大きさの不一致は主としてｈＧＲと相同でない大きい
アミノ末端のためである。この領域のサイズおよび配列
の相当な不均一性はグルココルチコイド、エストロゲン
およびプロゲステロンのそれぞれの受容体間に存在する
（実験の部Ｉ；文献９−１１を参照）。アミノ酸相同は
６８残基中９４％のアミノ酸が同一である中央のＤＮＡ
領域から始まる（第ＩＶ−３図）。他のステロイドホル
モン受容体に見られる配列保存の比較的低い領域が、Ｄ
ＮＡ結合ドメインとカルボキシル末端ステロイド結合ド
メインとを隔てている。この領域は２つのドメイン間の
分子ヒンジ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｉｎｇｅ）として役
立つことが推測された（実験の部ＩＩおよび文献１３を
参照）。ｈＧＲとの比較は、ｈＭＲのこの領域が反復ヌ
クレオチド配列によってコードされる４個のグルタミン
それに続く８個のプロリンの配列を含む２４個の追加の
アミノ酸を含むことを示す。起源および機能に関してこ
の例外的配列の意義は明らかでないが、構造を切断する
プロリンはヒンジ領域と一致する。ｈＭＲとｈＧＲのカ
ルボキシル末端の２５０個のアミノ酸を比較すると、５
７％のアミノ酸同一性および多数の保存的アミノ酸置換
が見られる。これらの置換のいくつかはステロイドホル
モンとの相互作用に必要な疎水領域を維持している。ＩＶ．Ｅ．発現およびホルモン結合 我々はグルココルチコイド受容体機能を調べるために、
サル腎臓細胞株ＣＶ１およびその誘導的（すなわち、Ｓ
Ｖ４０Ｔ抗原−形質転換）細胞株ＣＯＳ−１（ＣＯＳと
呼ばれる）のトランスフェクションを使用した（実験の
部ＩＩを参照）。トランスフェクションされたｈＭＲか
らの高レベルのポリペプチド発現は、トランスフェクシ
ョンした細胞によるステロイド結合実験を容易にするた
めに不可決であった。ＳＶ４０複製起点を含むプラスミ
ドはＣＯＳ細胞内で高コピー数に複製することができる
ので、ｈＧＲの研究において以前に使用したｐＲＳｈＧ
Ｒアルファと類似したｈＭＲコード配列用の発現ベクタ
ーを構築した。プラスミドｐＲＳｈＭＲはラウス肉腫ウ
イルス由来のプロモーターの支配下にあるｈＭＲコード
配列、およびＳＶ４０複製起点を含む（第ＩＶ−４
（Ａ）図）。ｈＭＲタンパク質のリガンド特異性はｐＲ
ＳｈＭＲでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの
細胞質ゾル抽出物を調製することにより調べた。トラン
スフェクションの２日後に細胞を回収して、デキストラ
ン処理チャーコール検定によりホルモン結合を測定し
た。疑似トランスフェクションした対照の抽出物は〔３
Ｈ〕アルドステロンに対して特異的結合活性を全く示さ
なかったが、ｐＲＳｈＭＲでトランスフェクションした
細胞からの抽出物は高親和性でもって有意量の〔３Ｈ〕
アルドステロンと結合した。スカッチャード分析によ
り、〔３Ｈ〕アルドステロン結合に関する解離定数（Ｋ
Ｄ）は１．３ｎＭと測定された（第ＩＶ−４（Ｂ）
図）。この値はミネラロコルチコイド受容体へのアルド
ステロン結合について報告されたものとよく一致してい
る（２，２０）。その後、１−，１０−または１００−
倍過剰モル量で存在させたときに、結合を５ｎＭ
〔３Ｈ〕アルドステロンと競合する異なる未標識ステロ
イドの能力を調べるために、競合試験を行った（第ＩＶ
−４（Ｃ）および（Ｄ）図）。これはｈＭＲに対するこ
れらのステロイドのそれぞれの相対親和性の度合を提供
した。これらの実験の結果は、アルドステロン、コルチ
コステロン、デオキシコルチコステロン、ヒドロコルチ
ゾン（コルチゾル）の全てがｈＭＲに対して非常に類似
した親和性をもつことを示した。デキサメタゾン、プロ
ゲステロン、およびスピロノラクトンは比較的弱い結合
親和性を示し、一方エストラジオールはｈＭＲの結合に
対して極めて弱く競合した。結局、この親和性の差異は
ｈＭＲがヒトミネラロコルチコイド受容体をコードする
ことを表している（２，２０）。ＩＶ．Ｆ．転写活性化 ステロイドホルモン作用は標的遺伝子転写のホルモン依
存性調節により特徴づけられる。ＣＶＩ細胞内にトラン
スフェクションされたｈＧＲによる転写調節検定（実験
の部ＩＩを参照）がｈＭＲ用に改変された（第ＩＶ−５
（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図）。ステロイド結合検定
に用いた発現プラスミドｐＲＳｈＭＲは、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌
遺伝子に連結されたＭＭＴＶ−ＬＴＲを含むＧＭＣＡＴ
と呼ばれるリポータープラスミドと共に同時トランスフ
ェクションされた。こうして、ＣＡＴ活性はＭＭＴＶプ
ロモーターの転写活性に関する酵素検定を与える。ＭＭ
ＴＶプロモーターはＧＲとの相互作用を介してグルココ
ルチコイド応答性を与える数種のグルココルチコイド応
答因子（ＧＲＥ）、エンハンサー様ＤＮＡ配列を含む
（２１）。ｈＭＲは、そのＤＮＡ結合ドメインがｈＧＲ
のそれとほぼ同一であるために、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを認
識できるかも知れないと考えた。ＣＶＩ細胞をｐＲＳｈ
ＭＲおよびＧＭＣＡＴで同時トランスフェクションした
とき、我々は十分なＣＡＴ活性を観察した。この活性は
添加したアルドステロンの影響を受けず、このことはト
ランスフェクションされたｈＧＲと対照的に、ｈＭＲを
十分に活性化するに足るホルモンが血清（ウシ胎児血
清，５％）中に存在していたことを示唆する（第ＩＶ−
５（Ｂ）図）。チャーコール処理血清（２２）の存在下
では、ＣＡＴ活性は外因性アルドステロンの添加に応答
するようになり、このことはｈＭＲｃＤＮＡが機能的ス
テロイドホルモン受容体をコードすることを示してい
る。ｈＭＲはまたグルココルチコイド・アゴニストのデ
キサメタゾンによって活性化されたが、ｈＧＲは生理学
的濃度以上（１０ｎＭ）のアルドステロンにさえも応答
しなかった。ＩＶ．Ｇ．組織特異的発現 我々はノザン・ブロット・ハイブリダイゼージョンによ
りラット組織内でのｈＭＲ ｃＤＮＡに相応するＭＲ
ｍＲＮＡの発現を調べた。脳、下垂体および心臓ばかり
でなく、腎臓（２４）や腸（２５）のような古典的ミネ
ラロコルチコイド標的組織はｈＭＲに相応するｍＲＮＡ
を含んでいた（第ＩＶ−６図）。腎臓におけるアルドス
テロン感受性細胞は主として遠位の皮質性集合管に局限
されており（２）、それ故にこの組織によるわずかな発
現レベルは意外なことではなかった。高レベルのＭＲ
（Ｉ型コルチコステロイド結合部位）はラットの脳、特
に海馬体（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｏｒ ｍａｔｉ
ｏｎ）において報告された（４，６）。切開した海馬Ｒ
ＮＡと全脳から調製したＲＮＡとを比較した際に、我々
は海馬中に著しく豊富なｍＲＮＡを見出した。アルドス
テロン結合は下垂体（２６）、培養大動脈細胞（２７）
および脾臓（２８）において報告されているが、この種
の活性は筋肉では報告されていない。肝臓はＧＲを発現
するが、検出しうる高親和性のアルドステロン結合活性
を示さず（２９）、予期されるように肝臓ＲＮＡとのハ
イブリッド形成は観察されなかった。ｈＧＲ ｃＤＮＡ
の類似部分を用いる同じノザン・ブロットの再検索は異
なる大きさのｍＲＮＡ種とのハイブリッド形成を示し、
ＭＲとＧＲとが異なる組織特異的発現パターンを示すこ
とが分かった。ＩＶ．Ｈ．染色体マッピング ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の染色体位置を決定
するために、我々はヒト染色体の異なる組合せを保有す
るネズミ−ヒト体細胞ハイブリッドのパネルに対してｈ
ＭＲを調べた（３０）。ミネラロコルチコイド受容体遺
伝子に特異的なＤＮＡフラグメントは、１５種のハイブ
リッド細胞株においてヒト染色体４と一致して分離され
た。染色体５（グルココルチコイド受容体遺伝子部位）
を含む他のすべてのヒト染色体については、不一致の分
離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が観察された（実験の部
Ｉおよび文献３１を参照）。染色体４への割当てを確認
するために、我々はサザン分析を用いてｈＭＲ遺伝子に
ついて限定組の微小核ハイブリッド（それぞれは１〜３
本のヒト染色体を保有する（３２））を試験した（第Ｉ
Ｖ−７図）。ラムダｈＫ２のコード部分により検出され
た６本のＥｃｏＲＩフラグメントは、このハイブリッド
パネルにおいて染色体４と同時分離される。とりわけ、
ｈＭＲ遺伝子は唯一のヒト染色体として染色体４を保有
する細胞株ＨＤｍ−１１３２Ｂ中に存在する。ＩＶ．Ｉ．副腎コルチコステロイドの生理機能との密接
な関係 ヒトミネラロコルチコイド受容体ｃＤＮＡはヒトグルコ
コルチコイド受容体に高度に相同であるポリペプチドを
コードする。ＤＮＡ結合ドメインにおいて、ｈＭＲはｈ
ＧＲと約９４％のアミノ酸同一性を維持するが、カルボ
キシル末端に局在化されるステロイド結合ドメインは５
７％の同一性を有する。最近報告されたウサギプロゲス
テロン受容体（ｒＰＲ）配列もまたｈＭＲとの高度な関
連性をもっている。ｈＧＲおよびｒＰＲ構造ドメインと
ｈＭＲのそれとのアミノ酸同一性の比較（第ＩＶ−８
図）は、これらの機能的に異なる調節タンパク質の驚く
べき類似性を示す。ｈＭＲとｒＰＲとの相同性はｈＧＲ
−ｈＭＲ比較にほとんど一致し、ＤＮＡ結合ドメインで
は９０％のアミノ酸を共有し、そしてステロイド結合ド
メインでは５６％を共有していた。対照的に、ｈＭＲと
ヒトエストロゲン受容体（１０）との同一領域の比較
は、ＤＮＡ結合ドメインにおいて５６％の同一性および
ステロイド結合ドメインカルボキジル末端において２１
％の配列同一性を示す。ｈＭＲ，ｈＧＲおよびｒＰＲに
よって共有される構造的相同度およびそれらのリガンド
の構造的関連性は、それらがステロイドホルモン受容体
のサブファミリーから成ることを示唆している。一時的
トランスフェクションによるＣＯＳ細胞内でのｈＭＲポ
リペプチドの発現は、そのステロイド結合能の評価を可
能にした。これらの分析結果は、ｈＭＲｃＤＮＡがヒト
ミネラロコルチコイド受容体をコードしていることを明
らかにした。スカッチャード分析は、ｐＲＳｈＭＲでト
ランスフェクションした細胞からの抽出物が１．３ｎＭ
のＫＤ値でもって〔３Ｈ〕アルドステロンと結合するこ
とを示した。ＭＲと結合するアルドステロンの報告され
たＫＤ値は０．５〜３ｎＭの範囲である（２）。これは
この遺伝子産物をヒトミネラロコルチコイド受容体とし
て定める際のただ１つの最も重要な基準である。ステロ
イド結合競合実験は、ｈＭＲのこの同定をさらに支持し
た。ミネラロコルチコイドのデオキシコルチコステロン
およびグルココルチコイドのコルチコステロンおよびコ
ルチゾルはアルドステロンそれ自体と同様に競合する
が、一方合成グルココルチコイドのデキサメタゾンおよ
びブロゲステロンはｈＭＲに対して比較的低い親和性を
有する。ｈＭＲ，ｈＧＲおよびｒＰＲの推定上のステロ
イド結合ドメインにおける十分なアミノ酸配列同一性
は、これらの受容体の類似リガンド結合特性とよく合っ
ている。ミネラロコルチコイド受容体、グルココルチコ
イド受容体およびプロゲステロン受容体はミネラロコル
チコイド、グルココルチコイドおよびプロゲスチンの類
似した２１−炭素原子構造間を識別するのに限られた能
力を示す。この特異性の欠如は特にＭＲとＧＲに当ては
まる。例えば、ＭＲはアルドステロンと等しい親和性で
もってグルココルチコイドと結合する。実際に、別の機
構がアルドステロンへの選択的応答を与える腎臓のよう
な組織においてのみ、ＭＲは古典的ミネラロコルチコイ
ド受容体として機能するのかも知れない（３，５）。Ｍ
Ｒはまたプロゲステロンと高い親和性で、しかしコルチ
コステロイドに対するその親和性よりも低い親和性でも
って結合する。プロゲステロンはミネラロコルチコイド
作用の部分アゴニストまたはアンタゴニストとして作用
するいくつかの徴候があり（３３）、またグルココルチ
コイドはミネラロコルチコイド受容体への結合において
十分なアゴニストとして作用するかどうか明らかでな
い。同様に、ＧＲは２０〜４０ｎＭのＫｄ値でグルココ
ルチコイドと結合し、それは２５〜６５ｎＭのＫｄ値で
アルドステロンと結合する（２）。従って、ＭＲとＧＲ
のホルモン結合特性間の重要な差異はリガンド特異性の
それではなく、むしろコルチコステロイドに対する高親
和性対低親和性受容体の差異である。ｈＭＲのｉｎ ｖ
ｉｖｏ機能は血清コルチゾン結合タンパク質のトランス
コルチンによって複雑になっている。このタンパク質は
コルチゾルを結合封鎖し、その特異な分布のために、ト
ランスコルチンは局部のグルココルチコイド濃度に影響
を及ぼすであろう。腎臓における高レベルのトランスコ
ルチンは血漿からの利用可能なコルチゾルを減少させ
て、アルドステロン感受性を与え、一方脳における低レ
ベルのトランスコルチンは、中枢神経系において、グル
ココルチコイドが主なｈＭＲリガンドでありうることを
示唆するであろう。従って、ｈＭＲのための好適な生理
学的リガンドは受容体発現の部位に応じて明らかに変化
する（３）。このモデルおよび他のモデル（５）は、よ
り一層高いレベルの競合性グルココルチコイドにもかか
わらず、アルドステロンへの若干の組織の応答性を説明
するために提案されたものである。ｈＭＲとｈＧＲのＤ
ＮＡ結合ドメイン間の相同度（この保存された６８残基
領域中で４個のアミノ酸残基のみが相違する）は、これ
らの受容体が類似の調節因子を認識しうることを示唆す
る。アルドステロンおよびデキサメタゾンの両方に応答
してトランスフェクションされたｈＭＲがＭＭＴＶ−Ｌ
ＴＲを活性化することはこの結論を支持するが、プロゲ
ステロン受容体もまたこのプロモーターを調節すること
が立証されている（２１）。さらに、ＤＮＡ結合ドメイ
ンにおけるｈＭＲとｈＧＲの差異、またはこれらの分子
の高度に異なるアミノ末端のような他の領域における差
異が、この検定では立証できないやり方で標的遺伝子特
異性に影響を及ぼすのかも知れない。しかしながら、我
々はｈＭＲおよびｈＧＲによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写
調節を利用して、ミネラロコルチコイドおよびグルココ
ルチコイドによるそれらの活性化を調べた。ｈＭＲ応答
は１０ｎＭアルドステロンまたはデキサメタゾンの場合
にほぼ等しかった。一方ｈＧＲはこの検定においてデキ
サメタゾンによって活性化されたが、アルドステロンに
は不感受性であった。外因性コルチゾルに応答するｈＭ
Ｒによる転写活性化も観察された。これらのデータは、
トランスフェクションした細胞において、ミネラロコル
チコイドとグルココルチコイドの両方がｈＭＲ媒介遺伝
子転写を活性化しうることを示している。この機能的特
性に基づいて、我々はｈＭＲが副腎コルチコステロイド
に対して高度に応答し、それ故にグルココルチコイド受
容体として機能しうると結論を下した。コルチコステロ
イドに協調応答するミネラロコルチコイド受容体の薬理
学的および生理学的機能を明らかにするほかに、ｈＭＲ
ｃＤＮＡの分離は多数の病気、なかでも高血圧および
偽低アルドステロン症（ｐｓｅｕｄｏ ｈｙｐｏ ａｌ
ｄｏｓｔｅｒｏｎｉｓｍ；ＰＨＡ）におけるｈＭＲの役
割の証明をうながす。ミネラロコルチコイドと高血圧の
関連性は数十年の間認められており、ｈＭＲ媒介ナトリ
ウム貯留および血液量の増加がいくつかの形態の高血圧
症に部分的に関与しているのかも知れない（３４）。Ｐ
ＨＡは正常レベルまたは高レベルのアルドステロンへの
応答性の欠如によって特徴づけられる常染色体劣性疾患
である。最近の研究により、この疾患をもつ患者では高
親和性アルドステロン結合部位が減少しているか又は完
全に消失していることが証明され（３５）、このことは
ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の欠陥により生ずる
と思われる。ｈＭＲ遺伝子の染色体マッピングはＰＨＡ
の遺伝子座が染色体４に存在することを示唆する。機能
的ｈＭＲのクローニングおよび発現は予期しない考察を
もたらし、生理学的複雑性の下に横たわる機構への新た
な興味を剌激し、そして遺伝子ネットワークの協調調節
のための新しいモデルの開発および試験を可能にするで
あろう。ＩＶ．Ｊ．実験の部ＩＶに関連した図面の詳細な説明 第ＩＶ−１（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）図 ｈＧＲ遺伝子に関連したゲノム配列の分離。（Ａ）表示
した制限エンドヌクレアーゼで消化したヒト胎盤ＤＮＡ
の高ストリンジェントハイブリダイゼーション。ｈＧＲ
ｃＤＮＡ（ｈＧＲ１．２）をプローブとして使用し
た。ＨｉｎｄＩＩＩ消化により作ったラムダＤＮＡフラ
グメントマーカーの大きさ（キロ塩基対で表す）をオー
トラジオグラムの隣に示す。（Ｂ）低ストリンジェント
サザン分析。ＨｉｎｄＩＩＩレーンに星印ではさまれた
２．５ｋｂｐバンドは直接ゲノムクローニングの的にさ
れた配列であった。（Ｃ）ラムダＨＧＨと命名されたク
ローン中のこのゲノム配列の分離は、類似のサザンブロ
ットでプローブとして使用することにより証明される。
ラムダＨＧＨゲノムフラグメントは、このクローニング
から分離されたハイブリッド形成性内部ＥｃｏＲＩフラ
グメントを含む。（Ｄ）ラムダＨＧＨゲノムフラグメン
トのイントロン−エクソン構造およびｈＧＲとのその相
同性。ラムダＨＧＨに存在するｈＧＲ関連エクソンは、
その推定アミノ酸配列と共に黒地に白で示される。保存
されたシステイン残基は白い点で示される。アンダーラ
インを施した共通のスプライス供与部位および受容部位
を有するイントロン配列部分がエクソンの両側に存在す
ることが分かる。ｈＧＲとのヌクレオド相同性を下側に
示す。ｈＧＲのヌクレオド番号は実験の部Ｉで論じた第
Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図からのものであり、
また実験の部Ｉとしてここで使用した研究を発表したＨ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８５）（文献８）を参照さ
れたい。サザン分析のために、我々は妊娠期間終結後の
ヒト胎盤由来のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、消化産物を０．８％アガロースゲル上で分離した。
ＤＮＡをニトロセルロース紙へ移行させ、ストリンジェ
ントまたは非ストリンジェント条件下でハイブリダイズ
させた。ストリンジェントハイブリダイゼーションは５
０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ，ＮａＨ２
ＰＯ４，ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）、１×デンハート溶
液、０．１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮ
Ａおよびプローブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を用いて４２
℃で行った。非ストリンジェントハイブリダイゼーショ
ンの場合は、５０％ホルムアミドの代わりに３５％ホル
ムアミドを用いた。洗浄条件はストリンジェント条件の
場合が６０℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ
（標準ＮａＣｌ−クエン酸塩）、そして非ストリンジェ
ントフィルターの場合が５５℃で０．１％ＳＤＳを含む
２×ＳＳＣから成っていた。プローブとしてラムダＨＧ
Ｈ由来の３３８ｂｐ挿入物を用いたときの洗浄条件は、
６８℃で０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに変更した。
ラムタＨＧＨの分離のために、ヒト胎盤ＤＮＡ（３００
μｇ）はＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％低融点アガロー
スゲル（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ，ＦＭＣ）上で大きさによ
り分画化した。ゲルを０．５ｃｍの細片に切り取り、フ
ェノール抽出およびエタノール沈澱によりＤＮＡを精製
した。（Ｂ）において星印ではさまれたバンドに大きさ
の点で対応する分画からのＤＮＡ（２μｇ）は、Ｅｃｏ
ＲＩリンカーを付加するためにクレノウＤＮＡポリメラ
ーゼで修復した。ＥｃｏＲＩでの消化およびセファロー
ス４Ｂカラムによる過剰リンカーの除去後に、このＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩ消化ラムダｇｔ１０ＤＮＡに連結し、ｉ
ｎｖｉｔｒｏでパッケージした（カリフォルニア州サン
ジェゴ，ベクター・クローニング・システムズ社からの
ラムダアームおよび抽出物）。約４×１０５個の独立し
た組換え体を非ストリンジェントサザン分析のために使
用した条件と同じ条件下でスクリーニングしてラムダＨ
ＧＨを得た。第ＩＶ−２（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトミネラロコルチコイド受容体のヌクレオド配列およ
び一次アミノ酸構造。 （Ａ）いくつかの制限エンドヌクレアーゼ切断部位の線
図と整列したｈＭＲの複合構造（ＥｃｏＲＩ部位はヌク
レオド１および５８２３に示され、リンカーから誘導さ
れる）。この複合体は２つの重複するラムダｇｔ１０ク
ローンのラムダｈｋ１０およびラムダｈｋ２から組み立
てられた。ラムダｈｋ２の線図におけるかっこは３５１
ｂｐの欠失を示す。斜線ボックスはイニシエーターコド
ンと終結コドンを含む推定されたコード配列を示す。
（Ｂ）ｈＭＲの完全なヌクレオド配列およびその推定上
の一次アミノ酸配列。推定されたイニシエーターメチオ
ニンの上流にある読み枠内の５′終結コドンおよび４つ
の可能なポリアデニル化部位（ＡＡＴＡＡＡ）にはアン
ダーラインが施してある。ヒト腎臓ラムダｇｔ１０ライ
ブラリー（１８）はラムダＨＧＨ由来の挿入物を用い
て、このプローブによる高ストリンジェント条件下での
サザン分析のために記載した条件と同じ条件でスクリー
ニングした。それぞれのｃＤＮＡの重複欠失はサイクロ
ン高速欠失サブクローニング法（インターナショナル・
バイオテクノロジー）により得られた（３６）。欠失ク
ローンはジデオキシ法（３７）によりその塩基配列を決
定し、そしてギャップやアンビギュイティ（ａｒｎｂｉ
ｇｕｉｔｙ）を化学的切断法（３８）により解明した。
ＤＮＡ配列は編集してＤｅｖｅｒｅｕｘら（３９）およ
びＳｔａｄｅｎ（４０）のプログラムにより分析した。第ＩＶ−３図 ミネラロコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容
体のアミノ酸相同性。ｈＭＲの一次アミノ酸配列は、ギ
ャツプ（点で表示）を導入することにより最大の相同性
を得るように、ｈＧＲのアミノ酸配列と整列させた。数
字はｈＭＲについては第ＩＶ−２（Ｂ）−１およびＩＶ
−２（Ｂ）−２図から、そしてｈＧＲについては第Ｉ−
２（１）およびＩ−２（２）図から引用した。表示した
領域の上流には有意な相同性が全く見られなかった。縦
線は同一のアミノ酸残基を示す。矢印はＤＮＡ結合ドメ
イン（ＤＮＡ）およびステロイド結合ドメイン（ＳＴＥ
ＲＯＩＤ）の推定上の境界を示す。ＤＮＡ結合ドメイン
のアミノ末端境界は最初の保存システイン残基によって
任意に定められたが、カルボキシル末端限界はＤＮＡ結
合および転写活性化に必要な配列を示す突然変異誘発実
験に基づいて選択された（１５）。ＤＮＡ結合ドメイン
に続く数個の保存的塩基性残基もまたこれらの機能にと
って重要でありうる。アミノ酸相同領域により定められ
たステロイド結合ドメインの境界もまた突然変異分析と
一致する。アミノ酸残基の一文字略号はＡ，Ａｌａ；
Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ，
Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ：Ｋ，Ｌｙｓ；
Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；
Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；
Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ：およびＹ，Ｔｙｒである。第ＩＶ−４（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）図 発現されたｈＭＲのステロイド結合特性。（Ａ）ｈＭＲ
発現プラスミドｐＲＳｈＭＲの構造（４１）。（Ｂ）ｐ
ＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から調製さ
れた抽出物における〔３Ｈ〕アルドステロン結合のスカ
ッチャード分析。各点は２００μｌ中の抽出タンパク質
１００μｇを０℃で２．５時間インキュベーションする
３通りの実験により検定した。５００倍過剰の未標識ア
ルドステロンを用いて測定した非特異的結合は全カウン
ト数の約２０％であった。疑似トランスフェクションし
た細胞では特異的結合が全く見られなかった。（Ｃおよ
びＤ）トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の抽出物に
おける５ｎＭ〔３Ｈ〕アルドステロンと未標識ステロイ
ドとの競合結合。これらの競合実験を代表する２つの独
立した実験の結果を示す。冷却競合剤は１−，１０−，
１００−倍過剰モル量で存在していた。１００％結合の
値は、１０００倍過剰の未標識アルドステロンの存在下
で結合したｃｐｍ数を、競合剤の不在下で結合したカウ
ント数から減算することにより決定した。略号：ＡＬＤ
Ｏ，アルドステロン；ＤＯＣ，デオキシコルチコステロ
ン；ＤＥＸ，デサメタゾン；ＳＰＩＲＯ，スピロノラク
トン；Ｅ２１，１７β−エストラジオール；ＣＳ，コル
チコステロン；ＨＣ，ヒドロコルチゾン；およびＰＲＯ
Ｇ，プロゲステロン。亜集密的生長（ｓｕｂｃｏｎｆｌ
ｕｅｎｔ）ＣＯＳ細胞はＤＥＡＥ−デキストラン法（４
２）により培養皿当たり１０μ９のｐＲＳｈＭＲを用い
てトランスフェクションした。細胞は５％チャーコール
処理ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（イグール最少培地の
ダルベッコ修飾）中に２日間維持し、その後４０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａ２Ｍ０Ｏ４、５ｍＭジチオト
レイトール、アンチパイン（５μｇ／ｍｌ）、ロイペプ
チン（５μｇ／ｍｌ）および５００μＭ弗化フェニルメ
チルスルホニル中に収集した。１５０００×ｇで１０分
遠心した後、抽出物は結合に先立って１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌおよび５％グリセロールヘ調整した。〔３Ｈ〕アル
ドステロン（比活性７８Ｃｉ／ｍｍｏｌ，アマーシャム
社製）との標識反応は全容量２００μｌ中０℃で２．５
時間インキュベージョンし、その後２０μｌの５０％デ
キストラン被覆チャーコール（活性チャーコール：デキ
ストラン１０：１）と共に１０分間インキュベーション
した。１５０００×ｇ、４℃で２分遠心した後、上清中
の三重水素を液体シンチレーション分光光度計により定
量化した。第ＩＶ−５（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 トランスフェクションしたＣＶＩ細胞内でのｈＭＲおよ
びｈＧＲ発現プラスミドによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写
活性化。（Ａ）ＧＭＣＡＴの構造。このプラスミドはホ
ルモン依存性転写活性化のためのリポーター遺伝子とし
てステロイド受容体と同時トランスフェクションされた
（実験の部ＩＩを参照）。（Ｂ）正常血清の存在下での
ｈＭＲまたはｈＧＲトランスフェクション後に見られた
示差的ＣＡＴ酵素活性。トランスフェクションした細胞
は５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。血清
はその後の実験において遊離ステロイドを排除するため
にチャーコールで処理した。その結果外因性ステロイド
の効果が測定できるであろう。（Ｃ）ｈＭＲまたはｈＧ
Ｒでトランスフェクションした細胞におけるアルドステ
ロンまたはデキサメタゾンによるＣＡＴ活性の示差的誘
導。ＣＶＩ細胞は１０μｇのｐＲＳＶｇａｌ（対照）、
ｐＲＳｈＭＲまたはｐＲＳｈＧＲアルファのいずれかお
よび１０μｇのリポーターＧＭＣＡＴで同時トランスフ
ェクションし、そして１０ｎＭアルドステロン（Ａ）ま
たは１０ｎＭデキサメタゾン（Ｄ）の存在下または不在
下（−）で培養した。ＡＣ，３−アセチルクロラムフェ
ニコール；Ｃ，クロラムフェニコール。リン酸カルジウ
ム共沈によるトランスフェクション（４３）の２日後、
抽出物をＣＡＴ検定のために調製した（４４）。検定は
５０μｇのタンパク質抽出物を用いて６時間インキュベ
ーションした。第ＩＶ−６図 ラット組織中のミネラロコルチコイド受容体ｍＲＮＡの
ノザン分析。ラムダｈｋ１０からの１２７０ｂｐ Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント（１７７０−３０４０）を、ラット
での相同ｍＲＮＡ発現のためのプローブとして使用し
た。すべてのレーンにおいて、１０μｇのポリ（Ａ）＋
ｍＲＮＡを用いた。リボソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１
８Ｓ）の泳動をサイズマーカーとして示す。ストリンジ
ェント条件下でのハイブリダイゼーション後に、フィル
ターは０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで３０分ずつ２
回、６８℃で洗浄した。第ＩＶ−７図 微小核ハイブリッドのサザン分析によるｈＭＲ遺伝子の
染色体局在化。これらのハイブリッドの構築および特性
決定は以前に開示されている（３２）。それぞれのヒト
染色体含有物は次の通りである：ＨＤｍ−４Ａ（染色体
２０）、ＨＤｍ−５（染色体１４および非特定化Ｅグル
ープ染色体）、ＨＤｍ−９（染色体２０，１４および２
１）、ＨＤｍ−１５（染色体２１，１１および４）、Ｈ
Ｄｍ−２０（染色体７および１４）、およびＨＤｍ−１
１３２Ｂ（染色体４のみ）。ヒト（ＨｅＬａ）およびマ
ウス（３Ｔ＃）対照ＤＮＡ試料も示す。微小核体由来の
ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）はＥｃｏＲＩで消化し、１．
０％アガロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜（Ｎ
ｙｔｒａｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ
社）に移行させ、そして高ストリンジェント条件下でｈ
ＭＲ ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズさせた
（第ＩＶ−１（Ａ））。放射性プローブは２つのランダ
ムにプライムした（４５）ｈＭＲ ｃＤＮＡ鋳型（ラム
ダｈｋ２の１０００−および８００−ｂｐ ＥｃｏＲＩ
フラグメント）から大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ウ断片により合成した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ラムダＤＮ
Ａのサイズをオートラジオグラムに近接して示す。第ＩＶ−８図 ｈＧＲ，ｈＭＲおよびｒＰＲ構造の模式図によるアミノ
酸比較。一次アミノ酸配列を模式図的に整列させ、点線
の間のそれぞれの相同領域についてアミノ酸同一性のパ
ーセンテージを示す。各ドメイン境界のアミノ酸位置を
それぞれの受容体について示す。ＮおよびＣはアミノ末
端およびカルボキジル末端を表す。Ｃｙｓは推定上のＤ
ＮＡ結合ドメインをコードするシステインに富む領域に
相当し、一方Ｓｔｅｒｏｉｄ（コルチゾル、アルドステ
ロンまたはプロゲステロン）はステロイド結合ドメイン
を表す。ｈＧＲの免疫原領域（ＩＭＭ）も示す。アミノ
酸残基番号はｈＧＲについては実験の部Ｉから、ｒＰＲ
についてはＬｏｏｓｆｅｌｔら（１１）から、そしてｈ
ＭＲについては我々のデータから引用する。 ２２．内因性ステロイドの除去のために、洗浄チャーコ
ールを血清に加え〔１００ｍｌ当たり２ｇ（乾燥重
量）〕、３７℃で４０分間、次に５５℃で３０分間イン
キュベーションした。チャーコールは０．４５ミクロン
その後０．２ミクロンのフィルターを通して▲ろ▼過す
ることにより除いた。２３．ヒト細胞株は高親和性アル
ドステロン結合部位を発現すると報告されていない。ヒ
ト卵巣ＲＮＡのノザンブロット分析により、大きさが約
６ｋｂおよび４ｋｂの２つのハイブリッド形成ＲＮＡ種
が明らかになにった。卵巣でのアルドステロン結合活性
は報告されていない。 ４１．ｐＲＳｈＭＲの構築。ラムダｈｋ１０からの３．
７５ｋｂ挿入物は、ｈＭＲコード配列の５′末端にｍｐ
１８ポリリンカーが隣接する方向で、ｐＧＥＮ４（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ社）のＥｃｏＲＩ部位へ連結した。このプラ
スミド（ｐｈｋ１０）をＨｉｎｄＩＩＩで消化してポリ
リンカー部位から３５６２位のｈＭＲ部位に及ぶＨｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントを形成させ、このフラグメントを
単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて
両末端を修復した。プラスミドｐＲＳＶＣＡＴ〔Ｃ．
Ｍ．Ｇｏｒｍａｎ，Ｇ．Ｔ．Ｍｅｒｌｉｎｏ，Ｍ．Ｃ．
Ｓｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｂ．Ｈ．Ｈ
ｏｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，７９：６７７７（１９８２）〕はＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化し、そしてｐＢＲ３２２
配列、ＲＳＶ−ＬＴＲおよびＳＶ４０ポリＡ部位を含む
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩフラグメントもまた修復し
た。ｈＭＲフラグメントとｐＲＳＶＣＡＴ由来のフラグ
メントとの連結は、正しい方向でＲＳＶプロモーターに
より支配されるｈＭＲコード配列を含むベクターをもた
らした。第ＩＶ−４（Ａ）図でかっこに入れた部位はこ
のクローニング段階で失われた。翻訳効率を改良するた
めに、５′非翻訳領域中のいくつかの上流の開始コドン
および終結コドンが、このベクターをＡｃｃＩで消化し
てｍｐ１８ポリリンカーからｈＭＲ５′−ＵＴ領域中の
１８８位までの約２００ｂｐ配列を除去することにより
欠失された。最後に、ＮｄｅＩリンカーを付加したＳＶ
４０複製起点をＮｄｅＩ部位（１２）に導入してｐＲＳ
ｈＭＲを形成させた。
ング：グルココルチコイド受容体との構造的および機能
的類似性ＩＶ．Ａ．概要 推定上の１０７キロダルトンのポリペプチドをコードす
る新しい遺伝子を単離するために、ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）相補ＤＮＡとの低ストリンジェン
トハイブリダイゼーションを使用した。発現試験によ
り、高親和性でもってアルドステロンと結合し、そして
アルドステロンに応答して遺伝子転写を活性化するその
能力が証明され、それによりヒトミネラロコルチコイド
受容体（ｈＭＲ）としてのその本性が確立される。この
分子はまたグルココルチコイドに対して高い親和性を示
し、グルココルチコイド応答性プロモーターを刺激す
る。ｈＭＲおよびｈＧＲは一緒になって、ホルモン結合
特性、標的遺伝子相互作用および組織特異的発現パター
ンが組合わされた様式で使用され、複雑な生理学的コン
トロールを達成する予期せぬ機能的多様性をもたらす。ＩＶ．Ｂ．序論 視床下部−下垂体−副腎軸はいろいろな神経内分泌の入
力信号を統合して、副腎コルチコステロイドの合成およ
び分泌を調節している。これらのステロイドホルモンは
数組の標的遺伝子の転写を直接的に調節する細胞内受容
体タンパク質との相互作用によって成長、発生およびホ
メオスタジスに影響を及ぼす（１，２）。２つの受容体
系がコルチコステロイドのために定められ、これらはグ
ルココルチコイド受容体（ＧＲ）およびミネラロコルチ
コイド受容体（ＭＲ）と名づけられた。初期の機能検定
により、コルチコステロイドは肝臓へのグルコーゲン貯
蔵を促進するそれらの作用によりグルココルチコイド、
または腎臓によるナトリウム貯留を促進するそれらの作
用によりミネラロコルチコイドのいずれかに類別され
た。しかしながら、それぞれのステロイドクラスはその
同族受容体とのみ相互作用するように制限されておら
ず、とりわけグルココルチコイドは実質上のミネラロコ
ルチコイド活性を示すことができる（１−３）。今や、
ＭＲはグルココルチコイドとミネラロコルチコイドの両
方に対して有意なｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性を有すること
が明らかである（３，４）。グルココルチコイドの循環
濃度はアルドステロン（代表的なミネラロコルチコイ
ド）よりも数段高いので、ＭＲのグルココルチコイド活
性化は機能的に意義がある。腎および腸のような組織の
分泌上皮はアルドステロンに応答して電解質と水のバラ
ンスを調節しているが、別の機構はこれらの組織にミネ
ラロコルチコイドに対する感受性を付与することが可能
である（５）。他の組織において発現されるＭＲの機能
的役割は全く明らかになっていないが、脳での生理学的
応答はＭＲとグルココルチコイドとの相互作用の結果と
して起こる（５−７）。高親和性の放射性標識リガンド
の利用可能性にもかかわらず、ＭＲは精製が困難であ
り、その生化学的性質はＧＲに比べて十分に理解されて
いない。ＭＲの研究に分子生物学の技術を応用すること
により、ＭＲの生化学的同定が容易となり、終局的にそ
の転写制御下にある遺伝子およびそれらの産物がホメオ
スタシスにおいて演ずる役割が理解されるであろう。グ
ルココルチコイド（実験の部Ｉおよび文献８，９を参
照）、エストロゲン（１０）、およびプロゲステロン
（１１）受容体の分子クローニングはそれらの一次アミ
ノ酸構造の決定およびこのファミリーの調節タンパク質
に共通の機能的ドメインの推定を可能にした。グルココ
ルチコイド（実験の部ＩＩおよび文献１２を参照）およ
びエストロゲン（１３）受容体の実験的解析はシステイ
ン、リシンおよびアルギニンに富む中央に位置するＤＮ
Ａ結合ドメイン、およびステロイドホルモンが作用する
カルボキシル末端領域を明らかにした。ＧＲの機能的研
究は、カルボキジル末端ヘのホルモン結合が、受容体と
ＤＮＡとの相互作用および転写の活性化を可能にすべく
ＤＮＡ結合領域をアンマスキング（ｕｎｍａｓｋｉｎ
ｇ）すると示唆した（１４，１５）。ステロイド受容体
および甲状腺ホルモン受容体のシステインに富むＤＮＡ
結合領域の比較は、これらの分子間に高度の関連性を示
す（１６）。不変のシステイン残基は、Ｚｎ２＋金属原
子の配位がキセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）５Ｓ遺伝子第
ＩＩＩＡ転写因子について提案されたものに類似したＤ
ＮＡ結合の構造的形状を維持するという仮説へ導いた
（１７）。また、ステロイド受容体ファミリーのステロ
イド結合領域も、共通の原始的前駆物質からの種々の受
容体クラスの進化と矛盾しない実質的保存（ｃｏｎｓｅ
ｒｖａｔｉｏｎ）を示す（１１，１６）。我々はヒトグ
ルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）に密接に関連した遺
伝子産物を単離するために、ステロイドホルモン受容体
間の構造的類似性を利用した。ｈＧＲプローブとの非ス
トリンジェントハイブリダイゼーションにより、ｈＧＲ
のシステインに富む配列と高度に関連したヒトゲノムＤ
ＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡをプローブと
して使用して、我々はシステインに富む領域からカルボ
キシル末端までのｈＧＲと強い相同性を有する分子をコ
ードする相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得た。細胞内で発現
させたとき、この分子は高い親和性でもってアルドステ
ロンと結合し、しかもマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）のロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）のアル
ドステロン応答性転写を活性化する。このヒトミネラロ
コルチコイド受容体のリガンドおよびＤＮＡ配列特異性
とｈＧＲのそれらとのオーバーラップは、これらの調節
分子に対して伝統的に割り当てられている別々の役割が
再考されるべきであることを示唆している。ＩＶ．Ｃ．ｈＭＲ ｃＤＮＡの分離 グルココルチコイド受容体関連遺伝子を同定するため
に、ヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画化し、そしてその分
画をｈＧＲ１．２（ＤＮＡ結合ドメインをコードする配
列を含むｈＧＲ ｃＤＮＡの１１００ｂｐフラグメン
ト）とハイブリダイズさせた（実験の部Ｉおよび文献１
５を参照）。サザンブロット分析は低ストリンジェント
ハイブリダイゼージョン条件に特有の数本のバンドを示
した（第ＩＶ−１，（Ａ）および（Ｂ）図を比較された
い）。２．５キロ塩基対（Ｋｂｐ）のＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメント（第ＩＶ−１（Ｂ）図中に星印で示したも
の）は他のハイブリッド形成バンドからよく分割され、
直接的ゲノムクローニングに適していると判定された。
ヒト胎盤からのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡはアガロース
ゲル上で大きさに基づいて分画化し、そしてゲノムライ
ブラリーの構築のために２．５Ｋｂｐ領域を分離した。
その後、このラムダｇｔ１０ライブラリーはプローブと
してｈＧＲ１．２を用いて低ストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でスクリーニングした。１つの陽
性ゲノムクローン（ラムダＨＧＨ）からの挿入物はニッ
クトランスレーションを行って、高ストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でのサザンブロットにおい
てプローブとして使用した（第ＩＶ−１（Ｃ）図）。
２．５Ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩシグナルは非ストリンジ
ェント条件下で見られたものに相当し、所望のゲノムフ
ラグメントの一部が分離されたことを示している。ラム
ダＨＧＨ由来の挿入物の塩基配列解析は、イントロン配
列によってはさまれた１４０塩基対（ｂｐ）のエクソン
を明らかにした（（第ＩＶ−１（Ｄ）図）。この全エク
ソンは相同性のｈＧＲ ｃＤＮＡ配列と６８％のヌクレ
オチド同一性を有するが、１０４個のヌクレオチドのう
ち８５個を保存する領域がその交差ハイブリダイゼーシ
ョン特性を与えるものと思われる。この高度に保存され
た領域はｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの一部に対応する
（１５）。ラムダＨＧＨエクソンは１６個の非交換残基
から始まってその後にステロイドホルモン受容体に特徴
的な高度に保存されたシステイン残基の最初の残基が続
く４６個のアミノ酸をコードしている（８−１１）。次
の３０個の残基のうち、２８個がｈＧＲと同一である。
これらの分析は、ｈＧＲｃＤＮＡ配列中に存在するもの
と関連があるが、それとは明らかに異なる配列を含むゲ
ノムフラグメントが分析されたことを示す（実験の部Ｉ
を参照）。ラムダＨＧＨからの挿入物は、このｈＧＲ関
連遺伝子に対応するクローンについて、ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用
した。ミネラロコルチコイド受容体はこの種の遺伝子に
よってコードされる候補物質であると考えられた。腎臓
はミネラロコルチコイド応答性組織であることが知られ
ているので、数人のヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。１１個の陽性クローンが１０６組変
えファージ当たり３〜４の頻度でこれらのラムダｇｔ１
０ライブラリーから分離された。２つの重複するクロー
ン、ラムダｈＫ２およびラムダｈＫ１０、をヌクレオチ
ド配列分析にかけ、合わせて５８２３ヌクレオチドに及
ぶことが見出された（第ＩＶ−２（Ａ），ＩＶ−２
（Ｂ）−１およびＩＶ−２（Ｂ）−２図）。ラムダＨＧ
Ｈのエクソン−イントロン境界はこれらのｃＤＮＡクロ
ーンの塩基配列を決定することにより証明した。ラムダ
ｈＫ１０（ヌクレオチド１から３７５０まで）は大きい
オープン・リーディング・フレームを含み、完全な一次
アミノ酸配列を予告している。ラムダｈＫ２からのＤＮ
Ａ挿入物はヌクレオチド８０２から５８２３にまで伸長
しているが、２２３５から２５８６までの３５１ｂｐ内
部欠失を有している。３個の別のクローンも試験し、欠
失領域がラムダｈＫ１０と同じ構造であることを確かめ
た。ラムダｈＫ２における欠失はクローニングアーチフ
ァクト（人工産物）を表すか、あるいはまれなメッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のスプライシングエラー（切
り継ぎの誤り）を表すと思われる（１８）。ヌクレオチ
ド３７５０の下流側の報告された３′非翻訳領域の配列
はラムダｈＫ２から誘導される。これらの２つのｃＤＮ
Ａの複合配列をｈＭＲと名づける（第ＩＶ−２（Ａ）
図）。読み枠内終止コドン（１３６位）の下流側に最初
の読み枠内ＡＴＧ（２２３位）があり、ｈＭＲは少なく
とも２１６ヌクレオチドの５′非翻訳領域を有してい
る。この最初のＡＴＧをとりまく配列はＫｏｚａｋ（１
９）によって示されたコンセンサス配列と一致する。こ
の推定されたイニシエーターメチオニンコドンは、９８
４個のアミノ酸をコードする大きいオープン・リーディ
ング・フレームの最初の部分をなす。終止コドン（３１
７５位）に続いて、７０ヌクレオチドーポリ（Ａ）（ポ
リアデニル化）尾部の１７ヌクレオチド上流にポリアデ
ニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有する２．６Ｋｂの
３′非翻訳領域が存在する。長い３′非翻訳領域はステ
ロイドホルモン受容体のｍＲＮＡに特徴的な性質である
（実験の部Ｉおよび文献９−１１を参照）。ＩＶ．Ｄ．ＤＮＡ−およびホルモン−結合領域 ｈＭＲ ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、ｈ
ＧＲと密接に関連したステロイドホルモン受容体の構造
的特性を有する。ｈＭＲの推定上のアミノ酸配列とｈＧ
Ｒのそれとの比較により、ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン
およびステロイド結合ドメインの両方と高度に相同であ
ることが立証された。ｈＭＲ遺伝子は７７７残基のｈＧ
Ｒよりもはるかに大きく、９８４個のアミノ酸からなる
タンパク質（推定分予量１０７ＫＤ）をコードする。こ
の大きさの不一致は主としてｈＧＲと相同でない大きい
アミノ末端のためである。この領域のサイズおよび配列
の相当な不均一性はグルココルチコイド、エストロゲン
およびプロゲステロンのそれぞれの受容体間に存在する
（実験の部Ｉ；文献９−１１を参照）。アミノ酸相同は
６８残基中９４％のアミノ酸が同一である中央のＤＮＡ
領域から始まる（第ＩＶ−３図）。他のステロイドホル
モン受容体に見られる配列保存の比較的低い領域が、Ｄ
ＮＡ結合ドメインとカルボキシル末端ステロイド結合ド
メインとを隔てている。この領域は２つのドメイン間の
分子ヒンジ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｈｉｎｇｅ）として役
立つことが推測された（実験の部ＩＩおよび文献１３を
参照）。ｈＧＲとの比較は、ｈＭＲのこの領域が反復ヌ
クレオチド配列によってコードされる４個のグルタミン
それに続く８個のプロリンの配列を含む２４個の追加の
アミノ酸を含むことを示す。起源および機能に関してこ
の例外的配列の意義は明らかでないが、構造を切断する
プロリンはヒンジ領域と一致する。ｈＭＲとｈＧＲのカ
ルボキシル末端の２５０個のアミノ酸を比較すると、５
７％のアミノ酸同一性および多数の保存的アミノ酸置換
が見られる。これらの置換のいくつかはステロイドホル
モンとの相互作用に必要な疎水領域を維持している。ＩＶ．Ｅ．発現およびホルモン結合 我々はグルココルチコイド受容体機能を調べるために、
サル腎臓細胞株ＣＶ１およびその誘導的（すなわち、Ｓ
Ｖ４０Ｔ抗原−形質転換）細胞株ＣＯＳ−１（ＣＯＳと
呼ばれる）のトランスフェクションを使用した（実験の
部ＩＩを参照）。トランスフェクションされたｈＭＲか
らの高レベルのポリペプチド発現は、トランスフェクシ
ョンした細胞によるステロイド結合実験を容易にするた
めに不可決であった。ＳＶ４０複製起点を含むプラスミ
ドはＣＯＳ細胞内で高コピー数に複製することができる
ので、ｈＧＲの研究において以前に使用したｐＲＳｈＧ
Ｒアルファと類似したｈＭＲコード配列用の発現ベクタ
ーを構築した。プラスミドｐＲＳｈＭＲはラウス肉腫ウ
イルス由来のプロモーターの支配下にあるｈＭＲコード
配列、およびＳＶ４０複製起点を含む（第ＩＶ−４
（Ａ）図）。ｈＭＲタンパク質のリガンド特異性はｐＲ
ＳｈＭＲでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの
細胞質ゾル抽出物を調製することにより調べた。トラン
スフェクションの２日後に細胞を回収して、デキストラ
ン処理チャーコール検定によりホルモン結合を測定し
た。疑似トランスフェクションした対照の抽出物は〔３
Ｈ〕アルドステロンに対して特異的結合活性を全く示さ
なかったが、ｐＲＳｈＭＲでトランスフェクションした
細胞からの抽出物は高親和性でもって有意量の〔３Ｈ〕
アルドステロンと結合した。スカッチャード分析によ
り、〔３Ｈ〕アルドステロン結合に関する解離定数（Ｋ
Ｄ）は１．３ｎＭと測定された（第ＩＶ−４（Ｂ）
図）。この値はミネラロコルチコイド受容体へのアルド
ステロン結合について報告されたものとよく一致してい
る（２，２０）。その後、１−，１０−または１００−
倍過剰モル量で存在させたときに、結合を５ｎＭ
〔３Ｈ〕アルドステロンと競合する異なる未標識ステロ
イドの能力を調べるために、競合試験を行った（第ＩＶ
−４（Ｃ）および（Ｄ）図）。これはｈＭＲに対するこ
れらのステロイドのそれぞれの相対親和性の度合を提供
した。これらの実験の結果は、アルドステロン、コルチ
コステロン、デオキシコルチコステロン、ヒドロコルチ
ゾン（コルチゾル）の全てがｈＭＲに対して非常に類似
した親和性をもつことを示した。デキサメタゾン、プロ
ゲステロン、およびスピロノラクトンは比較的弱い結合
親和性を示し、一方エストラジオールはｈＭＲの結合に
対して極めて弱く競合した。結局、この親和性の差異は
ｈＭＲがヒトミネラロコルチコイド受容体をコードする
ことを表している（２，２０）。ＩＶ．Ｆ．転写活性化 ステロイドホルモン作用は標的遺伝子転写のホルモン依
存性調節により特徴づけられる。ＣＶＩ細胞内にトラン
スフェクションされたｈＧＲによる転写調節検定（実験
の部ＩＩを参照）がｈＭＲ用に改変された（第ＩＶ−５
（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図）。ステロイド結合検定
に用いた発現プラスミドｐＲＳｈＭＲは、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌
遺伝子に連結されたＭＭＴＶ−ＬＴＲを含むＧＭＣＡＴ
と呼ばれるリポータープラスミドと共に同時トランスフ
ェクションされた。こうして、ＣＡＴ活性はＭＭＴＶプ
ロモーターの転写活性に関する酵素検定を与える。ＭＭ
ＴＶプロモーターはＧＲとの相互作用を介してグルココ
ルチコイド応答性を与える数種のグルココルチコイド応
答因子（ＧＲＥ）、エンハンサー様ＤＮＡ配列を含む
（２１）。ｈＭＲは、そのＤＮＡ結合ドメインがｈＧＲ
のそれとほぼ同一であるために、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを認
識できるかも知れないと考えた。ＣＶＩ細胞をｐＲＳｈ
ＭＲおよびＧＭＣＡＴで同時トランスフェクションした
とき、我々は十分なＣＡＴ活性を観察した。この活性は
添加したアルドステロンの影響を受けず、このことはト
ランスフェクションされたｈＧＲと対照的に、ｈＭＲを
十分に活性化するに足るホルモンが血清（ウシ胎児血
清，５％）中に存在していたことを示唆する（第ＩＶ−
５（Ｂ）図）。チャーコール処理血清（２２）の存在下
では、ＣＡＴ活性は外因性アルドステロンの添加に応答
するようになり、このことはｈＭＲｃＤＮＡが機能的ス
テロイドホルモン受容体をコードすることを示してい
る。ｈＭＲはまたグルココルチコイド・アゴニストのデ
キサメタゾンによって活性化されたが、ｈＧＲは生理学
的濃度以上（１０ｎＭ）のアルドステロンにさえも応答
しなかった。ＩＶ．Ｇ．組織特異的発現 我々はノザン・ブロット・ハイブリダイゼージョンによ
りラット組織内でのｈＭＲ ｃＤＮＡに相応するＭＲ
ｍＲＮＡの発現を調べた。脳、下垂体および心臓ばかり
でなく、腎臓（２４）や腸（２５）のような古典的ミネ
ラロコルチコイド標的組織はｈＭＲに相応するｍＲＮＡ
を含んでいた（第ＩＶ−６図）。腎臓におけるアルドス
テロン感受性細胞は主として遠位の皮質性集合管に局限
されており（２）、それ故にこの組織によるわずかな発
現レベルは意外なことではなかった。高レベルのＭＲ
（Ｉ型コルチコステロイド結合部位）はラットの脳、特
に海馬体（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｏｒ ｍａｔｉ
ｏｎ）において報告された（４，６）。切開した海馬Ｒ
ＮＡと全脳から調製したＲＮＡとを比較した際に、我々
は海馬中に著しく豊富なｍＲＮＡを見出した。アルドス
テロン結合は下垂体（２６）、培養大動脈細胞（２７）
および脾臓（２８）において報告されているが、この種
の活性は筋肉では報告されていない。肝臓はＧＲを発現
するが、検出しうる高親和性のアルドステロン結合活性
を示さず（２９）、予期されるように肝臓ＲＮＡとのハ
イブリッド形成は観察されなかった。ｈＧＲ ｃＤＮＡ
の類似部分を用いる同じノザン・ブロットの再検索は異
なる大きさのｍＲＮＡ種とのハイブリッド形成を示し、
ＭＲとＧＲとが異なる組織特異的発現パターンを示すこ
とが分かった。ＩＶ．Ｈ．染色体マッピング ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の染色体位置を決定
するために、我々はヒト染色体の異なる組合せを保有す
るネズミ−ヒト体細胞ハイブリッドのパネルに対してｈ
ＭＲを調べた（３０）。ミネラロコルチコイド受容体遺
伝子に特異的なＤＮＡフラグメントは、１５種のハイブ
リッド細胞株においてヒト染色体４と一致して分離され
た。染色体５（グルココルチコイド受容体遺伝子部位）
を含む他のすべてのヒト染色体については、不一致の分
離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が観察された（実験の部
Ｉおよび文献３１を参照）。染色体４への割当てを確認
するために、我々はサザン分析を用いてｈＭＲ遺伝子に
ついて限定組の微小核ハイブリッド（それぞれは１〜３
本のヒト染色体を保有する（３２））を試験した（第Ｉ
Ｖ−７図）。ラムダｈＫ２のコード部分により検出され
た６本のＥｃｏＲＩフラグメントは、このハイブリッド
パネルにおいて染色体４と同時分離される。とりわけ、
ｈＭＲ遺伝子は唯一のヒト染色体として染色体４を保有
する細胞株ＨＤｍ−１１３２Ｂ中に存在する。ＩＶ．Ｉ．副腎コルチコステロイドの生理機能との密接
な関係 ヒトミネラロコルチコイド受容体ｃＤＮＡはヒトグルコ
コルチコイド受容体に高度に相同であるポリペプチドを
コードする。ＤＮＡ結合ドメインにおいて、ｈＭＲはｈ
ＧＲと約９４％のアミノ酸同一性を維持するが、カルボ
キシル末端に局在化されるステロイド結合ドメインは５
７％の同一性を有する。最近報告されたウサギプロゲス
テロン受容体（ｒＰＲ）配列もまたｈＭＲとの高度な関
連性をもっている。ｈＧＲおよびｒＰＲ構造ドメインと
ｈＭＲのそれとのアミノ酸同一性の比較（第ＩＶ−８
図）は、これらの機能的に異なる調節タンパク質の驚く
べき類似性を示す。ｈＭＲとｒＰＲとの相同性はｈＧＲ
−ｈＭＲ比較にほとんど一致し、ＤＮＡ結合ドメインで
は９０％のアミノ酸を共有し、そしてステロイド結合ド
メインでは５６％を共有していた。対照的に、ｈＭＲと
ヒトエストロゲン受容体（１０）との同一領域の比較
は、ＤＮＡ結合ドメインにおいて５６％の同一性および
ステロイド結合ドメインカルボキジル末端において２１
％の配列同一性を示す。ｈＭＲ，ｈＧＲおよびｒＰＲに
よって共有される構造的相同度およびそれらのリガンド
の構造的関連性は、それらがステロイドホルモン受容体
のサブファミリーから成ることを示唆している。一時的
トランスフェクションによるＣＯＳ細胞内でのｈＭＲポ
リペプチドの発現は、そのステロイド結合能の評価を可
能にした。これらの分析結果は、ｈＭＲｃＤＮＡがヒト
ミネラロコルチコイド受容体をコードしていることを明
らかにした。スカッチャード分析は、ｐＲＳｈＭＲでト
ランスフェクションした細胞からの抽出物が１．３ｎＭ
のＫＤ値でもって〔３Ｈ〕アルドステロンと結合するこ
とを示した。ＭＲと結合するアルドステロンの報告され
たＫＤ値は０．５〜３ｎＭの範囲である（２）。これは
この遺伝子産物をヒトミネラロコルチコイド受容体とし
て定める際のただ１つの最も重要な基準である。ステロ
イド結合競合実験は、ｈＭＲのこの同定をさらに支持し
た。ミネラロコルチコイドのデオキシコルチコステロン
およびグルココルチコイドのコルチコステロンおよびコ
ルチゾルはアルドステロンそれ自体と同様に競合する
が、一方合成グルココルチコイドのデキサメタゾンおよ
びブロゲステロンはｈＭＲに対して比較的低い親和性を
有する。ｈＭＲ，ｈＧＲおよびｒＰＲの推定上のステロ
イド結合ドメインにおける十分なアミノ酸配列同一性
は、これらの受容体の類似リガンド結合特性とよく合っ
ている。ミネラロコルチコイド受容体、グルココルチコ
イド受容体およびプロゲステロン受容体はミネラロコル
チコイド、グルココルチコイドおよびプロゲスチンの類
似した２１−炭素原子構造間を識別するのに限られた能
力を示す。この特異性の欠如は特にＭＲとＧＲに当ては
まる。例えば、ＭＲはアルドステロンと等しい親和性で
もってグルココルチコイドと結合する。実際に、別の機
構がアルドステロンへの選択的応答を与える腎臓のよう
な組織においてのみ、ＭＲは古典的ミネラロコルチコイ
ド受容体として機能するのかも知れない（３，５）。Ｍ
Ｒはまたプロゲステロンと高い親和性で、しかしコルチ
コステロイドに対するその親和性よりも低い親和性でも
って結合する。プロゲステロンはミネラロコルチコイド
作用の部分アゴニストまたはアンタゴニストとして作用
するいくつかの徴候があり（３３）、またグルココルチ
コイドはミネラロコルチコイド受容体への結合において
十分なアゴニストとして作用するかどうか明らかでな
い。同様に、ＧＲは２０〜４０ｎＭのＫｄ値でグルココ
ルチコイドと結合し、それは２５〜６５ｎＭのＫｄ値で
アルドステロンと結合する（２）。従って、ＭＲとＧＲ
のホルモン結合特性間の重要な差異はリガンド特異性の
それではなく、むしろコルチコステロイドに対する高親
和性対低親和性受容体の差異である。ｈＭＲのｉｎ ｖ
ｉｖｏ機能は血清コルチゾン結合タンパク質のトランス
コルチンによって複雑になっている。このタンパク質は
コルチゾルを結合封鎖し、その特異な分布のために、ト
ランスコルチンは局部のグルココルチコイド濃度に影響
を及ぼすであろう。腎臓における高レベルのトランスコ
ルチンは血漿からの利用可能なコルチゾルを減少させ
て、アルドステロン感受性を与え、一方脳における低レ
ベルのトランスコルチンは、中枢神経系において、グル
ココルチコイドが主なｈＭＲリガンドでありうることを
示唆するであろう。従って、ｈＭＲのための好適な生理
学的リガンドは受容体発現の部位に応じて明らかに変化
する（３）。このモデルおよび他のモデル（５）は、よ
り一層高いレベルの競合性グルココルチコイドにもかか
わらず、アルドステロンへの若干の組織の応答性を説明
するために提案されたものである。ｈＭＲとｈＧＲのＤ
ＮＡ結合ドメイン間の相同度（この保存された６８残基
領域中で４個のアミノ酸残基のみが相違する）は、これ
らの受容体が類似の調節因子を認識しうることを示唆す
る。アルドステロンおよびデキサメタゾンの両方に応答
してトランスフェクションされたｈＭＲがＭＭＴＶ−Ｌ
ＴＲを活性化することはこの結論を支持するが、プロゲ
ステロン受容体もまたこのプロモーターを調節すること
が立証されている（２１）。さらに、ＤＮＡ結合ドメイ
ンにおけるｈＭＲとｈＧＲの差異、またはこれらの分子
の高度に異なるアミノ末端のような他の領域における差
異が、この検定では立証できないやり方で標的遺伝子特
異性に影響を及ぼすのかも知れない。しかしながら、我
々はｈＭＲおよびｈＧＲによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写
調節を利用して、ミネラロコルチコイドおよびグルココ
ルチコイドによるそれらの活性化を調べた。ｈＭＲ応答
は１０ｎＭアルドステロンまたはデキサメタゾンの場合
にほぼ等しかった。一方ｈＧＲはこの検定においてデキ
サメタゾンによって活性化されたが、アルドステロンに
は不感受性であった。外因性コルチゾルに応答するｈＭ
Ｒによる転写活性化も観察された。これらのデータは、
トランスフェクションした細胞において、ミネラロコル
チコイドとグルココルチコイドの両方がｈＭＲ媒介遺伝
子転写を活性化しうることを示している。この機能的特
性に基づいて、我々はｈＭＲが副腎コルチコステロイド
に対して高度に応答し、それ故にグルココルチコイド受
容体として機能しうると結論を下した。コルチコステロ
イドに協調応答するミネラロコルチコイド受容体の薬理
学的および生理学的機能を明らかにするほかに、ｈＭＲ
ｃＤＮＡの分離は多数の病気、なかでも高血圧および
偽低アルドステロン症（ｐｓｅｕｄｏ ｈｙｐｏ ａｌ
ｄｏｓｔｅｒｏｎｉｓｍ；ＰＨＡ）におけるｈＭＲの役
割の証明をうながす。ミネラロコルチコイドと高血圧の
関連性は数十年の間認められており、ｈＭＲ媒介ナトリ
ウム貯留および血液量の増加がいくつかの形態の高血圧
症に部分的に関与しているのかも知れない（３４）。Ｐ
ＨＡは正常レベルまたは高レベルのアルドステロンへの
応答性の欠如によって特徴づけられる常染色体劣性疾患
である。最近の研究により、この疾患をもつ患者では高
親和性アルドステロン結合部位が減少しているか又は完
全に消失していることが証明され（３５）、このことは
ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の欠陥により生ずる
と思われる。ｈＭＲ遺伝子の染色体マッピングはＰＨＡ
の遺伝子座が染色体４に存在することを示唆する。機能
的ｈＭＲのクローニングおよび発現は予期しない考察を
もたらし、生理学的複雑性の下に横たわる機構への新た
な興味を剌激し、そして遺伝子ネットワークの協調調節
のための新しいモデルの開発および試験を可能にするで
あろう。ＩＶ．Ｊ．実験の部ＩＶに関連した図面の詳細な説明 第ＩＶ−１（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）図 ｈＧＲ遺伝子に関連したゲノム配列の分離。（Ａ）表示
した制限エンドヌクレアーゼで消化したヒト胎盤ＤＮＡ
の高ストリンジェントハイブリダイゼーション。ｈＧＲ
ｃＤＮＡ（ｈＧＲ１．２）をプローブとして使用し
た。ＨｉｎｄＩＩＩ消化により作ったラムダＤＮＡフラ
グメントマーカーの大きさ（キロ塩基対で表す）をオー
トラジオグラムの隣に示す。（Ｂ）低ストリンジェント
サザン分析。ＨｉｎｄＩＩＩレーンに星印ではさまれた
２．５ｋｂｐバンドは直接ゲノムクローニングの的にさ
れた配列であった。（Ｃ）ラムダＨＧＨと命名されたク
ローン中のこのゲノム配列の分離は、類似のサザンブロ
ットでプローブとして使用することにより証明される。
ラムダＨＧＨゲノムフラグメントは、このクローニング
から分離されたハイブリッド形成性内部ＥｃｏＲＩフラ
グメントを含む。（Ｄ）ラムダＨＧＨゲノムフラグメン
トのイントロン−エクソン構造およびｈＧＲとのその相
同性。ラムダＨＧＨに存在するｈＧＲ関連エクソンは、
その推定アミノ酸配列と共に黒地に白で示される。保存
されたシステイン残基は白い点で示される。アンダーラ
インを施した共通のスプライス供与部位および受容部位
を有するイントロン配列部分がエクソンの両側に存在す
ることが分かる。ｈＧＲとのヌクレオド相同性を下側に
示す。ｈＧＲのヌクレオド番号は実験の部Ｉで論じた第
Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図からのものであり、
また実験の部Ｉとしてここで使用した研究を発表したＨ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８５）（文献８）を参照さ
れたい。サザン分析のために、我々は妊娠期間終結後の
ヒト胎盤由来のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、消化産物を０．８％アガロースゲル上で分離した。
ＤＮＡをニトロセルロース紙へ移行させ、ストリンジェ
ントまたは非ストリンジェント条件下でハイブリダイズ
させた。ストリンジェントハイブリダイゼーションは５
０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ，ＮａＨ２
ＰＯ４，ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）、１×デンハート溶
液、０．１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮ
Ａおよびプローブ（１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を用いて４２
℃で行った。非ストリンジェントハイブリダイゼーショ
ンの場合は、５０％ホルムアミドの代わりに３５％ホル
ムアミドを用いた。洗浄条件はストリンジェント条件の
場合が６０℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ
（標準ＮａＣｌ−クエン酸塩）、そして非ストリンジェ
ントフィルターの場合が５５℃で０．１％ＳＤＳを含む
２×ＳＳＣから成っていた。プローブとしてラムダＨＧ
Ｈ由来の３３８ｂｐ挿入物を用いたときの洗浄条件は、
６８℃で０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに変更した。
ラムタＨＧＨの分離のために、ヒト胎盤ＤＮＡ（３００
μｇ）はＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％低融点アガロー
スゲル（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ，ＦＭＣ）上で大きさによ
り分画化した。ゲルを０．５ｃｍの細片に切り取り、フ
ェノール抽出およびエタノール沈澱によりＤＮＡを精製
した。（Ｂ）において星印ではさまれたバンドに大きさ
の点で対応する分画からのＤＮＡ（２μｇ）は、Ｅｃｏ
ＲＩリンカーを付加するためにクレノウＤＮＡポリメラ
ーゼで修復した。ＥｃｏＲＩでの消化およびセファロー
ス４Ｂカラムによる過剰リンカーの除去後に、このＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩ消化ラムダｇｔ１０ＤＮＡに連結し、ｉ
ｎｖｉｔｒｏでパッケージした（カリフォルニア州サン
ジェゴ，ベクター・クローニング・システムズ社からの
ラムダアームおよび抽出物）。約４×１０５個の独立し
た組換え体を非ストリンジェントサザン分析のために使
用した条件と同じ条件下でスクリーニングしてラムダＨ
ＧＨを得た。第ＩＶ−２（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトミネラロコルチコイド受容体のヌクレオド配列およ
び一次アミノ酸構造。 （Ａ）いくつかの制限エンドヌクレアーゼ切断部位の線
図と整列したｈＭＲの複合構造（ＥｃｏＲＩ部位はヌク
レオド１および５８２３に示され、リンカーから誘導さ
れる）。この複合体は２つの重複するラムダｇｔ１０ク
ローンのラムダｈｋ１０およびラムダｈｋ２から組み立
てられた。ラムダｈｋ２の線図におけるかっこは３５１
ｂｐの欠失を示す。斜線ボックスはイニシエーターコド
ンと終結コドンを含む推定されたコード配列を示す。
（Ｂ）ｈＭＲの完全なヌクレオド配列およびその推定上
の一次アミノ酸配列。推定されたイニシエーターメチオ
ニンの上流にある読み枠内の５′終結コドンおよび４つ
の可能なポリアデニル化部位（ＡＡＴＡＡＡ）にはアン
ダーラインが施してある。ヒト腎臓ラムダｇｔ１０ライ
ブラリー（１８）はラムダＨＧＨ由来の挿入物を用い
て、このプローブによる高ストリンジェント条件下での
サザン分析のために記載した条件と同じ条件でスクリー
ニングした。それぞれのｃＤＮＡの重複欠失はサイクロ
ン高速欠失サブクローニング法（インターナショナル・
バイオテクノロジー）により得られた（３６）。欠失ク
ローンはジデオキシ法（３７）によりその塩基配列を決
定し、そしてギャップやアンビギュイティ（ａｒｎｂｉ
ｇｕｉｔｙ）を化学的切断法（３８）により解明した。
ＤＮＡ配列は編集してＤｅｖｅｒｅｕｘら（３９）およ
びＳｔａｄｅｎ（４０）のプログラムにより分析した。第ＩＶ−３図 ミネラロコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容
体のアミノ酸相同性。ｈＭＲの一次アミノ酸配列は、ギ
ャツプ（点で表示）を導入することにより最大の相同性
を得るように、ｈＧＲのアミノ酸配列と整列させた。数
字はｈＭＲについては第ＩＶ−２（Ｂ）−１およびＩＶ
−２（Ｂ）−２図から、そしてｈＧＲについては第Ｉ−
２（１）およびＩ−２（２）図から引用した。表示した
領域の上流には有意な相同性が全く見られなかった。縦
線は同一のアミノ酸残基を示す。矢印はＤＮＡ結合ドメ
イン（ＤＮＡ）およびステロイド結合ドメイン（ＳＴＥ
ＲＯＩＤ）の推定上の境界を示す。ＤＮＡ結合ドメイン
のアミノ末端境界は最初の保存システイン残基によって
任意に定められたが、カルボキシル末端限界はＤＮＡ結
合および転写活性化に必要な配列を示す突然変異誘発実
験に基づいて選択された（１５）。ＤＮＡ結合ドメイン
に続く数個の保存的塩基性残基もまたこれらの機能にと
って重要でありうる。アミノ酸相同領域により定められ
たステロイド結合ドメインの境界もまた突然変異分析と
一致する。アミノ酸残基の一文字略号はＡ，Ａｌａ；
Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ，
Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ：Ｋ，Ｌｙｓ；
Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；
Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；
Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ：およびＹ，Ｔｙｒである。第ＩＶ−４（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）図 発現されたｈＭＲのステロイド結合特性。（Ａ）ｈＭＲ
発現プラスミドｐＲＳｈＭＲの構造（４１）。（Ｂ）ｐ
ＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から調製さ
れた抽出物における〔３Ｈ〕アルドステロン結合のスカ
ッチャード分析。各点は２００μｌ中の抽出タンパク質
１００μｇを０℃で２．５時間インキュベーションする
３通りの実験により検定した。５００倍過剰の未標識ア
ルドステロンを用いて測定した非特異的結合は全カウン
ト数の約２０％であった。疑似トランスフェクションし
た細胞では特異的結合が全く見られなかった。（Ｃおよ
びＤ）トランスフェクションしたＣＯＳ細胞の抽出物に
おける５ｎＭ〔３Ｈ〕アルドステロンと未標識ステロイ
ドとの競合結合。これらの競合実験を代表する２つの独
立した実験の結果を示す。冷却競合剤は１−，１０−，
１００−倍過剰モル量で存在していた。１００％結合の
値は、１０００倍過剰の未標識アルドステロンの存在下
で結合したｃｐｍ数を、競合剤の不在下で結合したカウ
ント数から減算することにより決定した。略号：ＡＬＤ
Ｏ，アルドステロン；ＤＯＣ，デオキシコルチコステロ
ン；ＤＥＸ，デサメタゾン；ＳＰＩＲＯ，スピロノラク
トン；Ｅ２１，１７β−エストラジオール；ＣＳ，コル
チコステロン；ＨＣ，ヒドロコルチゾン；およびＰＲＯ
Ｇ，プロゲステロン。亜集密的生長（ｓｕｂｃｏｎｆｌ
ｕｅｎｔ）ＣＯＳ細胞はＤＥＡＥ−デキストラン法（４
２）により培養皿当たり１０μ９のｐＲＳｈＭＲを用い
てトランスフェクションした。細胞は５％チャーコール
処理ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（イグール最少培地の
ダルベッコ修飾）中に２日間維持し、その後４０ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａ２Ｍ０Ｏ４、５ｍＭジチオト
レイトール、アンチパイン（５μｇ／ｍｌ）、ロイペプ
チン（５μｇ／ｍｌ）および５００μＭ弗化フェニルメ
チルスルホニル中に収集した。１５０００×ｇで１０分
遠心した後、抽出物は結合に先立って１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌおよび５％グリセロールヘ調整した。〔３Ｈ〕アル
ドステロン（比活性７８Ｃｉ／ｍｍｏｌ，アマーシャム
社製）との標識反応は全容量２００μｌ中０℃で２．５
時間インキュベージョンし、その後２０μｌの５０％デ
キストラン被覆チャーコール（活性チャーコール：デキ
ストラン１０：１）と共に１０分間インキュベーション
した。１５０００×ｇ、４℃で２分遠心した後、上清中
の三重水素を液体シンチレーション分光光度計により定
量化した。第ＩＶ−５（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 トランスフェクションしたＣＶＩ細胞内でのｈＭＲおよ
びｈＧＲ発現プラスミドによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写
活性化。（Ａ）ＧＭＣＡＴの構造。このプラスミドはホ
ルモン依存性転写活性化のためのリポーター遺伝子とし
てステロイド受容体と同時トランスフェクションされた
（実験の部ＩＩを参照）。（Ｂ）正常血清の存在下での
ｈＭＲまたはｈＧＲトランスフェクション後に見られた
示差的ＣＡＴ酵素活性。トランスフェクションした細胞
は５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。血清
はその後の実験において遊離ステロイドを排除するため
にチャーコールで処理した。その結果外因性ステロイド
の効果が測定できるであろう。（Ｃ）ｈＭＲまたはｈＧ
Ｒでトランスフェクションした細胞におけるアルドステ
ロンまたはデキサメタゾンによるＣＡＴ活性の示差的誘
導。ＣＶＩ細胞は１０μｇのｐＲＳＶｇａｌ（対照）、
ｐＲＳｈＭＲまたはｐＲＳｈＧＲアルファのいずれかお
よび１０μｇのリポーターＧＭＣＡＴで同時トランスフ
ェクションし、そして１０ｎＭアルドステロン（Ａ）ま
たは１０ｎＭデキサメタゾン（Ｄ）の存在下または不在
下（−）で培養した。ＡＣ，３−アセチルクロラムフェ
ニコール；Ｃ，クロラムフェニコール。リン酸カルジウ
ム共沈によるトランスフェクション（４３）の２日後、
抽出物をＣＡＴ検定のために調製した（４４）。検定は
５０μｇのタンパク質抽出物を用いて６時間インキュベ
ーションした。第ＩＶ−６図 ラット組織中のミネラロコルチコイド受容体ｍＲＮＡの
ノザン分析。ラムダｈｋ１０からの１２７０ｂｐ Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント（１７７０−３０４０）を、ラット
での相同ｍＲＮＡ発現のためのプローブとして使用し
た。すべてのレーンにおいて、１０μｇのポリ（Ａ）＋
ｍＲＮＡを用いた。リボソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１
８Ｓ）の泳動をサイズマーカーとして示す。ストリンジ
ェント条件下でのハイブリダイゼーション後に、フィル
ターは０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで３０分ずつ２
回、６８℃で洗浄した。第ＩＶ−７図 微小核ハイブリッドのサザン分析によるｈＭＲ遺伝子の
染色体局在化。これらのハイブリッドの構築および特性
決定は以前に開示されている（３２）。それぞれのヒト
染色体含有物は次の通りである：ＨＤｍ−４Ａ（染色体
２０）、ＨＤｍ−５（染色体１４および非特定化Ｅグル
ープ染色体）、ＨＤｍ−９（染色体２０，１４および２
１）、ＨＤｍ−１５（染色体２１，１１および４）、Ｈ
Ｄｍ−２０（染色体７および１４）、およびＨＤｍ−１
１３２Ｂ（染色体４のみ）。ヒト（ＨｅＬａ）およびマ
ウス（３Ｔ＃）対照ＤＮＡ試料も示す。微小核体由来の
ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）はＥｃｏＲＩで消化し、１．
０％アガロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜（Ｎ
ｙｔｒａｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ
社）に移行させ、そして高ストリンジェント条件下でｈ
ＭＲ ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズさせた
（第ＩＶ−１（Ａ））。放射性プローブは２つのランダ
ムにプライムした（４５）ｈＭＲ ｃＤＮＡ鋳型（ラム
ダｈｋ２の１０００−および８００−ｂｐ ＥｃｏＲＩ
フラグメント）から大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ウ断片により合成した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ラムダＤＮ
Ａのサイズをオートラジオグラムに近接して示す。第ＩＶ−８図 ｈＧＲ，ｈＭＲおよびｒＰＲ構造の模式図によるアミノ
酸比較。一次アミノ酸配列を模式図的に整列させ、点線
の間のそれぞれの相同領域についてアミノ酸同一性のパ
ーセンテージを示す。各ドメイン境界のアミノ酸位置を
それぞれの受容体について示す。ＮおよびＣはアミノ末
端およびカルボキジル末端を表す。Ｃｙｓは推定上のＤ
ＮＡ結合ドメインをコードするシステインに富む領域に
相当し、一方Ｓｔｅｒｏｉｄ（コルチゾル、アルドステ
ロンまたはプロゲステロン）はステロイド結合ドメイン
を表す。ｈＧＲの免疫原領域（ＩＭＭ）も示す。アミノ
酸残基番号はｈＧＲについては実験の部Ｉから、ｒＰＲ
についてはＬｏｏｓｆｅｌｔら（１１）から、そしてｈ
ＭＲについては我々のデータから引用する。 ２２．内因性ステロイドの除去のために、洗浄チャーコ
ールを血清に加え〔１００ｍｌ当たり２ｇ（乾燥重
量）〕、３７℃で４０分間、次に５５℃で３０分間イン
キュベーションした。チャーコールは０．４５ミクロン
その後０．２ミクロンのフィルターを通して▲ろ▼過す
ることにより除いた。２３．ヒト細胞株は高親和性アル
ドステロン結合部位を発現すると報告されていない。ヒ
ト卵巣ＲＮＡのノザンブロット分析により、大きさが約
６ｋｂおよび４ｋｂの２つのハイブリッド形成ＲＮＡ種
が明らかになにった。卵巣でのアルドステロン結合活性
は報告されていない。 ４１．ｐＲＳｈＭＲの構築。ラムダｈｋ１０からの３．
７５ｋｂ挿入物は、ｈＭＲコード配列の５′末端にｍｐ
１８ポリリンカーが隣接する方向で、ｐＧＥＮ４（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ社）のＥｃｏＲＩ部位へ連結した。このプラ
スミド（ｐｈｋ１０）をＨｉｎｄＩＩＩで消化してポリ
リンカー部位から３５６２位のｈＭＲ部位に及ぶＨｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントを形成させ、このフラグメントを
単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて
両末端を修復した。プラスミドｐＲＳＶＣＡＴ〔Ｃ．
Ｍ．Ｇｏｒｍａｎ，Ｇ．Ｔ．Ｍｅｒｌｉｎｏ，Ｍ．Ｃ．
Ｓｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｂ．Ｈ．Ｈ
ｏｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，７９：６７７７（１９８２）〕はＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化し、そしてｐＢＲ３２２
配列、ＲＳＶ−ＬＴＲおよびＳＶ４０ポリＡ部位を含む
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩフラグメントもまた修復し
た。ｈＭＲフラグメントとｐＲＳＶＣＡＴ由来のフラグ
メントとの連結は、正しい方向でＲＳＶプロモーターに
より支配されるｈＭＲコード配列を含むベクターをもた
らした。第ＩＶ−４（Ａ）図でかっこに入れた部位はこ
のクローニング段階で失われた。翻訳効率を改良するた
めに、５′非翻訳領域中のいくつかの上流の開始コドン
および終結コドンが、このベクターをＡｃｃＩで消化し
てｍｐ１８ポリリンカーからｈＭＲ５′−ＵＴ領域中の
１８８位までの約２００ｂｐ配列を除去することにより
欠失された。最後に、ＮｄｅＩリンカーを付加したＳＶ
４０複製起点をＮｄｅＩ部位（１２）に導入してｐＲＳ
ｈＭＲを形成させた。
【００１０】実験の部Ｖ 新しいクラスのステロイドホルモン受容体の同定Ｖ．Ａ．序論 生殖腺および副腎はエストロゲン、プロゲスチン、アン
ドロゲン、グルココルチコイドおよびミネラロコルチコ
イドを含む５つの主なグループに類別される多種類のス
テロイドを産生する。生殖腺ステロイドは生殖系の分化
および成長をコントロールし、性的特徴を誘導・維持
し、そして生殖行動を調節する。同様に、副腎ステロイ
ドは代謝調節剤としての重要な役割のほかに分化にも影
響を与える。この広範囲の生理学的作用にもかかわら
ず、各ステロイドの効果は主としてそれが結合する特定
の同族受容体に基づいており、従ってステロイドホルモ
ン作用はそれらの生理活性を媒介する受容体に従ってよ
り正確に分類できるかも知れない。ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）ｃＤＮＡ（実験の部Ｉを参照され
たい、これは文献１として発表した）、すぐその後に実
施されたエストロゲン２’３（ｈＥＲ）、プロゲステロ
ン４（ｈＰＲ）およびミネラロコルチコイド受容体（ｈ
ＭＲ）をコードするｃＤＮＡ（実験の部ＩＶを参照、こ
れは文献５として発表）、ならびにいろいろな種
６−１１からの相同体の上首尾のクローニング、塩基配
列決定および発現は受容体の構造およびこれらの分予が
遺伝子発現を制御する分子機構を研究するための機会を
提供する。これらのタンパク質の配列比較および突然変
異分析は、すべてのクラスのステロイドホルモン受容体
に共通した構造的特徴を明らかにする（文献１２として
発表した実験の部ＩＩを参照；また文献１３および１４
を参照）。とりわけ、受容体は高度に保存されたシステ
インに富む領域（今や、ＤＮＡ−タウドメインと呼ばれ
る）を共有し、その領域はグルココルチコイド受容体
１５’１６のＤＮＡ結合機能およびトランス活性化機能
の両方に必要な情報をすべて含む。受容体間の共通セグ
メントの存在は、関連遺伝子産物についてゲノムを走査
する可能性を与える。例えば、ｈＭＲ ｃＤＮＡはハイ
ブリダイゼージョンプローブとしてｈＧＲを用いること
により分離された（文献５として発表した実験の部ＩＶ
を参照）。分子生物学が健康およびヒトの病気ならびに
これらの現象を支配する生理学の我々の理解を促し得る
１つの方法は、新しいホルモン応答系の同定を通してで
ある。この研究において、ヒトエストロゲン受容体ｃＤ
ＮＡの高度に保存されたＤＮＡ−タウ領域をハイブリダ
イゼージョンプローブとして使用することにより、我々
はステロイドホルモン受容体の構造的特徴をポリペプチ
ドをコードする２つのｃＤＮＡクローンを単離した。Ｖ．Ｂ．受容体ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡクローン 認定されていないホルモン応答系を検索する１つの方法
は、低下したストリンジェントハイブリダイゼーション
を系統的に利用して、新規なホルモン受容体について組
換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることであ
る。エストロゲン受容体のＤＮＡ−タウセグメントがこ
れらの研究を開始するために用いられた。ラムダｇｔ１
０ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーの分析により、３×１
０５組換えファージ当たり１個のクローンの頻度で３個
の陽性クローンが同定された。ヌクレオチド配列分析
は、これらのクローンのうち２個が実際にエストロゲン
受容体をコードしており、３番目のクローン（２．０キ
ロ塩基に及び、ラムダｈＴ１６と命名した）が部分的な
配列相同を示すことを明らかにした。その後、このクロ
ーンを使用してヒト胎児腎臓および成人心臓ｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングし、それにより３個の追加
クローンを同定した。腎臓ライブラリーからの２個のク
ローン（ラムダｈＫＥ４およびラムダｈＫＡ１）はラム
ダｈＴ１６と同じ遺伝子産物を表すが、心臓クローン
（ラムダｈＨ３）は部分的に関連しているにすぎない。
同一配列を共有する３つのｃＤＮＡの複合配列（ここで
はｈＥＲＲ１と呼ぶ）を第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−
１（Ｂ）−２図に示す。約１５０〜２００ヌクレオチド
１７のポリ（Ａ）尾部を仮定すると、この配列（約２４
３０ｎｔ）はほぼ全長であるにちがいない。ラムダｈＫ
ＡＩからのｃＤＮＡ挿入物はヌクレオチド１７９から２
４３０までを含み、一方ラムダｈＫＥ４はまれなメッセ
ンジャーＲＮＡのスプライジングエラー（ｓｐｌｉｃｉ
ｎｇ ｅｒｒｏｒ）を示し、エクソン２の欠失およびイ
ントロン配列の挿入を有する。ラムダｈＫＥ４によって
示唆されたエクソン／イントロン境界は、この遺伝子を
コードするゲノムフラグメントをクローニングして部分
的に塩基配列を決定することにより確かめた（データは
示さず）。最初のＡＴＧをとりまく配列は、翻訳開始部
位についてＫｏｚａｋ１８によって開示されたコンセン
サス配列と一致する。Ｍｒ５７３００のポリペプチドを
予告する５２１個のアミノ酸のオープン・リーディング
・フレームは、７７５ヌクレオチドの３′非翻訳領域と
接している。Ｖ．Ｃ．受容体ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡクローン クローンラムダｈＨ３の特性決定により、それはｈＥＲ
Ｒ１と高度に関連した唯一のポリペプチドをコードする
ことが分かった。第Ｖ−２（Ｂ）−１およびＶ−２
（Ｂ）−２図は、ラムダｈＨ３の２１５３ヌクレオチド
配列およびそのタンパク質産物（ｈＥＲＲ２と呼ぶ）の
一次構造を示す。その翻訳開始部位はヌクレオチド１０
０−１０２に一致するメチオニンコドンに指定された。
その理由は、これが読み枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）ター
ミネーターＴＧＡ（ヌクレオチド３１−３３）から下流
に現れる最初のＡＴＧトリプレットであるからである。
４３３個のアミノ酸を含むオープン・リーディング・フ
レームはＭｒ４７６００のポリペプチドをコードし、７
５２ヌクレオチドの３′非翻訳領域が後に続く。Ｖ．Ｄ．ｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２の特性決定 先に述べたように、ステロイドホルモン受容体は配列分
析により同定しうる別個の機能的ドメインから構成され
る。１４推定されたｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２ポリペ
プチドはステロイド受容体の予測されたドメイン特徴を
含む。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との間のアミノ酸比較
は、これらの２種のタンパク質が分岐（ｄｉｖｅｒｇｅ
ｎｔ）アミノ末端を有し、この領域内では他のクラスの
受容体との相同性が全く検出されないことを示す（デー
タは示さず）。この発見はこの領域の配列が高度に変化
しうることを示した先の比較研究（実験の部ＩＶを参
照；また文献５，８，１０，１４を参照）と一致してい
る。ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｈＥＲおよびｈＧＲの整
列（第Ｖ−３図）により、これらのタンパク質の間には
最高の相同度がｈＥＲＲ１のアミノ酸１７５から２４０
までの６６個のアミノ酸のシステインに富む領域〔ステ
ロイドホルモン受容体のＤＮＡ−タウドメイン（実験の
部ＩＩおよび文献１５を参照）に相当する〕に見られ
る。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との比較においては９１％
のアミノ酸同一性が存在し、ｈＥＲとの比較では６８
％、そしてｈＧＲとの比較では５６％の同一性が存在す
る。９個のシステイン残基の位置は厳格に保存されてい
るが、ｈＥＲＲ１の２０６位およびｈＥＲＲ２の１３４
位におけるヒスチジン残基の不在は前述のステロイドホ
ルモン受容体と大きく相違するところである。このヒス
チジン残基は元来保存性システイン残基と共にＤＮＡ結
合フィンガーの形成に関与すると考えられていた。リガ
ンド結合トランス活性化因子スーパーファミリーの他の
一員であるビタミンＤ受容体１９の対応するアミノ酸配
列にもこのヒスチジン残基の存在しないことが最近にな
って分かり、このことはＺｎ２＋原子がこれらのタンパ
ク質に存在する提案されたＤＮＡ結合フィンガーの形成
を調整するために、排他的にジステイン残基と相互作用
することを示唆している。ｈＥＲＲ１のアミノ酸２９５
と５２１の間に位置づけられる推定上のステロイド結合
ドメインは、ｈＥＲＲ２と比較したとき６３％の同一性
を示し、ｈＥＲとは３６％、そしてｈＧＲとは２８％の
同一性を示す。Ｖ．Ｅ．ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２のｍＲＮＡの組織
分布 ステロイド受容体はそれらの一次生理作用に直接関係す
る特徴的な組織特異的パターンで発現される。恐らく、
これらの推定受容体の分布はそれらの隠された本性に手
がかりを与えるであろう。従って、多種類のラットおよ
びヒト組織から分離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド−
アガロースゲル電気泳動で分画化し、ニトロセルロース
フィルターへ移行させた。プローブとしてラムダｈＫＡ
１を用いることにより、ｈＥＲＲ１をコードする２．６
ｋｂ ｍＲＮＡが検査したすべてのラットおよびヒト組
織に検出された。その際、驚いたことに、小脳および海
馬では高レベルで、そして肝臓、肺、精嚢および脾臓で
は最低レベルで検出された（第Ｖ−４（Ａ）図）。こう
して、ｈＥＲＲ１遺伝子は広く豊富に発現されるが、ラ
ット中枢神経系により一層高いレベルで存在すると思わ
れる。ｈＥＲＲ１ｍＲＮＡ発現パターンとは対照的に、
ｈＥＲＲ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの分布は、
極めて低レベルのｍＲＮＡが検出される少数の特定組織
に限られる（第Ｖ−４（Ｂ）図）。クローンラムダｈＨ
３から誘導されたプローブを用いて、４．８ｋｂ ｍＲ
ＮＡが腎臓、心臓、精巣、視床下部、海馬、小脳および
ラット前立腺から検出された。しかしながら、ヒト胎盤
または前立腺ではハイブリダイゼーションが全く検出さ
れなかった。露出時間の差異および生成する信号強度を
考慮すると、ｈＥＲＲ２ ｍＲＮＡのレベルはｈＥＲＲ
１のそれよりも約１０〜１００倍低下する。Ｖ．Ｆ．ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との相同性 従来の研究は、ステロイドホルモン受容体間のリガンド
結合ドメインの相同度がそれらのリガンドの構造的関連
性を反映すると指摘している。例えば、リガンド結合ド
メインが５６％の同一性を示すｈＧＲ、ｈＭＲおよびｈ
ＰＲ（実験の部ＩＶを参照）は関連ホルモンと親密に結
合する。実際、ｈＭＲはアルドステロンに等しい親和性
でもってグルココルチコイドと結合し、また比較的高い
親和性でプロゲステロンと結合する（実験の部ＩＶを参
照）。ｈＥＲＲ遺伝子産物の場合には、アミノ酸配列相
同がｈＥＲとの比較的遠い関係を示し、ＤＮＡ−タウ領
域では７０％およびステロイド結合領域では３６％の同
一性を示す（第Ｖ−５図）。これらの相同レベルはｈＧ
Ｒ、ｈＭＲおよびｈＰＲの間に観察されたものよりも低
く、従って推定上のｈＥＲＲタンパク質はエストロゲン
とは異なるクラスのステロイドホルモンと相互作用する
ことが推測される。しかしながら、ｈＥＲＲ１とｈＥＲ
Ｒ２との相同性は、それらが単一のまたは２つの密接に
関連したステロイド中間代謝物の受容体であることを示
唆している。ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２コード配列か
ら作製したキャップ構造をもつＳＰ６ＲＮＡのｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ翻訳産物またはＣＯＳ−１細胞による２つのｃ
ＤＮＡの発現産物を使用する予備ステロイド結合実験
（実験の部ＩＶおよびＩＩを参照）は、エストロゲンお
よびアンドロゲンを含む主要クラスのステロイドとの結
合を証明できなかった。Ｖ．Ｇ．結論 ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２ ｍＲＮＡ発現の組織分布
は、それぞれの推定上の受容体が別々の生物学的機能を
コントロールするであろうことを示唆する。これらのス
テロイドホルモン受容体の機能は何故見落されたのであ
ろうか。多分、それらの活性の多くは非定形の作用とし
て分類される差異をもつ他の受容体に誤って属するとみ
なされたのであろう。神経細胞ステロイド２０，２１の
最近の同定は、脳内でパラクリン作用をもつと思われる
新しいステロイドホルモンの証拠を提供する。このよう
な系は従来の生理学的検出を容易に免れた。従って、２
種類の新規なステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡの単離
は、新しいホルモン応答系の同定へ向けて第一歩を踏み
出すことになろう。Ｖ．Ｈ．実験のＶに関する図面の詳細な説明 第Ｖ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ｈＥＲＲ１の制限地図（Ａ）およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（Ｂ）。Ａ．ｈＥＲＲ１の複合ｃＤＮ
Ａを上段に表し、非コード配列（細線）およびコード配
列（斜線部分）を示す。通常の６−ヌクレオチド制限酵
素部位は線状地図の上に記す。配列決定に使用した重複
するｃＤＮＡ挿入物を示す。ラムダｈＫＥ４の５′未満
付近の波線は分岐配列を示す。Ｂ．ロング・オープン・
リーディング・フレーム上に与えられた推定アミノ酸を
伴う複合ｈＥＲＲ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列。第Ｖ−１（Ａ）および（Ｂ）図の方法 クローンラムダｈＴ１６はｈＥＲ ｃＤＮＡ（Ｖ．Ｇｉ
ｇｕｅｒｅおよびＲ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，未発表データ）
から誘導されたリンカー走査突然変異体１２（ｌｉｎｋ
ｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ）のｐＥＲ９４
５に由来するニックトランスレーション２２を行った４
４６ｂｐ ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを用い
て、ヒト精巣ラムダｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリー
（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）から分離された。ハイブリダ
イゼージョン混合物は３５％ホルムアミド、１×デンハ
ート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
および１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２Ｐ標識ＢｇｌＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメント（＞１０８ｃｐｍ／μｇ）を含んで
いた。２通りのニトロセルロースフィルターを４２℃で
１６時間ハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭク
エン酸ナトリウム）を用いて５５℃で２０分ずつ３回洗
浄し、そして増感紙を使って−７０℃でオートラジオグ
ラフィーを行った。クローンラムダｈＫＥ４およびラム
ダｈＫＡ１は、ラムダｈＴ１６由来のニックトランスレ
ーションした挿入物を用いて、ヒト腎臓ラムダｇｔ１０
ｃＤＮＡライブラリー２３から分離された。このスクリ
ーニングのために、ハイブリダイゼージョン混合物は５
０％ホルムアミドに変更し、洗浄条件は６８℃で０．１
％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに変えた。ｃＤＮＡクローン
は多数の制限酵素で消化し、生成したフラグメントをＭ
１３塩基配列決定ベクターｍｐ１８およびｍｐ１９に両
方の向きでサブクローニングし、そしてジデオキシ法
２４で塩基配列を決定した。ギャップやアンビギュイテ
ィは化学的切断法２５により解明した。ＤＮＡ配列は編
集してＤｅｖｅｒｅｕｘら２６およびＳｔａｄｅｎ２７
のプログラムにより分析した。第Ｖ−２（Ａ）および（Ｂ）図 ｈＥＲＲ２の制限地図（Ａ）およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（Ｂ）。Ａ．ｈＥＲＲ２ｃＤＮＡの模
式図；いくつかの通常の制限酵素部位を示す。斜線ボッ
クスは推定されたオープン・リーディング・フレームを
表す。Ｂ．ラムダｈＨ３の完全なヌクレオチド配列を、
ロング・オープン・リーディング・フレーム上の推定ア
ミノ酸配列と共に示す。５′非翻訳領域におけるショー
ト・オープン・リーディング・フレームは肉太の活字で
示す。第Ｖ−２（Ａ）および（Ｂ）図の方法 クローンラムダｈＨ３は、ラムダｈＫＡ１の５′部分を
表すニック トランスレーションした７００ｂｐ Ｅｃ
ｏＲＩ−ＳｍａＩフラグメントを用いて、ヒト心臓ラム
ダｇｔｌｌ ｃＤＮＡライブラリー（アルバート・アイ
ンシュタイン医科大学のＬ．Ａ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ博士
から寄贈）から分離された。ハイブリダイゼーション、
洗浄条件および塩基配列決定の手法はヒト腎臓ライブラ
リーについて第Ｖ−１（Ａ）および（Ｂ）図で説明した
通りであった。第Ｖ−３図 ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンおよびグル
ココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域間のアミノ
酸配列の比較。４種のアミノ酸配列はギャップ（ハイフ
ンで示す）を導入することにより最大相同性を得るよう
に整列させた。番号はｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２につ
いては第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）−２図な
らびに第Ｖ−２（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図か
ら、ｈＧＲについては第Ｉ−２図から、そしてｈＥＲに
ついてはＧｒｅｅｎら２から引用した。少なくとも３種
のポリペプチドにおいて一致するアミノ酸残基はボック
スで囲った。ｈＥＲＲ１の残基２０６の上の星印は、ｈ
ＥＲ配列中に存在するがｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２の両配
列中には存在しないヒスチジン残基の位置を示す。第Ｖ−４（Ａ）および（Ｂ）図 ラットおよびヒト組織におけるｈＥＲＲ１（Ａ）および
ｈＥＲＲ２（Ｂ）ｍＲＮＡのノザン・ブロッド・ハイブ
リダイゼーション。第Ｖ−４（Ａ）および（Ｂ）図の方法 全ＲＮＡはグアニジンチオシアネート２８を用いて種々
の組織から分離し、１％アガロース−ホルムアルデヒド
ゲル上で分画化し、ニトロセルロースヘ移行させ、そし
てストリンジェント条件下でラムダｈＫＡ１由来のニッ
クトランスレーションしたＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩフラグ
メント（ａ）およびラムダｈＨ３由来のニックトランス
レーションした１１９２ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラダメント（ｂ）を用いてハイブリダイズさせ
た。すべてのレーンにおいて２０μｇの全ＲＮＡを使用
した。リボソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動
をサイズマーカーとして示す。ニトロセルロースフィル
ターは増感紙を使って−７０℃で２４時間（ａ）および
６日間（ｂ）オートラジオグラフィーにかけた。（ａ）
におけるｍＲＮＡの泳動速度の明らかな差はゲルからの
アーチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔ）である。第Ｖ−５図 ｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２、ｈＥＲ、ｈＧＲおよびヒ
ト甲状腺ホルモン受容体（ｈＴ３Ｒベータ）間の模式図
によるアミノ酸比較。アミノ酸配列はステロイドおよび
甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリー４の機能的ド
メイン構造に従って模式図により整列させた。それぞれ
の受容体とｈＥＲＲ１とのアミノ酸同一性のパーセンテ
ージは各ドメインの内側に示す。それぞれのドメイン境
界のアミノ酸位置を各受容体について示す。
ドロゲン、グルココルチコイドおよびミネラロコルチコ
イドを含む５つの主なグループに類別される多種類のス
テロイドを産生する。生殖腺ステロイドは生殖系の分化
および成長をコントロールし、性的特徴を誘導・維持
し、そして生殖行動を調節する。同様に、副腎ステロイ
ドは代謝調節剤としての重要な役割のほかに分化にも影
響を与える。この広範囲の生理学的作用にもかかわら
ず、各ステロイドの効果は主としてそれが結合する特定
の同族受容体に基づいており、従ってステロイドホルモ
ン作用はそれらの生理活性を媒介する受容体に従ってよ
り正確に分類できるかも知れない。ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）ｃＤＮＡ（実験の部Ｉを参照され
たい、これは文献１として発表した）、すぐその後に実
施されたエストロゲン２’３（ｈＥＲ）、プロゲステロ
ン４（ｈＰＲ）およびミネラロコルチコイド受容体（ｈ
ＭＲ）をコードするｃＤＮＡ（実験の部ＩＶを参照、こ
れは文献５として発表）、ならびにいろいろな種
６−１１からの相同体の上首尾のクローニング、塩基配
列決定および発現は受容体の構造およびこれらの分予が
遺伝子発現を制御する分子機構を研究するための機会を
提供する。これらのタンパク質の配列比較および突然変
異分析は、すべてのクラスのステロイドホルモン受容体
に共通した構造的特徴を明らかにする（文献１２として
発表した実験の部ＩＩを参照；また文献１３および１４
を参照）。とりわけ、受容体は高度に保存されたシステ
インに富む領域（今や、ＤＮＡ−タウドメインと呼ばれ
る）を共有し、その領域はグルココルチコイド受容体
１５’１６のＤＮＡ結合機能およびトランス活性化機能
の両方に必要な情報をすべて含む。受容体間の共通セグ
メントの存在は、関連遺伝子産物についてゲノムを走査
する可能性を与える。例えば、ｈＭＲ ｃＤＮＡはハイ
ブリダイゼージョンプローブとしてｈＧＲを用いること
により分離された（文献５として発表した実験の部ＩＶ
を参照）。分子生物学が健康およびヒトの病気ならびに
これらの現象を支配する生理学の我々の理解を促し得る
１つの方法は、新しいホルモン応答系の同定を通してで
ある。この研究において、ヒトエストロゲン受容体ｃＤ
ＮＡの高度に保存されたＤＮＡ−タウ領域をハイブリダ
イゼージョンプローブとして使用することにより、我々
はステロイドホルモン受容体の構造的特徴をポリペプチ
ドをコードする２つのｃＤＮＡクローンを単離した。Ｖ．Ｂ．受容体ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡクローン 認定されていないホルモン応答系を検索する１つの方法
は、低下したストリンジェントハイブリダイゼーション
を系統的に利用して、新規なホルモン受容体について組
換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることであ
る。エストロゲン受容体のＤＮＡ−タウセグメントがこ
れらの研究を開始するために用いられた。ラムダｇｔ１
０ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーの分析により、３×１
０５組換えファージ当たり１個のクローンの頻度で３個
の陽性クローンが同定された。ヌクレオチド配列分析
は、これらのクローンのうち２個が実際にエストロゲン
受容体をコードしており、３番目のクローン（２．０キ
ロ塩基に及び、ラムダｈＴ１６と命名した）が部分的な
配列相同を示すことを明らかにした。その後、このクロ
ーンを使用してヒト胎児腎臓および成人心臓ｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングし、それにより３個の追加
クローンを同定した。腎臓ライブラリーからの２個のク
ローン（ラムダｈＫＥ４およびラムダｈＫＡ１）はラム
ダｈＴ１６と同じ遺伝子産物を表すが、心臓クローン
（ラムダｈＨ３）は部分的に関連しているにすぎない。
同一配列を共有する３つのｃＤＮＡの複合配列（ここで
はｈＥＲＲ１と呼ぶ）を第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−
１（Ｂ）−２図に示す。約１５０〜２００ヌクレオチド
１７のポリ（Ａ）尾部を仮定すると、この配列（約２４
３０ｎｔ）はほぼ全長であるにちがいない。ラムダｈＫ
ＡＩからのｃＤＮＡ挿入物はヌクレオチド１７９から２
４３０までを含み、一方ラムダｈＫＥ４はまれなメッセ
ンジャーＲＮＡのスプライジングエラー（ｓｐｌｉｃｉ
ｎｇ ｅｒｒｏｒ）を示し、エクソン２の欠失およびイ
ントロン配列の挿入を有する。ラムダｈＫＥ４によって
示唆されたエクソン／イントロン境界は、この遺伝子を
コードするゲノムフラグメントをクローニングして部分
的に塩基配列を決定することにより確かめた（データは
示さず）。最初のＡＴＧをとりまく配列は、翻訳開始部
位についてＫｏｚａｋ１８によって開示されたコンセン
サス配列と一致する。Ｍｒ５７３００のポリペプチドを
予告する５２１個のアミノ酸のオープン・リーディング
・フレームは、７７５ヌクレオチドの３′非翻訳領域と
接している。Ｖ．Ｃ．受容体ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡクローン クローンラムダｈＨ３の特性決定により、それはｈＥＲ
Ｒ１と高度に関連した唯一のポリペプチドをコードする
ことが分かった。第Ｖ−２（Ｂ）−１およびＶ−２
（Ｂ）−２図は、ラムダｈＨ３の２１５３ヌクレオチド
配列およびそのタンパク質産物（ｈＥＲＲ２と呼ぶ）の
一次構造を示す。その翻訳開始部位はヌクレオチド１０
０−１０２に一致するメチオニンコドンに指定された。
その理由は、これが読み枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）ター
ミネーターＴＧＡ（ヌクレオチド３１−３３）から下流
に現れる最初のＡＴＧトリプレットであるからである。
４３３個のアミノ酸を含むオープン・リーディング・フ
レームはＭｒ４７６００のポリペプチドをコードし、７
５２ヌクレオチドの３′非翻訳領域が後に続く。Ｖ．Ｄ．ｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２の特性決定 先に述べたように、ステロイドホルモン受容体は配列分
析により同定しうる別個の機能的ドメインから構成され
る。１４推定されたｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２ポリペ
プチドはステロイド受容体の予測されたドメイン特徴を
含む。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との間のアミノ酸比較
は、これらの２種のタンパク質が分岐（ｄｉｖｅｒｇｅ
ｎｔ）アミノ末端を有し、この領域内では他のクラスの
受容体との相同性が全く検出されないことを示す（デー
タは示さず）。この発見はこの領域の配列が高度に変化
しうることを示した先の比較研究（実験の部ＩＶを参
照；また文献５，８，１０，１４を参照）と一致してい
る。ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｈＥＲおよびｈＧＲの整
列（第Ｖ−３図）により、これらのタンパク質の間には
最高の相同度がｈＥＲＲ１のアミノ酸１７５から２４０
までの６６個のアミノ酸のシステインに富む領域〔ステ
ロイドホルモン受容体のＤＮＡ−タウドメイン（実験の
部ＩＩおよび文献１５を参照）に相当する〕に見られ
る。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との比較においては９１％
のアミノ酸同一性が存在し、ｈＥＲとの比較では６８
％、そしてｈＧＲとの比較では５６％の同一性が存在す
る。９個のシステイン残基の位置は厳格に保存されてい
るが、ｈＥＲＲ１の２０６位およびｈＥＲＲ２の１３４
位におけるヒスチジン残基の不在は前述のステロイドホ
ルモン受容体と大きく相違するところである。このヒス
チジン残基は元来保存性システイン残基と共にＤＮＡ結
合フィンガーの形成に関与すると考えられていた。リガ
ンド結合トランス活性化因子スーパーファミリーの他の
一員であるビタミンＤ受容体１９の対応するアミノ酸配
列にもこのヒスチジン残基の存在しないことが最近にな
って分かり、このことはＺｎ２＋原子がこれらのタンパ
ク質に存在する提案されたＤＮＡ結合フィンガーの形成
を調整するために、排他的にジステイン残基と相互作用
することを示唆している。ｈＥＲＲ１のアミノ酸２９５
と５２１の間に位置づけられる推定上のステロイド結合
ドメインは、ｈＥＲＲ２と比較したとき６３％の同一性
を示し、ｈＥＲとは３６％、そしてｈＧＲとは２８％の
同一性を示す。Ｖ．Ｅ．ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２のｍＲＮＡの組織
分布 ステロイド受容体はそれらの一次生理作用に直接関係す
る特徴的な組織特異的パターンで発現される。恐らく、
これらの推定受容体の分布はそれらの隠された本性に手
がかりを与えるであろう。従って、多種類のラットおよ
びヒト組織から分離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド−
アガロースゲル電気泳動で分画化し、ニトロセルロース
フィルターへ移行させた。プローブとしてラムダｈＫＡ
１を用いることにより、ｈＥＲＲ１をコードする２．６
ｋｂ ｍＲＮＡが検査したすべてのラットおよびヒト組
織に検出された。その際、驚いたことに、小脳および海
馬では高レベルで、そして肝臓、肺、精嚢および脾臓で
は最低レベルで検出された（第Ｖ−４（Ａ）図）。こう
して、ｈＥＲＲ１遺伝子は広く豊富に発現されるが、ラ
ット中枢神経系により一層高いレベルで存在すると思わ
れる。ｈＥＲＲ１ｍＲＮＡ発現パターンとは対照的に、
ｈＥＲＲ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの分布は、
極めて低レベルのｍＲＮＡが検出される少数の特定組織
に限られる（第Ｖ−４（Ｂ）図）。クローンラムダｈＨ
３から誘導されたプローブを用いて、４．８ｋｂ ｍＲ
ＮＡが腎臓、心臓、精巣、視床下部、海馬、小脳および
ラット前立腺から検出された。しかしながら、ヒト胎盤
または前立腺ではハイブリダイゼーションが全く検出さ
れなかった。露出時間の差異および生成する信号強度を
考慮すると、ｈＥＲＲ２ ｍＲＮＡのレベルはｈＥＲＲ
１のそれよりも約１０〜１００倍低下する。Ｖ．Ｆ．ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との相同性 従来の研究は、ステロイドホルモン受容体間のリガンド
結合ドメインの相同度がそれらのリガンドの構造的関連
性を反映すると指摘している。例えば、リガンド結合ド
メインが５６％の同一性を示すｈＧＲ、ｈＭＲおよびｈ
ＰＲ（実験の部ＩＶを参照）は関連ホルモンと親密に結
合する。実際、ｈＭＲはアルドステロンに等しい親和性
でもってグルココルチコイドと結合し、また比較的高い
親和性でプロゲステロンと結合する（実験の部ＩＶを参
照）。ｈＥＲＲ遺伝子産物の場合には、アミノ酸配列相
同がｈＥＲとの比較的遠い関係を示し、ＤＮＡ−タウ領
域では７０％およびステロイド結合領域では３６％の同
一性を示す（第Ｖ−５図）。これらの相同レベルはｈＧ
Ｒ、ｈＭＲおよびｈＰＲの間に観察されたものよりも低
く、従って推定上のｈＥＲＲタンパク質はエストロゲン
とは異なるクラスのステロイドホルモンと相互作用する
ことが推測される。しかしながら、ｈＥＲＲ１とｈＥＲ
Ｒ２との相同性は、それらが単一のまたは２つの密接に
関連したステロイド中間代謝物の受容体であることを示
唆している。ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２コード配列か
ら作製したキャップ構造をもつＳＰ６ＲＮＡのｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ翻訳産物またはＣＯＳ−１細胞による２つのｃ
ＤＮＡの発現産物を使用する予備ステロイド結合実験
（実験の部ＩＶおよびＩＩを参照）は、エストロゲンお
よびアンドロゲンを含む主要クラスのステロイドとの結
合を証明できなかった。Ｖ．Ｇ．結論 ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２ ｍＲＮＡ発現の組織分布
は、それぞれの推定上の受容体が別々の生物学的機能を
コントロールするであろうことを示唆する。これらのス
テロイドホルモン受容体の機能は何故見落されたのであ
ろうか。多分、それらの活性の多くは非定形の作用とし
て分類される差異をもつ他の受容体に誤って属するとみ
なされたのであろう。神経細胞ステロイド２０，２１の
最近の同定は、脳内でパラクリン作用をもつと思われる
新しいステロイドホルモンの証拠を提供する。このよう
な系は従来の生理学的検出を容易に免れた。従って、２
種類の新規なステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡの単離
は、新しいホルモン応答系の同定へ向けて第一歩を踏み
出すことになろう。Ｖ．Ｈ．実験のＶに関する図面の詳細な説明 第Ｖ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ｈＥＲＲ１の制限地図（Ａ）およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（Ｂ）。Ａ．ｈＥＲＲ１の複合ｃＤＮ
Ａを上段に表し、非コード配列（細線）およびコード配
列（斜線部分）を示す。通常の６−ヌクレオチド制限酵
素部位は線状地図の上に記す。配列決定に使用した重複
するｃＤＮＡ挿入物を示す。ラムダｈＫＥ４の５′未満
付近の波線は分岐配列を示す。Ｂ．ロング・オープン・
リーディング・フレーム上に与えられた推定アミノ酸を
伴う複合ｈＥＲＲ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列。第Ｖ−１（Ａ）および（Ｂ）図の方法 クローンラムダｈＴ１６はｈＥＲ ｃＤＮＡ（Ｖ．Ｇｉ
ｇｕｅｒｅおよびＲ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，未発表データ）
から誘導されたリンカー走査突然変異体１２（ｌｉｎｋ
ｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ）のｐＥＲ９４
５に由来するニックトランスレーション２２を行った４
４６ｂｐ ＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを用い
て、ヒト精巣ラムダｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリー
（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）から分離された。ハイブリダ
イゼージョン混合物は３５％ホルムアミド、１×デンハ
ート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
および１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２Ｐ標識ＢｇｌＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメント（＞１０８ｃｐｍ／μｇ）を含んで
いた。２通りのニトロセルロースフィルターを４２℃で
１６時間ハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭク
エン酸ナトリウム）を用いて５５℃で２０分ずつ３回洗
浄し、そして増感紙を使って−７０℃でオートラジオグ
ラフィーを行った。クローンラムダｈＫＥ４およびラム
ダｈＫＡ１は、ラムダｈＴ１６由来のニックトランスレ
ーションした挿入物を用いて、ヒト腎臓ラムダｇｔ１０
ｃＤＮＡライブラリー２３から分離された。このスクリ
ーニングのために、ハイブリダイゼージョン混合物は５
０％ホルムアミドに変更し、洗浄条件は６８℃で０．１
％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに変えた。ｃＤＮＡクローン
は多数の制限酵素で消化し、生成したフラグメントをＭ
１３塩基配列決定ベクターｍｐ１８およびｍｐ１９に両
方の向きでサブクローニングし、そしてジデオキシ法
２４で塩基配列を決定した。ギャップやアンビギュイテ
ィは化学的切断法２５により解明した。ＤＮＡ配列は編
集してＤｅｖｅｒｅｕｘら２６およびＳｔａｄｅｎ２７
のプログラムにより分析した。第Ｖ−２（Ａ）および（Ｂ）図 ｈＥＲＲ２の制限地図（Ａ）およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（Ｂ）。Ａ．ｈＥＲＲ２ｃＤＮＡの模
式図；いくつかの通常の制限酵素部位を示す。斜線ボッ
クスは推定されたオープン・リーディング・フレームを
表す。Ｂ．ラムダｈＨ３の完全なヌクレオチド配列を、
ロング・オープン・リーディング・フレーム上の推定ア
ミノ酸配列と共に示す。５′非翻訳領域におけるショー
ト・オープン・リーディング・フレームは肉太の活字で
示す。第Ｖ−２（Ａ）および（Ｂ）図の方法 クローンラムダｈＨ３は、ラムダｈＫＡ１の５′部分を
表すニック トランスレーションした７００ｂｐ Ｅｃ
ｏＲＩ−ＳｍａＩフラグメントを用いて、ヒト心臓ラム
ダｇｔｌｌ ｃＤＮＡライブラリー（アルバート・アイ
ンシュタイン医科大学のＬ．Ａ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ博士
から寄贈）から分離された。ハイブリダイゼーション、
洗浄条件および塩基配列決定の手法はヒト腎臓ライブラ
リーについて第Ｖ−１（Ａ）および（Ｂ）図で説明した
通りであった。第Ｖ−３図 ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンおよびグル
ココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域間のアミノ
酸配列の比較。４種のアミノ酸配列はギャップ（ハイフ
ンで示す）を導入することにより最大相同性を得るよう
に整列させた。番号はｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２につ
いては第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）−２図な
らびに第Ｖ−２（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図か
ら、ｈＧＲについては第Ｉ−２図から、そしてｈＥＲに
ついてはＧｒｅｅｎら２から引用した。少なくとも３種
のポリペプチドにおいて一致するアミノ酸残基はボック
スで囲った。ｈＥＲＲ１の残基２０６の上の星印は、ｈ
ＥＲ配列中に存在するがｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２の両配
列中には存在しないヒスチジン残基の位置を示す。第Ｖ−４（Ａ）および（Ｂ）図 ラットおよびヒト組織におけるｈＥＲＲ１（Ａ）および
ｈＥＲＲ２（Ｂ）ｍＲＮＡのノザン・ブロッド・ハイブ
リダイゼーション。第Ｖ−４（Ａ）および（Ｂ）図の方法 全ＲＮＡはグアニジンチオシアネート２８を用いて種々
の組織から分離し、１％アガロース−ホルムアルデヒド
ゲル上で分画化し、ニトロセルロースヘ移行させ、そし
てストリンジェント条件下でラムダｈＫＡ１由来のニッ
クトランスレーションしたＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩフラグ
メント（ａ）およびラムダｈＨ３由来のニックトランス
レーションした１１９２ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラダメント（ｂ）を用いてハイブリダイズさせ
た。すべてのレーンにおいて２０μｇの全ＲＮＡを使用
した。リボソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動
をサイズマーカーとして示す。ニトロセルロースフィル
ターは増感紙を使って−７０℃で２４時間（ａ）および
６日間（ｂ）オートラジオグラフィーにかけた。（ａ）
におけるｍＲＮＡの泳動速度の明らかな差はゲルからの
アーチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔ）である。第Ｖ−５図 ｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２、ｈＥＲ、ｈＧＲおよびヒ
ト甲状腺ホルモン受容体（ｈＴ３Ｒベータ）間の模式図
によるアミノ酸比較。アミノ酸配列はステロイドおよび
甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリー４の機能的ド
メイン構造に従って模式図により整列させた。それぞれ
の受容体とｈＥＲＲ１とのアミノ酸同一性のパーセンテ
ージは各ドメインの内側に示す。それぞれのドメイン境
界のアミノ酸位置を各受容体について示す。
【００１１】実験の部ＶＩ ラット成長ホルモン遺伝子のｃ−ｅｒｂ−Ａ結合部位は
甲状腺ホルモンによるトランス作用を仲介するＶＩ．Ａ．序論 １．３．３−トリヨードチロニン（Ｔ３）物質はラット
下垂体腫瘍細胞１−４において成長ホルモン遺伝子転写
を剌激する。この剌激は、その転写開始部位の５′側の
調節因子に核Ｔ３受容体が結合することにより仲介され
ると考えられる。５−８甲状腺ホルモンが遺伝子転写を
活性化するメカニズムの理解は、核Ｔ３受容体が豊富に
存在しないためにそれらを精製するのが困難であるこ
と、およびＴ３調節に作用するＴ３受容体−ＤＮＡ結合
部位が明確でないことにより制限されている。最近、ヒ
トおよびトリｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子産物は、高親和性で
もって甲状腺ホルモンと結合し（文献１０として発表し
た実験の部ＩＩＩを参照）、甲状腺ホルモン受容体の分
子量および核結合特性をもつことが見出された。目下の
研究において、我々はラット成長ホルモン遺伝子の転写
開始部位の５′側の１６４塩基対に位置する配列５′Ｃ
ＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３′へのラット下垂体
細胞Ｔ３受容体の特異的高親和性結合を検出できるアビ
ジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合検定の開発について説明
する。この配列を含むオリゴヌクレオチドは、トランス
フェクションしたラット下垂体ＧＣ２細胞においてＴ３
調節を単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーター
へ転移し、またヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子のｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳産物と特異的に結合した。このデータ
は、ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子がＴ３の転写作用を仲介
し、またＧＣ２細胞核抽出物がラット成長ホルモン遺伝
子Ｔ３応答因子への下垂体Ｔ３受容体の結合を変更する
別の因子を含むことを支持する証拠を提供する。ＶＩ．Ｂ．Ｔ３調節に必要なラット成長ホルモンＤＮＡ 配列の特性決定 （ａ）ラットＧＨ遺伝子欠失検定 Ｔ３調節に必要な成長ホルモン（ＧＨ）５′側ゲノム配
列中のジス活性因子を同定するために、我々は細菌クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子へ融合し且つラット下垂体ＧＣ２細胞にトラ
ンスフェクションした、ラットＧＨ遺伝子の一連の５′
欠失フラグメントを使用した（第ＩＶ−１（Ａ）図）。
−２３５位から転写開始（ＣＡＰ）部位までの５′欠失
物はＴ３に対する調節を転移させ（４．６倍，第ＶＩ−
１（Ａ）図）、以前の研究５’６に一致して１．７キロ
塩基（ｋｂ）または３０７塩基対（ｂｐ）の５′側ラッ
トＧＨ情報を含む構築物に等しかった（データは示さ
ず）。（ヌクレオチド位置はＣＡＰ部位に対して番号付
けされており、負の位置番号はそれに対して５′側であ
ることを意味する。）２３５ｂｐより少ない５′側ＧＨ
情報を含む欠失物は、Ｔ３の不在下でのＣＡＴ発現レベ
ルが有意にバックグラウンド以上でなかったので、Ｔ３
誘導について検定できなかった。この問題を解決するた
めに、ラットプロラクチンエンハンサー因子１１を１８
１ｂｐおよび１１０ｂｐの５′側情報を含むラットＧＨ
遺伝子フラグメントに近接して融合させた。−１８１位
まで延びる５′欠失フラグメントはＴ３によって２．６
倍の誘導を与え、そしてＣＡＰ部位から−１０７位まで
の別の欠失はＴ３調節を示さなかった（第ＶＩ−１
（Ａ）図）。 （ｂ）ＣＡＴ酵素検定 ３′欠失について検定するために、ラットＧＨ遺伝子の
フラグメントは単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｈ
ＳＶ ｔｋ）プロモーターに融合した。ＣＡＰ部位から
−２３５位ないし−４５位まで延びるＧＨ遺伝子フラグ
メントは、天然のままの向きでおよび逆向きでｔｋプロ
モーターに融合したとき、それぞれ２．５倍および２．
３倍のＣＡＴ活性刺激をもたらした（第ＶＩ−１（Ｂ）
図）。ＧＨ ＣＡＰ部位から２３５位ないし１４５位ま
で延びる９０ｂｐフラグメントは、２３５−４５ｂｐフ
ラグメントよりも一層効果的にＴ３調節を転移させ、こ
のことはネガティブＴ３調節因子がＣＡＰ部位から４５
ｂｐと１４５ｂｐの間に存在しうることを示唆している
（第ＶＩ−１（Ａ）図）。ＣＡＴメッセンジャーＲＮＡ
は、ｔｋプロモーターを含むプラスミドでトランスフェ
クションした細胞において観察されたＣＡＴ活性のＴ３
依存性刺激が適当に開始された転写物の増加によって起
こるのかどうかを調べるために、プライマー伸長技術
１２を用いて分析した。ｔｋプロモーターに融合した２
３５−４５ｂｐ ＧＨフラグメントはＴ３の存在下で正
しく開始されたＣＡＴ ｍＲＮＡを約４倍増加させ（第
ＶＩ−１（Ｃ）図）、これは観察されたＣＡＴ活性の測
定値と一致する結果であった。 （ｃ）アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合検定（ＡＢＣ
Ｄ検定） Ｔ３調節に必要とされる配列をさらに明確に定めるため
に、成長ホルモンＴ３調節因子への核Ｔ３受容体の特異
的結合を証明する必要があった。ゲルシフトおよびフッ
トプリント検定によりＴ３受容体結合部位をマッピング
する試みが初め不成功に終わったので、特異的結合を検
出する新しい検定法、アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結
合（ＡＢＣＤ）検定法、が創案された。第ＶＩ−２
（Ａ）図に示すような、いろいろな位置にビオチン−１
１−ｄＵＴＰを有する、Ｔ３調節に必要なＧＨ遺伝子の
５′側領域を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが作製され
た。初めに−２０９位から−１４６位までの成長ホルモ
ンゲノム配列を含む７７ｂｐオリゴヌクレオチド（Ｇ２
０９−１４６）を使用した。ＧＣ２核抽出物からのＴ３
受容体は１２５Ｉ−Ｔ３を用いて高い比活性へ標識し、
そしてビオチニル化オリゴヌクレオチドとインキュベー
トした。タンパク質−ＤＮＡ複合体は、その結合反応後
に、アガロースビーズに結合したストレプトアビジンを
用いて溶液から沈澱させた。第ＶＩ−２（Ｂ）図から明
らかなように、プローブＧ２０９−１４６は６９００ｃ
ｐｍの１２５Ｉ−Ｔ３活性の沈澱を生じさせた。これは
約３．２フェムトモルのＴ３受容体の結合を表し、結合
反応混合物中に存在する全Ｔ３受容体の約４０％を占め
る。１２５Ｉ−Ｔ３標識受容体の沈澱はプローブ依存性
であった；沈澱した１２５Ｉ−Ｔ３の全放射能の＜１５
％がＧ２０９−１４６の不在下で回収された。１００倍
過剰モル量の未標識Ｔ３の添加は沈澱した１２５Ｉ−Ｔ
３をバックグラウンドレベルにまで低下させ（第ＶＩ−
２（Ｂ）図）、このことはプローブによって沈澱される
はずのＴ３結合タンパク質が制限された量で存在してい
たことを示している。Ｔ３受容体−ＤＮＡ複合体の平衡
結合定数は１．４×１０−９Ｍであると概算された（デ
ータは示さず）。Ｇ２０９−１４６による標識Ｔ３受容
体の沈澱が特定のラットＧＨ配列に依存するかどうかを
調べるために、成長ホルモンエンハンサーとの明らかな
配列類似性をもたないがＧ２０９−１４６と同じ長さで
あり且つ同じ数のビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基を含む
一連のビオチニル化プローブを作製した。第ＶＩ−２
（Ｂ）図に示すように、ＧＣ２核抽出物への１００ｆｍ
ｏｌの各プローブの添加は測定しうる１２５Ｉ−Ｔ３の
沈澱を与えなかった。これはＧ２０９−１４６による
１２５Ｉ−Ｔ３の沈澱がこのプローブに含まれるラット
ＧＨ配列に依存することを示している。 （ｄ）フットプリント分析 通常のフットプリント法を用いてＴ３受容体結合部位を
局在化するための初期の試みは成功しなかったが、ＡＢ
ＣＤ結合検定における緩衝条件の変化は、もしもＤＮＡ
結合のための塩およびｐＨ条件が最適であるならば、粗
製核抽出物の場合にもフットプリントが達成しうること
を示唆した（データは示さず）。ＧＨエンハンサーの末
端標識フラグメントはＧＣ２核抽出物とインキュベート
し、ＤＮアーゼＩで消化した。変性条件下での消化物の
ＰＡＧＥ分析（第ＶＩ−３図）は以前に記載された２つ
のフットプリントを与え１３，１４；これらのうちの１
つはヌクレオチド−１７９と−１６４の間のアンチセン
ス鎖中の１６ｂｐ保護領域により示される。センス鎖に
おいて５′ＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３′に相
当するこの配列は、Ｔ３受容体と特異的に結合するオリ
ゴヌクレオチドプローブ中に含まれ、以前に同定された
Ｔ３依存性ＤＮアーゼＩ高感受性部位１９の位置に対応
する。センス鎖それ自体中にはっきりしたフットプリン
トは検出されなかったが、それは主としてこのＧに富む
領域におけるＤＮアーゼＩによる不完全消化のためであ
る。ＶＩ．Ｃ．Ｔ３オリゴヌクレオチドの機能性 ＧＨ遺伝子のＴ３調節におけるこの配列の機能を調べる
ために、特定部位の突然変異誘発を用いて野生型エンハ
ンサーから１１ｂｐのフットプリントを欠失させた（突
然変異体Ｇデルタ１６６／１７７）。ｔｋプロモーター
に融合した突然変異体Ｇデルタ１６６／１７７でトラン
スフェクションした細胞へのＴ３の添加はＣＡＴの発現
量に何ら影響を及ぼさなかったが、野生型エンハンサー
はＣＡＴ発現を９倍刺激した（第ＶＩ−１（Ｂ）図）。
従って、オリゴヌクレオチドおよびＤＮアーゼＩ結合検
定により同定した推定上のＴ３受容体結合領域の除去
は、ｔｋプロモーターにＴ３調節を付与するＧＨエンハ
ンサーの能力を失わせた。−１６４位から−１７９位ま
での１６塩基対が機能的なＴ３調節因子を構成すること
を証明するために、５′末端側および３′末端側にそれ
ぞれ７塩基および６塩基を付加したこの配列を含む二本
鎖オリゴヌクレオチドが作製された。このオリゴヌクレ
オチドはｔｋプロモーターに近接して天然のままの向き
で挿入した（構築物Ｇ２９ＴＫ，第ＶＩ−１（Ｂ）
図）。この構築物でトランスフェクションした細胞で
は、ＣＡＴ発現がＴ３によって２．９倍刺激された。こ
の配列３つを直列に配置したもの（構築物Ｇ２９３Ｔ
Ｋ）を挿入すると、Ｔ３によって５倍の刺激が生じた。
ｔｋプロモーターへのＴ３調節の転移のために使用した
短いオリゴヌクレオチド（Ｇ１８６−１５８）もまた、
Ｇ２０９−１４６中の核Ｔ３受容体結合部位と特異的に
結合したが、これはヌクレオチド位置−１７７から−２
３５までのラットＧＨ配列を含むオリゴヌクレオチド
（測定可能な量のＴ３受容体と結合しなかった）を用い
ることにより失われた（データは示さず）。非ビオチニ
ル化Ｇ２０９−１４６およびＧ１８６−１５８はまたビ
オチニル化Ｇ２０９−１４６とＴ３受容体との結合を競
合させるべく使用した；Ｇ２０９−１４６に対するＴ３
受容体の相対親和性はＧ１８６−１５８よりも２〜３倍
高かった（データは示さず）。短い方のプローブに対す
る明らかな親和性の低下は、Ｔ３受容体結合反応に直接
関与する塩基の欠乏により生ずるのかも知れない。この
ことは、ＤＮアーゼＩフットプリントの境界がこのプロ
ーブの両末端内にあるので、ありそうもない。その池に
考えられることとして、ＧＣ２核抽出物は長いプローブ
へのＴ３受容体の結合を安定化させる他の因子を含むの
かも知れない。ＶＩ．Ｄ．要約および結論 これらの実験は、ＣＡＰ部位に対して５′側の−１６４
位から−１７９位まで延びる１６ｂｐフットプリントを
含む２９塩基対のＧＨ遺伝子がＴ３受容体と結合し、ラ
ットＧＨエンハンサーのＴ３調節にとって必要であり、
またＴ３調節をｔｋプロモーターへ転移できることを証
明した。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａがこの因子と結合するかど
うかを試験するために、ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳産物を３５
Ｓ−メチオニンで標識した（実験の部ＩＩＩを参照）。
この産物はＳＤＳゲル電気泳動上で相対分子量（Ｍｒ）
４８０００（４８Ｋ）および５２Ｋのダブレットとして
泳動し、そして５×１０＋１１のｈｄ値でＴ３と結合し
た。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物のラ
ットＧＨ Ｔ３調節因子を含むＧ２０９−１４６および
Ｇ１８６−１５８オリゴヌクレオチドプローブへの結合
は第ＶＩ−４図に示す。長いプローブおよび短いプロー
ブは両方ともｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物と有意に結合し
たが、ＧＨ遺伝子のＴ３受容体結合部位に対して相同性
を欠くプローブ（例えばＰ−ＥＧＦ）は結合しなかっ
た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳混合物中に存在する
〔３５Ｓ〕メチオニンの概算上の比活性に基づいて、第
ＶＩ−４図に示した結合活性は１〜２ｆｍｏｌのｅｒｂ
−Ａタンパク質に相当する。１２５Ｉ−Ｔ３受容体を含
むＧＣ２細胞核抽出物と相違して、ｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物は長いオリゴヌクレオチドと短
いオリゴヌクレオチドの両方に同程度に結合した。類似
のデータが１２５Ｉ−Ｔ３で標識したヒトｃ−ｅｒｂ−
Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物を用いて得られた（デー
タは示さず）。これらの結果は、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子
産物がＧＣ２核抽出物からのＴ３受容体によって結合さ
れる同じＴ３調節配列と特異的に結合することを示して
いる。それらは、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子産物の機能がＴ
３の転写作用を仲介することであるという更なる証拠を
提供する。Ｆｌｕｇら（１９８７）は、ヌクレオチド位
置−２１０と−１８１の間のＧＨ配列が一時的にトラン
スフェクションしたＧＣ細胞におけるＴ３の完全刺激作
用に不可欠であることを最近報告し、さらにこの領域が
Ｔ３調節される他の遺伝子に対し限られた類似性を保有
することを指摘した。我々の実験は、Ｔ３受容体−ＤＮ
Ａ結合部位をＣＡＰ部位から１６４ｂｐと１７９ｂｐの
間に位置づけ、さらにＧＨ遺伝子のＴ３調節におけるヌ
クレオチド位置−２１０と−１８１の間の配列の機能的
重要性について証明する。これは、我々がＴ３受容体源
として粗製核抽出物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ
結合実験で観察したように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこ
の上流因子を含むＧＨエンハンサーフラグメントに対す
るＴ３受容体の増大した親和性を反映するであろう。ｅ
ｒｂ−Ａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物がＧ２０９−１４
６およびＧ１８６−１５８と同程度に結合するというこ
とは、粗製ＧＣ２核抽出物がヌクレオチド位置−２１０
と−１８１の間の配列と結合し且つその結合部位に対す
るＴ３受容体の結合を安定化する別の因子（１種または
２種以上）を含む可能性と一致する。真核細胞の転写因
子間の協同的相互作用は十分に確立されている
１６−１８；いくつかの場合において、これは別の因子
のＤＮＡ結合親和性を変更するある因子の能力を反映し
ている。この種の相互作用は甲状腺ホルモン作用の組織
特異的調節において重要であるだろう。５，６ここで使
用したＡＢＣＤ結合検定はこれらの問題を処理するのに
有用であり、それはまた標識リガンド、化学的修飾また
は標識アミノ酸によるｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて選
択的に放射性標識しうるすべてのＤＮＡ結合タンパク質
に応用できるであろう。ＶＩ．Ｅ．実験の部ＶＩに関する図面の詳細な説明 第ＶＩ−Ｉ（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 ラットＧＨ５′−フランキング配列を含む種々の遺伝子
融合物の甲状腺ホルモン応答性。Ａ．ラットＧＨ遺伝子
の５′および３′欠失の応答性。ラットＧＨ遺伝子の
５′欠失フラグメントは、ｐＳＶ２ＣＡＴをベースとし
たベクター１８（ＳＶ４０複製起点およびプロモーター
を除去したもの）中のＣＡＴ遺伝子に融合させた。これ
らの構築物はＧＣ２細胞にトランスフェクションし、Ｔ
３に対する応答性について検定した。ヌクレオチド位置
−１０７ないし＋８および−１８１ないし＋８のフラグ
メントの基礎発現は低レベルであるため、Ｔ３によって
調節されないラットプロラクチンエンハンサー（Ｐｒ
ｌ）１１をこれらのフラグメントに近接して配置した。
例示した３′欠失フラグメントは、−１９７位から＋５
４位までのｔｋプロモーターフラグメントに融合させ、
同じベクター中のＣＡＴ遺伝子に近接して配置した。
Ｂ．推定上のＴ３受容体結合部位の機能的分析。突然変
異体Ｇデルタ１７７／１６６はＣＡＰ部位から１７７−
１６６塩基対のＴ３受容体結合部位の１１個の塩基の欠
失を含む。プラスミドＧ２９ＴＫおよびＧ２９３ＴＫ
は、それぞれ１および３のコピー数でＴ３受容体と結合
するラットＧＨ遺伝子の２８ｂｐ領域を含む。Ｔ３の作
用は１０−９Ｍ Ｔ３の存在下でのクロラムフェニコー
ルの転化百分率をＴ３の不在下でのその転化百分率で割
ることにより決定した。３通りのプレートはＤＥＡＥ−
デキストラン１１を用いる被験プラスミドでのトランス
フェクション前に、イオン交換クロマトグラフィーでＴ
３を除いた１０％ウシ胎児血清中に２日間維持した。細
胞はトランスフェクションの２４時間後にホルモンで処
理し、Ｔ３暴露の２４時間後にＣＡＴ活性について検定
した。誤差限界は平均値の標準誤差を表す。ＡｎはＳＶ
４０ポリアデニル化部位を表す。Ｃ．メッセンジャーＲ
ＮＡ転写開始部位の分析。模式図はｔｋプロモーターを
含むプラスミドの転写物のＣＡＰ部位を決定するために
用いられた。ＣＡＴコード配列のヌクレオチド６７〜８
９に相補的な３３ヌクレオチドプライマーを表す。ＧＣ
細胞はパネルａおよびｂで示した実験において説明した
ように、被験プラスミドでトランスフェクションし、ホ
ルモン処理を行った。プライマー伸長分析は５０μｇの
全ＲＮＡに対して実施した。レーンＡおよびＢはｔｋプ
ロモーターに融合したＣＡＰ部位から２３５−４５位に
及ぶＧＨフラグメントを含むプラスミドでトランスフェ
クションした細胞からの伸長産物を表す。レーンＣおよ
びＤはｔｋプロモーターのみを含むプラスミドでトラン
スフェクションした細胞からの伸長産物を表す。伸長産
物は全く観察されなかった。レーンＡおよびレーンＣに
示した産物はＴ３の不在下でインキュベートした細胞か
らのものであり、そしてレーンＢおよびＤに示した産物
は１０−９Ｍの濃度のＴ３で処理した細胞からのもので
あった。レーンＥは（ヌクレオチドの）サイズ測定のた
めに使用したｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ消化物を示
す。第ＶＩ−Ｉ（Ａ），（Ｂ）およびＣ）図の方法 ＣＡＰ部位の−１．７ｋｂから＋８ｂｐまでのラットＧ
Ｈ遺伝子の５′フランキング配列を含むＣＡＴ発現ベク
ターの構築は開示されている。１１ラットプロラクチン
エンハンサーを含む融合物は、プラスミドｐＰＳＳ１１
からこのフラグメント（ラットプロラクチン配列ヌクレ
オチド位置１８３１−１５３０に相当する）を切り出
し、それを成長ホルモン因子の５′欠失物に近接して逆
向きに挿入することにより作製した。ＨＳＶ ｔｋプロ
モーターを含む融合物は、プラスミドｐＧＰＯ（文献１
１参照）からＧＨエンハンサーのフラグメントを切り出
し、それらを−１９７位から＋５４位までのｔｋプロモ
ーターに近接してｐＳＶ２ＣＡＴをベースとした発現ベ
クターのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位に挿入すること
により作製した。別法として、ＧＨエンハンサーはＢａ
ｍＨＩおよびＳａｌＩポリリンカー部位に挿入すること
により、ｐＵＣ８をベースとしたベクター２０中の−１
０７位から＋５４位のｔｋプロモーターに近接して配置
した。ＧＨエンハンサー因子の特定部位突然変異誘発
は、ＣＡＰ部位から２３５−４５ｂｐのフラグメントを
Ｍ１３ｍｐ１８のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位に挿入
することにより行った。アンチセンスＧＨヌクレオチド
−１８８ないし−１５７に相当する２１塩基オリゴヌク
レオチド（ヌクレオチド−１７７ないし−１６６を欠失
させて、Ａヌクレオチドで置換したもの）は合成した。
このオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋｕｎｋｅｌの方法
２１によりＧＨエンハンサー中の塩基−１７７から−１
６６を欠失させた。ＣＡＴ活性は薄層クロマトグラフィ
ー１９後にメチル化クロラムフェニコール誘導体のラジ
オアッセイにより測定した。プライマー伸長はＥｌｓｈ
ｏｌｔｚらの方法１２を用いた。第ＶＩ−２（Ａ）および（Ｂ）図 ビオチン−１１−ｄＵＴＰを含むオリゴヌクレオチドプ
ローブへのＴ３受容体の結合。Ａ．ＧＨ５′−フランキ
ング配列へのＴ３受容体結合を検定するために用いた２
つのオリゴヌクレオチドプローブの模式図。太い線、相
補的３′末端を有する合成オリゴヌクレオチド。細い
線、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメントを用い
て５′突出部を修復することにより組込まれた塩基。星
印、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基。ＢａｍＨＩおよび
ＢｇｌＩＩの制御部位も示される。Ｇ２０９−１４６お
よびＧ１８６−１５８は図示した５′および３′境界を
もつラットＧＨエンハンサー配列を含む。Ｂ．種々のビ
オチン−１１−ｄＵＴＰ含有オリゴヌクレオチドプロー
ブによるＧＣ２核抽出物からの１２５Ｉ−Ｔ３標識Ｔ３
受容体の沈澱。Ｐ−ＥＧＦ、ＰＢ１−Ｂ、ＰＢ２−Ｂお
よびＰＢ４−Ｂはそれぞれ１０、１１、１０および１０
個のビオチン−１１−ｄＵＴＰを含む６８、５３、５５
および５８塩基対のオリゴヌクレオチドである。これら
のオリゴヌクレオチドはＧ２０９−１８６に含まれるラ
ットＧＨ配列に対して明らかに相同性を欠くラットプロ
ラクチン遺伝子の５′フランキング配列を含む。沈澱は
１００フェムトモルの各プローブを用いて行った。ビオ
チニル化オリゴヌクレオチドプローブの不在下でストレ
プトアビジンアガロースビーズに付随する１２５Ｉ活性
を示すバックグラウンドは、本実験において１４００ｃ
ｐｍであった。結果は３通りのポイントの平均値および
標準誤差としてプロットした。本実験は１２５Ｉ−Ｔ３
結合の配列特異性を調べる６通りの実験を表す。第ＶＩ−２（Ａ）および（Ｂ）図の方法 核はＤｉｎｇｈａｍらの技法２２に従ってラットＧＣ２
細胞から分離し、そして０．６Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭヘ
ペス（ｐＨ７．９）、０．５ｍＭジチオトレイトール
（ＤＴＴ）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ Ｚｎ
Ｃｌ２中で氷上にて３０分間塩抽出した。その核抽出物
は緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭＫ３ＰＯ
４（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−
メルカプトエタノールおよび２０％グリセロール）中で
ゲル▲ろ▼過することにより脱塩し、−７０℃で貯蔵し
た。ＧＣ２核受容体に対するＴ３の特異的結合の検定は
Ｓａｍｕｅｌｓら２３によって記載されたように行われ
たが、ただしＴ３結合反応は２００μｇ／ｍｌポリ（ｄ
Ｉ−ｄＣ）の存在下に緩衝液Ａ中で実施した。ＤＮＡ結
合を検定するために、初めに核抽出物を１μＭの１２５
Ｉ−Ｔ３（２２００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）と２２℃で２０
分間インキュベートして、Ｔ３受容体を高い比活性へ標
識した。その後、核抽出物のアリコート（４０μｌ）は
２００μｌポリ（ｄＩ−ｄＣ）の存在下にビオチニル化
プローブと共に２２℃で４０分間インキュベートした。
タンパク質−ＤＮＡ複合体はアガロースビーズ（ＢＲ
Ｌ）に結合したストレプトアビジンを加えることにより
沈澱させた。アガロースビーズをペレットとなし、緩衝
液Ａ（１ｍｌ）で３回洗い、その後１２５Ｉ活性につい
て検定した。第ＶＩ−３図 ＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー因子のＤ
ＮアーゼＩフットプリント。アンチセンス鎖中の１６ｂ
ｐ保護領域が示される。ＣＡＰ部位から−１１０位ない
し−１４０位まで延びる第二フットプリントもはっきり
と示される。レーンＡ−Ｃ、それぞれ２４，１２および
４μｇのＤＮアーゼＩを用いた、ＧＣ２核抽出物とのイ
ンキュベーション後の標識ＧＨエンハンサーの消化。レ
ーンＤ−Ｆ、ＧＣ２核抽出物の不在下での２４，１２お
よび４μｇのＤＮアーゼＩによる標識ＧＨエンハンサー
の消化。レーンＧおよびＭ、マーカー。表示した配列は
フットプリントされた領域内のセンス鎖の配列に相当す
る。第ＶＩ−３図の方法 成長ホルモンエンハンサーのアンチセンス鎖は、ｐＧＰ
ＯのＢａｍＨＩ消化およびウシ腸ホスファターゼ処理後
に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５′末
端を３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識した。エンハンサーフラグ
メントは×ｈｏＩ消化でｐＧＰＯから切り離し、アガロ
ースゲル電気泳動で精製した。標識ＧＨエンハンサーフ
ラグメント（１ｎｇ，８ｆｍｏｌ）は１２ｆｍｏｌの特
異的Ｔ３受容体結合活性を含む２５μｌのＧＣ２核抽出
物とインキュベートした。ＤＮＡ結合反応は緩衝液Ａ中
２２℃で３０分間行った。ＤＮアーゼ消化は最終容量５
０μｌ中で上記濃度のＤＮアーゼＩを用いて２２℃で２
分間行った。この反応は２０μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ
および１％ＳＤＳで停止させた。試料はフェノール／ク
ロロホルムで一回抽出し、エタノール沈澱させ、そして
標準１０％塩基配列決定用ゲル上で電気泳動により分析
した。第ＶＩ−４図 ラット下垂体細胞Ｔ３の６４ｂｐおよび２９ｂｐの５′
側ＧＨ配列を含むオリゴヌクレオチドへの結合。１００
ｆｍｏｌのＧ２０９−１４６、Ｇ１８６−１５８または
Ｐ−ＥＧＦとインキュベートし、第ＶＩ−２（Ａ）およ
び（Ｂ）に記載の如く結合について検定した。また、
３５Ｓ−メチオニンで標識したｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳産物（４μｌ）は、１０ｎＭ Ｔ３の
存在下でのこれらのオリゴヌクレオチドへの結合につい
て検定した。ｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
産物を調製するために、ｈｃ−ｅｒｂ−Ａ相補的ＤＮＡ
のキャップ構造をもつｍＲＮＡ転写物を用いて、ウサギ
網状赤血球溶解液系１０における翻訳をプログラミング
した。アンチセンスｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｍＲＮＡを組み
入れた網状赤血球溶解液は、いずれのＧＨプローブにも
測定可能な結合活性を示さなかった（データは示さ
ず）。結果は３通りのポイントの平均値および標準誤差
としてプロットした。示した実験は、２種類のＧＨプロ
ーブへのＧＣ２核Ｔ３受容体の結合を比較する３回の実
験、およびｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産
物の結合を調べる４回の実験を代表するものである。
甲状腺ホルモンによるトランス作用を仲介するＶＩ．Ａ．序論 １．３．３−トリヨードチロニン（Ｔ３）物質はラット
下垂体腫瘍細胞１−４において成長ホルモン遺伝子転写
を剌激する。この剌激は、その転写開始部位の５′側の
調節因子に核Ｔ３受容体が結合することにより仲介され
ると考えられる。５−８甲状腺ホルモンが遺伝子転写を
活性化するメカニズムの理解は、核Ｔ３受容体が豊富に
存在しないためにそれらを精製するのが困難であるこ
と、およびＴ３調節に作用するＴ３受容体−ＤＮＡ結合
部位が明確でないことにより制限されている。最近、ヒ
トおよびトリｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子産物は、高親和性で
もって甲状腺ホルモンと結合し（文献１０として発表し
た実験の部ＩＩＩを参照）、甲状腺ホルモン受容体の分
子量および核結合特性をもつことが見出された。目下の
研究において、我々はラット成長ホルモン遺伝子の転写
開始部位の５′側の１６４塩基対に位置する配列５′Ｃ
ＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３′へのラット下垂体
細胞Ｔ３受容体の特異的高親和性結合を検出できるアビ
ジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合検定の開発について説明
する。この配列を含むオリゴヌクレオチドは、トランス
フェクションしたラット下垂体ＧＣ２細胞においてＴ３
調節を単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーター
へ転移し、またヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子のｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳産物と特異的に結合した。このデータ
は、ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子がＴ３の転写作用を仲介
し、またＧＣ２細胞核抽出物がラット成長ホルモン遺伝
子Ｔ３応答因子への下垂体Ｔ３受容体の結合を変更する
別の因子を含むことを支持する証拠を提供する。ＶＩ．Ｂ．Ｔ３調節に必要なラット成長ホルモンＤＮＡ 配列の特性決定 （ａ）ラットＧＨ遺伝子欠失検定 Ｔ３調節に必要な成長ホルモン（ＧＨ）５′側ゲノム配
列中のジス活性因子を同定するために、我々は細菌クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子へ融合し且つラット下垂体ＧＣ２細胞にトラ
ンスフェクションした、ラットＧＨ遺伝子の一連の５′
欠失フラグメントを使用した（第ＩＶ−１（Ａ）図）。
−２３５位から転写開始（ＣＡＰ）部位までの５′欠失
物はＴ３に対する調節を転移させ（４．６倍，第ＶＩ−
１（Ａ）図）、以前の研究５’６に一致して１．７キロ
塩基（ｋｂ）または３０７塩基対（ｂｐ）の５′側ラッ
トＧＨ情報を含む構築物に等しかった（データは示さ
ず）。（ヌクレオチド位置はＣＡＰ部位に対して番号付
けされており、負の位置番号はそれに対して５′側であ
ることを意味する。）２３５ｂｐより少ない５′側ＧＨ
情報を含む欠失物は、Ｔ３の不在下でのＣＡＴ発現レベ
ルが有意にバックグラウンド以上でなかったので、Ｔ３
誘導について検定できなかった。この問題を解決するた
めに、ラットプロラクチンエンハンサー因子１１を１８
１ｂｐおよび１１０ｂｐの５′側情報を含むラットＧＨ
遺伝子フラグメントに近接して融合させた。−１８１位
まで延びる５′欠失フラグメントはＴ３によって２．６
倍の誘導を与え、そしてＣＡＰ部位から−１０７位まで
の別の欠失はＴ３調節を示さなかった（第ＶＩ−１
（Ａ）図）。 （ｂ）ＣＡＴ酵素検定 ３′欠失について検定するために、ラットＧＨ遺伝子の
フラグメントは単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｈ
ＳＶ ｔｋ）プロモーターに融合した。ＣＡＰ部位から
−２３５位ないし−４５位まで延びるＧＨ遺伝子フラグ
メントは、天然のままの向きでおよび逆向きでｔｋプロ
モーターに融合したとき、それぞれ２．５倍および２．
３倍のＣＡＴ活性刺激をもたらした（第ＶＩ−１（Ｂ）
図）。ＧＨ ＣＡＰ部位から２３５位ないし１４５位ま
で延びる９０ｂｐフラグメントは、２３５−４５ｂｐフ
ラグメントよりも一層効果的にＴ３調節を転移させ、こ
のことはネガティブＴ３調節因子がＣＡＰ部位から４５
ｂｐと１４５ｂｐの間に存在しうることを示唆している
（第ＶＩ−１（Ａ）図）。ＣＡＴメッセンジャーＲＮＡ
は、ｔｋプロモーターを含むプラスミドでトランスフェ
クションした細胞において観察されたＣＡＴ活性のＴ３
依存性刺激が適当に開始された転写物の増加によって起
こるのかどうかを調べるために、プライマー伸長技術
１２を用いて分析した。ｔｋプロモーターに融合した２
３５−４５ｂｐ ＧＨフラグメントはＴ３の存在下で正
しく開始されたＣＡＴ ｍＲＮＡを約４倍増加させ（第
ＶＩ−１（Ｃ）図）、これは観察されたＣＡＴ活性の測
定値と一致する結果であった。 （ｃ）アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合検定（ＡＢＣ
Ｄ検定） Ｔ３調節に必要とされる配列をさらに明確に定めるため
に、成長ホルモンＴ３調節因子への核Ｔ３受容体の特異
的結合を証明する必要があった。ゲルシフトおよびフッ
トプリント検定によりＴ３受容体結合部位をマッピング
する試みが初め不成功に終わったので、特異的結合を検
出する新しい検定法、アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結
合（ＡＢＣＤ）検定法、が創案された。第ＶＩ−２
（Ａ）図に示すような、いろいろな位置にビオチン−１
１−ｄＵＴＰを有する、Ｔ３調節に必要なＧＨ遺伝子の
５′側領域を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが作製され
た。初めに−２０９位から−１４６位までの成長ホルモ
ンゲノム配列を含む７７ｂｐオリゴヌクレオチド（Ｇ２
０９−１４６）を使用した。ＧＣ２核抽出物からのＴ３
受容体は１２５Ｉ−Ｔ３を用いて高い比活性へ標識し、
そしてビオチニル化オリゴヌクレオチドとインキュベー
トした。タンパク質−ＤＮＡ複合体は、その結合反応後
に、アガロースビーズに結合したストレプトアビジンを
用いて溶液から沈澱させた。第ＶＩ−２（Ｂ）図から明
らかなように、プローブＧ２０９−１４６は６９００ｃ
ｐｍの１２５Ｉ−Ｔ３活性の沈澱を生じさせた。これは
約３．２フェムトモルのＴ３受容体の結合を表し、結合
反応混合物中に存在する全Ｔ３受容体の約４０％を占め
る。１２５Ｉ−Ｔ３標識受容体の沈澱はプローブ依存性
であった；沈澱した１２５Ｉ−Ｔ３の全放射能の＜１５
％がＧ２０９−１４６の不在下で回収された。１００倍
過剰モル量の未標識Ｔ３の添加は沈澱した１２５Ｉ−Ｔ
３をバックグラウンドレベルにまで低下させ（第ＶＩ−
２（Ｂ）図）、このことはプローブによって沈澱される
はずのＴ３結合タンパク質が制限された量で存在してい
たことを示している。Ｔ３受容体−ＤＮＡ複合体の平衡
結合定数は１．４×１０−９Ｍであると概算された（デ
ータは示さず）。Ｇ２０９−１４６による標識Ｔ３受容
体の沈澱が特定のラットＧＨ配列に依存するかどうかを
調べるために、成長ホルモンエンハンサーとの明らかな
配列類似性をもたないがＧ２０９−１４６と同じ長さで
あり且つ同じ数のビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基を含む
一連のビオチニル化プローブを作製した。第ＶＩ−２
（Ｂ）図に示すように、ＧＣ２核抽出物への１００ｆｍ
ｏｌの各プローブの添加は測定しうる１２５Ｉ−Ｔ３の
沈澱を与えなかった。これはＧ２０９−１４６による
１２５Ｉ−Ｔ３の沈澱がこのプローブに含まれるラット
ＧＨ配列に依存することを示している。 （ｄ）フットプリント分析 通常のフットプリント法を用いてＴ３受容体結合部位を
局在化するための初期の試みは成功しなかったが、ＡＢ
ＣＤ結合検定における緩衝条件の変化は、もしもＤＮＡ
結合のための塩およびｐＨ条件が最適であるならば、粗
製核抽出物の場合にもフットプリントが達成しうること
を示唆した（データは示さず）。ＧＨエンハンサーの末
端標識フラグメントはＧＣ２核抽出物とインキュベート
し、ＤＮアーゼＩで消化した。変性条件下での消化物の
ＰＡＧＥ分析（第ＶＩ−３図）は以前に記載された２つ
のフットプリントを与え１３，１４；これらのうちの１
つはヌクレオチド−１７９と−１６４の間のアンチセン
ス鎖中の１６ｂｐ保護領域により示される。センス鎖に
おいて５′ＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３′に相
当するこの配列は、Ｔ３受容体と特異的に結合するオリ
ゴヌクレオチドプローブ中に含まれ、以前に同定された
Ｔ３依存性ＤＮアーゼＩ高感受性部位１９の位置に対応
する。センス鎖それ自体中にはっきりしたフットプリン
トは検出されなかったが、それは主としてこのＧに富む
領域におけるＤＮアーゼＩによる不完全消化のためであ
る。ＶＩ．Ｃ．Ｔ３オリゴヌクレオチドの機能性 ＧＨ遺伝子のＴ３調節におけるこの配列の機能を調べる
ために、特定部位の突然変異誘発を用いて野生型エンハ
ンサーから１１ｂｐのフットプリントを欠失させた（突
然変異体Ｇデルタ１６６／１７７）。ｔｋプロモーター
に融合した突然変異体Ｇデルタ１６６／１７７でトラン
スフェクションした細胞へのＴ３の添加はＣＡＴの発現
量に何ら影響を及ぼさなかったが、野生型エンハンサー
はＣＡＴ発現を９倍刺激した（第ＶＩ−１（Ｂ）図）。
従って、オリゴヌクレオチドおよびＤＮアーゼＩ結合検
定により同定した推定上のＴ３受容体結合領域の除去
は、ｔｋプロモーターにＴ３調節を付与するＧＨエンハ
ンサーの能力を失わせた。−１６４位から−１７９位ま
での１６塩基対が機能的なＴ３調節因子を構成すること
を証明するために、５′末端側および３′末端側にそれ
ぞれ７塩基および６塩基を付加したこの配列を含む二本
鎖オリゴヌクレオチドが作製された。このオリゴヌクレ
オチドはｔｋプロモーターに近接して天然のままの向き
で挿入した（構築物Ｇ２９ＴＫ，第ＶＩ−１（Ｂ）
図）。この構築物でトランスフェクションした細胞で
は、ＣＡＴ発現がＴ３によって２．９倍刺激された。こ
の配列３つを直列に配置したもの（構築物Ｇ２９３Ｔ
Ｋ）を挿入すると、Ｔ３によって５倍の刺激が生じた。
ｔｋプロモーターへのＴ３調節の転移のために使用した
短いオリゴヌクレオチド（Ｇ１８６−１５８）もまた、
Ｇ２０９−１４６中の核Ｔ３受容体結合部位と特異的に
結合したが、これはヌクレオチド位置−１７７から−２
３５までのラットＧＨ配列を含むオリゴヌクレオチド
（測定可能な量のＴ３受容体と結合しなかった）を用い
ることにより失われた（データは示さず）。非ビオチニ
ル化Ｇ２０９−１４６およびＧ１８６−１５８はまたビ
オチニル化Ｇ２０９−１４６とＴ３受容体との結合を競
合させるべく使用した；Ｇ２０９−１４６に対するＴ３
受容体の相対親和性はＧ１８６−１５８よりも２〜３倍
高かった（データは示さず）。短い方のプローブに対す
る明らかな親和性の低下は、Ｔ３受容体結合反応に直接
関与する塩基の欠乏により生ずるのかも知れない。この
ことは、ＤＮアーゼＩフットプリントの境界がこのプロ
ーブの両末端内にあるので、ありそうもない。その池に
考えられることとして、ＧＣ２核抽出物は長いプローブ
へのＴ３受容体の結合を安定化させる他の因子を含むの
かも知れない。ＶＩ．Ｄ．要約および結論 これらの実験は、ＣＡＰ部位に対して５′側の−１６４
位から−１７９位まで延びる１６ｂｐフットプリントを
含む２９塩基対のＧＨ遺伝子がＴ３受容体と結合し、ラ
ットＧＨエンハンサーのＴ３調節にとって必要であり、
またＴ３調節をｔｋプロモーターへ転移できることを証
明した。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａがこの因子と結合するかど
うかを試験するために、ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳産物を３５
Ｓ−メチオニンで標識した（実験の部ＩＩＩを参照）。
この産物はＳＤＳゲル電気泳動上で相対分子量（Ｍｒ）
４８０００（４８Ｋ）および５２Ｋのダブレットとして
泳動し、そして５×１０＋１１のｈｄ値でＴ３と結合し
た。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物のラ
ットＧＨ Ｔ３調節因子を含むＧ２０９−１４６および
Ｇ１８６−１５８オリゴヌクレオチドプローブへの結合
は第ＶＩ−４図に示す。長いプローブおよび短いプロー
ブは両方ともｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物と有意に結合し
たが、ＧＨ遺伝子のＴ３受容体結合部位に対して相同性
を欠くプローブ（例えばＰ−ＥＧＦ）は結合しなかっ
た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳混合物中に存在する
〔３５Ｓ〕メチオニンの概算上の比活性に基づいて、第
ＶＩ−４図に示した結合活性は１〜２ｆｍｏｌのｅｒｂ
−Ａタンパク質に相当する。１２５Ｉ−Ｔ３受容体を含
むＧＣ２細胞核抽出物と相違して、ｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物は長いオリゴヌクレオチドと短
いオリゴヌクレオチドの両方に同程度に結合した。類似
のデータが１２５Ｉ−Ｔ３で標識したヒトｃ−ｅｒｂ−
Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物を用いて得られた（デー
タは示さず）。これらの結果は、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子
産物がＧＣ２核抽出物からのＴ３受容体によって結合さ
れる同じＴ３調節配列と特異的に結合することを示して
いる。それらは、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子産物の機能がＴ
３の転写作用を仲介することであるという更なる証拠を
提供する。Ｆｌｕｇら（１９８７）は、ヌクレオチド位
置−２１０と−１８１の間のＧＨ配列が一時的にトラン
スフェクションしたＧＣ細胞におけるＴ３の完全刺激作
用に不可欠であることを最近報告し、さらにこの領域が
Ｔ３調節される他の遺伝子に対し限られた類似性を保有
することを指摘した。我々の実験は、Ｔ３受容体−ＤＮ
Ａ結合部位をＣＡＰ部位から１６４ｂｐと１７９ｂｐの
間に位置づけ、さらにＧＨ遺伝子のＴ３調節におけるヌ
クレオチド位置−２１０と−１８１の間の配列の機能的
重要性について証明する。これは、我々がＴ３受容体源
として粗製核抽出物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ
結合実験で観察したように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこ
の上流因子を含むＧＨエンハンサーフラグメントに対す
るＴ３受容体の増大した親和性を反映するであろう。ｅ
ｒｂ−Ａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物がＧ２０９−１４
６およびＧ１８６−１５８と同程度に結合するというこ
とは、粗製ＧＣ２核抽出物がヌクレオチド位置−２１０
と−１８１の間の配列と結合し且つその結合部位に対す
るＴ３受容体の結合を安定化する別の因子（１種または
２種以上）を含む可能性と一致する。真核細胞の転写因
子間の協同的相互作用は十分に確立されている
１６−１８；いくつかの場合において、これは別の因子
のＤＮＡ結合親和性を変更するある因子の能力を反映し
ている。この種の相互作用は甲状腺ホルモン作用の組織
特異的調節において重要であるだろう。５，６ここで使
用したＡＢＣＤ結合検定はこれらの問題を処理するのに
有用であり、それはまた標識リガンド、化学的修飾また
は標識アミノ酸によるｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて選
択的に放射性標識しうるすべてのＤＮＡ結合タンパク質
に応用できるであろう。ＶＩ．Ｅ．実験の部ＶＩに関する図面の詳細な説明 第ＶＩ−Ｉ（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 ラットＧＨ５′−フランキング配列を含む種々の遺伝子
融合物の甲状腺ホルモン応答性。Ａ．ラットＧＨ遺伝子
の５′および３′欠失の応答性。ラットＧＨ遺伝子の
５′欠失フラグメントは、ｐＳＶ２ＣＡＴをベースとし
たベクター１８（ＳＶ４０複製起点およびプロモーター
を除去したもの）中のＣＡＴ遺伝子に融合させた。これ
らの構築物はＧＣ２細胞にトランスフェクションし、Ｔ
３に対する応答性について検定した。ヌクレオチド位置
−１０７ないし＋８および−１８１ないし＋８のフラグ
メントの基礎発現は低レベルであるため、Ｔ３によって
調節されないラットプロラクチンエンハンサー（Ｐｒ
ｌ）１１をこれらのフラグメントに近接して配置した。
例示した３′欠失フラグメントは、−１９７位から＋５
４位までのｔｋプロモーターフラグメントに融合させ、
同じベクター中のＣＡＴ遺伝子に近接して配置した。
Ｂ．推定上のＴ３受容体結合部位の機能的分析。突然変
異体Ｇデルタ１７７／１６６はＣＡＰ部位から１７７−
１６６塩基対のＴ３受容体結合部位の１１個の塩基の欠
失を含む。プラスミドＧ２９ＴＫおよびＧ２９３ＴＫ
は、それぞれ１および３のコピー数でＴ３受容体と結合
するラットＧＨ遺伝子の２８ｂｐ領域を含む。Ｔ３の作
用は１０−９Ｍ Ｔ３の存在下でのクロラムフェニコー
ルの転化百分率をＴ３の不在下でのその転化百分率で割
ることにより決定した。３通りのプレートはＤＥＡＥ−
デキストラン１１を用いる被験プラスミドでのトランス
フェクション前に、イオン交換クロマトグラフィーでＴ
３を除いた１０％ウシ胎児血清中に２日間維持した。細
胞はトランスフェクションの２４時間後にホルモンで処
理し、Ｔ３暴露の２４時間後にＣＡＴ活性について検定
した。誤差限界は平均値の標準誤差を表す。ＡｎはＳＶ
４０ポリアデニル化部位を表す。Ｃ．メッセンジャーＲ
ＮＡ転写開始部位の分析。模式図はｔｋプロモーターを
含むプラスミドの転写物のＣＡＰ部位を決定するために
用いられた。ＣＡＴコード配列のヌクレオチド６７〜８
９に相補的な３３ヌクレオチドプライマーを表す。ＧＣ
細胞はパネルａおよびｂで示した実験において説明した
ように、被験プラスミドでトランスフェクションし、ホ
ルモン処理を行った。プライマー伸長分析は５０μｇの
全ＲＮＡに対して実施した。レーンＡおよびＢはｔｋプ
ロモーターに融合したＣＡＰ部位から２３５−４５位に
及ぶＧＨフラグメントを含むプラスミドでトランスフェ
クションした細胞からの伸長産物を表す。レーンＣおよ
びＤはｔｋプロモーターのみを含むプラスミドでトラン
スフェクションした細胞からの伸長産物を表す。伸長産
物は全く観察されなかった。レーンＡおよびレーンＣに
示した産物はＴ３の不在下でインキュベートした細胞か
らのものであり、そしてレーンＢおよびＤに示した産物
は１０−９Ｍの濃度のＴ３で処理した細胞からのもので
あった。レーンＥは（ヌクレオチドの）サイズ測定のた
めに使用したｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ消化物を示
す。第ＶＩ−Ｉ（Ａ），（Ｂ）およびＣ）図の方法 ＣＡＰ部位の−１．７ｋｂから＋８ｂｐまでのラットＧ
Ｈ遺伝子の５′フランキング配列を含むＣＡＴ発現ベク
ターの構築は開示されている。１１ラットプロラクチン
エンハンサーを含む融合物は、プラスミドｐＰＳＳ１１
からこのフラグメント（ラットプロラクチン配列ヌクレ
オチド位置１８３１−１５３０に相当する）を切り出
し、それを成長ホルモン因子の５′欠失物に近接して逆
向きに挿入することにより作製した。ＨＳＶ ｔｋプロ
モーターを含む融合物は、プラスミドｐＧＰＯ（文献１
１参照）からＧＨエンハンサーのフラグメントを切り出
し、それらを−１９７位から＋５４位までのｔｋプロモ
ーターに近接してｐＳＶ２ＣＡＴをベースとした発現ベ
クターのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位に挿入すること
により作製した。別法として、ＧＨエンハンサーはＢａ
ｍＨＩおよびＳａｌＩポリリンカー部位に挿入すること
により、ｐＵＣ８をベースとしたベクター２０中の−１
０７位から＋５４位のｔｋプロモーターに近接して配置
した。ＧＨエンハンサー因子の特定部位突然変異誘発
は、ＣＡＰ部位から２３５−４５ｂｐのフラグメントを
Ｍ１３ｍｐ１８のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位に挿入
することにより行った。アンチセンスＧＨヌクレオチド
−１８８ないし−１５７に相当する２１塩基オリゴヌク
レオチド（ヌクレオチド−１７７ないし−１６６を欠失
させて、Ａヌクレオチドで置換したもの）は合成した。
このオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋｕｎｋｅｌの方法
２１によりＧＨエンハンサー中の塩基−１７７から−１
６６を欠失させた。ＣＡＴ活性は薄層クロマトグラフィ
ー１９後にメチル化クロラムフェニコール誘導体のラジ
オアッセイにより測定した。プライマー伸長はＥｌｓｈ
ｏｌｔｚらの方法１２を用いた。第ＶＩ−２（Ａ）および（Ｂ）図 ビオチン−１１−ｄＵＴＰを含むオリゴヌクレオチドプ
ローブへのＴ３受容体の結合。Ａ．ＧＨ５′−フランキ
ング配列へのＴ３受容体結合を検定するために用いた２
つのオリゴヌクレオチドプローブの模式図。太い線、相
補的３′末端を有する合成オリゴヌクレオチド。細い
線、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメントを用い
て５′突出部を修復することにより組込まれた塩基。星
印、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基。ＢａｍＨＩおよび
ＢｇｌＩＩの制御部位も示される。Ｇ２０９−１４６お
よびＧ１８６−１５８は図示した５′および３′境界を
もつラットＧＨエンハンサー配列を含む。Ｂ．種々のビ
オチン−１１−ｄＵＴＰ含有オリゴヌクレオチドプロー
ブによるＧＣ２核抽出物からの１２５Ｉ−Ｔ３標識Ｔ３
受容体の沈澱。Ｐ−ＥＧＦ、ＰＢ１−Ｂ、ＰＢ２−Ｂお
よびＰＢ４−Ｂはそれぞれ１０、１１、１０および１０
個のビオチン−１１−ｄＵＴＰを含む６８、５３、５５
および５８塩基対のオリゴヌクレオチドである。これら
のオリゴヌクレオチドはＧ２０９−１８６に含まれるラ
ットＧＨ配列に対して明らかに相同性を欠くラットプロ
ラクチン遺伝子の５′フランキング配列を含む。沈澱は
１００フェムトモルの各プローブを用いて行った。ビオ
チニル化オリゴヌクレオチドプローブの不在下でストレ
プトアビジンアガロースビーズに付随する１２５Ｉ活性
を示すバックグラウンドは、本実験において１４００ｃ
ｐｍであった。結果は３通りのポイントの平均値および
標準誤差としてプロットした。本実験は１２５Ｉ−Ｔ３
結合の配列特異性を調べる６通りの実験を表す。第ＶＩ−２（Ａ）および（Ｂ）図の方法 核はＤｉｎｇｈａｍらの技法２２に従ってラットＧＣ２
細胞から分離し、そして０．６Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭヘ
ペス（ｐＨ７．９）、０．５ｍＭジチオトレイトール
（ＤＴＴ）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ Ｚｎ
Ｃｌ２中で氷上にて３０分間塩抽出した。その核抽出物
は緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭＫ３ＰＯ
４（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ β−
メルカプトエタノールおよび２０％グリセロール）中で
ゲル▲ろ▼過することにより脱塩し、−７０℃で貯蔵し
た。ＧＣ２核受容体に対するＴ３の特異的結合の検定は
Ｓａｍｕｅｌｓら２３によって記載されたように行われ
たが、ただしＴ３結合反応は２００μｇ／ｍｌポリ（ｄ
Ｉ−ｄＣ）の存在下に緩衝液Ａ中で実施した。ＤＮＡ結
合を検定するために、初めに核抽出物を１μＭの１２５
Ｉ−Ｔ３（２２００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）と２２℃で２０
分間インキュベートして、Ｔ３受容体を高い比活性へ標
識した。その後、核抽出物のアリコート（４０μｌ）は
２００μｌポリ（ｄＩ−ｄＣ）の存在下にビオチニル化
プローブと共に２２℃で４０分間インキュベートした。
タンパク質−ＤＮＡ複合体はアガロースビーズ（ＢＲ
Ｌ）に結合したストレプトアビジンを加えることにより
沈澱させた。アガロースビーズをペレットとなし、緩衝
液Ａ（１ｍｌ）で３回洗い、その後１２５Ｉ活性につい
て検定した。第ＶＩ−３図 ＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー因子のＤ
ＮアーゼＩフットプリント。アンチセンス鎖中の１６ｂ
ｐ保護領域が示される。ＣＡＰ部位から−１１０位ない
し−１４０位まで延びる第二フットプリントもはっきり
と示される。レーンＡ−Ｃ、それぞれ２４，１２および
４μｇのＤＮアーゼＩを用いた、ＧＣ２核抽出物とのイ
ンキュベーション後の標識ＧＨエンハンサーの消化。レ
ーンＤ−Ｆ、ＧＣ２核抽出物の不在下での２４，１２お
よび４μｇのＤＮアーゼＩによる標識ＧＨエンハンサー
の消化。レーンＧおよびＭ、マーカー。表示した配列は
フットプリントされた領域内のセンス鎖の配列に相当す
る。第ＶＩ−３図の方法 成長ホルモンエンハンサーのアンチセンス鎖は、ｐＧＰ
ＯのＢａｍＨＩ消化およびウシ腸ホスファターゼ処理後
に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５′末
端を３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識した。エンハンサーフラグ
メントは×ｈｏＩ消化でｐＧＰＯから切り離し、アガロ
ースゲル電気泳動で精製した。標識ＧＨエンハンサーフ
ラグメント（１ｎｇ，８ｆｍｏｌ）は１２ｆｍｏｌの特
異的Ｔ３受容体結合活性を含む２５μｌのＧＣ２核抽出
物とインキュベートした。ＤＮＡ結合反応は緩衝液Ａ中
２２℃で３０分間行った。ＤＮアーゼ消化は最終容量５
０μｌ中で上記濃度のＤＮアーゼＩを用いて２２℃で２
分間行った。この反応は２０μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ
および１％ＳＤＳで停止させた。試料はフェノール／ク
ロロホルムで一回抽出し、エタノール沈澱させ、そして
標準１０％塩基配列決定用ゲル上で電気泳動により分析
した。第ＶＩ−４図 ラット下垂体細胞Ｔ３の６４ｂｐおよび２９ｂｐの５′
側ＧＨ配列を含むオリゴヌクレオチドへの結合。１００
ｆｍｏｌのＧ２０９−１４６、Ｇ１８６−１５８または
Ｐ−ＥＧＦとインキュベートし、第ＶＩ−２（Ａ）およ
び（Ｂ）に記載の如く結合について検定した。また、
３５Ｓ−メチオニンで標識したｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳産物（４μｌ）は、１０ｎＭ Ｔ３の
存在下でのこれらのオリゴヌクレオチドへの結合につい
て検定した。ｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
産物を調製するために、ｈｃ−ｅｒｂ−Ａ相補的ＤＮＡ
のキャップ構造をもつｍＲＮＡ転写物を用いて、ウサギ
網状赤血球溶解液系１０における翻訳をプログラミング
した。アンチセンスｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｍＲＮＡを組み
入れた網状赤血球溶解液は、いずれのＧＨプローブにも
測定可能な結合活性を示さなかった（データは示さ
ず）。結果は３通りのポイントの平均値および標準誤差
としてプロットした。示した実験は、２種類のＧＨプロ
ーブへのＧＣ２核Ｔ３受容体の結合を比較する３回の実
験、およびｈｃ−ｅｒｂ−Ａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産
物の結合を調べる４回の実験を代表するものである。
【００１２】実験の部ＶＩＩ 哺乳動物中枢神経系で発現された新規な甲状腺ホルモン
受容体の同定ＶＩＩ．Ａ．概要 ラット脳メッセンジャーＲＮＡから誘導された相補的Ｄ
ＮＡクローンは、ヒト甲状腺ホルモン受容体遺伝子に対
する相同性に基づいて分離された。この相補的ＤＮＡの
発現は甲状腺ホルモンに高い親和性を示す結合タンパク
質をもたらす。塩基配列の分析および特定のヒト遺伝子
座へのこの遺伝子のマッピングは、複数のヒト甲状腺ホ
ルモン受容体の存在を示す。この遺伝子からのメッセン
ジャーＲＮＡは組織特異的であり、中枢神経系において
最高レベルで発現される。ＶＩＩ．Ｂ．序論 甲状腺ホルモンは高等脊椎動物の多くの組織において発
生学的および生理学的応答の複雑な機構に関与している
（１）。それらの多種多様な作用には重要な代謝酵素、
ホルモンおよび受容体の調節が含まれる（２）。甲状腺
ホルモンの作用は核受容体により仲介され、標的細胞に
よる特定遺伝子の発現を調節する（３−５）。これらの
性質はステロイドホルモンとそれらの受容体との相互作
用に類似しており、最近観察されたステロイドホルモン
受容体と甲状腺ホルモン受容体との構造類似性に合致し
ている（実験の部ＩＩＩを参照）。ＶＩＩ．Ｃ．第２甲状腺ホルモン受容体ＤＮＡの分離 甲状腺ホルモン作用の多様性にもかかわらず、一般に甲
状腺ホルモン機能は単一の高親和性核受容体を介して起
こることが認められている。しかしながら、ｖ−ｅｒｂ
−Ａ腫瘍遺伝子産物の細胞相同体としての甲状腺ホルモ
ン受容体の最近の同定（実験の部ＩＩＩおよび文献７を
参照）は、ヒト染色体３および１７上の複数のｃ−ｅｒ
ｂ−Ａ遺伝子の先の同定（実験の部ＩＩＩおよび文献８
を参照）と合わせて、複数の甲状腺ホルモン受容体の存
在を示唆している。複数の甲状腺ホルモン応答の基礎を
なす機構が、構造的に異なる甲状腺ホルモン受容体の発
現から誘導されうる可能性を調べるために、我々はこれ
らの関連遺伝子座の１つの産物をコードする相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）クローンを分離した。推定上の神経細胞
型甲状腺ホルモン受容体は、ヒト甲状腺ホルモン受容体
ｃＤＮＡの１５００ｂｐフラグメントを用いて、ラット
脳メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から作製したｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより分離
された。（文献６として発表した実験の部ＩＩＩを参照
されたい。）約１０６個のファージから３個の陽性クロ
ーンを分離し、それらのうちで最も大きいもの、ｒｂｅ
Ａ１２、の完全ヌクレオチド配列を決定した（第ＶＩＩ
−１（Ｂ）図）。この配列は２０７９ｂｐの鎖長であ
り、ヌクレオチド位置３２５にイニシエーターメチオニ
ンコドンおよびヌクレオチド位置１５５４にターミネー
ターコドンを有する１２３０ｂｐの長いオープン・リー
ディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒ
ａｍｅ）を含む。このオープン・リーディング・フレー
ムは推定上のイニシエーターメチオニンの上流に３つの
短いオープン・リーディング・フレームを含む少なくと
も３２０ｂｐの５′非翻訳領域によって先行され、４１
０個のアミノ酸残基から成るタンパク質（計算した分子
量４５ＫＤ）をコードしている。ＶＩＩ．Ｄ．第２甲状腺ホルモン受容体と他の既知甲状
腺 ホルモン受容体タンパク質との比較 ｒｂｅＡ１２からの推定アミノ酸配列とヒト甲状腺ホル
モン受容体のアミノ酸配列（実験の部ＩＩＩを参照）と
の比較により、これらの２種類のタンパク質は異なるア
ミノ末端をもつことが分った（第ＶＩＩ−２図）。神経
細胞タンパク質の最初の４１個のアミノ酸とヒト甲状腺
ホルモン受容体の最初の９０個のアミノ酸は有意な相同
性を示さず、一方カルボキシル末端の３６７個のアミノ
酸は７５％のヌタレオチド同一性と８２％のアミノ酸同
一性を共有している。ラットのタンパク質は予告された
大きさおよび相同性の両方の点でニワトリの甲状腺ホル
モン受容体（７）とより一層関連が深く、８２％のヌク
レオチド同一性と８９％のアミノ酸同一性を共有してい
る。参考として、ニワトリ甲状腺ホルモン受容体は以前
に分離されたｅｒｂ−Ａ遺伝子との相同性ゆえにアルフ
ァ（ｃＴＲα）と称せられそしてヒト甲状腺ホルモン受
容体はベータ（ｈＴＲβ）と称せられる。ラット神経細
胞型はニワトリの受容体とより一層関連が深いので、そ
れはアルファ（ｒＴＲα）と呼ばれている。ステロイド
ホルモン受容体との類似性により、甲状腺ホルモン受容
体のシステインに富む領域はＤＮＡ結合ドメインである
と予想される（実験の部ＩＩＩおよびＩＩを参照；また
文献１０を参照）。この領域において、ｒＴＲαタンパ
ク質はｃＴＲαタンパク質と９７％のアミノ酸同一性を
有し、そしてｈＴＲβと９０％のアミノ酸同一性を有す
る。これらのタンパク質はまた、ステロイド受容体から
類推して、ホルモン結合ドメインであると思われるカル
ボキシル末端部分において十分に保存されている（実験
の部ＩＩおよび文献１１を参照）。ｒＴＲαのこの領域
はｃＴＲαと９４％のアミノ酸同一性を示し、そしてｈ
ＴＲβと８５％のアミノ酸同一性を示す。ＶＩＩ．Ｅ．新しい甲状腺ホルモン受容体の同定 塩基配列データに基づくと、我々が分離したｃＤＮＡは
以前に同定されたヒト甲状腺ホルモン受容体とは異なる
タンパク質をコードすると思われる（実験の部ＩＩＩを
参照）。神経細胞クローンが別の遺伝子産物であること
を立証するために、ｒｂｅＡ１２を用いてサザンブロッ
トおよび染色体分析によりヒト相同体を同定した。種々
の制限酵素で消化したヒト胎盤ＤＮＡはアガロースゲル
上で分離し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてラッ
トまたはヒトＴＲ特異的プローブ（それぞれの遺伝子の
重複領域から誘導されたもの）とハイブリダイズさせた
（第ＶＩＩ−３（Ａ）および（Ｂ）図）。試験した全て
の制限酵素に対して異なるハイブリダイゼーションパタ
ーンが観察され、このことは２つのｃＤＮＡが全く別の
遺伝子であることを示している。ｒｂｅＡ１２由来の同
じプローブは、ヒトリンパ様細胞から調製したレーザー
選別染色体とハイブリダイズさせた（第ＶＩＩ−３
（Ｃ）図）。ハイブリダイゼーションは染色体１７にの
み観察され、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子をヒト染色体１７に
局在化した以前のマッピング実験と一致した（８）。こ
れはヒト染色体３に存在するｈＴＲβとｒＴＲαとを区
別している（実験の部ＩＩを参照）。ＶＩＩ．Ｆ．発現実験 ｒＴＲα ｃＤＮＡが機能的な受容体タンパク質をコー
ドするか否かを調べるために、発現実験を行った。ｒＴ
Ｒの遺伝子の産物は初めにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写それに
続くｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により同定された。ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ転写のために、ｒｂｅＡ１２のＥｃｏＲＩ挿入
物は、発現ベクターｐＧＥＭ１にサブクローニングする
ことによりバクテリオファージＳＰ６プロモーターへ連
結した。第２構築物のｒｂｅＡ１２Ｂは翻訳効率を高め
る目的で作製された。ヌクレオチド位置９７までの５’
非翻訳領域は欠失させて、この領域内の３つの短いオー
プン・リーディング・フレームのうち２つを除去した。
ＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成した転写物はウサギ網
状赤血球溶解液と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳し、［
３５Ｓ］メチオニン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で分析した（第ＶＩＩ−４（Ａ）図）。約５
２，４８，３５および３３ＫＤの４種のタンパク質がセ
ンス鎖を翻訳したときだけ観察された。同じ４種のバン
ドがｒｂｅＡ１２およびｒｂｅＡ１２Ｂについて観察さ
れた。これらの翻訳産物はその後甲状腺ホルモン結合を
試験するために使用した。ＶＩＩ．Ｇ．ホルモン結合実験 甲状腺ホルモン結合は［１２５Ｉ］３，５，３’−トリ
ヨード−Ｌ−チロニン（１２５Ｉ−Ｔ３）を用いて測定
した。ｒＴＲαの特定タンパク質を含む試料のみがＴ３
結合を示した。ホルモン親和性はスカッチャード分析に
より決定し、解離定数（Ｋｄ）２．９×１０−１１Ｍを
与え（第ＶＩＩ−４（Ｂ）図）、これはｈＴＲβタンパ
ク質について観察されたＫｄ値（５×１０−１１Ｍ）と
類似するが（４，５）、ｃＴＲαタンパク質に対して測
定されたＫｄ値（２．１×１０−１０〜３．３×１０
−１０Ｍ）よりも低かった（実験の部ＩＩＩを参照）。
得られたＫｄ値の差異は使用した検定系が異なることに
よるのかも知れない。競合実験において、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ翻訳したｒＴＲαタンパク質はｈＴＲβタンパク質
と同じくＬ−Ｔ３およびＬ−チロキシン（Ｌ−Ｔ４）に
対して特有の親和性を示したが、３，５’，３’−トリ
ヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）に対しては異なるパター
ンを示した（第ＶＩＩ−４（Ｃ）図）。ＴＲＩＡＣはｈ
ＴＲβタンパク質の場合Ｔ３結合に対して比較的良好に
競合したが、ｒＴＲαタンパク質への結合に対してはＴ
３とほぼ同程度に競合した。ｈＴＲβおよびｃＴＲαの
タンパク質の場合のように、過剰のアルドステロン、エ
ストロゲン、プロゲステロン、テストステロンまたはビ
タミンＤ１によるｒＴＲαタンパク質へのＴ３結合に対
する競合は見られなかった。従って、我々は以前に開示
された甲状腺ホルモン受容体と類似した結合特性をもつ
が、それとは同一でない甲状腺ホルモン受容体を単離し
たと思われる（実験の部ＩＩＩおよび文献７を参照）。ＶＩＩ．Ｈ．組織特異性実験 甲状腺ホルモンに対する代謝応答の組織特異性により、
この甲状腺ホルモン受容体は特定の組織において発現さ
れるものかも知れないと考えた。こうして、ｒＴＲα遺
伝子の発現パターンがノザンブロット分析により調べら
れた（第ＶＩＩ−５図）。いろいろなラット組織から分
離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド−アガロースゲル上
で分画化し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてサザ
ンブロット分析および染色体マッピングの際に使用した
ものと同じｒｂｅＡ１２フラグメントとハイブリダイズ
させた。２．６Ｋｂ ＲＮＡが肝臓を除いて試験した全
ての組織に観察された。このＲＮＡは下垂体や筋肉にも
存在し、そしてＧＣ、ラット−１およびＰＣ１２細胞株
において発現される。デンシトメーター走査は、ｒＴＲ
αの発現レベルが試験した他のどの組織よりも脳におい
て１０〜２０倍高いことを示した。約５．０Ｋｂと６．
０Ｋｂの別の２種類のＲＮＡが全ての組織にほぼ等しい
量で存在するが、それらは２．６Ｋｂ ＲＮＡよりもは
るかに少量である。これらのバンドは２．６Ｋｂ ＲＮ
Ａの前駆体または関連遺伝子の産物でありうる。ＶＩＩ．Ｉ．論議および結論 第２の哺乳動物甲状腺ホルモン受容体の分離は、以前の
生化学的研究が単一の甲状腺ホルモン受容体よりも多く
の受容体の存在を予告していないので、驚くべきことで
ある。振り返ってみると、多くの臨床生理学的研究は複
数の受容体の存在を示すものとして解釈することができ
る。機能的異質性の１つの形態は、家族性甲状腺ホルモ
ン抵抗（甲状腺ホルモンに対する末梢応答が喪失または
減少するが、神経細胞機能は維持される）を有する患者
の確認により示唆された（１２，１３）。さらに、循環
性甲状腺ホルモンの低レベルと関連した苛酷な発生学的
作用（クレチン病）は、神経系に強く影響を与えるタイ
プと周辺機能により劇的に作用するタイプとに分類され
た（１３，１４）。構造的に異なる形の甲状腺ホルモン
受容体の存在を証明したのに加えて、我々が同定した受
容体はラット中枢神経系において高レベルで発現され
る。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用する
予備実験は海馬、視床下部、大脳皮質および扁桃での高
レベル発現を明らかにした。ＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョン実験もまた小脳において異例に高いレベルを示す。
甲状腺ホルモンは初期の脳発生において重要な役割を演
ずることが知られているが（１４）、この高レベル発現
は予期されないことである。なぜならば、生化学的研究
により、脳は他の多くの組織よりも甲状腺ホルモン受容
体が少なく（５，１６）、しかも成人の脳はリン酸脱水
素酵索活性によって甲状腺ホルモンに応答しないことが
示されたからである。（１７）。発現実験からの第２の
興味ある結果は、この転写物が肝臓に存在しないという
ことである。肝臓は通常甲状腺ホルモン受容体が分離さ
れる組織である。この不在はさらに別の形の甲状腺ホル
モン受容体の存在を暗示している。この提案は、肝臓と
心臓に薬理学的に区別しうる甲状腺ホルモン応答が存在
することを示すＵｎｄｅｒｗｏｏｄらのデータ（１８）
と一致するであろう。さらに、ＤＮＡハイブリダイゼー
ション実験からのデータは、哺乳動物甲状腺ホルモン受
容体のｃＤＮＡクローンとハイブリダイズする複数の遺
伝子座の存在を示し、異なる関連遺伝子座が５つも存在
しうることを示唆する（実験の部ＩＩＩおよび文献８を
参照）。これらの遺伝子座のいくつかは恐らく別の機能
分子をコードすると思われ、このことは発生およびホメ
オスタシス機能をコントロールする遺伝子の重なり合っ
たネットワークを協調的に調整する甲状腺ホルモン受容
体のファミリーの存在をうかがわせる。ＶＩＩ．Ｊ．実験の部ＶＩＩに関する図面の詳細な説明 第ＶＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地
図、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。
（Ａ）ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの
模式図；通常の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をいく
つか示す。斜線ボックスは推定されたコード領域を示
す。ハイブリダイゼーション実験で用いた５００ｂｐ
ＰｖｕＩＩフラグメント（ヌクレオチド位置６０７−１
１１３に相当する）は制限地図の下に実線で示す。
（Ｂ）ｒｂｅＡ１２の完全なヌクレオチド配列を、長い
オープン・リーディング・フレー上の推定アミノ酸配列
と共に示す。５’非翻訳領域内の３つの短いオープン・
リーディング・フレームは肉太の活字で示され、終結コ
ドンにはアンダーラインが引いてある。クローンｒｂｅ
Ａ１２はニック・トランスレーションしたプローブとし
てｐｈｅＡ４（Ｓｉｇｍａ社）の全ＥｃｏＲＩ挿入物を
用いて、Ｊ．Ａｒｒｉｚａから得たラット脳ｃＤＮＡラ
イブラリーからの約１０６個のファージをスクリーニン
グすることにより分離した（１９）。３個の陽性クロー
ンが分離され、そのうちで最も大きいもの（ｒｂｅＡ１
２）の完全ヌクレオチド配列をＭａｘａｍ ＆ Ｇｉｌ
ｂｅｒｔの化学的切断法（２０）により両鎖について決
定した。第ＶＩＩ−２図 ラット甲状腺ホルモン受容体（ｒＴＲα）タンパク質と
ヒト甲状腺ホルモン受容体（ｈＴＲβ）およびニワトリ
甲状腺ホルモン受容体（ｃＴＲα）タンパク質との略図
による比較。ボックス上の番号はアミノ酸残基を示し；
ボックス内の数字は閉じた領域内のｒＴＲαタンパク質
とのアミノ酸同一性のパーセントを示す。ＤＮＡはヒト
グルココルチコイド受容体（アミノ酸４２１から４８６
まで）との類似性から推定されたＤＮＡ結合ドメインを
表し、一方Ｔ３／Ｔ４は推定上のホルモン結合ドメイン
を表す。第ＶＩＩ−３（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）図 ｒＴＲα遺伝子のサザンブロット分析およびヒト染色体
局在化。ヒト胎盤ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、
０．８％アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース
へ移行させ、ＤＮＡ結合領域を含むｒｂｅＡ１２由来の
５００ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメント（Ａ）またはｈＴ
Ｒβ由来の４５０ｂｐ ＳｓｔＩフラグメント（実験の
部ＩＩＩを参照）（Ｂ）とハイブリダイズさせた。両ブ
ロットは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．００
１Ｍ ＥＤＴＡ）、１×デンハート溶液、０．１％ＳＤ
Ｓ、およびサケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）中４２
℃でハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒ
ｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）および０．１％Ｓ
ＤＳを用いて６８℃で洗浄した。ラムダＨｉｎｄＩＩＩ
マーカーのサイズをキロ塩基対で示す。（Ｃ）、ｒＴＲ
α遺伝子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレ
ーザーサイトフルオロメトリー（２１）で分離し、上記
条件と同じ条件下でｒｂｅＡ１２の５００ｂｐ Ｐｖｕ
ＩＩフラグメントとハイブリダイズさせた。第ＶＩＩ−４（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）図 ｒＴＲαのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および甲状腺ホルモン
結合。（Ａ）ｒＴＲαはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、ウ
サギ網状赤血球溶解液中で翻訳した。［３５Ｓ］メチオ
ニン標識産物は７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、フルオログラフィーで視覚化した。レー
ン１、添加ＲＮＡなし；レーン２、全５’非翻訳領域を
含むｒｂｅＡ１２；レーン３、９７ｂｐの５’非翻訳配
列のみを含むｒｂｅＡ１２Ｂ。タンパク質マーカーのサ
イズ：ウシ血清アルブミン、６６．２ＫＤ；卵アルブミ
ン、４５ＫＤ；カルボニックアンヒドラーゼ、３１Ｋ
Ｄ。（Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳したｒＴＲαに対する
１２５Ｉ−Ｔ３結合のスカッチャード分析。ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ翻訳したｒｂｅＡ１２Ｂ転写物を含む溶解液は、
１２５Ｉ−Ｔ３の異なる濃度で結合したホルモン量を測
定することにより、甲状腺ホルモン結合活性について検
定した。Ｋｄ＝２．９×１０−１１Ｍ。（Ｃ）ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ翻訳したｒＴＲαへの１２５Ｉ−Ｔ３結合に対
する甲状腺ホルモン類似体の競合。ｒｂｅＡ１２Ｂプロ
グラム化溶解液からの試料は、標識ホルモンと競合させ
るべく次第に増加する濃度の未標識甲状腺ホルモンまた
は類似体と混合した。特異的に結合した１２５Ｉ−Ｔ３
は競合化合物の濃度に対してプロットする。４つの別々
の実験において同じ競合パターンが観察された。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写／翻訳およびホルモン結合は記載した通
りに行った（２２，２３）。白の円はＴＲＩＡＣ、黒の
円はＬ−Ｔ３、黒の三角形はＬ−Ｔ４を表す。第ＶＩＩ−５図 ｒＴＲα ｍＲＮＡの組織分布。全ＲＮＡはグアニジン
チオシアネートを用いて種々のラット組織から分離し
（２４）、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で
分離し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてｒｂｅＡ
１２由来のニック・トランスレージョンした５００ｂｐ
ＰｖｕＩＩＩフラグメントとハイブリダイズさせた。
組織型および負荷した全ＲＮＡ量を各レーンの上に示
す。ＣＨＯ−ＢのｃＤＮＡ（試験したすべての組織にお
いて等しいレベルで発現されたチャイニーズハムスター
卵巣細胞ｍＲＮＡ）（２５）を内部標準として使用し
た。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの位置を示
す。 １９．ラット脳ｃＤＮＡライブラリーは全ライブラリー
脳からオリゴ（ｄＴ）選別ＲＮＡを用いて作製された。
第１鎖合成のためにモロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍ
−ＭｕＬＶ）の逆転写酵素（ＲＴ）を使用し；第２鎖合
成はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用し、そ
の後Ｍ−ＭｕＬＶ ＲＴ−ｃＤＮＡはＳＩヌクレアーゼ
で処理し、メチル化し、セファロース４Ｂ上でサイズに
より分画化し、ラムダｇｔＩＩアームへ連結し、そして
パッケージングを行った。このライブラリーは５００ｂ
ｐ以上の挿入物を含む２５×１０６個の独立した組換え
体から成る。 ２３．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、ｒｂｅＡ１２の
全ＥｃｏＲＩ挿入物はｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂ
ｉｏｔｅｃ社）にクローニングした。２２７ｂｐの５’
非翻訳配列を欠く第２構築物（ｒｂｅＡ１２Ｂ）は、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ修復したｒｂｅＡ１２のＢｇｌＩ
−ＳｍａＩフラグメント（ヌクレオチド位置２２７から
ポリリンカーまで）をｐＧＥＭ３のＳｍａＩ部位に挿入
することにより作製した。甲状腺ホルモン結合のため
に、転写はＳＰ６ポリメラーゼおよびＳｓｔＩで線状化
したｒｂｅＡ１２Ｂ５〜１０μｇを用いて行った。転写
物はＰ６０クロマトグラフィーで精製し、１５０〜２０
０μｌのウサギ網状赤血球溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂ
ｉｏｔｅｃ社）中で製造者の指示した条件下に翻訳し
た。スカッチャード分析および競合分析の両方におい
て、甲状腺ホルモン結合は同じ方法で測定した（但し、
スカッチャード分析の場合には未標識タンパク質を使用
した）。［１２５Ｉ］３，３’，５−トリヨードチロニ
ン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社，２２
２０ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、最終濃度０．３ｎＭ）はＴ３結
合緩衝液中でｉｎ ｖｉｔｒｏ合成したｒＴＲαポリペ
プチド（結合反応あたり溶解液２００μｌの５〜８μ
ｌ）と０℃で２時間２５０μｌの最終容量にて混合し
た。特異的ホルモン結合は１０００倍過剰未標識ホルモ
ンを加えることにより測定し、セファデックスＧ−２５
ファイン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）０．９×４．０ｃｍ
カラムから排除容量中に溶出される放射能をカウントす
ることにより検定した。
受容体の同定ＶＩＩ．Ａ．概要 ラット脳メッセンジャーＲＮＡから誘導された相補的Ｄ
ＮＡクローンは、ヒト甲状腺ホルモン受容体遺伝子に対
する相同性に基づいて分離された。この相補的ＤＮＡの
発現は甲状腺ホルモンに高い親和性を示す結合タンパク
質をもたらす。塩基配列の分析および特定のヒト遺伝子
座へのこの遺伝子のマッピングは、複数のヒト甲状腺ホ
ルモン受容体の存在を示す。この遺伝子からのメッセン
ジャーＲＮＡは組織特異的であり、中枢神経系において
最高レベルで発現される。ＶＩＩ．Ｂ．序論 甲状腺ホルモンは高等脊椎動物の多くの組織において発
生学的および生理学的応答の複雑な機構に関与している
（１）。それらの多種多様な作用には重要な代謝酵素、
ホルモンおよび受容体の調節が含まれる（２）。甲状腺
ホルモンの作用は核受容体により仲介され、標的細胞に
よる特定遺伝子の発現を調節する（３−５）。これらの
性質はステロイドホルモンとそれらの受容体との相互作
用に類似しており、最近観察されたステロイドホルモン
受容体と甲状腺ホルモン受容体との構造類似性に合致し
ている（実験の部ＩＩＩを参照）。ＶＩＩ．Ｃ．第２甲状腺ホルモン受容体ＤＮＡの分離 甲状腺ホルモン作用の多様性にもかかわらず、一般に甲
状腺ホルモン機能は単一の高親和性核受容体を介して起
こることが認められている。しかしながら、ｖ−ｅｒｂ
−Ａ腫瘍遺伝子産物の細胞相同体としての甲状腺ホルモ
ン受容体の最近の同定（実験の部ＩＩＩおよび文献７を
参照）は、ヒト染色体３および１７上の複数のｃ−ｅｒ
ｂ−Ａ遺伝子の先の同定（実験の部ＩＩＩおよび文献８
を参照）と合わせて、複数の甲状腺ホルモン受容体の存
在を示唆している。複数の甲状腺ホルモン応答の基礎を
なす機構が、構造的に異なる甲状腺ホルモン受容体の発
現から誘導されうる可能性を調べるために、我々はこれ
らの関連遺伝子座の１つの産物をコードする相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）クローンを分離した。推定上の神経細胞
型甲状腺ホルモン受容体は、ヒト甲状腺ホルモン受容体
ｃＤＮＡの１５００ｂｐフラグメントを用いて、ラット
脳メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から作製したｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより分離
された。（文献６として発表した実験の部ＩＩＩを参照
されたい。）約１０６個のファージから３個の陽性クロ
ーンを分離し、それらのうちで最も大きいもの、ｒｂｅ
Ａ１２、の完全ヌクレオチド配列を決定した（第ＶＩＩ
−１（Ｂ）図）。この配列は２０７９ｂｐの鎖長であ
り、ヌクレオチド位置３２５にイニシエーターメチオニ
ンコドンおよびヌクレオチド位置１５５４にターミネー
ターコドンを有する１２３０ｂｐの長いオープン・リー
ディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒ
ａｍｅ）を含む。このオープン・リーディング・フレー
ムは推定上のイニシエーターメチオニンの上流に３つの
短いオープン・リーディング・フレームを含む少なくと
も３２０ｂｐの５′非翻訳領域によって先行され、４１
０個のアミノ酸残基から成るタンパク質（計算した分子
量４５ＫＤ）をコードしている。ＶＩＩ．Ｄ．第２甲状腺ホルモン受容体と他の既知甲状
腺 ホルモン受容体タンパク質との比較 ｒｂｅＡ１２からの推定アミノ酸配列とヒト甲状腺ホル
モン受容体のアミノ酸配列（実験の部ＩＩＩを参照）と
の比較により、これらの２種類のタンパク質は異なるア
ミノ末端をもつことが分った（第ＶＩＩ−２図）。神経
細胞タンパク質の最初の４１個のアミノ酸とヒト甲状腺
ホルモン受容体の最初の９０個のアミノ酸は有意な相同
性を示さず、一方カルボキシル末端の３６７個のアミノ
酸は７５％のヌタレオチド同一性と８２％のアミノ酸同
一性を共有している。ラットのタンパク質は予告された
大きさおよび相同性の両方の点でニワトリの甲状腺ホル
モン受容体（７）とより一層関連が深く、８２％のヌク
レオチド同一性と８９％のアミノ酸同一性を共有してい
る。参考として、ニワトリ甲状腺ホルモン受容体は以前
に分離されたｅｒｂ−Ａ遺伝子との相同性ゆえにアルフ
ァ（ｃＴＲα）と称せられそしてヒト甲状腺ホルモン受
容体はベータ（ｈＴＲβ）と称せられる。ラット神経細
胞型はニワトリの受容体とより一層関連が深いので、そ
れはアルファ（ｒＴＲα）と呼ばれている。ステロイド
ホルモン受容体との類似性により、甲状腺ホルモン受容
体のシステインに富む領域はＤＮＡ結合ドメインである
と予想される（実験の部ＩＩＩおよびＩＩを参照；また
文献１０を参照）。この領域において、ｒＴＲαタンパ
ク質はｃＴＲαタンパク質と９７％のアミノ酸同一性を
有し、そしてｈＴＲβと９０％のアミノ酸同一性を有す
る。これらのタンパク質はまた、ステロイド受容体から
類推して、ホルモン結合ドメインであると思われるカル
ボキシル末端部分において十分に保存されている（実験
の部ＩＩおよび文献１１を参照）。ｒＴＲαのこの領域
はｃＴＲαと９４％のアミノ酸同一性を示し、そしてｈ
ＴＲβと８５％のアミノ酸同一性を示す。ＶＩＩ．Ｅ．新しい甲状腺ホルモン受容体の同定 塩基配列データに基づくと、我々が分離したｃＤＮＡは
以前に同定されたヒト甲状腺ホルモン受容体とは異なる
タンパク質をコードすると思われる（実験の部ＩＩＩを
参照）。神経細胞クローンが別の遺伝子産物であること
を立証するために、ｒｂｅＡ１２を用いてサザンブロッ
トおよび染色体分析によりヒト相同体を同定した。種々
の制限酵素で消化したヒト胎盤ＤＮＡはアガロースゲル
上で分離し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてラッ
トまたはヒトＴＲ特異的プローブ（それぞれの遺伝子の
重複領域から誘導されたもの）とハイブリダイズさせた
（第ＶＩＩ−３（Ａ）および（Ｂ）図）。試験した全て
の制限酵素に対して異なるハイブリダイゼーションパタ
ーンが観察され、このことは２つのｃＤＮＡが全く別の
遺伝子であることを示している。ｒｂｅＡ１２由来の同
じプローブは、ヒトリンパ様細胞から調製したレーザー
選別染色体とハイブリダイズさせた（第ＶＩＩ−３
（Ｃ）図）。ハイブリダイゼーションは染色体１７にの
み観察され、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子をヒト染色体１７に
局在化した以前のマッピング実験と一致した（８）。こ
れはヒト染色体３に存在するｈＴＲβとｒＴＲαとを区
別している（実験の部ＩＩを参照）。ＶＩＩ．Ｆ．発現実験 ｒＴＲα ｃＤＮＡが機能的な受容体タンパク質をコー
ドするか否かを調べるために、発現実験を行った。ｒＴ
Ｒの遺伝子の産物は初めにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写それに
続くｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により同定された。ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ転写のために、ｒｂｅＡ１２のＥｃｏＲＩ挿入
物は、発現ベクターｐＧＥＭ１にサブクローニングする
ことによりバクテリオファージＳＰ６プロモーターへ連
結した。第２構築物のｒｂｅＡ１２Ｂは翻訳効率を高め
る目的で作製された。ヌクレオチド位置９７までの５’
非翻訳領域は欠失させて、この領域内の３つの短いオー
プン・リーディング・フレームのうち２つを除去した。
ＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成した転写物はウサギ網
状赤血球溶解液と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳し、［
３５Ｓ］メチオニン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で分析した（第ＶＩＩ−４（Ａ）図）。約５
２，４８，３５および３３ＫＤの４種のタンパク質がセ
ンス鎖を翻訳したときだけ観察された。同じ４種のバン
ドがｒｂｅＡ１２およびｒｂｅＡ１２Ｂについて観察さ
れた。これらの翻訳産物はその後甲状腺ホルモン結合を
試験するために使用した。ＶＩＩ．Ｇ．ホルモン結合実験 甲状腺ホルモン結合は［１２５Ｉ］３，５，３’−トリ
ヨード−Ｌ−チロニン（１２５Ｉ−Ｔ３）を用いて測定
した。ｒＴＲαの特定タンパク質を含む試料のみがＴ３
結合を示した。ホルモン親和性はスカッチャード分析に
より決定し、解離定数（Ｋｄ）２．９×１０−１１Ｍを
与え（第ＶＩＩ−４（Ｂ）図）、これはｈＴＲβタンパ
ク質について観察されたＫｄ値（５×１０−１１Ｍ）と
類似するが（４，５）、ｃＴＲαタンパク質に対して測
定されたＫｄ値（２．１×１０−１０〜３．３×１０
−１０Ｍ）よりも低かった（実験の部ＩＩＩを参照）。
得られたＫｄ値の差異は使用した検定系が異なることに
よるのかも知れない。競合実験において、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ翻訳したｒＴＲαタンパク質はｈＴＲβタンパク質
と同じくＬ−Ｔ３およびＬ−チロキシン（Ｌ−Ｔ４）に
対して特有の親和性を示したが、３，５’，３’−トリ
ヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）に対しては異なるパター
ンを示した（第ＶＩＩ−４（Ｃ）図）。ＴＲＩＡＣはｈ
ＴＲβタンパク質の場合Ｔ３結合に対して比較的良好に
競合したが、ｒＴＲαタンパク質への結合に対してはＴ
３とほぼ同程度に競合した。ｈＴＲβおよびｃＴＲαの
タンパク質の場合のように、過剰のアルドステロン、エ
ストロゲン、プロゲステロン、テストステロンまたはビ
タミンＤ１によるｒＴＲαタンパク質へのＴ３結合に対
する競合は見られなかった。従って、我々は以前に開示
された甲状腺ホルモン受容体と類似した結合特性をもつ
が、それとは同一でない甲状腺ホルモン受容体を単離し
たと思われる（実験の部ＩＩＩおよび文献７を参照）。ＶＩＩ．Ｈ．組織特異性実験 甲状腺ホルモンに対する代謝応答の組織特異性により、
この甲状腺ホルモン受容体は特定の組織において発現さ
れるものかも知れないと考えた。こうして、ｒＴＲα遺
伝子の発現パターンがノザンブロット分析により調べら
れた（第ＶＩＩ−５図）。いろいろなラット組織から分
離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド−アガロースゲル上
で分画化し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてサザ
ンブロット分析および染色体マッピングの際に使用した
ものと同じｒｂｅＡ１２フラグメントとハイブリダイズ
させた。２．６Ｋｂ ＲＮＡが肝臓を除いて試験した全
ての組織に観察された。このＲＮＡは下垂体や筋肉にも
存在し、そしてＧＣ、ラット−１およびＰＣ１２細胞株
において発現される。デンシトメーター走査は、ｒＴＲ
αの発現レベルが試験した他のどの組織よりも脳におい
て１０〜２０倍高いことを示した。約５．０Ｋｂと６．
０Ｋｂの別の２種類のＲＮＡが全ての組織にほぼ等しい
量で存在するが、それらは２．６Ｋｂ ＲＮＡよりもは
るかに少量である。これらのバンドは２．６Ｋｂ ＲＮ
Ａの前駆体または関連遺伝子の産物でありうる。ＶＩＩ．Ｉ．論議および結論 第２の哺乳動物甲状腺ホルモン受容体の分離は、以前の
生化学的研究が単一の甲状腺ホルモン受容体よりも多く
の受容体の存在を予告していないので、驚くべきことで
ある。振り返ってみると、多くの臨床生理学的研究は複
数の受容体の存在を示すものとして解釈することができ
る。機能的異質性の１つの形態は、家族性甲状腺ホルモ
ン抵抗（甲状腺ホルモンに対する末梢応答が喪失または
減少するが、神経細胞機能は維持される）を有する患者
の確認により示唆された（１２，１３）。さらに、循環
性甲状腺ホルモンの低レベルと関連した苛酷な発生学的
作用（クレチン病）は、神経系に強く影響を与えるタイ
プと周辺機能により劇的に作用するタイプとに分類され
た（１３，１４）。構造的に異なる形の甲状腺ホルモン
受容体の存在を証明したのに加えて、我々が同定した受
容体はラット中枢神経系において高レベルで発現され
る。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用する
予備実験は海馬、視床下部、大脳皮質および扁桃での高
レベル発現を明らかにした。ＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョン実験もまた小脳において異例に高いレベルを示す。
甲状腺ホルモンは初期の脳発生において重要な役割を演
ずることが知られているが（１４）、この高レベル発現
は予期されないことである。なぜならば、生化学的研究
により、脳は他の多くの組織よりも甲状腺ホルモン受容
体が少なく（５，１６）、しかも成人の脳はリン酸脱水
素酵索活性によって甲状腺ホルモンに応答しないことが
示されたからである。（１７）。発現実験からの第２の
興味ある結果は、この転写物が肝臓に存在しないという
ことである。肝臓は通常甲状腺ホルモン受容体が分離さ
れる組織である。この不在はさらに別の形の甲状腺ホル
モン受容体の存在を暗示している。この提案は、肝臓と
心臓に薬理学的に区別しうる甲状腺ホルモン応答が存在
することを示すＵｎｄｅｒｗｏｏｄらのデータ（１８）
と一致するであろう。さらに、ＤＮＡハイブリダイゼー
ション実験からのデータは、哺乳動物甲状腺ホルモン受
容体のｃＤＮＡクローンとハイブリダイズする複数の遺
伝子座の存在を示し、異なる関連遺伝子座が５つも存在
しうることを示唆する（実験の部ＩＩＩおよび文献８を
参照）。これらの遺伝子座のいくつかは恐らく別の機能
分子をコードすると思われ、このことは発生およびホメ
オスタシス機能をコントロールする遺伝子の重なり合っ
たネットワークを協調的に調整する甲状腺ホルモン受容
体のファミリーの存在をうかがわせる。ＶＩＩ．Ｊ．実験の部ＶＩＩに関する図面の詳細な説明 第ＶＩＩ−１（Ａ）および（Ｂ）図 ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地
図、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。
（Ａ）ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの
模式図；通常の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をいく
つか示す。斜線ボックスは推定されたコード領域を示
す。ハイブリダイゼーション実験で用いた５００ｂｐ
ＰｖｕＩＩフラグメント（ヌクレオチド位置６０７−１
１１３に相当する）は制限地図の下に実線で示す。
（Ｂ）ｒｂｅＡ１２の完全なヌクレオチド配列を、長い
オープン・リーディング・フレー上の推定アミノ酸配列
と共に示す。５’非翻訳領域内の３つの短いオープン・
リーディング・フレームは肉太の活字で示され、終結コ
ドンにはアンダーラインが引いてある。クローンｒｂｅ
Ａ１２はニック・トランスレーションしたプローブとし
てｐｈｅＡ４（Ｓｉｇｍａ社）の全ＥｃｏＲＩ挿入物を
用いて、Ｊ．Ａｒｒｉｚａから得たラット脳ｃＤＮＡラ
イブラリーからの約１０６個のファージをスクリーニン
グすることにより分離した（１９）。３個の陽性クロー
ンが分離され、そのうちで最も大きいもの（ｒｂｅＡ１
２）の完全ヌクレオチド配列をＭａｘａｍ ＆ Ｇｉｌ
ｂｅｒｔの化学的切断法（２０）により両鎖について決
定した。第ＶＩＩ−２図 ラット甲状腺ホルモン受容体（ｒＴＲα）タンパク質と
ヒト甲状腺ホルモン受容体（ｈＴＲβ）およびニワトリ
甲状腺ホルモン受容体（ｃＴＲα）タンパク質との略図
による比較。ボックス上の番号はアミノ酸残基を示し；
ボックス内の数字は閉じた領域内のｒＴＲαタンパク質
とのアミノ酸同一性のパーセントを示す。ＤＮＡはヒト
グルココルチコイド受容体（アミノ酸４２１から４８６
まで）との類似性から推定されたＤＮＡ結合ドメインを
表し、一方Ｔ３／Ｔ４は推定上のホルモン結合ドメイン
を表す。第ＶＩＩ−３（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）図 ｒＴＲα遺伝子のサザンブロット分析およびヒト染色体
局在化。ヒト胎盤ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、
０．８％アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース
へ移行させ、ＤＮＡ結合領域を含むｒｂｅＡ１２由来の
５００ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメント（Ａ）またはｈＴ
Ｒβ由来の４５０ｂｐ ＳｓｔＩフラグメント（実験の
部ＩＩＩを参照）（Ｂ）とハイブリダイズさせた。両ブ
ロットは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．００
１Ｍ ＥＤＴＡ）、１×デンハート溶液、０．１％ＳＤ
Ｓ、およびサケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）中４２
℃でハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒ
ｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）および０．１％Ｓ
ＤＳを用いて６８℃で洗浄した。ラムダＨｉｎｄＩＩＩ
マーカーのサイズをキロ塩基対で示す。（Ｃ）、ｒＴＲ
α遺伝子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレ
ーザーサイトフルオロメトリー（２１）で分離し、上記
条件と同じ条件下でｒｂｅＡ１２の５００ｂｐ Ｐｖｕ
ＩＩフラグメントとハイブリダイズさせた。第ＶＩＩ−４（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）図 ｒＴＲαのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および甲状腺ホルモン
結合。（Ａ）ｒＴＲαはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、ウ
サギ網状赤血球溶解液中で翻訳した。［３５Ｓ］メチオ
ニン標識産物は７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、フルオログラフィーで視覚化した。レー
ン１、添加ＲＮＡなし；レーン２、全５’非翻訳領域を
含むｒｂｅＡ１２；レーン３、９７ｂｐの５’非翻訳配
列のみを含むｒｂｅＡ１２Ｂ。タンパク質マーカーのサ
イズ：ウシ血清アルブミン、６６．２ＫＤ；卵アルブミ
ン、４５ＫＤ；カルボニックアンヒドラーゼ、３１Ｋ
Ｄ。（Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳したｒＴＲαに対する
１２５Ｉ−Ｔ３結合のスカッチャード分析。ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ翻訳したｒｂｅＡ１２Ｂ転写物を含む溶解液は、
１２５Ｉ−Ｔ３の異なる濃度で結合したホルモン量を測
定することにより、甲状腺ホルモン結合活性について検
定した。Ｋｄ＝２．９×１０−１１Ｍ。（Ｃ）ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ翻訳したｒＴＲαへの１２５Ｉ−Ｔ３結合に対
する甲状腺ホルモン類似体の競合。ｒｂｅＡ１２Ｂプロ
グラム化溶解液からの試料は、標識ホルモンと競合させ
るべく次第に増加する濃度の未標識甲状腺ホルモンまた
は類似体と混合した。特異的に結合した１２５Ｉ−Ｔ３
は競合化合物の濃度に対してプロットする。４つの別々
の実験において同じ競合パターンが観察された。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写／翻訳およびホルモン結合は記載した通
りに行った（２２，２３）。白の円はＴＲＩＡＣ、黒の
円はＬ−Ｔ３、黒の三角形はＬ−Ｔ４を表す。第ＶＩＩ−５図 ｒＴＲα ｍＲＮＡの組織分布。全ＲＮＡはグアニジン
チオシアネートを用いて種々のラット組織から分離し
（２４）、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で
分離し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてｒｂｅＡ
１２由来のニック・トランスレージョンした５００ｂｐ
ＰｖｕＩＩＩフラグメントとハイブリダイズさせた。
組織型および負荷した全ＲＮＡ量を各レーンの上に示
す。ＣＨＯ−ＢのｃＤＮＡ（試験したすべての組織にお
いて等しいレベルで発現されたチャイニーズハムスター
卵巣細胞ｍＲＮＡ）（２５）を内部標準として使用し
た。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの位置を示
す。 １９．ラット脳ｃＤＮＡライブラリーは全ライブラリー
脳からオリゴ（ｄＴ）選別ＲＮＡを用いて作製された。
第１鎖合成のためにモロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍ
−ＭｕＬＶ）の逆転写酵素（ＲＴ）を使用し；第２鎖合
成はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用し、そ
の後Ｍ−ＭｕＬＶ ＲＴ−ｃＤＮＡはＳＩヌクレアーゼ
で処理し、メチル化し、セファロース４Ｂ上でサイズに
より分画化し、ラムダｇｔＩＩアームへ連結し、そして
パッケージングを行った。このライブラリーは５００ｂ
ｐ以上の挿入物を含む２５×１０６個の独立した組換え
体から成る。 ２３．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、ｒｂｅＡ１２の
全ＥｃｏＲＩ挿入物はｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂ
ｉｏｔｅｃ社）にクローニングした。２２７ｂｐの５’
非翻訳配列を欠く第２構築物（ｒｂｅＡ１２Ｂ）は、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ修復したｒｂｅＡ１２のＢｇｌＩ
−ＳｍａＩフラグメント（ヌクレオチド位置２２７から
ポリリンカーまで）をｐＧＥＭ３のＳｍａＩ部位に挿入
することにより作製した。甲状腺ホルモン結合のため
に、転写はＳＰ６ポリメラーゼおよびＳｓｔＩで線状化
したｒｂｅＡ１２Ｂ５〜１０μｇを用いて行った。転写
物はＰ６０クロマトグラフィーで精製し、１５０〜２０
０μｌのウサギ網状赤血球溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂ
ｉｏｔｅｃ社）中で製造者の指示した条件下に翻訳し
た。スカッチャード分析および競合分析の両方におい
て、甲状腺ホルモン結合は同じ方法で測定した（但し、
スカッチャード分析の場合には未標識タンパク質を使用
した）。［１２５Ｉ］３，３’，５−トリヨードチロニ
ン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社，２２
２０ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、最終濃度０．３ｎＭ）はＴ３結
合緩衝液中でｉｎ ｖｉｔｒｏ合成したｒＴＲαポリペ
プチド（結合反応あたり溶解液２００μｌの５〜８μ
ｌ）と０℃で２時間２５０μｌの最終容量にて混合し
た。特異的ホルモン結合は１０００倍過剰未標識ホルモ
ンを加えることにより測定し、セファデックスＧ−２５
ファイン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）０．９×４．０ｃｍ
カラムから排除容量中に溶出される放射能をカウントす
ることにより検定した。
【００１３】明細書の要約 前述の説明により、当分野で通常の知識を有する者は、
本発明がグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコ
イド受容体または甲状腺ホルモン受容体のホルモン結合
特性および／または転写活性化特性を有するタンパク質
をコードする配列から成る実質的に純粋なＤＮＡを提供
することを理解できるであろう。本発明はまた本発明Ｄ
ＮＡの実例となる受容体配列を含む種々のプラスミドを
提供する。本発明の代表的なプラスミドは特許目的のた
めにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託された。本発明はさらに本発明ＤＮＡ（またはｍＲ
ＮＡ）から発現された受容体タンパク質（その修飾され
た機能形体を含む）を提供する。新規な受容体ＤＮＡ、
ＲＮＡおよびタンパク質組成物に加えて、本発明は受容
体タンパク質の機能性を調べるためのバイオアッセイを
包含する。それはまた遺伝子工学的に処理された細胞に
おいて所望タンパク質を生産するための２つの新しい方
法を包含する。第１の方法は受容体と結合したホルモン
によって転写が活性化される遺伝子の転写を誘発する方
法である。第２の方法は細胞を遺伝子工学的に操作し、
その後受容体タンパク質と結合したホルモンによって転
写が活性化される遺伝子によりコードされるタンパク質
の生産を増大し且つ制御する方法である。本発明ＤＮＡ
は、ホルモン受容体タンパク質およびその機能的修飾体
を以前には不可能であった量で生産させるべく使用でき
る。本発明の結果として利用し得る受容体の量を用いれ
ば、今やこのタンパク質の詳細な構造解析が受容体結晶
を分析するＸ線回折法により可能である。さらに、受容
体タンパク質の十分な供給は、重合体−アゴニストまた
は受容体−アンタゴニスト活性について多くの化合物を
スクリーニングするために、それらを使用しうることを
意味している。また、受容体タンパク質の利用可能性
は、診断検定においてそれらを使用しうることを意味し
ている。本発明の精神および範囲から逸脱するこなく、
当業者は多種多様の用法および条件に適合させるべく本
発明をいろいろに変更および修飾することができる。こ
れらの変更および修飾は当然であり、公正であり、そし
て次の請求の範囲の均等の範囲内に含まれるものであ
る。
本発明がグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコ
イド受容体または甲状腺ホルモン受容体のホルモン結合
特性および／または転写活性化特性を有するタンパク質
をコードする配列から成る実質的に純粋なＤＮＡを提供
することを理解できるであろう。本発明はまた本発明Ｄ
ＮＡの実例となる受容体配列を含む種々のプラスミドを
提供する。本発明の代表的なプラスミドは特許目的のた
めにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託された。本発明はさらに本発明ＤＮＡ（またはｍＲ
ＮＡ）から発現された受容体タンパク質（その修飾され
た機能形体を含む）を提供する。新規な受容体ＤＮＡ、
ＲＮＡおよびタンパク質組成物に加えて、本発明は受容
体タンパク質の機能性を調べるためのバイオアッセイを
包含する。それはまた遺伝子工学的に処理された細胞に
おいて所望タンパク質を生産するための２つの新しい方
法を包含する。第１の方法は受容体と結合したホルモン
によって転写が活性化される遺伝子の転写を誘発する方
法である。第２の方法は細胞を遺伝子工学的に操作し、
その後受容体タンパク質と結合したホルモンによって転
写が活性化される遺伝子によりコードされるタンパク質
の生産を増大し且つ制御する方法である。本発明ＤＮＡ
は、ホルモン受容体タンパク質およびその機能的修飾体
を以前には不可能であった量で生産させるべく使用でき
る。本発明の結果として利用し得る受容体の量を用いれ
ば、今やこのタンパク質の詳細な構造解析が受容体結晶
を分析するＸ線回折法により可能である。さらに、受容
体タンパク質の十分な供給は、重合体−アゴニストまた
は受容体−アンタゴニスト活性について多くの化合物を
スクリーニングするために、それらを使用しうることを
意味している。また、受容体タンパク質の利用可能性
は、診断検定においてそれらを使用しうることを意味し
ている。本発明の精神および範囲から逸脱するこなく、
当業者は多種多様の用法および条件に適合させるべく本
発明をいろいろに変更および修飾することができる。こ
れらの変更および修飾は当然であり、公正であり、そし
て次の請求の範囲の均等の範囲内に含まれるものであ
る。
【００１４】
【図面の簡単な説明】 以下は図面の簡単な説明である。より詳細な説明は本明
細書の実験の部に示される。混同を避けるために実験の
部Ｉに述べた図面には頭部に点字“Ｉ”を付し、実験の
部ＩＩに述べた図面には頭部に点字“ＩＩ”を付した。
以下同様である。 図面は以下の４０図からなる。実験の部Ｉ 第Ｉ−１図（ＡおよびＢ）はヒトグルココルチコイド受
容体ｃＤＮＡ配列決定法（第Ｉ−１（Ａ）図）、および
ｃＤＮＡクローンの模式図を示す図である。第Ｉ−２図
はヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）のｃＤＮＡ
および推定一次蛋白質配列を示す図である。（第Ｉ−２
図は２部分に分かれている：第Ｉ−２（１）およびＩ−
２（２）図）。第Ｉ−３（ＡおよびＢ）図はヒトグルコ
コルチコイド受容体β−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’
末端の制限地図（第Ｉ−３（Ａ）図）およびヌクレオチ
ド配列（第Ｉ−３（Ｂ）図）を示す図である。第Ｉ−４
図（ＡおよびＢ）はインビトロで翻訳されたｈＧＲと細
胞抽出物からのインビボｈＧＲとのイムノブロット比較
に関する。第Ｉ−４（Ａ）図はｈＧＲｃＤＮＡ配列のイ
ンビトロ転写のために構成されたベクターを示す図であ
る。第Ｉ−４（Ｂ）図はインビトロ翻訳生成物および細
胞抽出物のウェスターンブロット分析を示す写真であ
る。第Ｉ−５図はインビトロで翻訳されたアルファーｈ
ＧＲ（ＧＲ１０７）のステロイド結合を示すグラフであ
る。第Ｉ−６（ＡおよびＢ）図は発現プラスミドｐＧＥ
ＲＲ１（第Ｉ−６（Ａ）図）およびｐＧＥＲＲ２（第Ｉ
−６（Ｂ）図）の模式図である。プラスミドｐＧＥＲＲ
１はエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１の発現に用いら
れ；ｐＧＥＲＲ２はｈＥＲＲ２の発現に用いられた。実験の部ＩＩ 第ＩＩ−１図はｈＧＲ機能的アッセイ法を模式的に表わ
した図である。第ＩＩ−２図はｈＧＲ蛋白質の発現を表
わすウェスターンブロット分析を示す写真である。第Ｉ
Ｉ−３図はｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導を示すブロッ
トの写真である。第ＩＩ４（ＡおよびＢ）図はグラフで
ある。第ＩＩ−４（Ａ）図はｐＲＳｈＧＲαのＤＥＸに
対する用量応答を示し、第ＩＩ−４（Ｂ）はｐＲＳｈＧ
Ｒαの滴定を示す。第ＩＩ−５図はｈＧＲにおける機能
区の位置を示す模式図である。実験の部ＩＩＩ 第ＩＩＩ−１（ＡおよびＢ）図はヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−
Ａ ｃＤＮＡの（Ａ）制限地図および配列決定法、なら
びに（Ｂ）ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。（第ＩＩＩ−１Ｂ図は２部分に分かれている：第Ｉ
ＩＩ−１（Ｂ）−１およびＩＩＩ−１（Ｂ）−２図）。
第ＩＩＩ−２図はｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子生成物、ヒ
ト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａポリペプチド、ならびにヒトグル
ココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ
末端部分間のアミノ酸配列比較を示す図である。第ＩＩ
Ｉ−３（Ａ，ＢおよびＣ）図はｃ−ｅｒｂ−Ａ ＤＮＡ
プローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサザーン分析および染
色体マッピングを示すブロットの写真である。第ＩＩＩ
−３（Ａ）図はエンドヌクレアーゼにより消化し、アガ
ロースゲル上で分離したヒト満期胎盤ＤＮＡを示す。第
ＩＩＩ−３（Ｂ）図はｃ−ｅｒｂ−Ａをプローブとして
用いた胎盤ＤＮＡの分析を示す。第ＩＩＩ−３（Ｃ）は
ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子の染色体マッピングを示す。
第ＩＩＩ−４（ＡおよびＢ）図はヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ発
現を示す写真である。第ＩＩＩ−４（Ａ）図はヒト細胞
系およびヒト胎盤から得たＲＮＡのノーザン分析を示す
ブロットである。第ＩＩＩ−４（Ｂ）図はインビトロに
おけるｅｒｂ−Ａポリペプチドの合成を示す。第ＩＩＩ
−５（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）図はインビトロで合成され
たｅｒｂ−Ａポリペプチドへの甲状腺ホルモンの結合に
関連する４種のグラフである。第ＩＩＩ−５（Ａ）図は
インビトロで形成されたｅｒｂ−Ａポリペプチドへの
１２５Ｉ−Ｔ３の結合のスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈ
ａｒｄ）分析である。第ＩＩＩ−５（Ｂ）図はインビト
ロにおける甲状腺ホルモン同族体の競合を示す。第ＩＩ
Ｉ−５（Ｃ）図はインビトロで合成されたｅｒｂ−Ａポ
リペプチドへの１２５Ｉ−Ｔ３結合に対するトリヨード
チロニン異性体の競合を示す。第ＩＩＩ−５（Ｄ）図は
０．４ＫＣｌ ＨｅＬａ細胞核抽出物への１２５Ｉ−Ｔ
３結合に対する甲状腺ホルモン同族体の競合を示す。第
ＩＩＩ−６図はステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモ
ン受容体を比較した模式図である。第ＩＩＩ−７図はヒ
ト甲状腺ホルモン受容体ｈＥＲＢＡ８．７のｃＤＮＡヌ
クレオチド配列および推定一次蛋白質配列を示す図であ
る。（甲状腺ホルモン受容体ｈＦＡ８の配列はｈＥＲＢ
Ａ８．７に関連がある。後記の発明の説明の項を参照さ
れたい）。実験の部ＩＶ 第ＩＶ−１（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）は３種の写真および
１種の模式図からなり、これらはすべてｈＧＲ遺伝子に
関連するゲノム配列の単離に関する。第ＩＶ−１（Ａ）
図は指示されたヌクレアーゼにより消化したヒト胎盤Ｄ
ＮＡの高ストリンジェンシーサザーン分析を示す写真で
ある。第ＩＶ−４（Ｂ）図は低ストリンジェンシーサザ
ーン分析を示す以外は同じである。第ＩＶ−４（Ｃ）図
もサザーンブロットの写真であり、これはラムダＨＧＨ
と表示されるクローンにおけるゲノム配列の単離を示
す。第ＩＶ−４（Ｄ）はラムダＨＧＨゲノム断片のイン
トロン−エクソン構造およびそれとｈＧＲとの相同を示
す模式図である。第ＩＶ−２（ＡおよびＢ）図はヒトミ
ネラロコルチコイド受容体のｃＤＮＡヌクレオチド配列
および推定一次蛋白質配列を示す図である。第ＩＶ−２
（Ａ）図は若干の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線
図と並んだｈＭＲの複合構造を示す。第ＩＶ−２（Ｂ）
図はｈＭＲの全ヌクレオチド配列およびその一次推定ア
ミノ酸配列を示す。（第ＩＶ−２（Ｂ）図は２部分に分
かれている：第ＩＶ−２（Ｂ）−１およびＩＶ−２
（Ｂ）２図）。第ＩＶ−３図はミネラロコルチコイド受
容体とグルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を示す
図である。第ＩＶ−４（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）図は発現
したｈＭＲのステロイド結合特性に関する図および３種
のグラフである。第ＩＶ−４（Ａ）図は発現ブラスミド
ｐＲＳｈＭＲ、すなわちｈＭＲの発現に用いたプラスミ
ドの構造を示す。第ＩＶ−４（Ｂ）図はｐＲＳｈＭＲト
ランスフェクションしたＣＯＳ細胞から調製した抽出物
におけるトリチウム化アルドステロン結合のスカッチャ
ード分析を示す。第ＩＶ−４（Ｃ）および（Ｄ）図はト
ランスフェクションしたＣＯＳ細胞における［３Ｈ］ア
ルドステロンとの結合に対する非標識ステロイド類の競
合を示すグラフである。第ＩＶ−５（Ａ，ＢおよびＣ）
図はトランスフェクションしたＣＶ−１細胞におけるｈ
ＭＲおよびｈＧＲ発現プラスミドによるＭＭＴＶ ＬＴ
Ｒの転写活性化を示す図および２種の写真である。第Ｉ
Ｖ−５（Ａ）図はプラスミドＧＭＣＡＴの模式図であ
る。第ＩＶ−５（Ｂ）図は正常血清によるｈＭＲまたは
ｈＧＲトランスフェクション後に見られたＣＡＴ酵素活
性の差を示すブロットの写真である。第ＩＶ−５（Ｃ）
図はｈＭＲまたはｈＧＲによりトランスフェクションし
た細胞における、アルドステロンまたはデキサメタゾン
によるＣＡＴ活性誘導の差を示すブロットの写真であ
る。第ＩＶ−６図はラット組織におけるミネラロコルチ
コイド受容体ｍＲＮＡのノーザーン分析を示すブロット
の写真である。第ＩＶ−７図はマイクロセルハイブリッ
ドのサザーン分析によるｈＭＲ遺伝子の染色体局在を示
す写真である。第ＩＶ−８図はｈＧＲ，ｈＭＲおよびｈ
ＰＲ構造のアミノ酸比較を示す模式図である。実験の部Ｖ 第Ｖ−１（ＡおよびＢ）図はｈＥＲＲ１のｃＤＮＡヌク
レオチド配列および推定一次蛋白質配列を示す図であ
る。第Ｖ−１（Ａ）図は若干の制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位の線図と並んだｈＥＲＲ１の複合構造を示す。
第Ｖ−１（Ｂ）図はｈＥＲＲ１の全ヌクレオチド配列お
よび一次推定アミノ酸配列を示す。（第Ｖ−１（Ｂ）図
は２部分に分かれている：第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ
−１（Ｂ）−２図）。第Ｖ−２（ＡおよびＢ）はｈＥＲ
Ｒ２のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定一次蛋白質
配列を示す図である。第Ｖ−２（Ａ）図は若干の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲＲ２の
複合構造を示す。第Ｖ−２（Ｂ）図はｈＥＲＲ２の全ヌ
クレオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示
す。（第Ｖ−２（Ｂ）図は２部分に分かれている：第Ｖ
−２（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図）。第Ｖ−３
図はｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ヒトエストロゲンおよび
グルココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域間のア
ミノ酸配列比較を示す図である。第Ｖ−４図はラットお
よびヒトの組織におけるｈＥＲＲ１（第Ｖ−４（Ａ）
図）およびｍＲＮＡ（第Ｖ−４（Ｂ）図）のノーザンブ
ロットハイブリダイゼーション分析を示す写真である。
第Ｖ−５図はｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２，ｈＥＲおよ
びヒト甲状腺ホルモン受容体（ｈＴ３Ｒβ）の間のアミ
ノ酸の比較を示す図である。実験の部ＶＩ 第ＶＩ−１（Ａ，ＢおよびＣ）図は２種の図、および図
と写真からなり、これらはすべてラットＧＨ５’側非翻
訳配列を含む種々の遺伝子融合体の甲状腺ホルモン応答
性に関する。第ＶＩ−１（Ａ）はラットＧＨ遺伝子の
５’側および３’側欠失体の応答性を示す図である。第
ＶＩ−１（Ｂ）図は推定Ｔ３受容体結合部位の機能分析
を示す図である。第ＶＩ−１（Ｃ）図はｍＲＮＡ転写開
始部位分析を示す図／写真の組合わせである。第ＶＩ−
２（ＡおよびＢ）図はビオチン−１１−ｄＵＴＰを含む
オリゴヌクレオチドプローブへのＴ３受容体の結合に関
する図である。第ＶＩ−１（Ａ）図はＧＨ５’側非翻訳
配列へのＴ３受容体の結合をアッセイするために用いら
れる２種のオリゴヌクレオチドプローブの模式図であ
る。第ＶＩ−２（Ｂ）図は各種オリゴヌクレオチドプロ
ーブによる、ＧＣ２核抽出物からの１２５Ｉ−Ｔ３標識
Ｔ３受容体の沈殿を示すグラフである。第ＶＩ−３図は
ＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー要素のＤ
ＮアーゼＩフットプリンティング（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ
ｉｎｇ）を示す写真である。第ＶＩ−４図は６４および
２９塩基対を含むオリゴヌクレオチドへの、ラット下垂
体細胞Ｔ３受容体およびｈｃ−ｅｒｂ−Ａインビトロ翻
訳生成物の５’側非翻訳ＧＨ配列の結合を示すグラフで
ある。実験の部ＶＩＩ 第ＶＩＩ−１（ＡおよびＢ）図はラット脳クローンｒｂ
ｅＡ１２由来の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地
図（Ａ）、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ酸配
列（Ｂ）を示す模式図である。第ＶＩＩ−２図はラット
甲状腺ホルモン受容体（ｒＴＲアルファ）蛋白質をヒト
甲状腺ホルモン受容体（ｈＴＲベータ）およびニワトリ
甲状腺ホルモン受容体（ｃＴＲフルファ）蛋白質と比較
した模式図である。第ＶＩＩ−３（Ａ，ＢおよびＣ）図
はｒＴＲアルファ遺伝子のサザーンブロット分析および
ヒト染色体局在を示す写真である。第ＶＩＩ−３（Ａ）
図はｒｂｅＡ１２由来の５００−ｂｐ ＰｖｕＩＩ断片
にハイブリダイズしたヒト胎盤ＤＮＡを示すブロットで
ある。第ＶＩＩ−３（Ｂ）図はｈＴＲベータ由来の４５
０−ｂｐ ＳｓｔＩ断片にハイブリダイズした胎盤ＤＮ
Ａを示す。第ＶＩＩ−３（Ｃ）図はｒＴＲアルファ遺伝
子の染色体マッピングを示す。第ＶＩＩ−４（Ａ，Ｂお
よびＣ）図はｒＴＲアルファのインビトロ翻訳および甲
状腺ホルモン結合に関する写真および２種のグラフであ
る。第ＶＩＩ−４（Ａ）図はｒＴＲアルファのインビト
ロ翻訳生成物を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの
写真である。第ＶＩＩ−４（Ｂ）図はインビトロ翻訳さ
れたｒＴＲアルファへの１２５Ｉ−Ｔ３結合のスカッチ
ャード分析を示すグラフである。第ＶＩＩ−４（Ｃ）図
はインビトロ翻訳されたｒＴＲアルファへの１２５Ｉ−
Ｔ３結合に対する甲状腺ホルモン同族体の競合を示すグ
ラフである。第ＶＩＩ−５図はｒＴＲアルファｍＲＮＡ
の組織分布を示すゲルの写真である。
細書の実験の部に示される。混同を避けるために実験の
部Ｉに述べた図面には頭部に点字“Ｉ”を付し、実験の
部ＩＩに述べた図面には頭部に点字“ＩＩ”を付した。
以下同様である。 図面は以下の４０図からなる。実験の部Ｉ 第Ｉ−１図（ＡおよびＢ）はヒトグルココルチコイド受
容体ｃＤＮＡ配列決定法（第Ｉ−１（Ａ）図）、および
ｃＤＮＡクローンの模式図を示す図である。第Ｉ−２図
はヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）のｃＤＮＡ
および推定一次蛋白質配列を示す図である。（第Ｉ−２
図は２部分に分かれている：第Ｉ−２（１）およびＩ−
２（２）図）。第Ｉ−３（ＡおよびＢ）図はヒトグルコ
コルチコイド受容体β−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’
末端の制限地図（第Ｉ−３（Ａ）図）およびヌクレオチ
ド配列（第Ｉ−３（Ｂ）図）を示す図である。第Ｉ−４
図（ＡおよびＢ）はインビトロで翻訳されたｈＧＲと細
胞抽出物からのインビボｈＧＲとのイムノブロット比較
に関する。第Ｉ−４（Ａ）図はｈＧＲｃＤＮＡ配列のイ
ンビトロ転写のために構成されたベクターを示す図であ
る。第Ｉ−４（Ｂ）図はインビトロ翻訳生成物および細
胞抽出物のウェスターンブロット分析を示す写真であ
る。第Ｉ−５図はインビトロで翻訳されたアルファーｈ
ＧＲ（ＧＲ１０７）のステロイド結合を示すグラフであ
る。第Ｉ−６（ＡおよびＢ）図は発現プラスミドｐＧＥ
ＲＲ１（第Ｉ−６（Ａ）図）およびｐＧＥＲＲ２（第Ｉ
−６（Ｂ）図）の模式図である。プラスミドｐＧＥＲＲ
１はエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１の発現に用いら
れ；ｐＧＥＲＲ２はｈＥＲＲ２の発現に用いられた。実験の部ＩＩ 第ＩＩ−１図はｈＧＲ機能的アッセイ法を模式的に表わ
した図である。第ＩＩ−２図はｈＧＲ蛋白質の発現を表
わすウェスターンブロット分析を示す写真である。第Ｉ
Ｉ−３図はｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導を示すブロッ
トの写真である。第ＩＩ４（ＡおよびＢ）図はグラフで
ある。第ＩＩ−４（Ａ）図はｐＲＳｈＧＲαのＤＥＸに
対する用量応答を示し、第ＩＩ−４（Ｂ）はｐＲＳｈＧ
Ｒαの滴定を示す。第ＩＩ−５図はｈＧＲにおける機能
区の位置を示す模式図である。実験の部ＩＩＩ 第ＩＩＩ−１（ＡおよびＢ）図はヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−
Ａ ｃＤＮＡの（Ａ）制限地図および配列決定法、なら
びに（Ｂ）ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示
す。（第ＩＩＩ−１Ｂ図は２部分に分かれている：第Ｉ
ＩＩ−１（Ｂ）−１およびＩＩＩ−１（Ｂ）−２図）。
第ＩＩＩ−２図はｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子生成物、ヒ
ト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａポリペプチド、ならびにヒトグル
ココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ
末端部分間のアミノ酸配列比較を示す図である。第ＩＩ
Ｉ−３（Ａ，ＢおよびＣ）図はｃ−ｅｒｂ−Ａ ＤＮＡ
プローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサザーン分析および染
色体マッピングを示すブロットの写真である。第ＩＩＩ
−３（Ａ）図はエンドヌクレアーゼにより消化し、アガ
ロースゲル上で分離したヒト満期胎盤ＤＮＡを示す。第
ＩＩＩ−３（Ｂ）図はｃ−ｅｒｂ−Ａをプローブとして
用いた胎盤ＤＮＡの分析を示す。第ＩＩＩ−３（Ｃ）は
ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子の染色体マッピングを示す。
第ＩＩＩ−４（ＡおよびＢ）図はヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ発
現を示す写真である。第ＩＩＩ−４（Ａ）図はヒト細胞
系およびヒト胎盤から得たＲＮＡのノーザン分析を示す
ブロットである。第ＩＩＩ−４（Ｂ）図はインビトロに
おけるｅｒｂ−Ａポリペプチドの合成を示す。第ＩＩＩ
−５（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）図はインビトロで合成され
たｅｒｂ−Ａポリペプチドへの甲状腺ホルモンの結合に
関連する４種のグラフである。第ＩＩＩ−５（Ａ）図は
インビトロで形成されたｅｒｂ−Ａポリペプチドへの
１２５Ｉ−Ｔ３の結合のスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈ
ａｒｄ）分析である。第ＩＩＩ−５（Ｂ）図はインビト
ロにおける甲状腺ホルモン同族体の競合を示す。第ＩＩ
Ｉ−５（Ｃ）図はインビトロで合成されたｅｒｂ−Ａポ
リペプチドへの１２５Ｉ−Ｔ３結合に対するトリヨード
チロニン異性体の競合を示す。第ＩＩＩ−５（Ｄ）図は
０．４ＫＣｌ ＨｅＬａ細胞核抽出物への１２５Ｉ−Ｔ
３結合に対する甲状腺ホルモン同族体の競合を示す。第
ＩＩＩ−６図はステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモ
ン受容体を比較した模式図である。第ＩＩＩ−７図はヒ
ト甲状腺ホルモン受容体ｈＥＲＢＡ８．７のｃＤＮＡヌ
クレオチド配列および推定一次蛋白質配列を示す図であ
る。（甲状腺ホルモン受容体ｈＦＡ８の配列はｈＥＲＢ
Ａ８．７に関連がある。後記の発明の説明の項を参照さ
れたい）。実験の部ＩＶ 第ＩＶ−１（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）は３種の写真および
１種の模式図からなり、これらはすべてｈＧＲ遺伝子に
関連するゲノム配列の単離に関する。第ＩＶ−１（Ａ）
図は指示されたヌクレアーゼにより消化したヒト胎盤Ｄ
ＮＡの高ストリンジェンシーサザーン分析を示す写真で
ある。第ＩＶ−４（Ｂ）図は低ストリンジェンシーサザ
ーン分析を示す以外は同じである。第ＩＶ−４（Ｃ）図
もサザーンブロットの写真であり、これはラムダＨＧＨ
と表示されるクローンにおけるゲノム配列の単離を示
す。第ＩＶ−４（Ｄ）はラムダＨＧＨゲノム断片のイン
トロン−エクソン構造およびそれとｈＧＲとの相同を示
す模式図である。第ＩＶ−２（ＡおよびＢ）図はヒトミ
ネラロコルチコイド受容体のｃＤＮＡヌクレオチド配列
および推定一次蛋白質配列を示す図である。第ＩＶ−２
（Ａ）図は若干の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線
図と並んだｈＭＲの複合構造を示す。第ＩＶ−２（Ｂ）
図はｈＭＲの全ヌクレオチド配列およびその一次推定ア
ミノ酸配列を示す。（第ＩＶ−２（Ｂ）図は２部分に分
かれている：第ＩＶ−２（Ｂ）−１およびＩＶ−２
（Ｂ）２図）。第ＩＶ−３図はミネラロコルチコイド受
容体とグルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を示す
図である。第ＩＶ−４（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）図は発現
したｈＭＲのステロイド結合特性に関する図および３種
のグラフである。第ＩＶ−４（Ａ）図は発現ブラスミド
ｐＲＳｈＭＲ、すなわちｈＭＲの発現に用いたプラスミ
ドの構造を示す。第ＩＶ−４（Ｂ）図はｐＲＳｈＭＲト
ランスフェクションしたＣＯＳ細胞から調製した抽出物
におけるトリチウム化アルドステロン結合のスカッチャ
ード分析を示す。第ＩＶ−４（Ｃ）および（Ｄ）図はト
ランスフェクションしたＣＯＳ細胞における［３Ｈ］ア
ルドステロンとの結合に対する非標識ステロイド類の競
合を示すグラフである。第ＩＶ−５（Ａ，ＢおよびＣ）
図はトランスフェクションしたＣＶ−１細胞におけるｈ
ＭＲおよびｈＧＲ発現プラスミドによるＭＭＴＶ ＬＴ
Ｒの転写活性化を示す図および２種の写真である。第Ｉ
Ｖ−５（Ａ）図はプラスミドＧＭＣＡＴの模式図であ
る。第ＩＶ−５（Ｂ）図は正常血清によるｈＭＲまたは
ｈＧＲトランスフェクション後に見られたＣＡＴ酵素活
性の差を示すブロットの写真である。第ＩＶ−５（Ｃ）
図はｈＭＲまたはｈＧＲによりトランスフェクションし
た細胞における、アルドステロンまたはデキサメタゾン
によるＣＡＴ活性誘導の差を示すブロットの写真であ
る。第ＩＶ−６図はラット組織におけるミネラロコルチ
コイド受容体ｍＲＮＡのノーザーン分析を示すブロット
の写真である。第ＩＶ−７図はマイクロセルハイブリッ
ドのサザーン分析によるｈＭＲ遺伝子の染色体局在を示
す写真である。第ＩＶ−８図はｈＧＲ，ｈＭＲおよびｈ
ＰＲ構造のアミノ酸比較を示す模式図である。実験の部Ｖ 第Ｖ−１（ＡおよびＢ）図はｈＥＲＲ１のｃＤＮＡヌク
レオチド配列および推定一次蛋白質配列を示す図であ
る。第Ｖ−１（Ａ）図は若干の制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位の線図と並んだｈＥＲＲ１の複合構造を示す。
第Ｖ−１（Ｂ）図はｈＥＲＲ１の全ヌクレオチド配列お
よび一次推定アミノ酸配列を示す。（第Ｖ−１（Ｂ）図
は２部分に分かれている：第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ
−１（Ｂ）−２図）。第Ｖ−２（ＡおよびＢ）はｈＥＲ
Ｒ２のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定一次蛋白質
配列を示す図である。第Ｖ−２（Ａ）図は若干の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲＲ２の
複合構造を示す。第Ｖ−２（Ｂ）図はｈＥＲＲ２の全ヌ
クレオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示
す。（第Ｖ−２（Ｂ）図は２部分に分かれている：第Ｖ
−２（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図）。第Ｖ−３
図はｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ヒトエストロゲンおよび
グルココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域間のア
ミノ酸配列比較を示す図である。第Ｖ−４図はラットお
よびヒトの組織におけるｈＥＲＲ１（第Ｖ−４（Ａ）
図）およびｍＲＮＡ（第Ｖ−４（Ｂ）図）のノーザンブ
ロットハイブリダイゼーション分析を示す写真である。
第Ｖ−５図はｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２，ｈＥＲおよ
びヒト甲状腺ホルモン受容体（ｈＴ３Ｒβ）の間のアミ
ノ酸の比較を示す図である。実験の部ＶＩ 第ＶＩ−１（Ａ，ＢおよびＣ）図は２種の図、および図
と写真からなり、これらはすべてラットＧＨ５’側非翻
訳配列を含む種々の遺伝子融合体の甲状腺ホルモン応答
性に関する。第ＶＩ−１（Ａ）はラットＧＨ遺伝子の
５’側および３’側欠失体の応答性を示す図である。第
ＶＩ−１（Ｂ）図は推定Ｔ３受容体結合部位の機能分析
を示す図である。第ＶＩ−１（Ｃ）図はｍＲＮＡ転写開
始部位分析を示す図／写真の組合わせである。第ＶＩ−
２（ＡおよびＢ）図はビオチン−１１−ｄＵＴＰを含む
オリゴヌクレオチドプローブへのＴ３受容体の結合に関
する図である。第ＶＩ−１（Ａ）図はＧＨ５’側非翻訳
配列へのＴ３受容体の結合をアッセイするために用いら
れる２種のオリゴヌクレオチドプローブの模式図であ
る。第ＶＩ−２（Ｂ）図は各種オリゴヌクレオチドプロ
ーブによる、ＧＣ２核抽出物からの１２５Ｉ−Ｔ３標識
Ｔ３受容体の沈殿を示すグラフである。第ＶＩ−３図は
ＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー要素のＤ
ＮアーゼＩフットプリンティング（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ
ｉｎｇ）を示す写真である。第ＶＩ−４図は６４および
２９塩基対を含むオリゴヌクレオチドへの、ラット下垂
体細胞Ｔ３受容体およびｈｃ−ｅｒｂ−Ａインビトロ翻
訳生成物の５’側非翻訳ＧＨ配列の結合を示すグラフで
ある。実験の部ＶＩＩ 第ＶＩＩ−１（ＡおよびＢ）図はラット脳クローンｒｂ
ｅＡ１２由来の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地
図（Ａ）、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ酸配
列（Ｂ）を示す模式図である。第ＶＩＩ−２図はラット
甲状腺ホルモン受容体（ｒＴＲアルファ）蛋白質をヒト
甲状腺ホルモン受容体（ｈＴＲベータ）およびニワトリ
甲状腺ホルモン受容体（ｃＴＲフルファ）蛋白質と比較
した模式図である。第ＶＩＩ−３（Ａ，ＢおよびＣ）図
はｒＴＲアルファ遺伝子のサザーンブロット分析および
ヒト染色体局在を示す写真である。第ＶＩＩ−３（Ａ）
図はｒｂｅＡ１２由来の５００−ｂｐ ＰｖｕＩＩ断片
にハイブリダイズしたヒト胎盤ＤＮＡを示すブロットで
ある。第ＶＩＩ−３（Ｂ）図はｈＴＲベータ由来の４５
０−ｂｐ ＳｓｔＩ断片にハイブリダイズした胎盤ＤＮ
Ａを示す。第ＶＩＩ−３（Ｃ）図はｒＴＲアルファ遺伝
子の染色体マッピングを示す。第ＶＩＩ−４（Ａ，Ｂお
よびＣ）図はｒＴＲアルファのインビトロ翻訳および甲
状腺ホルモン結合に関する写真および２種のグラフであ
る。第ＶＩＩ−４（Ａ）図はｒＴＲアルファのインビト
ロ翻訳生成物を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの
写真である。第ＶＩＩ−４（Ｂ）図はインビトロ翻訳さ
れたｒＴＲアルファへの１２５Ｉ−Ｔ３結合のスカッチ
ャード分析を示すグラフである。第ＶＩＩ−４（Ｃ）図
はインビトロ翻訳されたｒＴＲアルファへの１２５Ｉ−
Ｔ３結合に対する甲状腺ホルモン同族体の競合を示すグ
ラフである。第ＶＩＩ−５図はｒＴＲアルファｍＲＮＡ
の組織分布を示すゲルの写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年３月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ホルモン受容体組成物および方法
【特許請求の範囲】
【化１】
【化２】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体ベータに特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｃ） 配列III−７：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体ベータに特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｃ） 配列III−７：
【化３】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体アルファに特有の
ホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有す
る蛋白質； （ｅ） 配列IV−２（Ｂ）：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体アルファに特有の
ホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有す
る蛋白質； （ｅ） 配列IV−２（Ｂ）：
【化４】
【化５】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｆ） アミノ酸配列（ｅ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつミネラルコルチコイド受容体に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｇ） 配列V−１（Ｂ）：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつミネラルコルチコイド受容体に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｇ） 配列V−１（Ｂ）：
【化６】
【化７】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｈ） アミノ酸配列（ｇ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質； （ｉ） 配列V−２（Ｂ）：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質； （ｉ） 配列V−２（Ｂ）：
【化８】
【化９】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｊ） アミノ酸配列（ｉ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質。
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質。
【化１０】
【化１１】 ｈＴＲアルファ：
【化１２】 ｈＭＲ：
【化１３】
【化１４】 ｈＥＲＲ１：
【化１５】
【化１６】 ｈＥＲＲ２：
【化１７】
【化１８】 に示されるアミノ酸配列よりなる群から選ばれるアミノ
酸配列からなる請求項１１記載の実質的に純粋な蛋白
質。
酸配列からなる請求項１１記載の実質的に純粋な蛋白
質。
【化１９】
【化２０】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体ベータに特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｃ） 配列III−７：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体ベータに特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｃ） 配列III−７：
【化２１】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体アルファに特有の
ホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有す
る蛋白質； （ｅ） 配列IV−２（Ｂ）：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体アルファに特有の
ホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有す
る蛋白質； （ｅ） 配列IV−２（Ｂ）：
【化２２】
【化２３】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｆ） アミノ酸配列（ｅ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつミネラルコルチコイド受容体に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｇ） 配列V−１（Ｂ）：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつミネラルコルチコイド受容体に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質； （ｇ） 配列V−１（Ｂ）：
【化２４】
【化２５】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｈ） アミノ酸配列（ｇ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質； （ｉ） 配列V−２（Ｂ）：
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質； （ｉ） 配列V−２（Ｂ）：
【化２６】
【化２７】 のアミノ酸配列からなる蛋白質； （ｊ） アミノ酸配列（ｉ）において１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質であり； （１） 転写制御要素に結合した状態の［（Ｈ）または
（ａＨ）／（Ｒ）または（ｒ）］複合体によって活性化
されうる転写制御要素の制御下に遺伝子（Ｇ）が置かれ
るべく遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置し；（２）
受容体（Ｒ）、または受容体（Ｒ）が有する転写活性化
特性を備えたその修飾された機能性形態（ｒ）をコード
するＤＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転換し；そして
（３） 遺伝子（Ｇ）の発現、すなわち結果的に蛋白質
（Ｐ）の生成を誘導および制御するのに十分な水準にま
で細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体
（ａＨ）の濃度を増大させることよりなる方法。
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつエストロゲン関連受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質であり； （１） 転写制御要素に結合した状態の［（Ｈ）または
（ａＨ）／（Ｒ）または（ｒ）］複合体によって活性化
されうる転写制御要素の制御下に遺伝子（Ｇ）が置かれ
るべく遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置し；（２）
受容体（Ｒ）、または受容体（Ｒ）が有する転写活性化
特性を備えたその修飾された機能性形態（ｒ）をコード
するＤＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転換し；そして
（３） 遺伝子（Ｇ）の発現、すなわち結果的に蛋白質
（Ｐ）の生成を誘導および制御するのに十分な水準にま
で細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体
（ａＨ）の濃度を増大させることよりなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はホルモン受容体蛋白
質およびそれらをコードする遺伝子、組換えＤＮＡ法そ
の他の遺伝子工学的技術によるこれら受容体および遺伝
子の修飾、ならびにこれら受容体および遺伝子（修飾さ
れていないものおよび修飾されたもの）の利用に関す
る。より詳細には本発明はステロイドホルモンおよび甲
状腺ホルモン受容体、ならびに関連遺伝子に関する。き
わめて詳細には本発明はヒトのグルココルチコイド、ミ
ネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容体、な
らびにそれらに対する遺伝子に関する。さらに本発明は
受容体ＤＮＡクローンによりコードされるホルモン受容
体蛋白質の機能性を測定するための新規なバイオアッセ
イ系、および受容体蛋白質と複合体を形成したホルモン
によってその転写が活性化される遺伝子の発現を誘導お
よび制御するための新規な方法に関する。
質およびそれらをコードする遺伝子、組換えＤＮＡ法そ
の他の遺伝子工学的技術によるこれら受容体および遺伝
子の修飾、ならびにこれら受容体および遺伝子（修飾さ
れていないものおよび修飾されたもの）の利用に関す
る。より詳細には本発明はステロイドホルモンおよび甲
状腺ホルモン受容体、ならびに関連遺伝子に関する。き
わめて詳細には本発明はヒトのグルココルチコイド、ミ
ネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容体、な
らびにそれらに対する遺伝子に関する。さらに本発明は
受容体ＤＮＡクローンによりコードされるホルモン受容
体蛋白質の機能性を測定するための新規なバイオアッセ
イ系、および受容体蛋白質と複合体を形成したホルモン
によってその転写が活性化される遺伝子の発現を誘導お
よび制御するための新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトその他の哺乳動物、鳥類および魚類
を含む複雑な真核生物における発育および恒常性の転写
調節は、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンを含
む種々の調節物質によって制御されている。これらのホ
ルモンは系統発生的に異なる生物における発育および分
化に強い影響を与え、それらの作用はそれらと受容体と
呼ばれる特異的な高親和性結合蛋白質との相互作用の結
合として媒介される。一般にジェンセン(Ｊensen)ら(１
９７２)；ゴルスキー(Ｇorski)ら(１９７６)；ヤマモト
（Ｙamamoto）ら（１９７６）；オマレイ（Ｏ'Ｍalle
y）ら(１９６９)；ヘイワード（Ｈayward）ら(１９８
２)；およびアスバーナー(Ａsburner）ら(１９７８）を
参照されたい。
を含む複雑な真核生物における発育および恒常性の転写
調節は、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンを含
む種々の調節物質によって制御されている。これらのホ
ルモンは系統発生的に異なる生物における発育および分
化に強い影響を与え、それらの作用はそれらと受容体と
呼ばれる特異的な高親和性結合蛋白質との相互作用の結
合として媒介される。一般にジェンセン(Ｊensen)ら(１
９７２)；ゴルスキー(Ｇorski)ら(１９７６)；ヤマモト
（Ｙamamoto）ら（１９７６）；オマレイ（Ｏ'Ｍalle
y）ら(１９６９)；ヘイワード（Ｈayward）ら(１９８
２)；およびアスバーナー(Ａsburner）ら(１９７８）を
参照されたい。
【０００３】それぞれ幾つかの群の同系ステロイドホル
モン（すなわちエストロゲン（エストロゲン受容体）、
ゲスターゲン（プロゲステロン受容体）、グルココルチ
コイド（グルココルチコイド受容体）、アンドロゲン
（アンドロゲン受容体）、アルドステロン（ミネラルコ
ルチコイド受容体）のうちの１種、または同系甲状腺ホ
ルモン（甲状腺ホルモン受容体）に対して特に特異的で
ある受容体蛋白質が知られており、組織特異的な様式で
分布している。ホルビッツら（Ｈorwitz）ら(1978)およ
びパルミテール（Ｐamiter）ら（１９７６）を参照され
たい。
モン（すなわちエストロゲン（エストロゲン受容体）、
ゲスターゲン（プロゲステロン受容体）、グルココルチ
コイド（グルココルチコイド受容体）、アンドロゲン
（アンドロゲン受容体）、アルドステロン（ミネラルコ
ルチコイド受容体）のうちの１種、または同系甲状腺ホ
ルモン（甲状腺ホルモン受容体）に対して特に特異的で
ある受容体蛋白質が知られており、組織特異的な様式で
分布している。ホルビッツら（Ｈorwitz）ら(1978)およ
びパルミテール（Ｐamiter）ら（１９７６）を参照され
たい。
【０００４】ホルモンと受容体の相互作用については、
ステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモンが拡散の促進
により細胞に入り、その特異的受容体蛋白質に結合し、
蛋白質のアロステリック変化を開始することが知られて
いる。この変化の結果、ホルモン／受容体−複合体はク
ロマチン上の特定の特異的部位に高い親和性で結合する
ことができる。ヤマモト(Ｙamamoto)ら(１９７２)およ
びジェンセン(Ｊensen)ら（１９６８）を参照された
い。
ステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモンが拡散の促進
により細胞に入り、その特異的受容体蛋白質に結合し、
蛋白質のアロステリック変化を開始することが知られて
いる。この変化の結果、ホルモン／受容体−複合体はク
ロマチン上の特定の特異的部位に高い親和性で結合する
ことができる。ヤマモト(Ｙamamoto)ら(１９７２)およ
びジェンセン(Ｊensen)ら（１９６８）を参照された
い。
【０００５】ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン
の一次効果の多くが、特異的細胞型における一組の遺伝
子の転写の増大を伴うことも知られている。ペテルコフ
スキー(Ｐeterkofsky)ら(１９６８)およびマックナイト
(Ｍcknight）ら（１９６８）を参照されたい。さらにス
テロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンに応答する（ク
ロマチンとホルモン受容体／ホルモン−複合体との相互
作用により）遺伝子の転写の可活性化(結果的に発現の
増大)は複合体が遺伝子に付随するエンハンサーに結合
することによって行われることも証明されている(ホー
リー(Ｋhoury)ら、１９８３）を参照されたい。
の一次効果の多くが、特異的細胞型における一組の遺伝
子の転写の増大を伴うことも知られている。ペテルコフ
スキー(Ｐeterkofsky)ら(１９６８)およびマックナイト
(Ｍcknight）ら（１９６８）を参照されたい。さらにス
テロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンに応答する（ク
ロマチンとホルモン受容体／ホルモン−複合体との相互
作用により）遺伝子の転写の可活性化(結果的に発現の
増大)は複合体が遺伝子に付随するエンハンサーに結合
することによって行われることも証明されている(ホー
リー(Ｋhoury)ら、１９８３）を参照されたい。
【０００６】いずれにしろ多数のステロイドホルモンお
よび甲状腺ホルモン応答性転写制御ユニット(それらの
うちあるものはエンハンサーを含むことが示されてい
る)が同定されている。これらには下記のものが含まれ
る。マウス乳腺腫瘍ウイルス５’側長鎖末端反復（ＭＴ
Ｖ ＬＴＲ）：グルココルチコイド、アルドステロンお
よびアンドロゲンホルモンに応答；哺乳動物成長ホルモ
ン遺伝子に対する転写制御遺伝子；グルココルチコイ
ド、エストロゲンおよび甲状腺ホルモンに応答；哺乳動
物プロラクチン遺伝子およびプロゲステロン受容体遺伝
子に対する転写制御ユニット：エストロゲンに応答；鳥
類卵アルブミン遺伝子に対する転写制御ユニット；プロ
ゲステロンに応答；哺乳動物メタロチオネイン(metallo
thionein）遺伝子転写制御ユニット：グルココルチコイ
ドに応答；ならびに哺乳動物肝α2u−グロブリン遺伝子
転写制御ユニット：アンドロゲン、エストロゲン、甲状
腺ホルモンおよびグルココルチコイドに応答。（本発明
の実験の部Ｉの序文を参照されたい）。
よび甲状腺ホルモン応答性転写制御ユニット(それらの
うちあるものはエンハンサーを含むことが示されてい
る)が同定されている。これらには下記のものが含まれ
る。マウス乳腺腫瘍ウイルス５’側長鎖末端反復（ＭＴ
Ｖ ＬＴＲ）：グルココルチコイド、アルドステロンお
よびアンドロゲンホルモンに応答；哺乳動物成長ホルモ
ン遺伝子に対する転写制御遺伝子；グルココルチコイ
ド、エストロゲンおよび甲状腺ホルモンに応答；哺乳動
物プロラクチン遺伝子およびプロゲステロン受容体遺伝
子に対する転写制御ユニット：エストロゲンに応答；鳥
類卵アルブミン遺伝子に対する転写制御ユニット；プロ
ゲステロンに応答；哺乳動物メタロチオネイン(metallo
thionein）遺伝子転写制御ユニット：グルココルチコイ
ドに応答；ならびに哺乳動物肝α2u−グロブリン遺伝子
転写制御ユニット：アンドロゲン、エストロゲン、甲状
腺ホルモンおよびグルココルチコイドに応答。（本発明
の実験の部Ｉの序文を参照されたい）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ステロイドホルモンお
よび甲状腺ホルモン受容体の十分な理解およびいっそう
の実用に対する障害は、これらの特性を調べるのに十分
な量および十分な程度に純粋な形で入手できないことで
あった。これはそれらをコードするＤＮＡ遺伝子セグメ
ントについても同じであった。これらのＤＮＡセグメン
トを入手できないため、受容体コード遺伝子のインビト
ロ操作およびインビボ発現が妨げられ、結果的にこれら
の操作および発現が与えられる知見が得られなかった。
よび甲状腺ホルモン受容体の十分な理解およびいっそう
の実用に対する障害は、これらの特性を調べるのに十分
な量および十分な程度に純粋な形で入手できないことで
あった。これはそれらをコードするＤＮＡ遺伝子セグメ
ントについても同じであった。これらのＤＮＡセグメン
トを入手できないため、受容体コード遺伝子のインビト
ロ操作およびインビボ発現が妨げられ、結果的にこれら
の操作および発現が与えられる知見が得られなかった。
【０００８】参考文献一覧表 刊 行 物 本明細書の背景の項では以下の刊行物を参照する。 １．Ａsburner,Ｍ.，and Ｂerendes,Ｈ.Ｄ．in Ｔhe Ｇ
enetics and Ｂiology of Ｄrosophila，Ｅds.Ａshburne
r,Ｍ.，and Ｗright,Ｔ.Ｒ.Ｆ.,Ｖol.２，pp．315−39
5，Ａcademic，Ｌondon（1978）。 ２．Ｇorski,Ｊ.，and Ｇannon，Ｆ.,Ａ.Ｒev.Ｐhysio
l.,38：425−450（1976)。３．Ｈayward,Ｍ.Ａ.，Ｂroc
k,Ｍ.Ｌ. and Ｓhapiro,Ｄ.Ｊ.，Ｎucleic Ａcid s Ｒe
s.，10：8273−8284（1982）。 ４．Ｈorwitz，Ｋ.Ｂ.，and ＭcＧuire，Ｗ.Ｌ.，Ｊ.Ｂ
iol.Ｃhem，253：2223−2228（1978）。 ５．Ｊensen，Ｅ.Ｖ.，and ＤeＳombre,Ｅ.Ｒ.，Ａ.Ｒe
v.Ｂiochen.,41：203−230（1972）。 ６．Ｊensen，Ｅ.Ｖ.,et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i．Ｕ.Ｓ.Ａ.,59：632−638（1968）。 ７．Ｋhoury，Ｇ.，and Ｇruss，Ｐ.，Ｃell.，33：313
−314（1983）。 ８．ＭcＫnight，Ｇ.Ｓ.，and Ｐalmitre，Ｒ.Ｄ.,Ｊ.
Ｂiol.Ｃhem.，254：9050−9058（1968）。 ９．Ｏ'Ｍalley,Ｂ.Ｗ.，ＭcＧuire,Ｗ.Ｌ.，Ｋohler，
Ｐ.Ｏ.，and Ｋornman,Ｓ.Ｇ.，Ｒecent Ｐrog．Ｈor
m．Ｒes.，25：105−160（1969）。 10．Ｐamiter，Ｒ.Ｄ.，Ｍoore，Ｐ.Ｂ.，Ｍulvihill，
Ｅ.Ｒ.，and Ｅmtage，Ｓ.，Ｃell，8：557−572（197
6）。 11．Ｐeterkofsky，Ｂ.，and Ｔomkins，Ｇ.，Ｐroc．
Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ．，60：222−228（196
8）。 12．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，and Ａlberts，Ｂ.Ｍ.，Ａ．
Ｒev．Ｂiochem.，45：721−746（1976）。 13．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，and Ａlberts，Ｂ.Ｍ.，Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci. Ｕ．Ｓ．Ａ．，69：2105−2109
（1972）。
enetics and Ｂiology of Ｄrosophila，Ｅds.Ａshburne
r,Ｍ.，and Ｗright,Ｔ.Ｒ.Ｆ.,Ｖol.２，pp．315−39
5，Ａcademic，Ｌondon（1978）。 ２．Ｇorski,Ｊ.，and Ｇannon，Ｆ.,Ａ.Ｒev.Ｐhysio
l.,38：425−450（1976)。３．Ｈayward,Ｍ.Ａ.，Ｂroc
k,Ｍ.Ｌ. and Ｓhapiro,Ｄ.Ｊ.，Ｎucleic Ａcid s Ｒe
s.，10：8273−8284（1982）。 ４．Ｈorwitz，Ｋ.Ｂ.，and ＭcＧuire，Ｗ.Ｌ.，Ｊ.Ｂ
iol.Ｃhem，253：2223−2228（1978）。 ５．Ｊensen，Ｅ.Ｖ.，and ＤeＳombre,Ｅ.Ｒ.，Ａ.Ｒe
v.Ｂiochen.,41：203−230（1972）。 ６．Ｊensen，Ｅ.Ｖ.,et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i．Ｕ.Ｓ.Ａ.,59：632−638（1968）。 ７．Ｋhoury，Ｇ.，and Ｇruss，Ｐ.，Ｃell.，33：313
−314（1983）。 ８．ＭcＫnight，Ｇ.Ｓ.，and Ｐalmitre，Ｒ.Ｄ.,Ｊ.
Ｂiol.Ｃhem.，254：9050−9058（1968）。 ９．Ｏ'Ｍalley,Ｂ.Ｗ.，ＭcＧuire,Ｗ.Ｌ.，Ｋohler，
Ｐ.Ｏ.，and Ｋornman,Ｓ.Ｇ.，Ｒecent Ｐrog．Ｈor
m．Ｒes.，25：105−160（1969）。 10．Ｐamiter，Ｒ.Ｄ.，Ｍoore，Ｐ.Ｂ.，Ｍulvihill，
Ｅ.Ｒ.，and Ｅmtage，Ｓ.，Ｃell，8：557−572（197
6）。 11．Ｐeterkofsky，Ｂ.，and Ｔomkins，Ｇ.，Ｐroc．
Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ．，60：222−228（196
8）。 12．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，and Ａlberts，Ｂ.Ｍ.，Ａ．
Ｒev．Ｂiochem.，45：721−746（1976）。 13．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，and Ａlberts，Ｂ.Ｍ.，Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci. Ｕ．Ｓ．Ａ．，69：2105−2109
（1972）。
【０００９】他の刊行物 本発明に示される情報のうち若干は公表されている。実
験の部Ｉに示される研究は下記に公表されている。Ｈol
lenberg，Ｓ.Ｍ.,Ｗeinberger,Ｃ.,Ｏng,Ｅ.Ｓ.,Ｃerel
li，Ｇ.,Ｏro,Ａ.,Ｌebo，Ｒ.，Ｔhompson，Ｅ.Ｂ.，Ｒ
osenfeid，Ｍ.Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，“機能性ヒト
グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡの一次構造と発現”
Ｎature，（Ｌondon），３１８：６３５−６４１（Ｄec
ember，１９８５）。
験の部Ｉに示される研究は下記に公表されている。Ｈol
lenberg，Ｓ.Ｍ.,Ｗeinberger,Ｃ.,Ｏng,Ｅ.Ｓ.,Ｃerel
li，Ｇ.,Ｏro,Ａ.,Ｌebo，Ｒ.，Ｔhompson，Ｅ.Ｂ.，Ｒ
osenfeid，Ｍ.Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，“機能性ヒト
グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡの一次構造と発現”
Ｎature，（Ｌondon），３１８：６３５−６４１（Ｄec
ember，１９８５）。
【００１０】実験の部IIに示される研究は下記に公表さ
れている。Ｇiguere，Ｖ.，Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｒos
enfield，Ｍ.Ｇ．and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,“ヒトグルココ
ルチコイド受容体の機能区”Ｃell，４６：６４５−６
５２（Ａuguet，１９８６）。
れている。Ｇiguere，Ｖ.，Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｒos
enfield，Ｍ.Ｇ．and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,“ヒトグルココ
ルチコイド受容体の機能区”Ｃell，４６：６４５−６
５２（Ａuguet，１９８６）。
【００１１】実験の部IIIに示される研究は下記に公表
されている。Ｗeinberger，Ｃ.,Ｔhompson，Ｃ.Ｃ.,Ｏn
g，Ｅ.Ｓ.,Ｌebo,Ｒ.,Ｇruol,Ｄ.Ｊ.，and Ｅvans,“ｃ
−erb−Ａ遺伝子は甲状腺ホルモンをコードする“Ｎatu
re，(Ｌondon）,３２４：６４１−６４６（Ｄecember，
１９８６）。
されている。Ｗeinberger，Ｃ.,Ｔhompson，Ｃ.Ｃ.,Ｏn
g，Ｅ.Ｓ.,Ｌebo,Ｒ.,Ｇruol,Ｄ.Ｊ.，and Ｅvans,“ｃ
−erb−Ａ遺伝子は甲状腺ホルモンをコードする“Ｎatu
re，(Ｌondon）,３２４：６４１−６４６（Ｄecember，
１９８６）。
【００１２】実験の部IVに示される研究は下記に公表さ
れている。Ａrriza,Ｊ.Ｌ.，Ｗeinberger,Ｃ.,Ｃerell
i,Ｇ.,Ｇlaser,Ｔ.Ｍ.，Ｈandelin，Ｂ.Ｌ.，Ｈousema
n，Ｄ.Ｅ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,“ヒトミネラルコルチ
コイド受容体相補的ＤＮＡのクローニング：グルココル
チコイド受容体との構造的および構造的関連”Ｓcienc
e，２３７：２６８−２７５（Ｊuly，１９８７）。
れている。Ａrriza,Ｊ.Ｌ.，Ｗeinberger,Ｃ.,Ｃerell
i,Ｇ.,Ｇlaser,Ｔ.Ｍ.，Ｈandelin，Ｂ.Ｌ.，Ｈousema
n，Ｄ.Ｅ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,“ヒトミネラルコルチ
コイド受容体相補的ＤＮＡのクローニング：グルココル
チコイド受容体との構造的および構造的関連”Ｓcienc
e，２３７：２６８−２７５（Ｊuly，１９８７）。
【００１３】実験の部Vに示される研究は以下のとおり
印刷中である。Ｇiguere，Ｖ.，Ｙang，Ｎ.，Ｓegui，
Ｐ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，“新しい一群のステロイド
ホルモン受容体の同定”。
印刷中である。Ｇiguere，Ｖ.，Ｙang，Ｎ.，Ｓegui，
Ｐ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，“新しい一群のステロイド
ホルモン受容体の同定”。
【００１４】実験の部VIに示される研究は以下のとおり
印刷中である。Ｇlass，Ｃ.Ｋ.，Ｆranco，Ｒ.，Ｗeinb
erger，Ｃ.,Ａlbert，Ｖ.Ｒ.,Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，and Ｒ
osenfeld，Ｍ.Ｇ.,“ラット成長ホルモン遺伝子の c−e
rb−Ａ部位は甲状腺ホルモンによるトランザクションを
媒介する。”
印刷中である。Ｇlass，Ｃ.Ｋ.，Ｆranco，Ｒ.，Ｗeinb
erger，Ｃ.,Ａlbert，Ｖ.Ｒ.,Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，and Ｒ
osenfeld，Ｍ.Ｇ.,“ラット成長ホルモン遺伝子の c−e
rb−Ａ部位は甲状腺ホルモンによるトランザクションを
媒介する。”
【００１５】実験の部VIIに示される研究は下記に公表
されている。
されている。
【００１６】Ｔhompson，Ｃatherine Ｃ.，Ｗeinberge
r，Ｃary，Ｌebo，Ｒoger，and Ｅvans，Ｒonaid Ｍ.，
“哺乳動物中枢神経系に発現される新規な甲状腺ホルモ
ン受容体の同定"、Ｓcience，２３７：１６１０−１６
１４（Ｓeptember，１９８７）。
r，Ｃary，Ｌebo，Ｒoger，and Ｅvans，Ｒonaid Ｍ.，
“哺乳動物中枢神経系に発現される新規な甲状腺ホルモ
ン受容体の同定"、Ｓcience，２３７：１６１０−１６
１４（Ｓeptember，１９８７）。
【００１７】定 義 本明細書および請求の範囲においては、ここで以下のと
おり明確に定義された技術的な句および用語が用いられ
るであろう。
おり明確に定義された技術的な句および用語が用いられ
るであろう。
【００１８】ここで用いるＧＲはグルココルチコイド受
容体を意味する。開示されたＤＮＡｈＧＲがグルココル
チコイド受容体ＧＲをコードする。
容体を意味する。開示されたＤＮＡｈＧＲがグルココル
チコイド受容体ＧＲをコードする。
【００１９】ここで用いるＭＲはミネラルコルチコイド
受容体を意味する。開示されたＤＮＡｈＭＲがミネラル
コルチコイド受容体ＭＲをコードする。
受容体を意味する。開示されたＤＮＡｈＭＲがミネラル
コルチコイド受容体ＭＲをコードする。
【００２０】ここで用いるＴＲは甲状腺ホルモン受容体
を意味する。開示されたヒトＤＮＡc−erb−Ａ，ｈＥＲ
ＢＡ 8.7および hＦＡ８、ならびにラットrbeＡ１２が
すべて甲状腺ホルモン受容体をコードする。
を意味する。開示されたヒトＤＮＡc−erb−Ａ，ｈＥＲ
ＢＡ 8.7および hＦＡ８、ならびにラットrbeＡ１２が
すべて甲状腺ホルモン受容体をコードする。
【００２１】ここで用いるｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２
はエストロゲン関連受容体蛋白質をコードするＤＮＡを
表わす。
はエストロゲン関連受容体蛋白質をコードするＤＮＡを
表わす。
【００２２】ここで用いるグルココルチコイドホルモン
にはコルチゾル、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、およびコ
ルチコステロン（ＣＳ）が含まれ、その同族体にはデキ
サメタゾン(Ｄex）、デオキシコルチコステロン（Ｄoc）
およびトリアムシノロンアセトニドが含まれる。
にはコルチゾル、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、およびコ
ルチコステロン（ＣＳ）が含まれ、その同族体にはデキ
サメタゾン(Ｄex）、デオキシコルチコステロン（Ｄoc）
およびトリアムシノロンアセトニドが含まれる。
【００２３】ここで用いるミネラルコルチコイドにはア
ルドステロン(Ａldo）ならびにコルチコステロン（Ｃ
Ｓ）、およびデオキシコルチコステロン（Ｄoc）が含ま
れる。
ルドステロン(Ａldo）ならびにコルチコステロン（Ｃ
Ｓ）、およびデオキシコルチコステロン（Ｄoc）が含ま
れる。
【００２４】ここで用いる甲状腺ホルモンにはチロキシ
ン（Ｔ４）およびトリヨードチロニン（Ｔ３）が含まれ
る。
ン（Ｔ４）およびトリヨードチロニン（Ｔ３）が含まれ
る。
【００２５】ここで用いるエストロゲンにはエストラジ
オール−１７ベータが含まれ、その同族体にはジエチル
スチルベストロールが含まれる。
オール−１７ベータが含まれ、その同族体にはジエチル
スチルベストロールが含まれる。
【００２６】ここで用いるゲスターゲンにはプロゲステ
ロン(Ｐrog）が含まれ、その同族体にはプロメゲストン
が含まれる。
ロン(Ｐrog）が含まれ、その同族体にはプロメゲストン
が含まれる。
【００２７】ここで用いるアンドロゲンにはジヒドロキ
シテストステロンが含まれ、その同族体にはメチルトリ
エノロンが含まれる。
シテストステロンが含まれ、その同族体にはメチルトリ
エノロンが含まれる。
【００２８】ここで用いるＭＴＶは乳腺腫瘍ウイルスを
意味し；ＭＭＴＶはマウス乳腺腫瘍ウイルスを意味す
る。
意味し；ＭＭＴＶはマウス乳腺腫瘍ウイルスを意味す
る。
【００２９】ここで用いるＲＳＶはラウス肉腫ウイルス
を意味し；ＳＶはサルウイルスを意味する。
を意味し；ＳＶはサルウイルスを意味する。
【００３０】ここで用いるＣＡＴはクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼを意味する。
ルアセチルトランスフェラーゼを意味する。
【００３１】ここで用いるＣＯＳはＴ抗原（Ｔag）を発
現するサル腎細胞を意味する。グルッツマン，セル，２
３：１７５（１９８１）を参照されたい。ＣＯＳ細胞は
本発明のバイオアッセイ系に有用である。
現するサル腎細胞を意味する。グルッツマン，セル，２
３：１７５（１９８１）を参照されたい。ＣＯＳ細胞は
本発明のバイオアッセイ系に有用である。
【００３２】ここで用いるＣＶ−１は“ＣＶ−１”と呼
ばれる細胞系に由来するマウス腎細胞を意味する。ＣＶ
−１はＣＯＳの親細胞系である。ＳＶ４０ Ｔ抗原(Ｔa
g）を発現すべく形質転換されたＣＯＳ細胞と異なり、
ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現しない。ＣＶ−１細胞はＣ
ＯＳ細胞と同様に本発明のバイオアッセイ系および方法
に有用である。
ばれる細胞系に由来するマウス腎細胞を意味する。ＣＶ
−１はＣＯＳの親細胞系である。ＳＶ４０ Ｔ抗原(Ｔa
g）を発現すべく形質転換されたＣＯＳ細胞と異なり、
ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現しない。ＣＶ−１細胞はＣ
ＯＳ細胞と同様に本発明のバイオアッセイ系および方法
に有用である。
【００３３】ここで、ある蛋白質が“ホルモン受容体に
特有のホルモン結合性”をもつと述べた場合、これはあ
る種に由来するホルモンまたはその合成同族体とその種
に由来する同系の受容体との結合親和性に関する標準ア
ッセイ法のいずれにおいても、ホルモンまたはその合成
同族体に対する当該蛋白質の親和性が当該ホルモンまた
はその同族体とその種に由来する同系の受容体との親和
性の少なくとも約１０％であることを意味する。
特有のホルモン結合性”をもつと述べた場合、これはあ
る種に由来するホルモンまたはその合成同族体とその種
に由来する同系の受容体との結合親和性に関する標準ア
ッセイ法のいずれにおいても、ホルモンまたはその合成
同族体に対する当該蛋白質の親和性が当該ホルモンまた
はその同族体とその種に由来する同系の受容体との親和
性の少なくとも約１０％であることを意味する。
【００３４】ここで、ある蛋白質（Ｘ）の転写活性化特
性が、あるホルモン受容体（Ｒ）の特性に“特有”であ
ると述べた場合、これは下記を意味する。すなわち、た
とえば本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオ
アッセイ系（発明の記述の項を参照されたい；またこの
アッセイ法をｈＧＲの機能性発現の証明に用いることに
関する実験の部II、特に第９図、ならびに“結果”およ
び“実験法”と表示した小区分も参照されたい）などの
アッセイ法において試験する場合、遺伝子（Ｇ）（その
転写はホルモンまたはホルモン同族体と複合体形成した
受容体の結合によって活性化される）からの発現率が、
受容体（Ｒ）の代わりに蛋白質(Ｘ)を用いた場合、受容
体（Ｒ）自体が用いられた場合に示されるものの少なく
とも約１０％である。ただし、“受容体（Ｒ）”および
“蛋白質（Ｘ）”いずれの場合も、関与する細胞は同一
濃度のホルモンまたはその同族体中に装入される。
性が、あるホルモン受容体（Ｒ）の特性に“特有”であ
ると述べた場合、これは下記を意味する。すなわち、た
とえば本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオ
アッセイ系（発明の記述の項を参照されたい；またこの
アッセイ法をｈＧＲの機能性発現の証明に用いることに
関する実験の部II、特に第９図、ならびに“結果”およ
び“実験法”と表示した小区分も参照されたい）などの
アッセイ法において試験する場合、遺伝子（Ｇ）（その
転写はホルモンまたはホルモン同族体と複合体形成した
受容体の結合によって活性化される）からの発現率が、
受容体（Ｒ）の代わりに蛋白質(Ｘ)を用いた場合、受容
体（Ｒ）自体が用いられた場合に示されるものの少なく
とも約１０％である。ただし、“受容体（Ｒ）”および
“蛋白質（Ｘ）”いずれの場合も、関与する細胞は同一
濃度のホルモンまたはその同族体中に装入される。
【００３５】ここで、ある蛋白質が“あるホルモン受容
体に特有のホルモン結合特性または転写活性化特性”を
もつと述べた場合、これはそのホルモン受容体自体がこ
の定義に包含されることを意味する。
体に特有のホルモン結合特性または転写活性化特性”を
もつと述べた場合、これはそのホルモン受容体自体がこ
の定義に包含されることを意味する。
【００３６】ここで、ある遺伝子（Ｇ）の転写が“ホル
モン（Ｈ）またはホルモン同族体（aＨ)によって実質的
に活性化される”と述べた場合、これは遺伝子（Ｇ）が
位置する付近のクロマチンへのホルモン／受容体［(Ｈ)
または（aＨ)／(Ｒ)または(ｒ)］複合体の結合によって
遺伝子（Ｇ）の転写が誘導されることを意味する。この
定義において（Ｒ）は“野生型”または未変化のホルモ
ン受容体を表わすものとする。後者の（ｒ）という表示
は、機能性の“工学的に処理された”もしくは“修飾さ
れた”受容体蛋白質、または“野生型”受容体遺伝子の
ｍＲＮＡ変異型によりコードされた蛋白質を意味するも
のとする。
モン（Ｈ）またはホルモン同族体（aＨ)によって実質的
に活性化される”と述べた場合、これは遺伝子（Ｇ）が
位置する付近のクロマチンへのホルモン／受容体［(Ｈ)
または（aＨ)／(Ｒ)または(ｒ)］複合体の結合によって
遺伝子（Ｇ）の転写が誘導されることを意味する。この
定義において（Ｒ）は“野生型”または未変化のホルモ
ン受容体を表わすものとする。後者の（ｒ）という表示
は、機能性の“工学的に処理された”もしくは“修飾さ
れた”受容体蛋白質、または“野生型”受容体遺伝子の
ｍＲＮＡ変異型によりコードされた蛋白質を意味するも
のとする。
【００３７】ここで用いるＧＲＥはグルココルチコイド
応答要素を意味し、ＴＲＥは甲状腺ホルモン受容体エン
ハンサー様ＤＮＡ配列を意味する。ＧＲＥはＧＲと相互
作用によりグルココルチコイド応答性を与えるエンハン
サー様ＤＮＡ配列である。ペイバーら、セル，３５；３
８１（１９８３）およびシーデライトら、ネイチャー，
３０４：７４９（１９８３）を参照されたい。ＴＲＥは
それらがＴＲとの相互作用により甲状腺ホルモン応答性
を与える点以外はＧＲＥと同様である。
応答要素を意味し、ＴＲＥは甲状腺ホルモン受容体エン
ハンサー様ＤＮＡ配列を意味する。ＧＲＥはＧＲと相互
作用によりグルココルチコイド応答性を与えるエンハン
サー様ＤＮＡ配列である。ペイバーら、セル，３５；３
８１（１９８３）およびシーデライトら、ネイチャー，
３０４：７４９（１９８３）を参照されたい。ＴＲＥは
それらがＴＲとの相互作用により甲状腺ホルモン応答性
を与える点以外はＧＲＥと同様である。
【００３８】ここで用いる“転写制御ユニット”、“転
写制御要素”、“ホルモン応答性プロモーター／エンハ
ンサー要素”および“転写刺激作用を媒介するＤＮＡ配
列”という語は同じことを意味し、入れ換えて用いるこ
とができる。
写制御要素”、“ホルモン応答性プロモーター／エンハ
ンサー要素”および“転写刺激作用を媒介するＤＮＡ配
列”という語は同じことを意味し、入れ換えて用いるこ
とができる。
【００３９】ここで“作用性レポーター遺伝子に機能性
結合した作用性ホルモン応答性プロモーター／エンハン
サー要素”という句において“作用性（operative)”と
いう語はそれらのＤＮＡ配列（“ホルモン応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素”および“レポーター遺伝
子”という語で表わされる）が作用性であること、すな
わちそれらの意図する目的に対して作用することを意味
し;“機能性（functionally）”という語はそれら２セ
グメントが結合したのちホルモン／受容体−複合体によ
って適宜活性化された際に、“ホルモン応答性プロモー
ター”が“作動開始した（turned on）"、すなわち活性
化された結果、レポーター遺伝子が発現することを意味
する。
結合した作用性ホルモン応答性プロモーター／エンハン
サー要素”という句において“作用性（operative)”と
いう語はそれらのＤＮＡ配列（“ホルモン応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素”および“レポーター遺伝
子”という語で表わされる）が作用性であること、すな
わちそれらの意図する目的に対して作用することを意味
し;“機能性（functionally）”という語はそれら２セ
グメントが結合したのちホルモン／受容体−複合体によ
って適宜活性化された際に、“ホルモン応答性プロモー
ター”が“作動開始した（turned on）"、すなわち活性
化された結果、レポーター遺伝子が発現することを意味
する。
【００４０】ここで用いる“受容体陰性”という語は細
胞中に受容体が検出されないか、または検出されたとし
てもごく少量（すなわちかろうじて検出できる量）の受
容体が存在するにすぎないことを意味する。
胞中に受容体が検出されないか、または検出されたとし
てもごく少量（すなわちかろうじて検出できる量）の受
容体が存在するにすぎないことを意味する。
【００４１】ここで用いる本発明のＤＮＡの“変異体”
とは“野生型”のまたは装飾されていない配列と異なる
べく遺伝子工学的に処理された本発明のＤＮＡを意味す
る。この種の遺伝子工学的処理には野性型配列中への新
たなヌクレオチドの挿入、野生型配列からのヌクレオチ
ドの失欠、または野生型配列におけるヌクレオチドの置
換が含まれる。
とは“野生型”のまたは装飾されていない配列と異なる
べく遺伝子工学的に処理された本発明のＤＮＡを意味す
る。この種の遺伝子工学的処理には野性型配列中への新
たなヌクレオチドの挿入、野生型配列からのヌクレオチ
ドの失欠、または野生型配列におけるヌクレオチドの置
換が含まれる。
【００４２】本明細書および請求の範囲において用いら
れる“実質的な配列相同”という語は、ここに開示さ
れ、特許請求された実際の配列からの配列の変動がごく
わずかであるＤＮＡまたはＲＮＡ配列は請求の範囲に示
された範囲内に含まれることを意味する。
れる“実質的な配列相同”という語は、ここに開示さ
れ、特許請求された実際の配列からの配列の変動がごく
わずかであるＤＮＡまたはＲＮＡ配列は請求の範囲に示
された範囲内に含まれることを意味する。
【００４３】ここに示される各種アミノ酸配列を構成す
るアミノ酸は下記の３文字または１文字の略語によって
表示できる。アミノ酸 ３文字略語 １文字略語 Ｌ−アラニン Ａｌａ Ａ Ｌ−アルギニン Ａｒｇ Ｒ Ｌ−アスパラギン Ａｓｎ Ｎ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ Ｌ−システィン Ｃｙｓ Ｃ Ｌ−グルタミン Ｇｌｎ Ｑ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ Ｌ−ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ Ｌ−イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ Ｌ−ロイシン Ｌｅｕ Ｌ Ｌ−リジン Ｌｙｓ Ｋ Ｌ−メチオニン Ｍｅｔ Ｍ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ Ｌ−プロリン Ｐｒｏ Ｐ Ｌ−セリン Ｓｅｒ Ｓ Ｌ−スレオニン Ｔｈｒ Ｔ Ｌ−トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ Ｌ−チロシン Ｔｈｒ Ｙ Ｌ−バリン Ｖａｌ Ｖ ここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレ
オチドは当技術分野でルーチンに用いられている通常の
１文字表示（Ａ，Ｇ，Ｔ，ＣまたはＵ）による。
るアミノ酸は下記の３文字または１文字の略語によって
表示できる。アミノ酸 ３文字略語 １文字略語 Ｌ−アラニン Ａｌａ Ａ Ｌ−アルギニン Ａｒｇ Ｒ Ｌ−アスパラギン Ａｓｎ Ｎ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ Ｌ−システィン Ｃｙｓ Ｃ Ｌ−グルタミン Ｇｌｎ Ｑ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ Ｌ−ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ Ｌ−イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ Ｌ−ロイシン Ｌｅｕ Ｌ Ｌ−リジン Ｌｙｓ Ｋ Ｌ−メチオニン Ｍｅｔ Ｍ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ Ｌ−プロリン Ｐｒｏ Ｐ Ｌ−セリン Ｓｅｒ Ｓ Ｌ−スレオニン Ｔｈｒ Ｔ Ｌ−トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ Ｌ−チロシン Ｔｈｒ Ｙ Ｌ−バリン Ｖａｌ Ｖ ここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレ
オチドは当技術分野でルーチンに用いられている通常の
１文字表示（Ａ，Ｇ，Ｔ，ＣまたはＵ）による。
【００４４】本明細書の本文および請求の範囲において
ギリシャ文字についての言及はアルファ、ベータなどと
記載される。図面においては時には対応するギリシャ文
字記号が用いられる。
ギリシャ文字についての言及はアルファ、ベータなどと
記載される。図面においては時には対応するギリシャ文
字記号が用いられる。
【００４５】発現プラスミド pＧＥＭ３はプロメガ・バ
イオテク、53711 ワイオミング州マジソン，サウス・フ
ィッシュ・ハッチェリー・ロード 2800 から市販されて
いる。
イオテク、53711 ワイオミング州マジソン，サウス・フ
ィッシュ・ハッチェリー・ロード 2800 から市販されて
いる。
【００４６】寄 託 プラスミドｐＲＳｈＧＲ−アルファ、ｐＲＳｈＭＲ、pe
Ａ１０１、rbeＡ１２およびＧＭＣＡＴ（これらはすべ
て大腸菌（Ｅ．coli）ＨＢ１０１中）、プラスミド pＥ
４および pＨＫＡ（これらは両者とも大腸菌ＤＨ５
中）、ならびにプラスミドphＨ３，pｈＥＲＢＡ 8.7 お
よび phＦＡ８はアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、米国マリーランド州ロックビル（ＡＴＣ
Ｃ）に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブタペスト条約、およびこの条約に基づく規則の条件下
に寄託されている。上記プラスミドの試料は上記の条約
および規則の条件下で、または米国そのほか本出願もし
くは本出願の優先権を主張する出願がなされるか、もし
くはその出願に対する特許権が付与される他のすべての
国の特許法および規則に従ってそれらを受けるべく合法
的権利を有する企業事務所および他の個人が現在および
将来入手できる。
Ａ１０１、rbeＡ１２およびＧＭＣＡＴ（これらはすべ
て大腸菌（Ｅ．coli）ＨＢ１０１中）、プラスミド pＥ
４および pＨＫＡ（これらは両者とも大腸菌ＤＨ５
中）、ならびにプラスミドphＨ３，pｈＥＲＢＡ 8.7 お
よび phＦＡ８はアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、米国マリーランド州ロックビル（ＡＴＣ
Ｃ）に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブタペスト条約、およびこの条約に基づく規則の条件下
に寄託されている。上記プラスミドの試料は上記の条約
および規則の条件下で、または米国そのほか本出願もし
くは本出願の優先権を主張する出願がなされるか、もし
くはその出願に対する特許権が付与される他のすべての
国の特許法および規則に従ってそれらを受けるべく合法
的権利を有する企業事務所および他の個人が現在および
将来入手できる。
【００４７】上記１０種の寄託物に対するＡＴＣＣ寄託
番号は下記のとおりである。 ｐＲＳ ｈＧＲ−アルファ ６７２００ ｐＲＳ ｈＭＲ ６７２０１ ｐｅＡ１０１ ６７２４４ ｒｂｅＡ１２ ６７２８１ ＧＭＣＡＴ ６７２８２ ｐＥ４ ６７３０９ ｐＨＫＡ ６７３１０ ｐｈＥＲＢＡ ８．７ ４０３７４ ｐｈＦＡ８ ４０３７２ ｐｈＨ３ ４０３７３
番号は下記のとおりである。 ｐＲＳ ｈＧＲ−アルファ ６７２００ ｐＲＳ ｈＭＲ ６７２０１ ｐｅＡ１０１ ６７２４４ ｒｂｅＡ１２ ６７２８１ ＧＭＣＡＴ ６７２８２ ｐＥ４ ６７３０９ ｐＨＫＡ ６７３１０ ｐｈＥＲＢＡ ８．７ ４０３７４ ｐｈＦＡ８ ４０３７２ ｐｈＨ３ ４０３７３
【００４８】
【課題を解決するための手段】発明の要約 一観点においては本発明は、セグメントのプラスまたは
センスストランドが、グルココルチコイド受容体、ミネ
ラロコルチコイド受容体および甲状腺ホルモン受容体よ
りなる群から選ばれるホルモン受容体蛋白質に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質の一次配列をコードするトリプレットの配列を含
む二重鎖ＤＮＡセグメントからなる。本発明のこの観点
によれば、この二重鎖ＤＮＡセグメントは受容体蛋白質
中に発現されうるものである。
センスストランドが、グルココルチコイド受容体、ミネ
ラロコルチコイド受容体および甲状腺ホルモン受容体よ
りなる群から選ばれるホルモン受容体蛋白質に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質の一次配列をコードするトリプレットの配列を含
む二重鎖ＤＮＡセグメントからなる。本発明のこの観点
によれば、この二重鎖ＤＮＡセグメントは受容体蛋白質
中に発現されうるものである。
【００４９】他の観点においては本発明は、本発明によ
る二重鎖ＤＮＡのセンスストランドである一重鎖ＤＮ
Ａ、および本発明の二重鎖ＤＮＡの転写により形成され
たＲＮＡからなる。
る二重鎖ＤＮＡのセンスストランドである一重鎖ＤＮ
Ａ、および本発明の二重鎖ＤＮＡの転写により形成され
たＲＮＡからなる。
【００５０】他の観点においては本発明は、本発明のＤ
ＮＡの実例であるＤＮＡを含むプラスミドからなる。こ
れらのプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに特許の目的で寄託されている。本発明の
プラスミドには下記の群から選ばれるプラスミドが含ま
れる。
ＮＡの実例であるＤＮＡを含むプラスミドからなる。こ
れらのプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに特許の目的で寄託されている。本発明の
プラスミドには下記の群から選ばれるプラスミドが含ま
れる。
【００５１】ｐＲＳｈＧＲ−アルファ（ＡＴＣＣ＃６７
２００)，pＲＳｈＭＲ（ＡＴＣＣ＃６７２０１），peＡ
１０１（ＡＴＣＣ＃６７２４４），rbeＡ１２（ＡＴＣ
Ｃ＃６７２８１），ＧＭＣＡＴ（ＡＴＣＣ＃６７２８
２），pＥ４（ＡＴＣＣ＃６７３０９），pＨＫＡ（ＡＴ
ＣＣ＃６７３１０），pｈＥＲＢＡ 8.7（ＡＴＣＣ＃４
０３７４），phＦＡ８（ＡＴＣＣ＃４０３７２），およ
び phＨ３（ＡＴＣＣ＃４０３７３）。
２００)，pＲＳｈＭＲ（ＡＴＣＣ＃６７２０１），peＡ
１０１（ＡＴＣＣ＃６７２４４），rbeＡ１２（ＡＴＣ
Ｃ＃６７２８１），ＧＭＣＡＴ（ＡＴＣＣ＃６７２８
２），pＥ４（ＡＴＣＣ＃６７３０９），pＨＫＡ（ＡＴ
ＣＣ＃６７３１０），pｈＥＲＢＡ 8.7（ＡＴＣＣ＃４
０３７４），phＦＡ８（ＡＴＣＣ＃４０３７２），およ
び phＨ３（ＡＴＣＣ＃４０３７３）。
【００５２】さらに他の観点においては本発明は、本発
明のＤＮＡにより形質転換された細胞、好ましくは哺乳
動物細胞からなる。本発明のこの観点によれば、形質転
換を行うＤＮＡはこの細胞において発現可能であり、こ
れによりこのＤＮＡがコードする受容体の量が細胞中に
おいて増加する。
明のＤＮＡにより形質転換された細胞、好ましくは哺乳
動物細胞からなる。本発明のこの観点によれば、形質転
換を行うＤＮＡはこの細胞において発現可能であり、こ
れによりこのＤＮＡがコードする受容体の量が細胞中に
おいて増加する。
【００５３】さらに本発明は、本発明のＤＮＡにより形
質転換された、酵母細胞および細菌細胞、たとえば大腸
菌および枯草菌（Ｂ．subtilis）を含む細胞からなる。
質転換された、酵母細胞および細菌細胞、たとえば大腸
菌および枯草菌（Ｂ．subtilis）を含む細胞からなる。
【００５４】さらに本発明は、本発明のＤＮＡの発現、
または本発明のｍＲＮＡの翻訳によって形成された新規
な受容体からなる。本発明のこの観点によれば、受容体
は“修飾されていない”本発明のＤＮＡおよびｍＲＮＡ
の蛋白質生成物であるか、または受容体ＤＮＡ配列にお
ける工学的変異の結果、対応する天然の“野生型”もし
くは同系の受容体（新規受容体ときわめて大幅なアミノ
酸配列相同を有する既知配列の天然受容体）と１もしく
は２以上のアミノ酸配列の相違を有する、修飾された、
もしくは遺伝子工学的に処理された蛋白質生成物であろ
う。好ましくはこれらの受容体は“修飾されていないも
の"または“工学的に処理されたもの"のいずれであって
も、対応する天然の同系受容体のホルモン結合活性の少
なくとも１０％、および／または転写活性化活性の少な
くとも１０％を有するであろう。
または本発明のｍＲＮＡの翻訳によって形成された新規
な受容体からなる。本発明のこの観点によれば、受容体
は“修飾されていない”本発明のＤＮＡおよびｍＲＮＡ
の蛋白質生成物であるか、または受容体ＤＮＡ配列にお
ける工学的変異の結果、対応する天然の“野生型”もし
くは同系の受容体（新規受容体ときわめて大幅なアミノ
酸配列相同を有する既知配列の天然受容体）と１もしく
は２以上のアミノ酸配列の相違を有する、修飾された、
もしくは遺伝子工学的に処理された蛋白質生成物であろ
う。好ましくはこれらの受容体は“修飾されていないも
の"または“工学的に処理されたもの"のいずれであって
も、対応する天然の同系受容体のホルモン結合活性の少
なくとも１０％、および／または転写活性化活性の少な
くとも１０％を有するであろう。
【００５５】本発明はまた本発明のＤＮＡ（またはｍＲ
ＮＡ）から得たホルモン受容体蛋白質の機能性を測定す
るための新規方法からなる。ここでは“シス−トラン
ス”バイオアッセイ法と呼ぶこの新規方法は２種のプラ
スミド、すなわち“発現”プラスミドおよび“レポータ
ー”プラスミドを用いる。本発明によれば発現プラスミ
ドは、本発明の受容体ＤＮＡまたはその工学的処理によ
る変異体を含有しており、それを適切な受容体陰性宿主
細胞中において発現しうるいかなるプラスミドであって
もよい。また本発明によればレポータープラスミドは作
動性レポーター遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン
応答性プロモーター／エンハンサー要素を含有するいか
なるプラスミドであってもよい。
ＮＡ）から得たホルモン受容体蛋白質の機能性を測定す
るための新規方法からなる。ここでは“シス−トラン
ス”バイオアッセイ法と呼ぶこの新規方法は２種のプラ
スミド、すなわち“発現”プラスミドおよび“レポータ
ー”プラスミドを用いる。本発明によれば発現プラスミ
ドは、本発明の受容体ＤＮＡまたはその工学的処理によ
る変異体を含有しており、それを適切な受容体陰性宿主
細胞中において発現しうるいかなるプラスミドであって
もよい。また本発明によればレポータープラスミドは作
動性レポーター遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン
応答性プロモーター／エンハンサー要素を含有するいか
なるプラスミドであってもよい。
【００５６】本発明の“シス−トランス”バイオアッセ
イを実施する際には、発現プラスミド（本発明の“受容
体”ＤＮＡを含有する）およびレポータープラスミドを
適切な受容体陰性宿主細胞中へ共トランスフェクション
する。トランスフェクションされた宿主細胞は、次いで
レポータープラスミドのホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素を活性化しうるホルモンまたはその同
族体の存在下および不在下に培養される。次いでトラン
スフェクションおよび培養された宿主細胞を、レポータ
ー遺伝子配列の生成物の誘導（すなわち存在）について
監視する。最後に本発明に従って受容体蛋白質（発現プ
ラスミド上の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、そし
てトランスフェクションおよび培養された宿主細胞中で
産生されたもの）の発現およびステロイド結合能を測定
する。（この“シス−トランス”バイオアッセイ系の模
式図については第９図を参照されたい。）“シス−トラ
ンス”バイオアッセイ系は本発明の受容体ＤＮＡが形質
転換された宿主細胞中において発現したか否かを判定す
るために特に有用である。これは本発明の受容体が対応
する天然の同系受容体の結合活性の少なくとも約１０％
を含有するか否か、および本発明の受容体が対応する天
然の同系受容体の転写活性化活性の少なくとも１０％を
有するか否かを判定するためにも有用である。
イを実施する際には、発現プラスミド（本発明の“受容
体”ＤＮＡを含有する）およびレポータープラスミドを
適切な受容体陰性宿主細胞中へ共トランスフェクション
する。トランスフェクションされた宿主細胞は、次いで
レポータープラスミドのホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素を活性化しうるホルモンまたはその同
族体の存在下および不在下に培養される。次いでトラン
スフェクションおよび培養された宿主細胞を、レポータ
ー遺伝子配列の生成物の誘導（すなわち存在）について
監視する。最後に本発明に従って受容体蛋白質（発現プ
ラスミド上の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、そし
てトランスフェクションおよび培養された宿主細胞中で
産生されたもの）の発現およびステロイド結合能を測定
する。（この“シス−トランス”バイオアッセイ系の模
式図については第９図を参照されたい。）“シス−トラ
ンス”バイオアッセイ系は本発明の受容体ＤＮＡが形質
転換された宿主細胞中において発現したか否かを判定す
るために特に有用である。これは本発明の受容体が対応
する天然の同系受容体の結合活性の少なくとも約１０％
を含有するか否か、および本発明の受容体が対応する天
然の同系受容体の転写活性化活性の少なくとも１０％を
有するか否かを判定するためにも有用である。
【００５７】最後に、その転写が受容体との複合体を形
成したホルモンによって活性化される遺伝子（Ｇ）の転
写を活性化するのに必要な、かつそれに十分な条件は、
（Ｇ)と同じ細胞中にホルモンおよびその受容体が存在
することであることが、本発明のＤＮＡを用いて見出さ
れた。この知見から遺伝子工学的に処理された細胞にお
いて目的蛋白質を生成するための改良された組成物およ
び方法を得ることが可能となった。
成したホルモンによって活性化される遺伝子（Ｇ）の転
写を活性化するのに必要な、かつそれに十分な条件は、
（Ｇ)と同じ細胞中にホルモンおよびその受容体が存在
することであることが、本発明のＤＮＡを用いて見出さ
れた。この知見から遺伝子工学的に処理された細胞にお
いて目的蛋白質を生成するための改良された組成物およ
び方法を得ることが可能となった。
【００５８】これらの方法のうち２種類が本発明方法で
ある。第１はその転写が受容体との複合体を形成したホ
ルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘導する方
法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理し、次いで
その転写が受容体蛋白質との複合体を形成したホルモン
によって活性化される遺伝子によりコードされる蛋白質
の生成を増加させ、かつ制御する方法である。
ある。第１はその転写が受容体との複合体を形成したホ
ルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘導する方
法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理し、次いで
その転写が受容体蛋白質との複合体を形成したホルモン
によって活性化される遺伝子によりコードされる蛋白質
の生成を増加させ、かつ制御する方法である。
【００５９】これら２方法につき論じる際に、その転写
が受容体蛋白質との複合体を形成したホルモンによって
活性化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子
（Ｇ）を活性化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をい
ずれも（aＨ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機
能性修飾体は（ｒ）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）
が位置する細胞を（Ｃ）、遺伝子（Ｇ）によりコードさ
れる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ。
が受容体蛋白質との複合体を形成したホルモンによって
活性化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子
（Ｇ）を活性化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をい
ずれも（aＨ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機
能性修飾体は（ｒ）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）
が位置する細胞を（Ｃ）、遺伝子（Ｇ）によりコードさ
れる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ。
【００６０】本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子
（Ｇ）を含有する細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発
現可能であり、かつ受容体（Ｒ）またはそれから修飾さ
れた機能性形態(ｒ)をコードする本発明のＤＮＡによっ
て形質転換し；そして細胞(Ｃ)におけるホルモン(Ｈ)ま
たはその同族体（aＨ）の濃度を少なくとも遺伝子
（Ｇ）の発現の誘導を保証するのに十分な程度にまで高
める。
（Ｇ）を含有する細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発
現可能であり、かつ受容体（Ｒ）またはそれから修飾さ
れた機能性形態(ｒ)をコードする本発明のＤＮＡによっ
て形質転換し；そして細胞(Ｃ)におけるホルモン(Ｈ)ま
たはその同族体（aＨ）の濃度を少なくとも遺伝子
（Ｇ）の発現の誘導を保証するのに十分な程度にまで高
める。
【００６１】細胞を工学的に処理したのち蛋白質（Ｐ）
を生成させる方法によれば、ホルモン（Ｈ）が受容体
（Ｒ）との複合体を形成した状態で結合することがで
き、これにより遺伝子（Ｇ）の転写を誘導する転写制御
要素の制御下に置かれる状態に、蛋白質（Ｐ）をコード
する遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置する。この蛋白
質製造法によれば、ホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）
の双方が細胞（Ｃ）中に存在する。受容体（Ｒ）の存在
は、受容体（Ｒ）またはその機能性の修飾された形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより細胞（Ｃ）を
形質転換することによって保証される。ホルモン（Ｈ）
またはその合成同族体（aＨ)の存在は、ホルモン（Ｈ）
またはその同族体（aＨ)を含有する浸漬液中に形質転換
した細胞（Ｃ）を浸漬することによって保証される。次
いで本方法に従って、形質転換した細胞（Ｃ）を浸漬す
るために用いられる浸漬液中の（Ｈ）または（aＨ)の濃
度を制御することによって、遺伝子（Ｇ）の転写が制御
される。こうして遺伝子（Ｇ）の転写を制御することに
よって、細胞（Ｃ）における蛋白質（Ｐ）の生成を制御
することができる。
を生成させる方法によれば、ホルモン（Ｈ）が受容体
（Ｒ）との複合体を形成した状態で結合することがで
き、これにより遺伝子（Ｇ）の転写を誘導する転写制御
要素の制御下に置かれる状態に、蛋白質（Ｐ）をコード
する遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置する。この蛋白
質製造法によれば、ホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）
の双方が細胞（Ｃ）中に存在する。受容体（Ｒ）の存在
は、受容体（Ｒ）またはその機能性の修飾された形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより細胞（Ｃ）を
形質転換することによって保証される。ホルモン（Ｈ）
またはその合成同族体（aＨ)の存在は、ホルモン（Ｈ）
またはその同族体（aＨ)を含有する浸漬液中に形質転換
した細胞（Ｃ）を浸漬することによって保証される。次
いで本方法に従って、形質転換した細胞（Ｃ）を浸漬す
るために用いられる浸漬液中の（Ｈ）または（aＨ)の濃
度を制御することによって、遺伝子（Ｇ）の転写が制御
される。こうして遺伝子（Ｇ）の転写を制御することに
よって、細胞（Ｃ）における蛋白質（Ｐ）の生成を制御
することができる。
【００６２】この教示に基づいて当業者が認識するよう
に、転写がホルモン／受容体−複合体によって活性化さ
れる遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質（Ｐ）の生
成が遺伝子（Ｇ）の位置する細胞（Ｃ）内にホルモン
（Ｈ）およびその受容体を確実に存在させ、次いで細胞
（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体の
濃度を制御するだけで制御される状態に、細胞を工学的
に処理することが可能となるであろう。
に、転写がホルモン／受容体−複合体によって活性化さ
れる遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質（Ｐ）の生
成が遺伝子（Ｇ）の位置する細胞（Ｃ）内にホルモン
（Ｈ）およびその受容体を確実に存在させ、次いで細胞
（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体の
濃度を制御するだけで制御される状態に、細胞を工学的
に処理することが可能となるであろう。
【００６３】
【発明の実施の形態】発明の説明 本発明は一部は、グルココルチコイド、ミネラルコルチ
コイドおよび甲状腺ホルモンの受容体に特有のホルモン
結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡセグメントに関する。本発明のこの
観点によれば、これらのＤＮＡセグメントは適切な宿主
細胞において発現され、これによりグルココルチコイ
ド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容
体、または受容体様蛋白質を生成しうるものである。本
発明は本発明のＤＮＡのセンスストランドの転写の結果
生成したｍＲＮＡにも関する。
コイドおよび甲状腺ホルモンの受容体に特有のホルモン
結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡセグメントに関する。本発明のこの
観点によれば、これらのＤＮＡセグメントは適切な宿主
細胞において発現され、これによりグルココルチコイ
ド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容
体、または受容体様蛋白質を生成しうるものである。本
発明は本発明のＤＮＡのセンスストランドの転写の結果
生成したｍＲＮＡにも関する。
【００６４】本発明のＤＮＡはここでは以下のとおり呼
ばれるＤＮＡによって例示される。ヒトグルココルチコ
イド受容体ＤＮＡ（ｈＧＲ)；ヒト甲状腺ホルモン受容
体ＤＮＡ（hＴＲ：hＴＲアルファおよびhＴＲベータ；h
ＴＲアルファはたとえばｈＥＲＢＡ 8.7 および hＦＡ
８である；hＴＲベータはたとえば細胞性のもの、すな
わち“c−erb−Ａ”である）；ラット甲状腺ホルモン受
容体（rbeＡ１２)、これはヒト甲状腺ホルモン受容体ア
ルファのラット同族体である；ヒトミネラルコルチコイ
ド受容体(hＭＲ)；ならびに新規なヒトステロイドホル
モン受容体（ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２）。センスス
トランドｃＤＮＡヌクレオチド配列、およびこれらによ
りコードされる推定一次蛋白質配列は以下の図に示され
る。第３および４図：ｈＧＲについて；第１５および１
６図：ヒトc−erb−Ａについて、ならびに第２２図：ｈ
ＥＲＢＡ8.7 および hＦＡ８について；第２５および２
６図：hＭＲ について；第３４および３５、ならびに３
７および３８図：それぞれｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２
について；ならびに第４６(Ｂ）図：ラット甲状腺ホル
モン受容体rbeＡ１２について。
ばれるＤＮＡによって例示される。ヒトグルココルチコ
イド受容体ＤＮＡ（ｈＧＲ)；ヒト甲状腺ホルモン受容
体ＤＮＡ（hＴＲ：hＴＲアルファおよびhＴＲベータ；h
ＴＲアルファはたとえばｈＥＲＢＡ 8.7 および hＦＡ
８である；hＴＲベータはたとえば細胞性のもの、すな
わち“c−erb−Ａ”である）；ラット甲状腺ホルモン受
容体（rbeＡ１２)、これはヒト甲状腺ホルモン受容体ア
ルファのラット同族体である；ヒトミネラルコルチコイ
ド受容体(hＭＲ)；ならびに新規なヒトステロイドホル
モン受容体（ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２）。センスス
トランドｃＤＮＡヌクレオチド配列、およびこれらによ
りコードされる推定一次蛋白質配列は以下の図に示され
る。第３および４図：ｈＧＲについて；第１５および１
６図：ヒトc−erb−Ａについて、ならびに第２２図：ｈ
ＥＲＢＡ8.7 および hＦＡ８について；第２５および２
６図：hＭＲ について；第３４および３５、ならびに３
７および３８図：それぞれｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２
について；ならびに第４６(Ｂ）図：ラット甲状腺ホル
モン受容体rbeＡ１２について。
【００６５】ＤＮＡ、たとえばｈＧＲ、ヒトc−erb−
Ａ、ｈＥＲＢＡ8.7、hＦＡ８、hＭＲ、ｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２は本発明の好ましいＤＮＡである。同様に
これらおよび他の本発明のＤＮＡを保有するプラスミド
も好ましい。好ましいプラスミドは以下のものが含まれ
る。pＲＳｈＧＲ−アルファ，pＲＳｈＭＲ，peＡ１０
１，rbeＡ１２，ＧＭＣＡＴ，pＥ４，pＨＫＡ，pｈＥＲ
ＢＡ 8.7，phＦＡ８，およびphＨ３。
Ａ、ｈＥＲＢＡ8.7、hＦＡ８、hＭＲ、ｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２は本発明の好ましいＤＮＡである。同様に
これらおよび他の本発明のＤＮＡを保有するプラスミド
も好ましい。好ましいプラスミドは以下のものが含まれ
る。pＲＳｈＧＲ−アルファ，pＲＳｈＭＲ，peＡ１０
１，rbeＡ１２，ＧＭＣＡＴ，pＥ４，pＨＫＡ，pｈＥＲ
ＢＡ 8.7，phＦＡ８，およびphＨ３。
【００６６】ｐＲＳｈＧＲ−アルファのほかに好ましい
ＤＮＡにはｐＲＳｈＧＲ−アルファの修飾体も好まれ、
これらはここでは下記のように表示される。Ｉ９，Ｉ３
７，Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６
２，Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０
３，Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４
８，Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，および
Ｉ６８４。ここで“Ｉ”は“挿入配列（Ｉnsert）”を
表わし、“Ｉ”に続く数字はＤＮＡ修飾の表示を表す。
修飾されたｐＲＳｈＧＲ系ＤＮＡのうちきわめて好まし
いものは、ヒトグルココルチコイド受容体に特有な転写
活性化特性の少なくとも１０％を有する蛋白質をコード
するものである。これらのＤＮＡには、Ｉ９，Ｉ３７，
Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６２，
Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０３，
Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４８，
Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，およびＩ６
８４が含まれる。
ＤＮＡにはｐＲＳｈＧＲ−アルファの修飾体も好まれ、
これらはここでは下記のように表示される。Ｉ９，Ｉ３
７，Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６
２，Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０
３，Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４
８，Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，および
Ｉ６８４。ここで“Ｉ”は“挿入配列（Ｉnsert）”を
表わし、“Ｉ”に続く数字はＤＮＡ修飾の表示を表す。
修飾されたｐＲＳｈＧＲ系ＤＮＡのうちきわめて好まし
いものは、ヒトグルココルチコイド受容体に特有な転写
活性化特性の少なくとも１０％を有する蛋白質をコード
するものである。これらのＤＮＡには、Ｉ９，Ｉ３７，
Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６２，
Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０３，
Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４８，
Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，およびＩ６
８４が含まれる。
【００６７】ｐＲＳｈＧＲ−アルファの構造は本明細書
の“実験の部 II”と表示される部分に詳述されてい
る。（特に項目II．Ｆ.（ｂ）、“組換えプラスミド”を
参照されたい）。実験の部IIには上記の章に述べたｐＲ
ＳｈＧＲ−アルファ修飾体の構造および特性についても
詳述されている。
の“実験の部 II”と表示される部分に詳述されてい
る。（特に項目II．Ｆ.（ｂ）、“組換えプラスミド”を
参照されたい）。実験の部IIには上記の章に述べたｐＲ
ＳｈＧＲ−アルファ修飾体の構造および特性についても
詳述されている。
【００６８】第３および４図に示したｈＧＲに対するｃ
ＤＮＡ配列に関しては、図示された配列の５’末端の２
個のＣはＲＳＶ−ＬＴＲを含むセグメントの３’末端に
図示したセグメントを結合させるＫpnＩ部位の部分であ
る。図示した配列の３’末端のＴは、図示したセグメン
トがＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントに結
合する地点の５’側へ数個の塩基の位置にある。
ＤＮＡ配列に関しては、図示された配列の５’末端の２
個のＣはＲＳＶ−ＬＴＲを含むセグメントの３’末端に
図示したセグメントを結合させるＫpnＩ部位の部分であ
る。図示した配列の３’末端のＴは、図示したセグメン
トがＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントに結
合する地点の５’側へ数個の塩基の位置にある。
【００６９】ｐＲＳｈＧＲ は本質的にｐＲＳｈＧＲ−
アルファと同じ様式で構成され、本質的にｐＲＳｈＧＲ
−アルファと等しい。言い換えると、挿入部位における
わずかな修飾を除いて、第２４図に示したhＭＲセグメ
ントが、第３および４図に配列を示したｈＧＲに置換し
ている。ｐＲＳｈＧＲと同様にｐＲＳｈＭＲはラウス肉
腫ウイルス由来のプロモーターおよびＳＶ４０複製開始
点の制御下に受容体蛋白質ＤＮＡコード配列を含有す
る。実験の部IVの参考文献部分の脚注４１を参照された
い。第２８（Ａ）図も参照し、第９図と比較されたい。
アルファと同じ様式で構成され、本質的にｐＲＳｈＧＲ
−アルファと等しい。言い換えると、挿入部位における
わずかな修飾を除いて、第２４図に示したhＭＲセグメ
ントが、第３および４図に配列を示したｈＧＲに置換し
ている。ｐＲＳｈＧＲと同様にｐＲＳｈＭＲはラウス肉
腫ウイルス由来のプロモーターおよびＳＶ４０複製開始
点の制御下に受容体蛋白質ＤＮＡコード配列を含有す
る。実験の部IVの参考文献部分の脚注４１を参照された
い。第２８（Ａ）図も参照し、第９図と比較されたい。
【００７０】第２５および２６図に示したｈＭＲ配列に
関しては、このセグメントの５’末端にあるＡＧはＨin
dIII部位から数塩基対下流にあり、これによってｈＭＲ
セグメントはＲＳＶ−ＬＴＲ含有セグメントに結合して
いる。第２６図に示したセグメントの３’末端のＡＡは
ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントの５’末
端から塩基数個上流にある。
関しては、このセグメントの５’末端にあるＡＧはＨin
dIII部位から数塩基対下流にあり、これによってｈＭＲ
セグメントはＲＳＶ−ＬＴＲ含有セグメントに結合して
いる。第２６図に示したセグメントの３’末端のＡＡは
ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントの５’末
端から塩基数個上流にある。
【００７１】プラスミドpeＡ１０１はヒト甲状腺ホルモ
ン受容体c−erb−Ａのコード領域全体を保有する。（c
−erb−Ａに対する遺伝子はヒト染色体３に局在する；
この受容体遺伝子によりコードされる蛋白質生成物をこ
こでは hＴＲベータと呼ぶ。実験の部IIIを参照し、実
験の部VIIと比較されたい）。
ン受容体c−erb−Ａのコード領域全体を保有する。（c
−erb−Ａに対する遺伝子はヒト染色体３に局在する；
この受容体遺伝子によりコードされる蛋白質生成物をこ
こでは hＴＲベータと呼ぶ。実験の部IIIを参照し、実
験の部VIIと比較されたい）。
【００７２】プラスミドpeＡ１０１はpheＡ１２（第１
４図参照）からのＥcoＲＩ断片を発現ベクターpＧＥＭ
３（プロメガ・バイオテク）のＥcoＲＩ部位に適正な向
きに挿入することにより構成された。この構造について
の詳細は実験の部III、項目III．１の第III−４法と表
示する項目を参照されたい。
４図参照）からのＥcoＲＩ断片を発現ベクターpＧＥＭ
３（プロメガ・バイオテク）のＥcoＲＩ部位に適正な向
きに挿入することにより構成された。この構造について
の詳細は実験の部III、項目III．１の第III−４法と表
示する項目を参照されたい。
【００７３】ヒト染色体３に局在している hＴＲ受容体
のほかに、本発明者らはプラスミドpeＡ１０１により推
定される蛋白質配列と異なる第２の甲状腺ホルモン受容
体を見出した。本発明者らはこの新規な予想されなかっ
た甲状腺ホルモン受容体をラットおよびヒトの双方から
単離し、特性を調べた。ラットの場合、この新規な甲状
腺ホルモン受容体はプラスミドrbeＡ１２のＤＮＡによ
りコードされる。（rbeＡ１２に関するＤＮＡおよび推
定−次蛋白質配列を第４６（Ｂ）図に示す。）ヒトの場
合、この新規な甲状腺ホルモン受容体はプラスミドクロ
ーンｈＥＲＢＡ8.7およびその関連クローン hＦＡ８に
よりコードされる。（ｈＥＲＢＡの配列については第２
２図を参照されたい。）ｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８
は同一遺伝子からのｃＤＮＡ生成物である。クローン h
ＦＡ８のＤＮＡ配列は下記の点を除いてｈＥＲＢＡ 8.7
（第２２図に示す）と等しい。 hＦＡ８の配列は第２２
図に示す配列より短い。より詳細には、ｈＥＲＢＡ 8.7
のヌクレオチド１（Ｇ）から１４（Ａ）までが hＦＡ配
列にはない。さらに hＦＡ８配列は塩基対位置１１３８
のグアニン（Ｇ）から塩基対１２４４のグアニン（Ｇ）
に及ぶ欠失を有する。この欠失によってアミノ酸３６８
（Ｇlu)から４０６（Ｇｌn）までが hＦＡ８クローンに
よりコードされるポリペプチドから失われる。前記のよ
うに本発明の最初の甲状腺ホルモン受容体は染色体３に
局在している。実験の部VIIに示すように、新規な甲状
腺ホルモン受容体に対するヒト遺伝子ヒト染色体１７に
局在している。ラット甲状腺ホルモン受容体rbeＡ１２
を染色体１７からのヒト遺伝子生成物のラット型同族体
を表わす。
のほかに、本発明者らはプラスミドpeＡ１０１により推
定される蛋白質配列と異なる第２の甲状腺ホルモン受容
体を見出した。本発明者らはこの新規な予想されなかっ
た甲状腺ホルモン受容体をラットおよびヒトの双方から
単離し、特性を調べた。ラットの場合、この新規な甲状
腺ホルモン受容体はプラスミドrbeＡ１２のＤＮＡによ
りコードされる。（rbeＡ１２に関するＤＮＡおよび推
定−次蛋白質配列を第４６（Ｂ）図に示す。）ヒトの場
合、この新規な甲状腺ホルモン受容体はプラスミドクロ
ーンｈＥＲＢＡ8.7およびその関連クローン hＦＡ８に
よりコードされる。（ｈＥＲＢＡの配列については第２
２図を参照されたい。）ｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８
は同一遺伝子からのｃＤＮＡ生成物である。クローン h
ＦＡ８のＤＮＡ配列は下記の点を除いてｈＥＲＢＡ 8.7
（第２２図に示す）と等しい。 hＦＡ８の配列は第２２
図に示す配列より短い。より詳細には、ｈＥＲＢＡ 8.7
のヌクレオチド１（Ｇ）から１４（Ａ）までが hＦＡ配
列にはない。さらに hＦＡ８配列は塩基対位置１１３８
のグアニン（Ｇ）から塩基対１２４４のグアニン（Ｇ）
に及ぶ欠失を有する。この欠失によってアミノ酸３６８
（Ｇlu)から４０６（Ｇｌn）までが hＦＡ８クローンに
よりコードされるポリペプチドから失われる。前記のよ
うに本発明の最初の甲状腺ホルモン受容体は染色体３に
局在している。実験の部VIIに示すように、新規な甲状
腺ホルモン受容体に対するヒト遺伝子ヒト染色体１７に
局在している。ラット甲状腺ホルモン受容体rbeＡ１２
を染色体１７からのヒト遺伝子生成物のラット型同族体
を表わす。
【００７４】それらは異なる遺伝子坐によりコードされ
るので、染色体１７遺伝子生成物はhＴＲ アルファとし
て分類され、染色体３遺伝子生成物は hＴＲベータとし
て分類されている。関連性は高いが、アルファおよびベ
ータ遺伝子生成物はそれらの一次アミノ酸配列において
特異的変化を含む。またアルファおよびベータ生成物は
特徴的に異なる発現パターンを示す。
るので、染色体１７遺伝子生成物はhＴＲ アルファとし
て分類され、染色体３遺伝子生成物は hＴＲベータとし
て分類されている。関連性は高いが、アルファおよびベ
ータ遺伝子生成物はそれらの一次アミノ酸配列において
特異的変化を含む。またアルファおよびベータ生成物は
特徴的に異なる発現パターンを示す。
【００７５】甲状腺ホルモンの作用は多岐にわたり、そ
れらの受容体に依存している。本発明者らが甲状腺ホル
モン受容体をクローニングする以前はこの受容体は精製
または生化学的特性の解決はなされていなかった。科学
文献にも多種の甲状腺ホルモン受容体遺伝子生成物の存
在を示唆する証拠は全くなかった。多種の受容体が存在
することは、これら受容体のうち１種類のみを選択的に
活性化する甲状腺ホルモン同族体を開発する基礎として
有用である。これは広範な臨床的威力をもつと思われる
ので、興味ある重要な知見である。
れらの受容体に依存している。本発明者らが甲状腺ホル
モン受容体をクローニングする以前はこの受容体は精製
または生化学的特性の解決はなされていなかった。科学
文献にも多種の甲状腺ホルモン受容体遺伝子生成物の存
在を示唆する証拠は全くなかった。多種の受容体が存在
することは、これら受容体のうち１種類のみを選択的に
活性化する甲状腺ホルモン同族体を開発する基礎として
有用である。これは広範な臨床的威力をもつと思われる
ので、興味ある重要な知見である。
【００７６】本発明者らが特性を明らかにした最初の甲
状腺ホルモン受容体はpeＡ１２、すなわち現在ヒト甲状
腺ホルモン受容体ベータと呼ばれる受容体であった。本
発明者らは分子ハイブリダイゼーションによってラット
脳ｃＤＮＡライブラリーを関連配列につきスクリーニン
グするためにこのベータクローンを用いた。これによつ
てプラスミドrbe１２が同定され、のちにこれがアルフ
ァ群の新規な甲状腺ホルモン受容体として同定された。
このラット rbeＡ１２は rbeＡ１２遺伝子生成物に対す
るヒト同族体クローニングするための分子ハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いられた。このヒト生成物
はクローンｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８によりコード
される。
状腺ホルモン受容体はpeＡ１２、すなわち現在ヒト甲状
腺ホルモン受容体ベータと呼ばれる受容体であった。本
発明者らは分子ハイブリダイゼーションによってラット
脳ｃＤＮＡライブラリーを関連配列につきスクリーニン
グするためにこのベータクローンを用いた。これによつ
てプラスミドrbe１２が同定され、のちにこれがアルフ
ァ群の新規な甲状腺ホルモン受容体として同定された。
このラット rbeＡ１２は rbeＡ１２遺伝子生成物に対す
るヒト同族体クローニングするための分子ハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いられた。このヒト生成物
はクローンｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８によりコード
される。
【００７７】他の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡ（ラッ
ト甲状腺ホルモン受容体 rbeＡ１２、ならびにヒト甲状
腺ホルモン受容体ｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８）はそ
れらのcＤＮＡを−erb−Ａについて行ったと同様に適正
な向きで発現ベクター pＧＥＭ３中へ挿入することによ
って発現させることができる。
ト甲状腺ホルモン受容体 rbeＡ１２、ならびにヒト甲状
腺ホルモン受容体ｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８）はそ
れらのcＤＮＡを−erb−Ａについて行ったと同様に適正
な向きで発現ベクター pＧＥＭ３中へ挿入することによ
って発現させることができる。
【００７８】ここでプラスミドＧＭＣＡＴについて述べ
ると、これはクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）に対する細胞遺伝子に結合したＭＴ
ＶＬＴＲを含むレポータープラスミドである。この結合
の結果、pＧＭＣＡＴを用いてＭＴＶプロモーターの転
写活性を評価するための酵素アッセイを行うことができ
る。ＭＴＶプロモーターは数種のグルココルチコイド応
答要素（ＧＲＥ）を含むので、レポータープラスミド p
ＧＭＣＡＴはグルココルチコイドまたはミネラルコルチ
コイドレポーターＤＮＡ（現在知られているか、または
のちに見出された）を保有する発現プラスミドと共に適
切な宿主細胞中へ共トランスフェクションすることがで
きる。（このような共トランスフェクションは本発明の
“シス−トランス”機能性バイオアッセイ系の一部であ
る。本発明のこの観点についてはのちに詳述する。）共
トランスフェクションした宿主細胞においてＣＡＴ活性
が検出されたことは、受容体発現プラスミドにより産生
されたポリペプチドが機能性であること、すなわち受容
体蛋白質に特有の転写活性化特性を有することを示す。
プラスミド pＧＭＣＡＴはＡＴＣＣに特許の目的で寄託
され、ＡＴＣＣ＃６７２８２を得た。（pＧＭＣＡＴの
模式図については第２９（Ａ）図を参照されたい。
ると、これはクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）に対する細胞遺伝子に結合したＭＴ
ＶＬＴＲを含むレポータープラスミドである。この結合
の結果、pＧＭＣＡＴを用いてＭＴＶプロモーターの転
写活性を評価するための酵素アッセイを行うことができ
る。ＭＴＶプロモーターは数種のグルココルチコイド応
答要素（ＧＲＥ）を含むので、レポータープラスミド p
ＧＭＣＡＴはグルココルチコイドまたはミネラルコルチ
コイドレポーターＤＮＡ（現在知られているか、または
のちに見出された）を保有する発現プラスミドと共に適
切な宿主細胞中へ共トランスフェクションすることがで
きる。（このような共トランスフェクションは本発明の
“シス−トランス”機能性バイオアッセイ系の一部であ
る。本発明のこの観点についてはのちに詳述する。）共
トランスフェクションした宿主細胞においてＣＡＴ活性
が検出されたことは、受容体発現プラスミドにより産生
されたポリペプチドが機能性であること、すなわち受容
体蛋白質に特有の転写活性化特性を有することを示す。
プラスミド pＧＭＣＡＴはＡＴＣＣに特許の目的で寄託
され、ＡＴＣＣ＃６７２８２を得た。（pＧＭＣＡＴの
模式図については第２９（Ａ）図を参照されたい。
【００７９】プラスミド pＧＨＣＡＴは本発明に有用な
他のレポータープラスミドの一例である。pＧＨＣＡＴ
はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
(ＣＡＴ)に対する細菌遺伝子に機能性結合した成長ホル
モンプロモーターの一部を含む。この結合のため、pＧ
ＨＣＡＴを用いて成長ホルモン（ＧＨ）プロモーターの
転写活性を評価するための酵素アッセイを行うことがで
きる。ＧＨプロモーターは甲状腺ホルモン応答要素（Ｔ
ＲＥ）を含むので、レポータープラスミド pＧＨＣＡＴ
は甲状腺ホルモンレポーターＤＮＡ（現在知られている
か、またはのちに見出された）を保有する発現ベクター
と共に適切な宿主細胞中へ共トランスフェクションする
ことができる。（このような共トランスフェクションも
本発明の“シス−トランス”レポーター機能性バイオア
ッセイ系の一部である。本発明のこの観点についてはの
ちに詳述する。） pＧＨＣＡＴをＴＲ発現プラスミド
（これはたとえば hＴＲアルファまたは hＴＲベータＤ
ＮＡを保有する）と共に用いて適切な宿主細胞を共トラ
ンスフェクションした場合、共トランスフェクションし
た宿主細胞におけるＣＡＴ活性の検出は、甲状腺ホルモ
ン受容体（ＴＲ）発現プラスミドにより産生されたポリ
ペプチドが機能性であること、すななわち甲状腺ホルモ
ン受容体蛋白質に特有の転写活性化特性を有することを
示すために用いられる。
他のレポータープラスミドの一例である。pＧＨＣＡＴ
はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
(ＣＡＴ)に対する細菌遺伝子に機能性結合した成長ホル
モンプロモーターの一部を含む。この結合のため、pＧ
ＨＣＡＴを用いて成長ホルモン（ＧＨ）プロモーターの
転写活性を評価するための酵素アッセイを行うことがで
きる。ＧＨプロモーターは甲状腺ホルモン応答要素（Ｔ
ＲＥ）を含むので、レポータープラスミド pＧＨＣＡＴ
は甲状腺ホルモンレポーターＤＮＡ（現在知られている
か、またはのちに見出された）を保有する発現ベクター
と共に適切な宿主細胞中へ共トランスフェクションする
ことができる。（このような共トランスフェクションも
本発明の“シス−トランス”レポーター機能性バイオア
ッセイ系の一部である。本発明のこの観点についてはの
ちに詳述する。） pＧＨＣＡＴをＴＲ発現プラスミド
（これはたとえば hＴＲアルファまたは hＴＲベータＤ
ＮＡを保有する）と共に用いて適切な宿主細胞を共トラ
ンスフェクションした場合、共トランスフェクションし
た宿主細胞におけるＣＡＴ活性の検出は、甲状腺ホルモ
ン受容体（ＴＲ）発現プラスミドにより産生されたポリ
ペプチドが機能性であること、すななわち甲状腺ホルモ
ン受容体蛋白質に特有の転写活性化特性を有することを
示すために用いられる。
【００８０】プラスミド pＥ４および pＨＫＡは、ここ
ではｈＥＲＲ１と呼ばれるエストロゲン関連受容体をコ
ードするｃＤＮＡに関係する。（実験の部Ｖ、特に第３
３−３５図を参照されたい。）プラスミド pＥ４は第３
３図においてラムダ hＫＥ４とよばれるｃＤＮＡセグメ
ントを保有し、； pＨＫＡは同図においてラムダhＫＡ
１と呼ばれるセグメントを保有する。pＥ４およびpＨＫ
Ａ共方ともＡＴＣＣに特許の目的で寄託されている。こ
れら２種のプラスミドを後記に従って結合させて、エス
トロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１に対する全コード配列を
含む単一プラスミド（pＧＭＥＲＲ１）を得ることがで
きる。
ではｈＥＲＲ１と呼ばれるエストロゲン関連受容体をコ
ードするｃＤＮＡに関係する。（実験の部Ｖ、特に第３
３−３５図を参照されたい。）プラスミド pＥ４は第３
３図においてラムダ hＫＥ４とよばれるｃＤＮＡセグメ
ントを保有し、； pＨＫＡは同図においてラムダhＫＡ
１と呼ばれるセグメントを保有する。pＥ４およびpＨＫ
Ａ共方ともＡＴＣＣに特許の目的で寄託されている。こ
れら２種のプラスミドを後記に従って結合させて、エス
トロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１に対する全コード配列を
含む単一プラスミド（pＧＭＥＲＲ１）を得ることがで
きる。
【００８１】２種のｃＤＮＡクローン pＥ４および pＨ
ＫＡを結合させるための好ましい方法は、各ｃＤＮＡに
存在する特異的制限酵素部位に対し各末端において相補
的である合成リンカーを利用する。より詳細には、ラム
ダhＫＡ１およびラムダhＫＥ４からの挿入配列をＥcoＲ
Ｉ断片としてプラスミドベクター pＧＭ３（プロメガ・
バイオテク）中へクローニングする；本発明者らはこれ
らをそれぞれ pＧＭＫＡおよびpＧＭＫＥと命名した。
次いで pＧＭＫＡをＮarＩおよびＨindIIIにより切断
し、ｈＥＲＲ１をコードする断片をアガロースゲルから
精製する（断片１）。pＧＭＫＥをＤraIIIおよびＨindI
II により切断し、ｈＥＲＲ１の５’末端領域およびベ
クター配列をコードする断片をアガロースゲルから精製
する（断片２）。第３に、互いに相補的な２種の合成オ
リゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオ
チドは下記のものである。
ＫＡを結合させるための好ましい方法は、各ｃＤＮＡに
存在する特異的制限酵素部位に対し各末端において相補
的である合成リンカーを利用する。より詳細には、ラム
ダhＫＡ１およびラムダhＫＥ４からの挿入配列をＥcoＲ
Ｉ断片としてプラスミドベクター pＧＭ３（プロメガ・
バイオテク）中へクローニングする；本発明者らはこれ
らをそれぞれ pＧＭＫＡおよびpＧＭＫＥと命名した。
次いで pＧＭＫＡをＮarＩおよびＨindIIIにより切断
し、ｈＥＲＲ１をコードする断片をアガロースゲルから
精製する（断片１）。pＧＭＫＥをＤraIIIおよびＨindI
II により切断し、ｈＥＲＲ１の５’末端領域およびベ
クター配列をコードする断片をアガロースゲルから精製
する（断片２）。第３に、互いに相補的な２種の合成オ
リゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオ
チドは下記のものである。
【００８２】オリゴＩ： ＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣ
ＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧ
ＣＧＧＧ； オリゴII： ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＡＴＡＣ
ＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＣＣ
ＡＧＧＣＡＣＴＴＴ。
ＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧ
ＣＧＧＧ； オリゴII： ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＡＴＡＣ
ＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＣＣ
ＡＧＧＣＡＣＴＴＴ。
【００８３】最後に断片１および２ならびにオリゴIお
よびIIを当業者に周知の標準法に従って互いにリゲート
させ、次いで細菌ＤＨ５株中へ形質転換する。得られた
コロニーをここでは pＧＭＥＲＲ１と呼ばれるＤＮＡ構
造物につきスクリーニングする。プラスミド pＧＭＥＲ
Ｒ１を用いてｈＥＲＲ１を発現させることができる。p
ＧＭＥＲＲ１の模式図については第８（Ａ）図を参照さ
れたい。
よびIIを当業者に周知の標準法に従って互いにリゲート
させ、次いで細菌ＤＨ５株中へ形質転換する。得られた
コロニーをここでは pＧＭＥＲＲ１と呼ばれるＤＮＡ構
造物につきスクリーニングする。プラスミド pＧＭＥＲ
Ｒ１を用いてｈＥＲＲ１を発現させることができる。p
ＧＭＥＲＲ１の模式図については第８（Ａ）図を参照さ
れたい。
【００８４】プラスミド phＨ３は、ヒト心臓ラムダ gt
llｃＤＮＡライブラリーから、ラムダ hＫＡ１の５’部
分を表わす、ニックトランスレーションされた７００−
bpＥ coＲＩ−ＳmaＩ断片を用いて単離されたラムダ hＨ
３クローンに関連する。（ラムダ hＫＥ４およびラムダ
hＫＡ１クローンはヒト腎ラムダgt１０ｃＤＮＡライブ
ラリーから単離された；実験の部Ｖ.Ｈ，特に第３３−
３８図の方法と表示される項目を参照されたい。）ラム
ダhＨ３クローンはここではｈＥＲＲ２と呼ばれるエス
トロゲン関連受容体をコードするｃＤＮＡを保有する。
phＨ３からのｃＤＮＡを pＧＭ３中へ挿入して pＧＭＥ
ＲＲ２を形成することができる。その図は第８（Ｂ）図
に示されている。受容体様ポリペプチドｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２の機能上および構造上の特性を実験の部Ｖ
に示す。
llｃＤＮＡライブラリーから、ラムダ hＫＡ１の５’部
分を表わす、ニックトランスレーションされた７００−
bpＥ coＲＩ−ＳmaＩ断片を用いて単離されたラムダ hＨ
３クローンに関連する。（ラムダ hＫＥ４およびラムダ
hＫＡ１クローンはヒト腎ラムダgt１０ｃＤＮＡライブ
ラリーから単離された；実験の部Ｖ.Ｈ，特に第３３−
３８図の方法と表示される項目を参照されたい。）ラム
ダhＨ３クローンはここではｈＥＲＲ２と呼ばれるエス
トロゲン関連受容体をコードするｃＤＮＡを保有する。
phＨ３からのｃＤＮＡを pＧＭ３中へ挿入して pＧＭＥ
ＲＲ２を形成することができる。その図は第８（Ｂ）図
に示されている。受容体様ポリペプチドｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２の機能上および構造上の特性を実験の部Ｖ
に示す。
【００８５】本発明者らが本発明のＤＮＡを用いて得た
知見の１つは、同一種内の各種ホルモン受容体間の、ま
た特定のいずれかの受容体については種間の著しい配列
相同である。（たとえばv−erb−Ａ発癌遺伝子生成物、
ヒト胎盤c−erb−Ａポリペプチド、ならびにヒトグルコ
コルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ末
端部分を比較した第１７図；ステロイドおよび甲状腺ホ
ルモン受容体を比較した第２１図；ミネラルコルチコイ
ド受容体とグルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を
比較した第２７図；ｈＧＲ、hＭＲおよび hＰＲ間のア
ミノ酸比較を示した第３２図；ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ
２、ヒトエストロゲンおよびヒトグルココルチコイド受
容体のカルボキシ末端領域を比較した第３９図；ならび
にｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｈＥＲ，ｈＧＲおよびヒト
甲状腺ホルモン受容体 hＴ3Ｒベータ間のアミノ酸の比
較を示す第４１図を参照されたい。）この相同性がある
ため本発明のＤＮＡおよびＲＮＡは、ホルモンと複合体
を形成したのちクロマチンＤＮＡに結合することにより
転写を活性化するホルモン受容体をコードする遺伝子を
実質的にいかなる種からも検出および単離することがで
きる。本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ、特にＡＴＣＣに特
許の目的で寄託された好ましいＤＮＡを用いることによ
り、当業者は多大な試験を行うことなくゲノムライブラ
リーをスクリーニングして、本発明の範囲に含まれる他
のグルココルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲
状腺ホルモン受容体を見出すことができる。本発明のこ
の観点は本発明者らによりエストロゲン関連受容体ｈＥ
ＲＲ１およびｈＥＲＲ２（実験例Ｖ、特に項目Ａ、序、
および項目Ｂ、受容体ｈＥＲＲに対する cＤＮＡクロー
ンの項を参照されたい）、ならびにラット甲状腺ホルモ
ン受容体およびヒト甲状腺ホルモン受容体ＴＲアルファ
（実験の部VII、特に項目Ｃ、第２甲状腺ホルモン受容
体ＤＮＡの単離、ならびに第４６（Ａ）および（Ｂ）図
を参照されたい）が見出されたことにより説明される。
知見の１つは、同一種内の各種ホルモン受容体間の、ま
た特定のいずれかの受容体については種間の著しい配列
相同である。（たとえばv−erb−Ａ発癌遺伝子生成物、
ヒト胎盤c−erb−Ａポリペプチド、ならびにヒトグルコ
コルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ末
端部分を比較した第１７図；ステロイドおよび甲状腺ホ
ルモン受容体を比較した第２１図；ミネラルコルチコイ
ド受容体とグルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を
比較した第２７図；ｈＧＲ、hＭＲおよび hＰＲ間のア
ミノ酸比較を示した第３２図；ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ
２、ヒトエストロゲンおよびヒトグルココルチコイド受
容体のカルボキシ末端領域を比較した第３９図；ならび
にｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｈＥＲ，ｈＧＲおよびヒト
甲状腺ホルモン受容体 hＴ3Ｒベータ間のアミノ酸の比
較を示す第４１図を参照されたい。）この相同性がある
ため本発明のＤＮＡおよびＲＮＡは、ホルモンと複合体
を形成したのちクロマチンＤＮＡに結合することにより
転写を活性化するホルモン受容体をコードする遺伝子を
実質的にいかなる種からも検出および単離することがで
きる。本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ、特にＡＴＣＣに特
許の目的で寄託された好ましいＤＮＡを用いることによ
り、当業者は多大な試験を行うことなくゲノムライブラ
リーをスクリーニングして、本発明の範囲に含まれる他
のグルココルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲
状腺ホルモン受容体を見出すことができる。本発明のこ
の観点は本発明者らによりエストロゲン関連受容体ｈＥ
ＲＲ１およびｈＥＲＲ２（実験例Ｖ、特に項目Ａ、序、
および項目Ｂ、受容体ｈＥＲＲに対する cＤＮＡクロー
ンの項を参照されたい）、ならびにラット甲状腺ホルモ
ン受容体およびヒト甲状腺ホルモン受容体ＴＲアルファ
（実験の部VII、特に項目Ｃ、第２甲状腺ホルモン受容
体ＤＮＡの単離、ならびに第４６（Ａ）および（Ｂ）図
を参照されたい）が見出されたことにより説明される。
【００８６】本発明のＤＮＡおよびセンスストランドＤ
ＮＡはたとえば本発明の誘導法および蛋白質製造法と組
合わせて使用して、大量の実質的に純粋な受容体蛋白質
を製造することができる。さらに、こうして製造された
実質的に純粋な受容体蛋白質を周知の方法により診断ア
ッセイ法に使用して、各種の体液および組織試料におけ
る特定のホルモンの存在を調べることができる。
ＮＡはたとえば本発明の誘導法および蛋白質製造法と組
合わせて使用して、大量の実質的に純粋な受容体蛋白質
を製造することができる。さらに、こうして製造された
実質的に純粋な受容体蛋白質を周知の方法により診断ア
ッセイ法に使用して、各種の体液および組織試料におけ
る特定のホルモンの存在を調べることができる。
【００８７】さらに本発明の受容体蛋白質を結合アッセ
イ法、たとえば実験の部IIIに述べるpeＡ１０１により
コードされる受容体へのＴ3の結合に関する方法、また
は後述する本発明の“シス−トランス”受容体機能性バ
イオアッセイ法により、受容体作用薬および受容体拮抗
薬をスクリーニングするのに用いることができる。
イ法、たとえば実験の部IIIに述べるpeＡ１０１により
コードされる受容体へのＴ3の結合に関する方法、また
は後述する本発明の“シス−トランス”受容体機能性バ
イオアッセイ法により、受容体作用薬および受容体拮抗
薬をスクリーニングするのに用いることができる。
【００８８】最後に、本発明の受容体蛋白質は実質的に
純粋な形で製造されるので、それらを結晶化し、Ｘ線回
折法によりそれらの構造を調べることができる。当業者
に周知のように、これらの測定は“合成”または修飾さ
れた受容体蛋白質同族体を工学的に製造する際にきわめ
て有用である。
純粋な形で製造されるので、それらを結晶化し、Ｘ線回
折法によりそれらの構造を調べることができる。当業者
に周知のように、これらの測定は“合成”または修飾さ
れた受容体蛋白質同族体を工学的に製造する際にきわめ
て有用である。
【００８９】ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにこれにより
製造された新規な受容体蛋白質のほかに、本発明は以下
の３種の一般法を開示する。一方法は受容体蛋白質の機
能性を測定するためのバイオアッセイ法に関する。他の
二方法はそれらの転写がクロマチンＤＮＡに結合したホ
ルモン−受容体−複合体により活性化される遺伝子の発
現を誘導および制御する方法に関する。これら３種の一
般法それぞれにつき別個に述べる。
製造された新規な受容体蛋白質のほかに、本発明は以下
の３種の一般法を開示する。一方法は受容体蛋白質の機
能性を測定するためのバイオアッセイ法に関する。他の
二方法はそれらの転写がクロマチンＤＮＡに結合したホ
ルモン−受容体−複合体により活性化される遺伝子の発
現を誘導および制御する方法に関する。これら３種の一
般法それぞれにつき別個に述べる。
【００９０】本発明者らが“シス−トランス”バイオア
ッセイ系と呼ぶ、受容体機能性を試験するための新規な
バイオアッセイ系は２種のプラスミド、すなわち“発
現”プラスミドおよび“レポーター”プラスミドを使用
する。本発明によれば発現プラスミドは本発明の受容体
ＤＮＡまたはそれらの変異体を適切な受容体陰性宿主細
胞において発現しうるいかなるプラスミドであってもよ
い。同様に本発明によればレポータープラスミドは作動
性レポーター遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン応
答性プロモーター／エンハンサー要素を含むいかなるプ
ラスミドであってもよい。（ここで用いる用語の説明に
ついては本明細書の定義の項を参照されたい。）プラス
ミド pＧＭＣＡＴおよび pＧＨＣＡＴは作動性レポータ
ー遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素を含むレポータープラスミド
の例であり、従って本発明の受容体機能性バイオアッセ
イに使用できる。 pＧＭＣＡＴの場合、作動性ホルモン
応答性プロモーター／エンハンサー要素はＭＴＶ ＬＴ
Ｒであり；pＧＨＣＡＴの場合、これは成長ホルモン受
容体の機能性部分である。 pＧＭＣＡＴおよび pＧＨＣ
ＡＴの双方において作動性レポーター遺伝子はクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に
対する細菌性遺伝子である。
ッセイ系と呼ぶ、受容体機能性を試験するための新規な
バイオアッセイ系は２種のプラスミド、すなわち“発
現”プラスミドおよび“レポーター”プラスミドを使用
する。本発明によれば発現プラスミドは本発明の受容体
ＤＮＡまたはそれらの変異体を適切な受容体陰性宿主細
胞において発現しうるいかなるプラスミドであってもよ
い。同様に本発明によればレポータープラスミドは作動
性レポーター遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン応
答性プロモーター／エンハンサー要素を含むいかなるプ
ラスミドであってもよい。（ここで用いる用語の説明に
ついては本明細書の定義の項を参照されたい。）プラス
ミド pＧＭＣＡＴおよび pＧＨＣＡＴは作動性レポータ
ー遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素を含むレポータープラスミド
の例であり、従って本発明の受容体機能性バイオアッセ
イに使用できる。 pＧＭＣＡＴの場合、作動性ホルモン
応答性プロモーター／エンハンサー要素はＭＴＶ ＬＴ
Ｒであり；pＧＨＣＡＴの場合、これは成長ホルモン受
容体の機能性部分である。 pＧＭＣＡＴおよび pＧＨＣ
ＡＴの双方において作動性レポーター遺伝子はクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に
対する細菌性遺伝子である。
【００９１】本発明の“シス−トランス”受容体機能性
バイオアッセイを実施する際には、発現プラスミドおよ
びレポータープラスミドを適切な受容体陰性宿主細胞中
へ共トランスフェクションする。トランスフェクション
された宿主細胞は次いでホルモンまたは同族体の存在下
または不在下で培養され、レポータープラスミドのホル
モン応答性プロモーター／エンハンサー要素を活性化す
ることができる。トランスフェクションおよび培養され
た宿主細胞を次いでレポーター遺伝子配列の生成物の誘
導（すなわち存在）につき監視する。最後に、ホルモン
受容体蛋白質またはそれらの変異体（発現プラスミド上
の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、トランスフェク
ションおよび培養された宿主細胞において産生されたも
の）の発現および／またはステロイド結合能を本発明に
従って測定する。（この“シス−トランス”バイオアッ
セイ系の模式図については第９図を参照されたい。） 本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセ
イ系を好ましい形態においてグルココルチコイドまたは
ミネラルコルチコイド受容体の機能性の測定に用いる場
合、プラスミドは選択可能なマーカー、たとえば amp遺
伝子を保有するであろう。さらに、好ましい形態におい
てはレポータープラスミドは ＭＴＶ ＬＴＲまたは成長
ホルモンプロモーターの機能性部分をホルモン応答性プ
ロモーター／エンハンサー要素として含むであろう。Ｍ
ＴＶ ＬＴＲが好ましいのは、グルココルチコイドホル
モンがＭＴＶ ＬＴＲ内の特異的部位において転写開始
の効率を高めることによりＭＴＶ ＤＮＡの転写速度を
刺激することが知られているからである。さらにグルコ
コルチコイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッピングさ
れたＤＮＡ配列に特異的に結合し、従って異種プロモー
ターに対するグルココルチコイドの応答性を与えること
ができる。（実際の部II、特に項目Ｃ．（a)アッセイ系
および実験様式を参照されたい。）またミネラルコルチ
コイド受容体がグルココルチコイド受容体と機能的関連
を示すこと、およびｈＭＲのＤＮＡ結合区がＭＴＶ Ｌ
ＴＲを認識することも知られている。（実験の部IV、特
に項目Ｅ．：発現およびホルモンの結合、および項目
Ｆ．：転写活性化を参照されたい。）成長ホルモンプロ
モーターが好ましいのは、その活性化が甲状腺ホルモン
−受容体−複合体による結合に応答するからである。
バイオアッセイを実施する際には、発現プラスミドおよ
びレポータープラスミドを適切な受容体陰性宿主細胞中
へ共トランスフェクションする。トランスフェクション
された宿主細胞は次いでホルモンまたは同族体の存在下
または不在下で培養され、レポータープラスミドのホル
モン応答性プロモーター／エンハンサー要素を活性化す
ることができる。トランスフェクションおよび培養され
た宿主細胞を次いでレポーター遺伝子配列の生成物の誘
導（すなわち存在）につき監視する。最後に、ホルモン
受容体蛋白質またはそれらの変異体（発現プラスミド上
の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、トランスフェク
ションおよび培養された宿主細胞において産生されたも
の）の発現および／またはステロイド結合能を本発明に
従って測定する。（この“シス−トランス”バイオアッ
セイ系の模式図については第９図を参照されたい。） 本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセ
イ系を好ましい形態においてグルココルチコイドまたは
ミネラルコルチコイド受容体の機能性の測定に用いる場
合、プラスミドは選択可能なマーカー、たとえば amp遺
伝子を保有するであろう。さらに、好ましい形態におい
てはレポータープラスミドは ＭＴＶ ＬＴＲまたは成長
ホルモンプロモーターの機能性部分をホルモン応答性プ
ロモーター／エンハンサー要素として含むであろう。Ｍ
ＴＶ ＬＴＲが好ましいのは、グルココルチコイドホル
モンがＭＴＶ ＬＴＲ内の特異的部位において転写開始
の効率を高めることによりＭＴＶ ＤＮＡの転写速度を
刺激することが知られているからである。さらにグルコ
コルチコイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッピングさ
れたＤＮＡ配列に特異的に結合し、従って異種プロモー
ターに対するグルココルチコイドの応答性を与えること
ができる。（実際の部II、特に項目Ｃ．（a)アッセイ系
および実験様式を参照されたい。）またミネラルコルチ
コイド受容体がグルココルチコイド受容体と機能的関連
を示すこと、およびｈＭＲのＤＮＡ結合区がＭＴＶ Ｌ
ＴＲを認識することも知られている。（実験の部IV、特
に項目Ｅ．：発現およびホルモンの結合、および項目
Ｆ．：転写活性化を参照されたい。）成長ホルモンプロ
モーターが好ましいのは、その活性化が甲状腺ホルモン
−受容体−複合体による結合に応答するからである。
【００９２】本発明の“シス−トランス”バイオアッセ
イ系に用いるために好ましい宿主細胞はＣＯＳ細胞およ
びＣＶ−１細胞である。（本発明のバイオアッセイ系に
用いられる好ましい宿主細胞については、実験の部II、
項目Ｃ．（a）アッセイ系および実験様式を参照された
い。）ＣＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）細胞はＳＶ４０Ｔ抗
原（Ｔag）を発現するマウス腎細胞であり；ＣＶ−１は
ＳＶ４０ Ｔagを発現しない。ＣＶ−１細胞は内在性グ
ルココルチコイドもしくはミネラルコルチコイドまたは
他の既知のステロイドホルモンもしくは甲状腺ホルモン
の受容体をいずれも欠如するので好都合である。従って
適宜な発現ベクターを用いる遺伝子転写によりこれらの
宿主細胞を受容体陰性から受容体陽性へ転換させること
が可能である。ＣＯＳ−１誘導体系にＴagが存在するこ
とによって、導入された発現プラスミドを複製し、アッ
セイ期間中に生成する受容体の量を相対的に高めること
ができる。
イ系に用いるために好ましい宿主細胞はＣＯＳ細胞およ
びＣＶ−１細胞である。（本発明のバイオアッセイ系に
用いられる好ましい宿主細胞については、実験の部II、
項目Ｃ．（a）アッセイ系および実験様式を参照された
い。）ＣＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）細胞はＳＶ４０Ｔ抗
原（Ｔag）を発現するマウス腎細胞であり；ＣＶ−１は
ＳＶ４０ Ｔagを発現しない。ＣＶ−１細胞は内在性グ
ルココルチコイドもしくはミネラルコルチコイドまたは
他の既知のステロイドホルモンもしくは甲状腺ホルモン
の受容体をいずれも欠如するので好都合である。従って
適宜な発現ベクターを用いる遺伝子転写によりこれらの
宿主細胞を受容体陰性から受容体陽性へ転換させること
が可能である。ＣＯＳ−１誘導体系にＴagが存在するこ
とによって、導入された発現プラスミドを複製し、アッ
セイ期間中に生成する受容体の量を相対的に高めること
ができる。
【００９３】ＳＶ４０複製開始点（ori）を含む発現プ
ラスミドは、ＳＶ４０Ｔagを発現するいかなる宿主細胞
においても高いコピー数にまで増殖することができる。
従ってＳＶ４０“ori”を保有する本発明の発現プラス
ミドはＣＯＳ細胞において複製しうるが、ＣＶ−１細胞
においては複製されない。高いコピー数によって与えら
れる高い発現が望ましいが、これは開示されたバイオア
ッセイ系にとつて決定的なものではない。いずれかの特
定の細胞系を“宿主”として用いることも決定的なもの
ではない。上記発現ベクターはきわめて有効であるの
で、本発明者らによればこのアッセイ法は本発明者らが
試験したすべての宿主において作動した。ＣＶ−１細胞
が好ましいのは、それが遺伝子転移の研究に好都合であ
り、感受性の、かつ十分に報告された宿主細胞系を提供
するからにすぎない。
ラスミドは、ＳＶ４０Ｔagを発現するいかなる宿主細胞
においても高いコピー数にまで増殖することができる。
従ってＳＶ４０“ori”を保有する本発明の発現プラス
ミドはＣＯＳ細胞において複製しうるが、ＣＶ−１細胞
においては複製されない。高いコピー数によって与えら
れる高い発現が望ましいが、これは開示されたバイオア
ッセイ系にとつて決定的なものではない。いずれかの特
定の細胞系を“宿主”として用いることも決定的なもの
ではない。上記発現ベクターはきわめて有効であるの
で、本発明者らによればこのアッセイ法は本発明者らが
試験したすべての宿主において作動した。ＣＶ−１細胞
が好ましいのは、それが遺伝子転移の研究に好都合であ
り、感受性の、かつ十分に報告された宿主細胞系を提供
するからにすぎない。
【００９４】“シス−トランス”バイオアッセイ系は、
本発明の受容体ＤＮＡが転移した宿主細胞中に発現した
か否かを判定するために特に有用である。これは本発明
の受容体が対応する天然の同系受容体の結合活性の少な
くとも約１０％を有するか否か、またこの受容体が対応
する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なくとも１
０％を有するか否かを判定する際にも有用である。
本発明の受容体ＤＮＡが転移した宿主細胞中に発現した
か否かを判定するために特に有用である。これは本発明
の受容体が対応する天然の同系受容体の結合活性の少な
くとも約１０％を有するか否か、またこの受容体が対応
する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なくとも１
０％を有するか否かを判定する際にも有用である。
【００９５】第９図は本発明の“シス−トランス”受容
体機能性バイオアッセイ系をｈＧＲｃＤＮＡ によりコ
ードされる受容体ポリペプチドの機能性の測定に用いる
方法につき模式的に示す。このバイオアッセイ法の詳
細、および受容体の機能性を試験するための定量性バイ
オアッセイ系としてのその有効性は実験の部IIに開示お
よび論述される。（特に項目Ｆ．実験法；および項目
Ｃ.（b）機能性ｈＧＲの発現を参照されたい。）同実験
の部に示されるように、ホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素の活性化を証明するために採用できる
ＣＡＴ酵素アッセイ法のほかに、転移宿主細胞のウェス
ターンブロット分析法を採用して、対照として用いられ
る同系受容体から移動性に関して区別できない受容体ポ
リペプチドの合成を証明することができる。さらに本発
明の“シス−トランス”バイオアッセイ系を採用して、
特異的ホルモンによる受容体（トランスフェクションお
よび培養された宿主細胞において産生されたもの）の活
性化、ならびにそれらのホルモン結合能および特性を調
べることができる。実験の部IIに証明されるように、こ
れがｈＥＲについて行われた場合本発明のｈＧＲは機能
性であり、同系受容体の場合と同じ特異性および濃度で
グルココルチコイドホルモンと結合することが示され
た。
体機能性バイオアッセイ系をｈＧＲｃＤＮＡ によりコ
ードされる受容体ポリペプチドの機能性の測定に用いる
方法につき模式的に示す。このバイオアッセイ法の詳
細、および受容体の機能性を試験するための定量性バイ
オアッセイ系としてのその有効性は実験の部IIに開示お
よび論述される。（特に項目Ｆ．実験法；および項目
Ｃ.（b）機能性ｈＧＲの発現を参照されたい。）同実験
の部に示されるように、ホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素の活性化を証明するために採用できる
ＣＡＴ酵素アッセイ法のほかに、転移宿主細胞のウェス
ターンブロット分析法を採用して、対照として用いられ
る同系受容体から移動性に関して区別できない受容体ポ
リペプチドの合成を証明することができる。さらに本発
明の“シス−トランス”バイオアッセイ系を採用して、
特異的ホルモンによる受容体（トランスフェクションお
よび培養された宿主細胞において産生されたもの）の活
性化、ならびにそれらのホルモン結合能および特性を調
べることができる。実験の部IIに証明されるように、こ
れがｈＥＲについて行われた場合本発明のｈＧＲは機能
性であり、同系受容体の場合と同じ特異性および濃度で
グルココルチコイドホルモンと結合することが示され
た。
【００９６】最後に本発明者らは要約の項に示すように
本発明のＤＮＡを用いて、その転写が受容体との複合体
を形成したホルモンにより活性化される遺伝子（Ｇ）の
転写活性化に必要かつ十分な条件は、（Ｇ）が存在する
細胞（Ｃ）中にホルモンおよびその受容体が存在するこ
とであることを見出した。（ホルモン（Ｈ）および受容
体（Ｒ）が遺伝子（Ｇ）の転写に作用する様式は完全に
は理解されていない。しかし受容体（Ｒ）はホルモン
（Ｈ）と複合体を形成した場合、特異的ＤＮＡ部位、す
なわち当技術分野で“転写制御要素”または“転写刺激
を媒介するＤＮＡ配列”と呼ばれ、遺伝子（Ｇ）が位置
する付近のクロマチン上に存在するものに結合すると考
えられる。ホルモン／受容体−すなわち（Ｈ）／（Ｒ）
−複合体によるこの結合は、まだ解明されていない様式
で、遺伝子（Ｇ）に対するプロモーターを“始動させる
（turn on）”かまたは何らかの他の方法で活性化し、
これにより（Ｇ）遺伝子の転写を刺激するホルモン依存
性“スイッチ”として作用すると思われる。） 本発明者らの知見によって、遺伝子工学的に処理された
細胞において目的蛋白質を産生させるための改良された
組成物および方法が得られた。これらの方法２種が本発
明方法である。第１はその転写が受容体との複合体を形
成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘
導する方法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理
し、次いでその転写が受容体との複合体を形成したホル
モンによって活性化される遺伝子によりコードされる蛋
白質の生成を増大および制御する方法である。
本発明のＤＮＡを用いて、その転写が受容体との複合体
を形成したホルモンにより活性化される遺伝子（Ｇ）の
転写活性化に必要かつ十分な条件は、（Ｇ）が存在する
細胞（Ｃ）中にホルモンおよびその受容体が存在するこ
とであることを見出した。（ホルモン（Ｈ）および受容
体（Ｒ）が遺伝子（Ｇ）の転写に作用する様式は完全に
は理解されていない。しかし受容体（Ｒ）はホルモン
（Ｈ）と複合体を形成した場合、特異的ＤＮＡ部位、す
なわち当技術分野で“転写制御要素”または“転写刺激
を媒介するＤＮＡ配列”と呼ばれ、遺伝子（Ｇ）が位置
する付近のクロマチン上に存在するものに結合すると考
えられる。ホルモン／受容体−すなわち（Ｈ）／（Ｒ）
−複合体によるこの結合は、まだ解明されていない様式
で、遺伝子（Ｇ）に対するプロモーターを“始動させる
（turn on）”かまたは何らかの他の方法で活性化し、
これにより（Ｇ）遺伝子の転写を刺激するホルモン依存
性“スイッチ”として作用すると思われる。） 本発明者らの知見によって、遺伝子工学的に処理された
細胞において目的蛋白質を産生させるための改良された
組成物および方法が得られた。これらの方法２種が本発
明方法である。第１はその転写が受容体との複合体を形
成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘
導する方法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理
し、次いでその転写が受容体との複合体を形成したホル
モンによって活性化される遺伝子によりコードされる蛋
白質の生成を増大および制御する方法である。
【００９７】これら２方法につき述べる際にも、受容体
蛋白質との複合体を形成したホルモンにより転写が活性
化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子（Ｇ）を
活性化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をいずれも
（aＨ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機能性修
飾体は（r）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）が存在
する細胞を（Ｃ）と呼び、遺伝子（Ｇ）によりコードさ
れる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ。
蛋白質との複合体を形成したホルモンにより転写が活性
化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子（Ｇ）を
活性化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をいずれも
（aＨ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機能性修
飾体は（r）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）が存在
する細胞を（Ｃ）と呼び、遺伝子（Ｇ）によりコードさ
れる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ。
【００９８】本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子
（Ｇ）を含む細胞（Ｃ）が、細胞(Ｃ)において発現可能
であり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態
（r)をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換され
る。そして細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）の濃度ま
たは同族体（aＨ）の濃度を少なくとも遺伝子（Ｇ）の
発現を確実に誘導するのに十分な水準にまで高める。
（Ｇ）を含む細胞（Ｃ）が、細胞(Ｃ)において発現可能
であり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態
（r)をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換され
る。そして細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）の濃度ま
たは同族体（aＨ）の濃度を少なくとも遺伝子（Ｇ）の
発現を確実に誘導するのに十分な水準にまで高める。
【００９９】実験の部IIに示したように本発明の誘導法
を採用した場合、意外にも遺伝子(Ｇ)が位置する細胞に
（Ｈ）および（Ｒ）が存在することによって遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく、蛋白質（Ｐ）の
産生が５００〜１０００倍高められた。この知見はこの
誘導法が転写を誘導するためにだけでなく、これを増大
および制御するためにも採用されることを本発明者らに
示した。この知見から、細胞を工学的に処理し、次いで
その転写が受容体との複合体を形成したホルモンにより
活性化される遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質の
生成を制御する本発明方法も開発された。この方法につ
いてはのちにより詳細に述べる。
を採用した場合、意外にも遺伝子(Ｇ)が位置する細胞に
（Ｈ）および（Ｒ）が存在することによって遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく、蛋白質（Ｐ）の
産生が５００〜１０００倍高められた。この知見はこの
誘導法が転写を誘導するためにだけでなく、これを増大
および制御するためにも採用されることを本発明者らに
示した。この知見から、細胞を工学的に処理し、次いで
その転写が受容体との複合体を形成したホルモンにより
活性化される遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質の
生成を制御する本発明方法も開発された。この方法につ
いてはのちにより詳細に述べる。
【０１００】本発明の誘導法は細胞に与えられるホルモ
ン（Ｈ）またはその同族体（aＨ)の濃度を調節するだけ
で蛋白質（Ｐ）の生成を増大させ、および制御するため
にも採用できる。（当業者に自明のとおり、細胞（Ｃ）
を本発明のＤＮＡで形質転換すると、細胞（Ｃ）におい
て（Ｒ）または（r）の適切な供給が保証されるので、
（Ｒ)または（r）の欠如はもはや遺伝子（Ｇ）の転写に
おける制限因子とはならない。このため、培養液中の
（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで遺伝子
（Ｇ）の転写を増加させ、結果的に細胞（Ｃ）において
産生される蛋白質の量を増加させることができるであろ
う。） 本発明の誘導法は下記の条件を満たす限り、ホルモン
（Ｈ）またはその同族体（aＨ）のうちのいずれかと複
合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモ
ン受容体が結合することによって活性化される転写制御
要素による転写制御下にあるいかなる遺伝子（Ｇ）の発
現をも誘導するために採用できる：（１）受容体
（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えたその機
能的な修飾された形態（r)をコードするＤＮＡを使用で
きる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞である；
（３）細胞（Ｃ）がホルモン（Ｈ）または同族体（aＨ)
との複合体形成のために必要な（Ｒ）−または（r)−コ
ード化ＤＮＡを発現すべく形質転換されうる。
ン（Ｈ）またはその同族体（aＨ)の濃度を調節するだけ
で蛋白質（Ｐ）の生成を増大させ、および制御するため
にも採用できる。（当業者に自明のとおり、細胞（Ｃ）
を本発明のＤＮＡで形質転換すると、細胞（Ｃ）におい
て（Ｒ）または（r）の適切な供給が保証されるので、
（Ｒ)または（r）の欠如はもはや遺伝子（Ｇ）の転写に
おける制限因子とはならない。このため、培養液中の
（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで遺伝子
（Ｇ）の転写を増加させ、結果的に細胞（Ｃ）において
産生される蛋白質の量を増加させることができるであろ
う。） 本発明の誘導法は下記の条件を満たす限り、ホルモン
（Ｈ）またはその同族体（aＨ）のうちのいずれかと複
合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモ
ン受容体が結合することによって活性化される転写制御
要素による転写制御下にあるいかなる遺伝子（Ｇ）の発
現をも誘導するために採用できる：（１）受容体
（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えたその機
能的な修飾された形態（r)をコードするＤＮＡを使用で
きる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞である；
（３）細胞（Ｃ）がホルモン（Ｈ）または同族体（aＨ)
との複合体形成のために必要な（Ｒ）−または（r)−コ
ード化ＤＮＡを発現すべく形質転換されうる。
【０１０１】当業者は寄託された本発明のＤＮＡのいず
れをもプローブとして用いて、現在入手できない（Ｒ）
−または（r)−コード化ＤＮＡのゲノムライブラリーを
多大な実験なしに探査することができる。これらのＤＮ
Ａが見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細
胞（Ｃ）において発現可能である場合には細胞（Ｃ）の
形質転換に使用できる。培養細胞を形質転換する方法は
周知であり、当業者が多大な実験なしに用いることがで
きる。同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に（Ｈ）が
存在する場合その基礎水準はどの程度であるか、また遺
伝子(Ｇ)の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の生成を誘導お
よび制御するためには(Ｈ)または(aＨ）の濃度はどの程
度でなければならないかを当業者は判定できる。培養細
胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液に（Ｈ）または（a
Ｈ）を添加することにより、必要な濃度の（Ｈ）を形質
転換細胞（Ｃ）に供給することができる。
れをもプローブとして用いて、現在入手できない（Ｒ）
−または（r)−コード化ＤＮＡのゲノムライブラリーを
多大な実験なしに探査することができる。これらのＤＮ
Ａが見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細
胞（Ｃ）において発現可能である場合には細胞（Ｃ）の
形質転換に使用できる。培養細胞を形質転換する方法は
周知であり、当業者が多大な実験なしに用いることがで
きる。同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に（Ｈ）が
存在する場合その基礎水準はどの程度であるか、また遺
伝子(Ｇ)の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の生成を誘導お
よび制御するためには(Ｈ)または(aＨ）の濃度はどの程
度でなければならないかを当業者は判定できる。培養細
胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液に（Ｈ）または（a
Ｈ）を添加することにより、必要な濃度の（Ｈ）を形質
転換細胞（Ｃ）に供給することができる。
【０１０２】本発明により、遺伝子（Ｇ）の転写に必要
かつ十分な条件は遺伝子（Ｇ）が存在する細胞（Ｃ）に
（Ｈ）または（aＨ)および（Ｒ）または（ｒ）が存在す
ることであり、遺伝子（Ｇ）の転写、従って蛋白質
（Ｐ）の生成は形質転換細胞(Ｃ)の浸漬に用いられる培
養液中の（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで誘
導および制御できることが教示された。当業者に自明の
とおりこれらの知見に基づいて細胞を工学的に処理し、
その結果遺伝子（Ｇ）が位置する細胞（Ｃ）中にホルモ
ン（Ｈ）およびその受容体を確実に存在させ、次いで細
胞（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体
の濃度を制御するだけで、その転写がホルモン／受容体
−複合体により活性化される遺伝子によってコードされ
る蛋白質の生成を制御することができる。この概念は本
発明による細胞の工学的処理および蛋白質の製造のため
の方法の基礎である。
かつ十分な条件は遺伝子（Ｇ）が存在する細胞（Ｃ）に
（Ｈ）または（aＨ)および（Ｒ）または（ｒ）が存在す
ることであり、遺伝子（Ｇ）の転写、従って蛋白質
（Ｐ）の生成は形質転換細胞(Ｃ)の浸漬に用いられる培
養液中の（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで誘
導および制御できることが教示された。当業者に自明の
とおりこれらの知見に基づいて細胞を工学的に処理し、
その結果遺伝子（Ｇ）が位置する細胞（Ｃ）中にホルモ
ン（Ｈ）およびその受容体を確実に存在させ、次いで細
胞（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体
の濃度を制御するだけで、その転写がホルモン／受容体
−複合体により活性化される遺伝子によってコードされ
る蛋白質の生成を制御することができる。この概念は本
発明による細胞の工学的処理および蛋白質の製造のため
の方法の基礎である。
【０１０３】本発明による細胞の工学的処理法および蛋
白質の製法によれば、(１)細胞(Ｃ)を遺伝子（Ｇ）が含
有されるべく工学的に処理し、その結果遺伝子（Ｇ）の
転写は適宜なホルモン／受容体、（Ｈ）／（Ｒ）、複合
体が結合し、これにより遺伝子（Ｇ）の転写が活性化さ
れる転写制御要素による制御下に置かれ；（２）この時
点で転写制御要素による制御下にある遺伝子（Ｇ）が含
有される細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発現可能で
あり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能的形態
（r）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換し；
（３）最後に、細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）また
はその同族体の濃度を調節して、形質転換細胞（Ｃ）の
浸漬に用いる培養液から細胞が利用しうるホルモン
（Ｈ）の量を増大および制御することにより、遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく効果的に増大およ
び制御される。このように遺伝子（Ｇ）の転写を増大お
よび制御することにより、蛋白質（Ｐ）の生成も増大お
よび制御される。
白質の製法によれば、(１)細胞(Ｃ)を遺伝子（Ｇ）が含
有されるべく工学的に処理し、その結果遺伝子（Ｇ）の
転写は適宜なホルモン／受容体、（Ｈ）／（Ｒ）、複合
体が結合し、これにより遺伝子（Ｇ）の転写が活性化さ
れる転写制御要素による制御下に置かれ；（２）この時
点で転写制御要素による制御下にある遺伝子（Ｇ）が含
有される細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発現可能で
あり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能的形態
（r）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換し；
（３）最後に、細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）また
はその同族体の濃度を調節して、形質転換細胞（Ｃ）の
浸漬に用いる培養液から細胞が利用しうるホルモン
（Ｈ）の量を増大および制御することにより、遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく効果的に増大およ
び制御される。このように遺伝子（Ｇ）の転写を増大お
よび制御することにより、蛋白質（Ｐ）の生成も増大お
よび制御される。
【０１０４】上記の誘導法の場合、本発明による細胞の
工学的処理および蛋白質製造のための方法においてはホ
ルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）の双方が細胞（Ｃ）中
に存在する。また誘導法の場合、受容体(Ｒ)またはその
機能的な修飾された形態(r）の存在が本発明の（Ｒ）−
または（r)−コード化ＤＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転
換することにより保証される。前記のように、培養細胞
を形質転換する方法は周知であり、当業者が多大な実験
なしに用いることができる。適宜な濃度の(Ｈ)または
（aＨ）を含有する浸漬液中に形質転換細胞(Ｃ）を浸漬
するだけで、(Ｈ)またはその同族体（aＨ）の存在を保
証し、かつ（Ｈ）または（aＨ）の濃度を制御すること
ができる。適宜な濃度、すなわち一定量の蛋白質を生成
するために細胞（Ｃ）が必要とする（Ｈ）または（aＨ)
の濃度は、一定の条件下で多大の実験なしに当業者が判
定することができる。
工学的処理および蛋白質製造のための方法においてはホ
ルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）の双方が細胞（Ｃ）中
に存在する。また誘導法の場合、受容体(Ｒ)またはその
機能的な修飾された形態(r）の存在が本発明の（Ｒ）−
または（r)−コード化ＤＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転
換することにより保証される。前記のように、培養細胞
を形質転換する方法は周知であり、当業者が多大な実験
なしに用いることができる。適宜な濃度の(Ｈ)または
（aＨ）を含有する浸漬液中に形質転換細胞(Ｃ）を浸漬
するだけで、(Ｈ)またはその同族体（aＨ）の存在を保
証し、かつ（Ｈ）または（aＨ）の濃度を制御すること
ができる。適宜な濃度、すなわち一定量の蛋白質を生成
するために細胞（Ｃ）が必要とする（Ｈ）または（aＨ)
の濃度は、一定の条件下で多大の実験なしに当業者が判
定することができる。
【０１０５】同様に当業者に自明のとおり、細胞（Ｃ）
を本発明のＤＮＡにより形質転換することによって細胞
（Ｃ）における適切な（Ｒ）または（ｒ）の供給が保証
され、従って（Ｒ）または（r)の欠如が遺伝子（Ｇ）の
転写における制限因子となることはない。このため、培
養液中の（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで、
細胞（Ｃ）中に産生される蛋白質の（Ｐ）の量を増加さ
せることができるであろう。
を本発明のＤＮＡにより形質転換することによって細胞
（Ｃ）における適切な（Ｒ）または（ｒ）の供給が保証
され、従って（Ｒ）または（r)の欠如が遺伝子（Ｇ）の
転写における制限因子となることはない。このため、培
養液中の（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで、
細胞（Ｃ）中に産生される蛋白質の（Ｐ）の量を増加さ
せることができるであろう。
【０１０６】本発明の誘導法の場合と同様に、本発明に
よる細胞の工学的処理および蛋白質の製造のための方法
は下記の条件を満たす限り、細胞（Ｃ）に挿入すること
ができ、その結果ホルモン（Ｈ）またはその同族体のい
ずれかと複合体を形成したステロイドホルモンまたは甲
状腺ホルモン受容体（Ｒ）の結合によって活性化される
転写制御要素による転写制御下に置かれるいかなる遺伝
子（Ｇ）の発現の制御にも採用することができる：
（１）受容体（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を
備えたその機能的な修飾された形態（r）をコードする
ＤＮＡを使用できる；(２）細胞（Ｃ）が培養可能な細
胞である；（３）（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮ
Ａは遺伝子（Ｇ）が存在する細胞において発現可能であ
る。
よる細胞の工学的処理および蛋白質の製造のための方法
は下記の条件を満たす限り、細胞（Ｃ）に挿入すること
ができ、その結果ホルモン（Ｈ）またはその同族体のい
ずれかと複合体を形成したステロイドホルモンまたは甲
状腺ホルモン受容体（Ｒ）の結合によって活性化される
転写制御要素による転写制御下に置かれるいかなる遺伝
子（Ｇ）の発現の制御にも採用することができる：
（１）受容体（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を
備えたその機能的な修飾された形態（r）をコードする
ＤＮＡを使用できる；(２）細胞（Ｃ）が培養可能な細
胞である；（３）（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮ
Ａは遺伝子（Ｇ）が存在する細胞において発現可能であ
る。
【０１０７】この場合も多大な実験なしに当業者は寄託
された本発明のＤＮＡのいずれをもプローブとして用い
て、現在入手できない（Ｒ)−または（r）−コード化Ｄ
ＮＡのゲノムライブラリーを探査することができる。こ
れらのＤＮＡが見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の
存在する細胞（Ｃ）において発現可能である場合には本
発明の工学的蛋白質製造法に使用できる。
された本発明のＤＮＡのいずれをもプローブとして用い
て、現在入手できない（Ｒ)−または（r）−コード化Ｄ
ＮＡのゲノムライブラリーを探査することができる。こ
れらのＤＮＡが見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の
存在する細胞（Ｃ）において発現可能である場合には本
発明の工学的蛋白質製造法に使用できる。
【０１０８】同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に
（Ｈ）が存在する場合その基礎水準はどの程度である
か、また遺伝子（Ｇ）の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の
生成を誘導および制御するためには（Ｈ）または（aＨ)
の濃度はどの程度でなければならないかを当業者は判定
できる。培養細胞(Ｃ)の浸漬に用いられる培養液に
（Ｈ）または（aＨ)を添加することにより、目的量の蛋
白質（Ｐ）を確実に生成させるのに必要な濃度の（Ｈ）
を形質転換細胞（Ｃ）に供給することができる。
（Ｈ）が存在する場合その基礎水準はどの程度である
か、また遺伝子（Ｇ）の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の
生成を誘導および制御するためには（Ｈ）または（aＨ)
の濃度はどの程度でなければならないかを当業者は判定
できる。培養細胞(Ｃ)の浸漬に用いられる培養液に
（Ｈ）または（aＨ)を添加することにより、目的量の蛋
白質（Ｐ）を確実に生成させるのに必要な濃度の（Ｈ）
を形質転換細胞（Ｃ）に供給することができる。
【０１０９】本発明の種々の観点を以下の７実験例に詳
述し、例示する。実験の部Ｉはヒトグルココルチコイド
受容体に関する。より詳細にはこの例はｈＧＲｃＤＮＡ
の一次構造、およびこれまで報告されたｈＧＲ蛋白質と
機能的に区別できないポリペプチドへのその発現を示
す。実験の部IIはｈＧＲの機能区に関する。この例に示
されるように、ＧＲは少なくとも４個の機能区を含み、
それらのうち２個は予想されたものであり、予想された
ＤＮＡ−およびステロイド−結合区に対応し、それらの
うち２個は予想されなかったものであり、転写に対し強
い作用をもつ。実験の部IIIは甲状腺ホルモン受容体c−
erb−Ａに関する。この実験例に示すように、c−erb−
Ａは本発明者らがここで hＴＲアルファと呼ぶ甲状腺ホ
ルモン受容体をコードする。本発明者らが予想外に第２
の甲状腺ホルモン受容体を見出したことと合わせて（実
験例VII参照）、実験の部IIIに示された。c−erbに関す
るデータは甲状腺ホルモン受容体蛋白質についてのより
詳細な知見を得るのにきわめて有用であろう。実験の部
IVはヒトミネラルコルチコイド受容体に関する。これは
本発明者らが示すようにグルココルチコイド受容体に対
し構造的および機能的類似性をもつ。実験Vは本発明者
らがｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２と呼ぶ新規な予想され
なかった一群のステロイドホルモン受容体を示す。これ
らの受容体は新規なステロイドホルモン系の存在に対す
る最初の証拠を与える。新規な“シス−トランス”バイ
オアッセイ系に関する本明細書の記述と合わせて、この
新規なエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲ
Ｒ２は新規なホルモンの同定へ系統的に導くアッセイ系
を開発するための基礎を与えるであろう。このような新
規な系の同定は広範な生理学的および臨床上の重要性を
もつと思われる。実験の部VIにはラット甲状腺ホルモン
受容体c−erb−Ａオリゴヌクレオチドにおいて本発明者
らがＴ3 調節に必要であることを見出した部位に関する
本発明者らのデータを若干示す。これらの知見は、実験
の部III、およびヒト染色体１７に結合した新規な予想
されなかった甲状腺ホルモン受容体に関する実験VIIの
記述と合わせて、甲状腺ホルモン受容体蛋白質の特性を
開明する際に有用であろう。
述し、例示する。実験の部Ｉはヒトグルココルチコイド
受容体に関する。より詳細にはこの例はｈＧＲｃＤＮＡ
の一次構造、およびこれまで報告されたｈＧＲ蛋白質と
機能的に区別できないポリペプチドへのその発現を示
す。実験の部IIはｈＧＲの機能区に関する。この例に示
されるように、ＧＲは少なくとも４個の機能区を含み、
それらのうち２個は予想されたものであり、予想された
ＤＮＡ−およびステロイド−結合区に対応し、それらの
うち２個は予想されなかったものであり、転写に対し強
い作用をもつ。実験の部IIIは甲状腺ホルモン受容体c−
erb−Ａに関する。この実験例に示すように、c−erb−
Ａは本発明者らがここで hＴＲアルファと呼ぶ甲状腺ホ
ルモン受容体をコードする。本発明者らが予想外に第２
の甲状腺ホルモン受容体を見出したことと合わせて（実
験例VII参照）、実験の部IIIに示された。c−erbに関す
るデータは甲状腺ホルモン受容体蛋白質についてのより
詳細な知見を得るのにきわめて有用であろう。実験の部
IVはヒトミネラルコルチコイド受容体に関する。これは
本発明者らが示すようにグルココルチコイド受容体に対
し構造的および機能的類似性をもつ。実験Vは本発明者
らがｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２と呼ぶ新規な予想され
なかった一群のステロイドホルモン受容体を示す。これ
らの受容体は新規なステロイドホルモン系の存在に対す
る最初の証拠を与える。新規な“シス−トランス”バイ
オアッセイ系に関する本明細書の記述と合わせて、この
新規なエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲ
Ｒ２は新規なホルモンの同定へ系統的に導くアッセイ系
を開発するための基礎を与えるであろう。このような新
規な系の同定は広範な生理学的および臨床上の重要性を
もつと思われる。実験の部VIにはラット甲状腺ホルモン
受容体c−erb−Ａオリゴヌクレオチドにおいて本発明者
らがＴ3 調節に必要であることを見出した部位に関する
本発明者らのデータを若干示す。これらの知見は、実験
の部III、およびヒト染色体１７に結合した新規な予想
されなかった甲状腺ホルモン受容体に関する実験VIIの
記述と合わせて、甲状腺ホルモン受容体蛋白質の特性を
開明する際に有用であろう。
【０１１０】これ以上詳述しなくても当業者は以上の記
述および以下の実験の部によって本発明を最大限に利用
することができると考えられる。実験の部に示した材料
は特に指示しない限り例示の目的で示されたものであ
り、従って何らかの形で請求の範囲の記載を限定するも
のと解すべきではない。
述および以下の実験の部によって本発明を最大限に利用
することができると考えられる。実験の部に示した材料
は特に指示しない限り例示の目的で示されたものであ
り、従って何らかの形で請求の範囲の記載を限定するも
のと解すべきではない。
【０１１１】
【実施例】実験の部I 機能性ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡの一次構
造および発現Ｉ．Ａ．概要 ヒトリンパ様細胞および線維芽細胞cＤＮＡクローンか
ら推定したヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の
全アミノ酸配列を報告する。この配列はこの受容体の構
造上の種々の特性を明らかにする。これに主免疫原区、
およびＤＮＡ結合区の一部をなすと思われるシスティン
／アルギニン／リジンに富む領域が含まれる。分析量の
全長蛋白質を生成するためのＳＰ６転写ベクター系の使
用につき記述し、無細胞転写された蛋白質が免疫原性で
あり、かつ天然のグルココルチコイド受容体に特有のス
テロイド結合特性を備えていることを証明する。ワイン
バーガー（Ｗeinberger）ら（１９８５b）はｈＧＲ配列
と発癌遺伝子v−erb−Ａの配列の相同性を報告してい
る。
造および発現Ｉ．Ａ．概要 ヒトリンパ様細胞および線維芽細胞cＤＮＡクローンか
ら推定したヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の
全アミノ酸配列を報告する。この配列はこの受容体の構
造上の種々の特性を明らかにする。これに主免疫原区、
およびＤＮＡ結合区の一部をなすと思われるシスティン
／アルギニン／リジンに富む領域が含まれる。分析量の
全長蛋白質を生成するためのＳＰ６転写ベクター系の使
用につき記述し、無細胞転写された蛋白質が免疫原性で
あり、かつ天然のグルココルチコイド受容体に特有のス
テロイド結合特性を備えていることを証明する。ワイン
バーガー（Ｗeinberger）ら（１９８５b）はｈＧＲ配列
と発癌遺伝子v−erb−Ａの配列の相同性を報告してい
る。
【０１１２】Ｉ．Ｂ．序論 グルココルチコイド受容体は多種の培養細胞系に広く分
布し、発現しているので、グルココルチコイドによる遺
伝子発現の制御は転写調節のモデルとして広く研究され
ている。多数のグルココルチコイド応答性転写ユニット
が確認されており、これにはマウス乳腺腫瘍ウイルス
（ＭＭＴＶ）(リンゴールド)（Ｒingold）ら、１９７
５；パークス（Ｐarks）ら、１９７４）、マウスおよび
ヒトメタロチオネイン（ハーガー(Ｈager）ら、１９８
１；カーリン(Ｋarin）ら、１９８０)、ラットアルファ
２Ｍ−グロブリン（クルツ（Ｋurtz）ら、１９７７）な
らびにラットおよびヒト成長ホルモン（スピンドラー
（Ｓpindler）ら、１９８２；エバンス（Ｅvans）ら、
１９８２；ロビンス（Ｒobins）ら、１９８２）の遺伝
子が含まれる。これらの遺伝子数種の転写刺激を媒介す
るＤＮＡ配列の位置が決定された。ＭＭＴＶについて
は、これらの配列は転写開始部位の上流にある別個のゲ
ノム領域であり、これらは方向および位置と無関係にそ
れらの作用を及ぼすと思われる（チャンドラー（Ｃhand
ler）ら、１９８３；オストロフスキー（Ｏstrowski）
ら、１９８４）。ステロイド／受容体−複合体はこれら
の調節配列に結合すると思われ、精製された受容体を用
いて特異的結合部位が決定された（ゴビンダ（Ｇovind
a）ら、１９８２；シャイデライト(Ｓcheidereit)ら、
１９８３；プファール(Ｐfahl）１９８２；ペイバール
（Ｐayvar）ら、１９８３）。数種の応答性遺伝子のフ
ットプリンティング分析に基づいて、コア配列５’ＴＧ
Ｔ／ＣＴＣＴ３'を共有するコンセンサスＤＮＡ結合配
列が提唱された（カーリン(Ｋarin）ら、１９８４）。
布し、発現しているので、グルココルチコイドによる遺
伝子発現の制御は転写調節のモデルとして広く研究され
ている。多数のグルココルチコイド応答性転写ユニット
が確認されており、これにはマウス乳腺腫瘍ウイルス
（ＭＭＴＶ）(リンゴールド)（Ｒingold）ら、１９７
５；パークス（Ｐarks）ら、１９７４）、マウスおよび
ヒトメタロチオネイン（ハーガー(Ｈager）ら、１９８
１；カーリン(Ｋarin）ら、１９８０)、ラットアルファ
２Ｍ−グロブリン（クルツ（Ｋurtz）ら、１９７７）な
らびにラットおよびヒト成長ホルモン（スピンドラー
（Ｓpindler）ら、１９８２；エバンス（Ｅvans）ら、
１９８２；ロビンス（Ｒobins）ら、１９８２）の遺伝
子が含まれる。これらの遺伝子数種の転写刺激を媒介す
るＤＮＡ配列の位置が決定された。ＭＭＴＶについて
は、これらの配列は転写開始部位の上流にある別個のゲ
ノム領域であり、これらは方向および位置と無関係にそ
れらの作用を及ぼすと思われる（チャンドラー（Ｃhand
ler）ら、１９８３；オストロフスキー（Ｏstrowski）
ら、１９８４）。ステロイド／受容体−複合体はこれら
の調節配列に結合すると思われ、精製された受容体を用
いて特異的結合部位が決定された（ゴビンダ（Ｇovind
a）ら、１９８２；シャイデライト(Ｓcheidereit)ら、
１９８３；プファール(Ｐfahl）１９８２；ペイバール
（Ｐayvar）ら、１９８３）。数種の応答性遺伝子のフ
ットプリンティング分析に基づいて、コア配列５’ＴＧ
Ｔ／ＣＴＣＴ３'を共有するコンセンサスＤＮＡ結合配
列が提唱された（カーリン(Ｋarin）ら、１９８４）。
【０１１３】グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）が
その位置および方向を変えてもなおプロモーター誘導性
を保持しうることは、これがエンハンサーと命名される
一群のシス作用性調節配列に類似することを示唆する
(チャンドラー(Ｃhandler)ら、１９８３）。最初にウイ
ルス中に、次いで細胞遺伝子中に見出されたこれらの配
列はインビボにおける効果的な転写のために必要である
(ライモニス(Ｌaimonis)ら、１９８２；ベノイスト（Ｂ
enoist）ら、１９８１；ベルジ（Ｂaerji）ら、１９８
３）。エンハンサーは組織特異性転写制御により調節作
用を媒介するトランス作用性因子により認識されること
が示された。エンハンサー因子は十分には解明されてい
ないが、グルココルチコイド受容体はこれら推定遺伝子
活性化蛋白質の一例であると考えられる。
その位置および方向を変えてもなおプロモーター誘導性
を保持しうることは、これがエンハンサーと命名される
一群のシス作用性調節配列に類似することを示唆する
(チャンドラー(Ｃhandler)ら、１９８３）。最初にウイ
ルス中に、次いで細胞遺伝子中に見出されたこれらの配
列はインビボにおける効果的な転写のために必要である
(ライモニス(Ｌaimonis)ら、１９８２；ベノイスト（Ｂ
enoist）ら、１９８１；ベルジ（Ｂaerji）ら、１９８
３）。エンハンサーは組織特異性転写制御により調節作
用を媒介するトランス作用性因子により認識されること
が示された。エンハンサー因子は十分には解明されてい
ないが、グルココルチコイド受容体はこれら推定遺伝子
活性化蛋白質の一例であると考えられる。
【０１１４】放射性標識された高親和性グルココルチコ
イド同族体、たとえばデキサメサゾンおよびトリアムシ
ノロンアセトニドの入手が容易であるため、精製法が開
発され、その結果ほぼ純粋なラットおよびヒト受容体が
単離された(シモンズ(Simons)ら、１９８１；ゲーリン
グ（Ｇehring）ら、１９８３）。受容体はショ糖濃度勾
配液中を二量体として移動するが、変性作用性ＳＤＳ−
ポリアクリアミドゲル上での分析によれば相対分子量
（Ｍｔ)- 94,000（９４Ｋ）の単一ポリペプチドが検出
される（ウェストパール（Ｗestpahl）ら、１９８２；
ランゲ（Ｗrange)ら、１９７９）。その天然のポリペプ
チドはステロイド結合およびＤＮＡ配列認識に対する固
有の特異性を備えている。精製されたラットおよびヒト
受容体に対して産生されたモノクローナル抗体およびポ
リクローナル抗体(オクレット(Ｏkret）ら、１９８１；
ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４；ガメッチュ(Ｇamet
chu）ら、１９８４）をプローブとして用いて、ステロ
イド−およびＤＮＡ−結合領域と別個の分子部分上にあ
る主免疫原領域を確認することができた（カールステッ
ド−デューク（Ｃarlstedt−Ｄuke)ら、１９８２；ラン
ゲ（Ｗrange）ら、１９８４；デルウェーク（Ｄellweg）
ら、１９８２）。この分子の構造につきさらに情報を得
るために、またこれが遺伝子の転写を調節する分子機構
の分析に着手するために、本発明者らは受容体ｃＤＮＡ
配列のクローニングを試みた。受容体特異性抗体をプロ
ーブとして用いて、本発明者らはヒトまたはラットグル
ココルチコイド受容体ｃＤＮＡ挿入配列を含むクローン
を分離した（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、１９
８５a；ミースフェルド（Ｍiesfeld）ら、１９８４）。
イド同族体、たとえばデキサメサゾンおよびトリアムシ
ノロンアセトニドの入手が容易であるため、精製法が開
発され、その結果ほぼ純粋なラットおよびヒト受容体が
単離された(シモンズ(Simons)ら、１９８１；ゲーリン
グ（Ｇehring）ら、１９８３）。受容体はショ糖濃度勾
配液中を二量体として移動するが、変性作用性ＳＤＳ−
ポリアクリアミドゲル上での分析によれば相対分子量
（Ｍｔ)- 94,000（９４Ｋ）の単一ポリペプチドが検出
される（ウェストパール（Ｗestpahl）ら、１９８２；
ランゲ（Ｗrange)ら、１９７９）。その天然のポリペプ
チドはステロイド結合およびＤＮＡ配列認識に対する固
有の特異性を備えている。精製されたラットおよびヒト
受容体に対して産生されたモノクローナル抗体およびポ
リクローナル抗体(オクレット(Ｏkret）ら、１９８１；
ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４；ガメッチュ(Ｇamet
chu）ら、１９８４）をプローブとして用いて、ステロ
イド−およびＤＮＡ−結合領域と別個の分子部分上にあ
る主免疫原領域を確認することができた（カールステッ
ド−デューク（Ｃarlstedt−Ｄuke)ら、１９８２；ラン
ゲ（Ｗrange）ら、１９８４；デルウェーク（Ｄellweg）
ら、１９８２）。この分子の構造につきさらに情報を得
るために、またこれが遺伝子の転写を調節する分子機構
の分析に着手するために、本発明者らは受容体ｃＤＮＡ
配列のクローニングを試みた。受容体特異性抗体をプロ
ーブとして用いて、本発明者らはヒトまたはラットグル
ココルチコイド受容体ｃＤＮＡ挿入配列を含むクローン
を分離した（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、１９
８５a；ミースフェルド（Ｍiesfeld）ら、１９８４）。
【０１１５】Ｉ．Ｃ．結果 （a） グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ 先きに報告されたように（ワインバーガー（Weinberge
r）ら、１９８５ａ）ヒトリンパ様細胞系ＩＭ−９から
得たポリ（Ａ)+ ＲＮＡを鋳型として用いてファージ発
現ベクターラムダgtllにおいてｃＤＮＡクローンのライ
ブラリーを構成した。このライブラリーをまず精製グル
ココルチコイド受容体に対する家兎ポリクローナル抗血
清によりスクリーニングした結果、約2.5×１０5プラー
クから免疫陽性の候補クローン数種が分離された。これ
らのクローンから得たベータガラクトシダーゼ融合蛋白
質を用いて受容体エピトープ特異性抗体をアフィニティ
精製し、次いでこれを採取し、細胞抽出物の蛋白質ブロ
ットへの結合により同定した。ヒトグルココルチコイド
受容体の抗原決定因子を発現する挿入配列を含むクロー
ン３種を分離した。これらのクローンの挿入配列は異な
るサイズであったが交差ハイブリダイズした。それはそ
れらが恐らく受容体の主免疫原区の境界を定めると思わ
れる共通配列を含むことを示す。合わせてこれらのクロ
ーンは 1.4 kbpの長さに及んだが、明らかに受容体全体
をコードするのに十分なほど長くはなかった。これはＭ
ｔ９４Ｋのポリペプチドをコードするために約 2,500個
のヌクレオチドを必要とすると推定された。
r）ら、１９８５ａ）ヒトリンパ様細胞系ＩＭ−９から
得たポリ（Ａ)+ ＲＮＡを鋳型として用いてファージ発
現ベクターラムダgtllにおいてｃＤＮＡクローンのライ
ブラリーを構成した。このライブラリーをまず精製グル
ココルチコイド受容体に対する家兎ポリクローナル抗血
清によりスクリーニングした結果、約2.5×１０5プラー
クから免疫陽性の候補クローン数種が分離された。これ
らのクローンから得たベータガラクトシダーゼ融合蛋白
質を用いて受容体エピトープ特異性抗体をアフィニティ
精製し、次いでこれを採取し、細胞抽出物の蛋白質ブロ
ットへの結合により同定した。ヒトグルココルチコイド
受容体の抗原決定因子を発現する挿入配列を含むクロー
ン３種を分離した。これらのクローンの挿入配列は異な
るサイズであったが交差ハイブリダイズした。それはそ
れらが恐らく受容体の主免疫原区の境界を定めると思わ
れる共通配列を含むことを示す。合わせてこれらのクロ
ーンは 1.4 kbpの長さに及んだが、明らかに受容体全体
をコードするのに十分なほど長くはなかった。これはＭ
ｔ９４Ｋのポリペプチドをコードするために約 2,500個
のヌクレオチドを必要とすると推定された。
【０１１６】他のｃＤＮＡクローンを分離するために本
発明者らは最初のライブラリーを再びスクリーニング
し、かつオカヤマ（Ｏkayama）およびバーグ（Ｂerg)
（１９８３）により報告されたベクターにおいてヒト線
維芽細胞からのポリ（Ａ)+ ＲＮＡを用いて得た第２の
ライブラリー（オカヤマにより供与）をも試験した。免
疫陽性cＤＮＡ挿入配列（ｈＧＲ１.２）の１種をプロー
ブとして用いて１２クローンを分離した。これらは合わ
せて4.0kbp以上となった。これらのクローンのヌクレオ
チド配列をマキサム（Ｍaxam）およびギルバート（Ｇil
bert）（１９７７）の方法により、第１図に示した手法
に従って調べた。ＲＮＡブロット分析から全長クローン
を得るためには５〜７ kbのｃＤＮＡ挿入配列が必要で
あろうということが示された。配列分析から重複クロー
ンＯＢ７およびｈＧＲ5.16はアミノ酸７２０個のオープ
ンリーディングフレームに及ぶことが示されたが、これ
は完全な受容体をコードするのに十分な長さではない。
従って約２×１０6個の形質転換体を含む第２の線維芽
細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定翻
訳開始部位の上流１５０ bpに及ぶ大型の挿入配列を含
むクローン（ＯＢ１０）を得た（第１図参照）。配列分
析により２種の蛋白質の形態（アルファおよびベータと
命名）が予想された。これらはアミノ酸７２７において
異なり、それらのカルボキシ末端にそれぞれアミノ酸５
０個および１５個の付加的な異なるオープンリーデング
フレームを含む（第２図参照）。クローンＯＢ７により
表わされるアルファ形はグルココルチコイド受容体の主
要な形態である。各種のライブラリーから分離された８
種のｃＤＮＡクローンがこの配列を含むからである。
発明者らは最初のライブラリーを再びスクリーニング
し、かつオカヤマ（Ｏkayama）およびバーグ（Ｂerg)
（１９８３）により報告されたベクターにおいてヒト線
維芽細胞からのポリ（Ａ)+ ＲＮＡを用いて得た第２の
ライブラリー（オカヤマにより供与）をも試験した。免
疫陽性cＤＮＡ挿入配列（ｈＧＲ１.２）の１種をプロー
ブとして用いて１２クローンを分離した。これらは合わ
せて4.0kbp以上となった。これらのクローンのヌクレオ
チド配列をマキサム（Ｍaxam）およびギルバート（Ｇil
bert）（１９７７）の方法により、第１図に示した手法
に従って調べた。ＲＮＡブロット分析から全長クローン
を得るためには５〜７ kbのｃＤＮＡ挿入配列が必要で
あろうということが示された。配列分析から重複クロー
ンＯＢ７およびｈＧＲ5.16はアミノ酸７２０個のオープ
ンリーディングフレームに及ぶことが示されたが、これ
は完全な受容体をコードするのに十分な長さではない。
従って約２×１０6個の形質転換体を含む第２の線維芽
細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定翻
訳開始部位の上流１５０ bpに及ぶ大型の挿入配列を含
むクローン（ＯＢ１０）を得た（第１図参照）。配列分
析により２種の蛋白質の形態（アルファおよびベータと
命名）が予想された。これらはアミノ酸７２７において
異なり、それらのカルボキシ末端にそれぞれアミノ酸５
０個および１５個の付加的な異なるオープンリーデング
フレームを含む（第２図参照）。クローンＯＢ７により
表わされるアルファ形はグルココルチコイド受容体の主
要な形態である。各種のライブラリーから分離された８
種のｃＤＮＡクローンがこの配列を含むからである。
【０１１７】(b)ｃＤＮＡおよび蛋白質の配列 第３および４図はクローンｈＧＲ 1.2、ｈＧＲ5.16 、
ＯＢ７およびＯＢ１０を用いて判定された、ヒトアルフ
ァグルココルチコイド受容体をコードする4,800 ヌクレ
オチド配列を示す。翻訳開始部位はヌクレオチド１３３
−１３５に対応するメチオニンコドンに帰属すると判定
された。これがフレーム内ターミネーターＴＧＡ（ヌク
レオチド１２１−１２３）から下流に現われる最初のＡ
ＴＧトリプレットだからである。しかしアミノ末端ペプ
チド配列に関する情報がなければ開始部位の明確な決定
はまだ不可能である。７７７位のリジンに特異的なコド
ンの後に翻訳終止コドンＴＧＡがある。残りのコード化
配列は多数の重複クローンに包含され、ＯＢ７はポリ
（Ａ）付加部位に続く4.3 kbの挿入配列を含み、ＯＢ１
０は推点イニシエーターであるメチオニンを含む。クロ
ーンＯＢ７およびＯＢ１０の３’領域は制限エンドヌク
レアーゼおよびｃＤＮＡ配列分析の双方により示される
ようにヌクレオチド 2,314において異なる。この分岐点
においてアルファ受容体にはさらに５０個のアミノ酸を
コードする独自の配列が続き、一方ベータ受容体にはわ
ずか１５個のアミノ酸をコードする配列が続く（第５
（Ｂ）図）。ＯＢ７の３’側非翻訳領域はヌクレオチド
2,325個の長さであり、一方ＯＢ１０の場合はヌクレオ
チド１，４３３個である。直接的な配列比較により（第
３、４および５（Ｂ））、またはストリンジェント条件
下でのハイブリダイゼーション分析により（データは示
されていない）示されるように、これら２領域間には有
意の相同性はない。
ＯＢ７およびＯＢ１０を用いて判定された、ヒトアルフ
ァグルココルチコイド受容体をコードする4,800 ヌクレ
オチド配列を示す。翻訳開始部位はヌクレオチド１３３
−１３５に対応するメチオニンコドンに帰属すると判定
された。これがフレーム内ターミネーターＴＧＡ（ヌク
レオチド１２１−１２３）から下流に現われる最初のＡ
ＴＧトリプレットだからである。しかしアミノ末端ペプ
チド配列に関する情報がなければ開始部位の明確な決定
はまだ不可能である。７７７位のリジンに特異的なコド
ンの後に翻訳終止コドンＴＧＡがある。残りのコード化
配列は多数の重複クローンに包含され、ＯＢ７はポリ
（Ａ）付加部位に続く4.3 kbの挿入配列を含み、ＯＢ１
０は推点イニシエーターであるメチオニンを含む。クロ
ーンＯＢ７およびＯＢ１０の３’領域は制限エンドヌク
レアーゼおよびｃＤＮＡ配列分析の双方により示される
ようにヌクレオチド 2,314において異なる。この分岐点
においてアルファ受容体にはさらに５０個のアミノ酸を
コードする独自の配列が続き、一方ベータ受容体にはわ
ずか１５個のアミノ酸をコードする配列が続く（第５
（Ｂ）図）。ＯＢ７の３’側非翻訳領域はヌクレオチド
2,325個の長さであり、一方ＯＢ１０の場合はヌクレオ
チド１，４３３個である。直接的な配列比較により（第
３、４および５（Ｂ））、またはストリンジェント条件
下でのハイブリダイゼーション分析により（データは示
されていない）示されるように、これら２領域間には有
意の相同性はない。
【０１１８】さらに本発明者らはヒト一次線維芽細胞ラ
イブラリーから他のｃＤＮＡクローン、ＯＢ１２（デー
タは示されていない）を分離した。これはＯＢ７と等し
い配列を含むがヌクレオチド 3,101におけるポリアデニ
ル化信号を使用し（第２および３および４図）、より短
い３’側非翻訳領域を生じる。ＯＢ７の３’側非翻訳領
域に特異的なプローブを用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、大部分のクロ
ーンはＯＢ７の第１ポリ（Ａ）部位において終止するこ
とが明らかになった。従ってメッセンジャーＲＮＡの相
違は択一的ポリアデニル化および択一的ＲＮＡスプライ
シング双方による見掛けの結果である（後記参照）。ヒ
ト線維芽細胞ライブラリーが双方のｃＤＮＡを含んでい
たという事実は、双方の形の受容体が同一細胞内に存在
する可能性を示唆する。
イブラリーから他のｃＤＮＡクローン、ＯＢ１２（デー
タは示されていない）を分離した。これはＯＢ７と等し
い配列を含むがヌクレオチド 3,101におけるポリアデニ
ル化信号を使用し（第２および３および４図）、より短
い３’側非翻訳領域を生じる。ＯＢ７の３’側非翻訳領
域に特異的なプローブを用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、大部分のクロ
ーンはＯＢ７の第１ポリ（Ａ）部位において終止するこ
とが明らかになった。従ってメッセンジャーＲＮＡの相
違は択一的ポリアデニル化および択一的ＲＮＡスプライ
シング双方による見掛けの結果である（後記参照）。ヒ
ト線維芽細胞ライブラリーが双方のｃＤＮＡを含んでい
たという事実は、双方の形の受容体が同一細胞内に存在
する可能性を示唆する。
【０１１９】（c）アルファ−およびベータ−受容体蛋
白質の分析 配列分析によって、アルファ形およびベータ形双方のヒ
トグルココルチコイド受容体はそれぞれ残基７７７個お
よび７４２個の長さであることが明らかになった。これ
ら２形態は残基７２７までは等しく、その後でこれらは
相違する。インビボにおける受容体の水準を調べるため
に、数種のヒトおよびマウス細胞系からの細胞質抽出物
を、ヒトグルココルチコイド受容体に対するポリクロー
ナル抗体を用いるイムノブロット分析法により検査した
(ハーモン(Ｈarmon）1984）。アルファ−およびベータ
−受容体ｃＤＮＡをＳpb転写ベクターに挿入してインビ
トロ翻訳用の合成ｍＲＮＡを作成した（第６（Ａ）
図）。これらのＲＮＡを別個に家兎網赤血球溶解系に添
加し、非標識生成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。これら
２種のＲＮＡは、移動の相違が２種の形態の予想ポリペ
プチド長さと一致する異なる翻訳生成物の合成をプログ
ラムする（第６（Ｂ）図、レーン２、３）。未処理ＩＭ
−９細胞、および１μＭトリアムシノロンアセトニド処
理したＩＭ−９細胞からの細胞質抽出物が９４Ｋ受容体
（７９Ｋ形は推定受容体分解生成物を表わす）に対する
マーカー(第６（Ｂ）図、レーン４、５)として用いられ
る(ランゲ（Ｗrange）ら、１９８４）。ステロイド処理
後に、受容体／クロマチンの結合がより強くなること、
従って受容体が核へ転位することと対応して、９４Ｋバ
ンドの強度が低下する点を留意されたい。アルファ形は
受容体陰性の９４Ｋバンドと共に移動し、一方ベータ形
はより速やかに移動する（第６（Ｂ）図参照、レーン
２、３をレーン４、５と比較されたい）。各種のヒトお
よびマウス細胞系からの細胞質抽出物を比較することに
より、アルファ受容体のみが存在することが明らかにな
った（第６（Ｂ）図、レーン６〜９参照）。興味深いこ
とに、ステロイド誘導性細胞溶解に対する抵抗性に関し
て選択されたマウスＡＤＲ６リンパ腫細胞系（ダニエル
ソン（Ｄanielsen）ら、１９８４）はステロイド結合活
性をもたず、免疫反応性受容体を示さない（第６（Ｂ）
図、レーン７）。従ってイムノブロット分析法による多
種の受容体ｃＤＮＡクローンおよび受容体蛋白質の解明
に基づいて、本発明者らはグルココルチコイド受容体の
主要な生理学的形態はアルファ（９４Ｋ）種であると結
論する。
白質の分析 配列分析によって、アルファ形およびベータ形双方のヒ
トグルココルチコイド受容体はそれぞれ残基７７７個お
よび７４２個の長さであることが明らかになった。これ
ら２形態は残基７２７までは等しく、その後でこれらは
相違する。インビボにおける受容体の水準を調べるため
に、数種のヒトおよびマウス細胞系からの細胞質抽出物
を、ヒトグルココルチコイド受容体に対するポリクロー
ナル抗体を用いるイムノブロット分析法により検査した
(ハーモン(Ｈarmon）1984）。アルファ−およびベータ
−受容体ｃＤＮＡをＳpb転写ベクターに挿入してインビ
トロ翻訳用の合成ｍＲＮＡを作成した（第６（Ａ）
図）。これらのＲＮＡを別個に家兎網赤血球溶解系に添
加し、非標識生成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。これら
２種のＲＮＡは、移動の相違が２種の形態の予想ポリペ
プチド長さと一致する異なる翻訳生成物の合成をプログ
ラムする（第６（Ｂ）図、レーン２、３）。未処理ＩＭ
−９細胞、および１μＭトリアムシノロンアセトニド処
理したＩＭ−９細胞からの細胞質抽出物が９４Ｋ受容体
（７９Ｋ形は推定受容体分解生成物を表わす）に対する
マーカー(第６（Ｂ）図、レーン４、５)として用いられ
る(ランゲ（Ｗrange）ら、１９８４）。ステロイド処理
後に、受容体／クロマチンの結合がより強くなること、
従って受容体が核へ転位することと対応して、９４Ｋバ
ンドの強度が低下する点を留意されたい。アルファ形は
受容体陰性の９４Ｋバンドと共に移動し、一方ベータ形
はより速やかに移動する（第６（Ｂ）図参照、レーン
２、３をレーン４、５と比較されたい）。各種のヒトお
よびマウス細胞系からの細胞質抽出物を比較することに
より、アルファ受容体のみが存在することが明らかにな
った（第６（Ｂ）図、レーン６〜９参照）。興味深いこ
とに、ステロイド誘導性細胞溶解に対する抵抗性に関し
て選択されたマウスＡＤＲ６リンパ腫細胞系（ダニエル
ソン（Ｄanielsen）ら、１９８４）はステロイド結合活
性をもたず、免疫反応性受容体を示さない（第６（Ｂ）
図、レーン７）。従ってイムノブロット分析法による多
種の受容体ｃＤＮＡクローンおよび受容体蛋白質の解明
に基づいて、本発明者らはグルココルチコイド受容体の
主要な生理学的形態はアルファ（９４Ｋ）種であると結
論する。
【０１２０】（d）インビトロにおけるｈＧＲの発現 クローニングされた受容体が機能性であるという他の証
拠を提示するために、本発明者らはインビトロ翻訳生成
物がコルチコステロイドを選択的に結合しうる能力を調
べた。従って家兎の網赤血球溶解物をインビトロ合成し
たアルファまたはベータｈＧＲ ＲＮＡ添加前または添
加後に、放射性標識された合成グルココルイド同族体 3
Ｈ−トリアムシノロンアセトニド(3Ｈ−ＴＡ)と共にイ
ンキュベートした。第７図に示すようにｈＧＲ ＲＮＡ
によりプログラムされた溶解物は選択的にステロイド結
合能を獲得した。意外にもインビトロ合成したベータ受
容体は競合性 3Ｈ−ＴＡを結合しなかった。インビトロ
合成したアルファ−ｈＧＲは、過剰の非標識コルチゾル
またはデキサメサゾンの添加によって競合する可能性の
ある放射性標識ステロイドを結合した。しかし3Ｈ−Ｔ
Ａの結合は過剰の非標識エストロゲンまたはテストステ
ロンによっては効果的に競合されなかった。これに対し
過剰のプロゲステロンは有効な競合体となり、これは先
に報告されたプロゲステロンの抗グルココルチコイド活
性と一致する(ルソー(Ｒousseau)ら、１９７２）。これ
らの結果を確認するために、ヒトリンパ様細胞の抽出物
から調製された天然グルココルチコイド受容体を用いて
競合実験を反復した。インビトロ翻訳された受容体およ
び天然のインビボ受容体の双方とも、ステロイドの結
合、および過剰の非標識ステロイド同族体との競合に関
してほぼ等しい特性を示す（第７図参照）。
拠を提示するために、本発明者らはインビトロ翻訳生成
物がコルチコステロイドを選択的に結合しうる能力を調
べた。従って家兎の網赤血球溶解物をインビトロ合成し
たアルファまたはベータｈＧＲ ＲＮＡ添加前または添
加後に、放射性標識された合成グルココルイド同族体 3
Ｈ−トリアムシノロンアセトニド(3Ｈ−ＴＡ)と共にイ
ンキュベートした。第７図に示すようにｈＧＲ ＲＮＡ
によりプログラムされた溶解物は選択的にステロイド結
合能を獲得した。意外にもインビトロ合成したベータ受
容体は競合性 3Ｈ−ＴＡを結合しなかった。インビトロ
合成したアルファ−ｈＧＲは、過剰の非標識コルチゾル
またはデキサメサゾンの添加によって競合する可能性の
ある放射性標識ステロイドを結合した。しかし3Ｈ−Ｔ
Ａの結合は過剰の非標識エストロゲンまたはテストステ
ロンによっては効果的に競合されなかった。これに対し
過剰のプロゲステロンは有効な競合体となり、これは先
に報告されたプロゲステロンの抗グルココルチコイド活
性と一致する(ルソー(Ｒousseau)ら、１９７２）。これ
らの結果を確認するために、ヒトリンパ様細胞の抽出物
から調製された天然グルココルチコイド受容体を用いて
競合実験を反復した。インビトロ翻訳された受容体およ
び天然のインビボ受容体の双方とも、ステロイドの結
合、および過剰の非標識ステロイド同族体との競合に関
してほぼ等しい特性を示す（第７図参照）。
【０１２１】（e）少なくとも２種の遺伝子に対するｈ
ＧＲ配列地図 ヒトグルココルチコイド受容体は染色体５に機能的にマ
ッピングされている。受容体欠損マウスＴ細胞（ＥＬ
４）をヒト受容体含有Ｔ細胞（ＣＥＭ−Ｃ７）と融合さ
せることにより構成された体細胞ハイブリッドの分析か
ら、野生型ＣＥＭ−Ｃ７受容体を発現する分離体はヒト
染色体５を保持するが、デキサメサゾン耐性分離体はこ
の染色体を失っていることが示された（ゲーリング（Ｇ
ehring)ら、１９８５）。
ＧＲ配列地図 ヒトグルココルチコイド受容体は染色体５に機能的にマ
ッピングされている。受容体欠損マウスＴ細胞（ＥＬ
４）をヒト受容体含有Ｔ細胞（ＣＥＭ−Ｃ７）と融合さ
せることにより構成された体細胞ハイブリッドの分析か
ら、野生型ＣＥＭ−Ｃ７受容体を発現する分離体はヒト
染色体５を保持するが、デキサメサゾン耐性分離体はこ
の染色体を失っていることが示された（ゲーリング（Ｇ
ehring)ら、１９８５）。
【０１２２】本発明のｃＤＮＡクローンの信頼性を確認
するために、本発明者らはヒト染色体５のみを保有す
る、チャイニーズハムスター／ヒト体細胞ハイブリッド
（ＨＨＷ454）を用いて受容体ｃＤＮＡ配列をマッピン
グした。ヒト胎盤ＨＨＷ454ハイブリッド細胞およびチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から抽出した
ＤＮＡをＥcoＲＩまたはＨindIII制限エンドヌクレアー
ゼにより消化し、0.8％アガロースゲル上で分離した。
ニトロセルロースへ移したＤＮＡ断片をヌクレオチド57
0〜1,640から誘導される受容体コード領域の一部（第１
図）のｈＧＲ1.2を参照されたい）により試験した。ハ
イブリッド細胞系からのＤＮＡは、6.8および１７kbpの
ＣＨＯ特異性ＥcoＲＩバンドのほかに3.0および 5.0 kb
pのヒト特異性バンドをも含む（ホレンバーグ(Ｈollenb
erg）ら、１９８５の図６a、レーン２、３を参照された
い）。（ここに実験の部Ｉとして示した研究はホレンバ
ーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５として公表された。
図６および７は同報文中に示され、本明細書には示され
ていない。）意外にも9.5 kbpのＤＮＡ断片は全ヒトＤ
ＮＡ中に見出されたが、ハイブリッド系には見出されな
かった（ホレンバーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５、
図６a、レーン１を参照されたい）。同様にＨindIII消
化によって染色体５ハイブリッド細胞ＤＮＡ中に存在し
ない7.5kbp のバンドが示された（ホレンバーグ（Ｈoll
enberg）ら、１９８５、図６a 、レーン４を参照された
い）。これらの結果は、受容体ｃＤＮＡはヒト染色体５
にマッピングされるが、このゲノムの他のいずれかの位
置に付加的な受容体関連配列があることを示す。これら
の配列をマッピングするために、デュアルレーザー蛍光
活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使用し、ＤＩＰＩ／
クロモマイシン（ヘキスト33258 クロモマイシンと併
用）により染色した分裂期染色体懸濁液を識別した；こ
の方法により２４種のヒト染色体を２２画分に分離する
ことができた（レボ（Ｌebo）ら、１９８４）。染色体
を直接にニトロセルロース上に識別したのち、染色体Ｄ
ＮＡを変性し、ｈＧＲｃＤＮＡプローブにハイブリダイ
ズした。染色体５の配列確認のほかに、染色体１６上に
付加的配列が見出された。（ホレンバーグ（Ｈollenber
g）ら、1985、図６ｃを参照されたい））。この配置を
確認するために、マウス赤白血病細胞、およびヒト染色
体１６を含むマウス赤白血病細胞系（ボーデ（Bode）
ら、１９８１参照）からのＤＮＡをＨindIIIにより消化
し、ｈＧＲｃＤＮＡにより調べた（ホレンバーグ（Ｈol
lenberg）ら、1985、図６ｃを参照されたい）；予想さ
れたようにハイブリッド中に見出され、対照中には見出
されなかった唯一のＤＮＡが7.5kbpのＤＮＡ断片であ
り、これにより染色体１６の帰属が確立した（ホレンバ
ーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５、図６ｃ、レーン１、
２を参照されたい）。
するために、本発明者らはヒト染色体５のみを保有す
る、チャイニーズハムスター／ヒト体細胞ハイブリッド
（ＨＨＷ454）を用いて受容体ｃＤＮＡ配列をマッピン
グした。ヒト胎盤ＨＨＷ454ハイブリッド細胞およびチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から抽出した
ＤＮＡをＥcoＲＩまたはＨindIII制限エンドヌクレアー
ゼにより消化し、0.8％アガロースゲル上で分離した。
ニトロセルロースへ移したＤＮＡ断片をヌクレオチド57
0〜1,640から誘導される受容体コード領域の一部（第１
図）のｈＧＲ1.2を参照されたい）により試験した。ハ
イブリッド細胞系からのＤＮＡは、6.8および１７kbpの
ＣＨＯ特異性ＥcoＲＩバンドのほかに3.0および 5.0 kb
pのヒト特異性バンドをも含む（ホレンバーグ(Ｈollenb
erg）ら、１９８５の図６a、レーン２、３を参照された
い）。（ここに実験の部Ｉとして示した研究はホレンバ
ーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５として公表された。
図６および７は同報文中に示され、本明細書には示され
ていない。）意外にも9.5 kbpのＤＮＡ断片は全ヒトＤ
ＮＡ中に見出されたが、ハイブリッド系には見出されな
かった（ホレンバーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５、
図６a、レーン１を参照されたい）。同様にＨindIII消
化によって染色体５ハイブリッド細胞ＤＮＡ中に存在し
ない7.5kbp のバンドが示された（ホレンバーグ（Ｈoll
enberg）ら、１９８５、図６a 、レーン４を参照された
い）。これらの結果は、受容体ｃＤＮＡはヒト染色体５
にマッピングされるが、このゲノムの他のいずれかの位
置に付加的な受容体関連配列があることを示す。これら
の配列をマッピングするために、デュアルレーザー蛍光
活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使用し、ＤＩＰＩ／
クロモマイシン（ヘキスト33258 クロモマイシンと併
用）により染色した分裂期染色体懸濁液を識別した；こ
の方法により２４種のヒト染色体を２２画分に分離する
ことができた（レボ（Ｌebo）ら、１９８４）。染色体
を直接にニトロセルロース上に識別したのち、染色体Ｄ
ＮＡを変性し、ｈＧＲｃＤＮＡプローブにハイブリダイ
ズした。染色体５の配列確認のほかに、染色体１６上に
付加的配列が見出された。（ホレンバーグ（Ｈollenber
g）ら、1985、図６ｃを参照されたい））。この配置を
確認するために、マウス赤白血病細胞、およびヒト染色
体１６を含むマウス赤白血病細胞系（ボーデ（Bode）
ら、１９８１参照）からのＤＮＡをＨindIIIにより消化
し、ｈＧＲｃＤＮＡにより調べた（ホレンバーグ（Ｈol
lenberg）ら、1985、図６ｃを参照されたい）；予想さ
れたようにハイブリッド中に見出され、対照中には見出
されなかった唯一のＤＮＡが7.5kbpのＤＮＡ断片であ
り、これにより染色体１６の帰属が確立した（ホレンバ
ーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５、図６ｃ、レーン１、
２を参照されたい）。
【０１２３】ＯＢ７およびＯＢ１０の３’側非翻訳領域
からのＥcoＲＩ−ＸbaＩ 断片を用いた他のサザンブロ
ット分析により、染色体５のみへのハイブリダイゼーシ
ョンが明らかになった（データは示されていない）。本
発明者らは、アルファ−およびベータ−受容体ｃＤＮＡ
は共に恐らく染色体５上の単一遺伝子によってコードさ
れると結論し、これら２形態のｃＤＮＡが択一的スプラ
イシングにより生じることを示唆する。さらに本発明者
らは、染色体１６上に位置する他の遺伝子は少なくとも
ヌクレオチド 570〜1,640 においてグルココルチコイド
受容体遺伝子との相同性を有すると結論する。これらの
染色体１６上の配列が関連ステロイド受容体遺伝子、処
理された遺伝子もしくは偽遺伝子、またはグルココルチ
コイド受容体に対する遺伝子と共通の区域を共有する遺
伝子のいずれを表わすかは明らかでない。ゲノムクロー
ニングおよびＤＮＡ配列決定により解答が得られるであ
ろう。
からのＥcoＲＩ−ＸbaＩ 断片を用いた他のサザンブロ
ット分析により、染色体５のみへのハイブリダイゼーシ
ョンが明らかになった（データは示されていない）。本
発明者らは、アルファ−およびベータ−受容体ｃＤＮＡ
は共に恐らく染色体５上の単一遺伝子によってコードさ
れると結論し、これら２形態のｃＤＮＡが択一的スプラ
イシングにより生じることを示唆する。さらに本発明者
らは、染色体１６上に位置する他の遺伝子は少なくとも
ヌクレオチド 570〜1,640 においてグルココルチコイド
受容体遺伝子との相同性を有すると結論する。これらの
染色体１６上の配列が関連ステロイド受容体遺伝子、処
理された遺伝子もしくは偽遺伝子、またはグルココルチ
コイド受容体に対する遺伝子と共通の区域を共有する遺
伝子のいずれを表わすかは明らかでない。ゲノムクロー
ニングおよびＤＮＡ配列決定により解答が得られるであ
ろう。
【０１２４】グルココルチコイド受容体をコードするｍ
ＲＮＡのサイズを測定するために、ヒト線維芽細胞系Ｈ
Ｔ１０８０から分離された細胞質ｍＲＮＡを用いてノー
ザンブロットハイブリダイゼーション実験を行った(ボ
ーデ（Ｂode)ら、１９８１)。ｈＧＲ1.2コード化配列を
プローブとして用いて、5.6、6.1 および7.1kbpの多数
のｍＲＮＡを検出した。これらの細胞をグルココルチコ
イドと共に２４時間処理すると受容体ｍＲＮＡが２〜３
倍減少し、潜在的な負のフィードバック調節が示唆され
た。
ＲＮＡのサイズを測定するために、ヒト線維芽細胞系Ｈ
Ｔ１０８０から分離された細胞質ｍＲＮＡを用いてノー
ザンブロットハイブリダイゼーション実験を行った(ボ
ーデ（Ｂode)ら、１９８１)。ｈＧＲ1.2コード化配列を
プローブとして用いて、5.6、6.1 および7.1kbpの多数
のｍＲＮＡを検出した。これらの細胞をグルココルチコ
イドと共に２４時間処理すると受容体ｍＲＮＡが２〜３
倍減少し、潜在的な負のフィードバック調節が示唆され
た。
【０１２５】Ｉ.Ｄ．考察 グルココルチコイド受容体の構造分析は、この調節分子
が遺伝子の転写に作用を及ぼす機構を洞察するための前
提条件である。ここに本発明者らはｃＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列分析から推定したヒトグルココルチコ
イド受容体の一次配列を提示した。
が遺伝子の転写に作用を及ぼす機構を洞察するための前
提条件である。ここに本発明者らはｃＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列分析から推定したヒトグルココルチコ
イド受容体の一次配列を提示した。
【０１２６】ｈＧＲｃＤＮＡの分離によって、少なくと
も２形態のポリペプチドをコードする多数のｍＲＮＡの
存在が明らかになった。これらの推定蛋白質はそれらの
カルボキシ末端において、アルファ−ｈＧＲの場合は５
０個アミノ酸、ベータ−ｈＧＲの場合は１５個のアミノ
酸の置換によって異なる。アルファグルココルチコイド
受容体は数種のヒト細胞系およびｃＤＮＡライブラリー
において同定された主要な形態である。しかしノースロ
ップ（Ｎorthrop）ら(１９８５）による最近の報文で
は、これら２形態の受容体がマウスリンパ様細胞におい
て明らかにされている。マウスダブレット種に対するア
ルファ−およびベータ−ｈＧＲの関係は未確認である。
ベータ−ｈＧＲの細胞分布および潜在的機能も明らかで
ないが、変異型受容体が組織特異性の機能に用いられて
いる可能性はある。本発明者らは現在それらの組織特異
性発現を解明するために各形態のヒト受容体に特異的な
合成ペプチドに対する抗血清を生成している。
も２形態のポリペプチドをコードする多数のｍＲＮＡの
存在が明らかになった。これらの推定蛋白質はそれらの
カルボキシ末端において、アルファ−ｈＧＲの場合は５
０個アミノ酸、ベータ−ｈＧＲの場合は１５個のアミノ
酸の置換によって異なる。アルファグルココルチコイド
受容体は数種のヒト細胞系およびｃＤＮＡライブラリー
において同定された主要な形態である。しかしノースロ
ップ（Ｎorthrop）ら(１９８５）による最近の報文で
は、これら２形態の受容体がマウスリンパ様細胞におい
て明らかにされている。マウスダブレット種に対するア
ルファ−およびベータ−ｈＧＲの関係は未確認である。
ベータ−ｈＧＲの細胞分布および潜在的機能も明らかで
ないが、変異型受容体が組織特異性の機能に用いられて
いる可能性はある。本発明者らは現在それらの組織特異
性発現を解明するために各形態のヒト受容体に特異的な
合成ペプチドに対する抗血清を生成している。
【０１２７】免疫陽性ファージＤＮＡ挿入配列ｈＧＲ
1.2Ａをプローブとして用いて選ばれたcＤＮＡ には、
ヌクレオチド３１０１にあるＡＡＴＡＡＡを用いてポリ
アデニル化がより早期に信号化されている点以外はＯＢ
７と同様な３’末端を含むものがある。これらのクロー
ンはヒト線維芽細胞および胎盤双方のライブラリーから
分離された（データは示されていない）。択一的ポリ
（Ａ）部位の選択は多くの真核転写ユニットの特色であ
る（ダーネル（Ｄarnell）１９８２）。ある場合にはポ
リ（Ａ）部位の選択によって特定のポリペプチド生成物
が定められる（アマラ（Ａmara）ら、１９８２；ローゼ
ンフィールド（Ｒosenfeld）ら、１９８３；アルト（Ａ
lt）ら、１９８０；シュワルツバウエル(Ｓchwarzbaue
r）ら、１９８３)が、他の場合にはいずれかのポリ
（Ａ）部位の選択によってポリペプチドの一次構造に何
ら変化が生じない（ゼッツエル（Ｓetzer）ら、１９８
２）。受容体の転写に際してポリ（Ａ）部位の選択は
（１）特定の組織におけるｍＲＮＡの安定性を変える
か、（２）スプライシングを変化させるか、または
（３）ランダムであり、生理学的結果を生じない。
1.2Ａをプローブとして用いて選ばれたcＤＮＡ には、
ヌクレオチド３１０１にあるＡＡＴＡＡＡを用いてポリ
アデニル化がより早期に信号化されている点以外はＯＢ
７と同様な３’末端を含むものがある。これらのクロー
ンはヒト線維芽細胞および胎盤双方のライブラリーから
分離された（データは示されていない）。択一的ポリ
（Ａ）部位の選択は多くの真核転写ユニットの特色であ
る（ダーネル（Ｄarnell）１９８２）。ある場合にはポ
リ（Ａ）部位の選択によって特定のポリペプチド生成物
が定められる（アマラ（Ａmara）ら、１９８２；ローゼ
ンフィールド（Ｒosenfeld）ら、１９８３；アルト（Ａ
lt）ら、１９８０；シュワルツバウエル(Ｓchwarzbaue
r）ら、１９８３)が、他の場合にはいずれかのポリ
（Ａ）部位の選択によってポリペプチドの一次構造に何
ら変化が生じない（ゼッツエル（Ｓetzer）ら、１９８
２）。受容体の転写に際してポリ（Ａ）部位の選択は
（１）特定の組織におけるｍＲＮＡの安定性を変える
か、（２）スプライシングを変化させるか、または
（３）ランダムであり、生理学的結果を生じない。
【０１２８】ここに記載したインビトロ翻訳実験から、
クローニングされた分子が完全なグルココルチコイド受
容体をコードするという直接的証明が得られる。第１に
インビトロ翻訳生成物はサイズが天然のグルココルチコ
イド受容体と等しく、受容体特異性抗血清と免疫学的に
反応する。第２に、インビトロ翻訳された蛋白質は、合
成グルココルチコイドであるトリアムシノロンアセトニ
ドを選択的に結合されるいう点で、機能的にグルココル
チコイド受容体として作用する。この結合グルココルチ
コイド、グルココルチコイド同族体およびプロゲステロ
ンにより特異的に競合されるが、性ステロイドであるテ
ストステロンおよびエストロゲンによっては競合されな
い。この点に関して、インビトロ翻訳された受容体はヒ
トリンパ様細胞から得たインビボ受容体と等しい挙動を
示し、クローニングされた分子に関する機能の第１の証
拠を与える。ステロイド結合性の獲得は何ら特定の修飾
を要しないと思われるが、これが必要であったとしても
これらの修飾はインビトロ翻訳混合物中で行われる。
クローニングされた分子が完全なグルココルチコイド受
容体をコードするという直接的証明が得られる。第１に
インビトロ翻訳生成物はサイズが天然のグルココルチコ
イド受容体と等しく、受容体特異性抗血清と免疫学的に
反応する。第２に、インビトロ翻訳された蛋白質は、合
成グルココルチコイドであるトリアムシノロンアセトニ
ドを選択的に結合されるいう点で、機能的にグルココル
チコイド受容体として作用する。この結合グルココルチ
コイド、グルココルチコイド同族体およびプロゲステロ
ンにより特異的に競合されるが、性ステロイドであるテ
ストステロンおよびエストロゲンによっては競合されな
い。この点に関して、インビトロ翻訳された受容体はヒ
トリンパ様細胞から得たインビボ受容体と等しい挙動を
示し、クローニングされた分子に関する機能の第１の証
拠を与える。ステロイド結合性の獲得は何ら特定の修飾
を要しないと思われるが、これが必要であったとしても
これらの修飾はインビトロ翻訳混合物中で行われる。
【０１２９】ここに示した結果は真核細胞の転写調節蛋
白質とその標的遺伝子の分子レベルでの相互作用を研究
するために必要な情報を提供した。これらの構造研究か
ら、グルココルチコイド受容体、その遺伝子、およびそ
のＲＮＡ生成物を分析しうる基礎が得られる。さらにイ
ンビトロで受容体を発現しうることにより、特異的イン
ビトロ突然変異生成の結果を速やかに試験しうる新規な
方法が得られる。最後に突然変異生成および蛋白質結合
双方の実験によるグルココルチコイドおよび特異的調節
要素に応答する遺伝子の分離から、この蛋白質が誘導性
真核遺伝子調節の分析に対するきわめて有用なモデルと
して役立つことが示唆される。
白質とその標的遺伝子の分子レベルでの相互作用を研究
するために必要な情報を提供した。これらの構造研究か
ら、グルココルチコイド受容体、その遺伝子、およびそ
のＲＮＡ生成物を分析しうる基礎が得られる。さらにイ
ンビトロで受容体を発現しうることにより、特異的イン
ビトロ突然変異生成の結果を速やかに試験しうる新規な
方法が得られる。最後に突然変異生成および蛋白質結合
双方の実験によるグルココルチコイドおよび特異的調節
要素に応答する遺伝子の分離から、この蛋白質が誘導性
真核遺伝子調節の分析に対するきわめて有用なモデルと
して役立つことが示唆される。
【０１３０】Ｉ.Ｅ．実験の部Ｉに述べた図に関する 詳
細な説明 第１および２図 ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ配列決定法およ
びｃＤＮＡクローンの模式図。１．アルファグルココル
チコイド受容体に対する複合ｃＤＮＡを最上部に示し、
非コード化配列（直線）およびコード化配列（点彩部
分）を示す。共通の６ヌクレオチド制限酵素部位を示
す。配列を決定するために用いた重複ｃＤＮＡ挿入配列
が示され、配列決定された領域の下方の矢印は配列決定
の方向および範囲を表わす。ＯＢ１０の３’末端の破線
は相違する配列を示す。数字はＯＢ１０において５’側
寄りの転写された配列に対するヌクレオチドの位置を意
味する。２．アルファ形およびベータ形の受容体をコー
ドするｃＤＮＡ（それぞれＯＢ７およびＯＢ１０)。Ｏ
Ｂ７の５'末端（破線）はＯＢ１０クローンにより与え
られる。蛋白質コード化情報は幅広い棒により表わさ
れ；非翻訳配列は細い棒により示される。ヌクレオチド
およびアミノ酸はコード化配列のそれぞれ上方および下
方に番号が示される。共通ＤＮＡ配列はヌクレオチド
2,313（アミノ酸残基７２７）にまで及び、この地点で
アルファ形とベータ形の受容体が分かれ、アルファｃＤ
ＮＡ（ＯＢ１２，ＯＢ７）は１５０個のヌクレオチド
（５０個のアミノ酸）のオープンリーディングフレーム
へと続き、ベータｃＤＮＡ（ＯＢ１０）は４５個のヌク
レオチド（１５個のアミノ酸）へと続く（第５（Ｂ）図
参照）。これらのクローンにおいてポリ（Ａ）のすぐ上
流にヘキサヌクレオチド信号（ＡＡＴＡＡＡ）が示され
ており、ＯＢ７の最初のヘキサヌクレオチドはＯＢ１２
においてポリ（Ａ）として作用する。
細な説明 第１および２図 ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ配列決定法およ
びｃＤＮＡクローンの模式図。１．アルファグルココル
チコイド受容体に対する複合ｃＤＮＡを最上部に示し、
非コード化配列（直線）およびコード化配列（点彩部
分）を示す。共通の６ヌクレオチド制限酵素部位を示
す。配列を決定するために用いた重複ｃＤＮＡ挿入配列
が示され、配列決定された領域の下方の矢印は配列決定
の方向および範囲を表わす。ＯＢ１０の３’末端の破線
は相違する配列を示す。数字はＯＢ１０において５’側
寄りの転写された配列に対するヌクレオチドの位置を意
味する。２．アルファ形およびベータ形の受容体をコー
ドするｃＤＮＡ（それぞれＯＢ７およびＯＢ１０)。Ｏ
Ｂ７の５'末端（破線）はＯＢ１０クローンにより与え
られる。蛋白質コード化情報は幅広い棒により表わさ
れ；非翻訳配列は細い棒により示される。ヌクレオチド
およびアミノ酸はコード化配列のそれぞれ上方および下
方に番号が示される。共通ＤＮＡ配列はヌクレオチド
2,313（アミノ酸残基７２７）にまで及び、この地点で
アルファ形とベータ形の受容体が分かれ、アルファｃＤ
ＮＡ（ＯＢ１２，ＯＢ７）は１５０個のヌクレオチド
（５０個のアミノ酸）のオープンリーディングフレーム
へと続き、ベータｃＤＮＡ（ＯＢ１０）は４５個のヌク
レオチド（１５個のアミノ酸）へと続く（第５（Ｂ）図
参照）。これらのクローンにおいてポリ（Ａ）のすぐ上
流にヘキサヌクレオチド信号（ＡＡＴＡＡＡ）が示され
ており、ＯＢ７の最初のヘキサヌクレオチドはＯＢ１２
においてポリ（Ａ）として作用する。
【０１３１】第１および２図の方法 挿入配列ｈＧＲ 1.2、ｈＧＲ 2.9 およびｈＧＲ 5.16
を前記に従ってラムダgtｌｌＩＭ−９リンパ様細胞ｃＤ
ＮＡライブラリーから分離した(ワインバーガー(Ｗeinb
erger）ら、１９８５)。２種のクローンが pcＤにおいて
Ｈ．オカヤマにより（オカヤマ（Ｏkayama）ら、１９８
３)、ＧＭ６３７ヒト線維芽細胞(ＯＢ７)および一次ヒ
ト線維芽細胞（ＯＢ１０）からのポリ（Ａ)+ｍＲＮＡを
用いて構成されたcＤＮＡライブラリーから分離され
た。スクリーニングは 32Ｐ−dＣＴＰを用いるニックト
ランスレーションにより放射性標識されたｈＧＲ1.2−c
ＤＮＡを用いて行われた。マキサム（Ｍaxam）およびギ
ルバート（Ｇiblbert）(1977）の化学的開裂法により配
列が決定された。
を前記に従ってラムダgtｌｌＩＭ−９リンパ様細胞ｃＤ
ＮＡライブラリーから分離した(ワインバーガー(Ｗeinb
erger）ら、１９８５)。２種のクローンが pcＤにおいて
Ｈ．オカヤマにより（オカヤマ（Ｏkayama）ら、１９８
３)、ＧＭ６３７ヒト線維芽細胞(ＯＢ７)および一次ヒ
ト線維芽細胞（ＯＢ１０）からのポリ（Ａ)+ｍＲＮＡを
用いて構成されたcＤＮＡライブラリーから分離され
た。スクリーニングは 32Ｐ−dＣＴＰを用いるニックト
ランスレーションにより放射性標識されたｈＧＲ1.2−c
ＤＮＡを用いて行われた。マキサム（Ｍaxam）およびギ
ルバート（Ｇiblbert）(1977）の化学的開裂法により配
列が決定された。
【０１３２】第３および４図 ヒトグルココルチコイド受容体のｃＤＮＡおよび推定蛋
白質配列。完全なアルファコード化配列およびＯＢ７の
３’側非翻訳領域を図示し、推定アミノ酸を長いオープ
ンリーディングフレームの上方に示す。ヌクレオチド１
２１−１２３における上流フレーム内終止コドンおよび
ＯＢ７における推定の付加的ポリアデニル化信号に下線
を施した。
白質配列。完全なアルファコード化配列およびＯＢ７の
３’側非翻訳領域を図示し、推定アミノ酸を長いオープ
ンリーディングフレームの上方に示す。ヌクレオチド１
２１−１２３における上流フレーム内終止コドンおよび
ＯＢ７における推定の付加的ポリアデニル化信号に下線
を施した。
【０１３３】第５（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトグルココルチコイド受容体ベータｃＤＮＡの３’側
の制限地図およびヌクレオチド配列。Ａ．共通の６ヌク
レオチド制限酵素部位をＯＢ１０の３’側非翻訳領域に
つき示す。ベータ形（ＯＢ１０）のヌクレオチド2,281
から3,820までのcＤＮＡ配列をアルファ形（ＯＢ７）の
３’末端コード化部分に見られる蛋白質コード化情報と
比較したもの。各ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸
をヌクレオチド配列の上方に示す。ＯＢ１０の３’側非
翻訳配列における推定ポリアデニル化信号（ＡＡＴＡＡ
Ａ）に下線を施した。
の制限地図およびヌクレオチド配列。Ａ．共通の６ヌク
レオチド制限酵素部位をＯＢ１０の３’側非翻訳領域に
つき示す。ベータ形（ＯＢ１０）のヌクレオチド2,281
から3,820までのcＤＮＡ配列をアルファ形（ＯＢ７）の
３’末端コード化部分に見られる蛋白質コード化情報と
比較したもの。各ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸
をヌクレオチド配列の上方に示す。ＯＢ１０の３’側非
翻訳配列における推定ポリアデニル化信号（ＡＡＴＡＡ
Ａ）に下線を施した。
【０１３４】第６（Ａ）および（Ｂ）図 インビトロにおいて翻訳されたｈＧＲと細胞抽出物から
のインビボｈＧＲのイムノブロット比較。Ａ．ｈＧＲｃ
ＤＮＡ配列インビトロ転写のために構成されたベクタ
ー。完全なアルファ（pＧＲ１０７）およびベータ（pＧ
Ｒ１０８）コード化配列は pＧＥＭ１中のＳＰ６プロモ
ーターの転写制御下に置かれた。ベクター配列、非コー
ド化ｃＤＮＡ配列、およびコード化配列はそれぞれ細い
直線、太い棒、および四角で囲った領域により示され
る。約６０個のヌクレオチドのポリ（Ａ）領域をＡpiに
より示す。異なるコード化配列は斜線領域および点彩領
域により示される。Ｂ．インビトロ翻訳生成物および細
胞抽出物のウェスタンブロット分析。ＲＮＡを添加して
（レーン１）または pＧＲ１０８から（ベータ、レーン
２）もしくは pＧＲ１０７から（アルファ、レーン３）
合成されたＲＮＡを添加して家兎の網赤血球溶解系にお
いて合成した非標識翻訳生成物を7.5 ％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上で分画した。他のレーンは下記のも
のである。ＩＭ−９（レーン４）、１μＭトリアムシノ
ロンアセトニドで処理したＩＭ−９（レーン５）、Ｈe
Ｌa（レーン６）、ＡＤＲ６．Ｍ１８９０．ＡＤ１マウ
スリンパ腫（レーン７）、Ｓ４９マウスリンパ腫（レー
ン８）およびＥＬ４リンパ腫（レーン９）からの細胞質
抽出物。蛋白質をニトロセルロースに移し、 抗ｈＧＲ抗
体、次いで125Ｉ標識黄色ぶどう球菌（Ｓtaphylococcus
aureus）蛋白質Ａにより前記に従って試験した（ワイ
ンバーガー（Ｗeinberger）ら、１９８５）。
のインビボｈＧＲのイムノブロット比較。Ａ．ｈＧＲｃ
ＤＮＡ配列インビトロ転写のために構成されたベクタ
ー。完全なアルファ（pＧＲ１０７）およびベータ（pＧ
Ｒ１０８）コード化配列は pＧＥＭ１中のＳＰ６プロモ
ーターの転写制御下に置かれた。ベクター配列、非コー
ド化ｃＤＮＡ配列、およびコード化配列はそれぞれ細い
直線、太い棒、および四角で囲った領域により示され
る。約６０個のヌクレオチドのポリ（Ａ）領域をＡpiに
より示す。異なるコード化配列は斜線領域および点彩領
域により示される。Ｂ．インビトロ翻訳生成物および細
胞抽出物のウェスタンブロット分析。ＲＮＡを添加して
（レーン１）または pＧＲ１０８から（ベータ、レーン
２）もしくは pＧＲ１０７から（アルファ、レーン３）
合成されたＲＮＡを添加して家兎の網赤血球溶解系にお
いて合成した非標識翻訳生成物を7.5 ％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上で分画した。他のレーンは下記のも
のである。ＩＭ−９（レーン４）、１μＭトリアムシノ
ロンアセトニドで処理したＩＭ−９（レーン５）、Ｈe
Ｌa（レーン６）、ＡＤＲ６．Ｍ１８９０．ＡＤ１マウ
スリンパ腫（レーン７）、Ｓ４９マウスリンパ腫（レー
ン８）およびＥＬ４リンパ腫（レーン９）からの細胞質
抽出物。蛋白質をニトロセルロースに移し、 抗ｈＧＲ抗
体、次いで125Ｉ標識黄色ぶどう球菌（Ｓtaphylococcus
aureus）蛋白質Ａにより前記に従って試験した（ワイ
ンバーガー（Ｗeinberger）ら、１９８５）。
【０１３５】第６（Ａ）および（Ｂ）図の方法 第３および４図に示したアルファコード化配列全体を含
む発現ベクターを構成するために、ＯＢ７の３’側コー
ド化配列をＯＢ１０の５’側コード化配列に融合させ
た。ＯＢ７をＥcoＲＩにより部分的に消化し、ＸbaＩに
よって完全に消化し、1.20 kbpの断片をゲル精製してＥ
coＲＩ／ＸbaＩ消化ＯＢ１０とリゲートさせて、中間体
pＯＢ１０７を得た。５'側ポリ（Ｇ）領域(１１個のヌ
クレオチド、nt）および３’側ポリ（Ａ）領域（約６０
個のnt）を含む全pＯＢ１０７ｃＤＮＡ配列を部分Ｐst
Ｉ／完全 ＢamＨＩ消化により切断した。得られた 3.5k
bpの断片をゲル精製し、pＧＥＭ１(プロメガ・バイオテ
ク)の ＰstＩおよびＢamＨＩ部位間に挿入して pＧＲ１
０７を得た。プラスミド pＧＲ１０８は直接に pＯＢ１
０から、部分ＰstＩ／完全ＢamＨＩ消化し、得られたｃ
ＤＮＡ挿入配列を pＧＥＭ１の対応する部位へ挿入する
ことにより構成された。キャップ付きＳＰ６転写体はＰ
vuＩＩ−直線化された pＧＲ１０７およびpＧＲ１０８
からクリーブ（Ｋrieg）およびメルトン（Ｍelton）(１
９８４)の記載に従って合成され、ＧＴＰ濃度を４００
μＭから１００μＭに低下させかつm7ＧppＧ（ファルマ
シア）を５００μＭまで添加することにより同時キャッ
ピングが行われた。転写体をＰ６０クロマトグラフィー
により精製し、ミクロコッカスヌクレアーゼ処理した家
兎網赤血球溶解物（プロメガ・バイオテク）により、製
造業者が指示する条件で翻訳した。ステロイド処理細胞
からのＩＭ−９サイトゾルの調製は先に報告されたとお
りである（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、１９８
５）。サイズマーカーはホスフォリラーゼＢ（９７
Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６６Ｋ）および卵アルブミ
ン（４５Ｋ）であった。
む発現ベクターを構成するために、ＯＢ７の３’側コー
ド化配列をＯＢ１０の５’側コード化配列に融合させ
た。ＯＢ７をＥcoＲＩにより部分的に消化し、ＸbaＩに
よって完全に消化し、1.20 kbpの断片をゲル精製してＥ
coＲＩ／ＸbaＩ消化ＯＢ１０とリゲートさせて、中間体
pＯＢ１０７を得た。５'側ポリ（Ｇ）領域(１１個のヌ
クレオチド、nt）および３’側ポリ（Ａ）領域（約６０
個のnt）を含む全pＯＢ１０７ｃＤＮＡ配列を部分Ｐst
Ｉ／完全 ＢamＨＩ消化により切断した。得られた 3.5k
bpの断片をゲル精製し、pＧＥＭ１(プロメガ・バイオテ
ク)の ＰstＩおよびＢamＨＩ部位間に挿入して pＧＲ１
０７を得た。プラスミド pＧＲ１０８は直接に pＯＢ１
０から、部分ＰstＩ／完全ＢamＨＩ消化し、得られたｃ
ＤＮＡ挿入配列を pＧＥＭ１の対応する部位へ挿入する
ことにより構成された。キャップ付きＳＰ６転写体はＰ
vuＩＩ−直線化された pＧＲ１０７およびpＧＲ１０８
からクリーブ（Ｋrieg）およびメルトン（Ｍelton）(１
９８４)の記載に従って合成され、ＧＴＰ濃度を４００
μＭから１００μＭに低下させかつm7ＧppＧ（ファルマ
シア）を５００μＭまで添加することにより同時キャッ
ピングが行われた。転写体をＰ６０クロマトグラフィー
により精製し、ミクロコッカスヌクレアーゼ処理した家
兎網赤血球溶解物（プロメガ・バイオテク）により、製
造業者が指示する条件で翻訳した。ステロイド処理細胞
からのＩＭ−９サイトゾルの調製は先に報告されたとお
りである（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、１９８
５）。サイズマーカーはホスフォリラーゼＢ（９７
Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６６Ｋ）および卵アルブミ
ン（４５Ｋ）であった。
【０１３６】第７図 インビトロ翻訳されたアルファ−ｈＧＲのステロイド結
合性。ＩＭ−９サイトゾル抽出物（点彩した棒）および
ＳＰ６産生アルファ−ｈＧＲ ＲＮＡを含む網赤血球溶
解物（ＧＲ１０７；無地の棒）への結合を示す。各棒は
１００倍過剰の各種ステロイド競合体を用いて測定した
結合 3Ｈ−トリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）を表わ
す；非標識ＴＡを競合体として用いて１００％の競合が
測定された。各値は３回測定の平均を表わし、誤差の棒
はＰ＜0.05を示す。ステロイド系競合体はデキサメサゾ
ン(Ｄex)、コルチゾル(Ｃort)、プロゲステロン(Ｐro
g)、テストステロン（Ｔest）、およびエストラジオー
ル（Ｏest）である。
合性。ＩＭ−９サイトゾル抽出物（点彩した棒）および
ＳＰ６産生アルファ−ｈＧＲ ＲＮＡを含む網赤血球溶
解物（ＧＲ１０７；無地の棒）への結合を示す。各棒は
１００倍過剰の各種ステロイド競合体を用いて測定した
結合 3Ｈ−トリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）を表わ
す；非標識ＴＡを競合体として用いて１００％の競合が
測定された。各値は３回測定の平均を表わし、誤差の棒
はＰ＜0.05を示す。ステロイド系競合体はデキサメサゾ
ン(Ｄex)、コルチゾル(Ｃort)、プロゲステロン(Ｐro
g)、テストステロン（Ｔest）、およびエストラジオー
ル（Ｏest）である。
【０１３７】第７図の方法 結合アッセイは１０ mＭトリス−ＨＣｌ pＨ7.4，１０
０mＭ・ＮaＣｌ，１mＭＥＤＴＡ，１０mＭモリブテン酸
ナトリウム、１０mＭジチオトレイトール、１５０mＭ3
Ｈ−ＴＡ（２０Ｃi mmol-1；アメルシャム）を含有する
１００μｌ、および翻訳混合物１０μｌまたは新鮮なＩ
Ｍ−９シストゾル１００μｇ中で行なわれた。非標識競
合体（１５μＭ）を指示に従って添加した。０℃で２時
間後に５０％デキストラン被覆活性炭５μｌにより５分
ずつ２回抽出して未結合ステロイドを除去し、計数し
た。アルファグルココルチコイド受容体（ＧＲ１０７）
に対する非競合値および完全競合値はそれぞれ４９０お
よび２９０c.p.m.であった。転写体を添加せずに、また
はベータ受容体ＳＰ６ ＲＮＡ（ＧＲ１０８）を用いて
プログラムした網赤血球溶解物翻訳混合物は競合性 3Ｈ
−ＴＡ結合を含まなかった。
０mＭ・ＮaＣｌ，１mＭＥＤＴＡ，１０mＭモリブテン酸
ナトリウム、１０mＭジチオトレイトール、１５０mＭ3
Ｈ−ＴＡ（２０Ｃi mmol-1；アメルシャム）を含有する
１００μｌ、および翻訳混合物１０μｌまたは新鮮なＩ
Ｍ−９シストゾル１００μｇ中で行なわれた。非標識競
合体（１５μＭ）を指示に従って添加した。０℃で２時
間後に５０％デキストラン被覆活性炭５μｌにより５分
ずつ２回抽出して未結合ステロイドを除去し、計数し
た。アルファグルココルチコイド受容体（ＧＲ１０７）
に対する非競合値および完全競合値はそれぞれ４９０お
よび２９０c.p.m.であった。転写体を添加せずに、また
はベータ受容体ＳＰ６ ＲＮＡ（ＧＲ１０８）を用いて
プログラムした網赤血球溶解物翻訳混合物は競合性 3Ｈ
−ＴＡ結合を含まなかった。
【０１３８】他の図 ここに実験の部Ｉとして提示した科学研究はＮature，
３１８：６３５−６４１（１９８５）に発表された。そ
の Ｎature の報文はこの実験例に含まれない２図を含
む。それらの図は図６、ｈＧＲｃＤＮＡの染色体マッピ
ング分析；図７、ｈＧＲｃＤＮＡのノーザーンブロット
分析である。
３１８：６３５−６４１（１９８５）に発表された。そ
の Ｎature の報文はこの実験例に含まれない２図を含
む。それらの図は図６、ｈＧＲｃＤＮＡの染色体マッピ
ング分析；図７、ｈＧＲｃＤＮＡのノーザーンブロット
分析である。
【０１３９】Ｉ．Ｆ．実験の部Ｉで参照した参考文献 １．Ａlt，Ｆ．Ｗ.，et al.，Ｃell，２０：２９３−３
０１（１９８３）。 ２．Ａmara，Ｓ．Ｇ.，Ｊonas，Ｖ.，Ｒosenfeld，Ｍ．
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２９８：２４０−２４４（１９８２）。 ３．Ｂaerji，Ｊ.，Ｏlson,Ｌ.，and Ｓchaffner，
Ｗ.，Ｃell，３３：７２９−７４０（１９８３）。 ４．Ｂenoist，Ｃ.，and Ｃhambon，Ｐ.，Ｎature，２
９８：３０４−３１０（１９８１）。 ５．Ｂode．Ｕ.，Ｄeisseroth，Ａ.，and Ｈendrik，
Ｄ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad.Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７８：２
８１５−２８１９（１９８１）。 ６．Ｂourgeois，Ｓ.，and Ｎewby，Ｒ.Ｆ.，Ｃell，
１１：４２３−４３０（１９７７）。 ７．Ｃarlstedt−Ｄuke，Ｊ.，Ｏkret，Ｓ.，Ｗrange，
Ｏ.，and Ｇustafsson，Ｊ.−Ａ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａc
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and Ｇehring，Ｕ.，ＥＭＢＯ Ｊ．，１：２８５−２
８９（１９８２）。 12．Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，Ｂirnberg，Ｎ．Ｃ.，and Ｒos
enfeld，Ｍ．Ｇ.，Ｐroc .Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.
Ａ.，７９：７６５９−７６３３（１９８２）。 13．Ｇametchu，Ｂ.，and Ｈarrison，Ｒ．Ｗ.，Ｅndo
crinology，１１４：２７４−２７９（１９８４）。 14．Ｇehring，Ｕ.，and Ｈotz，Ａ.,Ｂiochemistry，
２２:４０１３−４０１８（１９８３）。 15．Ｇehring，Ｕ.，Ｓegnitz，Ｂ.，Ｆoellmer，Ｂ.，
and Ｆrancke，Ｕ.，Ｐr oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ．
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Ｊ.，Ｐroc． Ｎatl．Ａ cad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７９：
５１５７−５１６１（１９８２）。 17．Ｇrosschedl，Ｒ.，and Ｂirnstiel，Ｍ.Ｌ. ,Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７７：７１０２−
７１０６（１９８０）。 18．Ｇrove，Ｊ.Ｒ.，Ｄieckmann，Ｂ.Ｓ.，Ｓchroer，
Ｔ.Ａ.，and Ｒingold，Ｇ.Ｍ.，Ｃell，２１：４７−
５６（１９８０）。 19．Ｈagr，Ｌ．Ｊ.，and Ｐalmiter，Ｒ．Ｄ.，Ｎatu
re，２９１：３４０−３４２（１９８１）。 20．Ｈarmon，Ｊ．Ｍ.，et al.，Ｃancer Ｒes.，４
４：４５４０−４５４７（１９８４）。 21．Ｋarin，Ｍ.，Ａnderson，Ｒ．Ｄ.，Ｓlater，
Ｅ.，Ｓmith，Ｋ.，and Ｈerschman，Ｈ．Ｒ.，Ｎatur
e，２８６：２９５−２９７（１９８０）。 22．Ｋarin，Ｍ.，et al.，Ｎature，３０８：５１３−
５１９（１９８４）。 23．Ｋrieg，Ｐ.Ａ.，and Ｍelton，Ｄ.Ａ.，Ｎucleic
Ａcids Ｒes.，１２：７０５７−７０７０（１９８
４）。 24．Ｋurtz，Ｄ．Ｔ.，and Ｆeigelson，Ｐ.，Ｐroc．
Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ .Ｓ.Ａ.，７４：４７９１−４
７９５（１９７７）。 25．Ｌaimonis，Ｌ．Ａ.，Ｋhoury，Ｇ.，Ｇorman，
Ｃ.，Ｈoward，Ｂ.，andＧruss，Ｐ.，Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７９：６４５３−６４５７
（１９８２）。 26．Ｌebo，Ｒ．Ｖ．，and Ｂastian，Ａ．Ｍ.，Ｃyto
metry，３：２１３−２１９（１９８２）。 27．Ｌebo，Ｒ．Ｖ.，et al.，Ｓcience，２２５：５７
−５９（１９８４）。 28. Ｍaxam，Ａ.，and Ｇilbert，Ｗ.，Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,７４：５６０−５６４（１９
７７）。 29．Ｍiesfeld，Ｒ.，et al.，Ｎature，３１２：７７
９−７８１（１９８４）。 30．Ｎorthrop，Ｊ．Ｐ.，Ｇametchu，Ｂ.，Ｈarriso
n，Ｒ．Ｗ.，and Ｒingold，Ｇ．Ｍ.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhe
m.，２６０：６３９８−６４０３（１９８５）。 31．Ｏkayama，Ｈ.，and Ｂerg，Ｐ.，Ｍolec．Ｃel
l．Ｂiol.，３：２８０−２８９（１９８３）。 32．Ｏkret，Ｓ.，Ｃarlstedt−Ｄuke，Ｊ.，Ｗrange，
Ｏ.，Ｃarlstrom，Ｋ.，and Ｇustafsson，Ｊ.−Ａ.，
Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta，６７７：２０５−２１９
（１９８１）。 33．Ｏstrowski．Ｍ.Ｃ.，Ｈuang，Ａ.Ｌ.，Ｋessel，
Ｍ.，Ｗoolford，Ｒ.Ｇ.，and Ｈager，Ｇ.Ｌ.，ＥＭＢ
Ｏ Ｊ.，３：１８９１−１８９９(１９８４)。 34．Ｐarks，Ｗ.Ｐ.，Ｓcolnick，Ｅ.Ｍ.，and Ｋoziko
wski，Ｅ.Ｈ.，Ｓcience，１８４：１５８−１６０（１
９７４）。 35．Ｐayvar，Ｆ.，et al.，Ｃell，３５：３８１−３
９２（１９８３）。 36．Ｐfahl，Ｍ.，Ｃell，３１：４７５−４８２（１９
８２）。 37．Ｒingold，Ｇ.Ｍ.，Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，Ｔomkin
s，Ｇ.Ｍ.，Ｂishop，Ｊ．Ｍ.，and Ｖarmus，Ｈ．
Ｅ.，Ｃell，６：２９９−３０５（１９７５）。 38．Ｒobins，Ｄ.Ｍ.，Ｐack，Ｉ.，Ｓeeburg，Ｐ.
Ｈ.，and Ａzel，Ｒ.，Ｃell２９：６２３−６３１（１
９８２）。 39．Ｒosenfeld，Ｍ.Ｇ.，et al.，Ｎature，３０４:１
２９−１３５(１９８３)。40．Ｒousseau，Ｇ.Ｇ.，Ｂa
xter，Ｊ.Ｄ.，and Ｔomkins，Ｇ.Ｍ.，Ｊ.Ｍole c．Ｂi
ol.，６７：９９−１１５（１９７２）。 41．Ｓcheidereit，Ｃ.，Ｇeisse，Ｓ.，Ｗestphal，
Ｈ.Ｍ.，and Ｂeato，Ｍ.，Ｎature，３８４：７４９−
７５２（１９８３）。 42．Ｓchwarzbauer，Ｊ．Ｅ.，Ｔamkun，Ｊ．Ｗ.，Ｌem
ischka，Ｉ．Ｒ.，andＨynes，Ｒ．Ｏ.，Ｃell，３５：
４２１−４３１（１９８３）。 43．Ｓetzer，Ｄ.Ｒ.，ＭcＧrogan，Ｍ.，and Ｓchimk
e，Ｒ.Ｔ.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２５７：５１４３−５
１４７（１９８２）。 44．Ｓimons，Ｓ．Ｓ.，and Ｔhompson，Ｅ．Ｂ.，Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７８：３５４１−
３５４５（１９８１）。 45．Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｍellon，Ｓ.Ｈ.，and Ｂaxt
er，Ｊ.Ｄ.，Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.，２５７：１１６２７−
１１６３２（１９８２）。 46．Ｔhomas，Ｐ.Ｓ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
Ｕ.Ｓ.Ａ.,７７：５２０１−５２０５（１９８０）。 47．Ｗeinberger，Ｃ.，Ｈollenberg，Ｓ．Ｍ.，Ｒosen
feld，Ｍ．Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，Ｎature，３１
８：６７０−６７２（１９８５b）。 48．Ｗeinberger，Ｃ.，et al．Ｓcience,２２８:７４
０−７４２(１９８５a)。 49．Ｗestphal，Ｈ.Ｍ.，Ｍoldenhauer，Ｇ.，and Ｂea
to，Ｍ.，ＥＭＢＯ Ｊ.,１：１４６７−１４７１（１９
８２）。 50．Ｗrange，Ｏ.，Ｃarlstedt−Ｄuke，Ｊ.，and Ｇu
stafsson，Ｊ.−Ａ.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２５４：９
２８４−９２９０（１９７９）。 51．Ｗyange，Ｏ.，Ｏkret，Ｓ.，Ｒadojcic，Ｍ.，Ｃa
rlstedt−Ｄuke，ｊ.，and Ｇustafsson,Ｊ.−Ａ.,Ｊ.
Ｂiol．Ｃhem.,２５９：４５３４−４５４１（１９８
４）。 52．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，Ｓtampfer，Ｍ.Ｒ.，and Ｔom
kins，Ｇ.Ｍ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.
Ａ.，７１：３９０１−３９０５(１９７４)。
０１（１９８３）。 ２．Ａmara，Ｓ．Ｇ.，Ｊonas，Ｖ.，Ｒosenfeld，Ｍ．
Ｇ.，Ｏng，Ｅ．Ｓ.，and Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，Ｎature，
２９８：２４０−２４４（１９８２）。 ３．Ｂaerji，Ｊ.，Ｏlson,Ｌ.，and Ｓchaffner，
Ｗ.，Ｃell，３３：７２９−７４０（１９８３）。 ４．Ｂenoist，Ｃ.，and Ｃhambon，Ｐ.，Ｎature，２
９８：３０４−３１０（１９８１）。 ５．Ｂode．Ｕ.，Ｄeisseroth，Ａ.，and Ｈendrik，
Ｄ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad.Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７８：２
８１５−２８１９（１９８１）。 ６．Ｂourgeois，Ｓ.，and Ｎewby，Ｒ.Ｆ.，Ｃell，
１１：４２３−４３０（１９７７）。 ７．Ｃarlstedt−Ｄuke，Ｊ.，Ｏkret，Ｓ.，Ｗrange，
Ｏ.，and Ｇustafsson，Ｊ.−Ａ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,７９:４２６０−４２６４（１９
８２）。 ８．Ｃhandler，Ｖ．Ｌ.，Ｍaler，Ｂ．Ａ.，and Ｙam
amoto，Ｋ．Ｒ.，Ｃell，３３：４８９−４９９（１９
８３）。 ９．Ｄanielsen，Ｍ.，and Ｓtallcup，Ｍ．Ｒ.，Ｍol
e．Ｃell．Ｂiol.，４：４４９−４５３（１９８４）。 10. Ｄarnell，Ｊ．Ｅ.，Ｎature，２９７；３６５−３
７１（１９８２）。 11. Ｄellweg，Ｈ．Ｇ．，Ｈotz，Ａ.，Ｍugele，Ｋ.，
and Ｇehring，Ｕ.，ＥＭＢＯ Ｊ．，１：２８５−２
８９（１９８２）。 12．Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，Ｂirnberg，Ｎ．Ｃ.，and Ｒos
enfeld，Ｍ．Ｇ.，Ｐroc .Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.
Ａ.，７９：７６５９−７６３３（１９８２）。 13．Ｇametchu，Ｂ.，and Ｈarrison，Ｒ．Ｗ.，Ｅndo
crinology，１１４：２７４−２７９（１９８４）。 14．Ｇehring，Ｕ.，and Ｈotz，Ａ.,Ｂiochemistry，
２２:４０１３−４０１８（１９８３）。 15．Ｇehring，Ｕ.，Ｓegnitz，Ｂ.，Ｆoellmer，Ｂ.，
and Ｆrancke，Ｕ.，Ｐr oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ．
Ｓ．Ａ.，８２：３７５１−３７５５（１９８５）。 16．Ｇovinda，Ｍ．Ｖ.，Ｓpiess，Ｅ.，and Ｍajors，
Ｊ.，Ｐroc． Ｎatl．Ａ cad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７９：
５１５７−５１６１（１９８２）。 17．Ｇrosschedl，Ｒ.，and Ｂirnstiel，Ｍ.Ｌ. ,Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７７：７１０２−
７１０６（１９８０）。 18．Ｇrove，Ｊ.Ｒ.，Ｄieckmann，Ｂ.Ｓ.，Ｓchroer，
Ｔ.Ａ.，and Ｒingold，Ｇ.Ｍ.，Ｃell，２１：４７−
５６（１９８０）。 19．Ｈagr，Ｌ．Ｊ.，and Ｐalmiter，Ｒ．Ｄ.，Ｎatu
re，２９１：３４０−３４２（１９８１）。 20．Ｈarmon，Ｊ．Ｍ.，et al.，Ｃancer Ｒes.，４
４：４５４０−４５４７（１９８４）。 21．Ｋarin，Ｍ.，Ａnderson，Ｒ．Ｄ.，Ｓlater，
Ｅ.，Ｓmith，Ｋ.，and Ｈerschman，Ｈ．Ｒ.，Ｎatur
e，２８６：２９５−２９７（１９８０）。 22．Ｋarin，Ｍ.，et al.，Ｎature，３０８：５１３−
５１９（１９８４）。 23．Ｋrieg，Ｐ.Ａ.，and Ｍelton，Ｄ.Ａ.，Ｎucleic
Ａcids Ｒes.，１２：７０５７−７０７０（１９８
４）。 24．Ｋurtz，Ｄ．Ｔ.，and Ｆeigelson，Ｐ.，Ｐroc．
Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ .Ｓ.Ａ.，７４：４７９１−４
７９５（１９７７）。 25．Ｌaimonis，Ｌ．Ａ.，Ｋhoury，Ｇ.，Ｇorman，
Ｃ.，Ｈoward，Ｂ.，andＧruss，Ｐ.，Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７９：６４５３−６４５７
（１９８２）。 26．Ｌebo，Ｒ．Ｖ．，and Ｂastian，Ａ．Ｍ.，Ｃyto
metry，３：２１３−２１９（１９８２）。 27．Ｌebo，Ｒ．Ｖ.，et al.，Ｓcience，２２５：５７
−５９（１９８４）。 28. Ｍaxam，Ａ.，and Ｇilbert，Ｗ.，Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,７４：５６０−５６４（１９
７７）。 29．Ｍiesfeld，Ｒ.，et al.，Ｎature，３１２：７７
９−７８１（１９８４）。 30．Ｎorthrop，Ｊ．Ｐ.，Ｇametchu，Ｂ.，Ｈarriso
n，Ｒ．Ｗ.，and Ｒingold，Ｇ．Ｍ.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhe
m.，２６０：６３９８−６４０３（１９８５）。 31．Ｏkayama，Ｈ.，and Ｂerg，Ｐ.，Ｍolec．Ｃel
l．Ｂiol.，３：２８０−２８９（１９８３）。 32．Ｏkret，Ｓ.，Ｃarlstedt−Ｄuke，Ｊ.，Ｗrange，
Ｏ.，Ｃarlstrom，Ｋ.，and Ｇustafsson，Ｊ.−Ａ.，
Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta，６７７：２０５−２１９
（１９８１）。 33．Ｏstrowski．Ｍ.Ｃ.，Ｈuang，Ａ.Ｌ.，Ｋessel，
Ｍ.，Ｗoolford，Ｒ.Ｇ.，and Ｈager，Ｇ.Ｌ.，ＥＭＢ
Ｏ Ｊ.，３：１８９１−１８９９(１９８４)。 34．Ｐarks，Ｗ.Ｐ.，Ｓcolnick，Ｅ.Ｍ.，and Ｋoziko
wski，Ｅ.Ｈ.，Ｓcience，１８４：１５８−１６０（１
９７４）。 35．Ｐayvar，Ｆ.，et al.，Ｃell，３５：３８１−３
９２（１９８３）。 36．Ｐfahl，Ｍ.，Ｃell，３１：４７５−４８２（１９
８２）。 37．Ｒingold，Ｇ.Ｍ.，Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，Ｔomkin
s，Ｇ.Ｍ.，Ｂishop，Ｊ．Ｍ.，and Ｖarmus，Ｈ．
Ｅ.，Ｃell，６：２９９−３０５（１９７５）。 38．Ｒobins，Ｄ.Ｍ.，Ｐack，Ｉ.，Ｓeeburg，Ｐ.
Ｈ.，and Ａzel，Ｒ.，Ｃell２９：６２３−６３１（１
９８２）。 39．Ｒosenfeld，Ｍ.Ｇ.，et al.，Ｎature，３０４:１
２９−１３５(１９８３)。40．Ｒousseau，Ｇ.Ｇ.，Ｂa
xter，Ｊ.Ｄ.，and Ｔomkins，Ｇ.Ｍ.，Ｊ.Ｍole c．Ｂi
ol.，６７：９９−１１５（１９７２）。 41．Ｓcheidereit，Ｃ.，Ｇeisse，Ｓ.，Ｗestphal，
Ｈ.Ｍ.，and Ｂeato，Ｍ.，Ｎature，３８４：７４９−
７５２（１９８３）。 42．Ｓchwarzbauer，Ｊ．Ｅ.，Ｔamkun，Ｊ．Ｗ.，Ｌem
ischka，Ｉ．Ｒ.，andＨynes，Ｒ．Ｏ.，Ｃell，３５：
４２１−４３１（１９８３）。 43．Ｓetzer，Ｄ.Ｒ.，ＭcＧrogan，Ｍ.，and Ｓchimk
e，Ｒ.Ｔ.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２５７：５１４３−５
１４７（１９８２）。 44．Ｓimons，Ｓ．Ｓ.，and Ｔhompson，Ｅ．Ｂ.，Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７８：３５４１−
３５４５（１９８１）。 45．Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｍellon，Ｓ.Ｈ.，and Ｂaxt
er，Ｊ.Ｄ.，Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.，２５７：１１６２７−
１１６３２（１９８２）。 46．Ｔhomas，Ｐ.Ｓ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
Ｕ.Ｓ.Ａ.,７７：５２０１−５２０５（１９８０）。 47．Ｗeinberger，Ｃ.，Ｈollenberg，Ｓ．Ｍ.，Ｒosen
feld，Ｍ．Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，Ｎature，３１
８：６７０−６７２（１９８５b）。 48．Ｗeinberger，Ｃ.，et al．Ｓcience,２２８:７４
０−７４２(１９８５a)。 49．Ｗestphal，Ｈ.Ｍ.，Ｍoldenhauer，Ｇ.，and Ｂea
to，Ｍ.，ＥＭＢＯ Ｊ.,１：１４６７−１４７１（１９
８２）。 50．Ｗrange，Ｏ.，Ｃarlstedt−Ｄuke，Ｊ.，and Ｇu
stafsson，Ｊ.−Ａ.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２５４：９
２８４−９２９０（１９７９）。 51．Ｗyange，Ｏ.，Ｏkret，Ｓ.，Ｒadojcic，Ｍ.，Ｃa
rlstedt−Ｄuke，ｊ.，and Ｇustafsson,Ｊ.−Ａ.,Ｊ.
Ｂiol．Ｃhem.,２５９：４５３４−４５４１（１９８
４）。 52．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，Ｓtampfer，Ｍ.Ｒ.，and Ｔom
kins，Ｇ.Ｍ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.
Ａ.，７１：３９０１−３９０５(１９７４)。
【０１４０】実験の部II ヒトグルココルチコイド受容体の機能区II．Ａ．概要 ＣＶ−１細胞においてｈＧＲ発現ベクターのトランスフ
ェクションにより産生されたヒトグルココルチコイド受
容体（ｈＧＲ）はＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写活性
化のために必要かつ十分な因子として機能する。誘導の
規模（５００〜１０００倍）からｈＧＲは転写“スイッ
チ”として作用し、グルココルチコイド応答要素を含む
休止状態のプロモーターを活性化状態に変換するのであ
ろうということが明らかになった。ｈＧＲによるＭＴＶ
−ＣＡＴ融合遺伝子の転写の刺激はＣＶ−１細胞におい
て制限的な転写因子に依存しない。ｈＧＲの挿入変異体
２７種の特性を調べることにより少なくとも４種の機能
区の位置が決定された。それらのうち２種は推定ＤＮＡ
−およびステロイド−結合区に対応する。他の２区は転
写に対するそれらの有効な作用のため、タウ（τ）と呼
ばれる。これは、この受容体における他の領域は完全な
転写活性化のために必要であるが、ステロイドまたはＤ
ＮＡの結合に特異的には関与していないという可能性を
示す。
ェクションにより産生されたヒトグルココルチコイド受
容体（ｈＧＲ）はＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写活性
化のために必要かつ十分な因子として機能する。誘導の
規模（５００〜１０００倍）からｈＧＲは転写“スイッ
チ”として作用し、グルココルチコイド応答要素を含む
休止状態のプロモーターを活性化状態に変換するのであ
ろうということが明らかになった。ｈＧＲによるＭＴＶ
−ＣＡＴ融合遺伝子の転写の刺激はＣＶ−１細胞におい
て制限的な転写因子に依存しない。ｈＧＲの挿入変異体
２７種の特性を調べることにより少なくとも４種の機能
区の位置が決定された。それらのうち２種は推定ＤＮＡ
−およびステロイド−結合区に対応する。他の２区は転
写に対するそれらの有効な作用のため、タウ（τ）と呼
ばれる。これは、この受容体における他の領域は完全な
転写活性化のために必要であるが、ステロイドまたはＤ
ＮＡの結合に特異的には関与していないという可能性を
示す。
【０１４１】II．Ｂ．序論 ２群のステロイドホルモン受容体の一次構造がそれらの
ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により解明され
た。実験の部Ｉに示すように、ヒトグルココルチコイド
受容体（ｈＧＲ）をコード化するｃＤＮＡの同定により
２形態の蛋白質、すなわちアミノ酸７７７個のもの（ア
ルファ）および７４２個のもの（ベータ）が明らかにな
った。これらはそれらのカルボキシル末端において異な
る。（実験の部Ｉの記載はホレンバーグ（Ｈollenber
g）ら、１９８５として発表された。）ヒトエストロゲ
ン受容体はこれによりも若干小さな、アミノ酸５９５個
蛋白質である（グリーン（Ｇreene）ら、１９８６；グ
リーン（Ｇreene）ら、１９８６）。アミノ酸配列の比
較により、これら２群の受容体間のみでなく、鳥類赤芽
球症ウイルスのv−erb−Ａ発癌遺伝子生成物とも広範な
相同性が明らかになった（ワインバーガー（Ｗeinberge
r）ら、１９８５；グリーン（Ｇreene）ら、１９８６；
グリーン(Ｇreene)ら、１９８６）。これはステロイド
受容体遺伝子およびc−erb−Ａプロト発癌遺伝子が共通
の原始的な先祖由来の調節遺伝子に由来するという示唆
を支持する（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら１９８
５）。
ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により解明され
た。実験の部Ｉに示すように、ヒトグルココルチコイド
受容体（ｈＧＲ）をコード化するｃＤＮＡの同定により
２形態の蛋白質、すなわちアミノ酸７７７個のもの（ア
ルファ）および７４２個のもの（ベータ）が明らかにな
った。これらはそれらのカルボキシル末端において異な
る。（実験の部Ｉの記載はホレンバーグ（Ｈollenber
g）ら、１９８５として発表された。）ヒトエストロゲ
ン受容体はこれによりも若干小さな、アミノ酸５９５個
蛋白質である（グリーン（Ｇreene）ら、１９８６；グ
リーン（Ｇreene）ら、１９８６）。アミノ酸配列の比
較により、これら２群の受容体間のみでなく、鳥類赤芽
球症ウイルスのv−erb−Ａ発癌遺伝子生成物とも広範な
相同性が明らかになった（ワインバーガー（Ｗeinberge
r）ら、１９８５；グリーン（Ｇreene）ら、１９８６；
グリーン(Ｇreene)ら、１９８６）。これはステロイド
受容体遺伝子およびc−erb−Ａプロト発癌遺伝子が共通
の原始的な先祖由来の調節遺伝子に由来するという示唆
を支持する（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら１９８
５）。
【０１４２】クローニングされたｃＤＮＡから推定され
たｈＧＲのアミノ酸配列（実験の部Ｉ参照）に基づい
て、この蛋白質の機能的および免疫学的に重要な領域の
配置を提示した（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、
１９８５）。これらには、蛋白質のアミノ末端側半分に
位置する免疫区、他のＤＮＡ結合性蛋白質との構造的類
似性を示すＤＮＡ結合区、および分子のカルボキシル末
端付近に位置するグルココルチコイド結合区が含まれ
る。しかし各区の位置は仮定であり、転写自体の活性化
に関与する区は確認されていなかった。この研究におい
て本発明者らはｈＧＲ蛋白質に代替アミノ酸を導入する
ことによりｈＧＲ内に提唱されている機能区の部位を確
認し、かつ他の重要な領域を見出すことを試みた。本発
明者らはまずサル腎細胞における新規な発現系を開発し
た。この系では機能性ｈＧＲの合成がラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ）の長鎖末端リピートの制御下でのｃＤＮＡ
の転写によって方向づけられる。合成受容体の機能はク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）アッセイ（ゴルマン（Ｇorman）ら、１９８２a）お
よびステロイドホルモン結合により測定した、マウス乳
腺腫瘍ウイルス(ＭＴＶ)ＬＴＲの転写誘導によって監視
された。この新規な発現系によって本発明者らは挿入変
異生成が受容体の種々の機能に与える影響を調べること
ができ、これによってｈＧＲの機能区構造のより詳細な
モデルを提唱した。２７種の挿入変異体の分析に基づく
本発明者らの結果から、グルココルチコイド受容体は別
個の機能区からなることが確認された（ワインバーガー
（Ｗeinberger）ら、１９８５）。さらにこれらによ
り、提唱したＤＮＡ−およびステロイド−結合区外の他
の配列が確認され、これを前記のように本発明者らは転
写に対するそれらの有効な作用のためτと呼ぶ。
たｈＧＲのアミノ酸配列（実験の部Ｉ参照）に基づい
て、この蛋白質の機能的および免疫学的に重要な領域の
配置を提示した（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、
１９８５）。これらには、蛋白質のアミノ末端側半分に
位置する免疫区、他のＤＮＡ結合性蛋白質との構造的類
似性を示すＤＮＡ結合区、および分子のカルボキシル末
端付近に位置するグルココルチコイド結合区が含まれ
る。しかし各区の位置は仮定であり、転写自体の活性化
に関与する区は確認されていなかった。この研究におい
て本発明者らはｈＧＲ蛋白質に代替アミノ酸を導入する
ことによりｈＧＲ内に提唱されている機能区の部位を確
認し、かつ他の重要な領域を見出すことを試みた。本発
明者らはまずサル腎細胞における新規な発現系を開発し
た。この系では機能性ｈＧＲの合成がラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ）の長鎖末端リピートの制御下でのｃＤＮＡ
の転写によって方向づけられる。合成受容体の機能はク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）アッセイ（ゴルマン（Ｇorman）ら、１９８２a）お
よびステロイドホルモン結合により測定した、マウス乳
腺腫瘍ウイルス(ＭＴＶ)ＬＴＲの転写誘導によって監視
された。この新規な発現系によって本発明者らは挿入変
異生成が受容体の種々の機能に与える影響を調べること
ができ、これによってｈＧＲの機能区構造のより詳細な
モデルを提唱した。２７種の挿入変異体の分析に基づく
本発明者らの結果から、グルココルチコイド受容体は別
個の機能区からなることが確認された（ワインバーガー
（Ｗeinberger）ら、１９８５）。さらにこれらによ
り、提唱したＤＮＡ−およびステロイド−結合区外の他
の配列が確認され、これを前記のように本発明者らは転
写に対するそれらの有効な作用のためτと呼ぶ。
【０１４３】II．Ｃ．結果 (a)アッセイ系および実験様式 クローニングされたｃＤＮＡからの機能性ｈＧＲ（実験
の部Ｉ）の発現を調べるために用いたアッセイ系および
方法を第９図に示す。これらの実験においては、レポー
ター遺伝子に結合したグルココルチコイド応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素を受容体陰性細胞に導入し
た。従って原理的にこの構造物は転写不活性のはずであ
る。本発明者らのアッセイ法にはクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配
列に融合させたＭＴＶ ＬＴＲを選択使用した（ＥＣ
２．３．１．２８）。グルココルチコイドホルモンがＭ
ＴＶＬＴＲ内の独自の部位における転写開始の効率を高
めることにより(ウッカー(Ｕcker）ら、１９８３）ＭＴ
Ｖ ＤＮＡの転写速度を高めることは先に証明されてい
る。（ロンゴールド（Ｒingolg）ら、１９８３）。さら
にグルココルチコイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッ
ピングされたＤＮＡ配列に特異的に結合し（ペイバー
(Ｐayvar)ら、１９８３)、これがグルココルチコイド応
答性を異種プロモーターに与えうる（チャンドラー（Ｃ
handler）ら、１９８３)。pＭＴＶＣＡＴ(またはｐＧＮ
ＣＡＴ）を受容体発現プラスミドと共トランスフェクシ
ョンすることにより、トランスフェクションされた細胞
をグルココルチコイドホルモンで処理した際に活性を誘
導しうる機能性受容体が得られる。さらに生化学的実
験、たとえば発現した受容体のステロイド結合活性およ
びウェスタンブロット分析を同時に行うことができる。
の部Ｉ）の発現を調べるために用いたアッセイ系および
方法を第９図に示す。これらの実験においては、レポー
ター遺伝子に結合したグルココルチコイド応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素を受容体陰性細胞に導入し
た。従って原理的にこの構造物は転写不活性のはずであ
る。本発明者らのアッセイ法にはクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配
列に融合させたＭＴＶ ＬＴＲを選択使用した（ＥＣ
２．３．１．２８）。グルココルチコイドホルモンがＭ
ＴＶＬＴＲ内の独自の部位における転写開始の効率を高
めることにより(ウッカー(Ｕcker）ら、１９８３）ＭＴ
Ｖ ＤＮＡの転写速度を高めることは先に証明されてい
る。（ロンゴールド（Ｒingolg）ら、１９８３）。さら
にグルココルチコイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッ
ピングされたＤＮＡ配列に特異的に結合し（ペイバー
(Ｐayvar)ら、１９８３)、これがグルココルチコイド応
答性を異種プロモーターに与えうる（チャンドラー（Ｃ
handler）ら、１９８３)。pＭＴＶＣＡＴ(またはｐＧＮ
ＣＡＴ）を受容体発現プラスミドと共トランスフェクシ
ョンすることにより、トランスフェクションされた細胞
をグルココルチコイドホルモンで処理した際に活性を誘
導しうる機能性受容体が得られる。さらに生化学的実
験、たとえば発現した受容体のステロイド結合活性およ
びウェスタンブロット分析を同時に行うことができる。
【０１４４】ＲＳＶ ＬＴＲを全長ｈＧＲｃＤＮＡ（pＲ
ＳｈＧＲアルファ）に結合させる発現ベクターをデザイ
ンして、広範な宿主細胞型において高水準の発現を得
た。ベクターｐＲＳｈＧＲアルファはｐＲＳＶＣＡＴ
(ゴルマン（Ｇorman）ら、1982b）の誘導体であり、Ｃ
ＡＴ遺伝子のコード化配列がｈＧＲｃＤＮＡにより置換
されている。ＳＶ４０の複製開始点をこのベクターに導
入し、これにより組換えプラスミドはＴ抗原(Ｔag)を発
現するＣＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）サル腎細胞において
高いコピー数にまで増殖可能となった（グルッツマン
（Ｇluzman）１９８１）。ＣＯＳ細胞および親細胞系Ｃ
Ｖ−１はグルココルチコイド受容体の水準が検出不可能
であるという付加的な利点をも与える（未発表の所見な
らびに第１０および１１図）。
ＳｈＧＲアルファ）に結合させる発現ベクターをデザイ
ンして、広範な宿主細胞型において高水準の発現を得
た。ベクターｐＲＳｈＧＲアルファはｐＲＳＶＣＡＴ
(ゴルマン（Ｇorman）ら、1982b）の誘導体であり、Ｃ
ＡＴ遺伝子のコード化配列がｈＧＲｃＤＮＡにより置換
されている。ＳＶ４０の複製開始点をこのベクターに導
入し、これにより組換えプラスミドはＴ抗原(Ｔag)を発
現するＣＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）サル腎細胞において
高いコピー数にまで増殖可能となった（グルッツマン
（Ｇluzman）１９８１）。ＣＯＳ細胞および親細胞系Ｃ
Ｖ−１はグルココルチコイド受容体の水準が検出不可能
であるという付加的な利点をも与える（未発表の所見な
らびに第１０および１１図）。
【０１４５】(b)機能性ｈＧＲの発現 上記のアッセイ法はステロイドホルモン受容体の作用機
構を研究する際に遭遇する主な難点の幾つかを克服する
ために企画された。これらの難点には受容体の細胞内水
準が低いこと、受容体の異質性の可能性があったこと、
および受容体の機能を試験する定量可能なバイオアッセ
イ系がなかったことが含まれる。従って本発明者らはp
ＲＳｈＧＲアルファでトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞が産生しうるｈＧＲの相対量をまず調べた。第１０
図（右のレーン）のトランスフェクションされたＣＯＳ
細胞のウェスタンブロット分析は、ＣＯＳ細胞がＩＭ９
細胞系(左レーン)に存在するｈＧＲと移動性に関して区
別できない９４kdのｈＧＲポリペプチドを合成したこと
を証明する。さらに一時的にトランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞中に存在するｈＧＲの量はＩＭ９細胞、す
なわち細胞当たり100,000−200,000の受容体を含むもの
（ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４）に見出される水
準よりも多い。この発現系は高い細胞内ｈＧＲ水準を有
する細胞を提供するだけでなく、ｈＧＲの機能研究を妨
げる可能性のある受容体ミクロ異質性の可能性をも除
く。
構を研究する際に遭遇する主な難点の幾つかを克服する
ために企画された。これらの難点には受容体の細胞内水
準が低いこと、受容体の異質性の可能性があったこと、
および受容体の機能を試験する定量可能なバイオアッセ
イ系がなかったことが含まれる。従って本発明者らはp
ＲＳｈＧＲアルファでトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞が産生しうるｈＧＲの相対量をまず調べた。第１０
図（右のレーン）のトランスフェクションされたＣＯＳ
細胞のウェスタンブロット分析は、ＣＯＳ細胞がＩＭ９
細胞系(左レーン)に存在するｈＧＲと移動性に関して区
別できない９４kdのｈＧＲポリペプチドを合成したこと
を証明する。さらに一時的にトランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞中に存在するｈＧＲの量はＩＭ９細胞、す
なわち細胞当たり100,000−200,000の受容体を含むもの
（ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４）に見出される水
準よりも多い。この発現系は高い細胞内ｈＧＲ水準を有
する細胞を提供するだけでなく、ｈＧＲの機能研究を妨
げる可能性のある受容体ミクロ異質性の可能性をも除
く。
【０１４６】発現したｈＧＲの有効な転写因子としての
機能性を試験するために、pＭＴＶＣＡＴおよびｐＲＳ
ｈＧＲアルファを共トランスフェクションしたのちに得
た細胞抽出物を用いてＣＡＴアッセイを行った。ＣＯＳ
および親細胞であるＣＶ−１細胞の双方へのトランスフ
ェクションを調べた。予想どおり（アービン（Ａlwin
e）１９８５）ＣＯＳ中にＳＶ４０ Ｔagが存在すると
ＭＴＶ ＬＴＲの基礎活性が高まった（データは示され
ていない）。従って最大の誘導を得るために、ＳＶ４０
Ｔagを発現しないＣＶ−１細胞を用いた。第１１図に示
すように、pＭＴＶＣＡＴを対照プラスミドと共トラン
スフェクションした場合、ＣＶ−１細胞中にＣＡＴ活性
は生じなかった。同様に pＭＴＣＡＴおよびｐＲＳｈＧ
Ｒアルファを共トランスフェクションした場合もＣＡＴ
活性は生じなかった。しかし同じく共トランスフェクシ
ョンされたＣＶ−１細胞をデキサメサゾン（ＤＥＸ）で
処理すると、ＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写が開始さ
れる。pＭＴＶＣＡＴにより生じるＣＡＴ活性の基礎水
準はＣＶ−１細胞においてかろうじて検出しうる程度
（しばしばゼロ）であるので、この誘導係数はきわめて
大きい（約５００〜１０００倍）。対照実験として本発
明者らはベータ形のｈＧＲを共トランスフェクションし
た（実験の部Ｉ）。これはステロイドを結合し得ないこ
とが示されているものである。（第II−１表参照）。第
１１図はｈＧＲベータが本発明の発現アッセイ法におい
て機能しないことを証明する。また、ｈＧＲによる転写
の活性化はグルココルチコイド応答性要素を含むプロモ
ーターに限定される。pＭＴＶＣＡＴの代わりに pＭＴ
Ｉa ＣＡＴ、すなわち重金属には応答するがグルココル
チコイドには応答しないヒトメタロチオネインＩa 遺伝
子の調節領域を含むプラスミドを用いた場合、トランス
フェクションしたＣＶ−１のホルモン処理後にＣＡＴ活
性の誘導は認められなかった（データは示されていな
い）。これらの結果は、細胞内でｈＧＲがステロイド依
存性転写スイッチとして機能するのに必要かつ十分な因
子として作用することを証明する。
機能性を試験するために、pＭＴＶＣＡＴおよびｐＲＳ
ｈＧＲアルファを共トランスフェクションしたのちに得
た細胞抽出物を用いてＣＡＴアッセイを行った。ＣＯＳ
および親細胞であるＣＶ−１細胞の双方へのトランスフ
ェクションを調べた。予想どおり（アービン（Ａlwin
e）１９８５）ＣＯＳ中にＳＶ４０ Ｔagが存在すると
ＭＴＶ ＬＴＲの基礎活性が高まった（データは示され
ていない）。従って最大の誘導を得るために、ＳＶ４０
Ｔagを発現しないＣＶ−１細胞を用いた。第１１図に示
すように、pＭＴＶＣＡＴを対照プラスミドと共トラン
スフェクションした場合、ＣＶ−１細胞中にＣＡＴ活性
は生じなかった。同様に pＭＴＣＡＴおよびｐＲＳｈＧ
Ｒアルファを共トランスフェクションした場合もＣＡＴ
活性は生じなかった。しかし同じく共トランスフェクシ
ョンされたＣＶ−１細胞をデキサメサゾン（ＤＥＸ）で
処理すると、ＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写が開始さ
れる。pＭＴＶＣＡＴにより生じるＣＡＴ活性の基礎水
準はＣＶ−１細胞においてかろうじて検出しうる程度
（しばしばゼロ）であるので、この誘導係数はきわめて
大きい（約５００〜１０００倍）。対照実験として本発
明者らはベータ形のｈＧＲを共トランスフェクションし
た（実験の部Ｉ）。これはステロイドを結合し得ないこ
とが示されているものである。（第II−１表参照）。第
１１図はｈＧＲベータが本発明の発現アッセイ法におい
て機能しないことを証明する。また、ｈＧＲによる転写
の活性化はグルココルチコイド応答性要素を含むプロモ
ーターに限定される。pＭＴＶＣＡＴの代わりに pＭＴ
Ｉa ＣＡＴ、すなわち重金属には応答するがグルココル
チコイドには応答しないヒトメタロチオネインＩa 遺伝
子の調節領域を含むプラスミドを用いた場合、トランス
フェクションしたＣＶ−１のホルモン処理後にＣＡＴ活
性の誘導は認められなかった（データは示されていな
い）。これらの結果は、細胞内でｈＧＲがステロイド依
存性転写スイッチとして機能するのに必要かつ十分な因
子として作用することを証明する。
【０１４７】このアッセイに基づいて、ステロイドによ
る受容体の活性化を試験することができた。第１２
（Ａ）図に示したように、ＤＥＸはｈＧＲにより誘導さ
れたＣＡＴ活性に対し３nＭのＥＤ50値を示す。これは
種々の生理学的作用においてＤＥＸにつき観察されたＥ
Ｄ50値（５nＭ）と一致する。共トランスフェクション
されたＣＶ−１細胞を１００nＭのテストステロン、エ
ストラジオールおよびプロゲステロンで処理することに
よりｈＧＲの作用の特異性をさらに調べた。これらのス
テロイドはプロゲステロン以外はＣＡＴ活性を誘導し得
なかった。プロゲステロンはＤＥＸにより生じた最大誘
導の１％の値でｈＧＲの機能を刺激した（データは示さ
れていない）。これらの結果は、トランスフェクション
されたＣＶ−１細胞が、天然受容体の特異性および濃度
において薬理学的リガンドと相互作用する機能性ｈＧＲ
を合成することを示す。
る受容体の活性化を試験することができた。第１２
（Ａ）図に示したように、ＤＥＸはｈＧＲにより誘導さ
れたＣＡＴ活性に対し３nＭのＥＤ50値を示す。これは
種々の生理学的作用においてＤＥＸにつき観察されたＥ
Ｄ50値（５nＭ）と一致する。共トランスフェクション
されたＣＶ−１細胞を１００nＭのテストステロン、エ
ストラジオールおよびプロゲステロンで処理することに
よりｈＧＲの作用の特異性をさらに調べた。これらのス
テロイドはプロゲステロン以外はＣＡＴ活性を誘導し得
なかった。プロゲステロンはＤＥＸにより生じた最大誘
導の１％の値でｈＧＲの機能を刺激した（データは示さ
れていない）。これらの結果は、トランスフェクション
されたＣＶ−１細胞が、天然受容体の特異性および濃度
において薬理学的リガンドと相互作用する機能性ｈＧＲ
を合成することを示す。
【０１４８】エンハンサー含有分子と細胞成分との特異
的相互作用に関する研究から、ＣＶ−１細胞は特定のウ
イルス性エンハンサーの機能に必要な細胞性因子を限定
された量含有することが示された（ショラー（Ｓchole
r）およびグルス（Ｇruss）１９８４）。これらの細胞
においてはトランスフェクションされたpＳＶ２ＣＡＴ
（ゴルマン（Ｇorman）ら、１９８２a）により生じるＣ
ＡＴ活性はプラスミド0.3pmol／ディッシュでプラトー
に達する。同様に、ｈＧＲが限定因子と相互作用するな
らば漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファのトランスフェ
クションにより誘導されるＣＡＴ活性を一定量の pＭＴ
ＶＣＡＴで飽和させることができるはずである。この実
験では２pmol（５μｇ)の pＭＴＶＣＡＴ ＤＮＡを使用
し、漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファＤＮＡを非特異
的キャリヤーＤＮＡと共に添加して、合計３０μｇ／デ
ィッシュを得た。第１２（Ｂ）図は0.03pml(１００n
ｇ）程度の少量のｐＲＳｈＧＲアルファ（ディッシュ当
たり）をトランスフェクションした際にＣＡＴ活性を検
出しうること、およびＣＡＴ活性においてプラトーに達
することはないことを証明する。これらデータは、ｈＧ
ＲによるＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子のトランスフェクシ
ョンの刺激はＣＶ−１細胞中で限定する転写因子に依存
しないことを示唆する。
的相互作用に関する研究から、ＣＶ−１細胞は特定のウ
イルス性エンハンサーの機能に必要な細胞性因子を限定
された量含有することが示された（ショラー（Ｓchole
r）およびグルス（Ｇruss）１９８４）。これらの細胞
においてはトランスフェクションされたpＳＶ２ＣＡＴ
（ゴルマン（Ｇorman）ら、１９８２a）により生じるＣ
ＡＴ活性はプラスミド0.3pmol／ディッシュでプラトー
に達する。同様に、ｈＧＲが限定因子と相互作用するな
らば漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファのトランスフェ
クションにより誘導されるＣＡＴ活性を一定量の pＭＴ
ＶＣＡＴで飽和させることができるはずである。この実
験では２pmol（５μｇ)の pＭＴＶＣＡＴ ＤＮＡを使用
し、漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファＤＮＡを非特異
的キャリヤーＤＮＡと共に添加して、合計３０μｇ／デ
ィッシュを得た。第１２（Ｂ）図は0.03pml(１００n
ｇ）程度の少量のｐＲＳｈＧＲアルファ（ディッシュ当
たり）をトランスフェクションした際にＣＡＴ活性を検
出しうること、およびＣＡＴ活性においてプラトーに達
することはないことを証明する。これらデータは、ｈＧ
ＲによるＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子のトランスフェクシ
ョンの刺激はＣＶ−１細胞中で限定する転写因子に依存
しないことを示唆する。
【０１４９】(c)ｈＧＲの機能区のマッピング ｈＧＲが遺伝子転写を調節する機構を理解するために
は、まずその機能区の解明が必要であった。グルココル
チコイド受容体の蛋白質分解に関する限定された研究
(カールスデット−デューク(Ｃarlsdedt−Ｄuke)１９８
２；デルウェーク(Ｄellweg)ら、１９８２；ランゲ(Ｗra
nge)ら、１９８４；ライヒマン(Reichman）ら、１９８
４、およびｈＧＲの一次構造の分析（実験の部Ｉ参照）
に基づいて、受容体の構造に対するモデルが提示されて
いる（ワインバーガー(Ｗeinberger)ら、１９８５）。
このモデルにより主要な３区域が確認される。すなわち
アミノ酸１４５から２８０に及ぶ免疫区、アミノ酸４２
１から４８１に及ぶＤＮＡ結合区、および蛋白質のカル
ボキシル末端付近に位置するステロイド結合区である。
このモデルを試験するために本発明者らはグルココルチ
コイド受容体コード化配列における２７種の部位特異性
挿入変異体をリンカースキャニング法により形成した。
次いでこれらの遺伝子工学的に形成された変異体につ
き、遺伝子転写およびステロイドホルモン結合に対する
それらの能力をアッセイした。
は、まずその機能区の解明が必要であった。グルココル
チコイド受容体の蛋白質分解に関する限定された研究
(カールスデット−デューク(Ｃarlsdedt−Ｄuke)１９８
２；デルウェーク(Ｄellweg)ら、１９８２；ランゲ(Ｗra
nge)ら、１９８４；ライヒマン(Reichman）ら、１９８
４、およびｈＧＲの一次構造の分析（実験の部Ｉ参照）
に基づいて、受容体の構造に対するモデルが提示されて
いる（ワインバーガー(Ｗeinberger)ら、１９８５）。
このモデルにより主要な３区域が確認される。すなわち
アミノ酸１４５から２８０に及ぶ免疫区、アミノ酸４２
１から４８１に及ぶＤＮＡ結合区、および蛋白質のカル
ボキシル末端付近に位置するステロイド結合区である。
このモデルを試験するために本発明者らはグルココルチ
コイド受容体コード化配列における２７種の部位特異性
挿入変異体をリンカースキャニング法により形成した。
次いでこれらの遺伝子工学的に形成された変異体につ
き、遺伝子転写およびステロイドホルモン結合に対する
それらの能力をアッセイした。
【０１５０】ｈＧＲのリンカー挿入変異体を形成するた
めに、ＤＮＡ分子を高い頻度で開裂させる制限酵素を用
いて部分開裂することによりプラスミドｐＲＳｈＧＲア
ルファをまず線状化した。線状プラスミドを分離し、Ｂ
amＨＩリンカーを添加して、ｈＧＲをコードするオープ
ンリーディングフレームを再生した。得られた変異体は
３個または４個の付加的アミノ酸を保有し、これらが野
生型の蛋白質の配列を中断している。この方法により本
発明者らは一連のランダムなｈＧＲ変異体を形成した
（第１３図）。これらの変異体が全長ｈＧＲを発現する
能力をウェスタンブロット分析により推定した。産生さ
れたｈＧＲは３０％以上は異ならないことが示され、従
ってこれらの変異体はいずれも発現された蛋白質を不安
定化しないと思われた。
めに、ＤＮＡ分子を高い頻度で開裂させる制限酵素を用
いて部分開裂することによりプラスミドｐＲＳｈＧＲア
ルファをまず線状化した。線状プラスミドを分離し、Ｂ
amＨＩリンカーを添加して、ｈＧＲをコードするオープ
ンリーディングフレームを再生した。得られた変異体は
３個または４個の付加的アミノ酸を保有し、これらが野
生型の蛋白質の配列を中断している。この方法により本
発明者らは一連のランダムなｈＧＲ変異体を形成した
（第１３図）。これらの変異体が全長ｈＧＲを発現する
能力をウェスタンブロット分析により推定した。産生さ
れたｈＧＲは３０％以上は異ならないことが示され、従
ってこれらの変異体はいずれも発現された蛋白質を不安
定化しないと思われた。
【０１５１】各変異体の機能性を第II−１表の野生型ｈ
ＧＲのものと比較した。２７種のｈＧＲ変異体のうち１
２種により誘導されるＣＡＴ活性は野生型の水準に匹敵
した。ＣＡＴ活性の誘導によりアッセイして機能が低下
し、または完全に失われている１５種のｈＧＲ変異体の
分析により、これらは別個の４群に属することが示され
た。いわゆる免疫原区のアミノ酸１２０と２１５の間に
位置する一群のこれら変異体が第１群を形成する。受容
体分子のこの領域には特異的機能は帰属されていない
が、３種の変異体（Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１
４）は低いＣＡＴ活性誘導能を示す。これらの変異体は
ステロイド結合能を完全に維持した。
ＧＲのものと比較した。２７種のｈＧＲ変異体のうち１
２種により誘導されるＣＡＴ活性は野生型の水準に匹敵
した。ＣＡＴ活性の誘導によりアッセイして機能が低下
し、または完全に失われている１５種のｈＧＲ変異体の
分析により、これらは別個の４群に属することが示され
た。いわゆる免疫原区のアミノ酸１２０と２１５の間に
位置する一群のこれら変異体が第１群を形成する。受容
体分子のこの領域には特異的機能は帰属されていない
が、３種の変異体（Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１
４）は低いＣＡＴ活性誘導能を示す。これらの変異体は
ステロイド結合能を完全に維持した。
【０１５２】意外ではないと思われるが、第２群の欠損
変異体は受容体の推定ＤＮＡ結合区に見出される。この
機能区はシスティンに富み、それぞれアミノ酸約２５個
の２反復単位からなり、これがＺn2+ リガンドにより調
整されたループ構造に折れ曲がっている（ミラー（Ｍil
ler）ら、１９８５）。変異体Ｉ４２２の場合は、配列モ
チーフＣys−Ｘ2−ＣysがＣys−Ｘ5−Ｃysに変わってい
る。付加的アミノ酸の存在が受容体の機能を完全に失わ
せている。変異体Ｉ４４０は第１ループの形成に関与す
る他の２個のシスティン間に同様にアミノ酸４個の挿入
配列を有し、同様に検出可能な水準のＣＡＴ活性を誘導
できない。他方、変異体Ｉ４２８ではループ自体の長さ
がアミノ酸１３個から１７個に伸長している。著しく低
下してはいるが、Ｉ４２８によるＣＡＴ活性の誘導はな
お検出可能である。３種の変異体すべてについてＤＮＡ
結合区に存在するステロイド結合容量は野生型の水準の
範囲内にあることが示された。突然変異により影響を受
ける第３の領域はＤＮＡ結合区に隣接した位置にある。
変異体Ｉ４８８およびＩ４９０は低い水準のＣＡＴ活性
を示すが、ステロイドを効果的に結合する。第４群は受
容体蛋白質の最後の２００個のアミノ酸を包含する。５
種の変異体は（Ｉ５８２，Ｉ５８９，Ｉ５９９，Ｉ６２
６およびＩ６９６）は検出可能な水準のＣＡＴ活性を示
さない。この機能活性の欠如はそれらがデキサメサゾン
を全く結合し得ないことと関係がある。これらの結果
は、ステロイド結合領域が蛋白質の大部分を包含するこ
とを示す。これらはすべてＣ末端付近に集中している。
分子のアミノ末端と異なりこの領域は受容体の一次構造
の変化に対してきわめて敏感である。
変異体は受容体の推定ＤＮＡ結合区に見出される。この
機能区はシスティンに富み、それぞれアミノ酸約２５個
の２反復単位からなり、これがＺn2+ リガンドにより調
整されたループ構造に折れ曲がっている（ミラー（Ｍil
ler）ら、１９８５）。変異体Ｉ４２２の場合は、配列モ
チーフＣys−Ｘ2−ＣysがＣys−Ｘ5−Ｃysに変わってい
る。付加的アミノ酸の存在が受容体の機能を完全に失わ
せている。変異体Ｉ４４０は第１ループの形成に関与す
る他の２個のシスティン間に同様にアミノ酸４個の挿入
配列を有し、同様に検出可能な水準のＣＡＴ活性を誘導
できない。他方、変異体Ｉ４２８ではループ自体の長さ
がアミノ酸１３個から１７個に伸長している。著しく低
下してはいるが、Ｉ４２８によるＣＡＴ活性の誘導はな
お検出可能である。３種の変異体すべてについてＤＮＡ
結合区に存在するステロイド結合容量は野生型の水準の
範囲内にあることが示された。突然変異により影響を受
ける第３の領域はＤＮＡ結合区に隣接した位置にある。
変異体Ｉ４８８およびＩ４９０は低い水準のＣＡＴ活性
を示すが、ステロイドを効果的に結合する。第４群は受
容体蛋白質の最後の２００個のアミノ酸を包含する。５
種の変異体は（Ｉ５８２，Ｉ５８９，Ｉ５９９，Ｉ６２
６およびＩ６９６）は検出可能な水準のＣＡＴ活性を示
さない。この機能活性の欠如はそれらがデキサメサゾン
を全く結合し得ないことと関係がある。これらの結果
は、ステロイド結合領域が蛋白質の大部分を包含するこ
とを示す。これらはすべてＣ末端付近に集中している。
分子のアミノ末端と異なりこの領域は受容体の一次構造
の変化に対してきわめて敏感である。
【０１５３】(d)第II−１表
【表１】 ｈＧＲ変異体の機能性 挿入 ＣＡＴ ＤＥＸｈＧＲ アミノ酸 活性（％） 結合（％） アルファ − １００ １００ Ｉ９ ＲＩＲ １１７ ＮＴ Ｉ３７ ＲＩＲＡ ９５ ＮＴ Ｉ１０２ ＧＳＶ １３０ ＮＴ Ｉ１２０ ＲＧＳＡ ２ ７６ Ｉ２０４ ＲＩＲ ３ １２５ Ｉ２１４ ＲＧＳＡ ２ ７９ Ｉ２６２ ＡＤＰＲ ９７ ＮＴ Ｉ２８９ ＲＩＲ １２５ ＮＴ Ｉ３０５ ＡＤＰＲ ８６ ＮＴ Ｉ３４６ ＡＤＰＲ １９ １０７ Ｉ３８４ ＲＩＲ １０１ ＮＴ Ｉ４０３ ＡＤＰＲ １１４ ＮＴ Ｉ４０８ ＡＤＰＲ ５５ ＮＴ Ｉ４２２ ＧＳＶ ０ １０５ Ｉ４２８ ＲＩＲＡ ２ ９２ Ｉ４４０ ＡＤＰＲ ０ ６９ Ｉ４８８ ＧＳＶ １５ ９６ Ｉ４９０ ＲＩＲＡ １０ １１５ Ｉ５１５ ＲＩＲ １０９ ＮＴ Ｉ５３２ ＧＳＶ １１５ ＮＴ Ｉ５５０ ＡＤＰＲ ５ １９ Ｉ５８２ ＲＩＲ ０ ０ Ｉ５８９ ＧＳＶ ０ ０ Ｉ５９９ ＳＤＰ ０ ０ Ｉ６２６ ＡＤＰＲ ０ ０ Ｉ６８４ ＲＧＳＡ ７９ ８１ Ｉ６９６ ＲＧＳＡ ０ ０ ベータ Ｃ末端欠失 ０ ０
【０１５４】ＣＶ−１またはＣＯＳ細胞をｐＲＳｈＧＲ
アルファ、pＲＳｈＧＲベータ、または突然変異したｈ
ＧＲアルファによりトランスフェクションし、ＣＡＴ活
性およびステロイド結合能につきアッセイした。トラン
スフェクション後にＣＶ−１細胞を１０nＭ−ＤＥＸの
存在下で２日間培養したのち、細胞溶解およびＣＡＴア
ッセイを行った。ＣＯＳ細胞は普通の培地に維持され
た。これら２パラメーターを野生型ｈＧＲ活性に対する
％として定量した。ｈＧＲアルファに挿入されたアミノ
酸を１文字コードで表示する。ＮＴは試験しなかったこ
とを意味する。ｈＧＲアルファとｈＧＲベータのアミノ
酸組成の相違を第１３図および実験の部Ｉに示す。
アルファ、pＲＳｈＧＲベータ、または突然変異したｈ
ＧＲアルファによりトランスフェクションし、ＣＡＴ活
性およびステロイド結合能につきアッセイした。トラン
スフェクション後にＣＶ−１細胞を１０nＭ−ＤＥＸの
存在下で２日間培養したのち、細胞溶解およびＣＡＴア
ッセイを行った。ＣＯＳ細胞は普通の培地に維持され
た。これら２パラメーターを野生型ｈＧＲ活性に対する
％として定量した。ｈＧＲアルファに挿入されたアミノ
酸を１文字コードで表示する。ＮＴは試験しなかったこ
とを意味する。ｈＧＲアルファとｈＧＲベータのアミノ
酸組成の相違を第１３図および実験の部Ｉに示す。
【０１５５】II．Ｄ．考察 ｈＧＲ発現ベクターのトランスフェクションによりＣＶ
−１細胞中で産生されたｈＧＲがＭＴＲ−ＣＡＴ融合遺
伝子の転写活性化に必要かつ十分な因子であることを示
した。誘導の規模から、ｈＧＲは転写”スイッチ”とし
て作用し、これがグルココルチコイド応答要素を含む静
止状態のプロモーターを活性化状態に変換しうることが
明らかになった。構成性活性を示す他の転写因子と異な
り、ｈＧＲによる転写刺激は完全にグルココルチコイド
ホルモンの存在に依存性である（第１１および１２
（Ａ）図）。細胞内で蛋白質が大量に産生されるだけで
は調節された遺伝子の転写を誘導するのに十分ではな
い。ｈＧＲがホルモンによって活性化される機構は十分
には解明されていないがサイクリックＡＭＰ結合蛋白質
の場合と同様に、蛋白質内におけるアロステリック転移
を伴うものと思われる（マッケイ（Ｍckay）およびスタ
イツ（Ｓteitz）１９８１；ゲージス(Ｇages）およびア
ジヤ（Ａdhya）１９８５）。
−１細胞中で産生されたｈＧＲがＭＴＲ−ＣＡＴ融合遺
伝子の転写活性化に必要かつ十分な因子であることを示
した。誘導の規模から、ｈＧＲは転写”スイッチ”とし
て作用し、これがグルココルチコイド応答要素を含む静
止状態のプロモーターを活性化状態に変換しうることが
明らかになった。構成性活性を示す他の転写因子と異な
り、ｈＧＲによる転写刺激は完全にグルココルチコイド
ホルモンの存在に依存性である（第１１および１２
（Ａ）図）。細胞内で蛋白質が大量に産生されるだけで
は調節された遺伝子の転写を誘導するのに十分ではな
い。ｈＧＲがホルモンによって活性化される機構は十分
には解明されていないがサイクリックＡＭＰ結合蛋白質
の場合と同様に、蛋白質内におけるアロステリック転移
を伴うものと思われる（マッケイ（Ｍckay）およびスタ
イツ（Ｓteitz）１９８１；ゲージス(Ｇages）およびア
ジヤ（Ａdhya）１９８５）。
【０１５６】本発明者らは、ｈＧＲによる転写の活性化
はＣＶ−１細胞中に限定された量で存在する因子によっ
て制限されないことを認めた（第１２（Ｂ）図）。これ
らの結果はグルココルチコイド応答性エンハンサーへの
ｈＧＲ−ステロイド−複合体の結合がプロモーター付近
の一般的転写因子の活性を高めるのに十分であることを
示唆する。他の数種の転写因子について同様な特性が報
告されている。たとえばＡdf１、すなわちメラノガスタ
ー（Ｄ. melanogaster）におけるアルコールデヒドロゲ
ナーゼ（Ａdh）の近位プロモーターを活性化する転写因
子は他の蛋白質因子の不在下でＡdh鋳型ＤＮＡを結合
し、Ａdh ＲＮＡ合成の開始を活性化するために内在性
ＲＮＡポリメラーゼＩｉ、および他の一般的転写因子を
含む画分を必要とするにすぎない（ヘーベライン（Ｈeb
erlein）ら、 1985)。ＳＶ４０エンハンサー／プロモー
ター要素を含む組換えプラスミド pＳＶ２ＣＡＴを用い
る他の型の実験において、ショーラー（Ｓcholer）およ
びグルス(Ｇruss）(1984）は、エンハンサー含有ＤＮＡ
の機能に細胞性分子が必要であることを示した。彼らの
実験によれば、ＳＶ４０エンハンサー要素によるＣＡＴ
遺伝子の活性化に必要な限られた量の細胞性因子の存在
が示された。しかし一般的転写因子の枯渇は観察されな
かった。これらのデータは特定の有効な転写因子の作用
機作が一般的転写因子の活性を高める因子自身、または
ポリメラーゼ自身によって誘導されるクロマチンの構造
における変化をもたらすらしいということを示唆してい
るモロー（Ｍoreau）ら、1981；ウェイジリク（Ｗasyly
k）ら、1983）。グルココルチコイド処理によってＭＴ
Ｖ ＬＴＲのセグメントを含むＤＮＡ領域に可逆的およ
び永続的双方の変化が生じることはすでに示されている
（ザレット（Ｚaret）およびヤマモト（Ｙamamoto） 19
84）。結合した受容体がプロモーター活性を高める機構
は完全に解明されている。しかしｈＧＲを過剰に発現す
る系が得られれば、有効な転写因子による分子基盤での
転写活性化についての将来の研究が容易になるであろ
う。
はＣＶ−１細胞中に限定された量で存在する因子によっ
て制限されないことを認めた（第１２（Ｂ）図）。これ
らの結果はグルココルチコイド応答性エンハンサーへの
ｈＧＲ−ステロイド−複合体の結合がプロモーター付近
の一般的転写因子の活性を高めるのに十分であることを
示唆する。他の数種の転写因子について同様な特性が報
告されている。たとえばＡdf１、すなわちメラノガスタ
ー（Ｄ. melanogaster）におけるアルコールデヒドロゲ
ナーゼ（Ａdh）の近位プロモーターを活性化する転写因
子は他の蛋白質因子の不在下でＡdh鋳型ＤＮＡを結合
し、Ａdh ＲＮＡ合成の開始を活性化するために内在性
ＲＮＡポリメラーゼＩｉ、および他の一般的転写因子を
含む画分を必要とするにすぎない（ヘーベライン（Ｈeb
erlein）ら、 1985)。ＳＶ４０エンハンサー／プロモー
ター要素を含む組換えプラスミド pＳＶ２ＣＡＴを用い
る他の型の実験において、ショーラー（Ｓcholer）およ
びグルス(Ｇruss）(1984）は、エンハンサー含有ＤＮＡ
の機能に細胞性分子が必要であることを示した。彼らの
実験によれば、ＳＶ４０エンハンサー要素によるＣＡＴ
遺伝子の活性化に必要な限られた量の細胞性因子の存在
が示された。しかし一般的転写因子の枯渇は観察されな
かった。これらのデータは特定の有効な転写因子の作用
機作が一般的転写因子の活性を高める因子自身、または
ポリメラーゼ自身によって誘導されるクロマチンの構造
における変化をもたらすらしいということを示唆してい
るモロー（Ｍoreau）ら、1981；ウェイジリク（Ｗasyly
k）ら、1983）。グルココルチコイド処理によってＭＴ
Ｖ ＬＴＲのセグメントを含むＤＮＡ領域に可逆的およ
び永続的双方の変化が生じることはすでに示されている
（ザレット（Ｚaret）およびヤマモト（Ｙamamoto） 19
84）。結合した受容体がプロモーター活性を高める機構
は完全に解明されている。しかしｈＧＲを過剰に発現す
る系が得られれば、有効な転写因子による分子基盤での
転写活性化についての将来の研究が容易になるであろ
う。
【０１５７】２７種の挿入変異体の解明の結果は、ヒト
グルココルチコイド受容体が一連の機能区からなるとい
う本発明者らの先の示唆を支持し、拡大する。ステロイ
ド結合に影響を与える変異体がすべてカルボキシル末端
に集中していることは注目に値する。この領域がホルモ
ンの特異性をコードする別個の機能区として機能するこ
とが示唆されるほか、これらの結果はこの受容体内に確
認された他の機能区が別個の機能を果たすという可能性
をも暗示する。従って、受容体が特定のＤＮＡ配列を認
識し、これと相互作用する能力は、エストロゲン受容体
および発癌遺伝子生成物 v−erb−Ａによって高度に保
持されているＣys−Ｌys−Ａrg に富む領域にあると思
われる。これらの領域における突然変異は受容体分子が
転写を活性化する能力を低下させるというのは論理的で
あると思われる。活性化はリガンドがアロステリック形
質転換を誘導する能力、および形質転換した分子がＤＮ
Ａを認識し、これと相互作用する能力の双方に依存する
からである。ステロイド受容体構造の最初のモデル（ワ
インバーガー（Ｗeinberger）ら、1985）に基づけば、
これらは突然変異誘発の解明に際し予想された結果であ
った。しかし予想されなかった結果は、転写活性に影響
を与える他の領域が少なくとも２か所確認されたことで
ある。これは、転写活性化に必要であるがステロイドま
たはＤＮＡの結合のいずれにも特異的に関与してはいな
い他の機能区が受容体中に存在するという興味深い可能
性を与える。変異体Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１４
は野生型の親和性をもってステロイドと結合するが、転
写活性が低下している。これらの変異体は本発明者らが
τ1と呼ぶこの機能区が完全なｈＧＲ 活性を得るために
機能的に重要であり、かつ必要であることを明瞭に証明
している。興味深いことに、数系列のグルココルチコイ
ド耐性細胞に見出された非機能性の切除型変異体（すな
わち４０kd）は野生型受容体よりも効率的に核内に保持
されるが、転写を活性化し得ない（ヤマモト（Ｙamamot
o）ら、1976；アンドレアセン（Ａndreasen）およびゲ
ーリング（Ｇehring）1981；ウェストファル（Ｗestpha
l）ら、(1984)。これらの“核転移増加型”（nti）変異
体において失われた受容体断片は明らかに蛋白質のアミ
ノ末端である。それらはホルモン結合能を保持している
からである。本発明者らはτ1 がｈＧＲの主免疫原区と
一致することを指摘した（ワインバーガー（Ｗeinberge
r）ら、1985）。これは恐らくこれが分子の外表にある
ことを示す。この機能区がその機能を果たす様式につい
ての考察には、受容体の二量化をもたらす自己相互作
用、ＲＮＡポリメラーゼIIなどの一般的転写因子との相
互作用の可能性、および／または活性化された受容体の
残りの部分にアロステリック作用を及ぼすことによるＤ
ＮＡ結合の調節が含まれる(デルウェーク（Ｄellweg）
ら、1982）、τ1は受容体のアミノ末端、すなわちより
小型のエストロゲン受容体とは共有されない領域に含ま
れる。恐らくエストロゲン受容体が第２の蛋白質との相
互作用によりこの機能区と同等の機能を得るか、または
τ1 が他の調節分子との相互作用ではなくグルココルチ
コイド受容体自体の内部の他の残基と相互作用するので
あろう。転写活性化に影響を及ぼす他のτ領域（τ2と
呼ぶ）はエストロゲン受容体および v−erb−Ａ発癌遺
伝子中に存在する領域である。その位置からも、これが
ステロイド−およびＤＮＡ−結合区を結合させる“ちょ
うつがい”領域として作用するという可能性が示唆され
る。従ってこれらの変異体は受容体の活性化に必要なア
ロステリック形質転換を遮断するであろう。
グルココルチコイド受容体が一連の機能区からなるとい
う本発明者らの先の示唆を支持し、拡大する。ステロイ
ド結合に影響を与える変異体がすべてカルボキシル末端
に集中していることは注目に値する。この領域がホルモ
ンの特異性をコードする別個の機能区として機能するこ
とが示唆されるほか、これらの結果はこの受容体内に確
認された他の機能区が別個の機能を果たすという可能性
をも暗示する。従って、受容体が特定のＤＮＡ配列を認
識し、これと相互作用する能力は、エストロゲン受容体
および発癌遺伝子生成物 v−erb−Ａによって高度に保
持されているＣys−Ｌys−Ａrg に富む領域にあると思
われる。これらの領域における突然変異は受容体分子が
転写を活性化する能力を低下させるというのは論理的で
あると思われる。活性化はリガンドがアロステリック形
質転換を誘導する能力、および形質転換した分子がＤＮ
Ａを認識し、これと相互作用する能力の双方に依存する
からである。ステロイド受容体構造の最初のモデル（ワ
インバーガー（Ｗeinberger）ら、1985）に基づけば、
これらは突然変異誘発の解明に際し予想された結果であ
った。しかし予想されなかった結果は、転写活性に影響
を与える他の領域が少なくとも２か所確認されたことで
ある。これは、転写活性化に必要であるがステロイドま
たはＤＮＡの結合のいずれにも特異的に関与してはいな
い他の機能区が受容体中に存在するという興味深い可能
性を与える。変異体Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１４
は野生型の親和性をもってステロイドと結合するが、転
写活性が低下している。これらの変異体は本発明者らが
τ1と呼ぶこの機能区が完全なｈＧＲ 活性を得るために
機能的に重要であり、かつ必要であることを明瞭に証明
している。興味深いことに、数系列のグルココルチコイ
ド耐性細胞に見出された非機能性の切除型変異体（すな
わち４０kd）は野生型受容体よりも効率的に核内に保持
されるが、転写を活性化し得ない（ヤマモト（Ｙamamot
o）ら、1976；アンドレアセン（Ａndreasen）およびゲ
ーリング（Ｇehring）1981；ウェストファル（Ｗestpha
l）ら、(1984)。これらの“核転移増加型”（nti）変異
体において失われた受容体断片は明らかに蛋白質のアミ
ノ末端である。それらはホルモン結合能を保持している
からである。本発明者らはτ1 がｈＧＲの主免疫原区と
一致することを指摘した（ワインバーガー（Ｗeinberge
r）ら、1985）。これは恐らくこれが分子の外表にある
ことを示す。この機能区がその機能を果たす様式につい
ての考察には、受容体の二量化をもたらす自己相互作
用、ＲＮＡポリメラーゼIIなどの一般的転写因子との相
互作用の可能性、および／または活性化された受容体の
残りの部分にアロステリック作用を及ぼすことによるＤ
ＮＡ結合の調節が含まれる(デルウェーク（Ｄellweg）
ら、1982）、τ1は受容体のアミノ末端、すなわちより
小型のエストロゲン受容体とは共有されない領域に含ま
れる。恐らくエストロゲン受容体が第２の蛋白質との相
互作用によりこの機能区と同等の機能を得るか、または
τ1 が他の調節分子との相互作用ではなくグルココルチ
コイド受容体自体の内部の他の残基と相互作用するので
あろう。転写活性化に影響を及ぼす他のτ領域（τ2と
呼ぶ）はエストロゲン受容体および v−erb−Ａ発癌遺
伝子中に存在する領域である。その位置からも、これが
ステロイド−およびＤＮＡ−結合区を結合させる“ちょ
うつがい”領域として作用するという可能性が示唆され
る。従ってこれらの変異体は受容体の活性化に必要なア
ロステリック形質転換を遮断するであろう。
【０１５８】アミノ酸挿入配列により影響を受ける第３
の領域は、ワインバーガー(Ｗeinberger）ら（1985）に
より報告される推定ＤＮＡ結合区内に位置する。この機
能区はＣys−Ｌys−Ａrgに富む配列を含む２個の反復単
位からなり、v−erb−Ａ発癌遺伝子およびエストロゲン
受容体と比較して最も強く保守されるものである（ワイ
ンバーガー（Ｗeinberger）ら、1985；グリーン（Ｇree
n）ら、1986；グリーン（Ｇreen）ら、1986）。これら
の反復単位はまず因子ＴＦ−IIIa（ミラー（Ｍiller）
ら、1985）に観察され、それ以来多数の他の核酸結合性
蛋白質中に配列相同性研究によって見出された（バーグ
（Ｂerg）1986）。因子ＴＦ IIIaの実験的および理論的
研究に基づいてミラー（Ｍiller）ら、（1985）は蛋白質
がＤＮＡ分子を結合する新規な機構を提示した。彼らの
モデルにおいては各ユニットは亜鉛イオンを中心とした
“フィンガー状”構造に折れ曲がっている。１本のフィ
ンガーがＤＮＡの半回転に結合する。変異体Ｉ４２２お
よびＩ４４０はフィンガーモデルの中心となるモチーフ
Ｃys−Ｘ2−Ｃysを乱すアミノ酸挿入配列を有する。こ
れらの変異体は転写活性化に関しては全く不活性である
が、それらグルココルチコイド結合能は保持する。予備
実験が示すように、これらの変異体もホルモン処理後に
核に転座することができず、インビトロにおいてＤＮＡ
を結合することができない（エス・ホレンバーグ、未発
表の所見）。これらの突然変異した受容体はｈＧＲ中に
存在するフィンガーモチーフの機能的重要性を証明す
る。この領域に位置する第３の変異体Ｉ４２８は４個の
アミノ酸の添加によりフィンガーが伸びている。Ｉ４２
８の転写活性は大幅に損われる（野生型水準の２％）
が、なお検出可能である。従って各ループは亜鉛結合モ
チーフよりも変化に耐えると思われる。フィンガー様機
能区がｈＧＲにおいて機能的に重要であるという証明か
ら、本発明者らはステロイドホルモン結合体が原始的な
祖先由来のＤＮＡ結合蛋白質から進化した金属蛋白質で
あると提唱するに至った。
の領域は、ワインバーガー(Ｗeinberger）ら（1985）に
より報告される推定ＤＮＡ結合区内に位置する。この機
能区はＣys−Ｌys−Ａrgに富む配列を含む２個の反復単
位からなり、v−erb−Ａ発癌遺伝子およびエストロゲン
受容体と比較して最も強く保守されるものである（ワイ
ンバーガー（Ｗeinberger）ら、1985；グリーン（Ｇree
n）ら、1986；グリーン（Ｇreen）ら、1986）。これら
の反復単位はまず因子ＴＦ−IIIa（ミラー（Ｍiller）
ら、1985）に観察され、それ以来多数の他の核酸結合性
蛋白質中に配列相同性研究によって見出された（バーグ
（Ｂerg）1986）。因子ＴＦ IIIaの実験的および理論的
研究に基づいてミラー（Ｍiller）ら、（1985）は蛋白質
がＤＮＡ分子を結合する新規な機構を提示した。彼らの
モデルにおいては各ユニットは亜鉛イオンを中心とした
“フィンガー状”構造に折れ曲がっている。１本のフィ
ンガーがＤＮＡの半回転に結合する。変異体Ｉ４２２お
よびＩ４４０はフィンガーモデルの中心となるモチーフ
Ｃys−Ｘ2−Ｃysを乱すアミノ酸挿入配列を有する。こ
れらの変異体は転写活性化に関しては全く不活性である
が、それらグルココルチコイド結合能は保持する。予備
実験が示すように、これらの変異体もホルモン処理後に
核に転座することができず、インビトロにおいてＤＮＡ
を結合することができない（エス・ホレンバーグ、未発
表の所見）。これらの突然変異した受容体はｈＧＲ中に
存在するフィンガーモチーフの機能的重要性を証明す
る。この領域に位置する第３の変異体Ｉ４２８は４個の
アミノ酸の添加によりフィンガーが伸びている。Ｉ４２
８の転写活性は大幅に損われる（野生型水準の２％）
が、なお検出可能である。従って各ループは亜鉛結合モ
チーフよりも変化に耐えると思われる。フィンガー様機
能区がｈＧＲにおいて機能的に重要であるという証明か
ら、本発明者らはステロイドホルモン結合体が原始的な
祖先由来のＤＮＡ結合蛋白質から進化した金属蛋白質で
あると提唱するに至った。
【０１５９】これらのデータを合わせると、受容体は調
節機能区の集合体からなり、これらは原始的なステロイ
ドホルモン受容体中へ進化の過程で侵入凝縮されたもの
と思われ、これが哺乳動物ゲノム中に存在する一群の多
数のホルモン応答遺伝子を生じたことが示唆される。こ
の分子の転写活性はそれが遺伝学的スイッチとして作用
する潜在的能力をもつことを証明する。これは各種の進
化上の種族および恒常的機能の活性化におけるステロイ
ドホルモンの役割りと一致する。この突然変異の方式に
よれば、希望する小規模または大規模の欠失変異体のい
かなる組をも好都合に形成することができ、機能を研究
するために関連分子間の機能区を始動させることができ
る。この実験例に記載した迅速かつ定量的な機能アッセ
イと合わせて、τ、ＤＮＡ−およびステロイド−結合区
の機能性に関して特定の問題を提起することが可能とな
った。
節機能区の集合体からなり、これらは原始的なステロイ
ドホルモン受容体中へ進化の過程で侵入凝縮されたもの
と思われ、これが哺乳動物ゲノム中に存在する一群の多
数のホルモン応答遺伝子を生じたことが示唆される。こ
の分子の転写活性はそれが遺伝学的スイッチとして作用
する潜在的能力をもつことを証明する。これは各種の進
化上の種族および恒常的機能の活性化におけるステロイ
ドホルモンの役割りと一致する。この突然変異の方式に
よれば、希望する小規模または大規模の欠失変異体のい
かなる組をも好都合に形成することができ、機能を研究
するために関連分子間の機能区を始動させることができ
る。この実験例に記載した迅速かつ定量的な機能アッセ
イと合わせて、τ、ＤＮＡ−およびステロイド−結合区
の機能性に関して特定の問題を提起することが可能とな
った。
【０１６０】II．実験の部IIに述べた図に関する詳細な
説明 第９図 ｈＧＲ機能アッセイ法の模式図 このアッセイ法においては、ｈＧＲアルファｃＤＮＡを
含む発現ベクターまたはそれから誘導される変異体を、
ＣＡＴ遺伝子を保有するプラスミドと共にＭＴＶ ＬＴ
Ｒの制御下にＣＶ−１またはＣＯＳ細胞中へ共トランス
フェクションする。次いで細胞をホルモンの存在下また
は不在下で培養する。ＣＶ−１細胞はＣＡＴ活性の誘導
を監視するために用いられ、ＣＯＳ細胞はステロイド結
合能およびｈＧＲ蛋白質の発現を測定するために用いら
れた。
説明 第９図 ｈＧＲ機能アッセイ法の模式図 このアッセイ法においては、ｈＧＲアルファｃＤＮＡを
含む発現ベクターまたはそれから誘導される変異体を、
ＣＡＴ遺伝子を保有するプラスミドと共にＭＴＶ ＬＴ
Ｒの制御下にＣＶ−１またはＣＯＳ細胞中へ共トランス
フェクションする。次いで細胞をホルモンの存在下また
は不在下で培養する。ＣＶ−１細胞はＣＡＴ活性の誘導
を監視するために用いられ、ＣＯＳ細胞はステロイド結
合能およびｈＧＲ蛋白質の発現を測定するために用いら
れた。
【０１６１】第１０図 ｈＧＲ蛋白質の発現 ＣＯＳ細胞をトランスフェクションし(中央レーン)、ま
たはプラスミドｐＲＳｈＧＲアルファでトランスフェク
ションし（右レーン）、２日後にｈＧＲ蛋白質の存在に
つき分析した。粗製の細胞質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により溶解し、ウェスタンブロットにより分析した。Ｉ
Ｍ９細胞からの細胞質抽出物を比較のため同一ゲルに付
与した（左レーン）。
たはプラスミドｐＲＳｈＧＲアルファでトランスフェク
ションし（右レーン）、２日後にｈＧＲ蛋白質の存在に
つき分析した。粗製の細胞質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により溶解し、ウェスタンブロットにより分析した。Ｉ
Ｍ９細胞からの細胞質抽出物を比較のため同一ゲルに付
与した（左レーン）。
【０１６２】第１１図 ｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導 サブコンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞をｐＲＳＶga
l(対照)、ｐＲＳｈＧＲアルファ、またはｐＲＳｈＧＲベ
ータ、およびレポータープラスミドｐＭＴＶＣＡＴで共
トランスフェクションし、１０nＭデキサメサゾンの存
在下(＋)または不在下(−）で２日間培養した。ＣＡＴ
アッセイは実験法（実験の部II・Ｆ．）に示したとおり
行われた。Ｃ．クロラムフェニコール；ＡＣ、３−アセ
チルクロラムフェニコール。
l(対照)、ｐＲＳｈＧＲアルファ、またはｐＲＳｈＧＲベ
ータ、およびレポータープラスミドｐＭＴＶＣＡＴで共
トランスフェクションし、１０nＭデキサメサゾンの存
在下(＋)または不在下(−）で２日間培養した。ＣＡＴ
アッセイは実験法（実験の部II・Ｆ．）に示したとおり
行われた。Ｃ．クロラムフェニコール；ＡＣ、３−アセ
チルクロラムフェニコール。
【０１６３】第１２図 ＤＥＸに対する用量応答性およびpＲＳｈＧＲアルファ
の滴定 （Ａ）pＲＳｈＧＲアルファのおよび pＭＴＶＣＡＴ
（各プラスミド１０μｇ）で共トランスフェクションし
たＣＶ−１細胞を漸増する濃度のデキサメサゾンの存在
下に培養した。ＤＥＸに対する見掛けのＥＤ50 値は３n
Ｍであった。ＣＡＴ活性の水準を特定の実験において観
察された最大応答に対する％としてプロットした。ＤＥ
Ｘの不在下ではＣＡＴ活性は検出されなかった。
の滴定 （Ａ）pＲＳｈＧＲアルファのおよび pＭＴＶＣＡＴ
（各プラスミド１０μｇ）で共トランスフェクションし
たＣＶ−１細胞を漸増する濃度のデキサメサゾンの存在
下に培養した。ＤＥＸに対する見掛けのＥＤ50 値は３n
Ｍであった。ＣＡＴ活性の水準を特定の実験において観
察された最大応答に対する％としてプロットした。ＤＥ
Ｘの不在下ではＣＡＴ活性は検出されなかった。
【０１６４】（Ｂ）滴定。漸増する量のｐＲＳｈＧＲア
ルファをサブコンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞中へ
一定量の pＭＴＶＣＡＴ（５μｇ）と共に共トランスフ
ェクションした。プラスミド pＢＲ３２２をキャリヤー
ＤＮＡとして用いて全体としてＤＮＡ３０μｇ／プレー
トを得た。１０nＭ・ＤＥＸの存在下に細胞を２日間培
養し、ＣＡＴ活性を測定し、（Ａ）の場合と同様にプロ
ットした。
ルファをサブコンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞中へ
一定量の pＭＴＶＣＡＴ（５μｇ）と共に共トランスフ
ェクションした。プラスミド pＢＲ３２２をキャリヤー
ＤＮＡとして用いて全体としてＤＮＡ３０μｇ／プレー
トを得た。１０nＭ・ＤＥＸの存在下に細胞を２日間培
養し、ＣＡＴ活性を測定し、（Ａ）の場合と同様にプロ
ットした。
【０１６５】第１３図 ｈＧＲにおける機能区の位置 ｈＧＲを転写活性化に関与する推定機能区τ1およびτ2
（斜線を施した領域により示す）と共に模式的に示す。
ＤＮＡ結合区は点彩を施した四角で、ステロイド結合区
は点を施した四角により表わされる。ＢamＨＩリンカー
挿入配列は三角形および丸印で表わす。数字はその後で
挿入が起こるアミノ酸の位置を意味する（実験の部Ｉ参
照）。白地の記号はＣＡＴ活性により測定して野生型水
準のホルモン依存性転写活性を誘導しうる変異体を表わ
す。黒地の記号は大幅に低下した、または無効になった
機能を示す。棒は機能を示さないｈＧＲベータ中に存在
する異なるアミノ酸の位置を示す。
（斜線を施した領域により示す）と共に模式的に示す。
ＤＮＡ結合区は点彩を施した四角で、ステロイド結合区
は点を施した四角により表わされる。ＢamＨＩリンカー
挿入配列は三角形および丸印で表わす。数字はその後で
挿入が起こるアミノ酸の位置を意味する（実験の部Ｉ参
照）。白地の記号はＣＡＴ活性により測定して野生型水
準のホルモン依存性転写活性を誘導しうる変異体を表わ
す。黒地の記号は大幅に低下した、または無効になった
機能を示す。棒は機能を示さないｈＧＲベータ中に存在
する異なるアミノ酸の位置を示す。
【０１６６】II．Ｆ．実験法 （a）培養条件 ＣＶ−１およびＣＯＳ−１細胞は３７℃で、５％（v／
v）ウシ胎仔血清、アンピシリン４００μｇ／mｌ、およ
びストレプトマイシン１００μｇ／mｌを補充したダル
ベッコの改良イーグル培地において増殖させた。良好な
トランスフェクション効率を得るために細胞を３日毎に
継代し、コンフルエンシーに到達させなかった。トラン
スフェクションされた培養物は５％ＣＯ2下で３７℃に
保持された。
v）ウシ胎仔血清、アンピシリン４００μｇ／mｌ、およ
びストレプトマイシン１００μｇ／mｌを補充したダル
ベッコの改良イーグル培地において増殖させた。良好な
トランスフェクション効率を得るために細胞を３日毎に
継代し、コンフルエンシーに到達させなかった。トラン
スフェクションされた培養物は５％ＣＯ2下で３７℃に
保持された。
【０１６７】（b）組換えプラスミド プラスミドｐＲＳｈＧＲアルファおよびｐＲＳｈＧＲベ
ータ、すなわちＣＶ−１およびＣＯＳ細胞において２形
態のｈＧＲの合成を方向づけるものは、３個のＤＮＡ断
片から構成された。第１断片はｐＲＳＶＣＡＴゴルマン
（Ｇorman）ら、１９８２b）から誘導され、ＲＳＶ Ｌ
ＴＲ，pＢＲ３２２配列、およびＳＶ４０ポリアデニル
化部位を含む。この断片を得るためにはpＲＳＶＣＡＴ
をＨinｄIIIで切断し、各末端をＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片で処理することにより修復した。ＫpnＩ
リンカーを標準法によりこれらの末端に付加し(マニア
チス（Ｍaniatis)ら、１９８２）、このプラスミドを次
いでＨpaＩで切断し、これによってＣＡＴコード化配列
を除去した。第２の断片はｈＧＲアルファまたはｈＧＲ
ベータのいずれのコード化配列をも含む。プラスミド p
ＯＢ１１３および pＯＢ１１７（エス．エム．ホレンバ
ーグ、未発表の結果）、すなわちそれぞれアルファ形お
よびベータ形のｈＧＲのコード化配列全体を含むものを
ＢamＨＩで切断した。各末端をクレノー断片で修復し、
これらのプラスミをＫpnＩで切断した。第１および第２
断片のリゲーションによりプラスミド pＲｈＧＲアルフ
ァおよびpＲｈＧＲベータを形成した。付加すべき第３
の断片はプラスミドpＳＶ２ＣＡＴから得たＳＶ ４０Ｏ
ＲＩを含むＰvuII−ＨindIIIからなる（ゴルマン(Ｇorm
an）ら、１９８２a)。この断片の各末端をクレノー断片
で処理することにより修復し、これらにＮdeＩリンカー
を付加した。ＳＶ４０ ＯＲＩを含むこのＤＮＡ断片を
次いで pＲｈＧＲアルファおよび pＲｈＧＲベータ中に
存在する１個のＮdeＩ部位に導入した。最後にこれらの
プラスミド中に存在する１個のＢamＨＩ部位を破壊し、
合成アダプターの挿入によりＸhoＩと置換した。得られ
たプラスミドはpＲＳｈＧＲアダプターおよびｐＲＳｈ
ＧＲベータであった。プラスミド pＭＴＶＣＡＴおよび
pＭＴＩaＣＡＴはエス．ゴールド氏からの供与であっ
た。
ータ、すなわちＣＶ−１およびＣＯＳ細胞において２形
態のｈＧＲの合成を方向づけるものは、３個のＤＮＡ断
片から構成された。第１断片はｐＲＳＶＣＡＴゴルマン
（Ｇorman）ら、１９８２b）から誘導され、ＲＳＶ Ｌ
ＴＲ，pＢＲ３２２配列、およびＳＶ４０ポリアデニル
化部位を含む。この断片を得るためにはpＲＳＶＣＡＴ
をＨinｄIIIで切断し、各末端をＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片で処理することにより修復した。ＫpnＩ
リンカーを標準法によりこれらの末端に付加し(マニア
チス（Ｍaniatis)ら、１９８２）、このプラスミドを次
いでＨpaＩで切断し、これによってＣＡＴコード化配列
を除去した。第２の断片はｈＧＲアルファまたはｈＧＲ
ベータのいずれのコード化配列をも含む。プラスミド p
ＯＢ１１３および pＯＢ１１７（エス．エム．ホレンバ
ーグ、未発表の結果）、すなわちそれぞれアルファ形お
よびベータ形のｈＧＲのコード化配列全体を含むものを
ＢamＨＩで切断した。各末端をクレノー断片で修復し、
これらのプラスミをＫpnＩで切断した。第１および第２
断片のリゲーションによりプラスミド pＲｈＧＲアルフ
ァおよびpＲｈＧＲベータを形成した。付加すべき第３
の断片はプラスミドpＳＶ２ＣＡＴから得たＳＶ ４０Ｏ
ＲＩを含むＰvuII−ＨindIIIからなる（ゴルマン(Ｇorm
an）ら、１９８２a)。この断片の各末端をクレノー断片
で処理することにより修復し、これらにＮdeＩリンカー
を付加した。ＳＶ４０ ＯＲＩを含むこのＤＮＡ断片を
次いで pＲｈＧＲアルファおよび pＲｈＧＲベータ中に
存在する１個のＮdeＩ部位に導入した。最後にこれらの
プラスミド中に存在する１個のＢamＨＩ部位を破壊し、
合成アダプターの挿入によりＸhoＩと置換した。得られ
たプラスミドはpＲＳｈＧＲアダプターおよびｐＲＳｈ
ＧＲベータであった。プラスミド pＭＴＶＣＡＴおよび
pＭＴＩaＣＡＴはエス．ゴールド氏からの供与であっ
た。
【０１６８】（c）挿入突然変異形成 ｈＧＲアルファの野性型配列を乱すアミノ酸の挿入は下
記の方法により行われた。全長線状ｐＲＳｈＧＲアルフ
ァＤＮＡはＡluＩ，ＤpnＩ，およびＢstＮＩ制限酵素に
よる部分消化によって形成された。ＢstＮＩにより切断
したＤＮＡの場合、各末端をまずクレノー断片で修復し
た。次いでＤＮＡ分子をアガロースゲル電気泳動により
分画し、線状のプラスミドを抽出した。８−または１２
−merのＢ amＨＩリンカーを付加してｈＧＲアミノ酸配
列の本来の解読フレームを再生した。ｈＧＲのコード化
領域に１個のＢamＨＩリンカーを保有するプラスミドの
配列を決定し（マクサム（Ｍaxam）およびギルバート
（Ｇilbert）、1980）、リンカーの位置およびｈＧＲ変
異体の全体性を確認した。
記の方法により行われた。全長線状ｐＲＳｈＧＲアルフ
ァＤＮＡはＡluＩ，ＤpnＩ，およびＢstＮＩ制限酵素に
よる部分消化によって形成された。ＢstＮＩにより切断
したＤＮＡの場合、各末端をまずクレノー断片で修復し
た。次いでＤＮＡ分子をアガロースゲル電気泳動により
分画し、線状のプラスミドを抽出した。８−または１２
−merのＢ amＨＩリンカーを付加してｈＧＲアミノ酸配
列の本来の解読フレームを再生した。ｈＧＲのコード化
領域に１個のＢamＨＩリンカーを保有するプラスミドの
配列を決定し（マクサム（Ｍaxam）およびギルバート
（Ｇilbert）、1980）、リンカーの位置およびｈＧＲ変
異体の全体性を確認した。
【０１６９】（d）細胞トランスフェクションおよびＣ
ＡＴアッセイ 組換えＤＮＡ構造体をリン酸カルシウム共沈法によりＣ
Ｖ−１細胞中へ（ウィグラー（Ｗigler）ら、1979）、
またはＤＥＡＥ−デキストランによりＣＯＳ細胞中へ
（ディーンズ（Ｄeans）ら、1984）導入した。トランス
フェクションに用いた各プラスミド調製物は２種の連続
ＣsＣｌ−ＥtＢr平衡濃度勾配により精製された。ＣＡ
Ｔ遺伝子構造物でトランスフェクションしたのち、ゴル
マン(Ｇorman）ら（１９８２a）の記載に従ってＣＶ−
１細胞をＣＡＴアッセイ用に調製した。これらのアッセ
イは全細胞抽出物の３分の１を用いて、インキュベーシ
ョン時間６時間で行われた。
ＡＴアッセイ 組換えＤＮＡ構造体をリン酸カルシウム共沈法によりＣ
Ｖ−１細胞中へ（ウィグラー（Ｗigler）ら、1979）、
またはＤＥＡＥ−デキストランによりＣＯＳ細胞中へ
（ディーンズ（Ｄeans）ら、1984）導入した。トランス
フェクションに用いた各プラスミド調製物は２種の連続
ＣsＣｌ−ＥtＢr平衡濃度勾配により精製された。ＣＡ
Ｔ遺伝子構造物でトランスフェクションしたのち、ゴル
マン(Ｇorman）ら（１９８２a）の記載に従ってＣＶ−
１細胞をＣＡＴアッセイ用に調製した。これらのアッセ
イは全細胞抽出物の３分の１を用いて、インキュベーシ
ョン時間６時間で行われた。
【０１７０】（e）ウェスタンブロット分析 ＣＯＳ細胞からの粗抽出物は１０mＭトリス−ＨＣｌ（p
Ｈ７.5）、１００mＭＮaＣｌ，１mＭ ＥＤＴＡ，０.５
％トライトンＸ−１００を含有する緩衝液を用いる細胞
溶解により調製された。等量の蛋白質(１００μｇ)を
７.５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により溶解
し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗ｈＧＲ抗体
ＧＲ８８４（ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４）によ
り検査したのち125Ｉ標識−黄色ぶどう球菌蛋白質Ａに
より検出した。フィルターを風乾し、フィルムに露光し
た。受容体の量をオートラジオグラフのスキャニングに
より定量した。
Ｈ７.5）、１００mＭＮaＣｌ，１mＭ ＥＤＴＡ，０.５
％トライトンＸ−１００を含有する緩衝液を用いる細胞
溶解により調製された。等量の蛋白質(１００μｇ)を
７.５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により溶解
し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗ｈＧＲ抗体
ＧＲ８８４（ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４）によ
り検査したのち125Ｉ標識−黄色ぶどう球菌蛋白質Ａに
より検出した。フィルターを風乾し、フィルムに露光し
た。受容体の量をオートラジオグラフのスキャニングに
より定量した。
【０１７１】（f）ステロイド結合のアッセイ ＣＯＳ細胞を、１０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ７.５）、
１００mＭ ＮaＣｌ，１mＭＥＤＴＡ，５μｇ／mｌ ア
ンチペイン、５μｇ／mｌロイペプチンおよび０.５mＭ
ＰＭＳＦを含有する低張緩衝液中でダウンスホモジナ
イゼーションにより細胞溶解し、15,000×ｇで１０分間
遠心分離してサイトゾル画分を得た。１００mＭ ＮaＣ
ｌに調整され、サイトゾル画分からの蛋白質１０μｇお
よび２×１０-8〔3Ｈ〕ＤＥＸ（アメルシャム，９５Ｃi
／mmoｌ）を全容量２００μｌに含有する低張緩衝液中
でインキュベーションを行った。非特異的結合は２×１
０-6非標識ＤＥＸの添加により測定された。反応は０℃
で２時間行われ、次いで５０％デキストラン被覆活性炭
（１０：１活性炭：デキストラン）２０μｌと共にイン
キュベーションし、15,000×ｇで４℃において２分間、
遠心分離した。上層液をベックマンＬＳ−７８００液体
シンチレーション分光光度計による液体シンチレーショ
ン法によって計数した。各アッセイは通常２５００〜３
０００cpm〔3Ｈ〕標識ステロイドを与えた。非標識ＤＥ
Ｘはこの結合の７０％に対し競合した。
１００mＭ ＮaＣｌ，１mＭＥＤＴＡ，５μｇ／mｌ ア
ンチペイン、５μｇ／mｌロイペプチンおよび０.５mＭ
ＰＭＳＦを含有する低張緩衝液中でダウンスホモジナ
イゼーションにより細胞溶解し、15,000×ｇで１０分間
遠心分離してサイトゾル画分を得た。１００mＭ ＮaＣ
ｌに調整され、サイトゾル画分からの蛋白質１０μｇお
よび２×１０-8〔3Ｈ〕ＤＥＸ（アメルシャム，９５Ｃi
／mmoｌ）を全容量２００μｌに含有する低張緩衝液中
でインキュベーションを行った。非特異的結合は２×１
０-6非標識ＤＥＸの添加により測定された。反応は０℃
で２時間行われ、次いで５０％デキストラン被覆活性炭
（１０：１活性炭：デキストラン）２０μｌと共にイン
キュベーションし、15,000×ｇで４℃において２分間、
遠心分離した。上層液をベックマンＬＳ−７８００液体
シンチレーション分光光度計による液体シンチレーショ
ン法によって計数した。各アッセイは通常２５００〜３
０００cpm〔3Ｈ〕標識ステロイドを与えた。非標識ＤＥ
Ｘはこの結合の７０％に対し競合した。
【０１７２】II．実験の部IIで参照した参考文献 １．Ａlwine，Ｊ．Ｃ.，Ｍol．Ｃell．Ｂiol.，5：1034
−1043（1983）。 ２．Ａndreasen，Ｐ．Ａ.，and Ｇehring，Ｕ.，Ｅur．
J.Ｂiochem.,120:443-449（1981）。 3. Ｂazett−Ｊones,Ｄ.Ｐ.,Ｙeckel,Ｍ.,and Ｇottes
feld,Ｊ.Ｆ.,Ｎature,317：824−828(1985)。 4. Ｂerg,Ｊ.,Ｓcience，232：485−487（1986）。 5. Ｃarlstedt−Ｄuke,Ｊ.,Ｏkret,Ｓ.,Ｗrange,Ｏ.,a
nd Ｇustafsson，Ｊ.−Ａ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i.，Ｕ.Ｓ.Ａ.,79：4260−4264（1982）。 6. Ｃhandler，Ｖ.Ｌ.,Ｍaler，Ｂ．Ａ.，and Ｙamamo
to，Ｋ.Ｒ.，Cell, 33:489-499(1983)。 7. Ｄeans,Ｒ.Ｊ.,Ｄenis，Ｋ.Ａ.，Ｔaylor，Ａ.，an
d Ｗall,Ｒ.，Ｐroc.Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，Ｕ.Ｓ.
Ａ.，81：1292−1296（1984） 8. Ｄellweg，Ｈ.-Ｇ.，Ｈotz，Ａ.，Ｍugele，Ｋ.,an
d Ｇehring,Ｕ.,ＥＭＢＯ Ｊ.，1：285-289（198
2）。 9. Ｄynan,Ｗ.Ｓ.，and Ｔjian，Ｒ.，Ｃell，32：669
−680（1983）。 10. Ｇarges，Ｓ.，and Ａdhya，Ｓ.，Ｃell,41：745−
751（1985）。 11. Ｇluzman，Ｙ.，Ｃell，23：175−182（1981）。 12. Ｇorman．Ｃ.Ｍ.，Ｍoffat，Ｌ.Ｆ..,and Ｈowar
d，Ｂ.Ｈ.，Ｍol.Ｃell.Ｂ iol.，2：1044−1051（1982
a）。 13. Ｇorman．Ｃ.Ｍ.，Ｍerlino，Ｇ.Ｔ.，Ｗillingha
m，Ｍ.Ｃ.，Ｐastan,I.,and Ｈoward,Ｂ.Ｈ.,Ｐroc.Ｎa
tl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ.,79：6777−6781(1982b)。 14. Ｇreen, Ｓ.,Ｗalter,Ｐ.,Ｋumar,Ｖ.,Ｋrust,Ａ.,
Ｂornert,Ｊ.Ｍ.,Ａrgos,Ｐ.,and Ｃhambon,Ｐ.,Ｎatur
e,320：134−139（1986）。 15. Ｇreen,Ｇ.Ｌ.,Ｇilna，Ｐ.,Ｗaterfield,Ｍ.,Ｂak
er,Ａ.,Ｈort,Ｙ.,andＳhine,Ｊ.,Ｓcience,321:1150−
1154（1986）。 16. Ｈarmon，Ｊ.Ｍ.，Ｅisen，Ｈ.Ｊ.，Ｂrower，Ｓ.
Ｔ.，Ｓimons,Ｓ.Ｓ.,Ｌangley,Ｃ.Ｌ.,and Ｔhompso
n,,Ｅ.Ｂ.,Ｃancer Ｒes.,44：4540−4547（1984）。 17. Ｈeberlein,Ｕ.,Ｅngland,Ｂ.,and Ｔjian,Ｒ.,Ｃe
ll,41:965−977(1985)。 18. Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｗeinberger,Ｃ.,Ｏng，Ｅ.
Ｓ.，Ｃerelli,Ｇ.,Ｏro,Ａ.,Ｌebo,Ｒ.,Ｔhompson,Ｅ.
Ｂ.,Ｒosenfeld,Ｍ.Ｇ.,and Ｅvans,Ｒ.Ｍ.,Ｎat ure, 3
18：635−641（1985）。 19. Ｋhoury,Ｇ.,and Ｇruss,Ｐ.,Ｍolecular Ｃlonin
g：Ａ Laboratory Ｍanua l,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎe
w Ｙork（1982）。 20. Ｍaxam，Ａ.Ｍ.,and Ｇilbert,Ｗ.，Ｐroc．Ｎatl.
Ａcad.Sci．ＵＳＡ,74：560−564(1977)。 21. ＭcKay,Ｄ.Ｂ.,and Ｓteitz,Ｔ.Ａ.,Ｎature，29
0：744−749（1981）。 22. Ｍiller，Ｊ.，ＭcLachlan，Ａ.Ｄ.，and Ｋlug,
Ａ.，ＥＭＢＯ Ｊ.４：1609−1614（1985）。 23. Ｍoreau,Ｐ.,Ｈen,Ｒ.,Ｗasylyk,Ｂ.,Ｅverett,
Ｒ.,Ｇaub,Ｍ.Ｐ., and Ｃhambon.Ｐ.,Ｎucl.Ａcids Ｒ
es.,9：6047−6067（1981）。 24. Ｐarker,Ｃ.Ｓ.,and Ｔopol,ｊ.,Ｃell,37：273−2
83（1984）。 25..Ｐayvar,Ｆ.,ＤeFranco,Ｄ.,Ｆirestone,Ｇ.Ｌ.,Ｅ
dgar,Ｂ.Ｗrange,Ｏ.,Ｏkret，Ｓ.,Ｇustafsson,Ｊ.−
Ａ.,and Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｃell,35：381−392（198
3）。 26. Ｒeichman,Ｍ.Ｅ.,Ｆoster,Ｃ.Ｍ.,Ｅisen,Ｌ.Ｐ.,
Ｅisen,Ｈ.Ｊ.,Ｔorain,Ｂ.Ｆ.,and Ｓimons,Ｓ.Ｓ.,Ｊ
r.,Ｂiochemistry,23：5376−5384(1984)。 27. Ｒingold,Ｇ.Ｍ.,Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｂishop,Ｊ.
Ｍ.,and Ｖarmus,Ｈ. Ｅ.,Ｐroc.Ｎucl.Ａcad.Ｓci.,Ｕ
SＡ 74：2879−2883（1977）。 28. Ｓawadogo,Ｍ.,and Ｒoeder,Ｒ.Ｇ.,Ｃell,43：165
−175（1985）。 29. Ｓcholer,Ｈ.Ｒ.,and Ｇruss,Ｐ.,Ｃell,36：403−
411（1984）。 30. Ｓhymala,Ｇ.,Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.,6
4：408−415（1975）。 31. Ucker,D.S.,Firestone,G.L.,and Yamamoto,K.R.,Mo
l.Cell.Ｂiol.,3：551−561（1983）。 32. Ｗasylyk,Ｂ.,Ｗasylyk,Ｃ.,Ａugereau,Ｐ.,and Ｃ
hambon,Ｐ.,Ｃell, 32：503−514（1983）。 33. Ｗeinberger,Ｃ.,Ｈollenberg,Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld,
Ｍ.Ｇ.,and Evans,Ｒ.Ｍ.,Ｎature,318：670−672（198
5）。 34. Ｗestphal，Ｈ.Ｍ.，Ｍugele，Ｋ.，Ｂeato，Ｍ.，
and Ｇehring,Ｕ.,ＥＭＢＯ Ｊ.,3：1493−1498（198
4）。 35. Ｗigler,Ｍ.,Ｓweet,Ｒ.,Ｓim,Ｇ.Ｋ.,Ｗold,Ｂ.,
Ｐellicer,Ａ.,Ｌacy,Ｅ.,Ｍaniatis,Ｔ.,Ｓilverstei
n,Ｓ.,and Ａxel,Ｒ.,Ｃell,16：777−785（1979）。 36. Ｗrange，Ｏ.，Ｏkret，Ｓ.,Ｒadojcic，Ｍ.，Ｃar
lstedt−Ｄuke,Ｊ.,andＧustafsson,Ｊ.−Ａ.,Ｊ.Ｂio
l.Ｃhem.,259：4534−4541（1984）。 37 Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｇehring,Ｕ.,Ｓtampfer,Ｍ.
Ｒ.,and Ｓibley,Ｃ.,Ｒec.Ｐrog.Ｈormone Ｒes.,32：
3−32（1976）。 38 Ｚaret,Ｋ.Ｓ.,and Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｃell,38：2
9−38（1984）。
−1043（1983）。 ２．Ａndreasen，Ｐ．Ａ.，and Ｇehring，Ｕ.，Ｅur．
J.Ｂiochem.,120:443-449（1981）。 3. Ｂazett−Ｊones,Ｄ.Ｐ.,Ｙeckel,Ｍ.,and Ｇottes
feld,Ｊ.Ｆ.,Ｎature,317：824−828(1985)。 4. Ｂerg,Ｊ.,Ｓcience，232：485−487（1986）。 5. Ｃarlstedt−Ｄuke,Ｊ.,Ｏkret,Ｓ.,Ｗrange,Ｏ.,a
nd Ｇustafsson，Ｊ.−Ａ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i.，Ｕ.Ｓ.Ａ.,79：4260−4264（1982）。 6. Ｃhandler，Ｖ.Ｌ.,Ｍaler，Ｂ．Ａ.，and Ｙamamo
to，Ｋ.Ｒ.，Cell, 33:489-499(1983)。 7. Ｄeans,Ｒ.Ｊ.,Ｄenis，Ｋ.Ａ.，Ｔaylor，Ａ.，an
d Ｗall,Ｒ.，Ｐroc.Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，Ｕ.Ｓ.
Ａ.，81：1292−1296（1984） 8. Ｄellweg，Ｈ.-Ｇ.，Ｈotz，Ａ.，Ｍugele，Ｋ.,an
d Ｇehring,Ｕ.,ＥＭＢＯ Ｊ.，1：285-289（198
2）。 9. Ｄynan,Ｗ.Ｓ.，and Ｔjian，Ｒ.，Ｃell，32：669
−680（1983）。 10. Ｇarges，Ｓ.，and Ａdhya，Ｓ.，Ｃell,41：745−
751（1985）。 11. Ｇluzman，Ｙ.，Ｃell，23：175−182（1981）。 12. Ｇorman．Ｃ.Ｍ.，Ｍoffat，Ｌ.Ｆ..,and Ｈowar
d，Ｂ.Ｈ.，Ｍol.Ｃell.Ｂ iol.，2：1044−1051（1982
a）。 13. Ｇorman．Ｃ.Ｍ.，Ｍerlino，Ｇ.Ｔ.，Ｗillingha
m，Ｍ.Ｃ.，Ｐastan,I.,and Ｈoward,Ｂ.Ｈ.,Ｐroc.Ｎa
tl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ.,79：6777−6781(1982b)。 14. Ｇreen, Ｓ.,Ｗalter,Ｐ.,Ｋumar,Ｖ.,Ｋrust,Ａ.,
Ｂornert,Ｊ.Ｍ.,Ａrgos,Ｐ.,and Ｃhambon,Ｐ.,Ｎatur
e,320：134−139（1986）。 15. Ｇreen,Ｇ.Ｌ.,Ｇilna，Ｐ.,Ｗaterfield,Ｍ.,Ｂak
er,Ａ.,Ｈort,Ｙ.,andＳhine,Ｊ.,Ｓcience,321:1150−
1154（1986）。 16. Ｈarmon，Ｊ.Ｍ.，Ｅisen，Ｈ.Ｊ.，Ｂrower，Ｓ.
Ｔ.，Ｓimons,Ｓ.Ｓ.,Ｌangley,Ｃ.Ｌ.,and Ｔhompso
n,,Ｅ.Ｂ.,Ｃancer Ｒes.,44：4540−4547（1984）。 17. Ｈeberlein,Ｕ.,Ｅngland,Ｂ.,and Ｔjian,Ｒ.,Ｃe
ll,41:965−977(1985)。 18. Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｗeinberger,Ｃ.,Ｏng，Ｅ.
Ｓ.，Ｃerelli,Ｇ.,Ｏro,Ａ.,Ｌebo,Ｒ.,Ｔhompson,Ｅ.
Ｂ.,Ｒosenfeld,Ｍ.Ｇ.,and Ｅvans,Ｒ.Ｍ.,Ｎat ure, 3
18：635−641（1985）。 19. Ｋhoury,Ｇ.,and Ｇruss,Ｐ.,Ｍolecular Ｃlonin
g：Ａ Laboratory Ｍanua l,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎe
w Ｙork（1982）。 20. Ｍaxam，Ａ.Ｍ.,and Ｇilbert,Ｗ.，Ｐroc．Ｎatl.
Ａcad.Sci．ＵＳＡ,74：560−564(1977)。 21. ＭcKay,Ｄ.Ｂ.,and Ｓteitz,Ｔ.Ａ.,Ｎature，29
0：744−749（1981）。 22. Ｍiller，Ｊ.，ＭcLachlan，Ａ.Ｄ.，and Ｋlug,
Ａ.，ＥＭＢＯ Ｊ.４：1609−1614（1985）。 23. Ｍoreau,Ｐ.,Ｈen,Ｒ.,Ｗasylyk,Ｂ.,Ｅverett,
Ｒ.,Ｇaub,Ｍ.Ｐ., and Ｃhambon.Ｐ.,Ｎucl.Ａcids Ｒ
es.,9：6047−6067（1981）。 24. Ｐarker,Ｃ.Ｓ.,and Ｔopol,ｊ.,Ｃell,37：273−2
83（1984）。 25..Ｐayvar,Ｆ.,ＤeFranco,Ｄ.,Ｆirestone,Ｇ.Ｌ.,Ｅ
dgar,Ｂ.Ｗrange,Ｏ.,Ｏkret，Ｓ.,Ｇustafsson,Ｊ.−
Ａ.,and Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｃell,35：381−392（198
3）。 26. Ｒeichman,Ｍ.Ｅ.,Ｆoster,Ｃ.Ｍ.,Ｅisen,Ｌ.Ｐ.,
Ｅisen,Ｈ.Ｊ.,Ｔorain,Ｂ.Ｆ.,and Ｓimons,Ｓ.Ｓ.,Ｊ
r.,Ｂiochemistry,23：5376−5384(1984)。 27. Ｒingold,Ｇ.Ｍ.,Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｂishop,Ｊ.
Ｍ.,and Ｖarmus,Ｈ. Ｅ.,Ｐroc.Ｎucl.Ａcad.Ｓci.,Ｕ
SＡ 74：2879−2883（1977）。 28. Ｓawadogo,Ｍ.,and Ｒoeder,Ｒ.Ｇ.,Ｃell,43：165
−175（1985）。 29. Ｓcholer,Ｈ.Ｒ.,and Ｇruss,Ｐ.,Ｃell,36：403−
411（1984）。 30. Ｓhymala,Ｇ.,Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.,6
4：408−415（1975）。 31. Ucker,D.S.,Firestone,G.L.,and Yamamoto,K.R.,Mo
l.Cell.Ｂiol.,3：551−561（1983）。 32. Ｗasylyk,Ｂ.,Ｗasylyk,Ｃ.,Ａugereau,Ｐ.,and Ｃ
hambon,Ｐ.,Ｃell, 32：503−514（1983）。 33. Ｗeinberger,Ｃ.,Ｈollenberg,Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld,
Ｍ.Ｇ.,and Evans,Ｒ.Ｍ.,Ｎature,318：670−672（198
5）。 34. Ｗestphal，Ｈ.Ｍ.，Ｍugele，Ｋ.，Ｂeato，Ｍ.，
and Ｇehring,Ｕ.,ＥＭＢＯ Ｊ.,3：1493−1498（198
4）。 35. Ｗigler,Ｍ.,Ｓweet,Ｒ.,Ｓim,Ｇ.Ｋ.,Ｗold,Ｂ.,
Ｐellicer,Ａ.,Ｌacy,Ｅ.,Ｍaniatis,Ｔ.,Ｓilverstei
n,Ｓ.,and Ａxel,Ｒ.,Ｃell,16：777−785（1979）。 36. Ｗrange，Ｏ.，Ｏkret，Ｓ.,Ｒadojcic，Ｍ.，Ｃar
lstedt−Ｄuke,Ｊ.,andＧustafsson,Ｊ.−Ａ.,Ｊ.Ｂio
l.Ｃhem.,259：4534−4541（1984）。 37 Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｇehring,Ｕ.,Ｓtampfer,Ｍ.
Ｒ.,and Ｓibley,Ｃ.,Ｒec.Ｐrog.Ｈormone Ｒes.,32：
3−32（1976）。 38 Ｚaret,Ｋ.Ｓ.,and Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｃell,38：2
9−38（1984）。
【０１７３】実験の部III c−erb−Ａ遺伝子は甲状腺ホルモン受容体をコードするIII．Ａ．概要および序論 ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ)の相補ＤＮＡ
はその塩基配列が決定されており（Ｗeinbergerら、198
5bおよび実験の部Ｉを参照）、機能的に活性であること
が分かっている（実験の部IIを参照）。興味あることに
は、その受容体の塩基配列解析により、それは鳥類の赤
芽球症ウイルス(ＡＥＶ)のv−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物に
関係のあることが見出された（Ｗeinberger ら、1985を
参照）。これはステロイド受容体とerb−Ａ腫瘍遺伝子
産物が共通の原始的原型(primordial archetype)を共有
し、そしてerb−Ａ原腫瘍遺伝子産物もまたＤＮＡエン
ハンサー因子と結合する蛋白質でありうるという提案へ
導いた。ヒトエストロゲン（Ｇreenら、1986 およびＧr
eeneら、1986）、ニワトリプロゲステロン(Ｊeltschら、
1986およびＣonneelyら、1986）およびヒトアルドステ
ロン（Ｊ.Ａrriza，Ｃ．Ｗ．およびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発
表データ）の最近の特性決定はこれらの結論をさらに支
持するものである。
はその塩基配列が決定されており（Ｗeinbergerら、198
5bおよび実験の部Ｉを参照）、機能的に活性であること
が分かっている（実験の部IIを参照）。興味あることに
は、その受容体の塩基配列解析により、それは鳥類の赤
芽球症ウイルス(ＡＥＶ)のv−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物に
関係のあることが見出された（Ｗeinberger ら、1985を
参照）。これはステロイド受容体とerb−Ａ腫瘍遺伝子
産物が共通の原始的原型(primordial archetype)を共有
し、そしてerb−Ａ原腫瘍遺伝子産物もまたＤＮＡエン
ハンサー因子と結合する蛋白質でありうるという提案へ
導いた。ヒトエストロゲン（Ｇreenら、1986 およびＧr
eeneら、1986）、ニワトリプロゲステロン(Ｊeltschら、
1986およびＣonneelyら、1986）およびヒトアルドステ
ロン（Ｊ.Ａrriza，Ｃ．Ｗ．およびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発
表データ）の最近の特性決定はこれらの結論をさらに支
持するものである。
【０１７４】従って、我々はたとえヒトc−erb−Ａ原腫
瘍遺伝子が機能的に確実に固定されなくとも、その遺伝
子の配列を決定することから始めた。これらの実験の進
行中に、グルココルチコイド受容体の機能的ドメイン
（実験の部IIを参照）の解説において進歩が見られ、ｈ
ＧＲのホルモン結合ドメインはカルボキシ末端の３００
個のアミノ酸を包含する異常に大きい領域であることが
判明した。この全領域はv−erb−Ａのカルボキシ末端と
のわずかではあるが有意な類似性を有し、それ故にステ
ロイドホルモンの作用と類似した転写調節作用を及ぼし
うる分子の部類に我々の関心が集中した。
瘍遺伝子が機能的に確実に固定されなくとも、その遺伝
子の配列を決定することから始めた。これらの実験の進
行中に、グルココルチコイド受容体の機能的ドメイン
（実験の部IIを参照）の解説において進歩が見られ、ｈ
ＧＲのホルモン結合ドメインはカルボキシ末端の３００
個のアミノ酸を包含する異常に大きい領域であることが
判明した。この全領域はv−erb−Ａのカルボキシ末端と
のわずかではあるが有意な類似性を有し、それ故にステ
ロイドホルモンの作用と類似した転写調節作用を及ぼし
うる分子の部類に我々の関心が集中した。
【０１７５】遺伝子発現の甲状腺ホルモン刺激の分子機
構はステロイドについて概略したものと類似していると
思われる（Ｅberhardtら、1980を参照）。甲状腺ホルモ
ンは試験したすべての脊索動物種に存在し、そして発生
および分化（例えば両生類の変態）に対して重要な作用
を及ぼす（Ｅberhardtら、1980を参照）。ステロイドと
同様に、甲状腺ホルモンは受動拡散によって細胞に入
り、高親和性核受容体と結合し、その後遺伝子発現の迅
速かつ選択的な活性化を仲介する（Ｔataら、1966およ
びＯppenheimerら、1972）。この仮説を支持する証拠
は、ラット下垂体前葉のソマトトロピン生成細胞および
多数の関連するラットソマトトロピン生成細胞株におけ
る成長ホルモンおよびそのメッセンジャーＲＮＡの誘導
の研究からもたらされた（Ｓamuelsら、1973 およびＴa
taら、1974）。甲状腺ホルモンはこれらの細胞における
成長ホルモン遺伝子の転写を速やかに増強する（Ｍarti
al ら、1977 およびＥvansら、1982）。この転写増強は
核甲状腺ホルモン−受容体複合体のレベルが上昇するこ
とにより達成され、時間および濃度に依存しているが、
蛋白質合成とは無関係である(Ｓamuelsら、1976；Ｓpind
lerら、1982；およびＹaffeら、1984を参照）。
構はステロイドについて概略したものと類似していると
思われる（Ｅberhardtら、1980を参照）。甲状腺ホルモ
ンは試験したすべての脊索動物種に存在し、そして発生
および分化（例えば両生類の変態）に対して重要な作用
を及ぼす（Ｅberhardtら、1980を参照）。ステロイドと
同様に、甲状腺ホルモンは受動拡散によって細胞に入
り、高親和性核受容体と結合し、その後遺伝子発現の迅
速かつ選択的な活性化を仲介する（Ｔataら、1966およ
びＯppenheimerら、1972）。この仮説を支持する証拠
は、ラット下垂体前葉のソマトトロピン生成細胞および
多数の関連するラットソマトトロピン生成細胞株におけ
る成長ホルモンおよびそのメッセンジャーＲＮＡの誘導
の研究からもたらされた（Ｓamuelsら、1973 およびＴa
taら、1974）。甲状腺ホルモンはこれらの細胞における
成長ホルモン遺伝子の転写を速やかに増強する（Ｍarti
al ら、1977 およびＥvansら、1982）。この転写増強は
核甲状腺ホルモン−受容体複合体のレベルが上昇するこ
とにより達成され、時間および濃度に依存しているが、
蛋白質合成とは無関係である(Ｓamuelsら、1976；Ｓpind
lerら、1982；およびＹaffeら、1984を参照）。
【０１７６】ステロイドホルモン作用と甲状腺ホルモン
作用との類似性は、erb−Ａ蛋白質それ自体が甲状腺ホ
ルモン受容体でありうるという可能性を調べることへ導
いた。我々は初めにヒトc−erb−ＡのｃＤＮＡを単離し
て、その配列を決定した。その塩基配列から、ステロイ
ドホルモン受容体の推定上のＤＮＡ結合ドメインに類似
したシステイン／リシン／アルギニンに富む領域、およ
びそのステロイド結合ドメインとわずかに関連したカル
ボキシ末端領域を含む４５６個のアミノ酸から成るポリ
ペプチドが推定された。クローン化したステロイド受容
体のホルモン結合特性を調べるために開発された機能決
定（実験の部Ｉを参照）を用いて、我々はヒト c−erb
−ＡｃＤＮＡの翻訳産物が天然甲状腺ホルモン受容体分
子に特徴的な、固有の甲状腺ホルモン結合活性を保持す
ることを証明した。
作用との類似性は、erb−Ａ蛋白質それ自体が甲状腺ホ
ルモン受容体でありうるという可能性を調べることへ導
いた。我々は初めにヒトc−erb−ＡのｃＤＮＡを単離し
て、その配列を決定した。その塩基配列から、ステロイ
ドホルモン受容体の推定上のＤＮＡ結合ドメインに類似
したシステイン／リシン／アルギニンに富む領域、およ
びそのステロイド結合ドメインとわずかに関連したカル
ボキシ末端領域を含む４５６個のアミノ酸から成るポリ
ペプチドが推定された。クローン化したステロイド受容
体のホルモン結合特性を調べるために開発された機能決
定（実験の部Ｉを参照）を用いて、我々はヒト c−erb
−ＡｃＤＮＡの翻訳産物が天然甲状腺ホルモン受容体分
子に特徴的な、固有の甲状腺ホルモン結合活性を保持す
ることを証明した。
【０１７７】III．Ｂ．c−erb−Ａ cＤＮＡの特性決定 ヒトc−erb−ＡｃＤＮＡを単離するために、ｖ−erb−
Ａ遺伝子のみを含むＡＥＶゲノム領域から分離した５０
０塩基対（bp）のＰstＩＤＮＡフラグメント（Ｖennstr
omら、1980）を32Ｐ標識プロープとして使用して、２つ
のヒト胎盤cＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。それぞれ約１０6個のファージ組換え体の２つの独
立したライブラリーを選択することにより、２つの重複
するラムダgt１０ｃＤＮＡクローンが得られた。 pＵＣ
８サブクローンからのｃＤＮＡクローンＥcoＲＩ挿入物
pheＡ４およびpheＡ１２のそれぞれの制限地図を作成し
た（第１４図）。これらの重複する1.5キロ塩基（kb）c
ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列解析により、ヌクレ
オチド番号３０１に推定上のイニシエーターメチオニン
コドンおよびヌクレオチド番号１６６９にターミネータ
ーコドンを有する４５６個のアミノ酸の長いオープン・
リーディング・フレームを含むことが明らかになった
（第１５図および第１６図）。ＡＴＧの７コドン上流に
は読み枠内のターミネーターＴＡＡが存在してイニシエ
ーターメチオニンに対する支持を与えているが、２６コ
ドン下流に存在する別のメチオニンはこの割当てを不確
かなものにする。共通のポリアデニル化付加シグナル
（ＡＡＴＡＡＡ，Ｐroudfootら、１９７６を参照）はph
eＡ１２のターミネーターとポリ（Ａ）領域の間の２７
ヌクレオチド中に存在しない。
Ａ遺伝子のみを含むＡＥＶゲノム領域から分離した５０
０塩基対（bp）のＰstＩＤＮＡフラグメント（Ｖennstr
omら、1980）を32Ｐ標識プロープとして使用して、２つ
のヒト胎盤cＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。それぞれ約１０6個のファージ組換え体の２つの独
立したライブラリーを選択することにより、２つの重複
するラムダgt１０ｃＤＮＡクローンが得られた。 pＵＣ
８サブクローンからのｃＤＮＡクローンＥcoＲＩ挿入物
pheＡ４およびpheＡ１２のそれぞれの制限地図を作成し
た（第１４図）。これらの重複する1.5キロ塩基（kb）c
ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列解析により、ヌクレ
オチド番号３０１に推定上のイニシエーターメチオニン
コドンおよびヌクレオチド番号１６６９にターミネータ
ーコドンを有する４５６個のアミノ酸の長いオープン・
リーディング・フレームを含むことが明らかになった
（第１５図および第１６図）。ＡＴＧの７コドン上流に
は読み枠内のターミネーターＴＡＡが存在してイニシエ
ーターメチオニンに対する支持を与えているが、２６コ
ドン下流に存在する別のメチオニンはこの割当てを不確
かなものにする。共通のポリアデニル化付加シグナル
（ＡＡＴＡＡＡ，Ｐroudfootら、１９７６を参照）はph
eＡ１２のターミネーターとポリ（Ａ）領域の間の２７
ヌクレオチド中に存在しない。
【０１７８】ヒトc−erb−Ａ ｃＤＮＡ翻訳オープン・
リーディング・フレーム内にコードされる相対分子量 5
2000（Ｍ1＝５２Ｋ）の推定上のポリペプチドは、ＡＥ
Ｖ中のウイルスgag配列（Ｄebuireら、１９８４）から
下流の領域と８２％のアミノ酸同一性を共有する。アミ
ノ酸の比較において大きな相違は見られなかった。ヒト
c−erb−Ａアミノ酸配列はウイルスのアミノ酸残基３７
から始まるウイルス蛋白質と相同である（第１７図）。
c−erb−Ａのカルボキシ末端はv−erb−Ａのそれと次の
点で相違する：すなわち、２種のポリペプチドのアミノ
酸配列類似性がc−erb−Ａの残基４４５およびv−erb−
Ａ残基３８０で終止する（第１７図）。
リーディング・フレーム内にコードされる相対分子量 5
2000（Ｍ1＝５２Ｋ）の推定上のポリペプチドは、ＡＥ
Ｖ中のウイルスgag配列（Ｄebuireら、１９８４）から
下流の領域と８２％のアミノ酸同一性を共有する。アミ
ノ酸の比較において大きな相違は見られなかった。ヒト
c−erb−Ａアミノ酸配列はウイルスのアミノ酸残基３７
から始まるウイルス蛋白質と相同である（第１７図）。
c−erb−Ａのカルボキシ末端はv−erb−Ａのそれと次の
点で相違する：すなわち、２種のポリペプチドのアミノ
酸配列類似性がc−erb−Ａの残基４４５およびv−erb−
Ａ残基３８０で終止する（第１７図）。
【０１７９】ヒトc−erb−Ａ核酸配列とv−erb−Ａのそ
れとを整列させると、ヒト遺伝子の約７４％がアミノ酸
の相同領域（c−erb−Ａのヌクレオチド 563−1636，デ
ータは示さず）においてウイルス遺伝子と同一であるこ
とが分かる。これらの比較は、染色体１７にマッピング
される他のヒトerb−Ａ遺伝子に関する以前のデータ
（Ｊanssonら、1983；Ｓpurrら、1984；およびＤayton
ら、1984）と考え合わせると、我々の分離したヒト胎盤
c−erb−Ａ遺伝子が別個のものであることを示す。２種
の染色体１７erb−Ａ遺伝子（我々は両方ともhc−erb−
Ａアルファと呼ぶよう提案する）のうちの１種はヌクレ
オチド配列に関して８２％がv−erb−Ａ遺伝子と類似し
ており、アミノ酸配列に関しては８９％が同一である
（Ｄayton ら、1984 を参照）。従って、我々が hc−er
b−Ａベータと呼ぶよう提案する胎盤c−erb−Ａ ｃＤ
ＮＡは、hc−erb−Ａアルファ遺伝子よりもウイルスerb
−Ａ遺伝子との関連性がうすい。
れとを整列させると、ヒト遺伝子の約７４％がアミノ酸
の相同領域（c−erb−Ａのヌクレオチド 563−1636，デ
ータは示さず）においてウイルス遺伝子と同一であるこ
とが分かる。これらの比較は、染色体１７にマッピング
される他のヒトerb−Ａ遺伝子に関する以前のデータ
（Ｊanssonら、1983；Ｓpurrら、1984；およびＤayton
ら、1984）と考え合わせると、我々の分離したヒト胎盤
c−erb−Ａ遺伝子が別個のものであることを示す。２種
の染色体１７erb−Ａ遺伝子（我々は両方ともhc−erb−
Ａアルファと呼ぶよう提案する）のうちの１種はヌクレ
オチド配列に関して８２％がv−erb−Ａ遺伝子と類似し
ており、アミノ酸配列に関しては８９％が同一である
（Ｄayton ら、1984 を参照）。従って、我々が hc−er
b−Ａベータと呼ぶよう提案する胎盤c−erb−Ａ ｃＤ
ＮＡは、hc−erb−Ａアルファ遺伝子よりもウイルスerb
−Ａ遺伝子との関連性がうすい。
【０１８０】ウイルスおよび細胞erb−Ａ蛋白質産物と
グルココルチコイド受容体とのアミノ酸配列の比較は，
ｈＧＲのカルボキシ末端半分との段階的レベルの相同性
を示す（第１７図）。最も高い類似性はc−erb−Ａアミ
ノ酸残基１０２から始まって６５個のアミノ酸から成る
システインに富む配列に見られる（Ｗeinbergerら、１
９８５を参照）。ｈＧＲと比較した場合には４７％のア
ミノ酸同一性が見られ、そしてc−erb−Ａをヒトエスト
ロゲン受容体（ｈＥＲ）のアミノ酸配列と比較した場合
には５２％の同一性が存在する（第１７図）。我々はｈ
ＧＲのこの領域がＤＮＡ結合ドメン4を表すと提案し
た。突然変異誘発および発現実験により、転写活性化に
おけるその役割の直接的証拠が得られた（実験の部IIを
参照）。システインに富むドメインから下流の領域（ホ
ルモン結合ドメインに相当する）には、ウイルスerb−
Ａ産物において先に述べたようなｈＧＲおよびｈＥＲと
の低下したしかし有意な(１７％)相同性が存在する（Ｗ
einbergerら、1985；Ｇreeneら、1986；およびＧreen
ら、1986 を参照）。
グルココルチコイド受容体とのアミノ酸配列の比較は，
ｈＧＲのカルボキシ末端半分との段階的レベルの相同性
を示す（第１７図）。最も高い類似性はc−erb−Ａアミ
ノ酸残基１０２から始まって６５個のアミノ酸から成る
システインに富む配列に見られる（Ｗeinbergerら、１
９８５を参照）。ｈＧＲと比較した場合には４７％のア
ミノ酸同一性が見られ、そしてc−erb−Ａをヒトエスト
ロゲン受容体（ｈＥＲ）のアミノ酸配列と比較した場合
には５２％の同一性が存在する（第１７図）。我々はｈ
ＧＲのこの領域がＤＮＡ結合ドメン4を表すと提案し
た。突然変異誘発および発現実験により、転写活性化に
おけるその役割の直接的証拠が得られた（実験の部IIを
参照）。システインに富むドメインから下流の領域（ホ
ルモン結合ドメインに相当する）には、ウイルスerb−
Ａ産物において先に述べたようなｈＧＲおよびｈＥＲと
の低下したしかし有意な(１７％)相同性が存在する（Ｗ
einbergerら、1985；Ｇreeneら、1986；およびＧreen
ら、1986 を参照）。
【０１８１】III．Ｃ．多重 erb−Ａ遺伝子 制限エンドヌクレアーゼ消化ヒト胎盤ＤＮＡIII．Ｄ．c−erb−Ａ遺伝子の発現 種々のヒト細胞株またはヒト胎盤から分離した細胞質ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡと、pheＡ４からの６５０bpＢamＨ
Ｉ−ＰstＩフラグメント（第１４図）と、をハイブリダ
イズするノザン・ブロット（Ｎorthern blot）は、Ｈe
Ｌa およびＭＣＦ−７細胞中に最も豊富に存在する 200
0ヌクレオチドの単一のＲＮＡ種を明らかにした（第１
９（Ａ）図）。ｍＲＮＡの大きさは、我々がほぼ全長の
c−erb−ＡｃＤＮＡを分離したことを示す。ＨＴ１０８
０細胞は少量の２kb 転写物を含み、一方それはＩＭ−
９細胞中に検出されない。ヒト胎盤は２.０kbのＲＮＡ
に加えて５,３および2.5kbの多数のＲＮＡ種を含むと思
われる。多数の胎盤バンドが核前駆体、または単一遺伝
子からの成熟ｍＲＮＡ、もしくは他のerb−Ａ遺伝子の
産物を表すかどうかは定かでない。
リ（Ａ）含有ＲＮＡと、pheＡ４からの６５０bpＢamＨ
Ｉ−ＰstＩフラグメント（第１４図）と、をハイブリダ
イズするノザン・ブロット（Ｎorthern blot）は、Ｈe
Ｌa およびＭＣＦ−７細胞中に最も豊富に存在する 200
0ヌクレオチドの単一のＲＮＡ種を明らかにした（第１
９（Ａ）図）。ｍＲＮＡの大きさは、我々がほぼ全長の
c−erb−ＡｃＤＮＡを分離したことを示す。ＨＴ１０８
０細胞は少量の２kb 転写物を含み、一方それはＩＭ−
９細胞中に検出されない。ヒト胎盤は２.０kbのＲＮＡ
に加えて５,３および2.5kbの多数のＲＮＡ種を含むと思
われる。多数の胎盤バンドが核前駆体、または単一遺伝
子からの成熟ｍＲＮＡ、もしくは他のerb−Ａ遺伝子の
産物を表すかどうかは定かでない。
【０１８２】ヒトc−erb−Ａ ｃＤＮＡの蛋白質産物は
in vitro翻訳により同定した。全c−erb−Ａコード領
域を含むcＤＮＡは両方の向きで発現ベクターpＧＥＭ３
のＥcoＲＩ部位に挿入した。ウサギ網状赤血球溶解液中
での蛋白質合成をプログラミングするために、これらの
鋳型からＴ７ポリメラーゼにより合成したキャップ(ca
p)をもつＲＮＡ転写物を使用し、そして35Ｓ−メチオニ
ン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離
した（Ｌaemmli，1970）。鋳型としてpeＡ１０１ＤＮＡ
（erb−Ａセンス転写物）を用いたときにはＭr５５,５
２および３５Ｋの蛋白質が検出されたが（第１９（Ｂ）
図、レーン３および４)、peＡ１０２ＤＮＡ（erb−Ａア
ンチセンス転写物）を用いたときには検出されなかった
（第１９（Ｂ）図、レーン２）。５５および５２Ｋの産
物はそれぞれメチオニン１および２７で翻訳を開始する
ポリペプチドに相当し（第１５図）、３５Ｋ産物は蛋白
質分解産物でありうる。
in vitro翻訳により同定した。全c−erb−Ａコード領
域を含むcＤＮＡは両方の向きで発現ベクターpＧＥＭ３
のＥcoＲＩ部位に挿入した。ウサギ網状赤血球溶解液中
での蛋白質合成をプログラミングするために、これらの
鋳型からＴ７ポリメラーゼにより合成したキャップ(ca
p)をもつＲＮＡ転写物を使用し、そして35Ｓ−メチオニ
ン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離
した（Ｌaemmli，1970）。鋳型としてpeＡ１０１ＤＮＡ
（erb−Ａセンス転写物）を用いたときにはＭr５５,５
２および３５Ｋの蛋白質が検出されたが（第１９（Ｂ）
図、レーン３および４)、peＡ１０２ＤＮＡ（erb−Ａア
ンチセンス転写物）を用いたときには検出されなかった
（第１９（Ｂ）図、レーン２）。５５および５２Ｋの産
物はそれぞれメチオニン１および２７で翻訳を開始する
ポリペプチドに相当し（第１５図）、３５Ｋ産物は蛋白
質分解産物でありうる。
【０１８３】III．Ｅ．甲状腺ホルモンの結合 ｈＧＲのカルボキシ末端とｈＥＲのカルボキシ末端（ホ
ルモン結合ドメインを定める；Ｋrustら、1986を参照）
の間の部分的アミノ酸配列相同性（４０％）並びにステ
ロイドリガンドの構造的類似性は、ステロイド受容体が
調節蛋白質の１つのファミリーから成るという仮説を支
持するものである。c−erb−Ａのカルボキシ末端とステ
ロイド受容体のカルボキシ末端と比較的少ない相同性
は、erb−Ａ原腫瘍遺伝子が恐らくステロイド受容体を
コードしないことを示唆しており、erb−Ａが他の分子
に応答しうるという仮説に一致する。我々はin vitro
翻訳がクローン化したステロイド受容体のホルモン結合
活性を同定する手段として使えることを示した（実験の
部Ｉを参照）。従って、推定上のc−erb−Ａリガンドを
同定するために、この検定を利用した。
ルモン結合ドメインを定める；Ｋrustら、1986を参照）
の間の部分的アミノ酸配列相同性（４０％）並びにステ
ロイドリガンドの構造的類似性は、ステロイド受容体が
調節蛋白質の１つのファミリーから成るという仮説を支
持するものである。c−erb−Ａのカルボキシ末端とステ
ロイド受容体のカルボキシ末端と比較的少ない相同性
は、erb−Ａ原腫瘍遺伝子が恐らくステロイド受容体を
コードしないことを示唆しており、erb−Ａが他の分子
に応答しうるという仮説に一致する。我々はin vitro
翻訳がクローン化したステロイド受容体のホルモン結合
活性を同定する手段として使えることを示した（実験の
部Ｉを参照）。従って、推定上のc−erb−Ａリガンドを
同定するために、この検定を利用した。
【０１８４】ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン
は基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼす。
erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き
出すために、in vitro翻訳産物を125Ｉ−３，５，３’
−トリヨード−チロニン（125Ｉ−Ｔ3）とホルモン結合
反応条件下で混合した（Ｓamuelsら、1974を参照）。非
特異的ホルモン結合は同様な試料に５００倍過剰モル量
の冷却Ｔ3を加えることにより調べた。驚いたことに、
５５および５２Ｋポリペプチドを含む混合物(peＡ１０
１）は125Ｉ−Ｔ3と結合したが、アンチセンスＲＮＡ−
プログラム化溶解液（peＡ１０２）はバックグラウンド
結合のみを示した。ホルモン結合はプロテアーゼに対し
て感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受性である
（データは示さず）。クローン化 erb−Ａ蛋白質に対す
る手段として使えることを示した（実験の部Ｉを参
照）。従って、推定上のc−erb−Ａリガンドを同定する
ために、この検定を利用した。
は基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼす。
erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き
出すために、in vitro翻訳産物を125Ｉ−３，５，３’
−トリヨード−チロニン（125Ｉ−Ｔ3）とホルモン結合
反応条件下で混合した（Ｓamuelsら、1974を参照）。非
特異的ホルモン結合は同様な試料に５００倍過剰モル量
の冷却Ｔ3を加えることにより調べた。驚いたことに、
５５および５２Ｋポリペプチドを含む混合物(peＡ１０
１）は125Ｉ−Ｔ3と結合したが、アンチセンスＲＮＡ−
プログラム化溶解液（peＡ１０２）はバックグラウンド
結合のみを示した。ホルモン結合はプロテアーゼに対し
て感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受性である
（データは示さず）。クローン化 erb−Ａ蛋白質に対す
る手段として使えることを示した（実験の部Ｉを参
照）。従って、推定上のc−erb−Ａリガンドを同定する
ために、この検定を利用した。
【０１８５】ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン
は基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼす。
erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き
出すために、in vitro翻訳産物を125Ｉ−３，５，３’
−トリヨード−チロニン(125Ｉ−Ｔ3）とホルモン結合
反応条件下で混合した（Ｓamuelsら、１９７４を参
照）。非特異的ホルモン結合は同様な試料に５００倍過
剰モル量の冷却Ｔ3を加えることにより調べた。驚いた
ことに、５５および５２Ｋポリペプチドを含む混合物
（peＡ１０１）は125Ｉ−Ｔ3と結合したが、アンチセン
スＲＮＡ−プログラム化溶解液（peＡ１０２）はバック
グラウンド結合のみを示した。ホルモン結合はプロテア
ーゼに対して感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受
性である（データは示さず）。クローン化erb−Ａ蛋白
質に対するＴ3親和性はスカッチャード分析により測定
した（第２０（Ａ）図）。５×１０-11 ＭのＫd 値が得
られ、これはＨeＬa細胞の核抽出物におけるＴ3結合
（６×１０-11Ｍ）とほとんど同じである（データは示
さず）。
は基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼす。
erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き
出すために、in vitro翻訳産物を125Ｉ−３，５，３’
−トリヨード−チロニン(125Ｉ−Ｔ3）とホルモン結合
反応条件下で混合した（Ｓamuelsら、１９７４を参
照）。非特異的ホルモン結合は同様な試料に５００倍過
剰モル量の冷却Ｔ3を加えることにより調べた。驚いた
ことに、５５および５２Ｋポリペプチドを含む混合物
（peＡ１０１）は125Ｉ−Ｔ3と結合したが、アンチセン
スＲＮＡ−プログラム化溶解液（peＡ１０２）はバック
グラウンド結合のみを示した。ホルモン結合はプロテア
ーゼに対して感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受
性である（データは示さず）。クローン化erb−Ａ蛋白
質に対するＴ3親和性はスカッチャード分析により測定
した（第２０（Ａ）図）。５×１０-11 ＭのＫd 値が得
られ、これはＨeＬa細胞の核抽出物におけるＴ3結合
（６×１０-11Ｍ）とほとんど同じである（データは示
さず）。
【０１８６】特殊な甲状腺ホルモン類似体は、天然甲状
腺ホルモン受容体へのＴ3 結合に対し特徴的な競合パタ
ーンを有する。我々はin vitro で合成したerb−Ａ産物
が天然および合成甲状腺ホルモンに対して同じ固有の親
和性を有するかどうか調べた。125Ｉ−Ｔ3結合は３，
５’，３’−トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）の場合
に最も効果的に競合され、それは３００pＭで125Ｉ−Ｔ
3結合の５０％を阻害した（第２０（Ｂ）図）。さら
に、Ｌ−チロキシン（第２０（Ｂ）図）、Ｄ−Ｔ3およ
びrＴ3（３，３’，５’，−トリヨード−Ｌ−チロニ
ン）はＴ3よりも弱く競合し（第２０（Ｃ）図）、一方
１００μＭのビタミンＤ3、アルドステロン、コルチゾ
ル、テストステロン、プロゲステロンまたはエストラジ
オールは競合せず（データは示さず）、ラット甲状腺ホ
ルモン受容体の生化学的性質と一致する（Ｓamuelsら、
1974；Ｓamuelsら、1979；およびＬathamら、1976を参
照）。
腺ホルモン受容体へのＴ3 結合に対し特徴的な競合パタ
ーンを有する。我々はin vitro で合成したerb−Ａ産物
が天然および合成甲状腺ホルモンに対して同じ固有の親
和性を有するかどうか調べた。125Ｉ−Ｔ3結合は３，
５’，３’−トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）の場合
に最も効果的に競合され、それは３００pＭで125Ｉ−Ｔ
3結合の５０％を阻害した（第２０（Ｂ）図）。さら
に、Ｌ−チロキシン（第２０（Ｂ）図）、Ｄ−Ｔ3およ
びrＴ3（３，３’，５’，−トリヨード−Ｌ−チロニ
ン）はＴ3よりも弱く競合し（第２０（Ｃ）図）、一方
１００μＭのビタミンＤ3、アルドステロン、コルチゾ
ル、テストステロン、プロゲステロンまたはエストラジ
オールは競合せず（データは示さず）、ラット甲状腺ホ
ルモン受容体の生化学的性質と一致する（Ｓamuelsら、
1974；Ｓamuelsら、1979；およびＬathamら、1976を参
照）。
【０１８７】高塩（0.4Ｍ ＫＣｌ）ＨeＬa細胞核抽出物
は甲状腺ホルモン（125Ｉ−Ｔ3）結合活性を含むが、細
胞質または低塩（0.1ＭＫＣｌ）核抽出物には全く見ら
れなかった（データは示さず）。核抽出物における甲状
腺ホルモン結合の競合は、invitroで調製したc−erb−
Ａ含有溶解液のそれと定量的に類似していた（第２０
（Ｂ）図および（Ｄ）図を比較されたい）。さらに、検
出不能なレベルのc−erb−ＡｍＲＮＡ（第１９（Ａ）
図、レーン４）を含むＩＭ−９細胞由来の0.4ＭＫＣｌ
核抽出物を用いた甲状腺ホルモン結合は、類似のＨeＬa
細胞抽出物と比較したとき、ごくわずかである。これら
の結果はc−erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体であるという
直接的証拠を提供する。
は甲状腺ホルモン（125Ｉ−Ｔ3）結合活性を含むが、細
胞質または低塩（0.1ＭＫＣｌ）核抽出物には全く見ら
れなかった（データは示さず）。核抽出物における甲状
腺ホルモン結合の競合は、invitroで調製したc−erb−
Ａ含有溶解液のそれと定量的に類似していた（第２０
（Ｂ）図および（Ｄ）図を比較されたい）。さらに、検
出不能なレベルのc−erb−ＡｍＲＮＡ（第１９（Ａ）
図、レーン４）を含むＩＭ−９細胞由来の0.4ＭＫＣｌ
核抽出物を用いた甲状腺ホルモン結合は、類似のＨeＬa
細胞抽出物と比較したとき、ごくわずかである。これら
の結果はc−erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体であるという
直接的証拠を提供する。
【０１８８】III．Ｆ．結論 ここで得られたデータは、c−erb−Ａ産物を甲状腺ホル
モン受容体として同定するための３つの基準をもたら
す。第一に、c−erb−Ａの全体的な構造相同性はリガン
ド応答性調節蛋白質である可能性を示している。第二
に、発現された蛋白質産物は天然および合成甲状腺ホル
モンに対して天然受容体と同じ固有の親和性を有してい
る。第三に、erb−Ａのin vitro 翻訳産物の分子量はフ
ォトアフィニティ標識ラット甲状腺ホルモン受容体と類
似している（Ｐascualら、１９８２）。甲状腺ホルモン
受容体としてのerb−Ａの本性は、成長ホルモン遺伝子
のようなＴ3−応答性遺伝子のその転写調節を証明する
ことによりさらに実証されるであろう。
モン受容体として同定するための３つの基準をもたら
す。第一に、c−erb−Ａの全体的な構造相同性はリガン
ド応答性調節蛋白質である可能性を示している。第二
に、発現された蛋白質産物は天然および合成甲状腺ホル
モンに対して天然受容体と同じ固有の親和性を有してい
る。第三に、erb−Ａのin vitro 翻訳産物の分子量はフ
ォトアフィニティ標識ラット甲状腺ホルモン受容体と類
似している（Ｐascualら、１９８２）。甲状腺ホルモン
受容体としてのerb−Ａの本性は、成長ホルモン遺伝子
のようなＴ3−応答性遺伝子のその転写調節を証明する
ことによりさらに実証されるであろう。
【０１８９】ｈＧＲおよびhＭの分析により、これらの
蛋白質は一連の機能的ドメインから構成されていること
が明らかになった。（実験の部ＩおよびIV；Ｗeinberge
rら、1985a；Ｃarlstedt−Ｄukeら、1982；Dellwegら、
1982；Ｒeichmanら、1984；およびＳhermanら、1978を
参照されたい。）これらはキセノプス（Ｘenopus）５Ｓ
遺伝子の第IIIＡ転写因子および他の転写調節蛋白質
（Ｍillerら、1985；Berg，1985）に見られる反復した
システインに富む配列との構造的類似性を有するシステ
インに富む領域、並びにステロイド結合ドメインをコー
ドするカルボキシ末端領域（実験の部II；Ｗeinberger
ら、1985a；およびＫumarら、1986を参照）を含む。甲
状腺ホルモン受容体に類似したこの範囲はそのホルモン
結合領域がその分子のカルボキシ末端近傍に局在化する
ことを予告するであろう（第２１図）。推定上のＤＮＡ
結合配列はシステインに富む領域に存在し（第２１
図）、ｈＧＲおよびｈＥＲのＤＮＡ結合特性は局在化さ
れると思われる（実験の部II;Ｋumarら、1986；Ｓ．Ｈo
llenbergおよびＲ．Ｍ．Ｅ．、未発表データを参照）。
蛋白質は一連の機能的ドメインから構成されていること
が明らかになった。（実験の部ＩおよびIV；Ｗeinberge
rら、1985a；Ｃarlstedt−Ｄukeら、1982；Dellwegら、
1982；Ｒeichmanら、1984；およびＳhermanら、1978を
参照されたい。）これらはキセノプス（Ｘenopus）５Ｓ
遺伝子の第IIIＡ転写因子および他の転写調節蛋白質
（Ｍillerら、1985；Berg，1985）に見られる反復した
システインに富む配列との構造的類似性を有するシステ
インに富む領域、並びにステロイド結合ドメインをコー
ドするカルボキシ末端領域（実験の部II；Ｗeinberger
ら、1985a；およびＫumarら、1986を参照）を含む。甲
状腺ホルモン受容体に類似したこの範囲はそのホルモン
結合領域がその分子のカルボキシ末端近傍に局在化する
ことを予告するであろう（第２１図）。推定上のＤＮＡ
結合配列はシステインに富む領域に存在し（第２１
図）、ｈＧＲおよびｈＥＲのＤＮＡ結合特性は局在化さ
れると思われる（実験の部II;Ｋumarら、1986；Ｓ．Ｈo
llenbergおよびＲ．Ｍ．Ｅ．、未発表データを参照）。
【０１９０】III．Ｇ．甲状腺ホルモン受容体および腫
瘍形成 鳥類の赤芽球によるv−erb−Ａ産物の発現は、完全に形
質転換された表現型の維持のために必要とされる（Ｇra
fら、1983；Ｆrykberg ら、1983；Ｓealy ら、1983；お
よびＫahnら、1986を参照）。v−erb−Ａ遺伝子を欠失
したウイルスに感染したニワトリは比較的悪性でない症
状を呈するが、in vitroにおいてこれらの感染赤芽球は
自然に分化して、複合倍地を補給したときだけ生育す
る。しかしながら、erb−Ａ+／erb−Ｂ+ウイルスに感染
した細胞は増大した自己回復能を有し、比較的未分化の
表現型を呈する。v−erb−Ａ蛋白質の構造的変化は異常
な成長調節特性を及ぼす産物を生じさせるであろう。例
えば、カルボキシ末端における変化は甲状腺ホルモン結
合活性に影響を及ぼして、以前にヒトグルココルチコイ
ド受容体のベータ型において示したように、構成的に活
性な分子をもたらすかも知れない（実験の部IIおよびII
I；Ｗeinbergerら、1985aを参照）。この場合の変化は
ステロイド結合活性を排除する。このドメインにおける
挿入変異もまたステロイド結合特性を不活性化する（実
験の部IIを参照）。しかしながらホルモン結合領域の欠
失は構成的に活性な受容体を生じさせ、このことはこの
ドメインが転写活性化において調節的役割を演じている
ことを示す（Ｖ．ＧiguereおよびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発表
データ）。これらのデータは、v−erb−Ａがホルモンと
結合しそうもなく、むしろ甲状腺ホルモン受容体の構成
的に活性な形体であることを推測させる。甲状腺ホルモ
ン受容体としてのerb−Ａ同定は、腫瘍の原因となる形
質転換にエンハンサーおよびそれらの結合蛋白質を巻き
込む最初の直接的証拠を提供する。
瘍形成 鳥類の赤芽球によるv−erb−Ａ産物の発現は、完全に形
質転換された表現型の維持のために必要とされる（Ｇra
fら、1983；Ｆrykberg ら、1983；Ｓealy ら、1983；お
よびＫahnら、1986を参照）。v−erb−Ａ遺伝子を欠失
したウイルスに感染したニワトリは比較的悪性でない症
状を呈するが、in vitroにおいてこれらの感染赤芽球は
自然に分化して、複合倍地を補給したときだけ生育す
る。しかしながら、erb−Ａ+／erb−Ｂ+ウイルスに感染
した細胞は増大した自己回復能を有し、比較的未分化の
表現型を呈する。v−erb−Ａ蛋白質の構造的変化は異常
な成長調節特性を及ぼす産物を生じさせるであろう。例
えば、カルボキシ末端における変化は甲状腺ホルモン結
合活性に影響を及ぼして、以前にヒトグルココルチコイ
ド受容体のベータ型において示したように、構成的に活
性な分子をもたらすかも知れない（実験の部IIおよびII
I；Ｗeinbergerら、1985aを参照）。この場合の変化は
ステロイド結合活性を排除する。このドメインにおける
挿入変異もまたステロイド結合特性を不活性化する（実
験の部IIを参照）。しかしながらホルモン結合領域の欠
失は構成的に活性な受容体を生じさせ、このことはこの
ドメインが転写活性化において調節的役割を演じている
ことを示す（Ｖ．ＧiguereおよびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発表
データ）。これらのデータは、v−erb−Ａがホルモンと
結合しそうもなく、むしろ甲状腺ホルモン受容体の構成
的に活性な形体であることを推測させる。甲状腺ホルモ
ン受容体としてのerb−Ａ同定は、腫瘍の原因となる形
質転換にエンハンサーおよびそれらの結合蛋白質を巻き
込む最初の直接的証拠を提供する。
【０１９１】III．Ｈ．調節遺伝子のスーパーファミリ
ー ステロイド受容体とv−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物との類似
性は、これらが原始的な受容体遺伝子から進化したもの
であると我々が提案するのに十分であった（Ｗeinberge
rら、１９８５a）。２つの驚くべき結果がここに示した
実験から得られた。第一は、erb−Ａ原腫瘍遺伝子のフ
ァミリーの存在が甲状腺ホルモン受容体と密接に関連し
た１種またはそれ以上の他の分子の存在を暗示するとい
うことである。生理学的研究は第二のクラスの甲状腺ホ
ルモン受容体の存在を予告しなかった。従ってこのファ
ミリーの同定は発生およびホメオスタシス調節の機構に
新たな光を投げかけるかも知れない。これらの結果から
得られた第二の驚くべき観察は、甲状腺ホルモン受容体
とステロイドホルモン受容体ファミリーとの密接な関係
である。この関係は、これらの分子がすべてより複雑な
真核生物の次第に高まる発生学的および生理学的要求に
適合すべく進化の過程で生じた調節蛋白質のスーパーフ
ァミリーの一部でありうることを示している。
ー ステロイド受容体とv−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物との類似
性は、これらが原始的な受容体遺伝子から進化したもの
であると我々が提案するのに十分であった（Ｗeinberge
rら、１９８５a）。２つの驚くべき結果がここに示した
実験から得られた。第一は、erb−Ａ原腫瘍遺伝子のフ
ァミリーの存在が甲状腺ホルモン受容体と密接に関連し
た１種またはそれ以上の他の分子の存在を暗示するとい
うことである。生理学的研究は第二のクラスの甲状腺ホ
ルモン受容体の存在を予告しなかった。従ってこのファ
ミリーの同定は発生およびホメオスタシス調節の機構に
新たな光を投げかけるかも知れない。これらの結果から
得られた第二の驚くべき観察は、甲状腺ホルモン受容体
とステロイドホルモン受容体ファミリーとの密接な関係
である。この関係は、これらの分子がすべてより複雑な
真核生物の次第に高まる発生学的および生理学的要求に
適合すべく進化の過程で生じた調節蛋白質のスーパーフ
ァミリーの一部でありうることを示している。
【０１９２】III．Ｉ．実験の部IIIに関連した図面の詳
細な説明 第１４−１６図 ヒト胎盤c−erb−Ａ ｃＤＮＡの制限地図および塩基配
列決定計画（１４）、並びにそのヌクレオチド配列およ
び推定上のアミノ酸配列（１５−１６）。ａ．複合制限
地図に対する２つのサブクローンpheＡ４およびpheＡ１
２の方向性。共通の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を
線状地図の上に示す。細線、非翻訳配列；斜線ボック
ス、erb−Ａコード領域；矢印、塩基配列を決定したＤ
ＮＡフラグメント。ｂ．複合erb−ＡｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を５’→３’の方向で示す。ウイルスerb−
Ａ蛋白質21に関する翻訳オープン・リーディング・フレ
ームをヌクレオチド配列の上に示す。アデノシン残基
（約１３０個）がpheＡ１２の３’末端に存在する。翻
訳配列の上の番号はアミノ酸残基を示し、そしてヌクレ
オチド番号はその配列の右側に示す。
細な説明 第１４−１６図 ヒト胎盤c−erb−Ａ ｃＤＮＡの制限地図および塩基配
列決定計画（１４）、並びにそのヌクレオチド配列およ
び推定上のアミノ酸配列（１５−１６）。ａ．複合制限
地図に対する２つのサブクローンpheＡ４およびpheＡ１
２の方向性。共通の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を
線状地図の上に示す。細線、非翻訳配列；斜線ボック
ス、erb−Ａコード領域；矢印、塩基配列を決定したＤ
ＮＡフラグメント。ｂ．複合erb−ＡｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を５’→３’の方向で示す。ウイルスerb−
Ａ蛋白質21に関する翻訳オープン・リーディング・フレ
ームをヌクレオチド配列の上に示す。アデノシン残基
（約１３０個）がpheＡ１２の３’末端に存在する。翻
訳配列の上の番号はアミノ酸残基を示し、そしてヌクレ
オチド番号はその配列の右側に示す。
【０１９３】第１４−１６図の方法 ２つのヒト胎盤ラムダgt１０ＤＮＡライブラリー（Ｈuy
nhら、1985）のそれぞれからの組換えファージ（約１０
6個）はpＡＥＶ−１１（Vennstromら、1980）から単離
した５００bp ＰstＩフラグメント（ニック・トランス
レーションを行ったもの；Rigbyら、1977）を用いてス
クリーニングした。ハイブリダイゼーション混合物は５
０％ホルムアミド、１×デンハート溶液、５×ＳＳＰ
Ｅ、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００
μｇ／mｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０6cpm／mｌの32
Ｐ標識ＰstＩフラグメント（比活性＝１×１０8cpm／μ
ｇ）を含んでいた。２通りのニトロセルロースフィルタ
ーを３７℃で１８時間ハイブリダイズさせ、0.1×ＳＳ
Ｃ、0.1％ＳＤＳ(１×ＳＳＣ＝１５０mＭ ＮaＣｌ、１５m
Ｍクエン酸三ナトリウム）で２０分ずつ３回洗い、そし
て増感紙を用いて−７０℃でオートラジオグラフィーに
かけた。２つのハイブリダイゼーション陽性クローンが
単離され、それをpＵＣ８のＥcoＲＩ部位にサブクロー
ニングし、その後化学的切断方法により塩基配列を決定
した(Ｍaxamら、1977）。
nhら、1985）のそれぞれからの組換えファージ（約１０
6個）はpＡＥＶ−１１（Vennstromら、1980）から単離
した５００bp ＰstＩフラグメント（ニック・トランス
レーションを行ったもの；Rigbyら、1977）を用いてス
クリーニングした。ハイブリダイゼーション混合物は５
０％ホルムアミド、１×デンハート溶液、５×ＳＳＰ
Ｅ、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００
μｇ／mｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０6cpm／mｌの32
Ｐ標識ＰstＩフラグメント（比活性＝１×１０8cpm／μ
ｇ）を含んでいた。２通りのニトロセルロースフィルタ
ーを３７℃で１８時間ハイブリダイズさせ、0.1×ＳＳ
Ｃ、0.1％ＳＤＳ(１×ＳＳＣ＝１５０mＭ ＮaＣｌ、１５m
Ｍクエン酸三ナトリウム）で２０分ずつ３回洗い、そし
て増感紙を用いて−７０℃でオートラジオグラフィーに
かけた。２つのハイブリダイゼーション陽性クローンが
単離され、それをpＵＣ８のＥcoＲＩ部位にサブクロー
ニングし、その後化学的切断方法により塩基配列を決定
した(Ｍaxamら、1977）。
【０１９４】第１７図 v−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物、ヒト胎盤c−erb−Ａポリペ
プチド、およびヒトグルココルチコイド受容体並びにヒ
トエストロゲン受容体のカルボキシ末端部分のアミノ酸
配列比較。v−erb−Ａ蛋白質（上段の配列）とヒト胎盤
c−erb−Ａポリペプチド（第二段の配列）との翻訳アミ
ノ酸配列は、対応する残基を整列させることにより比較
した。３個以上のアミノ酸配列の同時比較用のコンピュ
ータプログラム（Ｊohnsonら、１９８６）は、c−erb−
Ａ、ヒトグルココルチコイド受容体（第三段のｈＧＲ配
列；実験の部Ｉ、第３および４図を参照）、およびヒト
エストロゲン受容体（下段のｈＥＲ配列；Ｇreen ら、1
986を参照）のカルボキシ末端アミノ酸配列を、各配列
の所定のセグメントの漸進的評価に基づいて整列させる
べく用いられた。少なくとも３種のポリペプチド間で一
致するアミノ酸残基をボックスで囲った。２種の erb−
Ａポリペプチド間のアミノ酸の一致は、各欄の上段配列
の上に星印で示した。ステロイド受容体間のアミノ酸配
列の同一性は、配列の下に十字形の印で示した。ハイフ
ン、ギャップは比較の際にアミノ酸の同一性の数を最大
とするために挿入した。４種のポリペプチド間に保存さ
れたシステイン残基は黒地に白で印刷した。
プチド、およびヒトグルココルチコイド受容体並びにヒ
トエストロゲン受容体のカルボキシ末端部分のアミノ酸
配列比較。v−erb−Ａ蛋白質（上段の配列）とヒト胎盤
c−erb−Ａポリペプチド（第二段の配列）との翻訳アミ
ノ酸配列は、対応する残基を整列させることにより比較
した。３個以上のアミノ酸配列の同時比較用のコンピュ
ータプログラム（Ｊohnsonら、１９８６）は、c−erb−
Ａ、ヒトグルココルチコイド受容体（第三段のｈＧＲ配
列；実験の部Ｉ、第３および４図を参照）、およびヒト
エストロゲン受容体（下段のｈＥＲ配列；Ｇreen ら、1
986を参照）のカルボキシ末端アミノ酸配列を、各配列
の所定のセグメントの漸進的評価に基づいて整列させる
べく用いられた。少なくとも３種のポリペプチド間で一
致するアミノ酸残基をボックスで囲った。２種の erb−
Ａポリペプチド間のアミノ酸の一致は、各欄の上段配列
の上に星印で示した。ステロイド受容体間のアミノ酸配
列の同一性は、配列の下に十字形の印で示した。ハイフ
ン、ギャップは比較の際にアミノ酸の同一性の数を最大
とするために挿入した。４種のポリペプチド間に保存さ
れたシステイン残基は黒地に白で印刷した。
【０１９５】第１８（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 c−erb−Ａ ＤＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサ
ザン分析および染色体マッピング。Ａ．妊娠期間終決後
のヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
生成物を0.8％アガロースゲルで分離した。ＤＮＡはニ
トロセルロース紙に移行させ（Ｓouthern，１９７
５）、pheＡ４由来の４５０bp ＳstＩフラグメント（ニ
ック・トランスレーションを行って、比活性５×１０8c
pm／μｇとした）を用いて５０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＰＥ、１×デンハート溶液、0.1％ＳＤＳ、１００μ
ｇ／mｌサケ精子ＤＮＡ中でハイブリダイズさせた。フ
ィルターを０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で６０℃に
て洗い、その後増感紙を用いて−７０℃でＸ線フィルム
に露光した。ラムダＨindIIIＤＮＡマーカー（Ｋｂでの
サイズ）をオートラジオグラムの左側に並べる。Ｂ．非
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での上
記セクションaと同じc−erb−Ａプローブを用いた胎盤
ＤＮＡの分析。同じ試料を含む類似のブロットをセクシ
ョンａのようにハイブリダイズさせた（但し、３５％ホ
ルムアミドを使用）。ハイブリダイズしたフィルターは
２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で５５℃にて洗い、その後
上記の如くＸ線フィルムに露光した。Ｃ．ヒトc−erb−
Ａ遺伝子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレ
ーザー・サイトフルオロメトリー（Ｌebo ら、1984）に
より分離し、セクションｂで説明した非ストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下に、pheＡ４由来の１.
５kb ＥcoＲＩ挿入物をプローブとして使用して検索し
た。
ザン分析および染色体マッピング。Ａ．妊娠期間終決後
のヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
生成物を0.8％アガロースゲルで分離した。ＤＮＡはニ
トロセルロース紙に移行させ（Ｓouthern，１９７
５）、pheＡ４由来の４５０bp ＳstＩフラグメント（ニ
ック・トランスレーションを行って、比活性５×１０8c
pm／μｇとした）を用いて５０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＰＥ、１×デンハート溶液、0.1％ＳＤＳ、１００μ
ｇ／mｌサケ精子ＤＮＡ中でハイブリダイズさせた。フ
ィルターを０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で６０℃に
て洗い、その後増感紙を用いて−７０℃でＸ線フィルム
に露光した。ラムダＨindIIIＤＮＡマーカー（Ｋｂでの
サイズ）をオートラジオグラムの左側に並べる。Ｂ．非
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での上
記セクションaと同じc−erb−Ａプローブを用いた胎盤
ＤＮＡの分析。同じ試料を含む類似のブロットをセクシ
ョンａのようにハイブリダイズさせた（但し、３５％ホ
ルムアミドを使用）。ハイブリダイズしたフィルターは
２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で５５℃にて洗い、その後
上記の如くＸ線フィルムに露光した。Ｃ．ヒトc−erb−
Ａ遺伝子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレ
ーザー・サイトフルオロメトリー（Ｌebo ら、1984）に
より分離し、セクションｂで説明した非ストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下に、pheＡ４由来の１.
５kb ＥcoＲＩ挿入物をプローブとして使用して検索し
た。
【０１９６】第１９（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトc−erb−Ａの発現。Ａ．ヒト細胞株およびヒト胎盤
からのＲＮＡのノザン分析。ＨeＬa、ＭＣＦ−７および
ＩＭ−９細胞からの細胞質ポリ(Ａ)含有ＲＮＡ（１２μ
ｇ）、またはＨＴ１０８０もしくは胎盤からの全ポリ
（Ａ）ＲＮＡはホルムアルデヒドを含有する１％アガロ
ースゲル上で分離し、ニトロセルロースに移行させ(Ｔh
omas，1980）、そしてニック・トランスレーションを行
った６５０bp ＢamＨＩ−ＰstＩpheＡ４フラグメント
を用いて検索した。細胞質ＲＮＡは等張緩衝液および0.
5％ＮＰ４０を用いて細胞株から分離し、一方胎盤ＲＮ
Ａはグアニジンチオシアネートを用いて新鮮な組織から
抽出した(Ｃhirgwinら、1979)。レーン１，ＨeＬa；レ
ーン２、ＨＴ１０８０；レーン３，ヒト胎盤；レーン
４，ＩＭ−９；レーン５，ＭＣＦ−７。Ｂ．in vitroで
のerb−Ａポリペプチドの合成。Ｔ７ポリメラーゼによ
り触媒されたＲＮＡ転写物を用いて合成した35Ｓ−メチ
オニン標識産物は12.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、フルオログラフィー（ＥＮ3ＨＡＮＣ
Ｅ，ニューイングランドヌクレアー）にかけた。レーン
１，対照（ｍＲＮＡ不含）；レーン２，peＡ１０２（ア
ンチセンスＲＮＡ，４μｌ）；レーン３，peＡ１０１
（センスＲＮＡ，１μｌ）；レーン４，peＡ１０１(４
μｌＲＮＡ)。蛋白質標準のサイズ：血清アルブミン，6
6.2Ｋ；卵アルブミン，4.5Ｋ；およびカルボニックアン
ヒドラーゼ，３１Ｋ。
からのＲＮＡのノザン分析。ＨeＬa、ＭＣＦ−７および
ＩＭ−９細胞からの細胞質ポリ(Ａ)含有ＲＮＡ（１２μ
ｇ）、またはＨＴ１０８０もしくは胎盤からの全ポリ
（Ａ）ＲＮＡはホルムアルデヒドを含有する１％アガロ
ースゲル上で分離し、ニトロセルロースに移行させ(Ｔh
omas，1980）、そしてニック・トランスレーションを行
った６５０bp ＢamＨＩ−ＰstＩpheＡ４フラグメント
を用いて検索した。細胞質ＲＮＡは等張緩衝液および0.
5％ＮＰ４０を用いて細胞株から分離し、一方胎盤ＲＮ
Ａはグアニジンチオシアネートを用いて新鮮な組織から
抽出した(Ｃhirgwinら、1979)。レーン１，ＨeＬa；レ
ーン２、ＨＴ１０８０；レーン３，ヒト胎盤；レーン
４，ＩＭ−９；レーン５，ＭＣＦ−７。Ｂ．in vitroで
のerb−Ａポリペプチドの合成。Ｔ７ポリメラーゼによ
り触媒されたＲＮＡ転写物を用いて合成した35Ｓ−メチ
オニン標識産物は12.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、フルオログラフィー（ＥＮ3ＨＡＮＣ
Ｅ，ニューイングランドヌクレアー）にかけた。レーン
１，対照（ｍＲＮＡ不含）；レーン２，peＡ１０２（ア
ンチセンスＲＮＡ，４μｌ）；レーン３，peＡ１０１
（センスＲＮＡ，１μｌ）；レーン４，peＡ１０１(４
μｌＲＮＡ)。蛋白質標準のサイズ：血清アルブミン，6
6.2Ｋ；卵アルブミン，4.5Ｋ；およびカルボニックアン
ヒドラーゼ，３１Ｋ。
【０１９７】第１９（Ａ）および（Ｂ）図の方法 c−erb−Ａの全コード領域を含むphrＡ１２由来のＥco
ＲＩ挿入物は両方の向きでｐＧＥＭ３（Ｐromega Ｂio
tec社）のＥcoＲＩ部位へ挿入した。プラスミドＤＮＡ
のpｅＡ１０１およびpeＡ１０２をＨindIIIで線状とな
し、0.8％アガロースゲル上で精製し、そしてＴ７ポリ
メラーゼにより触媒されるin vitroＲＮＡ合成のための
鋳型として使用した（実験の部Ｉを参照）。Ｐ６０クロ
マトグラフィー後に、全核酸物質(２μｇ)はウサギ網状
赤血球溶解液系（Ｐromega Ｂiotec社）中で35Ｓ−メ
チニオン（２５μＣi，１１００Ｃi／m moｌ）を用いて
最終容量２５μｌにて蛋白質翻訳を行わせるべく使用し
た。
ＲＩ挿入物は両方の向きでｐＧＥＭ３（Ｐromega Ｂio
tec社）のＥcoＲＩ部位へ挿入した。プラスミドＤＮＡ
のpｅＡ１０１およびpeＡ１０２をＨindIIIで線状とな
し、0.8％アガロースゲル上で精製し、そしてＴ７ポリ
メラーゼにより触媒されるin vitroＲＮＡ合成のための
鋳型として使用した（実験の部Ｉを参照）。Ｐ６０クロ
マトグラフィー後に、全核酸物質(２μｇ)はウサギ網状
赤血球溶解液系（Ｐromega Ｂiotec社）中で35Ｓ−メ
チニオン（２５μＣi，１１００Ｃi／m moｌ）を用いて
最終容量２５μｌにて蛋白質翻訳を行わせるべく使用し
た。
【０１９８】第２０（Ａ）,（Ｂ）,（Ｃ）および（Ｄ）
図 in vitroで合成したerb−Ａポリペプチドへの甲状腺ホ
ルモンの結合。Ａ．invitro で合成したerb−Ａポリペ
プチドの125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチャード分析。erb−
Ａポリペプチド（全容量２mｌ中のin vitro翻訳混合物
からの２μｌ）は異なる125Ｉ−Ｔ3濃度での結合した標
識ホルモン量および遊離の標識ホルモン量を測定するた
めにヒドロキシルアパタイトを用いて特異的甲状腺ホル
モン結合活性について検定した（Ｇruol，1980）。Ｂ．
in vitroで合成した erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ−
Ｔ3結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。peＡ１
０１（センス鎖）−プログラム化反応からの試料（２μ
ｌ）は、次第に増加する濃度の未標識甲状腺ホルモンま
たは類似体（標識ホルモンと競合する）と共に125Ｉ−
Ｔ3標識結合反応（Ｓamuelsら、1974）において使用し
た。特異的に結合した甲状腺ホルモンを競合化合物の濃
度に対してプロットする。Ｃ．in vitroで合成したerb
−Ａポリペプチドへの125Ｉ−Ｔ3結合に対するトリヨー
ドチロニン異性体の競合。結合反応は次第に増加する濃
度のＴ3異性体を加えて上記の通りに行った。erb−Ａに
結合した甲状腺ホルモンは縦座標上にプロットする。
Ｄ．０.４ＭＫＣｌ ＨeＬa 細胞核抽出物への125Ｉ−
Ｔ3結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。ＨeＬa
細胞核は0.4 Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液で抽出した（Ｓam
uelsら、1974）。蛋白質抽出物（２５μｌ）（バイオー
ラッド蛋白質検定法により測定）は次第に増加する濃度
の甲状腺ホルモンおよび類似体を含む標準結合反応混合
物中で0.6nＭ125Ｉ−Ｔ3と混合した（Ｓamuelsら、197
4；Ｌathamら、1976）。
図 in vitroで合成したerb−Ａポリペプチドへの甲状腺ホ
ルモンの結合。Ａ．invitro で合成したerb−Ａポリペ
プチドの125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチャード分析。erb−
Ａポリペプチド（全容量２mｌ中のin vitro翻訳混合物
からの２μｌ）は異なる125Ｉ−Ｔ3濃度での結合した標
識ホルモン量および遊離の標識ホルモン量を測定するた
めにヒドロキシルアパタイトを用いて特異的甲状腺ホル
モン結合活性について検定した（Ｇruol，1980）。Ｂ．
in vitroで合成した erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ−
Ｔ3結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。peＡ１
０１（センス鎖）−プログラム化反応からの試料（２μ
ｌ）は、次第に増加する濃度の未標識甲状腺ホルモンま
たは類似体（標識ホルモンと競合する）と共に125Ｉ−
Ｔ3標識結合反応（Ｓamuelsら、1974）において使用し
た。特異的に結合した甲状腺ホルモンを競合化合物の濃
度に対してプロットする。Ｃ．in vitroで合成したerb
−Ａポリペプチドへの125Ｉ−Ｔ3結合に対するトリヨー
ドチロニン異性体の競合。結合反応は次第に増加する濃
度のＴ3異性体を加えて上記の通りに行った。erb−Ａに
結合した甲状腺ホルモンは縦座標上にプロットする。
Ｄ．０.４ＭＫＣｌ ＨeＬa 細胞核抽出物への125Ｉ−
Ｔ3結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。ＨeＬa
細胞核は0.4 Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液で抽出した（Ｓam
uelsら、1974）。蛋白質抽出物（２５μｌ）（バイオー
ラッド蛋白質検定法により測定）は次第に増加する濃度
の甲状腺ホルモンおよび類似体を含む標準結合反応混合
物中で0.6nＭ125Ｉ−Ｔ3と混合した（Ｓamuelsら、197
4；Ｌathamら、1976）。
【０１９９】第２０(Ａ),(Ｂ),(Ｃ)および(Ｄ)図の方法 標識125Ｉ−３,３’,５−トリヨード−Ｌ−チロニン
（Ｎew Ｅngland Ｎuclear社製，２２００Ｃi／m moｌ
0.3ｎＭ最終）はＴ3−結合緩衝液（0.25Ｍシュークロ
ース，0.25Ｍ ＫＣｌ，２０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ7.
5）,１mＭ ＭｇＣｌ2，２mＭ ＥＤＴＡ，５mＭジチオ
トレイト−ル（ＤＴＴ））（Ｓamuelsら、1974）中でin
vitro 翻訳混合物（第１９（Ａ)にて説明）中で合成し
たerb−Ａポリペプチドと最終容量２５０μｌにて０℃
で２時間混合した。特異的ホルモン結合は 1000倍過剰
の未標識ホルモンを加えることにより測定し、セファデ
ックスＧ−２５微粒子（Ｐharmacia社）0.9×4.0cmカラ
ムから排除容量中に溶出される放射能を計数することに
より検定した（Samuelsら、1974）。
（Ｎew Ｅngland Ｎuclear社製，２２００Ｃi／m moｌ
0.3ｎＭ最終）はＴ3−結合緩衝液（0.25Ｍシュークロ
ース，0.25Ｍ ＫＣｌ，２０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ7.
5）,１mＭ ＭｇＣｌ2，２mＭ ＥＤＴＡ，５mＭジチオ
トレイト−ル（ＤＴＴ））（Ｓamuelsら、1974）中でin
vitro 翻訳混合物（第１９（Ａ)にて説明）中で合成し
たerb−Ａポリペプチドと最終容量２５０μｌにて０℃
で２時間混合した。特異的ホルモン結合は 1000倍過剰
の未標識ホルモンを加えることにより測定し、セファデ
ックスＧ−２５微粒子（Ｐharmacia社）0.9×4.0cmカラ
ムから排除容量中に溶出される放射能を計数することに
より検定した（Samuelsら、1974）。
【０２００】第２１図 ステロイドホルモン受容体と甲状腺ホルモン受容体との
模式図による比較。第１７図に示した受容体分子のアミ
ノ酸配列を模式図で表す。ＣＹＳ，受容体蛋白質に見ら
れる推定上のＤＮＡ結合ドメインをコードするシステイ
ンに富む領域（Ｃysに富む領域の残基は：c−erb−Ａ,
１０２−１６９;ｈＧＲ，４２１−４８６；ｈＥＲ,１８
５−２５０）；Ｃortisol，ＥstradiolおよびＴ3／
Ｔ4，カルボキシル末端のホルモン結合領域；ＩＭＭ，
ヒトグルココルチコイド受容体の免疫原領域。ボックス
を分離する数字，垂直破線間の受容体種同士のアミノ酸
同一性のパーセンテージ；ｈＥＲ，ヒトエストロゲン受
容体；ｈＧＲ，ヒトグルココルチコイド受容体；hc−er
b−Ａベータ，ヒト甲状腺ホルモン受容体。
模式図による比較。第１７図に示した受容体分子のアミ
ノ酸配列を模式図で表す。ＣＹＳ，受容体蛋白質に見ら
れる推定上のＤＮＡ結合ドメインをコードするシステイ
ンに富む領域（Ｃysに富む領域の残基は：c−erb−Ａ,
１０２−１６９;ｈＧＲ，４２１−４８６；ｈＥＲ,１８
５−２５０）；Ｃortisol，ＥstradiolおよびＴ3／
Ｔ4，カルボキシル末端のホルモン結合領域；ＩＭＭ，
ヒトグルココルチコイド受容体の免疫原領域。ボックス
を分離する数字，垂直破線間の受容体種同士のアミノ酸
同一性のパーセンテージ；ｈＥＲ，ヒトエストロゲン受
容体；ｈＧＲ，ヒトグルココルチコイド受容体；hc−er
b−Ａベータ，ヒト甲状腺ホルモン受容体。
【０２０１】III−Ｊ．実験の部IIIで引用した文献 １．Ｂerg，Ｊ.，Ｓcience，232：485−487（1985）。 ２．Ｃarlstedt−Ｄuke,Ｊ.，Ｏkret，Ｓ.，Ｗrange,
Ｏ.，and Ｇustafsson,J.-Ａ.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓci.,Ｕ.Ｓ.Ａ.，79：4260−4264（1982）。 ３．Ｃhirgwin,Ｊ.Ｍ.，Ｐrzybyla,Ａ.Ｆ.，ＭacＤonal
d，Ｒ.Ｊ.,and Ｒutter,Ｗ.Ｆ.，Ｂiochemistry，18：5
294−5299（1979）。 ４．Ｃonneely，Ｏ.Ｍ.，et al.，Ｓcience，233：767
−770（1986）。 ５．Ｄayton，Ａ.Ｉ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.,Ｕ
ＳＡ，81：4495−4499(1984)。 ６．Ｄebuire,Ｂ.，et al.，Ｓcience，224：1456−145
9（1984）。 ７．Ｄejean，Ａ.，Ｂougueleret，Ｌ.，Ｇrzeschik，
Ｋ.−Ｈ.，and Ｔiollais,Ｐ.，Ｎature，322：70−72
（1986）。 ８．Ｄellweg，Ｈ．−Ｇ.，Ｈotz，Ａ.，Ｍugelr，
Ｋ.，and Ｇehring，Ｕ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，1：285−289
（1982）。 ９．Ｅberhardt，Ｎ.Ｌ.，Ａpriletti，Ｊ.Ｗ.，and Ｂ
axter，Ｊ.Ｄ．in Ｂioc hemical Ａctions of Ｈormone
s，Ｖol.ＶＩＩ（ed.Ｌitwack，Ｇ.)，pp．311−394，
Ａcademic，Ｎew Ｙork（1980）。 10. Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，Ｂirnberg，Ｎ.Ｃ.，and Ｒosenf
eld，Ｍ.Ｇ.，Ｐroc．Ｎ atl．Ａcad．Ｓci.,ＵＳＡ，7
9：7659−7663（1982）。 11. Ｆryberg，Ｌ.，et al.，Ｃell，32：227−238（19
83）。 12. Ｇraf，Ｔ.，and Ｂeug，Ｈ.，Ｃell，34：7−9（1
983）。 13. Ｇreen，Ｓ.，et al.，Ｎature，320：134−139（1
986）。 14. Ｇreene，Ｇ.Ｌ.，et al.,Ｓcience，231：1150−1
154（1986）。 15. Ｇruol，Ｄ.Ｊ.，Ａnalyt.Ｂiochem.，101：387−3
93（1980）。 16. Ｈuynh，Ｔ.Ｖ.,Ｙoung，Ｒ.Ａ.,and Ｄavis,Ｒ.
Ｗ.,in ＤＮＡ Ｃloning,a Ｐractical Ａpproach，Ｖo
l.１(ed.Ｇlover，Ｄ.，pp.49−78，ＩＲＬ Ｐress，Ｏ
xford（1985）。 17. Ｊanson，Ｍ.，Ｐhilipson，Ｌ.，and Ｖennstro
m，Ｂ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，2：561−565（1983）。 18. Ｊeltsch，Ｊ.Ｍ.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.，Ｕ
ＳＡ，83：5424−5428（1986）。 19. Ｊohnson，Ｍ.Ｓ.，and Ｄoolittle，Ｒ.Ｆ.，Ｊ.
Ｍolec.Ｅvol.，23：267−278（1986）。 20. Ｋahn，Ｐ.，et al.，Ｃell，45：349−356（198
6）。 21. Ｋrust，Ａ.，et al.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：891−897
（1986）。 22. Ｋummar，Ｖ.，Ｇreen，Ｓ.，Ｓtaub，Ａ.,and Ｃh
ambon，Ｐ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：2231−2236（1986）。 23. Ｌaemmli，Ｕ.Ｋ.，Ｎature，227：680−685（197
0）。 24. Ｌatham，Ｋ.Ｒ.，Ｒing，Ｊ.Ｃ.，and Ｂaxter，
Ｊ.Ｄ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,251：7388−7397（1976）。 25. Ｌebo，Ｒ.，et al.，Ｓcience，225：57−59（198
4）。 26. Ｍartial，Ｊ.Ａ.，Ｂaxter，Ｊ.Ｄ.，Ｇoodman，
Ｈ.Ｍ.，and Ｓeeburg，Ｐ.Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci.，ＵＳＡ，74：1816−1820（1977）。 27. Ｍaxam，Ａ.,and Ｇibert，Ｗ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａ
cad．Ｓci.，ＵＳＡ，74：560−564（1977）。 28. Ｍiller，Ｊ.，Ｍclachlan，Ａ.Ｄ.，and Ｋlug，
Ａ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，4：1609：1614（1985）。 29. Ｏppenheimer，Ｊ.Ｈ.,Ｋoerner，Ｄ.，Ｓchwart
z，Ｈ.Ｌ.，and Ｓiurks，Ｍ.Ｉ.Ｊ.，Ｃlin．Ｅndoc
r．Ｍetab.，35：330−333（1972）。 30. Ｐascual，Ａ.，Ｃasanova，Ｊ．and Ｓamuels，
Ｈ.Ｈ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,257：9640−9647（1982）。 31. Ｐroudfoot，Ｎ.Ｊ.，and Ｂrownlee，Ｇ.Ｇ.，Ｎa
ture，263：211−214（1976）。 32. Ｒeichman，Ｍ.Ｅ.，et al.，Ｂiochemistry，23：
5376−5384（1984）。 33. Ｒigby，Ｐ.Ｗ.Ｊ.，Ｄieckmann，Ｍ.，Ｒhodes，
Ｃ.，and Ｂerg，Ｐ.，Ｊ．Ｍolec．Ｂiol.，113：237
−251（1977）。 34. Ｓamuls，Ｈ.Ｈ.，and Ｓhapiro，Ｌ.Ｅ., Ｐroc．
Ｎatl．Ａcad．Ｓci.， ＵＳＡ，73：3369−3373（197
6）。 35. Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.,Ｓtanley，Ｆ.，and Ｃasanova,
Ｊ.,Ｊ.Ｃlin.Invest.,63：1229−1240（1979）。 36. Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.,Ｔsai，Ｊ.Ｓ.,Ｃasanova,Ｊ.,a
nd Ｓtanley,Ｆ.Ｊ.，Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest.，54：853−
865（1974）。 37. Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｔsai，Ｊ.Ｓ.，and Ｃintro
n，Ｒ.，Ｓcience，181：1253−1256（1973）。 38. Ｓealy，Ｌ.，Ｐrivalsky，Ｍ.Ｌ.，Ｍoscovici，
Ｇ.，Ｍoscovici，Ｃ.，and Ｂishop，Ｊ.Ｍ.，Ｖirolo
gy，130：155−178（1983）。 39. Ｓherman，Ｍ.Ｒ.,Ｐickering,Ｌ.Ａ.,Ｒollwage
n，Ｆ.Ｍ.，and Ｍiller，Ｌ.Ｋ.，Ｆedn．Ｐroc.，3
7：167−173（1978）。 40. Ｓpindler，Ｂ.Ｊ.，Ｍellon，Ｓ.Ｈ.，and Ｂaxte
r，Ｊ.Ｄ.，Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.，257：11627−11632（19
82）。 41. Ｓpurr，Ｎ.Ｋ.，et al.，ＥＭＢＯ Ｊ.，3：159−
163（1984）。 42. Ｔata，Ｊ.Ｒ.，and Ｗindnell，Ｃ.Ｃ.，Ｂioche
m．Ｊ.，98：604−620（1966）。 43. Ｔhomas,Ｐ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，ＵＳ
Ａ，77：5201−5205（1980）。 44. Ｔsai,Ｊ.Ｓ.,and Ｓamuels,Ｈ.Ｈ.,Ｂiochem.Ｂio
phys.Ｒes.Ｃommmmun.,59：420−428（1974）。 45. Ｖennstrom，Ｂ.,Ｆanshier,Ｌ.，Ｍoscovici,
Ｃ.，and Ｂishop,Ｊ.Ｍ.,Ｊ．Ｖirol.，36：575−585
（1980）。 46. Ｗeinberger，Ｃ.，Ｈollenberg，Ｓ．Ｍ.，Ｒosen
feld，Ｍ.Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，Ｎature，318：67
0−672（1985a）。 47. Ｗeinberger，Ｃ.，Ｈollenberg，Ｓ．Ｍ.，Ｒosen
feld，Ｍ.Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，Ｓcience，228：7
40−742（1985b）。 48. Ｙaffe，Ｂ.Ｍ.，and Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｊ.Ｂio
l．Ｃhem.，259：6284−6291（1984）。
Ｏ.，and Ｇustafsson,J.-Ａ.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓci.,Ｕ.Ｓ.Ａ.，79：4260−4264（1982）。 ３．Ｃhirgwin,Ｊ.Ｍ.，Ｐrzybyla,Ａ.Ｆ.，ＭacＤonal
d，Ｒ.Ｊ.,and Ｒutter,Ｗ.Ｆ.，Ｂiochemistry，18：5
294−5299（1979）。 ４．Ｃonneely，Ｏ.Ｍ.，et al.，Ｓcience，233：767
−770（1986）。 ５．Ｄayton，Ａ.Ｉ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.,Ｕ
ＳＡ，81：4495−4499(1984)。 ６．Ｄebuire,Ｂ.，et al.，Ｓcience，224：1456−145
9（1984）。 ７．Ｄejean，Ａ.，Ｂougueleret，Ｌ.，Ｇrzeschik，
Ｋ.−Ｈ.，and Ｔiollais,Ｐ.，Ｎature，322：70−72
（1986）。 ８．Ｄellweg，Ｈ．−Ｇ.，Ｈotz，Ａ.，Ｍugelr，
Ｋ.，and Ｇehring，Ｕ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，1：285−289
（1982）。 ９．Ｅberhardt，Ｎ.Ｌ.，Ａpriletti，Ｊ.Ｗ.，and Ｂ
axter，Ｊ.Ｄ．in Ｂioc hemical Ａctions of Ｈormone
s，Ｖol.ＶＩＩ（ed.Ｌitwack，Ｇ.)，pp．311−394，
Ａcademic，Ｎew Ｙork（1980）。 10. Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，Ｂirnberg，Ｎ.Ｃ.，and Ｒosenf
eld，Ｍ.Ｇ.，Ｐroc．Ｎ atl．Ａcad．Ｓci.,ＵＳＡ，7
9：7659−7663（1982）。 11. Ｆryberg，Ｌ.，et al.，Ｃell，32：227−238（19
83）。 12. Ｇraf，Ｔ.，and Ｂeug，Ｈ.，Ｃell，34：7−9（1
983）。 13. Ｇreen，Ｓ.，et al.，Ｎature，320：134−139（1
986）。 14. Ｇreene，Ｇ.Ｌ.，et al.,Ｓcience，231：1150−1
154（1986）。 15. Ｇruol，Ｄ.Ｊ.，Ａnalyt.Ｂiochem.，101：387−3
93（1980）。 16. Ｈuynh，Ｔ.Ｖ.,Ｙoung，Ｒ.Ａ.,and Ｄavis,Ｒ.
Ｗ.,in ＤＮＡ Ｃloning,a Ｐractical Ａpproach，Ｖo
l.１(ed.Ｇlover，Ｄ.，pp.49−78，ＩＲＬ Ｐress，Ｏ
xford（1985）。 17. Ｊanson，Ｍ.，Ｐhilipson，Ｌ.，and Ｖennstro
m，Ｂ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，2：561−565（1983）。 18. Ｊeltsch，Ｊ.Ｍ.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.，Ｕ
ＳＡ，83：5424−5428（1986）。 19. Ｊohnson，Ｍ.Ｓ.，and Ｄoolittle，Ｒ.Ｆ.，Ｊ.
Ｍolec.Ｅvol.，23：267−278（1986）。 20. Ｋahn，Ｐ.，et al.，Ｃell，45：349−356（198
6）。 21. Ｋrust，Ａ.，et al.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：891−897
（1986）。 22. Ｋummar，Ｖ.，Ｇreen，Ｓ.，Ｓtaub，Ａ.,and Ｃh
ambon，Ｐ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：2231−2236（1986）。 23. Ｌaemmli，Ｕ.Ｋ.，Ｎature，227：680−685（197
0）。 24. Ｌatham，Ｋ.Ｒ.，Ｒing，Ｊ.Ｃ.，and Ｂaxter，
Ｊ.Ｄ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,251：7388−7397（1976）。 25. Ｌebo，Ｒ.，et al.，Ｓcience，225：57−59（198
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cad．Ｓci.，ＵＳＡ，74：560−564（1977）。 28. Ｍiller，Ｊ.，Ｍclachlan，Ａ.Ｄ.，and Ｋlug，
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nd Ｓtanley,Ｆ.Ｊ.，Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest.，54：853−
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Ｇ.，Ｍoscovici，Ｃ.，and Ｂishop，Ｊ.Ｍ.，Ｖirolo
gy，130：155−178（1983）。 39. Ｓherman，Ｍ.Ｒ.,Ｐickering,Ｌ.Ａ.,Ｒollwage
n，Ｆ.Ｍ.，and Ｍiller，Ｌ.Ｋ.，Ｆedn．Ｐroc.，3
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l．Ｃhem.，259：6284−6291（1984）。
【０２０２】実験の部IV ヒトミネラロコルチコイド受容体相補ＤＮＡのクローニ
ング：グルココルチコイド受容体との構造的および機能
的類似性IV．Ａ．概要 推定上の１０７キロダルトンのポリペプチドをコードす
る新しい遺伝子を単離するために、ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）相補ＤＮＡとの低いストリンジェ
ントハイブリダイゼーションを使用した。発現試験によ
り、高親和性でもってアルドステロンと結合し、そして
アルドステロンに応答して遺伝子転写を活性化するその
能力が証明され、それによりヒトミネラロコルチコイド
受容体（hＭＲ）としてのその本性が確立される。この
分子はまたグルココルチコイドに対して高い親和性を示
し、グルココルチコイド応答性プロモーターを刺激す
る。ｈＭＲおよびｈＧＲは一緒になって、ホルモン結合
特性、標的遺伝子相互作用および組織特異的発現パター
ンが組合わされた様式で使用され、複雑な生理学的コン
トロールを達成する予期せぬ機能的多様性をもたらす。
ング：グルココルチコイド受容体との構造的および機能
的類似性IV．Ａ．概要 推定上の１０７キロダルトンのポリペプチドをコードす
る新しい遺伝子を単離するために、ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）相補ＤＮＡとの低いストリンジェ
ントハイブリダイゼーションを使用した。発現試験によ
り、高親和性でもってアルドステロンと結合し、そして
アルドステロンに応答して遺伝子転写を活性化するその
能力が証明され、それによりヒトミネラロコルチコイド
受容体（hＭＲ）としてのその本性が確立される。この
分子はまたグルココルチコイドに対して高い親和性を示
し、グルココルチコイド応答性プロモーターを刺激す
る。ｈＭＲおよびｈＧＲは一緒になって、ホルモン結合
特性、標的遺伝子相互作用および組織特異的発現パター
ンが組合わされた様式で使用され、複雑な生理学的コン
トロールを達成する予期せぬ機能的多様性をもたらす。
【０２０３】IV．Ｂ．序論 視床下部−下垂体−副腎軸はいろいろな神経内分泌の入
力信号を結合して、副腎コルチコステロイドの合成およ
び分泌を調節している。これらのステロイドホルモンは
数組の標的遺伝子の転写を直接的に調節する細胞内受容
体蛋白質との相互作用によって成長、発生およびホメオ
スタシスに影響を及ぼす（１，２）。２つの受容体系が
コルチコステロイドのために定められ、これらはグルコ
コルチコイド受容体（ＧＲ）およびミネラロコルチコイ
ド受容体（ＭＲ）と名づけられた。初期の機能検定によ
り、コルチコステロイドは肝臓へのグルコーゲン貯蔵を
促進するそれらの作用によりグルココルチコイド、また
は腎臓によるナトリウム貯留を促進するそれらの作用に
よりミネラロコルチコイドのいずれかに類別された。し
かしながら、それぞれのステロイドクラスはその同族受
容体とのみ相互作用するように制限されておらず、とり
わけグルココルチコイドは実質上のミネラロコルチコイ
ド活性を示すことができる（１−３）。
力信号を結合して、副腎コルチコステロイドの合成およ
び分泌を調節している。これらのステロイドホルモンは
数組の標的遺伝子の転写を直接的に調節する細胞内受容
体蛋白質との相互作用によって成長、発生およびホメオ
スタシスに影響を及ぼす（１，２）。２つの受容体系が
コルチコステロイドのために定められ、これらはグルコ
コルチコイド受容体（ＧＲ）およびミネラロコルチコイ
ド受容体（ＭＲ）と名づけられた。初期の機能検定によ
り、コルチコステロイドは肝臓へのグルコーゲン貯蔵を
促進するそれらの作用によりグルココルチコイド、また
は腎臓によるナトリウム貯留を促進するそれらの作用に
よりミネラロコルチコイドのいずれかに類別された。し
かしながら、それぞれのステロイドクラスはその同族受
容体とのみ相互作用するように制限されておらず、とり
わけグルココルチコイドは実質上のミネラロコルチコイ
ド活性を示すことができる（１−３）。
【０２０４】今や、ＭＲはグルココルチコイドとミネラ
ロコルチコイドの両方に対して有意なin vitro親和性を
有することが明らかである（３，４）。グルココルチコ
イドの循環濃度はアルドステロン（代表的なミネラロコ
ルチコイド）よりも数段高いので、ＭＲのグルココルチ
コイド活性化は機能的に意義がある。腎および腸のよう
な組織の分泌上波はアルドステロンに応答して電解質と
水のバランスを調節しているが、別の機構はこれらの組
織にミネラロコルチコイドに対する感受性を付与するこ
とが可能である（５）。他の組織において発現されるＭ
Ｒの機能的役割は全く明らかになっていないが、脳での
生理学的応答はＭＲとグルココルチコイドの相互作用の
結果として起こる（５−７）。高親和性の放射性標識リ
ガンドの利用可能性にもかかわらず、ＭＲは精製が困難
であり、その生化学的性質はＧＲに比べて十分に理解さ
れていない。ＭＲの研究に分子生物学の技術を応用する
ことにより、ＭＲの生化学的同定が容易となり、終局的
にその転写制御下にある遺伝子およびそれらの産物がホ
メオスタシスにおいて演ずる役割が理解されるであろ
う。
ロコルチコイドの両方に対して有意なin vitro親和性を
有することが明らかである（３，４）。グルココルチコ
イドの循環濃度はアルドステロン（代表的なミネラロコ
ルチコイド）よりも数段高いので、ＭＲのグルココルチ
コイド活性化は機能的に意義がある。腎および腸のよう
な組織の分泌上波はアルドステロンに応答して電解質と
水のバランスを調節しているが、別の機構はこれらの組
織にミネラロコルチコイドに対する感受性を付与するこ
とが可能である（５）。他の組織において発現されるＭ
Ｒの機能的役割は全く明らかになっていないが、脳での
生理学的応答はＭＲとグルココルチコイドの相互作用の
結果として起こる（５−７）。高親和性の放射性標識リ
ガンドの利用可能性にもかかわらず、ＭＲは精製が困難
であり、その生化学的性質はＧＲに比べて十分に理解さ
れていない。ＭＲの研究に分子生物学の技術を応用する
ことにより、ＭＲの生化学的同定が容易となり、終局的
にその転写制御下にある遺伝子およびそれらの産物がホ
メオスタシスにおいて演ずる役割が理解されるであろ
う。
【０２０５】グルココルチコイド（実験の部Ｉおよび文
献８，９を参照）、エストロゲン（１０）、およびプロ
ゲステロン（１１）受容体の分子クローニングはそれら
の一次アミノ酸構造の決定およびこのファミリーの調節
蛋白質に共通の機能的ドメインの推定を可能にした。グ
ルココルチコイド（実験の部IIおよび文献１２を参照）
およびエストロゲン（１３）受容体の実験的解析はシス
テイン、リシンおよびアルギニンに富む中央に位置する
ＤＮＡ結合ドメイン、およびステロイドホルモンが作用
するカルボキシル末端領域を明らかにした。ＧＲの機能
的研究は、カルボキシル末端へのホルモン結合が、受容
体とＤＮＡとの相互作用および転写の活性化を可能にす
べくＤＮＡ結合領域をアンマスキング（unmasking）す
ると示唆した(１４，１５)。ステロイド受容体および甲
状腺ホルモン受容体のシステインに富むＤＮＡ結合領域
の比較は、これらの分子間に高度の関連性を示す(１
６)。不変のシステイン残基は、Ｚn2+ 金属原子の配置
がキセノプス（Ｘenopus）５Ｓ遺伝子第IIIＡ転写因子
について提案されたものに類似したＤＮＡ結合の構造的
形状を維持するという仮説へ導いた（１７）。また、ス
テロイド受容体ファミリーのステロイド結合領域も、共
通の原子的前駆物質からの種々の受容体クラスの進化と
矛盾しない実質的保存（conservation）を示す（１１，
１６）。
献８，９を参照）、エストロゲン（１０）、およびプロ
ゲステロン（１１）受容体の分子クローニングはそれら
の一次アミノ酸構造の決定およびこのファミリーの調節
蛋白質に共通の機能的ドメインの推定を可能にした。グ
ルココルチコイド（実験の部IIおよび文献１２を参照）
およびエストロゲン（１３）受容体の実験的解析はシス
テイン、リシンおよびアルギニンに富む中央に位置する
ＤＮＡ結合ドメイン、およびステロイドホルモンが作用
するカルボキシル末端領域を明らかにした。ＧＲの機能
的研究は、カルボキシル末端へのホルモン結合が、受容
体とＤＮＡとの相互作用および転写の活性化を可能にす
べくＤＮＡ結合領域をアンマスキング（unmasking）す
ると示唆した(１４，１５)。ステロイド受容体および甲
状腺ホルモン受容体のシステインに富むＤＮＡ結合領域
の比較は、これらの分子間に高度の関連性を示す(１
６)。不変のシステイン残基は、Ｚn2+ 金属原子の配置
がキセノプス（Ｘenopus）５Ｓ遺伝子第IIIＡ転写因子
について提案されたものに類似したＤＮＡ結合の構造的
形状を維持するという仮説へ導いた（１７）。また、ス
テロイド受容体ファミリーのステロイド結合領域も、共
通の原子的前駆物質からの種々の受容体クラスの進化と
矛盾しない実質的保存（conservation）を示す（１１，
１６）。
【０２０６】我々はヒトグルココルチコイド受容体（ｈ
ＧＲ）に密接に関連した遺伝子産物を単離するために、
ステロイドホルモン受容体間の構造的類似性を利用し
た。ｈＧＲプローブとの非ストリンジェントハイブリダ
イゼーションにより、ｈＧＲのシステインに富む配列と
高度に関連したヒトゲノムＤＮＡフラグメントを分離し
た。このＤＮＡをプローブとして使用して、我々はシス
テインに富む領域からカルボキシル末端までのｈＧＲと
強い相同性を有する分子をコードする相補ＤＮＡ（cＤ
ＮＡ）を得た。細胞内で発現させたとき、この分子は高
い親和性でもってアルドステロンと結合し、しかもマウ
ス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）のロング・ターミナル・
リピート（ＬＴＲ）のアルドステロン応答性転写を活性
化する。このヒトミネラロコルチコイド受容体のリガン
ドおよびＤＮＡ配列特異性とｈＧＲのそれらとのオーバ
ーラップは、これらの調節分子に対して伝統的に割り当
てられている別々の役割が再考されるべきであることを
示唆している。
ＧＲ）に密接に関連した遺伝子産物を単離するために、
ステロイドホルモン受容体間の構造的類似性を利用し
た。ｈＧＲプローブとの非ストリンジェントハイブリダ
イゼーションにより、ｈＧＲのシステインに富む配列と
高度に関連したヒトゲノムＤＮＡフラグメントを分離し
た。このＤＮＡをプローブとして使用して、我々はシス
テインに富む領域からカルボキシル末端までのｈＧＲと
強い相同性を有する分子をコードする相補ＤＮＡ（cＤ
ＮＡ）を得た。細胞内で発現させたとき、この分子は高
い親和性でもってアルドステロンと結合し、しかもマウ
ス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）のロング・ターミナル・
リピート（ＬＴＲ）のアルドステロン応答性転写を活性
化する。このヒトミネラロコルチコイド受容体のリガン
ドおよびＤＮＡ配列特異性とｈＧＲのそれらとのオーバ
ーラップは、これらの調節分子に対して伝統的に割り当
てられている別々の役割が再考されるべきであることを
示唆している。
【０２０７】IV．Ｃ．hＭＲｃＤＮＡの分離 グルココルチコイド受容体関連遺伝子を同定するため
に、ヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画化し、そしてその分
画をｈＧＲ1.2(ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列を
含むｈＧＲｃＤＮＡの１１００bp フラグメント）とハ
イブリダイズさせた(実験の部Ｉおよび文献１５を参
照）。サザンブロット分析は低ストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件に特有の数本のバンドを示した
（第２３（Ａ）および（Ｂ）図を比較されたい）。2.5
キロ塩基対（Ｋbp）のＨindIIIフラグメント（第２３
（Ｂ）図中に星印で示したもの）は他のハイブリッド形
成バンドからよく分割され、直接的ゲノムクローニング
に適していると判定された。ヒト胎盤からのＨindIII消
化ＤＮＡはアガロースゲル上で大きさに基づいて分画化
し、そしてゲノムライブラリーの構築のために2.5Ｋbp
領域を分離した。その後、このラムダgt１０ライブラリ
ーはプローブとしてｈＧＲ1.2を用いて低ストリンジェ
ントハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングし
た。１つの陽性ゲノムクローン（ランダムＨＧＨ）から
の挿入物はニックトランスレーションを行って、高スト
リンジェントハイブリダイゼーション条件下でのサザン
ブロットにおいてプローブとして使用した（第２３
（Ｃ）図）。2.5Ｋbp ＨindIIIシグナルは非ストリン
ジェント条件下で見られたものに相当し、所望のゲノム
フラグメントの一部が分離されたことを示している。ラ
ムダＨＧＨ由来の挿入物の塩基配列解析は、イントロン
配列によってはさまれた１４０塩基対（bp）のエクソン
を明らかにした(（第２３(Ｄ)図）。この全エクソンは
相同性のｈＧＲｃＤＮＡ配列と６８％のヌクレオチド同
一性を有するが、１０４個のヌクレオチドのうち８５個
を保存する領域がその交差ハイブリダイゼーション特性
を与えるものと思われる。この高度に保存された領域は
ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの一部に対応する（１
５）。ラムダＨＧＨエクソンは１６個の非交換残基から
始まってその後にステロイドホルモン受容体に特徴的な
高度に保存されたシステイン残基の最初の残基が続く４
６個のアミノ酸をコードしている（８−１１）。次の３
０個の残基のうち、２８個がｈＧＲと同一である。これ
らの分析は、ｈＧＲｃＤＮＡ配列中に存在するものと関
連があるが、それとは明らかに異なる配列を含むゲノム
フラグメントが分析されたことを示す（実験の部Ｉを参
照）。
に、ヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画化し、そしてその分
画をｈＧＲ1.2(ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列を
含むｈＧＲｃＤＮＡの１１００bp フラグメント）とハ
イブリダイズさせた(実験の部Ｉおよび文献１５を参
照）。サザンブロット分析は低ストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件に特有の数本のバンドを示した
（第２３（Ａ）および（Ｂ）図を比較されたい）。2.5
キロ塩基対（Ｋbp）のＨindIIIフラグメント（第２３
（Ｂ）図中に星印で示したもの）は他のハイブリッド形
成バンドからよく分割され、直接的ゲノムクローニング
に適していると判定された。ヒト胎盤からのＨindIII消
化ＤＮＡはアガロースゲル上で大きさに基づいて分画化
し、そしてゲノムライブラリーの構築のために2.5Ｋbp
領域を分離した。その後、このラムダgt１０ライブラリ
ーはプローブとしてｈＧＲ1.2を用いて低ストリンジェ
ントハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングし
た。１つの陽性ゲノムクローン（ランダムＨＧＨ）から
の挿入物はニックトランスレーションを行って、高スト
リンジェントハイブリダイゼーション条件下でのサザン
ブロットにおいてプローブとして使用した（第２３
（Ｃ）図）。2.5Ｋbp ＨindIIIシグナルは非ストリン
ジェント条件下で見られたものに相当し、所望のゲノム
フラグメントの一部が分離されたことを示している。ラ
ムダＨＧＨ由来の挿入物の塩基配列解析は、イントロン
配列によってはさまれた１４０塩基対（bp）のエクソン
を明らかにした(（第２３(Ｄ)図）。この全エクソンは
相同性のｈＧＲｃＤＮＡ配列と６８％のヌクレオチド同
一性を有するが、１０４個のヌクレオチドのうち８５個
を保存する領域がその交差ハイブリダイゼーション特性
を与えるものと思われる。この高度に保存された領域は
ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの一部に対応する（１
５）。ラムダＨＧＨエクソンは１６個の非交換残基から
始まってその後にステロイドホルモン受容体に特徴的な
高度に保存されたシステイン残基の最初の残基が続く４
６個のアミノ酸をコードしている（８−１１）。次の３
０個の残基のうち、２８個がｈＧＲと同一である。これ
らの分析は、ｈＧＲｃＤＮＡ配列中に存在するものと関
連があるが、それとは明らかに異なる配列を含むゲノム
フラグメントが分析されたことを示す（実験の部Ｉを参
照）。
【０２０８】ラムダＨＧＨからの挿入物は、このｈＧＲ
関連遺伝子に対応するクローンについて、cＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使
用した。ミネラロコルチコイド受容体はこの種の遺伝子
によってコードされる候補物質であると考えられた。腎
臓はミネラロコルチコイド応答性組織であることが知ら
れているので、数人のヒト腎臓cＤＮＡライブラリーを
スクリーニングした。１１個の陽性クローンが１０6組
換えファージ当たり３〜４の頻度でこれらのラムダgt１
０ライブラリーから分離された。２つの重複するクロー
ン、ラムダ hＫ２およびラムダ hＫ１０、をヌクレオチ
ド配列分析にかけ、合わせて５８２３ヌクレオチドに及
ぶことが見出された（第２４，２５および２６図）。ラ
ムダＨＧＨのエクソン−イントロン境界はこれらのcＤ
ＮＡクローンの塩基配列を決定することにより証明し
た。ラムダhＫ１０（ヌクレオチド１から ３７５０ま
で）は大きいオープン・リーディング・フレームを含
み、完全な一次アミノ酸配列を予告している。ラムダh
Ｋ２からのＤＮＡ挿入物はヌクレオチド８０２から５８
２３にまで伸長しているが、２２３５から２５８６まで
の３５１bp内部欠失を有している。３個の別のクローン
も試験し、欠失領域がラムダ hＫ１０と同じ構造である
ことを確かめた。ラムダhＫ２における欠失はクローニ
ングアーチファクト（人工産物）を表すか、あるいはま
れなメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のスプライシン
グエラー(切り継ぎの誤り）を表すと思われる（１
８）。ヌクレオチド３７５０の下流側の報告された３’
非翻訳領域の配列はラムダ hＫ２から誘導される。これ
らの２つのcＤＮＡの複合配列をhＭＲと名づける（第２
４図）。読み枠内終止コドン(１３６位）の下流側に最
初の読み枠内ＡＴＧ（２２３位）があり、hＭＲは少な
くとも２１６ヌクレオチドの５’非翻訳領域を有してい
る。この最初のＡＴＧをとりまく配列はＫozak（１９）
によって示されたコンセンサス配列と一致する。この推
定されたイニシエーターメチオニンコドンは、９８４個
のアミノ酸をコードする大きいオープン・リーディング
・フレームの最初の部分をなす。終止コドン（３１７５
位）に続いて７０ヌクレオチド−ポリ(Ａ)（ポリアデニ
ル化）尾部の１７ヌクレオチド上流にポリアデニル化シ
グナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有する2.6Ｋbの３’非翻訳領
域が存在する。長い３’非翻訳領域はステロイドホルモ
ン受容体のｍＲＮＡに特徴的な性質である（実際の部Ｉ
および文献９−１１を参照）。
関連遺伝子に対応するクローンについて、cＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使
用した。ミネラロコルチコイド受容体はこの種の遺伝子
によってコードされる候補物質であると考えられた。腎
臓はミネラロコルチコイド応答性組織であることが知ら
れているので、数人のヒト腎臓cＤＮＡライブラリーを
スクリーニングした。１１個の陽性クローンが１０6組
換えファージ当たり３〜４の頻度でこれらのラムダgt１
０ライブラリーから分離された。２つの重複するクロー
ン、ラムダ hＫ２およびラムダ hＫ１０、をヌクレオチ
ド配列分析にかけ、合わせて５８２３ヌクレオチドに及
ぶことが見出された（第２４，２５および２６図）。ラ
ムダＨＧＨのエクソン−イントロン境界はこれらのcＤ
ＮＡクローンの塩基配列を決定することにより証明し
た。ラムダhＫ１０（ヌクレオチド１から ３７５０ま
で）は大きいオープン・リーディング・フレームを含
み、完全な一次アミノ酸配列を予告している。ラムダh
Ｋ２からのＤＮＡ挿入物はヌクレオチド８０２から５８
２３にまで伸長しているが、２２３５から２５８６まで
の３５１bp内部欠失を有している。３個の別のクローン
も試験し、欠失領域がラムダ hＫ１０と同じ構造である
ことを確かめた。ラムダhＫ２における欠失はクローニ
ングアーチファクト（人工産物）を表すか、あるいはま
れなメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のスプライシン
グエラー(切り継ぎの誤り）を表すと思われる（１
８）。ヌクレオチド３７５０の下流側の報告された３’
非翻訳領域の配列はラムダ hＫ２から誘導される。これ
らの２つのcＤＮＡの複合配列をhＭＲと名づける（第２
４図）。読み枠内終止コドン(１３６位）の下流側に最
初の読み枠内ＡＴＧ（２２３位）があり、hＭＲは少な
くとも２１６ヌクレオチドの５’非翻訳領域を有してい
る。この最初のＡＴＧをとりまく配列はＫozak（１９）
によって示されたコンセンサス配列と一致する。この推
定されたイニシエーターメチオニンコドンは、９８４個
のアミノ酸をコードする大きいオープン・リーディング
・フレームの最初の部分をなす。終止コドン（３１７５
位）に続いて７０ヌクレオチド−ポリ(Ａ)（ポリアデニ
ル化）尾部の１７ヌクレオチド上流にポリアデニル化シ
グナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有する2.6Ｋbの３’非翻訳領
域が存在する。長い３’非翻訳領域はステロイドホルモ
ン受容体のｍＲＮＡに特徴的な性質である（実際の部Ｉ
および文献９−１１を参照）。
【０２０９】IV．Ｄ．ＤＮＡ−およびホルモン−結合領
域 ｈＭＲｃＤＮＡによりコードされる蛋白質は、ｈＧＲと
密接に関連したステロイドホルモン受容体の構造的特性
を有する。ｈＭＲの推定上のアミノ酸配列とｈＧＲのそ
れとの比較により、ｈＧＲののＤＮＡ結合ドメインおよ
びステロイド結合ドメインの両方と高度に相同であるこ
とが立証された。ｈＭＲ遺伝子は７７７残基のｈＧＲよ
りもはるかに大きく、９８４個のアミノ酸からなる蛋白
質（推定分子量１０７ＫＤ）をコードする。この大きさ
の不一致は主としてｈＧＲと相同でない大きいアミノ末
端のためである。この領域のサイズおよび配列の相当な
不均一性はグルココルチコイド、エストロゲンおよびプ
ロゲステロンのそれぞれの受容体間に存在する（実験の
部Ｉ；文献９−１１を参照）。アミノ酸相同は６８残基
中９４％のアミノ酸が同一である中央のＤＮＡ領域から
始まる(第２７図)。他のステロイドホルモン受容体に見
られる配列保存の比較的低い領域が、ＤＮＡ結合ドメイ
ンとカルボキシル末端ステロイド結合ドメインとを隔て
ている。この領域は２つのドメイン間の分子ヒンジ（mo
lecular hinge）として役立つことが推測された（実験
の部IIおよび文献１３を参照）。ｈＧＲとの比較は、ｈ
ＭＲのこの領域が反復ヌクレオチド配列によってコード
される４個のグルタミンそれに続く８個のプロリンの配
列を含む２４個の追加のアミノ酸を含むことを示す。起
源および機能に関してこの例外的配列の意義は明らかで
ないが、構造を切断するプロリンはヒンジ領域と一致す
る。hＭＲとｈＧＲのカルボキシル末端の２５０個のア
ミノ酸を比較すると、５７％のアミノ酸同一性および多
数の保存的アミノ酸置換が見られる。これらの置換のい
くつかはステロイドホルモンとの相互作用に必要な疎水
領域を維持している。
域 ｈＭＲｃＤＮＡによりコードされる蛋白質は、ｈＧＲと
密接に関連したステロイドホルモン受容体の構造的特性
を有する。ｈＭＲの推定上のアミノ酸配列とｈＧＲのそ
れとの比較により、ｈＧＲののＤＮＡ結合ドメインおよ
びステロイド結合ドメインの両方と高度に相同であるこ
とが立証された。ｈＭＲ遺伝子は７７７残基のｈＧＲよ
りもはるかに大きく、９８４個のアミノ酸からなる蛋白
質（推定分子量１０７ＫＤ）をコードする。この大きさ
の不一致は主としてｈＧＲと相同でない大きいアミノ末
端のためである。この領域のサイズおよび配列の相当な
不均一性はグルココルチコイド、エストロゲンおよびプ
ロゲステロンのそれぞれの受容体間に存在する（実験の
部Ｉ；文献９−１１を参照）。アミノ酸相同は６８残基
中９４％のアミノ酸が同一である中央のＤＮＡ領域から
始まる(第２７図)。他のステロイドホルモン受容体に見
られる配列保存の比較的低い領域が、ＤＮＡ結合ドメイ
ンとカルボキシル末端ステロイド結合ドメインとを隔て
ている。この領域は２つのドメイン間の分子ヒンジ（mo
lecular hinge）として役立つことが推測された（実験
の部IIおよび文献１３を参照）。ｈＧＲとの比較は、ｈ
ＭＲのこの領域が反復ヌクレオチド配列によってコード
される４個のグルタミンそれに続く８個のプロリンの配
列を含む２４個の追加のアミノ酸を含むことを示す。起
源および機能に関してこの例外的配列の意義は明らかで
ないが、構造を切断するプロリンはヒンジ領域と一致す
る。hＭＲとｈＧＲのカルボキシル末端の２５０個のア
ミノ酸を比較すると、５７％のアミノ酸同一性および多
数の保存的アミノ酸置換が見られる。これらの置換のい
くつかはステロイドホルモンとの相互作用に必要な疎水
領域を維持している。
【０２１０】IV．Ｅ．発現およびホルモン結合 我々はグルココルチコイド受容体機能を調べるために、
サル腎臓細胞株ＣＶ１およびその誘導的（すなわち、Ｓ
Ｖ４０Ｔ抗原−形質転換）細胞株ＣＯＳ−１（ＣＯＳと
呼ばれる）のトランスフェクションを使用した（実験の
部IIを参照）。トランスフェクションされたｈＭＲから
の高レベルのポリペプチド発現は、トランスフェクショ
ンした細胞によるステロイド結合実験を容易にするため
に不可決であった。ＳＶ４０複製起点を含むプラスミド
はＣＯＳ細胞内で高コピー数に複製することができるの
で、ｈＧＲの研究において以前に使用したｐＲＳｈＧＲ
アルファと類似したｈＭＲコード配列用の発現ベクター
を構築した。プラスミドpＲＳｈＭＲはラウス肉腫ウイ
ルス由来のプロモーターの支配下にあるｈＭＲコード配
列、およびＳＶ４０複製起点を含む（第２８（Ａ）
図）。
サル腎臓細胞株ＣＶ１およびその誘導的（すなわち、Ｓ
Ｖ４０Ｔ抗原−形質転換）細胞株ＣＯＳ−１（ＣＯＳと
呼ばれる）のトランスフェクションを使用した（実験の
部IIを参照）。トランスフェクションされたｈＭＲから
の高レベルのポリペプチド発現は、トランスフェクショ
ンした細胞によるステロイド結合実験を容易にするため
に不可決であった。ＳＶ４０複製起点を含むプラスミド
はＣＯＳ細胞内で高コピー数に複製することができるの
で、ｈＧＲの研究において以前に使用したｐＲＳｈＧＲ
アルファと類似したｈＭＲコード配列用の発現ベクター
を構築した。プラスミドpＲＳｈＭＲはラウス肉腫ウイ
ルス由来のプロモーターの支配下にあるｈＭＲコード配
列、およびＳＶ４０複製起点を含む（第２８（Ａ）
図）。
【０２１１】ｈＭＲ蛋白質のリガンド特異性はｐＲＳｈ
ＭＲでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの細胞
質ゾル抽出物を調製することにより調べた。トランスフ
ェクションの２日後に細胞を回収して、デキストラン処
理チャーコール検定によりホルモン結合を測定した。疑
似トランスフェクションした対照の抽出物は〔3Ｈ〕ア
ルドステロンに対して特異的結合活性を全く示さなかっ
たが、pＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞か
らの抽出物は高親和性でもって有意量の〔3Ｈ〕アルド
ステロンと結合した。スカッチャード分析により、〔3
Ｈ〕アルドステロン結合に関する解離定数（ＫD）は1.3
ｎＭと測定された（第２８（Ｂ）図）。この値はミネラ
ロコルチコイド受容体へのアルドステロン結合について
報告されたものとよく一致している（２，２０）。その
後、１−,１０−または１００−倍過剰モル量で存在さ
せたときに、結合を５nＭ〔3Ｈ〕アルドステロンと競合
する異なる未標識ステロイドの能力を調べるために、競
合試験を行った（第２８（Ｃ）および（Ｄ）図）。これ
はｈＭＲに対するこれらのステロイドのそれぞれの相対
親和性の度合を提供した。これらの実験の結果は、アル
ドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステ
ロン、ヒドロコルチゾン（コルチゾル）の全てがｈＭＲ
に対して非常に類似した親和性をもつことを示した。デ
キサメタゾン、プロゲステロン、およびスピロノラクト
ンは比較的弱い結合親和性を示し、一方エストラジオー
ルはhＭＲの結合に対して極めて弱く競合した。結局、
この親和性の差異はhＭＲがヒトミネラロコルチコイド
受容体をコードすることを表している（２,２０）。
ＭＲでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの細胞
質ゾル抽出物を調製することにより調べた。トランスフ
ェクションの２日後に細胞を回収して、デキストラン処
理チャーコール検定によりホルモン結合を測定した。疑
似トランスフェクションした対照の抽出物は〔3Ｈ〕ア
ルドステロンに対して特異的結合活性を全く示さなかっ
たが、pＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞か
らの抽出物は高親和性でもって有意量の〔3Ｈ〕アルド
ステロンと結合した。スカッチャード分析により、〔3
Ｈ〕アルドステロン結合に関する解離定数（ＫD）は1.3
ｎＭと測定された（第２８（Ｂ）図）。この値はミネラ
ロコルチコイド受容体へのアルドステロン結合について
報告されたものとよく一致している（２，２０）。その
後、１−,１０−または１００−倍過剰モル量で存在さ
せたときに、結合を５nＭ〔3Ｈ〕アルドステロンと競合
する異なる未標識ステロイドの能力を調べるために、競
合試験を行った（第２８（Ｃ）および（Ｄ）図）。これ
はｈＭＲに対するこれらのステロイドのそれぞれの相対
親和性の度合を提供した。これらの実験の結果は、アル
ドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステ
ロン、ヒドロコルチゾン（コルチゾル）の全てがｈＭＲ
に対して非常に類似した親和性をもつことを示した。デ
キサメタゾン、プロゲステロン、およびスピロノラクト
ンは比較的弱い結合親和性を示し、一方エストラジオー
ルはhＭＲの結合に対して極めて弱く競合した。結局、
この親和性の差異はhＭＲがヒトミネラロコルチコイド
受容体をコードすることを表している（２,２０）。
【０２１２】IV．Ｆ．転写活性化 ステロイドホルモン作用は標的遺伝子転写のホルモン依
存性調節により特徴づけられる。ＣＶＩ細胞内にトラン
スフェクションされたｈＧＲによる転写調節検定（実験
の部IIを参照）がｈＭＲ用に改変された（第２９
（Ａ）,（Ｂ）および（Ｃ）図）。ステロイド結合検定
に用いた発現プラスミドｐＲＳｈＭＲは、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌
遺伝子に連結されたＭＭＴＶ−ＬＴＲを含むＧＭＣＡＴ
と呼ばれるリポータープラスミドと共に同時トランスフ
ェクションされた。こうして、ＣＡＴ活性はＭＭＴＶプ
ロモーターの転写活性に関する酵素検定を与える。ＭＭ
ＴＶプロモーターはＧＲとの相互作用を介してグルココ
ルチコイド応答性を与える数種のグルココルチコイド応
答因子（ＧＲＥ）、エンハンサー様ＤＮＡ配列を含む
（２１）。ｈＭＲは、そのＤＮＡ結合ドメインが ｈＧ
Ｒのそれとほぼ同一であるために、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを
認識できるかも知れないと考えた。ＣＶＩ細胞をpＲＳh
ＭＲおよびＧＭＣＡＴで同時トランスフェクションした
とき、我々は十分なＣＡＴ活性を観察した。この活性は
添加したアルドステロンの影響を受けず、このことはト
ランスフェクションされたｈＧＲと対照的にｈＭＲを十
分に活性化するに足るホルモンが血清（ウシ胎児血清，
５％）中に存在していたことを示唆する（第２９（Ｂ）
図）。チャーコール処理血清（２２）の存在下では、Ｃ
ＡＴ活性は外因性アルドステロンの添加に応答するよう
になり、このことはhＭＲ ｃＤＮＡが機構的ステロイド
ホルモン受容体をコードすることを示している。hＭＲ
はまたグルココルチコイド・アゴニストのデキサメタゾ
ンによって活性化されたが、ｈＧＲは生理学的濃度以上
（１０ｎＭ）のアルドステロンにさえも応答しなかっ
た。
存性調節により特徴づけられる。ＣＶＩ細胞内にトラン
スフェクションされたｈＧＲによる転写調節検定（実験
の部IIを参照）がｈＭＲ用に改変された（第２９
（Ａ）,（Ｂ）および（Ｃ）図）。ステロイド結合検定
に用いた発現プラスミドｐＲＳｈＭＲは、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌
遺伝子に連結されたＭＭＴＶ−ＬＴＲを含むＧＭＣＡＴ
と呼ばれるリポータープラスミドと共に同時トランスフ
ェクションされた。こうして、ＣＡＴ活性はＭＭＴＶプ
ロモーターの転写活性に関する酵素検定を与える。ＭＭ
ＴＶプロモーターはＧＲとの相互作用を介してグルココ
ルチコイド応答性を与える数種のグルココルチコイド応
答因子（ＧＲＥ）、エンハンサー様ＤＮＡ配列を含む
（２１）。ｈＭＲは、そのＤＮＡ結合ドメインが ｈＧ
Ｒのそれとほぼ同一であるために、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを
認識できるかも知れないと考えた。ＣＶＩ細胞をpＲＳh
ＭＲおよびＧＭＣＡＴで同時トランスフェクションした
とき、我々は十分なＣＡＴ活性を観察した。この活性は
添加したアルドステロンの影響を受けず、このことはト
ランスフェクションされたｈＧＲと対照的にｈＭＲを十
分に活性化するに足るホルモンが血清（ウシ胎児血清，
５％）中に存在していたことを示唆する（第２９（Ｂ）
図）。チャーコール処理血清（２２）の存在下では、Ｃ
ＡＴ活性は外因性アルドステロンの添加に応答するよう
になり、このことはhＭＲ ｃＤＮＡが機構的ステロイド
ホルモン受容体をコードすることを示している。hＭＲ
はまたグルココルチコイド・アゴニストのデキサメタゾ
ンによって活性化されたが、ｈＧＲは生理学的濃度以上
（１０ｎＭ）のアルドステロンにさえも応答しなかっ
た。
【０２１３】IV．Ｇ．組織特異的発現 我々はノザン・ブロット・ハイブリダイゼーションによ
りラット組織内でのhＭＲｃＤＮＡに相応するＭＲｍＲ
ＮＡの発現を調べた。脳、下垂体および心臓ばかりでな
く、腎臓(２４)や腸(２５)のような古典的ミネラロコル
チコイド標的組織はｈＭＲに相応するｍＲＮＡを含んで
いた（第３０図）。腎臓におけるアルドステロン感受性
細胞は主として遠位の皮質性集合管に局限されており
(２)、それ故にこの組織によるわずかな発現レベルは意
外なことではなかった。高レベルのＭＲ(Ｉ型コルチコ
ステロイド結合部位)はラットの脳、特に海馬体（hippo
campal formation)において報告された(４,６)。切開し
た海馬ＲＮＡと全脳から調製したＲＮＡとを比較した際
に、我々は海馬中に著しく豊富なｍＲＮＡを見出した。
アルドステロン結合は下垂体(２６)、培養大動脈細胞
(２７)および脾臓(２８)において報告されているが、こ
の種の活性は筋肉では報告されていない。肝臓はＧＲを
発現するが、検出しうる高親和性のアルドステロン結合
活性を示さず(２９)、予期されるように肝臓ＲＮＡとの
ハイブリッド形成は観察されなかった。ｈＧＲｃＤＮＡ
の類似部分を用いる同じノザン・ブロットの再検索は異
なる大きさのｍＲＮＡ種とのハイブリッド形成を示し、
ＭＲとＧＲとが異なる組織特異的発現パターンを示すこ
とが分かった。
りラット組織内でのhＭＲｃＤＮＡに相応するＭＲｍＲ
ＮＡの発現を調べた。脳、下垂体および心臓ばかりでな
く、腎臓(２４)や腸(２５)のような古典的ミネラロコル
チコイド標的組織はｈＭＲに相応するｍＲＮＡを含んで
いた（第３０図）。腎臓におけるアルドステロン感受性
細胞は主として遠位の皮質性集合管に局限されており
(２)、それ故にこの組織によるわずかな発現レベルは意
外なことではなかった。高レベルのＭＲ(Ｉ型コルチコ
ステロイド結合部位)はラットの脳、特に海馬体（hippo
campal formation)において報告された(４,６)。切開し
た海馬ＲＮＡと全脳から調製したＲＮＡとを比較した際
に、我々は海馬中に著しく豊富なｍＲＮＡを見出した。
アルドステロン結合は下垂体(２６)、培養大動脈細胞
(２７)および脾臓(２８)において報告されているが、こ
の種の活性は筋肉では報告されていない。肝臓はＧＲを
発現するが、検出しうる高親和性のアルドステロン結合
活性を示さず(２９)、予期されるように肝臓ＲＮＡとの
ハイブリッド形成は観察されなかった。ｈＧＲｃＤＮＡ
の類似部分を用いる同じノザン・ブロットの再検索は異
なる大きさのｍＲＮＡ種とのハイブリッド形成を示し、
ＭＲとＧＲとが異なる組織特異的発現パターンを示すこ
とが分かった。
【０２１４】IV．Ｈ．染色体マッピング ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の染色体位置を決定
するために、我々はヒト染色体の異なる組合わせを保有
するネズミ−ヒト体細胞ハイブリッドのパネルに対して
ｈＭＲを調べた（３０）。ミネラロコルチコイド受容体
遺伝子に特異的なＤＮＡフラグメントは、１５種のハイ
ブリッド細胞株においてヒト染色体４と一致して分離さ
れた。染色体５（グルココルチコイド受容体遺伝子部
位）を含む他のすべてのヒト染色体については、不一致
の分離（segregation）が観察された（実験の部Ｉよび
文献３１を参照）。染色体４への割当てを確認するため
に、我々はサザン分析を用いてｈＭＲ遺伝子について限
定組の微小核ハイブリッド（それぞれは１〜３本のヒト
染色体を保有する（３２))を試験した(第３１図)。ラム
ダhＫ２のコード部分により検出された６本のＥcoＲＩ
フラグメントは、このハイブリッドパネルにおいて染色
体４と同時分離される。とりわけ、hＭＲ遺伝子は唯一
のヒト染色体として染色体４を保有する細胞株ＨＤm−
１１３２Ｂ中に存在する。
するために、我々はヒト染色体の異なる組合わせを保有
するネズミ−ヒト体細胞ハイブリッドのパネルに対して
ｈＭＲを調べた（３０）。ミネラロコルチコイド受容体
遺伝子に特異的なＤＮＡフラグメントは、１５種のハイ
ブリッド細胞株においてヒト染色体４と一致して分離さ
れた。染色体５（グルココルチコイド受容体遺伝子部
位）を含む他のすべてのヒト染色体については、不一致
の分離（segregation）が観察された（実験の部Ｉよび
文献３１を参照）。染色体４への割当てを確認するため
に、我々はサザン分析を用いてｈＭＲ遺伝子について限
定組の微小核ハイブリッド（それぞれは１〜３本のヒト
染色体を保有する（３２))を試験した(第３１図)。ラム
ダhＫ２のコード部分により検出された６本のＥcoＲＩ
フラグメントは、このハイブリッドパネルにおいて染色
体４と同時分離される。とりわけ、hＭＲ遺伝子は唯一
のヒト染色体として染色体４を保有する細胞株ＨＤm−
１１３２Ｂ中に存在する。
【０２１５】IV．Ｉ．副腎コルチコステロイドの生理機
能との密接な関係 ヒトミネラロコルチコイド受容体cＤＮＡはヒトグルコ
コルチコイド受容体に高度に相同であるポリペプチドを
コードする。ＤＮＡ結合ドメインにおいて、hＭＲはｈ
ＧＲと約９４％のアミノ酸同一性を維持するが、カルボ
キシル末端に局在化されるステロイド結合ドメインは５
７％の同一性を有する。最近報告されたウサギプロゲス
テロン受容体（ rＰＲ）配列もまたｈＭＲとの高度な関
連性をもっている。ｈＧＲおよび rＰＲ構造ドメインと
ｈＭＲのそれとのアミノ酸同一性の比較（第３２図）
は、これらの機能的に異なる調節蛋白質の驚くべき類似
性を示す。hＭＲとrＰＲとの相同性はｈＧＲ−ｈＭＲ比
較にほとんど一致し、ＤＮＡ結合ドメインでは９０％の
アミノ酸を共有し、そしてステロイド結合ドメインでは
５６％を共有していた。対照的に、hＭＲとヒトエスト
ロゲン受容体（10）との同一領域の比較は、ＤＮＡ結合
ドメインにおいて５６％の同一性およびステロイド結合
ドメインカルボキシル末端において２１％の配列同一性
を示す。hＭＲ，ｈＧＲおよびrＰＲによって共有される
構造的相同度およびそれらのリガンドの構造的関連性
は、それらがステロイドホルモン受容体のサブファミリ
ーから成ることを示唆している。
能との密接な関係 ヒトミネラロコルチコイド受容体cＤＮＡはヒトグルコ
コルチコイド受容体に高度に相同であるポリペプチドを
コードする。ＤＮＡ結合ドメインにおいて、hＭＲはｈ
ＧＲと約９４％のアミノ酸同一性を維持するが、カルボ
キシル末端に局在化されるステロイド結合ドメインは５
７％の同一性を有する。最近報告されたウサギプロゲス
テロン受容体（ rＰＲ）配列もまたｈＭＲとの高度な関
連性をもっている。ｈＧＲおよび rＰＲ構造ドメインと
ｈＭＲのそれとのアミノ酸同一性の比較（第３２図）
は、これらの機能的に異なる調節蛋白質の驚くべき類似
性を示す。hＭＲとrＰＲとの相同性はｈＧＲ−ｈＭＲ比
較にほとんど一致し、ＤＮＡ結合ドメインでは９０％の
アミノ酸を共有し、そしてステロイド結合ドメインでは
５６％を共有していた。対照的に、hＭＲとヒトエスト
ロゲン受容体（10）との同一領域の比較は、ＤＮＡ結合
ドメインにおいて５６％の同一性およびステロイド結合
ドメインカルボキシル末端において２１％の配列同一性
を示す。hＭＲ，ｈＧＲおよびrＰＲによって共有される
構造的相同度およびそれらのリガンドの構造的関連性
は、それらがステロイドホルモン受容体のサブファミリ
ーから成ることを示唆している。
【０２１６】一時的トランスフェクションによるＣＯＳ
細胞内でのｈＭＲポリペプチドの発現は、そのステロイ
ド結合能の評価を可能にした。これらの分析結果は、h
ＭＲcＤＮＡがヒトミネラロコルチコイド受容体をコー
ドしていることを明らかにした。スカッチャード分析
は、pＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から
の抽出物が1.3 nＭのＫD値でもって〔3Ｈ〕アルドステ
ロンと結合することを示した。ＭＲと結合するアルドス
テロンの報告されたＫD値は0.5〜３nＭの範囲である
（２）。これはこの遺伝子産物をヒトミネラロコルチコ
イド受容体として定める際のただ１つの最も重要な基準
である。ステロイド結合競合実験は、ｈＭＲのこの同定
をさらに支持した。ミネラロコルチコイドのデオキシコ
ルチコステロンおよびグルココルチコイドのコルチコス
テロンおよびコルチゾルはアルドステロンそれ自体と同
様に競合するが、一方合成グルココルチコイドのデキサ
メタゾンおよびプロゲステロンはｈＭＲに対して比較的
低い親和性を有する。hＭＲ，ｈＧＲおよびrＰＲの推定
上のステロイド結合ドメインにおける十分なアミノ酸配
列同一性は、これらの受容体の類似リガンド結合特性と
よく合っている。ミネラロコルチコイド受容体、グルコ
コルチコイド受容体およびプロゲステロン受容体はミネ
ラロコルチコイド、グルココルチコイドおよびプロゲス
テロンの類似した２１−炭素原子構造間を識別するのに
限られた能力を示す。この特異性の欠如は特にＭＲとＧ
Ｒに当てはまる。例えば、ＭＲはアルドステロンと等し
い親和性でもってグルココルチコイドと結合する。実際
に、別の機構がアルドステロンへの選択的応答を与える
腎臓のような組織においてのみ、ＭＲは古典的ミネラロ
コルチコイド受容体として機能するのかも知れない
（３,５）。ＭＲはまたプロゲステロンと高い親和性
で、しかしコルチコステロイドに対するその親和性より
も低い親和性でもって結合する。プロゲステロンはミネ
ラロコルチコイド作用の部分アゴニストまたはアンタゴ
ニストとして作用するいくつかの徴候があり（３３）、
またグルココルチコイドはミネラロコルチコイド受容体
への結合において十分なアゴニストとして作用するかど
うか明らかでない。同様に、ＧＲは２０〜４０nＭのＫd
値でグルココルチコイドと結合し、それは２５〜６５ n
ＭのＫｄ値でアルドステロンと結合する（２）。従っ
て、ＭＲとＧＲのホルモン結合特性間の重要な差異はリ
ガンド特異性のそれではなく、むしろコルチコステロイ
ドに対する高親和性対低親和性受容体の差異である。
細胞内でのｈＭＲポリペプチドの発現は、そのステロイ
ド結合能の評価を可能にした。これらの分析結果は、h
ＭＲcＤＮＡがヒトミネラロコルチコイド受容体をコー
ドしていることを明らかにした。スカッチャード分析
は、pＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から
の抽出物が1.3 nＭのＫD値でもって〔3Ｈ〕アルドステ
ロンと結合することを示した。ＭＲと結合するアルドス
テロンの報告されたＫD値は0.5〜３nＭの範囲である
（２）。これはこの遺伝子産物をヒトミネラロコルチコ
イド受容体として定める際のただ１つの最も重要な基準
である。ステロイド結合競合実験は、ｈＭＲのこの同定
をさらに支持した。ミネラロコルチコイドのデオキシコ
ルチコステロンおよびグルココルチコイドのコルチコス
テロンおよびコルチゾルはアルドステロンそれ自体と同
様に競合するが、一方合成グルココルチコイドのデキサ
メタゾンおよびプロゲステロンはｈＭＲに対して比較的
低い親和性を有する。hＭＲ，ｈＧＲおよびrＰＲの推定
上のステロイド結合ドメインにおける十分なアミノ酸配
列同一性は、これらの受容体の類似リガンド結合特性と
よく合っている。ミネラロコルチコイド受容体、グルコ
コルチコイド受容体およびプロゲステロン受容体はミネ
ラロコルチコイド、グルココルチコイドおよびプロゲス
テロンの類似した２１−炭素原子構造間を識別するのに
限られた能力を示す。この特異性の欠如は特にＭＲとＧ
Ｒに当てはまる。例えば、ＭＲはアルドステロンと等し
い親和性でもってグルココルチコイドと結合する。実際
に、別の機構がアルドステロンへの選択的応答を与える
腎臓のような組織においてのみ、ＭＲは古典的ミネラロ
コルチコイド受容体として機能するのかも知れない
（３,５）。ＭＲはまたプロゲステロンと高い親和性
で、しかしコルチコステロイドに対するその親和性より
も低い親和性でもって結合する。プロゲステロンはミネ
ラロコルチコイド作用の部分アゴニストまたはアンタゴ
ニストとして作用するいくつかの徴候があり（３３）、
またグルココルチコイドはミネラロコルチコイド受容体
への結合において十分なアゴニストとして作用するかど
うか明らかでない。同様に、ＧＲは２０〜４０nＭのＫd
値でグルココルチコイドと結合し、それは２５〜６５ n
ＭのＫｄ値でアルドステロンと結合する（２）。従っ
て、ＭＲとＧＲのホルモン結合特性間の重要な差異はリ
ガンド特異性のそれではなく、むしろコルチコステロイ
ドに対する高親和性対低親和性受容体の差異である。
【０２１７】ｈＭＲのin vivo機能は血清コルチゾル結
合蛋白質のトランスコルチンによって複雑になってい
る。この蛋白質はコルチゾルを結合封鎖し、その特異な
分布のために、トランスコルチンは局部のグルココルチ
コイド濃度に影響を及ぼすであろう。腎臓における高レ
ベルのトランスコルチンは血漿からの利用可能なコルチ
ゾルを減少させて、アルドステロン感受性を与え、一方
脳における低レベルのトランスコルチンは、中枢神経系
において、グルココルチコイドが主なｈＭＲリガンドで
ありうることを示唆するであろう。従って、ｈＭＲのた
めの好適な生理学的リガンドは受容体発現の部位に応じ
て明らかに変化する（３）。このモデルおよび他のモデ
ル（５）は、より一層高いレベルの競合性グルココルチ
コイドにもかかわらず、アルドステロンへの若干の組織
の応答性を説明するために提案されたものである。
合蛋白質のトランスコルチンによって複雑になってい
る。この蛋白質はコルチゾルを結合封鎖し、その特異な
分布のために、トランスコルチンは局部のグルココルチ
コイド濃度に影響を及ぼすであろう。腎臓における高レ
ベルのトランスコルチンは血漿からの利用可能なコルチ
ゾルを減少させて、アルドステロン感受性を与え、一方
脳における低レベルのトランスコルチンは、中枢神経系
において、グルココルチコイドが主なｈＭＲリガンドで
ありうることを示唆するであろう。従って、ｈＭＲのた
めの好適な生理学的リガンドは受容体発現の部位に応じ
て明らかに変化する（３）。このモデルおよび他のモデ
ル（５）は、より一層高いレベルの競合性グルココルチ
コイドにもかかわらず、アルドステロンへの若干の組織
の応答性を説明するために提案されたものである。
【０２１８】ｈＭＲとｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン間の
相同度（この保存された６８残基領域中で４個のアミノ
酸残基のみが相違する）は、これらの受容体が類似の調
節因子を認識しうることを示唆する。アルドステロンお
よびデキサメタゾンの両方に応答してトランスフェクシ
ョンされたｈＭＲがＭＭＴＶ−ＬＴＲを活性化すること
はこの結論を支持するが、プロゲステロン受容体もまた
このプロモーターを調節することが立証されている（２
１）。さらに、ＤＮＡ結合ドメインにおけるｈＭＲとｈ
ＧＲの差異、またはこれらの分子の高度に異なるアミノ
末端のような他の領域における差異が、この検定では立
証できないやり方で標的遺伝子特異性に影響を及ぼすの
かも知れない。しかしながら、我々はhＭＲおよびｈＧ
ＲによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写調節を利用して、ミネ
ラロコルチコイドおよびグルココルチコイドによるそれ
らの活性化を調べた。hＭＲ応答は１０nＭアルドステロ
ンまたはデキサメタゾンの場合にほぼ等しかった。一方
ｈＧＲはこの検定においてデキサメタゾンによって活性
化されたが、アルドステロンには不感受性であった。外
因性コルチゾルに応答するｈＭＲによる転写活性化も観
察された。これらのデータは、トランスフェクションし
た細胞において、ミネラロコルチコイドとグルココルチ
コイドの両方がｈＭＲ媒介遺伝子転写を活性化しうるこ
とを示している。この機能的特性に基づいて、我々はｈ
ＭＲが副腎コルチコステロイドに対して高度に応答し、
それ故にグルココルチコイド受容体として機能しうると
結論を下した。
相同度（この保存された６８残基領域中で４個のアミノ
酸残基のみが相違する）は、これらの受容体が類似の調
節因子を認識しうることを示唆する。アルドステロンお
よびデキサメタゾンの両方に応答してトランスフェクシ
ョンされたｈＭＲがＭＭＴＶ−ＬＴＲを活性化すること
はこの結論を支持するが、プロゲステロン受容体もまた
このプロモーターを調節することが立証されている（２
１）。さらに、ＤＮＡ結合ドメインにおけるｈＭＲとｈ
ＧＲの差異、またはこれらの分子の高度に異なるアミノ
末端のような他の領域における差異が、この検定では立
証できないやり方で標的遺伝子特異性に影響を及ぼすの
かも知れない。しかしながら、我々はhＭＲおよびｈＧ
ＲによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写調節を利用して、ミネ
ラロコルチコイドおよびグルココルチコイドによるそれ
らの活性化を調べた。hＭＲ応答は１０nＭアルドステロ
ンまたはデキサメタゾンの場合にほぼ等しかった。一方
ｈＧＲはこの検定においてデキサメタゾンによって活性
化されたが、アルドステロンには不感受性であった。外
因性コルチゾルに応答するｈＭＲによる転写活性化も観
察された。これらのデータは、トランスフェクションし
た細胞において、ミネラロコルチコイドとグルココルチ
コイドの両方がｈＭＲ媒介遺伝子転写を活性化しうるこ
とを示している。この機能的特性に基づいて、我々はｈ
ＭＲが副腎コルチコステロイドに対して高度に応答し、
それ故にグルココルチコイド受容体として機能しうると
結論を下した。
【０２１９】コルチコステロイドに協調応答するミネラ
ロコルチコイド受容体の薬理学的および生理学的機能を
明らかにするほかに、hＭＲｃＤＮＡの分離は多数の病
気、なかでも高血圧および偽低アルドステロン症（pseu
do hypo aldosteronism；ＰＨＡ）におけるｈＭＲの役
割の証明をうながす。ミネラロコルチコイドと高血圧の
関連性は数十年の間認められており、hＭＲ媒介ナトリ
ウム貯留および血液量の増加がいくつかの形態の高血圧
症に部分的に関与しているのかも知れない（３４）。Ｐ
ＨＡは正常レベルまたは高レベルのアルドステロンへの
応答性の欠如によって特徴づけられる常染色体劣性疾患
である。最近の研究により、この疾患をもつ患者では高
親和性アルドステロン結合部位が減少しているか又は完
全に消失していることが証明され（３５）、このことは
ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の欠陥により生ずる
と思われる。hＭＲ遺伝子の染色体マッピングはＰＨＡ
の遺伝子座が染色体４に存在することを示唆する。
ロコルチコイド受容体の薬理学的および生理学的機能を
明らかにするほかに、hＭＲｃＤＮＡの分離は多数の病
気、なかでも高血圧および偽低アルドステロン症（pseu
do hypo aldosteronism；ＰＨＡ）におけるｈＭＲの役
割の証明をうながす。ミネラロコルチコイドと高血圧の
関連性は数十年の間認められており、hＭＲ媒介ナトリ
ウム貯留および血液量の増加がいくつかの形態の高血圧
症に部分的に関与しているのかも知れない（３４）。Ｐ
ＨＡは正常レベルまたは高レベルのアルドステロンへの
応答性の欠如によって特徴づけられる常染色体劣性疾患
である。最近の研究により、この疾患をもつ患者では高
親和性アルドステロン結合部位が減少しているか又は完
全に消失していることが証明され（３５）、このことは
ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の欠陥により生ずる
と思われる。hＭＲ遺伝子の染色体マッピングはＰＨＡ
の遺伝子座が染色体４に存在することを示唆する。
【０２２０】機能的ｈＭＲのクローニングおよび発現は
予期しない考察をもたらし、生理学的複雑性の下に横た
わる機構への新たな興味を刺激し、そして遺伝子ネット
ワークの協調調節のための新しいモデルの開発および試
験を可能にするであろう。
予期しない考察をもたらし、生理学的複雑性の下に横た
わる機構への新たな興味を刺激し、そして遺伝子ネット
ワークの協調調節のための新しいモデルの開発および試
験を可能にするであろう。
【０２２１】IV．Ｊ．実験の部IVに関連した図面の詳細
な説明 第２３（Ａ）,（Ｂ）,（Ｃ）および（Ｄ）図 ｈＧＲ遺伝子に関連したゲノム配列の分離。（Ａ）表示
した制限エンドヌクレアーゼで消化したヒト胎盤ＤＮＡ
の高ストリンジェントハイブリダイゼーション。ｈＧＲ
ｃＤＮＡ（ｈＧＲ1.2）をプローブとして使用した。Ｈi
ndIII消化により作ったラムダＤＮＡフラグメントマー
カーの大きさ（キロ塩基対で表す）をオートラジオグラ
ムの隣に示す。（Ｂ）低ストリンジェントサザン分析。
ＨindIIIレーンに星印ではさまれた2.5kbpバンドは直接
ゲノムクローニングの的にされた配列であった。（Ｃ）
ラムダＨＧＨと命名されたクローン中のこのゲノム配列
の分離は、類似のサザンブロットでプローブとして使用
することにより証明される。ラムダＨＧＨゲノムフラグ
メントは、このクローニングから分離されたハイブリッ
ド形成性内部ＥcoＲＩフラグメントを含む。（Ｄ）ラム
ダＨＧＨゲノムフラグメントのイントロン−エクソン構
造およびｈＧＲとのその相同性。ラムダＨＧＨに存在す
るｈＧＲ関連エクソンは、その推定アミノ酸配列と共に
黒地に白で示される。保存されたシステイン残基は白い
点で示される。アンダーラインを施した共通のスプライ
ス供与部位および受容部位を有するイントロン配列部位
がエクソンの両側に存在することが分かる。ｈＧＲとの
ヌクレオチド相同性を下側に示す。ｈＧＲのヌクレオチ
ド番号は実験の部Ｉで論じた第３および４図からのもの
であり、また実験の部Ｉとしてここで使用した研究を発
表したＨollenbergら（1985）（文献８）を参照された
い。サザン分析のために、我々は妊娠期間終結後のヒト
胎盤由来のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
消化産物を 0.8％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡ
をニトロセルロース紙へ移行させ、ストリンジェントま
たは非ストリンジェント条件下でハイブリダイズさせ
た。ストリンジェントハイブリダイゼーションは５０％
ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（ＮaＣｌ，ＮaＨ2ＰＯ4，
ＥＤＴＡ，pＨ7.4）、１×デンハート溶液、0.1％ＳＤ
Ｓ，100μｇ／mｌのサケ精子ＤＮＡおよびプローブ(１
０6cpm／mｌ）を用いて４２℃で行った。非ストリンジ
ェントハイブリダイゼーションの場合は、５０％ホルム
アミドの代わりに３５％ホルムアミドを用いた。洗浄条
件はストリンジェント条件の場合が６０℃で0.1％ＳＤ
Ｓを含む0.1×ＳＳＣ(標準ＮaＣｌ−クエン酸塩)、そし
て非ストリジェントフィルターの場合が５５℃で ０.１
％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣから成っていた。プローブと
してラムダＨＧＨ由来の３３８bp挿入物を用いたときの
洗浄条件は、６８℃で 0.1％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに
変更した。ラムダＨＧＨの分離のために、ヒト胎盤ＤＮ
Ａ(300μｇ）はＨindIIIで消化し、１％低融点アガロー
スゲル（Ｓeaplaque,ＦＭＣ）上で大きさにより分画化
した。ゲルを 0.5cmの細片に切り取り、フェノール抽出
およびエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。（Ｂ）
において星印ではさまれたバンドに大きさの点で対応す
る分画からのＤＮＡ（２μｇ）は、ＥcoＲＩリンカーを
付加するためにクレノウＤＮＡポリメラーゼで修復し
た。ＥcoＲＩでの消化およびセファロース４Ｂカラムに
よる過剰リンカーの除去後に、このＤＮＡをＥcoＲＩ消
化ラムダｇｔ１０ＤＮＡに連結し、in vitroでパッケー
ジした（カリフォルニア州サンジェゴ，ベクター・クロ
ーニング・システムズ社からのラムダアームおよび抽出
物）。約４×１０5個の独立した組換え体を非ストリン
ジェントサザン分析のために使用した条件と同じ条件下
でスクリーニングしてラムダＨＧＨを得た。
な説明 第２３（Ａ）,（Ｂ）,（Ｃ）および（Ｄ）図 ｈＧＲ遺伝子に関連したゲノム配列の分離。（Ａ）表示
した制限エンドヌクレアーゼで消化したヒト胎盤ＤＮＡ
の高ストリンジェントハイブリダイゼーション。ｈＧＲ
ｃＤＮＡ（ｈＧＲ1.2）をプローブとして使用した。Ｈi
ndIII消化により作ったラムダＤＮＡフラグメントマー
カーの大きさ（キロ塩基対で表す）をオートラジオグラ
ムの隣に示す。（Ｂ）低ストリンジェントサザン分析。
ＨindIIIレーンに星印ではさまれた2.5kbpバンドは直接
ゲノムクローニングの的にされた配列であった。（Ｃ）
ラムダＨＧＨと命名されたクローン中のこのゲノム配列
の分離は、類似のサザンブロットでプローブとして使用
することにより証明される。ラムダＨＧＨゲノムフラグ
メントは、このクローニングから分離されたハイブリッ
ド形成性内部ＥcoＲＩフラグメントを含む。（Ｄ）ラム
ダＨＧＨゲノムフラグメントのイントロン−エクソン構
造およびｈＧＲとのその相同性。ラムダＨＧＨに存在す
るｈＧＲ関連エクソンは、その推定アミノ酸配列と共に
黒地に白で示される。保存されたシステイン残基は白い
点で示される。アンダーラインを施した共通のスプライ
ス供与部位および受容部位を有するイントロン配列部位
がエクソンの両側に存在することが分かる。ｈＧＲとの
ヌクレオチド相同性を下側に示す。ｈＧＲのヌクレオチ
ド番号は実験の部Ｉで論じた第３および４図からのもの
であり、また実験の部Ｉとしてここで使用した研究を発
表したＨollenbergら（1985）（文献８）を参照された
い。サザン分析のために、我々は妊娠期間終結後のヒト
胎盤由来のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
消化産物を 0.8％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡ
をニトロセルロース紙へ移行させ、ストリンジェントま
たは非ストリンジェント条件下でハイブリダイズさせ
た。ストリンジェントハイブリダイゼーションは５０％
ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（ＮaＣｌ，ＮaＨ2ＰＯ4，
ＥＤＴＡ，pＨ7.4）、１×デンハート溶液、0.1％ＳＤ
Ｓ，100μｇ／mｌのサケ精子ＤＮＡおよびプローブ(１
０6cpm／mｌ）を用いて４２℃で行った。非ストリンジ
ェントハイブリダイゼーションの場合は、５０％ホルム
アミドの代わりに３５％ホルムアミドを用いた。洗浄条
件はストリンジェント条件の場合が６０℃で0.1％ＳＤ
Ｓを含む0.1×ＳＳＣ(標準ＮaＣｌ−クエン酸塩)、そし
て非ストリジェントフィルターの場合が５５℃で ０.１
％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣから成っていた。プローブと
してラムダＨＧＨ由来の３３８bp挿入物を用いたときの
洗浄条件は、６８℃で 0.1％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに
変更した。ラムダＨＧＨの分離のために、ヒト胎盤ＤＮ
Ａ(300μｇ）はＨindIIIで消化し、１％低融点アガロー
スゲル（Ｓeaplaque,ＦＭＣ）上で大きさにより分画化
した。ゲルを 0.5cmの細片に切り取り、フェノール抽出
およびエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。（Ｂ）
において星印ではさまれたバンドに大きさの点で対応す
る分画からのＤＮＡ（２μｇ）は、ＥcoＲＩリンカーを
付加するためにクレノウＤＮＡポリメラーゼで修復し
た。ＥcoＲＩでの消化およびセファロース４Ｂカラムに
よる過剰リンカーの除去後に、このＤＮＡをＥcoＲＩ消
化ラムダｇｔ１０ＤＮＡに連結し、in vitroでパッケー
ジした（カリフォルニア州サンジェゴ，ベクター・クロ
ーニング・システムズ社からのラムダアームおよび抽出
物）。約４×１０5個の独立した組換え体を非ストリン
ジェントサザン分析のために使用した条件と同じ条件下
でスクリーニングしてラムダＨＧＨを得た。
【０２２２】第２４−２６図 ヒトミネラロコルチコイド受容体のヌクレオチド配列お
よび一次アミノ酸構造。（２４）いくつかの制限エンド
ヌクレアーゼ切断部位の線図と整列したｈＭＲの複合構
造（ＥcoＲＩ部位はヌクレオチド１および５８２３に示
され、リンカーから誘導される）。この複合体は２つの
重複するラムダgt１０クローンのラムダhk１０およびラ
ムダhk２から組み立てられた。ラムダhk２の線図におけ
るかっこは３５１bpの欠失を示す。斜線ボックスはイニ
シエーターコドンと終結コドンを含む推定されたコード
配列を示す。（２５−２６）ｈＭＲの完全なヌクレオチ
ド配列およびその推定上の一次アミノ酸配列。推定され
たイニシエーターメチオニンの上流にある読み枠内の
５’終結コドンおよび４つの可能なポリアデニル化部位
（ＡＡＴＡＡＡ）にはアンダーラインが施してある。ヒ
ト腎臓ラムダgt１０ライブラリー（１８）はラムダＨＧ
Ｈ由来の挿入物を用いて、このプローブによる高ストリ
ンジェント条件下でのサザン分析のために記載した条件
と同じ条件でスクリーニングした。それぞれのｃＤＮＡ
の重複欠失はサイクロン高速欠失サブクローニング法
（インターナショナル・バイオテクノロジー）により得
られた（３６）。欠失クローンはジデオキシ法（３７）
によりその塩基配列を決定し、そしてギャップやアンビ
ギュイティ（ambiguity）を化学的切断法（３８）によ
り解明した。ＤＮＡ配列は編集してＤevereuxら（３
９）およびＳtaden（４０）のプログラムにより分析し
た。
よび一次アミノ酸構造。（２４）いくつかの制限エンド
ヌクレアーゼ切断部位の線図と整列したｈＭＲの複合構
造（ＥcoＲＩ部位はヌクレオチド１および５８２３に示
され、リンカーから誘導される）。この複合体は２つの
重複するラムダgt１０クローンのラムダhk１０およびラ
ムダhk２から組み立てられた。ラムダhk２の線図におけ
るかっこは３５１bpの欠失を示す。斜線ボックスはイニ
シエーターコドンと終結コドンを含む推定されたコード
配列を示す。（２５−２６）ｈＭＲの完全なヌクレオチ
ド配列およびその推定上の一次アミノ酸配列。推定され
たイニシエーターメチオニンの上流にある読み枠内の
５’終結コドンおよび４つの可能なポリアデニル化部位
（ＡＡＴＡＡＡ）にはアンダーラインが施してある。ヒ
ト腎臓ラムダgt１０ライブラリー（１８）はラムダＨＧ
Ｈ由来の挿入物を用いて、このプローブによる高ストリ
ンジェント条件下でのサザン分析のために記載した条件
と同じ条件でスクリーニングした。それぞれのｃＤＮＡ
の重複欠失はサイクロン高速欠失サブクローニング法
（インターナショナル・バイオテクノロジー）により得
られた（３６）。欠失クローンはジデオキシ法（３７）
によりその塩基配列を決定し、そしてギャップやアンビ
ギュイティ（ambiguity）を化学的切断法（３８）によ
り解明した。ＤＮＡ配列は編集してＤevereuxら（３
９）およびＳtaden（４０）のプログラムにより分析し
た。
【０２２３】第２７図 ミネラロコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容
体のアミノ酸相同性。hＭＲの一次アミノ酸配列は、ギ
ャップ（点で表示）を導入することにより最大の相同性
を得るように、ｈＧＲのアミノ酸配列と整列させた。数
字はhＭＲについては第２５および２６図から、そして
ｈＧＲについては第３および４図から引用した。表示し
た領域の上流には有意な相同性が全く見られなかった。
縦線は同一のアミノ酸残基を示す。矢印はＤＮＡ結合ド
メイン（ＤＮＡ）およびステロイド結合ドメイン(ＳＴ
ＥＲＯＩＤ)の推定上の境界を示す。ＤＮＡ結合ドメイ
ンのアミノ末端境界は最初の保存システイン残基によっ
て任意に定められたが、カルボキシル末端限界はＤＮＡ
結合および転写活性化に必要な配列を示す突然変異誘発
実験に基づいて選択された（１５）。ＤＮＡ結合ドメイ
ンに続く数個の保存的塩基性残基もまたこれらの機能に
とって重要でありうる。アミノ酸相同領域により定めら
れたステロイド結合ドメインの境界もまた突然変異分析
と一致する。アミノ酸残基の一文字略号はＡ，Ａｌa；
Ｃ，Ｃys；Ｄ，Ａsp；Ｅ，Ｇｌu；Ｆ，Ｐhe，Ｇ，Ｇｌ
y；Ｈ，Ｈis；Ｉ，Ｉｌe；Ｋ，Ｌys；Ｌ，Ｌeu；Ｍ，Ｍ
et；Ｎ，Ａsn；Ｐ，Ｐro；Ｑ，Ｇｌn；Ｒ，Ａrg；Ｓ，
Ｓer；Ｔ，Ｔhr；Ｖ，Ｖaｌ；Ｗ，Ｔrp；およびＹ，Ｔy
rである。
体のアミノ酸相同性。hＭＲの一次アミノ酸配列は、ギ
ャップ（点で表示）を導入することにより最大の相同性
を得るように、ｈＧＲのアミノ酸配列と整列させた。数
字はhＭＲについては第２５および２６図から、そして
ｈＧＲについては第３および４図から引用した。表示し
た領域の上流には有意な相同性が全く見られなかった。
縦線は同一のアミノ酸残基を示す。矢印はＤＮＡ結合ド
メイン（ＤＮＡ）およびステロイド結合ドメイン(ＳＴ
ＥＲＯＩＤ)の推定上の境界を示す。ＤＮＡ結合ドメイ
ンのアミノ末端境界は最初の保存システイン残基によっ
て任意に定められたが、カルボキシル末端限界はＤＮＡ
結合および転写活性化に必要な配列を示す突然変異誘発
実験に基づいて選択された（１５）。ＤＮＡ結合ドメイ
ンに続く数個の保存的塩基性残基もまたこれらの機能に
とって重要でありうる。アミノ酸相同領域により定めら
れたステロイド結合ドメインの境界もまた突然変異分析
と一致する。アミノ酸残基の一文字略号はＡ，Ａｌa；
Ｃ，Ｃys；Ｄ，Ａsp；Ｅ，Ｇｌu；Ｆ，Ｐhe，Ｇ，Ｇｌ
y；Ｈ，Ｈis；Ｉ，Ｉｌe；Ｋ，Ｌys；Ｌ，Ｌeu；Ｍ，Ｍ
et；Ｎ，Ａsn；Ｐ，Ｐro；Ｑ，Ｇｌn；Ｒ，Ａrg；Ｓ，
Ｓer；Ｔ，Ｔhr；Ｖ，Ｖaｌ；Ｗ，Ｔrp；およびＹ，Ｔy
rである。
【０２２４】第２８(Ａ),（Ｂ）,（Ｃ）および(Ｄ)図 発現されたｈＭＲのステロイド結合特性。（Ａ）hＭＲ
発現プラスミドｐＲＳhＭＲの構造（４１）。（Ｂ）pＲ
ＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から調製され
た抽出物における〔3Ｈ〕アルドステロン結合のスカッ
チャード分析。各点は２００μｌ中の抽出蛋白質１００
μｇを０℃で2.5時間インキュベーションする３通りの
実験により検定した。５００倍過剰の未標識アルドステ
ロンを用いて測定した非特異的結合は全カウント数の約
２０％であった。疑似トランスフェクションした細胞で
は特異的結合が全く見られなかった。（ＣおよびＤ）ト
ランスフェクションしたＣＯＳ細胞の抽出物における５
nＭ〔3Ｈ〕アルドステロンと未標識ステロイドとの競合
結合。これらの競合実験を代表する２つの独立した実験
の結果を示す。冷却競合剤は１−，１０−，１００−倍
過剰モル量で存在していた。１００％結合の値は、１０
００倍過剰の未標識アルドステロンの存在下で結合した
cpm数を、競合剤の不在下で結合したカウント数から減
算することにより決定した。略号：ＡＬＤＯ，アルドス
テロン；ＤＯＣ，デオキシコルチコステロン；ＤＥＸ，
デキサメタゾン；ＳＰＩＲＯ，スピロノラクトン；Ｅ2
1,17β−エストラジオールＣＳ,コルチコステロン；Ｈ
Ｃ,ヒドロコルチゾン；およびＰＲＯＧ，プロゲステロ
ン。亜集密的生長（subconfluent）ＣＯＳ細胞はＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法（４２）により培養皿当たり１０μ
ｇのpＲＳｈＭＲを用いてトランスフェクションした。
細胞は５％チャーコール処理ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ（イーグル最少培地のダルベッコ修飾）中に２日間維
持し、その後４０mＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.8）、１０
mＭ ＮaＣｌ、１mＭＥＤＴＡ、１０mＭ Ｎa2ＭoＯ4、５
mＭジチオトレイトール、アンチパイン（５μｇ/m
ｌ）、ロイペプチン(５μｇ/mｌ）および５００μＭ弗
化フェニルメチルスルホニル中に収集した。１５０００
×ｇで１０分遠心した後、抽出物は結合に先立って１０
０mＭ ＮaＣｌおよび５％グリセロールへ調整した。〔
3Ｈ〕アルドステロン（比非活性７８Ｃi／mmoｌ，アマ
−シャム社製）との標識反応は全容量２００μｌ中０℃
で2.5時間インキュベーションし、その後２０μｌの５
０％デキストラン被覆チヤーコール（活性チャーコー
ル：デキストラン１０：１）と共に１０分間インキュベ
ーションした。１５０００×ｇ、４℃で２分間遠心した
後、上清中の三重水素を液体シンチレーション分光光度
計により定量化した。
発現プラスミドｐＲＳhＭＲの構造（４１）。（Ｂ）pＲ
ＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から調製され
た抽出物における〔3Ｈ〕アルドステロン結合のスカッ
チャード分析。各点は２００μｌ中の抽出蛋白質１００
μｇを０℃で2.5時間インキュベーションする３通りの
実験により検定した。５００倍過剰の未標識アルドステ
ロンを用いて測定した非特異的結合は全カウント数の約
２０％であった。疑似トランスフェクションした細胞で
は特異的結合が全く見られなかった。（ＣおよびＤ）ト
ランスフェクションしたＣＯＳ細胞の抽出物における５
nＭ〔3Ｈ〕アルドステロンと未標識ステロイドとの競合
結合。これらの競合実験を代表する２つの独立した実験
の結果を示す。冷却競合剤は１−，１０−，１００−倍
過剰モル量で存在していた。１００％結合の値は、１０
００倍過剰の未標識アルドステロンの存在下で結合した
cpm数を、競合剤の不在下で結合したカウント数から減
算することにより決定した。略号：ＡＬＤＯ，アルドス
テロン；ＤＯＣ，デオキシコルチコステロン；ＤＥＸ，
デキサメタゾン；ＳＰＩＲＯ，スピロノラクトン；Ｅ2
1,17β−エストラジオールＣＳ,コルチコステロン；Ｈ
Ｃ,ヒドロコルチゾン；およびＰＲＯＧ，プロゲステロ
ン。亜集密的生長（subconfluent）ＣＯＳ細胞はＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法（４２）により培養皿当たり１０μ
ｇのpＲＳｈＭＲを用いてトランスフェクションした。
細胞は５％チャーコール処理ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ（イーグル最少培地のダルベッコ修飾）中に２日間維
持し、その後４０mＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.8）、１０
mＭ ＮaＣｌ、１mＭＥＤＴＡ、１０mＭ Ｎa2ＭoＯ4、５
mＭジチオトレイトール、アンチパイン（５μｇ/m
ｌ）、ロイペプチン(５μｇ/mｌ）および５００μＭ弗
化フェニルメチルスルホニル中に収集した。１５０００
×ｇで１０分遠心した後、抽出物は結合に先立って１０
０mＭ ＮaＣｌおよび５％グリセロールへ調整した。〔
3Ｈ〕アルドステロン（比非活性７８Ｃi／mmoｌ，アマ
−シャム社製）との標識反応は全容量２００μｌ中０℃
で2.5時間インキュベーションし、その後２０μｌの５
０％デキストラン被覆チヤーコール（活性チャーコー
ル：デキストラン１０：１）と共に１０分間インキュベ
ーションした。１５０００×ｇ、４℃で２分間遠心した
後、上清中の三重水素を液体シンチレーション分光光度
計により定量化した。
【０２２５】第２９(Ａ),（Ｂ）および(Ｃ)図 トランスフェクションしたＣＶＩ細胞内でのhＭＲおよ
びｈＧＲ発現プラスミドによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写
活性化。（Ａ）ＧＭＣＡＴの構造。このプラスミドはホ
ルモン依存性転写活性化のためのリポーター遺伝子とし
てステロイド受容体と同時トランスフェクションされた
（実験の部IIを参照）。（Ｂ）正常血清の存在下でのh
ＭＲまたはｈＧＲトランスフェクション後に見られた示
差的ＣＡＴ酵素活性。トランスフェクションした細胞は
５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。血清は
その後の実験において遊離ステロイドを排除するために
チャーコールで処理した。その結果外因性ステロイドの
効果が測定できるであろう。（Ｃ）hＭＲまたはｈＧＲ
でトランスフェクションした細胞におけるアルドステロ
ンまたはデキサメタゾンによるＣＡＴ活性の示差的誘
導。ＣＶＩ細胞は１０μｇのｐＲＳＶｇaｌ（対照）、p
ＲＳhＭＲまたはpＲＳｈＧＲアルファのいずれかおよび
１０μｇのリポーターＧＭＣＡＴで同時トランスフェク
ションし、そして１０nＭアルドステロン（Ａ）または
１０nＭデキサメタゾン（Ｄ）の存在下または不在下
（−）で培養した。ＡＣ，３−アセチルクロラムフェニ
コール；Ｃ，クロラムフェニコール。リン酸カルシウム
共沈によるトランスフェクション（４３）の２日後、抽
出物をＣＡＴ検定のために調製した（４４）。検定は５
０μｇの蛋白質抽出物を用いて６時間インキュベーショ
ンした。
びｈＧＲ発現プラスミドによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写
活性化。（Ａ）ＧＭＣＡＴの構造。このプラスミドはホ
ルモン依存性転写活性化のためのリポーター遺伝子とし
てステロイド受容体と同時トランスフェクションされた
（実験の部IIを参照）。（Ｂ）正常血清の存在下でのh
ＭＲまたはｈＧＲトランスフェクション後に見られた示
差的ＣＡＴ酵素活性。トランスフェクションした細胞は
５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。血清は
その後の実験において遊離ステロイドを排除するために
チャーコールで処理した。その結果外因性ステロイドの
効果が測定できるであろう。（Ｃ）hＭＲまたはｈＧＲ
でトランスフェクションした細胞におけるアルドステロ
ンまたはデキサメタゾンによるＣＡＴ活性の示差的誘
導。ＣＶＩ細胞は１０μｇのｐＲＳＶｇaｌ（対照）、p
ＲＳhＭＲまたはpＲＳｈＧＲアルファのいずれかおよび
１０μｇのリポーターＧＭＣＡＴで同時トランスフェク
ションし、そして１０nＭアルドステロン（Ａ）または
１０nＭデキサメタゾン（Ｄ）の存在下または不在下
（−）で培養した。ＡＣ，３−アセチルクロラムフェニ
コール；Ｃ，クロラムフェニコール。リン酸カルシウム
共沈によるトランスフェクション（４３）の２日後、抽
出物をＣＡＴ検定のために調製した（４４）。検定は５
０μｇの蛋白質抽出物を用いて６時間インキュベーショ
ンした。
【０２２６】第３０図 ラット組織中のミネラロコルチコイド受容体ｍＲＮＡの
ノザン分析。ラムダhk１０からの１２７０ bp ＥcoＲＩ
フラグメント（1770−3040）を、ラットでの相同ｍＲＮ
Ａ発現のためのプローブとして使用した。すべてのレー
ンにおいて、１０μｇのポリ（Ａ)+ｍＲＮＡを用いた。
リボソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動をサイ
ズマーカーとして示す。ストリンジェント条件下でのハ
イブリダイゼーション後に、フィルターは0.1％ＳＤＳ
を含む２×ＳＳＣで３０分ずつ２回、６８℃で洗浄し
た。
ノザン分析。ラムダhk１０からの１２７０ bp ＥcoＲＩ
フラグメント（1770−3040）を、ラットでの相同ｍＲＮ
Ａ発現のためのプローブとして使用した。すべてのレー
ンにおいて、１０μｇのポリ（Ａ)+ｍＲＮＡを用いた。
リボソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動をサイ
ズマーカーとして示す。ストリンジェント条件下でのハ
イブリダイゼーション後に、フィルターは0.1％ＳＤＳ
を含む２×ＳＳＣで３０分ずつ２回、６８℃で洗浄し
た。
【０２２７】第３１図 微小核ハイブリッドのサザン分析によるhＭＲ遺伝子の
染色体局在化。これらのハイブリッドの構築および特性
決定は以前に開示されている（３２）。それぞれのヒト
染色体含有物は次の通りである：ＨＤm−４Ａ（染色体
２０）、ＨＤm−５（染色体１４および非特定化Ｅグル
ープ染色体）、ＨＤm−９（染色体２０，１４および２
１）、ＨＤm−１５（染色体２１，１１および４）、Ｈ
Ｄm−２０（染色体７および１４）、およびＨＤm−１１
３２Ｂ（染色体４のみ）。ヒト（ＨeＬa）およびマウス
（３Ｔ＃）対照ＤＮＡ試料も示す。微小核体由来のゲノ
ムＤＮＡ（１０μｇ）はＥcoＲＩで消化し、1.0％アガ
ロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜（Ｎytran,
Ｓchleicher ＆ Ｓchuell社）に移行させ、そして高ス
トリンジェント条件下でhＭＲｃＤＮＡプローブを用い
てハイブリダイズさせた（第２３（Ａ）)。放射性プロ
ーブは２つのランダムにプライムした（４５)hＭＲｃＤ
ＮＡ（鋳型（ラムダ hk２の1000−および800−bp Ｅco
ＲＩフラグメント）から大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのク
レノウ断片により合成した。ＨindIII消化ラムダＤＮＡ
のサイズをオートラジオグラムに近接して示す。
染色体局在化。これらのハイブリッドの構築および特性
決定は以前に開示されている（３２）。それぞれのヒト
染色体含有物は次の通りである：ＨＤm−４Ａ（染色体
２０）、ＨＤm−５（染色体１４および非特定化Ｅグル
ープ染色体）、ＨＤm−９（染色体２０，１４および２
１）、ＨＤm−１５（染色体２１，１１および４）、Ｈ
Ｄm−２０（染色体７および１４）、およびＨＤm−１１
３２Ｂ（染色体４のみ）。ヒト（ＨeＬa）およびマウス
（３Ｔ＃）対照ＤＮＡ試料も示す。微小核体由来のゲノ
ムＤＮＡ（１０μｇ）はＥcoＲＩで消化し、1.0％アガ
ロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜（Ｎytran,
Ｓchleicher ＆ Ｓchuell社）に移行させ、そして高ス
トリンジェント条件下でhＭＲｃＤＮＡプローブを用い
てハイブリダイズさせた（第２３（Ａ）)。放射性プロ
ーブは２つのランダムにプライムした（４５)hＭＲｃＤ
ＮＡ（鋳型（ラムダ hk２の1000−および800−bp Ｅco
ＲＩフラグメント）から大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのク
レノウ断片により合成した。ＨindIII消化ラムダＤＮＡ
のサイズをオートラジオグラムに近接して示す。
【０２２８】第３２図 ｈＧＲ，hＭＲおよび rＰＲ構造の模式図によるアミノ
酸比較。一次アミノ酸配列を模式図的に整列させ、点線
の間のそれぞれの相同領域についてアミノ酸同一性のパ
ーセンテージを示す。各ドメイン境界のアミノ酸位置を
それぞれの受容体について示す。ＮおよびＣはアミノ末
端およびカルボキシル末端を表す。Ｃysは推定上のＤＮ
Ａ結合ドメインをコードするシステインに富む領域に相
当し、一方Ｓteroid（コルチゾル、アルドステロンまた
はプロゲステロン）はステロイド結合ドメインを表す。
ｈＧＲの免疫原領域（ＩＭＭ）も示す。アミノ酸残基番
号はｈＧＲについては実験の部Ｉから、rＰＲについて
はＬoosfeltら(１１)から、そしてhＭＲについては我々
のデータから引用する。
酸比較。一次アミノ酸配列を模式図的に整列させ、点線
の間のそれぞれの相同領域についてアミノ酸同一性のパ
ーセンテージを示す。各ドメイン境界のアミノ酸位置を
それぞれの受容体について示す。ＮおよびＣはアミノ末
端およびカルボキシル末端を表す。Ｃysは推定上のＤＮ
Ａ結合ドメインをコードするシステインに富む領域に相
当し、一方Ｓteroid（コルチゾル、アルドステロンまた
はプロゲステロン）はステロイド結合ドメインを表す。
ｈＧＲの免疫原領域（ＩＭＭ）も示す。アミノ酸残基番
号はｈＧＲについては実験の部Ｉから、rＰＲについて
はＬoosfeltら(１１)から、そしてhＭＲについては我々
のデータから引用する。
【０２２９】IV．Ｋ．実験の部IVで引用した文献 １．Ｂaxter,Ｊ.Ｄ.,and Ｔyrrell,Ｊ.Ｂ.,in Ｅndocri
nology and Ｍetabolism，Ｆelig,P.,Ｂaxter,Ｊ．Ｄ.,
Ｂroadus，Ａ．Ｅ．and Ｆrohman,Ｌ．Ｓ．，Ｅds.,p
p．385−510，ＭcＧraw−Ｈill,Ｎew Ｙork(1981)；Ｍa
rver，Ｄ．inＢioch emical Ａctions of Ｈormones，
Ｌitwack，Ｇ.,Ｅd., vol．12，pp．385−431，Ａcadem
ic Ｐress，Ｏrlando ＦＬ（1985）。 ２．Ｆanestil，Ｄ．Ｄ.,and Ｐark,Ｃ.Ｓ.,Ａnnu．Ｒe
v．Ｐhysiol.,43：637（1981)。 ３．Ｆunder，Ｇ．Ｗ.，in Ａdrenal Ｃortex，Ａnder
son，Ｄ．Ｃ.，and Ｗinter,Ｊ.Ｓ.Ｄ.，Ｅds.,pp．86
−95,Ｂutterworths, Ｌondon(1985)。 ４．Ｂeaumont，Ｋ.,and Ｆanestil，Ｄ．Ｄ.,Ｅndocri
nology，113：2043（1983；Ｋrozowski,Ｚ.Ｓ.,and Ｆu
nder,Ｊ.Ｗ.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad．Ｓci．，ＵＳＡ，8
0：6056（1983)。 ５. Ｆunder,Ｊ.Ｗ., and Ｓheppard,Ｋ.,Ａnnu．rev.
Ｐhysiol,49：397（1987)。６．Ｒeul，Ｊ.Ｍ.Ｈ., and
dek loet，Ｅ.Ｒ., Ｅndocrinology，117：2505（198
5)。 ７．ＭcＥwen，Ｂ.Ｓ.,deＫ loet，Ｅ.Ｒ.,and Ｒoster
ne,Ｗ.,Ｐhysiol.Ｒev.,66：1121（1986)。 ８．Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.,et al.，Ｎature，318：635
（1985)。 ９．Ｍiesfeld，et al.,Ｃell，46：389（1986)。 10．Ｇreen,Ｓ.,et al.,Ｎature，320：134（1986);Ｇr
eene,Ｇ.Ｌ.,et al.,Ｓcience，231：1150 (1986)。 11. Ｌoosfelt，Ｈ.,et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,
ＵＳＡ，83：9045(1986)。 12. Ｇiguere,Ｖ.,Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld，
Ｍ.Ｇ.,and Ｅvans，Ｒ．Ｍ.,Ｃell，46：645（198
6）。 13. Ｋumar,Ｖ.，Ｇreen，Ｓ.,Ｓtaub，Ａ.,and Ｃhamb
on，Ｐ.,ＥＭＢＯ Ｊ.,5：2231（1986）；Ｇreen，Ｓ.,
and Ｃhambon，Ｐ.,Ｎature，235：75（1987）。 14. Ｇodowski,Ｐ.Ｊ.,Ｒusconi,Ｓ.,Ｍiesfeld，Ｒ.,a
nd Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.,Ｎature，325：365（1987）。 15. Ｈollenberg，Ｓ．Ｍ.,Ｇiguere，Ｖ.,Ｓegui，
Ｐ.,and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｃell，49：39（1987)。 16. Ｗeinberger,Ｇ.,Ｈollenberg,Ｓ．Ｍ.,Ｒosenfel
d．Ｍ．Ｇ.,and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｎature，318：670
（1985）；Ｋrust,Ａ.,et al.,ＥＭＢＯ Ｊ.,5：891（1
986）；Ｓap,Ｊ.,et al.,Ｎature，324：635（1986）；
Ｗeinberger, Ｇ.,Ｈollenberg,Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld.Ｍ.
Ｇ.,and Ｅvans,Ｒ.Ｍ.,Ｎature，318：641（1985）。 17. Ｍiller,Ｊ.,ＭcLachlan，Ａ.Ｄ.,and Ｋlug，Ａ.,
ＥＭＢＯ Ｊ.,4：1609（1985）。 18. その他のｃＤＮＡクローンの欠失はこれらのライブ
ラリーに報告されている〔Ｇ．Ｉ．Ｂell，et al.,Ｎuc
leic Ａcids Ｒes.,14：8427（1986）〕。 19. Ｋozak，Ｍ.,Ｎature, 308：241(1984)。 20. Ａrmanini,Ｄ.,Ｓtrasser，Ｔ.,and Ｗeber,Ｐc.,
Ａm．Ｊ.Ｐhysiol.,284：Ｅ388 (1985)。 21. Ｒingold,Ｇ.Ｍ.,Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｂishop,Ｊ.
Ｍ.,and Ｖarmus,Ｈ.Ｅ.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
ＵＳＡ，74：2879（1977）；Ｐayvar,Ｆ.，et al.，Ｃe
ll，35：381（1983）；Ｓchiedereit，Ｃ.，Ｇeisse，
Ｓ.，Ｗestphal，Ｈ.Ｍ．and Ｂeato，Ｍ.，Ｎature．3
04：749（1983）。 22. 内因性ステロイドの除去のために、洗浄チャーコー
ルを血清に加え〔100 mｌ当たり２ｇ(乾燥重量)〕 、３
７℃で４０分間、次に５５℃で３０分間インキュベーシ
ョンした。チャーコールは０.４５ミクロンその後０.２
ミクロンのフィルターを通して濾過することにより除い
た。 23. ヒト細胞株は高親和性アルドステロン結合部位を発
現すると報告されていない。ヒト卵巣ＲＮＡのノザンブ
ロット分析により、大きさが約６kbおよび４kbの２つの
ハイブリッド形成ＲＮＡ種が明らかになった。卵巣での
アルドステロン結合活性は報告されていない。 24. Ｆuller，Ｐ.Ｊ.,and Ｆunder,Ｊ.Ｗ.,ＫidneyＩn
t.,10：154（1976）;Ｍatulich，Ｄ.Ｔ.,Ｓpindier,Ｂ.
Ｊ.,Ｓchambelan，Ｍ.,and Ｂaxter,Ｊ. Ｄ.,Ｊ.Ｃli
n．Ｅndocrinol．Ｍetab.，43：1170（1976）。 25. Ｐressley，Ｌ.,and. Ｆunder，Ｊ.Ｗ.，Ｅndocrin
ology，97：588（1975）。 26. Ｌan，Ｎ.Ｃ.，Ｍatulich，Ｄ.Ｔ.，Ｍorris，Ｊ.
Ａ.，and Ｂaxter,Ｊ.Ｄ.,Ｅndocrinology，109：1963
（1981）。 26. Ｋrozowski,Ｚ.,and Ｆunder，J.Ｗ.,Ｅndocrinolo
gy，109：1221（1981）。 27. Ｍeyer，Ｗ.Ｊ.,and Ｎichols，Ｎ.Ｒ.,Ｊ.Ｓteroi
d Ｂiochem.,14：1157（1981）；Ｉ型受容体は心臓にお
いて初期の研究では検出されなかった〔Ｆunder，Ｊ.
Ｗ.，Ｄuval，Ｄ.,and Ｍeyer，Ｐ.，Ｅndocrinology，
93：1300（1973）〕。 28. Ｓwaneck，Ｇ.Ｅ.,Ｈighland，Ｅ.，and Ｅdelman,
Ｊ.Ｓ.，Ｎephron， 6：297（1969）。 29. Ｄuval，Ｄ.，and Ｆunder，Ｊ.Ｗ.，Ｅndocrinolo
gy，94：575（1975）。 30. Ｄracopoli，Ｎ.Ｃ.,et al.，Ａm.Ｊ．Ｈum．Ｇene
t.，37：199（1985）；Ｒettig，Ｗ.，et al.，Ｊ.Ｅx
p．Ｍed.，162：1603（1985）。 31. Ｇehring，Ｕ.，Ｓegnitz，Ｂ.，Ｆoellmer，Ｂ.，
and Ｆrancke，Ｕ.，Ｐr oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，Ｕ
ＳＡ，82：3751（1985）。 32. Ｌugo，Ｔ.Ｇ.,Ｈandelin，Ｂ.Ｌ.,Ｋillary，Ａ.
Ｍ.,Ｈousman，Ｄ.Ｅ.,and Ｈournier，Ｋ.，Ｍol．Ｃe
ll．Ｂiol.，in press。 33. Ｗambach，Ｇ.,and Ｈiggins,Ｊ.Ｒ.,Ｅndocrinolo
gy，102：1686（1978）。 34. Ｖallotton，Ｍ.Ｂ.，and Ｆavre，Ｌ.，in Ａdren
al Ｃortex，Ａnderson,Ｄ.Ｃ.,and Ｗinter，Ｊ.Ｓ.
Ｄ.,Ｅds.，pp．169−187，Ｂutterworths，Ｌondon（1
985）。 35. Ａrmanini，Ｄ.，et al.，Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed.，31
3：1178（1985）。 36. Ｄale，Ｒ.Ｍ.Ｋ.,ＭcＣlure，Ｂ.Ａ.,and Ｈouchi
ns，Ｊ.Ｐ.,Ｐlasmid,13：31（1985）。 37. Ｓanger，Ｆ.,Ｎicklen，Ｓ.，and Ｃoulson，Ａ.
Ｒ.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ，74：5463（19
77）。 38. Ｍaxam，Ａ.Ｍ.,and Ｇilbert，Ｗ.,Ｍethods Ｅnz
ymol.,65：499（1980)。 39. Ｄevereux,Ｊ.,Ｈaeberli,Ｐ.,and Ｓmithies,Ｏ.,
Ｎucleic Ａcids Ｒes.,12：387（1984）。 40. Ｓtaden，Ｒ.，Ｎucleic Ａcids Ｒes.，10：4731
（1982）;Ｓtaden，Ｒ.，Ｎucleic Ａcids Ｒes., 12：
521（1984）。 41.ｐＲＳｈＭＲの構築。ラムダhk１０からの３.７５kb
挿入物は、hＭＲコード配列の５’末端にmp１８ポリリ
ンカーが隣接する方向で、pＧＥＮ４（Ｐromega社）の
ＥcoＲＩ部位へ連結した。このプラスミド（phk１０）
をＨindIIIで消化してポリリンカー部位から3562位のｈ
ＭＲ部位に及ぶＨindIIIフラグメントを形成させ、この
フラグメントを単離し、ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片を用いて両末端を修復した。プラスミドｐＲＳ
ＶＣＡＴ〔Ｃ.Ｍ.Ｇorman，Ｇ.Ｔ.Ｍerlino，Ｍ.Ｃ.Ｓi
llingham，Ｉ.Ｐastan,Ｂ．Ｈ．Ｈoward，Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ，79：6777（1982）〕はＨind
IIIおよびＨpa I で消化し、そして pＢＲ３２２配列、
ＲＳＶ−ＬＴＲおよびＳＶ４０ポリＡ部位を含むＨindI
II−Ｈpa I フラグメントもまた修復した。hＭＲ フラ
グメントとｐＲＳＶＣＡＴ由来のフラグメントとの連結
は、正しい方向でＲＳＶプロモーターにより支配される
ｈＭＲコード配列を含むベクターをもらした。第２８
（Ａ）図でかっこに入れた部位はこのクローニング段階
で失われた。翻訳効率を改良するために、５’非翻訳領
域中のいくつかの上流の開始コドンおよび終結コドン
が、このベクターをＡccＩで消化して mp１８ポリリン
カーからｈＭＲ５'−ＵＴ領域中の１８８位までの約２
００bp 配列を除去することにより欠失された。最後
に、ＮdeＩリンカーを付加したＳＶ４０複製起点をＮde
Ｉ部位（１２）に導入してｐＲＳｈＭＲを形成させた。 42. Ｄeans，Ｒ.Ｊ.，Ｄenis.，Ｋ.Ａ.，Ｔaylor，
Ａ.，and Ｗall，Ｒ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，
ＵＳＡ，81：1292（1984）。 43. Ｗigler，Ｍ.，et al.,Ｃell，16：777（1979）。 44. Ｇorman，Ｃ.Ｍ.，Ｍoffat，Ｌ.Ｆ.，and Ｈoward,
Ｂ.Ｈ.，Ｍol．Ｃell.Ｂ iol.，2：1044（1982）。 45. Ｆeinberg，Ａ.Ｐ.，and Ｖogelstein，Ｂ,．Ａna
l．Ｂiochem.，137：266（1984）。
nology and Ｍetabolism，Ｆelig,P.,Ｂaxter,Ｊ．Ｄ.,
Ｂroadus，Ａ．Ｅ．and Ｆrohman,Ｌ．Ｓ．，Ｅds.,p
p．385−510，ＭcＧraw−Ｈill,Ｎew Ｙork(1981)；Ｍa
rver，Ｄ．inＢioch emical Ａctions of Ｈormones，
Ｌitwack，Ｇ.,Ｅd., vol．12，pp．385−431，Ａcadem
ic Ｐress，Ｏrlando ＦＬ（1985）。 ２．Ｆanestil，Ｄ．Ｄ.,and Ｐark,Ｃ.Ｓ.,Ａnnu．Ｒe
v．Ｐhysiol.,43：637（1981)。 ３．Ｆunder，Ｇ．Ｗ.，in Ａdrenal Ｃortex，Ａnder
son，Ｄ．Ｃ.，and Ｗinter,Ｊ.Ｓ.Ｄ.，Ｅds.,pp．86
−95,Ｂutterworths, Ｌondon(1985)。 ４．Ｂeaumont，Ｋ.,and Ｆanestil，Ｄ．Ｄ.,Ｅndocri
nology，113：2043（1983；Ｋrozowski,Ｚ.Ｓ.,and Ｆu
nder,Ｊ.Ｗ.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad．Ｓci．，ＵＳＡ，8
0：6056（1983)。 ５. Ｆunder,Ｊ.Ｗ., and Ｓheppard,Ｋ.,Ａnnu．rev.
Ｐhysiol,49：397（1987)。６．Ｒeul，Ｊ.Ｍ.Ｈ., and
dek loet，Ｅ.Ｒ., Ｅndocrinology，117：2505（198
5)。 ７．ＭcＥwen，Ｂ.Ｓ.,deＫ loet，Ｅ.Ｒ.,and Ｒoster
ne,Ｗ.,Ｐhysiol.Ｒev.,66：1121（1986)。 ８．Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.,et al.，Ｎature，318：635
（1985)。 ９．Ｍiesfeld，et al.,Ｃell，46：389（1986)。 10．Ｇreen,Ｓ.,et al.,Ｎature，320：134（1986);Ｇr
eene,Ｇ.Ｌ.,et al.,Ｓcience，231：1150 (1986)。 11. Ｌoosfelt，Ｈ.,et al.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,
ＵＳＡ，83：9045(1986)。 12. Ｇiguere,Ｖ.,Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld，
Ｍ.Ｇ.,and Ｅvans，Ｒ．Ｍ.,Ｃell，46：645（198
6）。 13. Ｋumar,Ｖ.，Ｇreen，Ｓ.,Ｓtaub，Ａ.,and Ｃhamb
on，Ｐ.,ＥＭＢＯ Ｊ.,5：2231（1986）；Ｇreen，Ｓ.,
and Ｃhambon，Ｐ.,Ｎature，235：75（1987）。 14. Ｇodowski,Ｐ.Ｊ.,Ｒusconi,Ｓ.,Ｍiesfeld，Ｒ.,a
nd Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.,Ｎature，325：365（1987）。 15. Ｈollenberg，Ｓ．Ｍ.,Ｇiguere，Ｖ.,Ｓegui，
Ｐ.,and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｃell，49：39（1987)。 16. Ｗeinberger,Ｇ.,Ｈollenberg,Ｓ．Ｍ.,Ｒosenfel
d．Ｍ．Ｇ.,and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｎature，318：670
（1985）；Ｋrust,Ａ.,et al.,ＥＭＢＯ Ｊ.,5：891（1
986）；Ｓap,Ｊ.,et al.,Ｎature，324：635（1986）；
Ｗeinberger, Ｇ.,Ｈollenberg,Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld.Ｍ.
Ｇ.,and Ｅvans,Ｒ.Ｍ.,Ｎature，318：641（1985）。 17. Ｍiller,Ｊ.,ＭcLachlan，Ａ.Ｄ.,and Ｋlug，Ａ.,
ＥＭＢＯ Ｊ.,4：1609（1985）。 18. その他のｃＤＮＡクローンの欠失はこれらのライブ
ラリーに報告されている〔Ｇ．Ｉ．Ｂell，et al.,Ｎuc
leic Ａcids Ｒes.,14：8427（1986）〕。 19. Ｋozak，Ｍ.,Ｎature, 308：241(1984)。 20. Ａrmanini,Ｄ.,Ｓtrasser，Ｔ.,and Ｗeber,Ｐc.,
Ａm．Ｊ.Ｐhysiol.,284：Ｅ388 (1985)。 21. Ｒingold,Ｇ.Ｍ.,Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｂishop,Ｊ.
Ｍ.,and Ｖarmus,Ｈ.Ｅ.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．
ＵＳＡ，74：2879（1977）；Ｐayvar,Ｆ.，et al.，Ｃe
ll，35：381（1983）；Ｓchiedereit，Ｃ.，Ｇeisse，
Ｓ.，Ｗestphal，Ｈ.Ｍ．and Ｂeato，Ｍ.，Ｎature．3
04：749（1983）。 22. 内因性ステロイドの除去のために、洗浄チャーコー
ルを血清に加え〔100 mｌ当たり２ｇ(乾燥重量)〕 、３
７℃で４０分間、次に５５℃で３０分間インキュベーシ
ョンした。チャーコールは０.４５ミクロンその後０.２
ミクロンのフィルターを通して濾過することにより除い
た。 23. ヒト細胞株は高親和性アルドステロン結合部位を発
現すると報告されていない。ヒト卵巣ＲＮＡのノザンブ
ロット分析により、大きさが約６kbおよび４kbの２つの
ハイブリッド形成ＲＮＡ種が明らかになった。卵巣での
アルドステロン結合活性は報告されていない。 24. Ｆuller，Ｐ.Ｊ.,and Ｆunder,Ｊ.Ｗ.,ＫidneyＩn
t.,10：154（1976）;Ｍatulich，Ｄ.Ｔ.,Ｓpindier,Ｂ.
Ｊ.,Ｓchambelan，Ｍ.,and Ｂaxter,Ｊ. Ｄ.,Ｊ.Ｃli
n．Ｅndocrinol．Ｍetab.，43：1170（1976）。 25. Ｐressley，Ｌ.,and. Ｆunder，Ｊ.Ｗ.，Ｅndocrin
ology，97：588（1975）。 26. Ｌan，Ｎ.Ｃ.，Ｍatulich，Ｄ.Ｔ.，Ｍorris，Ｊ.
Ａ.，and Ｂaxter,Ｊ.Ｄ.,Ｅndocrinology，109：1963
（1981）。 26. Ｋrozowski,Ｚ.,and Ｆunder，J.Ｗ.,Ｅndocrinolo
gy，109：1221（1981）。 27. Ｍeyer，Ｗ.Ｊ.,and Ｎichols，Ｎ.Ｒ.,Ｊ.Ｓteroi
d Ｂiochem.,14：1157（1981）；Ｉ型受容体は心臓にお
いて初期の研究では検出されなかった〔Ｆunder，Ｊ.
Ｗ.，Ｄuval，Ｄ.,and Ｍeyer，Ｐ.，Ｅndocrinology，
93：1300（1973）〕。 28. Ｓwaneck，Ｇ.Ｅ.,Ｈighland，Ｅ.，and Ｅdelman,
Ｊ.Ｓ.，Ｎephron， 6：297（1969）。 29. Ｄuval，Ｄ.，and Ｆunder，Ｊ.Ｗ.，Ｅndocrinolo
gy，94：575（1975）。 30. Ｄracopoli，Ｎ.Ｃ.,et al.，Ａm.Ｊ．Ｈum．Ｇene
t.，37：199（1985）；Ｒettig，Ｗ.，et al.，Ｊ.Ｅx
p．Ｍed.，162：1603（1985）。 31. Ｇehring，Ｕ.，Ｓegnitz，Ｂ.，Ｆoellmer，Ｂ.，
and Ｆrancke，Ｕ.，Ｐr oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，Ｕ
ＳＡ，82：3751（1985）。 32. Ｌugo，Ｔ.Ｇ.,Ｈandelin，Ｂ.Ｌ.,Ｋillary，Ａ.
Ｍ.,Ｈousman，Ｄ.Ｅ.,and Ｈournier，Ｋ.，Ｍol．Ｃe
ll．Ｂiol.，in press。 33. Ｗambach，Ｇ.,and Ｈiggins,Ｊ.Ｒ.,Ｅndocrinolo
gy，102：1686（1978）。 34. Ｖallotton，Ｍ.Ｂ.，and Ｆavre，Ｌ.，in Ａdren
al Ｃortex，Ａnderson,Ｄ.Ｃ.,and Ｗinter，Ｊ.Ｓ.
Ｄ.,Ｅds.，pp．169−187，Ｂutterworths，Ｌondon（1
985）。 35. Ａrmanini，Ｄ.，et al.，Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed.，31
3：1178（1985）。 36. Ｄale，Ｒ.Ｍ.Ｋ.,ＭcＣlure，Ｂ.Ａ.,and Ｈouchi
ns，Ｊ.Ｐ.,Ｐlasmid,13：31（1985）。 37. Ｓanger，Ｆ.,Ｎicklen，Ｓ.，and Ｃoulson，Ａ.
Ｒ.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ，74：5463（19
77）。 38. Ｍaxam，Ａ.Ｍ.,and Ｇilbert，Ｗ.,Ｍethods Ｅnz
ymol.,65：499（1980)。 39. Ｄevereux,Ｊ.,Ｈaeberli,Ｐ.,and Ｓmithies,Ｏ.,
Ｎucleic Ａcids Ｒes.,12：387（1984）。 40. Ｓtaden，Ｒ.，Ｎucleic Ａcids Ｒes.，10：4731
（1982）;Ｓtaden，Ｒ.，Ｎucleic Ａcids Ｒes., 12：
521（1984）。 41.ｐＲＳｈＭＲの構築。ラムダhk１０からの３.７５kb
挿入物は、hＭＲコード配列の５’末端にmp１８ポリリ
ンカーが隣接する方向で、pＧＥＮ４（Ｐromega社）の
ＥcoＲＩ部位へ連結した。このプラスミド（phk１０）
をＨindIIIで消化してポリリンカー部位から3562位のｈ
ＭＲ部位に及ぶＨindIIIフラグメントを形成させ、この
フラグメントを単離し、ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレ
ノウ断片を用いて両末端を修復した。プラスミドｐＲＳ
ＶＣＡＴ〔Ｃ.Ｍ.Ｇorman，Ｇ.Ｔ.Ｍerlino，Ｍ.Ｃ.Ｓi
llingham，Ｉ.Ｐastan,Ｂ．Ｈ．Ｈoward，Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ，79：6777（1982）〕はＨind
IIIおよびＨpa I で消化し、そして pＢＲ３２２配列、
ＲＳＶ−ＬＴＲおよびＳＶ４０ポリＡ部位を含むＨindI
II−Ｈpa I フラグメントもまた修復した。hＭＲ フラ
グメントとｐＲＳＶＣＡＴ由来のフラグメントとの連結
は、正しい方向でＲＳＶプロモーターにより支配される
ｈＭＲコード配列を含むベクターをもらした。第２８
（Ａ）図でかっこに入れた部位はこのクローニング段階
で失われた。翻訳効率を改良するために、５’非翻訳領
域中のいくつかの上流の開始コドンおよび終結コドン
が、このベクターをＡccＩで消化して mp１８ポリリン
カーからｈＭＲ５'−ＵＴ領域中の１８８位までの約２
００bp 配列を除去することにより欠失された。最後
に、ＮdeＩリンカーを付加したＳＶ４０複製起点をＮde
Ｉ部位（１２）に導入してｐＲＳｈＭＲを形成させた。 42. Ｄeans，Ｒ.Ｊ.，Ｄenis.，Ｋ.Ａ.，Ｔaylor，
Ａ.，and Ｗall，Ｒ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，
ＵＳＡ，81：1292（1984）。 43. Ｗigler，Ｍ.，et al.,Ｃell，16：777（1979）。 44. Ｇorman，Ｃ.Ｍ.，Ｍoffat，Ｌ.Ｆ.，and Ｈoward,
Ｂ.Ｈ.，Ｍol．Ｃell.Ｂ iol.，2：1044（1982）。 45. Ｆeinberg，Ａ.Ｐ.，and Ｖogelstein，Ｂ,．Ａna
l．Ｂiochem.，137：266（1984）。
【０２３０】実験の部V 新しいクラスのステロイドホルモン受容体の同定V．Ａ．序論 生殖腺および副腎はエストロゲン、プロゲスチン、アン
ドロゲン、グルココルチコイドおよびミネラロコルチコ
イドを含む５つの主なグループに類別される多種類のス
テロイドを産生する。生殖腺ステロイドは生殖系の分化
および成長をコントロールし、性的特徴を誘導・維持
し、そして生殖行動を調節する。同様に、副腎ステロイ
ドは代謝調節剤としての重要な役割のほかに分化にも影
響を与える。この広範囲の生理学的作用にもかかわら
ず、各ステロイドの効果は主としてそれが結合する特定
の同族受容体に基づいており、従ってステロイドホルモ
ン作用はそれらの生理活性を媒介する受容体に従ってよ
り正確に分類できるかも知れない。ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）cＤＮＡ（実験の部Ｉを参照され
たい、これは文献１として発表した）、すぐその後に実
施されたエストロゲン2'3（ｈＥＲ）、プロゲステロン4
（hＰＲ）およびミネラロコルチコイド受容体（hＭＲ)
をコードするcＤＮＡ（実験の部IVを参照、これは文献
５として発表）、ならびにいろいろな種6-11からの相同
体の上首尾のクローニング、塩基配列決定および発現は
受容体の構造およびこれらの分子が遺伝子発現を制御す
る分子機構を研究するための機会を提供する。これらの
蛋白質の配列比較および突然変異分析は、すべてのクラ
スのステロイドホルモン受容体に共通した構造的特徴を
明らかにする(文献１２として発表した実験の部IIを参
照；また文献１３および１４を参照)。とりわけ、受容体
は高度に保存されたシステインに富む領域（今や、ＤＮ
Ａ−タウドメインと呼ばれる）を共通し、その領域はグ
ルココルチコイド受容体15 '16のＤＮＡ結合機能および
トランス活性化機能の両方に必要な情報をすべて含む。
受容体間の共通セグメントの存在は、関連遺伝子産物に
ついてゲノムを走査する可能性を与える。例えば、hＭ
Ｒ ｃＤＮＡはハイブリダイゼーションプローブとして
ｈＧＲを用いることにより分離された（文献５として発
表した実験の部IVを参照）。分子生理学が健康およびヒ
トの病気ならびにこれらの現象を支配する生理学の我々
の理解を促し得る１つの方法は、新しいホルモン応答系
の同定を通してである。この研究において、ヒトエスト
ロゲン受容体ｃＤＮＡの高度に保存されたＤＮＡ−タウ
領域をハイブリダイゼーションプローブとして使用する
ことにより、我々はステロイドホルモン受容体の構造的
特徴をポリペプチドをコードする２つのｃＤＮＡクロー
ンを単離した。
ドロゲン、グルココルチコイドおよびミネラロコルチコ
イドを含む５つの主なグループに類別される多種類のス
テロイドを産生する。生殖腺ステロイドは生殖系の分化
および成長をコントロールし、性的特徴を誘導・維持
し、そして生殖行動を調節する。同様に、副腎ステロイ
ドは代謝調節剤としての重要な役割のほかに分化にも影
響を与える。この広範囲の生理学的作用にもかかわら
ず、各ステロイドの効果は主としてそれが結合する特定
の同族受容体に基づいており、従ってステロイドホルモ
ン作用はそれらの生理活性を媒介する受容体に従ってよ
り正確に分類できるかも知れない。ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）cＤＮＡ（実験の部Ｉを参照され
たい、これは文献１として発表した）、すぐその後に実
施されたエストロゲン2'3（ｈＥＲ）、プロゲステロン4
（hＰＲ）およびミネラロコルチコイド受容体（hＭＲ)
をコードするcＤＮＡ（実験の部IVを参照、これは文献
５として発表）、ならびにいろいろな種6-11からの相同
体の上首尾のクローニング、塩基配列決定および発現は
受容体の構造およびこれらの分子が遺伝子発現を制御す
る分子機構を研究するための機会を提供する。これらの
蛋白質の配列比較および突然変異分析は、すべてのクラ
スのステロイドホルモン受容体に共通した構造的特徴を
明らかにする(文献１２として発表した実験の部IIを参
照；また文献１３および１４を参照)。とりわけ、受容体
は高度に保存されたシステインに富む領域（今や、ＤＮ
Ａ−タウドメインと呼ばれる）を共通し、その領域はグ
ルココルチコイド受容体15 '16のＤＮＡ結合機能および
トランス活性化機能の両方に必要な情報をすべて含む。
受容体間の共通セグメントの存在は、関連遺伝子産物に
ついてゲノムを走査する可能性を与える。例えば、hＭ
Ｒ ｃＤＮＡはハイブリダイゼーションプローブとして
ｈＧＲを用いることにより分離された（文献５として発
表した実験の部IVを参照）。分子生理学が健康およびヒ
トの病気ならびにこれらの現象を支配する生理学の我々
の理解を促し得る１つの方法は、新しいホルモン応答系
の同定を通してである。この研究において、ヒトエスト
ロゲン受容体ｃＤＮＡの高度に保存されたＤＮＡ−タウ
領域をハイブリダイゼーションプローブとして使用する
ことにより、我々はステロイドホルモン受容体の構造的
特徴をポリペプチドをコードする２つのｃＤＮＡクロー
ンを単離した。
【０２３１】V．Ｂ．受容体ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡクロ
ーン 認定されていないホルモン応答系を検索する１つの方法
は、低下したストリンジェントハイブリダイゼーション
を系統的に利用して、新規なホルモン受容体について組
換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることであ
る。エストロゲン受容体のＤＮＡ−タウセグメントがこ
れらの研究を開始するために用いられた。ラムダgt１０
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーの分析により、３×１０
5組換えファージ当たり１個のクローンの頻度で３個の
陽性クローンが同定された。ヌクレオチド配列分析は、
これらのクローンのうち２個が実際にエストロゲン受容
体をコードしており、３番目のクローン（２.０キロ塩
基に及び、ラムダ hＴ１６と命名した）が部分的な配列
相同を示すことを明らかにした。その後、このクローン
を使用してヒト胎児腎臓および成人心臓ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングし、それにより３個の追加クロ
ーンを同定した。腎臓ライブラリーからの２個のクロー
ン（ラムダ hＫＥ４およびラムダ hＫＡ１）はラムダ h
Ｔ１６と同じ遺伝子産物を表すが、心臓クローン（ラム
ダ hＨ３）は部分的に関連しているにすぎない。同一配
列を共有する３つのｃＤＮＡの複合配列（ここではｈＥ
ＲＲ１と呼ぶ）を第３４および３５図に示す。約１５０
〜２００ヌクレオチド17のポリ(Ａ)尾部を仮定すると、
この配列（約2430nt）はほぼ全長であるにちがいない。
ラムダ hＫＡ１からのｃＤＮＡ挿入物はヌクレオチド１
７９から2430までを含み、一方ラムダ hＫＥ４はまれな
メッセンジャーＲＮＡのスプライシングエラー（splici
ng error）を示し、エクソン２の欠失およびイントロン
配列の挿入を有する。ラムダ hＫＥ４によって示唆され
たエクソン／イントロン境界は、この遺伝子をコードす
るゲノムフラグメントをクローニングして部分的に塩基
配列を決定することにより確かめた（データは示さ
ず）。最初のＡＴＧをとりまく配列は、翻訳開始部位に
ついてＫozak18によって開示されたコンセンサス配列と
一致する。Ｍr 57300のポリペプチドを予告する５２１
個のアミノ酸のオープン・リーディング・フレームは、
７７５ヌクレオチドの３’非翻訳領域と接している。
ーン 認定されていないホルモン応答系を検索する１つの方法
は、低下したストリンジェントハイブリダイゼーション
を系統的に利用して、新規なホルモン受容体について組
換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることであ
る。エストロゲン受容体のＤＮＡ−タウセグメントがこ
れらの研究を開始するために用いられた。ラムダgt１０
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーの分析により、３×１０
5組換えファージ当たり１個のクローンの頻度で３個の
陽性クローンが同定された。ヌクレオチド配列分析は、
これらのクローンのうち２個が実際にエストロゲン受容
体をコードしており、３番目のクローン（２.０キロ塩
基に及び、ラムダ hＴ１６と命名した）が部分的な配列
相同を示すことを明らかにした。その後、このクローン
を使用してヒト胎児腎臓および成人心臓ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングし、それにより３個の追加クロ
ーンを同定した。腎臓ライブラリーからの２個のクロー
ン（ラムダ hＫＥ４およびラムダ hＫＡ１）はラムダ h
Ｔ１６と同じ遺伝子産物を表すが、心臓クローン（ラム
ダ hＨ３）は部分的に関連しているにすぎない。同一配
列を共有する３つのｃＤＮＡの複合配列（ここではｈＥ
ＲＲ１と呼ぶ）を第３４および３５図に示す。約１５０
〜２００ヌクレオチド17のポリ(Ａ)尾部を仮定すると、
この配列（約2430nt）はほぼ全長であるにちがいない。
ラムダ hＫＡ１からのｃＤＮＡ挿入物はヌクレオチド１
７９から2430までを含み、一方ラムダ hＫＥ４はまれな
メッセンジャーＲＮＡのスプライシングエラー（splici
ng error）を示し、エクソン２の欠失およびイントロン
配列の挿入を有する。ラムダ hＫＥ４によって示唆され
たエクソン／イントロン境界は、この遺伝子をコードす
るゲノムフラグメントをクローニングして部分的に塩基
配列を決定することにより確かめた（データは示さ
ず）。最初のＡＴＧをとりまく配列は、翻訳開始部位に
ついてＫozak18によって開示されたコンセンサス配列と
一致する。Ｍr 57300のポリペプチドを予告する５２１
個のアミノ酸のオープン・リーディング・フレームは、
７７５ヌクレオチドの３’非翻訳領域と接している。
【０２３２】V．Ｃ．受容体ｈＥＲＲ２のcＤＮＡクロー
ン クローンラムダhＨ３の特性決定により、それはｈＥＲ
Ｒ１と高度に関連した唯一のポリペプチドをコードする
ことが分かった。第３７および３８図は、ラムダ hＨ３
の2153ヌクレオチド配列およびその蛋白質産物（ｈＥＲ
Ｒ２と呼ぶ）の一次構造を示す。その翻訳開始部位はヌ
クレオチド100−102 に一致するメチオニンコドンに指
定された。その理由は、これが読み枠内（in−frame）
ターミネーターＴＧＡ（ヌクレオチド３１−３３）から
下流に現れる最初のＡＴＧトリプレットであるからであ
る。４３３個のアミノ酸を含むオープン・リーディング
・フレームはＭr 47600のポリペプチドをコードし、７
５２ヌクレオチドの３’非翻訳領域が後に続く。
ン クローンラムダhＨ３の特性決定により、それはｈＥＲ
Ｒ１と高度に関連した唯一のポリペプチドをコードする
ことが分かった。第３７および３８図は、ラムダ hＨ３
の2153ヌクレオチド配列およびその蛋白質産物（ｈＥＲ
Ｒ２と呼ぶ）の一次構造を示す。その翻訳開始部位はヌ
クレオチド100−102 に一致するメチオニンコドンに指
定された。その理由は、これが読み枠内（in−frame）
ターミネーターＴＧＡ（ヌクレオチド３１−３３）から
下流に現れる最初のＡＴＧトリプレットであるからであ
る。４３３個のアミノ酸を含むオープン・リーディング
・フレームはＭr 47600のポリペプチドをコードし、７
５２ヌクレオチドの３’非翻訳領域が後に続く。
【０２３３】V．Ｄ．ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２の特
性決定 先に述べたように、ステロイドホルモン受容体は配列分
析により同定しうる別個の機能的ドメインから構成され
る。14推定されたｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２ポリペプ
チドはステロイド受容体の予測されたドメイン特徴を含
む。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との間のアミノ酸比較は、
これらの２種の蛋白質が分岐(divergent)アミノ末端を
有し、この領域内では他のクラスの受容体との相同性が
全く検出されないことを示す（データは示さず）。この
発見はこの領域の配列が高度に変化しうることを示した
先の比較研究（実験の部IVを参照；また文献５，８，１
０，１４を参照）と一致している。ｈＥＲＲ１，ｈＥＲ
Ｒ２，ｈＥＲおよびｈＧＲの整列（第３９図）により、
これらの蛋白質の間には最高の相同度がｈＥＲＲ１のア
ミノ酸１７５から２４０までの６６個のアミノ酸のシス
テインに富む領域〔ステロイドホルモン受容体のＤＮＡ
−タウドメイン（実験の部IIおよび文献１５を参照）に
相当する〕に見られる。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との比
較においては９１％のアミノ酸同一性が存在し、ｈＥＲ
との比較では６８％、そしてｈＧＲとの比較では５６％
の同一性が存在する。９個のシステイン残基の位置は厳
格に保存されているが、ｈＥＲＲ１の２０６位およびｈ
ＥＲＲ２の１３４位におけるヒスチジン残基の不在は前
述のステロイドホルモン受容体と大きく相違するところ
である。このヒスチジン残基は元来保存性システイン残
基と共にＤＮＡ結合フィンガーの形成に関与すると考え
られていた。リガンド結合トランス活性化因子スーパー
ファミリーの他の一員であるビタミンＤ受容体19の対応
するアミノ酸配列にもこのヒスチジン残基の存在しない
ことが最近になって分かり、このことはＺn2+原子がこ
れらの蛋白質に存在する提案されたＤＮＡ結合フィンガ
ーの形成を調整するために、排他的にシステイン残基と
相互作用することを示唆している。ｈＥＲＲ１のアミノ
酸２９５と５２１の間に位置づけられる推定上のステロ
イド結合ドメインは、ｈＥＲＲ２と比較したとき６３％
の同一性を示し、ｈＥＲとは３６％、そしてｈＧＲとは
２８％の同一性を示す。
性決定 先に述べたように、ステロイドホルモン受容体は配列分
析により同定しうる別個の機能的ドメインから構成され
る。14推定されたｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２ポリペプ
チドはステロイド受容体の予測されたドメイン特徴を含
む。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との間のアミノ酸比較は、
これらの２種の蛋白質が分岐(divergent)アミノ末端を
有し、この領域内では他のクラスの受容体との相同性が
全く検出されないことを示す（データは示さず）。この
発見はこの領域の配列が高度に変化しうることを示した
先の比較研究（実験の部IVを参照；また文献５，８，１
０，１４を参照）と一致している。ｈＥＲＲ１，ｈＥＲ
Ｒ２，ｈＥＲおよびｈＧＲの整列（第３９図）により、
これらの蛋白質の間には最高の相同度がｈＥＲＲ１のア
ミノ酸１７５から２４０までの６６個のアミノ酸のシス
テインに富む領域〔ステロイドホルモン受容体のＤＮＡ
−タウドメイン（実験の部IIおよび文献１５を参照）に
相当する〕に見られる。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との比
較においては９１％のアミノ酸同一性が存在し、ｈＥＲ
との比較では６８％、そしてｈＧＲとの比較では５６％
の同一性が存在する。９個のシステイン残基の位置は厳
格に保存されているが、ｈＥＲＲ１の２０６位およびｈ
ＥＲＲ２の１３４位におけるヒスチジン残基の不在は前
述のステロイドホルモン受容体と大きく相違するところ
である。このヒスチジン残基は元来保存性システイン残
基と共にＤＮＡ結合フィンガーの形成に関与すると考え
られていた。リガンド結合トランス活性化因子スーパー
ファミリーの他の一員であるビタミンＤ受容体19の対応
するアミノ酸配列にもこのヒスチジン残基の存在しない
ことが最近になって分かり、このことはＺn2+原子がこ
れらの蛋白質に存在する提案されたＤＮＡ結合フィンガ
ーの形成を調整するために、排他的にシステイン残基と
相互作用することを示唆している。ｈＥＲＲ１のアミノ
酸２９５と５２１の間に位置づけられる推定上のステロ
イド結合ドメインは、ｈＥＲＲ２と比較したとき６３％
の同一性を示し、ｈＥＲとは３６％、そしてｈＧＲとは
２８％の同一性を示す。
【０２３４】Ｖ．Ｅ．ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２のｍ
ＲＮＡの組織分布 ステロイド受容体はそれらの一次生理作用に直接関係す
る特徴的な組織特異的パターンで発現される。恐らく、
これらの推定受容体の分布はそれらの隠された本性に手
ががかりを与えるであろう。従って、多種類のラットお
よびヒト組織から分離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド
−アガロースゲル電気泳動で分画化し、ニトロセルロー
スフィルターへ移行させた。プローブとしてラムダ hＫ
Ａ１を用いることにより、ｈＥＲＲ１をコードする２.
６kbｍＲＮＡが検査したすべてのラットおよびヒト組織
に検出された。その際、驚いたことに、小脳および海馬
では高レベルで、そして肝臓、肺、精嚢および脾臓では
最低レベルで検出された（第４０（Ａ）図）。こうし
て、ｈＥＲＲ１遺伝子は広く豊富に発現されるが、ラッ
ト中枢神経系により一層高いレベルで存在すると思われ
る。ｈＥＲＲ１ｍＲＮＡ発現パターンとは対照的に、ｈ
ＥＲＲ２蛋白質をコードするｍＲＮＡの分布は、極めて
低レベルのｍＲＮＡが検出される少数の特定組織に限ら
れる（第４０（Ｂ）図）。クローンラムダ hＨ３から誘
導されたプローブを用いて、４.８kbｍＲＮＡが腎臓、
心臓、精巣、視床下部、海馬、小脳およびラット前立腺
から検出された。しかしながら、ヒト胎盤または前立腺
ではハイブダイゼーションが全く検出されなかった。露
出時間の差異および生成する信号強度を考慮すると、ｈ
ＥＲＲ２ｍＲＮＡのレベルはｈＥＲＲ１のそれよりも約
１０〜１００倍低下する。
ＲＮＡの組織分布 ステロイド受容体はそれらの一次生理作用に直接関係す
る特徴的な組織特異的パターンで発現される。恐らく、
これらの推定受容体の分布はそれらの隠された本性に手
ががかりを与えるであろう。従って、多種類のラットお
よびヒト組織から分離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド
−アガロースゲル電気泳動で分画化し、ニトロセルロー
スフィルターへ移行させた。プローブとしてラムダ hＫ
Ａ１を用いることにより、ｈＥＲＲ１をコードする２.
６kbｍＲＮＡが検査したすべてのラットおよびヒト組織
に検出された。その際、驚いたことに、小脳および海馬
では高レベルで、そして肝臓、肺、精嚢および脾臓では
最低レベルで検出された（第４０（Ａ）図）。こうし
て、ｈＥＲＲ１遺伝子は広く豊富に発現されるが、ラッ
ト中枢神経系により一層高いレベルで存在すると思われ
る。ｈＥＲＲ１ｍＲＮＡ発現パターンとは対照的に、ｈ
ＥＲＲ２蛋白質をコードするｍＲＮＡの分布は、極めて
低レベルのｍＲＮＡが検出される少数の特定組織に限ら
れる（第４０（Ｂ）図）。クローンラムダ hＨ３から誘
導されたプローブを用いて、４.８kbｍＲＮＡが腎臓、
心臓、精巣、視床下部、海馬、小脳およびラット前立腺
から検出された。しかしながら、ヒト胎盤または前立腺
ではハイブダイゼーションが全く検出されなかった。露
出時間の差異および生成する信号強度を考慮すると、ｈ
ＥＲＲ２ｍＲＮＡのレベルはｈＥＲＲ１のそれよりも約
１０〜１００倍低下する。
【０２３５】Ｖ．Ｆ．ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との相同
性 従来の研究は、ステロイドホルモン受容体間のリガンド
結合ドメインの相同度がそれらのリガンドの構造的関連
性を反映すると指摘している。例えば、リガンド結合ド
メインが５６％の同一性を示すｈＧＲ、hＭＲおよびhＰ
Ｒ（実験の部IVを参照）は関連ホルモンと親密に結合す
る。実際、hＭＲはアルドステロンに等しい親和性でも
ってグルココルチコイドと結合し、また比較的高い親和
性でプロゲステロンと結合する（実験の部IVを参照）。
ｈＥＲＲ遺伝子産物の場合には、アミノ酸配列相同がｈ
ＥＲとの比較的遠い関係を示し、ＤＮＡ−タウ領域では
７０％およびステロイド結合領域では３６％の同一性を
示す（第４１図）。これらの相同レベルはｈＧＲ、ｈＭ
Ｒおよび hＰＲの間に観察されたものよりも低く、従っ
て推定上のｈＥＲＲ蛋白質はエストロゲンとは異なるク
ラスのステロイドホルモンと相互作用することが推測さ
れる。しかしながら、ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との相同
性は、それらが単一のまたは２つの密接に関連したステ
ロイド中間代謝物の受容体であることを示唆している。
ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２コード配列から作製したキ
ャップ構造をもつＳＰ６ＲＮＡの in vitro 翻訳産物ま
たはＣＯＳ−１細胞による２つのｃＤＮＡの発現産物を
使用する予備ステロイド結合実験（実験の部IVおよびII
を参照）はエストロゲンおよびアンドロゲンを含む主要
クラスのステロイドとの結合を証明できなかった。
性 従来の研究は、ステロイドホルモン受容体間のリガンド
結合ドメインの相同度がそれらのリガンドの構造的関連
性を反映すると指摘している。例えば、リガンド結合ド
メインが５６％の同一性を示すｈＧＲ、hＭＲおよびhＰ
Ｒ（実験の部IVを参照）は関連ホルモンと親密に結合す
る。実際、hＭＲはアルドステロンに等しい親和性でも
ってグルココルチコイドと結合し、また比較的高い親和
性でプロゲステロンと結合する（実験の部IVを参照）。
ｈＥＲＲ遺伝子産物の場合には、アミノ酸配列相同がｈ
ＥＲとの比較的遠い関係を示し、ＤＮＡ−タウ領域では
７０％およびステロイド結合領域では３６％の同一性を
示す（第４１図）。これらの相同レベルはｈＧＲ、ｈＭ
Ｒおよび hＰＲの間に観察されたものよりも低く、従っ
て推定上のｈＥＲＲ蛋白質はエストロゲンとは異なるク
ラスのステロイドホルモンと相互作用することが推測さ
れる。しかしながら、ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との相同
性は、それらが単一のまたは２つの密接に関連したステ
ロイド中間代謝物の受容体であることを示唆している。
ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２コード配列から作製したキ
ャップ構造をもつＳＰ６ＲＮＡの in vitro 翻訳産物ま
たはＣＯＳ−１細胞による２つのｃＤＮＡの発現産物を
使用する予備ステロイド結合実験（実験の部IVおよびII
を参照）はエストロゲンおよびアンドロゲンを含む主要
クラスのステロイドとの結合を証明できなかった。
【０２３６】Ｖ．Ｇ．結論 ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２ｍＲＮＡ発現の組織分布
は、それぞれの推定上の受容体が別々の生物学的機能を
コントロールするであろうことを示唆する。これらのス
テロイドホルモン受容体の機能は何故見落されたのであ
ろうか。多分、それらの活性の多くは非定形の作用とし
て分類される差異をもつ他の受容体に誤って属するとみ
なされたのであろう。神経細胞ステロイド20'21の最近
の同定は、脳内でパラクリン作用をもつと思われる新し
いステロイドホルモンの証拠を提供する。このような系
は従来の生理学的検出を容易に免れた。従って、２種類
の新規なステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡの単離は、
新しいホルモン応答系の同定へ向けて第一歩を踏み出す
ことになろう。
は、それぞれの推定上の受容体が別々の生物学的機能を
コントロールするであろうことを示唆する。これらのス
テロイドホルモン受容体の機能は何故見落されたのであ
ろうか。多分、それらの活性の多くは非定形の作用とし
て分類される差異をもつ他の受容体に誤って属するとみ
なされたのであろう。神経細胞ステロイド20'21の最近
の同定は、脳内でパラクリン作用をもつと思われる新し
いステロイドホルモンの証拠を提供する。このような系
は従来の生理学的検出を容易に免れた。従って、２種類
の新規なステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡの単離は、
新しいホルモン応答系の同定へ向けて第一歩を踏み出す
ことになろう。
【０２３７】V．Ｈ．実験のVに関する図面の詳細な説明 第３３−３５図 ｈＥＲＲ１の制限地図(３３)およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（３４−３５）。３３．ｈＥＲＲ１の
複合ｃＤＮＡを上段に表し、非コード配列（細線）およ
びコード配列（斜線部分）を示す。通常の６−ヌクレオ
チド制限酵素部位は線状地図の上に記す。配列決定に使
用した重複するｃＤＮＡ挿入物を示す。ラムダhＫＥ４
の５’末端付近の波線は分岐配列を示す。３４−３５．
ロング・オープン・リーディング・フレーム上に与えられ
た推定アミノ酸を伴う複合ｈＥＲＲｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列。
れたアミノ酸配列（３４−３５）。３３．ｈＥＲＲ１の
複合ｃＤＮＡを上段に表し、非コード配列（細線）およ
びコード配列（斜線部分）を示す。通常の６−ヌクレオ
チド制限酵素部位は線状地図の上に記す。配列決定に使
用した重複するｃＤＮＡ挿入物を示す。ラムダhＫＥ４
の５’末端付近の波線は分岐配列を示す。３４−３５．
ロング・オープン・リーディング・フレーム上に与えられ
た推定アミノ酸を伴う複合ｈＥＲＲｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列。
【０２３８】第３３−３５図の方法 クローン ラムダ hＴ１６はｈＥＲｃＤＮＡ（Ｖ．Ｇigu
ereおよびＲ.Ｍ.Evans，未発表データ）から誘導された
リンカー走査突然変異体12（linker−scanningmutant）
の pＥＲ９４５に由来するニックトランスレーション22
を行った４４６bp ＢgｌＩ−ＢamＨＩフラグメントを用
いて、ヒト精巣ラムダ gt１０ｃＤＮＡライブラリ−
（Ｃlonetech社）から分離された。ハイブリダイゼーシ
ョン混合物は３５％ホルムアミド、１×デンハート溶
液、５×ＳＳＰＥ、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)、１００μｇ／mｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０6
cpm／mｌの32Ｐ標識ＢｇｌＩ−ＢamＨＩフラグメント
（＞１０8cpm／μｇ）を含んでいた。２通りのニトロセ
ルロースフィルターを４２℃で１６時間ハイブリダイズ
させ、２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０m
Ｍ ＮaＣｌ、１５mＭクエン酸ナトリウム）を用いて５
５℃で２０分ずつ３回洗浄し、そして増感紙を使って−
７０℃でオートラジオグラフィーを行った。クローンラ
ムダ hＫＥ４およびラムダ hＫＡ１は、ラムダhＴ１６
由来のニックトランスレーションした挿入物を用いて、
ヒト腎臓ラムダgt１０ｃＤＮＡライブラリー23から分離
された。このスクリーニングのために、ハイブリダイゼ
ーション混合物は５０％ホルムアミドに変更し、洗浄条
件は６８℃で０.１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに変え
た。cＤＮＡクローンは多数の制限酵素で消化し、生成
したフラグメントをＭ１３塩基配列決定ベクターmp１８
およびmp１９に両方の向きでサブクローニングし、そし
てジデオキシ法24で塩基配列を決定した。ギャップやア
ンビギュイティは化学的切断法25により解明した。ＤＮ
Ａ配列は編集してＤevereuxら26およびＳtaden27のプロ
グラムにより分析した。
ereおよびＲ.Ｍ.Evans，未発表データ）から誘導された
リンカー走査突然変異体12（linker−scanningmutant）
の pＥＲ９４５に由来するニックトランスレーション22
を行った４４６bp ＢgｌＩ−ＢamＨＩフラグメントを用
いて、ヒト精巣ラムダ gt１０ｃＤＮＡライブラリ−
（Ｃlonetech社）から分離された。ハイブリダイゼーシ
ョン混合物は３５％ホルムアミド、１×デンハート溶
液、５×ＳＳＰＥ、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)、１００μｇ／mｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０6
cpm／mｌの32Ｐ標識ＢｇｌＩ−ＢamＨＩフラグメント
（＞１０8cpm／μｇ）を含んでいた。２通りのニトロセ
ルロースフィルターを４２℃で１６時間ハイブリダイズ
させ、２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０m
Ｍ ＮaＣｌ、１５mＭクエン酸ナトリウム）を用いて５
５℃で２０分ずつ３回洗浄し、そして増感紙を使って−
７０℃でオートラジオグラフィーを行った。クローンラ
ムダ hＫＥ４およびラムダ hＫＡ１は、ラムダhＴ１６
由来のニックトランスレーションした挿入物を用いて、
ヒト腎臓ラムダgt１０ｃＤＮＡライブラリー23から分離
された。このスクリーニングのために、ハイブリダイゼ
ーション混合物は５０％ホルムアミドに変更し、洗浄条
件は６８℃で０.１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに変え
た。cＤＮＡクローンは多数の制限酵素で消化し、生成
したフラグメントをＭ１３塩基配列決定ベクターmp１８
およびmp１９に両方の向きでサブクローニングし、そし
てジデオキシ法24で塩基配列を決定した。ギャップやア
ンビギュイティは化学的切断法25により解明した。ＤＮ
Ａ配列は編集してＤevereuxら26およびＳtaden27のプロ
グラムにより分析した。
【０２３９】第３６−３８図 ｈＥＲＲ２の制限地図(３６)およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（３７−３８）。３６．ｈＥＲＲ２ｃ
ＤＮＡの模式図；いくつかの通常の制限酵素部位を示
す。斜線ボックスは推定されたオープン・リーディング
・フレームを表す。３７−３８．ラムダhＨ３の完全な
ヌクレオチド配列を、ロング・オープン・リーディング
・フレーム上の推定アミノ酸配列と共に示す。５’非翻
訳領域におけるショート・オープン・リーディング・フ
レームは肉太の活字で示す。
れたアミノ酸配列（３７−３８）。３６．ｈＥＲＲ２ｃ
ＤＮＡの模式図；いくつかの通常の制限酵素部位を示
す。斜線ボックスは推定されたオープン・リーディング
・フレームを表す。３７−３８．ラムダhＨ３の完全な
ヌクレオチド配列を、ロング・オープン・リーディング
・フレーム上の推定アミノ酸配列と共に示す。５’非翻
訳領域におけるショート・オープン・リーディング・フ
レームは肉太の活字で示す。
【０２４０】第３６−３８図の方法 クローン ラムダｈＨ３は、ラムダｈＫＡ１の５’部分
を表すニックトランスレーションした７００bp ＥcoＲ
Ｉ−ＳmaＩフラグメントを用いて、ヒト心臓ラムダgt１
１ｃＤＮＡライブラリー(アルバート・アインシュタイ
ン医科大学のＬ．Ａ．Ｌeinwand 博士から寄贈）から分
離された。ハイブリダイゼーション、洗浄条件および塩
基配列決定の手法はヒト腎臓ライブラリーについて第３
３−３５図で説明した通りであった。
を表すニックトランスレーションした７００bp ＥcoＲ
Ｉ−ＳmaＩフラグメントを用いて、ヒト心臓ラムダgt１
１ｃＤＮＡライブラリー(アルバート・アインシュタイ
ン医科大学のＬ．Ａ．Ｌeinwand 博士から寄贈）から分
離された。ハイブリダイゼーション、洗浄条件および塩
基配列決定の手法はヒト腎臓ライブラリーについて第３
３−３５図で説明した通りであった。
【０２４１】第３９図 ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンおよびグル
ココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域間のアミノ
酸配列の比較。４種のアミノ酸配列はギャップ（ハイフ
ンで示す）を導入することにより最大相同性を得るよう
に整列させた。番号はｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２につ
いては第３４および３５図ならびに第３７および３８図
から、ｈＧＲについては第３，４図から、そしてｈＥＲ
についてはＧreenら2 から引用した。少なくとも３種の
ポリペプチドにおいて一致するアミノ酸残基はボックス
で囲った。ｈＥＲＲ１の残基２０６の上の星印は、ｈＥ
Ｒ配列中に存在するがｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２の両配列
中には存在しないヒスチジン残基の位置を示す。
ココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域間のアミノ
酸配列の比較。４種のアミノ酸配列はギャップ（ハイフ
ンで示す）を導入することにより最大相同性を得るよう
に整列させた。番号はｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２につ
いては第３４および３５図ならびに第３７および３８図
から、ｈＧＲについては第３，４図から、そしてｈＥＲ
についてはＧreenら2 から引用した。少なくとも３種の
ポリペプチドにおいて一致するアミノ酸残基はボックス
で囲った。ｈＥＲＲ１の残基２０６の上の星印は、ｈＥ
Ｒ配列中に存在するがｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２の両配列
中には存在しないヒスチジン残基の位置を示す。
【０２４２】第４０（Ａ）および（Ｂ）図 ラットおよびヒト組織におけるｈＥＲＲ１(Ａ)およびｈ
ＥＲＲ２(Ｂ)ｍＲＮＡのノザン・ブロット・ハイブリダ
イゼーション。
ＥＲＲ２(Ｂ)ｍＲＮＡのノザン・ブロット・ハイブリダ
イゼーション。
【０２４３】第４０（Ａ）および（Ｂ）図の方法 全ＲＮＡはグアニジンチオシアネート28を用いて種々の
組織から分離し、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲ
ル上で分画化し、ニトロセルロースへ移行させ、そして
ストリンジェント条件下でラムダ hＫＡ１由来のニック
トランスレーションしたＥcoＲＩ−ＳmaＩフラグメント
（ａ）およびラムダ hＨ３由来のニックトランスレーシ
ョンした1192 bp ＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメント
（ｂ）を用いてハイブリダイズさせた。すべてのレーン
において２０μｇの全ＲＮＡを使用した。リボソームＲ
ＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動をサイズマーカーと
して示す。ニトロセルロースフィルターは増感紙を使っ
て−７０℃で２４時間(ａ)および６日間（ｂ）オートラ
ジオグラフィーにかけた。（ａ）におけるｍＲＮＡの泳
動速度の明らかな差はゲルからのアーチファクト（arti
fact）である。
組織から分離し、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲ
ル上で分画化し、ニトロセルロースへ移行させ、そして
ストリンジェント条件下でラムダ hＫＡ１由来のニック
トランスレーションしたＥcoＲＩ−ＳmaＩフラグメント
（ａ）およびラムダ hＨ３由来のニックトランスレーシ
ョンした1192 bp ＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメント
（ｂ）を用いてハイブリダイズさせた。すべてのレーン
において２０μｇの全ＲＮＡを使用した。リボソームＲ
ＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動をサイズマーカーと
して示す。ニトロセルロースフィルターは増感紙を使っ
て−７０℃で２４時間(ａ)および６日間（ｂ）オートラ
ジオグラフィーにかけた。（ａ）におけるｍＲＮＡの泳
動速度の明らかな差はゲルからのアーチファクト（arti
fact）である。
【０２４４】第４１図 ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２、ｈＥＲ、ｈＧＲおよびヒ
ト甲状腺ホルモン受容体(hＴ3Ｒベータ）間の模式図に
よるアミノ酸比較。アミノ酸配列はステロイドおよび甲
状腺ホルモン受容体スーパーファミリー4の機能的ドメ
イン構造に従って模式図により整列させた。それぞれの
受容体とｈＥＲＲ１とのアミノ酸同一性のパーセンテー
ジは各ドメインの内側に示す。それぞれのドメイン境界
のアミノ酸位置を各受容体について示す。
ト甲状腺ホルモン受容体(hＴ3Ｒベータ）間の模式図に
よるアミノ酸比較。アミノ酸配列はステロイドおよび甲
状腺ホルモン受容体スーパーファミリー4の機能的ドメ
イン構造に従って模式図により整列させた。それぞれの
受容体とｈＥＲＲ１とのアミノ酸同一性のパーセンテー
ジは各ドメインの内側に示す。それぞれのドメイン境界
のアミノ酸位置を各受容体について示す。
【０２４５】Ｖ．Ｉ．実験の部Ｖで引用した文献 １．Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，et al.，Ｎature，318：635
−641（1985）。 ２．Ｇreen，Ｓ.，et al.，Ｎature，320：134−139（1
986）。 ３．Ｇreene ,Ｇ.Ｌ.，et al.，Ｓcience，231：1150−
1154（1986）。 ４．Ｍisrachim，Ｍ.，et al.，Ｂiochem．Ｂiophys．
Ｒes．Ｃomm.，143：740−748（1987）。 ５．Ａrriza，Ｊ.Ｌ.，et al.，Ｓcience，237：268−2
75（1987）。 ６．Ｍiesfeld，Ｒ.，et al.，Ｃell，46：389−399（1
986）。 ７．Ｄanielsen，Ｍ.,Ｎorthrop.,Ｊ.Ｐ.,and Ｒingol
d,Ｇ.Ｍ.，ＥＭＢＯ Ｊ.,5：2513-2522（1986）。 ８．Ｋrust，Ａ.，et al.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：891−897
（1986）。 ９．Ｍaxwell，Ｂ.Ｌ.，et al.，Ｍol．Ｅndocrinol.，
1：25−35（1987）。 10. Ｌoosfelt，Ｈ.,et al.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Sc
i．ＵＳＡ，83：9045−9049（1986）。 11. Ｗeiler，Ｉ.Ｊ.,Ｌew，Ｄ.,and Ｓhapiro，Ｄ.
Ｊ.,Ｊ.Ｍol.Ｅndocrinol.,1：355−362（1987）。 12. Ｇiguere，Ｖ.,Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld，
Ｇ．Ｍ.,and Ｅvans，Ｒ．Ｍ.,Ｃell，46：645−652（1
986）。 13. Ｋumar，Ｖ.,Ｇreen,Ｓ.,Ｓtaub,Ａ.,and Ｃhambo
n．Ｐ.,ＥＭＢＯ Ｊ.,5：2231−2236（1986）。 14. Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｓcience，(in press）。 15. Ｈollenberg,Ｓ.Ｍ.,Ｇiguere,Ｖ.,Ｓegui,Ｐ.,and
Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｃelｌ，49：39−46（1987）。 16. Ｍiesfeld，Ｒ.,Ｇodowski，Ｐ.Ｊ.,Ｍaler,Ｂ.
Ａ.,and Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，Ｓcience，236：423−427
（1987）。 17. Ｓawiki，Ｓ.Ｇ.,Ｊelinek，Ｗ.,and Ｄarnell，
Ｊ,Ｅ.,Ｊ.Ｍol.Ｂiol.,113：219−235（1977）。 18. Kozak，Ｍ.,Ｎature，308：241−246（1984）。 19. ＭcＤonnell，Ｄ.Ｐ.,et al.,Ｓcience，235：1214
−1217（1987）。 20. Ｌe Ｇoascogne，Ｃ.,et al.,Ｓcience，237：1212
−1215（1987）。 21. Ｈu，Ｚ.Ｙ.,Ｂourreau，Ｅ.,Ｒobel，Ｐ.,and Ｂa
ulieu，Ｅ．Ｅ.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，
(in press)。 22. Ｒigby，Ｐ.Ｗ.Ｊ.，Ｄieckmann，Ｍ.,Ｒhodes，
Ｃ., and Ｂerg，Ｐ.Ｊ.,Ｊ．Ｍol．Ｂiol.,113：237−
251（1977）。 23. Ｂell，Ｇ．Ｉ.,et al.,Ｎucleic Ａcid Ｒes.,1
4：8427−8446（1986）。 24. Ｓanger，Ｆ.,Ｎicklen，Ｓ.,and，Ｃoulson，Ａ．
Ｒ.,Ｐroc．Ａcad．Ｓci .ＵＳＡ，74：5463−5467（197
7）。 25. Ｍaxam，Ａ.,and Ｇilbert，Ｗ.,Ｐroc．Ｎatl.Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ，74：560−564（1977）。 26. Ｄevereux,Ｊ.,Ｈaeberli,Ｐ.,and Ｓmithies,Ｏ.,
Ｎucleic Ａcid Ｒes.,12：387−395（1984）。 27. Ｓtaden，Ｒ.,Ｎucleic Ａcid Ｒes.,10：2951−29
61（1982）。 28. Ｃhirgwin，Ｊ.Ｍ.,Ｐrzybyla，Ａ．Ｆ.,ＭcＤonal
d，Ｒ.Ｊ.,and Ｒutter．Ｗ．Ｆ.,Ｂiochemistry，18：
5294−5299（1980）。
−641（1985）。 ２．Ｇreen，Ｓ.，et al.，Ｎature，320：134−139（1
986）。 ３．Ｇreene ,Ｇ.Ｌ.，et al.，Ｓcience，231：1150−
1154（1986）。 ４．Ｍisrachim，Ｍ.，et al.，Ｂiochem．Ｂiophys．
Ｒes．Ｃomm.，143：740−748（1987）。 ５．Ａrriza，Ｊ.Ｌ.，et al.，Ｓcience，237：268−2
75（1987）。 ６．Ｍiesfeld，Ｒ.，et al.，Ｃell，46：389−399（1
986）。 ７．Ｄanielsen，Ｍ.,Ｎorthrop.,Ｊ.Ｐ.,and Ｒingol
d,Ｇ.Ｍ.，ＥＭＢＯ Ｊ.,5：2513-2522（1986）。 ８．Ｋrust，Ａ.，et al.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：891−897
（1986）。 ９．Ｍaxwell，Ｂ.Ｌ.，et al.，Ｍol．Ｅndocrinol.，
1：25−35（1987）。 10. Ｌoosfelt，Ｈ.,et al.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Sc
i．ＵＳＡ，83：9045−9049（1986）。 11. Ｗeiler，Ｉ.Ｊ.,Ｌew，Ｄ.,and Ｓhapiro，Ｄ.
Ｊ.,Ｊ.Ｍol.Ｅndocrinol.,1：355−362（1987）。 12. Ｇiguere，Ｖ.,Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.,Ｒosenfeld，
Ｇ．Ｍ.,and Ｅvans，Ｒ．Ｍ.,Ｃell，46：645−652（1
986）。 13. Ｋumar，Ｖ.,Ｇreen,Ｓ.,Ｓtaub,Ａ.,and Ｃhambo
n．Ｐ.,ＥＭＢＯ Ｊ.,5：2231−2236（1986）。 14. Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｓcience，(in press）。 15. Ｈollenberg,Ｓ.Ｍ.,Ｇiguere,Ｖ.,Ｓegui,Ｐ.,and
Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,Ｃelｌ，49：39−46（1987）。 16. Ｍiesfeld，Ｒ.,Ｇodowski，Ｐ.Ｊ.,Ｍaler,Ｂ.
Ａ.,and Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，Ｓcience，236：423−427
（1987）。 17. Ｓawiki，Ｓ.Ｇ.,Ｊelinek，Ｗ.,and Ｄarnell，
Ｊ,Ｅ.,Ｊ.Ｍol.Ｂiol.,113：219−235（1977）。 18. Kozak，Ｍ.,Ｎature，308：241−246（1984）。 19. ＭcＤonnell，Ｄ.Ｐ.,et al.,Ｓcience，235：1214
−1217（1987）。 20. Ｌe Ｇoascogne，Ｃ.,et al.,Ｓcience，237：1212
−1215（1987）。 21. Ｈu，Ｚ.Ｙ.,Ｂourreau，Ｅ.,Ｒobel，Ｐ.,and Ｂa
ulieu，Ｅ．Ｅ.,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，
(in press)。 22. Ｒigby，Ｐ.Ｗ.Ｊ.，Ｄieckmann，Ｍ.,Ｒhodes，
Ｃ., and Ｂerg，Ｐ.Ｊ.,Ｊ．Ｍol．Ｂiol.,113：237−
251（1977）。 23. Ｂell，Ｇ．Ｉ.,et al.,Ｎucleic Ａcid Ｒes.,1
4：8427−8446（1986）。 24. Ｓanger，Ｆ.,Ｎicklen，Ｓ.,and，Ｃoulson，Ａ．
Ｒ.,Ｐroc．Ａcad．Ｓci .ＵＳＡ，74：5463−5467（197
7）。 25. Ｍaxam，Ａ.,and Ｇilbert，Ｗ.,Ｐroc．Ｎatl.Ａc
ad．Ｓci．ＵＳＡ，74：560−564（1977）。 26. Ｄevereux,Ｊ.,Ｈaeberli,Ｐ.,and Ｓmithies,Ｏ.,
Ｎucleic Ａcid Ｒes.,12：387−395（1984）。 27. Ｓtaden，Ｒ.,Ｎucleic Ａcid Ｒes.,10：2951−29
61（1982）。 28. Ｃhirgwin，Ｊ.Ｍ.,Ｐrzybyla，Ａ．Ｆ.,ＭcＤonal
d，Ｒ.Ｊ.,and Ｒutter．Ｗ．Ｆ.,Ｂiochemistry，18：
5294−5299（1980）。
【０２４６】実験の部VI ラット成長ホルモン遺伝子のc−erb−Ａ結合部位は甲状
腺ホルモンによるトランス作用を仲介するVI．Ａ．序論 １．３．３−トリヨードチロニン（Ｔ3）物質はラット
下垂体腫瘍細胞1-4において成長ホルモン遺伝子転写を
刺激する。この刺激は、その転写開始部位の５’側の調
節因子に核Ｔ3受容体が結合することにより仲介される
と考えられる。5-8甲状腺ホルモンが遺伝子転写を活性
化するメカニズムの理解は、核Ｔ3受容体が豊富に存在
しないためにそれらを精製するのが困難であること、お
よびＴ3調節に作用するＴ3受容体−ＤＮＡ結合部位が明
確でないことにより制限されている。最近、ヒトおよび
トリc−erb−Ａ遺伝子産物は、高親和性でもって甲状腺
ホルモンと結合し（文献１０として発表した実験の部II
Iを参照）、甲状腺ホルモン受容体の分子量および核結
合特性をもつことが見出された。目下の研究において、
我々はラット成長ホルモン遺伝子の転写開始部位の５’
側の１６４塩基対に位置する配列５’ＣＡＧＧＧＡＣＧ
ＴＧＡＣＣＧＣＡ３’へのラット下垂体細胞Ｔ3受容体
の特異的高親和性結合を検出できるアビジン−ビオチン
複合ＤＮＡ結合検定の開発について説明する。この配列
を含むオリゴヌクレオチドは、トランスフェクションし
たラット下垂体ＧＣ２細胞においてＴ3調節を単純疱疹
ウイルスチミジンキナーゼプロモーターへ転移し、また
ヒト胎盤c−erb−Ａ遺伝子のin vitro 翻訳産物と特異
的に結合した。このデータは、ヒトc−erb−Ａ遺伝子が
Ｔ3の転写作用を仲介し、またＧＣ２細胞核抽出物がラ
ット成長ホルモン遺伝子Ｔ3応答因子への下垂体Ｔ3受容
体の結合を変更する別の因子を含むことを支持する証拠
を提供する。
腺ホルモンによるトランス作用を仲介するVI．Ａ．序論 １．３．３−トリヨードチロニン（Ｔ3）物質はラット
下垂体腫瘍細胞1-4において成長ホルモン遺伝子転写を
刺激する。この刺激は、その転写開始部位の５’側の調
節因子に核Ｔ3受容体が結合することにより仲介される
と考えられる。5-8甲状腺ホルモンが遺伝子転写を活性
化するメカニズムの理解は、核Ｔ3受容体が豊富に存在
しないためにそれらを精製するのが困難であること、お
よびＴ3調節に作用するＴ3受容体−ＤＮＡ結合部位が明
確でないことにより制限されている。最近、ヒトおよび
トリc−erb−Ａ遺伝子産物は、高親和性でもって甲状腺
ホルモンと結合し（文献１０として発表した実験の部II
Iを参照）、甲状腺ホルモン受容体の分子量および核結
合特性をもつことが見出された。目下の研究において、
我々はラット成長ホルモン遺伝子の転写開始部位の５’
側の１６４塩基対に位置する配列５’ＣＡＧＧＧＡＣＧ
ＴＧＡＣＣＧＣＡ３’へのラット下垂体細胞Ｔ3受容体
の特異的高親和性結合を検出できるアビジン−ビオチン
複合ＤＮＡ結合検定の開発について説明する。この配列
を含むオリゴヌクレオチドは、トランスフェクションし
たラット下垂体ＧＣ２細胞においてＴ3調節を単純疱疹
ウイルスチミジンキナーゼプロモーターへ転移し、また
ヒト胎盤c−erb−Ａ遺伝子のin vitro 翻訳産物と特異
的に結合した。このデータは、ヒトc−erb−Ａ遺伝子が
Ｔ3の転写作用を仲介し、またＧＣ２細胞核抽出物がラ
ット成長ホルモン遺伝子Ｔ3応答因子への下垂体Ｔ3受容
体の結合を変更する別の因子を含むことを支持する証拠
を提供する。
【０２４７】VI．Ｂ．Ｔ3調節に必要なラット成長ホル
モンＤＮＡ配列の特性決定 （a）ラットＧＨ遺伝子欠失検定 Ｔ3調節に必要な成長ホルモン（ＧＨ）５’側ゲノム配
列中のシス活性因子を同定するために、我々は細菌クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子へ融合し且つラット下垂体ＧＣ２細胞にトラ
ンスフェクションした、ラットＧＨ遺伝子の一連の５’
欠失フラグメントを使用した（第４２（Ａ）図）。−２
３５位から転写開始（ＣＡＰ）部位までの５’欠失物は
Ｔ3に対する調節を転移させ（４.６倍，第４２（Ａ）
図）、以前の研究5 ’6に一致して１.７キロ塩基（kb）
または３０７塩基対（bp）の５'側ラットＧＨ情報を含
む構築物に等しかった（データは示さず）。（ヌクレオ
チド位置はＣＡＰ部位に対して番号付けされており、負
の位置番号はそれに対して５’側であることを意味す
る。）２３５bpより少ない５’側ＧＨ情報を含む欠失物
は、Ｔ3の不在下でのＣＡＴ発現レベルが有意にバック
グラウンド以上でなかったので、Ｔ3誘導について検定
できなかった。この問題を解決するために、ラットプロ
ラクチンエンハンサー因子11を１８１bpおよび１１０bp
の５’側情報を含むラットＧＨ遺伝子フラグメントに近
接して融合させた。−１８１位まで延びる５’欠失フラ
グメントはＴ3によって２.６倍の誘導を与え、そしてＣ
ＡＰ部位から−１０７位までの別の欠失はＴ3調節を示
さなかった（第４２（Ａ）図）。
モンＤＮＡ配列の特性決定 （a）ラットＧＨ遺伝子欠失検定 Ｔ3調節に必要な成長ホルモン（ＧＨ）５’側ゲノム配
列中のシス活性因子を同定するために、我々は細菌クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子へ融合し且つラット下垂体ＧＣ２細胞にトラ
ンスフェクションした、ラットＧＨ遺伝子の一連の５’
欠失フラグメントを使用した（第４２（Ａ）図）。−２
３５位から転写開始（ＣＡＰ）部位までの５’欠失物は
Ｔ3に対する調節を転移させ（４.６倍，第４２（Ａ）
図）、以前の研究5 ’6に一致して１.７キロ塩基（kb）
または３０７塩基対（bp）の５'側ラットＧＨ情報を含
む構築物に等しかった（データは示さず）。（ヌクレオ
チド位置はＣＡＰ部位に対して番号付けされており、負
の位置番号はそれに対して５’側であることを意味す
る。）２３５bpより少ない５’側ＧＨ情報を含む欠失物
は、Ｔ3の不在下でのＣＡＴ発現レベルが有意にバック
グラウンド以上でなかったので、Ｔ3誘導について検定
できなかった。この問題を解決するために、ラットプロ
ラクチンエンハンサー因子11を１８１bpおよび１１０bp
の５’側情報を含むラットＧＨ遺伝子フラグメントに近
接して融合させた。−１８１位まで延びる５’欠失フラ
グメントはＴ3によって２.６倍の誘導を与え、そしてＣ
ＡＰ部位から−１０７位までの別の欠失はＴ3調節を示
さなかった（第４２（Ａ）図）。
【０２４８】（b）ＣＡＴ酵素検定 ３’欠失について検定するために、ラットＧＨ遺伝子の
フラグメントは単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｈ
ＳＶ tk）プロモーターに融合した。ＣＡＰ部位から−
２３５位ないし−４５位まで延びるＧＨ遺伝子フラグメ
ントは、天然のままの向きでおよび逆向きでtkプロモー
ターに融合したとき、それぞれ２.５倍および2.3倍のＣ
ＡＴ活性刺激をもたらした（第４２（Ｂ）図）。ＧＨ
ＣＡＰ部位から２３５位ないし１４５位まで延びる９０
bpクラブメントは，２３５−４５bpフラグメントよりも
一層効果的にＴ3調節を転移させ，このことはネガティ
ブＴ3調節因子がＣＡＰ部位から４５bpと１４５bpの間
に存在しうることを示唆している（第４２（Ａ）図）。
ＣＡＴメッセンジャーＲＮＡは，tkプロモーターを含む
プラスミドでトランスフェクションした細胞において観
察されたＣＡＴ活性のＴ3依存性刺激が適当に開始され
た転写物の増加によって起こるのかどうかを調べるため
に，プライマー伸長技術12を用いて分析した。tkプロモ
ーターに融合した２３５−４５bp ＧＨフラグメントト
はＴ3の存在下で正しく開始されたＣＡＴ mＲＮＡを約
４倍増加させ（第４２（Ｃ）図），これは観察されたＣ
ＡＴ活性の測定値と一致する結果であった。
フラグメントは単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｈ
ＳＶ tk）プロモーターに融合した。ＣＡＰ部位から−
２３５位ないし−４５位まで延びるＧＨ遺伝子フラグメ
ントは、天然のままの向きでおよび逆向きでtkプロモー
ターに融合したとき、それぞれ２.５倍および2.3倍のＣ
ＡＴ活性刺激をもたらした（第４２（Ｂ）図）。ＧＨ
ＣＡＰ部位から２３５位ないし１４５位まで延びる９０
bpクラブメントは，２３５−４５bpフラグメントよりも
一層効果的にＴ3調節を転移させ，このことはネガティ
ブＴ3調節因子がＣＡＰ部位から４５bpと１４５bpの間
に存在しうることを示唆している（第４２（Ａ）図）。
ＣＡＴメッセンジャーＲＮＡは，tkプロモーターを含む
プラスミドでトランスフェクションした細胞において観
察されたＣＡＴ活性のＴ3依存性刺激が適当に開始され
た転写物の増加によって起こるのかどうかを調べるため
に，プライマー伸長技術12を用いて分析した。tkプロモ
ーターに融合した２３５−４５bp ＧＨフラグメントト
はＴ3の存在下で正しく開始されたＣＡＴ mＲＮＡを約
４倍増加させ（第４２（Ｃ）図），これは観察されたＣ
ＡＴ活性の測定値と一致する結果であった。
【０２４９】（ｃ）アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合
検定（ＡＢＣＤ検定） Ｔ3調節に必要とされる配列をさらに明確に定めるため
に，成長ホルモンＴ3調節因子への核Ｔ3受容体の特異的
結合を証明する必要があった。ゲルシフトおよびフット
プリント検定によりＴ3受容体結合部位をマッピングす
る試みが初め不成功に終わったので，特異的結合を検出
する新しい検定法、アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合
（ＡＢＣＤ）検定法、が創案された。第４３（Ａ）図に
示すような、いろいろな位置にビオチン−１１−dＵＴ
Ｐを有する、Ｔ3調節に必要なＧＨ遺伝子の５’側領域
を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが作製された。初めに
−２０９位から−１４６位までの成長ホルモンゲノム配
列を含む７７bpオリゴヌクレオチド（Ｇ２０９−１４
６）を使用した。ＧＣ２核抽出物からのＴ3受容体は125
Ｉ−Ｔ3を用いて高い比活性へ標識し、そしてビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドとインキュベートした。蛋白質
−ＤＮＡ複合体は、その結合反応後に、アガロースビー
ズに結合したストレプトアビジンを用いて溶液から沈澱
させた。第４３（Ｂ）図から明らかなように，プローブ
Ｇ２０９−１４６は 6900cpmの125Ｉ−Ｔ3活性の沈澱を
生じさせた。これは約3.2フェムトモルのＴ3受容体の結
合を表し、結合反応混合物中に存在する全Ｔ3受容体の
約４０％を占める。125Ｉ−Ｔ3標識受容体の沈澱はプロ
ーブ依存性であった；沈澱した125Ｉ−Ｔ3の全放射能の
＜１５％がＧ２０９−１４６の不在下で回収された。１
００倍過剰モル量の未標識Ｔ3の添加は沈澱した125Ｉ−
Ｔ3をバックグラウンドレベルにまで低下させ（第４３
（Ｂ）図）、このことはプローブによって沈澱されるは
ずのＴ3結合蛋白質が制限された量で存在していたこと
を示している。Ｔ3受容体−ＤＮＡ複合体の平衡結合定
数は１.４×１０-9Ｍであると概算された（データは示
さず）。
検定（ＡＢＣＤ検定） Ｔ3調節に必要とされる配列をさらに明確に定めるため
に，成長ホルモンＴ3調節因子への核Ｔ3受容体の特異的
結合を証明する必要があった。ゲルシフトおよびフット
プリント検定によりＴ3受容体結合部位をマッピングす
る試みが初め不成功に終わったので，特異的結合を検出
する新しい検定法、アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合
（ＡＢＣＤ）検定法、が創案された。第４３（Ａ）図に
示すような、いろいろな位置にビオチン−１１−dＵＴ
Ｐを有する、Ｔ3調節に必要なＧＨ遺伝子の５’側領域
を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが作製された。初めに
−２０９位から−１４６位までの成長ホルモンゲノム配
列を含む７７bpオリゴヌクレオチド（Ｇ２０９−１４
６）を使用した。ＧＣ２核抽出物からのＴ3受容体は125
Ｉ−Ｔ3を用いて高い比活性へ標識し、そしてビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドとインキュベートした。蛋白質
−ＤＮＡ複合体は、その結合反応後に、アガロースビー
ズに結合したストレプトアビジンを用いて溶液から沈澱
させた。第４３（Ｂ）図から明らかなように，プローブ
Ｇ２０９−１４６は 6900cpmの125Ｉ−Ｔ3活性の沈澱を
生じさせた。これは約3.2フェムトモルのＴ3受容体の結
合を表し、結合反応混合物中に存在する全Ｔ3受容体の
約４０％を占める。125Ｉ−Ｔ3標識受容体の沈澱はプロ
ーブ依存性であった；沈澱した125Ｉ−Ｔ3の全放射能の
＜１５％がＧ２０９−１４６の不在下で回収された。１
００倍過剰モル量の未標識Ｔ3の添加は沈澱した125Ｉ−
Ｔ3をバックグラウンドレベルにまで低下させ（第４３
（Ｂ）図）、このことはプローブによって沈澱されるは
ずのＴ3結合蛋白質が制限された量で存在していたこと
を示している。Ｔ3受容体−ＤＮＡ複合体の平衡結合定
数は１.４×１０-9Ｍであると概算された（データは示
さず）。
【０２５０】Ｇ２０９−１４６による標識Ｔ3受容体の
沈澱が特定のラットＧＨ配列に依存するかどうかを調べ
るために、成長ホルモンエンハンサーとの明らかな配列
類似性をもたないがＧ２０９−１４６と同じ長さであり
且つ同じ数のビオチン−１１−dＵＴＰ残基を含む一連
のビオチニル化プローブを作製した。第４３（Ｂ）図に
示すように、ＧＣ２核抽出物への１００ fmoｌの各プロ
ーブの添加は測定しうる125Ｉ−Ｔ3の沈澱を与えなかっ
た。これはＧ２０９−１４６による125Ｉ−Ｔ3の沈澱が
このプローブに含まれるラットＧＨ配列に依存すること
を示している。
沈澱が特定のラットＧＨ配列に依存するかどうかを調べ
るために、成長ホルモンエンハンサーとの明らかな配列
類似性をもたないがＧ２０９−１４６と同じ長さであり
且つ同じ数のビオチン−１１−dＵＴＰ残基を含む一連
のビオチニル化プローブを作製した。第４３（Ｂ）図に
示すように、ＧＣ２核抽出物への１００ fmoｌの各プロ
ーブの添加は測定しうる125Ｉ−Ｔ3の沈澱を与えなかっ
た。これはＧ２０９−１４６による125Ｉ−Ｔ3の沈澱が
このプローブに含まれるラットＧＨ配列に依存すること
を示している。
【０２５１】（d）フットプリント分析 通常のフットプリント法を用いてＴ3受容体結合部位を
局在化するための初期の試みは成功しなかったが、ＡＢ
ＣＤ結合検定における緩衝条件の変化は、もしもＤＮＡ
結合のための塩およびpＨ条件が最適であるならば、粗
製核抽出物の場合にもフットプリントが達成しうること
を示唆した（データは示さず）。ＧＨエンハンサー末端
標識フラグメントはＧＣ２核抽出物とインキュベート
し、ＤＮアーゼＩで消化した。変性条件下での消化物の
ＰＡＧＥ分析（第４４図）は以前に記載された２つのフ
ットプリントを与え13’14；これらのうちの１つはヌク
レオチド−１７９と−１６４の間のアンチセンス鎖中の
１６bp保護領域により示される。センス鎖において５’
ＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３’に相当するこの
配列は、Ｔ3受容体と特異的に結合するオリゴヌクレオ
チドプローブ中に含まれ、以前に同定されたＴ3依存性
ＤＮアーゼＩ高感受性部位19の位置に対応する。センス
鎖それ自体中にはっきりしたフットプリントは検出され
なかったが、それは主としてこのＧに富む領域における
ＤＮアーゼＩによる不完全消化のためである。
局在化するための初期の試みは成功しなかったが、ＡＢ
ＣＤ結合検定における緩衝条件の変化は、もしもＤＮＡ
結合のための塩およびpＨ条件が最適であるならば、粗
製核抽出物の場合にもフットプリントが達成しうること
を示唆した（データは示さず）。ＧＨエンハンサー末端
標識フラグメントはＧＣ２核抽出物とインキュベート
し、ＤＮアーゼＩで消化した。変性条件下での消化物の
ＰＡＧＥ分析（第４４図）は以前に記載された２つのフ
ットプリントを与え13’14；これらのうちの１つはヌク
レオチド−１７９と−１６４の間のアンチセンス鎖中の
１６bp保護領域により示される。センス鎖において５’
ＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３’に相当するこの
配列は、Ｔ3受容体と特異的に結合するオリゴヌクレオ
チドプローブ中に含まれ、以前に同定されたＴ3依存性
ＤＮアーゼＩ高感受性部位19の位置に対応する。センス
鎖それ自体中にはっきりしたフットプリントは検出され
なかったが、それは主としてこのＧに富む領域における
ＤＮアーゼＩによる不完全消化のためである。
【０２５２】VI．Ｃ．Ｔ3オリゴヌクレオチドの機能性 ＧＨ遺伝子のＴ3調節におけるこの配列の機能を調べる
ために、特定部位の突然変異誘発を用いて野生型エンハ
ンサーから１１bpのフットプリントを欠失させた（突然
変異体Ｇデルタ１６６／１７７）。tkプロモーターに融
合した突然変異体Ｇデルタ１６６／１７７でトランスフ
ェクションした細胞へのＴ3の添加はＣＡＴの発現量に
何ら影響を及ぼさなかったが、野生型エンハンサーはＣ
ＡＴ発現を９倍刺激した（第４２（Ｂ）図）。従って、
オリゴヌクレオチドおよびＤＮアーゼＩ結合検定により
同定した推定上のＴ3受容体結合領域の除去は、tkプロ
モーターにＴ3調節を付与するＧＨエンハンサーの能力
を失わせた。
ために、特定部位の突然変異誘発を用いて野生型エンハ
ンサーから１１bpのフットプリントを欠失させた（突然
変異体Ｇデルタ１６６／１７７）。tkプロモーターに融
合した突然変異体Ｇデルタ１６６／１７７でトランスフ
ェクションした細胞へのＴ3の添加はＣＡＴの発現量に
何ら影響を及ぼさなかったが、野生型エンハンサーはＣ
ＡＴ発現を９倍刺激した（第４２（Ｂ）図）。従って、
オリゴヌクレオチドおよびＤＮアーゼＩ結合検定により
同定した推定上のＴ3受容体結合領域の除去は、tkプロ
モーターにＴ3調節を付与するＧＨエンハンサーの能力
を失わせた。
【０２５３】−１６４から−１７９位までの１６塩基対
が機能的なＴ3調節因子を構成することを証明するため
に、５’末端側および３’末端側にそれぞれ７塩基およ
び６塩基を付加したこの配列を含む二本鎖オリゴヌクレ
オチドが作製された。このオリゴヌクレオチドは、tkプ
ロモーターに近接して天然のままの向きで挿入した（構
築物Ｇ２９ＴＫ、第４２（Ｂ）図）。この構築物でトラ
ンスフェクションした細胞では、ＣＡＴ発現がＴ3によ
って２.９倍刺激された。この配列３つを直列に配置し
たもの（構築物Ｇ２９３ＴＫ）を挿入すると、Ｔ3によ
って５倍の刺激が生じた。
が機能的なＴ3調節因子を構成することを証明するため
に、５’末端側および３’末端側にそれぞれ７塩基およ
び６塩基を付加したこの配列を含む二本鎖オリゴヌクレ
オチドが作製された。このオリゴヌクレオチドは、tkプ
ロモーターに近接して天然のままの向きで挿入した（構
築物Ｇ２９ＴＫ、第４２（Ｂ）図）。この構築物でトラ
ンスフェクションした細胞では、ＣＡＴ発現がＴ3によ
って２.９倍刺激された。この配列３つを直列に配置し
たもの（構築物Ｇ２９３ＴＫ）を挿入すると、Ｔ3によ
って５倍の刺激が生じた。
【０２５４】tkプロモーターへのＴ3 調節の転移のため
に使用した短いオリゴヌクレオチド（Ｇ１８６−１５
８）もまた、Ｇ２０９−１４６中の核Ｔ3受容体結合部
位と特異的に結合したが、これはヌクレオチド位置−１
７７から−２３５までのラットＧＨ配列を含むオリゴヌ
クレオチド（測定可能な量のＴ3受容体と結合しなかっ
た）を用いることにより失われた（データは示さず）。
非ビオチニル化Ｇ２０９−１４６およびＧ１８６−１５
８はまたビオチニル化Ｇ２０９−１４６とＴ3受容体と
の結合を競合させるべく使用した；Ｇ２０９−１４６に
対するＴ3受容体の相対親和性はＧ１８６−１５８より
も２〜３倍高かった（データは示さず）。短い方のプロ
ーブに対する明らかな親和性の低下は、Ｔ3受容体結合
反応に直接関与する塩基の欠乏により生ずるのかも知れ
ない。このことは、ＤＮアーゼＩフットプリントの境界
がこのプローブの両末端内にあるので、ありそうもな
い。その他に考えられることとして、ＧＣ２核抽出物は
長いプローブへのＴ3受容体の結合を安定化させる他の
因子を含むのかも知れない。
に使用した短いオリゴヌクレオチド（Ｇ１８６−１５
８）もまた、Ｇ２０９−１４６中の核Ｔ3受容体結合部
位と特異的に結合したが、これはヌクレオチド位置−１
７７から−２３５までのラットＧＨ配列を含むオリゴヌ
クレオチド（測定可能な量のＴ3受容体と結合しなかっ
た）を用いることにより失われた（データは示さず）。
非ビオチニル化Ｇ２０９−１４６およびＧ１８６−１５
８はまたビオチニル化Ｇ２０９−１４６とＴ3受容体と
の結合を競合させるべく使用した；Ｇ２０９−１４６に
対するＴ3受容体の相対親和性はＧ１８６−１５８より
も２〜３倍高かった（データは示さず）。短い方のプロ
ーブに対する明らかな親和性の低下は、Ｔ3受容体結合
反応に直接関与する塩基の欠乏により生ずるのかも知れ
ない。このことは、ＤＮアーゼＩフットプリントの境界
がこのプローブの両末端内にあるので、ありそうもな
い。その他に考えられることとして、ＧＣ２核抽出物は
長いプローブへのＴ3受容体の結合を安定化させる他の
因子を含むのかも知れない。
【０２５５】VI．Ｄ．要約および結論 これらの実験は、ＣＡＰ部位に対して５’側の−１６４
位から−１７９位まで延びる１６bpフットプリントを含
む２９塩基対のＧＨ遺伝子がＴ3受容体と結合し、ラッ
トＧＨエンハンサーのＴ3調節にとって必要であり、ま
たＴ3調節を tkプロモーターへ転移できることを証明し
た。ヒトc−erb−Ａがこの因子と結合するかどうかを試
験するために、in vivo 翻訳産物を35Ｓ−メチオニンで
標識した（実験の部IIIを参照）。この産物はＳＤＳゲ
ル電気泳動上で相対分子量（Ｍr）48000(４８ｋ)および
５２Ｋのダブレットとして泳動し、そして５×１０+11の
hd値でＴ3と結合した。ヒトc−erb−Ａ in vitro翻訳産
物のラットＧＨ Ｔ3調節因子を含むＧ２０９−１４６お
よびＧ１８６−１５８オリゴヌクレオチドプローブへの
結合は第４５図に示す。長いプローブおよび短いプロー
ブは両方ともin vitro翻訳産物と有意に結合したが，Ｇ
Ｈ遺伝子のＴ3受容体結合部位に対して相同性を欠くプ
ローブ(例えばＰ−ＥＧＦ)は結合しなかった。in vitro
翻訳混合物中に存在する〔35Ｓ〕メチオニンの概算上の
比活性に基づいて，第４５図に示した結合活性は１〜２
fmoｌの erb−Ａ蛋白質に相当する。125Ｉ−Ｔ3受容体
を含むＧＣ２細胞核抽出物と相違して、c−erb−Ａ in
vitro翻訳産物は長いオリゴヌクレオチドと短いオリゴ
ヌクレオチドの両方に同程度に結合した。類似のデータ
が125Ｉ−Ｔ3で標識したヒトc−erb−Ａのin vitro翻訳
産物を用いて得られた（データは示さず）。これらの結
果は、c−erb−Ａ遺伝子産物がＧＣ２核抽出物からのＴ
3受容体によって結合される同じＴ3調節配列と特異的に
結合することを示している。それらは、c−erb−Ａ遺伝
子産物の機能がＴ3の転写作用を仲介することであると
いう更なる証拠を提供する。
位から−１７９位まで延びる１６bpフットプリントを含
む２９塩基対のＧＨ遺伝子がＴ3受容体と結合し、ラッ
トＧＨエンハンサーのＴ3調節にとって必要であり、ま
たＴ3調節を tkプロモーターへ転移できることを証明し
た。ヒトc−erb−Ａがこの因子と結合するかどうかを試
験するために、in vivo 翻訳産物を35Ｓ−メチオニンで
標識した（実験の部IIIを参照）。この産物はＳＤＳゲ
ル電気泳動上で相対分子量（Ｍr）48000(４８ｋ)および
５２Ｋのダブレットとして泳動し、そして５×１０+11の
hd値でＴ3と結合した。ヒトc−erb−Ａ in vitro翻訳産
物のラットＧＨ Ｔ3調節因子を含むＧ２０９−１４６お
よびＧ１８６−１５８オリゴヌクレオチドプローブへの
結合は第４５図に示す。長いプローブおよび短いプロー
ブは両方ともin vitro翻訳産物と有意に結合したが，Ｇ
Ｈ遺伝子のＴ3受容体結合部位に対して相同性を欠くプ
ローブ(例えばＰ−ＥＧＦ)は結合しなかった。in vitro
翻訳混合物中に存在する〔35Ｓ〕メチオニンの概算上の
比活性に基づいて，第４５図に示した結合活性は１〜２
fmoｌの erb−Ａ蛋白質に相当する。125Ｉ−Ｔ3受容体
を含むＧＣ２細胞核抽出物と相違して、c−erb−Ａ in
vitro翻訳産物は長いオリゴヌクレオチドと短いオリゴ
ヌクレオチドの両方に同程度に結合した。類似のデータ
が125Ｉ−Ｔ3で標識したヒトc−erb−Ａのin vitro翻訳
産物を用いて得られた（データは示さず）。これらの結
果は、c−erb−Ａ遺伝子産物がＧＣ２核抽出物からのＴ
3受容体によって結合される同じＴ3調節配列と特異的に
結合することを示している。それらは、c−erb−Ａ遺伝
子産物の機能がＴ3の転写作用を仲介することであると
いう更なる証拠を提供する。
【０２５６】Ｆlugら（1987）は、ヌクレオチド位置−
２１０と−１８１の間のＧＨ配列が一時的にトランスフ
ェクションしたＧＣ細胞におけるＴ3の完全刺激作用に
不可欠であることを最近報告し、さらにこの領域がＴ3
調節される他の遺伝子に対し限られた類似性を保有する
ことを指摘した。我々の実験は、Ｔ3受容体−ＤＮＡ結
合部位をＣＡＰ部位から１６４bpと１７９bpの間に位置
づけ、さらにＧＨ遺伝子のＴ3調節におけるヌクレオチ
ド位置−２１０と−１８１の間の配列の機能的重要性に
ついて証明する。これは、我々がＴ3受容体源として粗
製核抽出物を用いてin vitro ＤＮＡ結合実験で観察し
たように、in vivoにおいてこの上流因子を含むＧＨエ
ンハンサーフラグメントに対するＴ3受容体の増大した
親和性を反映するのであろう。erb−Ａ in vitro翻訳産
物がＧ２０９−１４６およびＧ１８６−１５８と同程度
に結合するということは、粗製ＧＣ２核抽出物がヌクレ
オチド位置−２１０と−１８１の間の配列と結合し且つ
その結合部位に対するＴ3受容体の結合を安定化する別
の因子（１種または２種以上）を含む可能性と一致す
る。真核細胞の転写因子間の協同的相互作用は十分に確
立されている16-18；いくつかの場合において、これは
別の因子のＤＮＡ結合親和性を変更するある因子の能力
を反映している。この種の相互作用は甲状腺ホルモン作
用の組織特異的調節において重要であるだろう。5 '6こ
こで使用したＡＢＣＤ結合検定はこれらの問題を処理す
るのに有用であり、それはまた標識リガンド、化学的修
飾または標識アミノ酸によるin vitro翻訳を用いて選択
的に放射性標識しうるすべてのＤＮＡ結合蛋白質に応用
できるであろう。
２１０と−１８１の間のＧＨ配列が一時的にトランスフ
ェクションしたＧＣ細胞におけるＴ3の完全刺激作用に
不可欠であることを最近報告し、さらにこの領域がＴ3
調節される他の遺伝子に対し限られた類似性を保有する
ことを指摘した。我々の実験は、Ｔ3受容体−ＤＮＡ結
合部位をＣＡＰ部位から１６４bpと１７９bpの間に位置
づけ、さらにＧＨ遺伝子のＴ3調節におけるヌクレオチ
ド位置−２１０と−１８１の間の配列の機能的重要性に
ついて証明する。これは、我々がＴ3受容体源として粗
製核抽出物を用いてin vitro ＤＮＡ結合実験で観察し
たように、in vivoにおいてこの上流因子を含むＧＨエ
ンハンサーフラグメントに対するＴ3受容体の増大した
親和性を反映するのであろう。erb−Ａ in vitro翻訳産
物がＧ２０９−１４６およびＧ１８６−１５８と同程度
に結合するということは、粗製ＧＣ２核抽出物がヌクレ
オチド位置−２１０と−１８１の間の配列と結合し且つ
その結合部位に対するＴ3受容体の結合を安定化する別
の因子（１種または２種以上）を含む可能性と一致す
る。真核細胞の転写因子間の協同的相互作用は十分に確
立されている16-18；いくつかの場合において、これは
別の因子のＤＮＡ結合親和性を変更するある因子の能力
を反映している。この種の相互作用は甲状腺ホルモン作
用の組織特異的調節において重要であるだろう。5 '6こ
こで使用したＡＢＣＤ結合検定はこれらの問題を処理す
るのに有用であり、それはまた標識リガンド、化学的修
飾または標識アミノ酸によるin vitro翻訳を用いて選択
的に放射性標識しうるすべてのＤＮＡ結合蛋白質に応用
できるであろう。
【０２５７】VI．Ｅ．実験の部VIに関する図面の詳細な
説明 第４２（Ａ）,（Ｂ）および（Ｃ）図 ラットＧＨ５’−フランキング配列を含む種々の遺伝子
融合物の甲状腺ホルモン応答性。Ａ．ラットＧＨ遺伝子
の５’および３’欠失の応答性。ラットＧＨ遺伝子の
５’欠失フラグメントは、pＳＶ２ＣＡＴをベースとし
たベクター18(ＳＶ４０複製起点およびプロモーターを
除去したもの）中のＣＡＴ遺伝子に融合させた。これら
の構築物はＧＣ２細胞にトランスフェクションし、Ｔ3
に対する応答性について検定した。ヌクレオチド位置−
１０７ないし＋８および−１８１ないし＋８のフラグメ
ントの基礎発現は低レベルであるため、Ｔ3 によって調
節されないラットプロラクチンエンハンサー（Ｐrｌ）
11をこれらのフラグメントに近接して配置した。例示し
た３’欠失フラグメントは、−１９７位から＋５４位ま
でのtkプロモーターフラグメントに融合させ、同じベク
ター中のＣＡＴ遺伝子に近接して配置した。Ｂ．推定上
のＴ3 受容体結合部位の機能的分析。突然変異体Ｇデル
タ１７７／１６６はＣＡＰ部位から１７７−１６６塩基
対のＴ3 受容体結合部位の１１個の塩基の欠失を含む。
プラスミドＧ２９ＴＫおよびＧ２９３ＴＫは、それぞれ
１および３のコピー数で Ｔ3受容体と結合するラットＧ
Ｈ遺伝子の２８bp領域を含む。Ｔ3の作用は、１０-9Ｍ
Ｔ3 の存在下でのクロラムフェニコールの転化百分率を
Ｔ3の不在下でのその転化百分率で割ることにより決定
した。３通りのプレートはＤＥＡＥ−デキストラン11を
用いる被験プラスミドでのトランスフェクション前に、
イオン交換クロマトグラフィーでＴ3 を除いた１０％ウ
シ胎児血清中に２日間維持した。細胞はトランスフェク
ションの２４時間後にホルモンで処理し、Ｔ3暴露の２
４時間後にＣＡＴ活性について決定した。誤差限界は平
均値の標準誤差を表す。Ａn はＳＶ４０ポリアデニル化
部位を表す。Ｃ．メッセンジャーＲＮＡ転写開始部位の
分析。模式図はtkプロモーターを含むプラスミドの転写
物のＣＡＰ部位を決定するために用いられた。ＣＡＴコ
ード配列のヌクレオチド６７−８９に相補的な３３ヌク
レオチドプライマーを表す。ＧＣ細胞はパネルａおよび
ｂで示した実験において説明したように、被験プラスミ
ドでトランスフェクションし、ホルモン処理を行った。
プライマー伸長分析は５０μｇの全ＲＮＡに対して実施
した。レーンＡおよびＢはtkプロモーターに融合したＣ
ＡＰ部位から２３５−４５位に及ぶＧＨフラグメントを
含むプラスミドでトランスフェクションした細胞からの
伸長産物を表す。レーンＣおよびＤはtkプロモーターの
みを含むプラスミドでトランスフェクションした細胞か
らの伸長産物を表す。伸長産物は全く観察されなかっ
た。レーンＡおよびレーンＣに示した産物はＴ3 の不在
下でインキュベートした細胞からのものであり、そして
レーンＢおよびＤに示した産物は１０-9Ｍの濃度のＴ3
で処理した細胞からのものであった。レーンＥは(ヌク
レオチドの)サイズ測定のために使用したpＢＲ３２２の
ＨindIII消化物を示す。
説明 第４２（Ａ）,（Ｂ）および（Ｃ）図 ラットＧＨ５’−フランキング配列を含む種々の遺伝子
融合物の甲状腺ホルモン応答性。Ａ．ラットＧＨ遺伝子
の５’および３’欠失の応答性。ラットＧＨ遺伝子の
５’欠失フラグメントは、pＳＶ２ＣＡＴをベースとし
たベクター18(ＳＶ４０複製起点およびプロモーターを
除去したもの）中のＣＡＴ遺伝子に融合させた。これら
の構築物はＧＣ２細胞にトランスフェクションし、Ｔ3
に対する応答性について検定した。ヌクレオチド位置−
１０７ないし＋８および−１８１ないし＋８のフラグメ
ントの基礎発現は低レベルであるため、Ｔ3 によって調
節されないラットプロラクチンエンハンサー（Ｐrｌ）
11をこれらのフラグメントに近接して配置した。例示し
た３’欠失フラグメントは、−１９７位から＋５４位ま
でのtkプロモーターフラグメントに融合させ、同じベク
ター中のＣＡＴ遺伝子に近接して配置した。Ｂ．推定上
のＴ3 受容体結合部位の機能的分析。突然変異体Ｇデル
タ１７７／１６６はＣＡＰ部位から１７７−１６６塩基
対のＴ3 受容体結合部位の１１個の塩基の欠失を含む。
プラスミドＧ２９ＴＫおよびＧ２９３ＴＫは、それぞれ
１および３のコピー数で Ｔ3受容体と結合するラットＧ
Ｈ遺伝子の２８bp領域を含む。Ｔ3の作用は、１０-9Ｍ
Ｔ3 の存在下でのクロラムフェニコールの転化百分率を
Ｔ3の不在下でのその転化百分率で割ることにより決定
した。３通りのプレートはＤＥＡＥ−デキストラン11を
用いる被験プラスミドでのトランスフェクション前に、
イオン交換クロマトグラフィーでＴ3 を除いた１０％ウ
シ胎児血清中に２日間維持した。細胞はトランスフェク
ションの２４時間後にホルモンで処理し、Ｔ3暴露の２
４時間後にＣＡＴ活性について決定した。誤差限界は平
均値の標準誤差を表す。Ａn はＳＶ４０ポリアデニル化
部位を表す。Ｃ．メッセンジャーＲＮＡ転写開始部位の
分析。模式図はtkプロモーターを含むプラスミドの転写
物のＣＡＰ部位を決定するために用いられた。ＣＡＴコ
ード配列のヌクレオチド６７−８９に相補的な３３ヌク
レオチドプライマーを表す。ＧＣ細胞はパネルａおよび
ｂで示した実験において説明したように、被験プラスミ
ドでトランスフェクションし、ホルモン処理を行った。
プライマー伸長分析は５０μｇの全ＲＮＡに対して実施
した。レーンＡおよびＢはtkプロモーターに融合したＣ
ＡＰ部位から２３５−４５位に及ぶＧＨフラグメントを
含むプラスミドでトランスフェクションした細胞からの
伸長産物を表す。レーンＣおよびＤはtkプロモーターの
みを含むプラスミドでトランスフェクションした細胞か
らの伸長産物を表す。伸長産物は全く観察されなかっ
た。レーンＡおよびレーンＣに示した産物はＴ3 の不在
下でインキュベートした細胞からのものであり、そして
レーンＢおよびＤに示した産物は１０-9Ｍの濃度のＴ3
で処理した細胞からのものであった。レーンＥは(ヌク
レオチドの)サイズ測定のために使用したpＢＲ３２２の
ＨindIII消化物を示す。
【０２５８】第４２(Ａ),(Ｂ)および(Ｃ)図の方法 ＣＡＰ部位の−１.７kbから＋８bpまでのラットＧＨ遺
伝子の５'フランキング配列を含むＣＡＴ発現ベクター
の構築は開示されている。11ラットプロラクチンエンハ
ンサーを含む融合物は、プラスミド pＰＳＳ11からこの
フラグメント（ラットプロラクチン配列ヌクレオチド位
置１８３１−１５３０に相当する）を切り出し、それを
成長ホルモン因子の５’欠失物に近接して逆向きに挿入
することにより作製した。ＨＳＶtkプロモーターを含む
融合物は、プラスミド pＧＰＯ（文献１１参照）からＧ
Ｈエンハンサーのフラグメントを切り出し、それらを−
１９７位から＋５４位までのtkプロモーターに近接して
pＳＶ２ＣＡＴをベースとした発現ベクターのＢamＨＩ
およびＳaｌＩ部位に挿入することにより作製した。別
法として、ＧＨエンハンサーはＢamＨＩおよびＳaｌｌ
ポリリンカー部位に挿入することより、 pＵＣ８をベー
スとしたベクター20中の−１０７位から＋５４位のtkプ
ロモーターに近接して配置した。ＧＨエンハンサー因子
の特定部位突然変異誘発は、ＣＡＰ部位から２３５−４
５bpのフラグメントをＭ１３mp１８のＢamＨＩおよびＳ
aｌＩ部位に挿入することにより行った。アンチセンス
ＧＨヌクレオチド−１８８ないし−１５７に相当する２
１塩基オリゴヌクレオチド（ヌクレオチド−１７７ない
し−１６６を欠失させて、Ａヌクレオチドで置換したも
の）は合成した。このオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋ
unkel の方法21によりＧＨエンハンサー中の塩基−１７
７から−１６６を欠失させた。ＣＡＴ活性は薄層クロマ
トグラフィー19後にメチル化クロラムフェニコール誘導
体のラジオアッセイにより測定した。プライマー伸長は
Ｅlsholtzらの方法12を用いた。
伝子の５'フランキング配列を含むＣＡＴ発現ベクター
の構築は開示されている。11ラットプロラクチンエンハ
ンサーを含む融合物は、プラスミド pＰＳＳ11からこの
フラグメント（ラットプロラクチン配列ヌクレオチド位
置１８３１−１５３０に相当する）を切り出し、それを
成長ホルモン因子の５’欠失物に近接して逆向きに挿入
することにより作製した。ＨＳＶtkプロモーターを含む
融合物は、プラスミド pＧＰＯ（文献１１参照）からＧ
Ｈエンハンサーのフラグメントを切り出し、それらを−
１９７位から＋５４位までのtkプロモーターに近接して
pＳＶ２ＣＡＴをベースとした発現ベクターのＢamＨＩ
およびＳaｌＩ部位に挿入することにより作製した。別
法として、ＧＨエンハンサーはＢamＨＩおよびＳaｌｌ
ポリリンカー部位に挿入することより、 pＵＣ８をベー
スとしたベクター20中の−１０７位から＋５４位のtkプ
ロモーターに近接して配置した。ＧＨエンハンサー因子
の特定部位突然変異誘発は、ＣＡＰ部位から２３５−４
５bpのフラグメントをＭ１３mp１８のＢamＨＩおよびＳ
aｌＩ部位に挿入することにより行った。アンチセンス
ＧＨヌクレオチド−１８８ないし−１５７に相当する２
１塩基オリゴヌクレオチド（ヌクレオチド−１７７ない
し−１６６を欠失させて、Ａヌクレオチドで置換したも
の）は合成した。このオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋ
unkel の方法21によりＧＨエンハンサー中の塩基−１７
７から−１６６を欠失させた。ＣＡＴ活性は薄層クロマ
トグラフィー19後にメチル化クロラムフェニコール誘導
体のラジオアッセイにより測定した。プライマー伸長は
Ｅlsholtzらの方法12を用いた。
【０２５９】第４３(Ａ)および(Ｂ)図 ビチオン−１１−dＵＴＰを含むオリゴヌクレオチドプ
ローブへのＴ3受容体の結合。Ａ．ＧＨ５’−フランキ
ング配列へのＴ3受容体結合を検定するために用いた２
つのオリゴヌクレオチドプロ−ブの模式図。太い線、相
補的３’末端を有する合成オリゴヌクレオチド。細い
線、大腸菌ＤＮＡポリメラ−ゼの大フラグメントを用い
て５’突出部を修復することにより組込まれた塩基。星
印、ビオチン−１１−dＵＴＰ残基。ＢamＨＩおよびＢg
ｌII の制限部位も示される。Ｇ２０９−１４６および
Ｇ１８６−１５８は図示した５’および３’境界をもつ
ラットＧＨエンハンサ−配列を含む。Ｂ．種々のビオチ
ン−１１− dＵＴＰ含有オリゴヌクレオチドプロ−ブに
よるＧＣ２核抽出物からの125Ｉ−Ｔ3 標識Ｔ3受容体の
沈澱。Ｐ−ＥＧＦ、ＰＢ１−Ｂ、ＰＢ２−ＢおよびＰＢ
４−Ｂはそれぞれ１０、１１、１０および１０個のビオ
チン−１１ dＵＴＰを含む６８、５３、５５および５８
塩基対のオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌ
クレオチドはＧ２０９−１８６に含まれるラットＧＨ配
列に対して明らかに相同性を欠くラットプロラクチン遺
伝子の５’フランキング配列を含む。沈澱は１００フェ
ムトモルの各プロ−ブを用いて行った。ビオチニル化オ
リゴヌクレオチドプロ−ブの不在下でストレプトアビジ
ンアガロ−スビ−ズに付随する125Ｉ 活性を示すバック
グラウンドは、本実験において 1400 cpmであった。結
果は３通りのポイントの平均値および標準誤差としてプ
ロットした。本実験は125Ｉ−Ｔ3結合の配列特異性を調
べる６通りの実験を表す。
ローブへのＴ3受容体の結合。Ａ．ＧＨ５’−フランキ
ング配列へのＴ3受容体結合を検定するために用いた２
つのオリゴヌクレオチドプロ−ブの模式図。太い線、相
補的３’末端を有する合成オリゴヌクレオチド。細い
線、大腸菌ＤＮＡポリメラ−ゼの大フラグメントを用い
て５’突出部を修復することにより組込まれた塩基。星
印、ビオチン−１１−dＵＴＰ残基。ＢamＨＩおよびＢg
ｌII の制限部位も示される。Ｇ２０９−１４６および
Ｇ１８６−１５８は図示した５’および３’境界をもつ
ラットＧＨエンハンサ−配列を含む。Ｂ．種々のビオチ
ン−１１− dＵＴＰ含有オリゴヌクレオチドプロ−ブに
よるＧＣ２核抽出物からの125Ｉ−Ｔ3 標識Ｔ3受容体の
沈澱。Ｐ−ＥＧＦ、ＰＢ１−Ｂ、ＰＢ２−ＢおよびＰＢ
４−Ｂはそれぞれ１０、１１、１０および１０個のビオ
チン−１１ dＵＴＰを含む６８、５３、５５および５８
塩基対のオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌ
クレオチドはＧ２０９−１８６に含まれるラットＧＨ配
列に対して明らかに相同性を欠くラットプロラクチン遺
伝子の５’フランキング配列を含む。沈澱は１００フェ
ムトモルの各プロ−ブを用いて行った。ビオチニル化オ
リゴヌクレオチドプロ−ブの不在下でストレプトアビジ
ンアガロ−スビ−ズに付随する125Ｉ 活性を示すバック
グラウンドは、本実験において 1400 cpmであった。結
果は３通りのポイントの平均値および標準誤差としてプ
ロットした。本実験は125Ｉ−Ｔ3結合の配列特異性を調
べる６通りの実験を表す。
【０２６０】第４３（Ａ）および（Ｂ）図の方法 核はＤinghamらの技法22 に従ってラットＧＣ２細胞か
ら分離し，そして０.６Ｍ ＫＣｌ、１０mＭへペス（pＨ
７.９），０.５mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)、０.２
mＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ Ｚn Ｃｌ2中で氷上にて３０分
間塩抽出した。その核抽出物は緩衝液Ａ（５０mＭ ＫＣ
ｌ、２０mＭ Ｋ3ＰＯ4（ pＨ７.４）、１mＭＭｇＣ
ｌ2，１mＭ β−メルカプトエタノ−ルおよび２０％グ
リセロ−ル）中でゲル濾過することにより脱塩し、−７
０℃で貯蔵した。ＧＣ２核受容体に対するＴ3の特異的
結合の検定はＳamuelsら23によって記載されたように行
われたが，ただし、Ｔ3結合反応は２００μｇ／mｌ ポ
リ(dＩ−dＣ)の存在下に緩衝液Ａ中で実施した。ＤＮＡ
結合を検定するために、初めに核抽出物を１μＭの12 5
Ｉ−Ｔ3（2200Ｃi／m moｌ）と２２℃で２０分間インキ
ュベートして、Ｔ3 受容体を高い比活性へ標識した。そ
の後、核抽出物のアリコート（４０μｌ）は２００μｌ
ポリ(dＩ−dＣ）の存在下にビオチニル化プローブと共
に２２℃で４０分間インキュベートした。蛋白質−ＤＮ
Ａ複合体はアガロースビーズ（ＢＲＬ）結合したストレ
プトアビジンを加えることにより沈澱させた。アガロー
スビーズをペレットとなし、緩衝液Ａ（１mｌ）で３回
洗い、その後125Ｉ活性について検定した。
ら分離し，そして０.６Ｍ ＫＣｌ、１０mＭへペス（pＨ
７.９），０.５mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)、０.２
mＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ Ｚn Ｃｌ2中で氷上にて３０分
間塩抽出した。その核抽出物は緩衝液Ａ（５０mＭ ＫＣ
ｌ、２０mＭ Ｋ3ＰＯ4（ pＨ７.４）、１mＭＭｇＣ
ｌ2，１mＭ β−メルカプトエタノ−ルおよび２０％グ
リセロ−ル）中でゲル濾過することにより脱塩し、−７
０℃で貯蔵した。ＧＣ２核受容体に対するＴ3の特異的
結合の検定はＳamuelsら23によって記載されたように行
われたが，ただし、Ｔ3結合反応は２００μｇ／mｌ ポ
リ(dＩ−dＣ)の存在下に緩衝液Ａ中で実施した。ＤＮＡ
結合を検定するために、初めに核抽出物を１μＭの12 5
Ｉ−Ｔ3（2200Ｃi／m moｌ）と２２℃で２０分間インキ
ュベートして、Ｔ3 受容体を高い比活性へ標識した。そ
の後、核抽出物のアリコート（４０μｌ）は２００μｌ
ポリ(dＩ−dＣ）の存在下にビオチニル化プローブと共
に２２℃で４０分間インキュベートした。蛋白質−ＤＮ
Ａ複合体はアガロースビーズ（ＢＲＬ）結合したストレ
プトアビジンを加えることにより沈澱させた。アガロー
スビーズをペレットとなし、緩衝液Ａ（１mｌ）で３回
洗い、その後125Ｉ活性について検定した。
【０２６１】第４４図 ＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー因子のＤ
ＮアーゼＩフットプリント。アンチセンス鎖中の１６bp
保護領域が示される。ＣＡＰ部位から−１１０位ないし
−１４０位まで延びる第二フットプリントもはっきりと
示される。レ−ンＡ−Ｃ、それぞれ２４，１２および４
μｇのＤＮア−ゼＩを用いた、ＧＣ２核抽出物とのイン
キュベ−ション後の標識ＧＨエンハンサーの消化。レ−
ンＤ−Ｆ、ＧＣ２核抽出物の不在下での２４，１２およ
び４μｇのＤＮア−ゼＩによる標識ＧＨエンハンサーの
消化。レ−ンＧおよびＭ、マ−カ−。表示した配列はフ
ットプリントされた領域内のセンス鎖の配列に相当す
る。
ＮアーゼＩフットプリント。アンチセンス鎖中の１６bp
保護領域が示される。ＣＡＰ部位から−１１０位ないし
−１４０位まで延びる第二フットプリントもはっきりと
示される。レ−ンＡ−Ｃ、それぞれ２４，１２および４
μｇのＤＮア−ゼＩを用いた、ＧＣ２核抽出物とのイン
キュベ−ション後の標識ＧＨエンハンサーの消化。レ−
ンＤ−Ｆ、ＧＣ２核抽出物の不在下での２４，１２およ
び４μｇのＤＮア−ゼＩによる標識ＧＨエンハンサーの
消化。レ−ンＧおよびＭ、マ−カ−。表示した配列はフ
ットプリントされた領域内のセンス鎖の配列に相当す
る。
【０２６２】第４４図の方法 成長ホルモンエンハンサーのアンチセンス鎖は、pＧＰ
ＯのＢam ＨＩ消化およびウシ腸ホスファターゼ処理後
に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末
端を32Ｐ−dＡＴＰで標識した。エンハンサーフラグメ
ントはＸhoＩ消化で pＧＰＯから切り離し、アガロース
ゲル電気泳動で精製した。標識ＧＨエンハンサーフラグ
メント（１nｇ，８fmoｌ）は１２ fmoｌの特異的Ｔ3受
容体結合活性を含む２５μｌのＧＣ２核抽出物とインキ
ュベートした。ＤＮＡ結合反応は緩衝液Ａ中２２℃で３
０分間行った。ＤＮアーゼ消化は最終容量５０μｌ中で
上記濃度のＤＮアーゼＩを用いて２２℃で２分間行っ
た。この反応は２０μｌの５０mＭＥＤＴＡおよび１％
ＳＤＳで停止させた。試料はフェノール／クロロホルム
で一回抽出し、エタノール沈澱させ、そして標準１０％
塩基配列決定用ゲル上で電気泳動により分析した。
ＯのＢam ＨＩ消化およびウシ腸ホスファターゼ処理後
に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末
端を32Ｐ−dＡＴＰで標識した。エンハンサーフラグメ
ントはＸhoＩ消化で pＧＰＯから切り離し、アガロース
ゲル電気泳動で精製した。標識ＧＨエンハンサーフラグ
メント（１nｇ，８fmoｌ）は１２ fmoｌの特異的Ｔ3受
容体結合活性を含む２５μｌのＧＣ２核抽出物とインキ
ュベートした。ＤＮＡ結合反応は緩衝液Ａ中２２℃で３
０分間行った。ＤＮアーゼ消化は最終容量５０μｌ中で
上記濃度のＤＮアーゼＩを用いて２２℃で２分間行っ
た。この反応は２０μｌの５０mＭＥＤＴＡおよび１％
ＳＤＳで停止させた。試料はフェノール／クロロホルム
で一回抽出し、エタノール沈澱させ、そして標準１０％
塩基配列決定用ゲル上で電気泳動により分析した。
【０２６３】第４５図 ラット下垂体細胞Ｔ3の６４bpおよび２９bpの５’側Ｇ
Ｈ配列を含むオリゴヌクレオチドへの結合。１００fmo
ｌのＧ２０９−１４６、Ｇ１８６−１５８またはＰ−Ｅ
ＧＦとインキュベートし、第VI−２（Ａ）および（Ｂ）
に記載の如く結合について検定した。また、35Ｓ−メチ
オニンで標識した hc−erb−Ａ in vitro翻訳産物（４
μｌ）は、１０nＭ Ｔ3の存在下でのこれらのオリゴヌ
クレオチドへの結合について検定した。hc−erb−Ａ in
vitro翻訳産物を調製するために、hc−erb−Ａ相補的
ＤＮＡのキャップ構造をもつｍＲＮＡ転写物を用いて、
ウサギ網状赤血球溶解液系10における翻訳をプログラミ
ングした。アンチセンス hc−erb−ＡｍＲＮＡを組み入
れた網状赤血球溶解液は、いずれのＧＨプローブにも測
定可能な結合活性を示さなかった（データは示さず）。
結果は３通りのポイントの平均値および標準誤差として
プロットした。示した実験は、２種類のＧＨプローブへ
のＧＣ２核Ｔ3受容体の結合を比較する３回の実験、お
よびhc−erb−Ａ in vitro翻訳産物の結合を調べる４
回の実験を代表するものである。
Ｈ配列を含むオリゴヌクレオチドへの結合。１００fmo
ｌのＧ２０９−１４６、Ｇ１８６−１５８またはＰ−Ｅ
ＧＦとインキュベートし、第VI−２（Ａ）および（Ｂ）
に記載の如く結合について検定した。また、35Ｓ−メチ
オニンで標識した hc−erb−Ａ in vitro翻訳産物（４
μｌ）は、１０nＭ Ｔ3の存在下でのこれらのオリゴヌ
クレオチドへの結合について検定した。hc−erb−Ａ in
vitro翻訳産物を調製するために、hc−erb−Ａ相補的
ＤＮＡのキャップ構造をもつｍＲＮＡ転写物を用いて、
ウサギ網状赤血球溶解液系10における翻訳をプログラミ
ングした。アンチセンス hc−erb−ＡｍＲＮＡを組み入
れた網状赤血球溶解液は、いずれのＧＨプローブにも測
定可能な結合活性を示さなかった（データは示さず）。
結果は３通りのポイントの平均値および標準誤差として
プロットした。示した実験は、２種類のＧＨプローブへ
のＧＣ２核Ｔ3受容体の結合を比較する３回の実験、お
よびhc−erb−Ａ in vitro翻訳産物の結合を調べる４
回の実験を代表するものである。
【０２６４】VI．Ｆ．実験の部VIで引用した文献 １．Ｅvans，Ｒ．Ｍ．，Ｂirnberg，Ｎ．Ｃ．，and Ｒ
osenfeld，Ｍ．Ｇ．，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ，79：7659−7663（1982）。 ２．Ｄiamond，Ｄ.Ｊ．，and Ｇoodman，Ｈ.Ｍ.，Ｊ.Ｍ
olec．Ｂiol.，181：41−62（1985）。 ３．Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｍellon，Ｓ.Ｈ.，and Ｂaxt
er，Ｊ.Ｄ.，Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．，257：11627−11632
（1982）。 ４．Ｙaffee，Ｂ.Ｍ.，and Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｊ.Ｂio
l.Ｃhem.，259：6284−6291（1984）。 ５．Ｌarsen，Ｐ.Ｒ.,Ｈarney，Ｊ.Ｗ.，and Ｍoore，
Ｄ.Ｄ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．,261：14373−14376（198
6）。 ６．Ｆlug，Ｆ.，et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，262：6373
−6382（1987）。 ７．Ｃasanova，Ｊ.，Ｃopp，Ｒ.Ｐ.，Ｊanocko，Ｌ.，
and Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，260：11744
−11748（1985）。 ８．Ｃrew，Ｍ.，and Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｊ.Ｂiol.Ｃ
hem.，261：5018−5022（1986）。 ９．Ｓap，Ｊ.，et al.，Ｎature，324：635−640（198
6）。 10．Ｗeinberger，Ｃ.，et al.，Ｎature，324：641−6
46（1986）。 11．Ｎelson，Ｃ.，et al.，Ｎature，322：557−562
（1986）。 12．Ｅlsholtz，Ｈ.Ｐ.，et al.，Ｓcience，234：1552
−1557（1986）。 13．Ｗest，Ｂ.Ｌ.，et al.，Ｍolec.Ｃell.Ｂiol.，
7：1193−1198（1987）。 14．Ｃatanzaro，Ｄ.Ｆ.,Ｗest，Ｂ.Ｌ.,Ｂaxter，Ｊ.
Ｄ.，and Ｒeudelhuber，Ｔ.Ｌ.，Ｍolec．Ｅndo.，1：
90−96（1987）。 15．Ｎyborg，Ｊ.Ｋ.，and Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｊ.Ｂi
ol.Ｃhem.，261：5685−5688（1986）。 16．Ｔopol，Ｊ.，Ｒuden，Ｄ.Ｍ.，and Ｐarker，Ｃ.
Ｓ.，Ｃell，42：527−537（1985）。 17．Ｒeinberg，Ｄ．，Ｈorikoshi，Ｍ．，and Ｒoede
r，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，262：3322−3330
（1987）。 18．Ｍcknight，Ｓ.，and Ｔjian，Ｒ.，Ｃell，46：7
95−805（1986）。 19．Ｇorman，Ｃ.Ｍ.，Ｍoffat，Ｌ.Ｆ.，and Ｈowar
d，Ｂ.Ｈ.，Ｍolec.Ｃell.Ｂiol.，2：1044−1051（198
2）。 20．Ｌinney，Ｅ.，and Ｄonerly，Ｓ．Ｃell，35：69
3−699（1983）。 21．Ｋunkel，Ｔ.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ，
82：488−492（1985）。 22．Ｄingham，Ｊ.Ｄ.，Ｌebovitz，Ｒ.Ｍ.，and Ｒoe
der，Ｒ.Ｇ.，Ｎucleic.Ａcids．Ｒes．，11：1475−14
89（1983）。 23．Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｔsai，Ｊ.Ｓ.，Ｃasanova，
Ｊ.，and Ｓtanley，Ｆ.，Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.，54：853
−865（1974）。
osenfeld，Ｍ．Ｇ．，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ，79：7659−7663（1982）。 ２．Ｄiamond，Ｄ.Ｊ．，and Ｇoodman，Ｈ.Ｍ.，Ｊ.Ｍ
olec．Ｂiol.，181：41−62（1985）。 ３．Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｍellon，Ｓ.Ｈ.，and Ｂaxt
er，Ｊ.Ｄ.，Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．，257：11627−11632
（1982）。 ４．Ｙaffee，Ｂ.Ｍ.，and Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｊ.Ｂio
l.Ｃhem.，259：6284−6291（1984）。 ５．Ｌarsen，Ｐ.Ｒ.,Ｈarney，Ｊ.Ｗ.，and Ｍoore，
Ｄ.Ｄ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．,261：14373−14376（198
6）。 ６．Ｆlug，Ｆ.，et al.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，262：6373
−6382（1987）。 ７．Ｃasanova，Ｊ.，Ｃopp，Ｒ.Ｐ.，Ｊanocko，Ｌ.，
and Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，260：11744
−11748（1985）。 ８．Ｃrew，Ｍ.，and Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｊ.Ｂiol.Ｃ
hem.，261：5018−5022（1986）。 ９．Ｓap，Ｊ.，et al.，Ｎature，324：635−640（198
6）。 10．Ｗeinberger，Ｃ.，et al.，Ｎature，324：641−6
46（1986）。 11．Ｎelson，Ｃ.，et al.，Ｎature，322：557−562
（1986）。 12．Ｅlsholtz，Ｈ.Ｐ.，et al.，Ｓcience，234：1552
−1557（1986）。 13．Ｗest，Ｂ.Ｌ.，et al.，Ｍolec.Ｃell.Ｂiol.，
7：1193−1198（1987）。 14．Ｃatanzaro，Ｄ.Ｆ.,Ｗest，Ｂ.Ｌ.,Ｂaxter，Ｊ.
Ｄ.，and Ｒeudelhuber，Ｔ.Ｌ.，Ｍolec．Ｅndo.，1：
90−96（1987）。 15．Ｎyborg，Ｊ.Ｋ.，and Ｓpindler，Ｓ.Ｒ.，Ｊ.Ｂi
ol.Ｃhem.，261：5685−5688（1986）。 16．Ｔopol，Ｊ.，Ｒuden，Ｄ.Ｍ.，and Ｐarker，Ｃ.
Ｓ.，Ｃell，42：527−537（1985）。 17．Ｒeinberg，Ｄ．，Ｈorikoshi，Ｍ．，and Ｒoede
r，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．，262：3322−3330
（1987）。 18．Ｍcknight，Ｓ.，and Ｔjian，Ｒ.，Ｃell，46：7
95−805（1986）。 19．Ｇorman，Ｃ.Ｍ.，Ｍoffat，Ｌ.Ｆ.，and Ｈowar
d，Ｂ.Ｈ.，Ｍolec.Ｃell.Ｂiol.，2：1044−1051（198
2）。 20．Ｌinney，Ｅ.，and Ｄonerly，Ｓ．Ｃell，35：69
3−699（1983）。 21．Ｋunkel，Ｔ.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ，
82：488−492（1985）。 22．Ｄingham，Ｊ.Ｄ.，Ｌebovitz，Ｒ.Ｍ.，and Ｒoe
der，Ｒ.Ｇ.，Ｎucleic.Ａcids．Ｒes．，11：1475−14
89（1983）。 23．Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｔsai，Ｊ.Ｓ.，Ｃasanova，
Ｊ.，and Ｓtanley，Ｆ.，Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.，54：853
−865（1974）。
【０２６５】実験の部VII 哺乳動物中枢神経系で発現された新規な甲状腺ホルモン
受容体の同定VII．Ａ．概要 ラット脳メッセンジャーＲＮＡから誘導された相補的Ｄ
ＮＡクローンは、ヒト甲状腺ホルモン受容体遺伝子に対
する相同性に基づいて分離された。この相補的ＤＮＡの
発現は甲状腺ホルモンに高い親和性を示す結合蛋白質を
もたらす。塩基配列の分析および特定のヒト遺伝子座へ
のこの遺伝子のマッピングは、複数のヒト甲状腺ホルモ
ン受容体の存在を示す。この遺伝子からのメッセンジャ
ーＲＮＡは組織特異的であり、中枢神経系において最高
レベルで発現される。
受容体の同定VII．Ａ．概要 ラット脳メッセンジャーＲＮＡから誘導された相補的Ｄ
ＮＡクローンは、ヒト甲状腺ホルモン受容体遺伝子に対
する相同性に基づいて分離された。この相補的ＤＮＡの
発現は甲状腺ホルモンに高い親和性を示す結合蛋白質を
もたらす。塩基配列の分析および特定のヒト遺伝子座へ
のこの遺伝子のマッピングは、複数のヒト甲状腺ホルモ
ン受容体の存在を示す。この遺伝子からのメッセンジャ
ーＲＮＡは組織特異的であり、中枢神経系において最高
レベルで発現される。
【０２６６】VII．Ｂ．序論 甲状腺ホルモンは高等脊椎動物の多くの組織において発
生学的および生理学的応答の複雑な機構に関与している
（１）。それらの多種多様な作用には重要な代謝酵素、
ホルモンおよび受容体の調節が含まれる（２）。甲状腺
ホルモンの作用は核受容体により仲介され、標的細胞に
よる特定遺伝子の発現を調節する（３−５）。これらの
性質はステロイドホルモンとそれらの受容体との相互作
用に類似しており、最近観察されたステロイドホルモン
受容体と甲状腺ホルモン受容体との構造類似性に合致し
ている（実験の部IIIを参照）。
生学的および生理学的応答の複雑な機構に関与している
（１）。それらの多種多様な作用には重要な代謝酵素、
ホルモンおよび受容体の調節が含まれる（２）。甲状腺
ホルモンの作用は核受容体により仲介され、標的細胞に
よる特定遺伝子の発現を調節する（３−５）。これらの
性質はステロイドホルモンとそれらの受容体との相互作
用に類似しており、最近観察されたステロイドホルモン
受容体と甲状腺ホルモン受容体との構造類似性に合致し
ている（実験の部IIIを参照）。
【０２６７】VII．Ｃ．第２甲状腺ホルモン受容体ＤＮ
Ａの分離 甲状腺ホルモン作用の多様性にもかかわらず、一般に甲
状腺ホルモン機能は単一の高親和性核受容体を介して起
こることが認められている。しかしながら、v−erb−Ａ
腫瘍遺伝子産物の細胞相同体としての甲状腺ホルモン
受容体の最近の同定（実験の部IIIおよび文献７を参
照）は、ヒト染色体３および１７上の複数のc−erb−Ａ
遺伝子の先の同定（実験の部IIIおよび文献８を参照）
と合わせて、複数の甲状腺ホルモン受容体の存在を示唆
している。複数の甲状腺ホルモン応答の基礎をなす機構
が、構造的に異なる甲状腺ホルモン受容体の発現から誘
導されうる可能性を調べるために、我々はこれらの関連
遺伝子座の１つの産物をコードする相補的ＤＮＡ（cＤ
ＮＡ）クローンを分離した。
Ａの分離 甲状腺ホルモン作用の多様性にもかかわらず、一般に甲
状腺ホルモン機能は単一の高親和性核受容体を介して起
こることが認められている。しかしながら、v−erb−Ａ
腫瘍遺伝子産物の細胞相同体としての甲状腺ホルモン
受容体の最近の同定（実験の部IIIおよび文献７を参
照）は、ヒト染色体３および１７上の複数のc−erb−Ａ
遺伝子の先の同定（実験の部IIIおよび文献８を参照）
と合わせて、複数の甲状腺ホルモン受容体の存在を示唆
している。複数の甲状腺ホルモン応答の基礎をなす機構
が、構造的に異なる甲状腺ホルモン受容体の発現から誘
導されうる可能性を調べるために、我々はこれらの関連
遺伝子座の１つの産物をコードする相補的ＤＮＡ（cＤ
ＮＡ）クローンを分離した。
【０２６８】推定上の神経細胞型甲状腺ホルモン受容体
は、ヒト甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの１５００bpフ
ラグメントを用いて、ラット脳メッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）から作製したｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより分離された。（文献６として
発表した実験の部IIIを参照されたい。）約１０6 個の
ファージから３個の陽性クローンを分離し、それらのう
ちで最も大きいもの、rbeＡ１２、の完全ヌクレオチド
配列を決定した（第４６（Ｂ）図）。この配列は２０７
９bpの鎖長であり、ヌクレオチド位置３２５にイニシエ
ーターメチオニンコドンおよびヌクレオチド位置１５５
４にターミネーターコドンを有する 1230bpの長いオー
プン・リーディング・フレーム（open reading fram
e）を含む。このオープン・リーディング・フレームは
推定上のイニシエーターメチオニンの上流に３つの短い
オープン・リーディング・フレームを含む少なくとも３
２０bpの５’非翻訳領域によって先行され、４１０個の
アミノ酸残基から成る蛋白質（計算した分子量４５Ｋ
Ｄ）をコードしている。
は、ヒト甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの１５００bpフ
ラグメントを用いて、ラット脳メッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）から作製したｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより分離された。（文献６として
発表した実験の部IIIを参照されたい。）約１０6 個の
ファージから３個の陽性クローンを分離し、それらのう
ちで最も大きいもの、rbeＡ１２、の完全ヌクレオチド
配列を決定した（第４６（Ｂ）図）。この配列は２０７
９bpの鎖長であり、ヌクレオチド位置３２５にイニシエ
ーターメチオニンコドンおよびヌクレオチド位置１５５
４にターミネーターコドンを有する 1230bpの長いオー
プン・リーディング・フレーム（open reading fram
e）を含む。このオープン・リーディング・フレームは
推定上のイニシエーターメチオニンの上流に３つの短い
オープン・リーディング・フレームを含む少なくとも３
２０bpの５’非翻訳領域によって先行され、４１０個の
アミノ酸残基から成る蛋白質（計算した分子量４５Ｋ
Ｄ）をコードしている。
【０２６９】VII．Ｄ．第２甲状腺ホルモン受容体と他
の既知甲状腺ホルモン受容体蛋白質との比較 rbeＡ１２ からの推定アミノ酸配列とヒト甲状腺ホルモ
ン受容体のアミノ酸配列（実験の部IIIを参照）との比
較により、これらの２種類の蛋白質は異なるアミノ末端
をもつことが分った（第４７図）。神経細胞蛋白質の最
初の４１個のアミノ酸とヒト甲状腺ホルモン受容体の最
初の９０個のアミノ酸は有意な相同性を示さず、一方カ
ルボキシル末端の３６７個のアミノ酸は７５％のヌクレ
オチド同一性と８２％のアミノ酸同一性を共有してい
る。ラットの蛋白質は予告された大きなおよび相同性の
両方の点でニワトリの甲状腺ホルモン受容体（７）とよ
り一層関連が深く、８２％のヌクレオチド同一性と８９
％のアミノ酸同一性を共有している。参考として、ニワ
トリ甲状腺ホルモン受容体は以前に分離されたerb−Ａ
遺伝子との相同性ゆえにアルファ（cＴＲα）と称せら
れそして甲状腺ホルモン受容体はベ−タ（hＴＲβ）と
称せられる。ラット神経細胞型はニワトリの受容体とよ
り一層関連が深いので、それはアルファ（rＴＲα）と
呼ばれている。ステロイドホルモン受容体との類似性に
より、甲状腺ホルモン受容体のシステインに富む領域は
ＤＮＡ結合ドメインであると予想される（実験の部III
およびIIを参照；また文献１０を参照）。この領域にお
いて、 rＴＲα蛋白質は cＴＲα蛋白質と９７％のアミ
ノ酸同一性を有し、そして hＴＲβと９０％のアミノ酸
同一性を有する。これらの蛋白質はまた、ステロイド受
容体から類推して、ホルモン結合ドメインであると思わ
れるカルボキシル末端部分において十分に保存されてい
る（実験の部IIおよび文献１１を参照）。 rＴＲαのこ
の領域は cＴＲαと９４％のアミノ酸同一性を示し、そ
して hＴＲβと８５％のアミノ酸同一性を示す。
の既知甲状腺ホルモン受容体蛋白質との比較 rbeＡ１２ からの推定アミノ酸配列とヒト甲状腺ホルモ
ン受容体のアミノ酸配列（実験の部IIIを参照）との比
較により、これらの２種類の蛋白質は異なるアミノ末端
をもつことが分った（第４７図）。神経細胞蛋白質の最
初の４１個のアミノ酸とヒト甲状腺ホルモン受容体の最
初の９０個のアミノ酸は有意な相同性を示さず、一方カ
ルボキシル末端の３６７個のアミノ酸は７５％のヌクレ
オチド同一性と８２％のアミノ酸同一性を共有してい
る。ラットの蛋白質は予告された大きなおよび相同性の
両方の点でニワトリの甲状腺ホルモン受容体（７）とよ
り一層関連が深く、８２％のヌクレオチド同一性と８９
％のアミノ酸同一性を共有している。参考として、ニワ
トリ甲状腺ホルモン受容体は以前に分離されたerb−Ａ
遺伝子との相同性ゆえにアルファ（cＴＲα）と称せら
れそして甲状腺ホルモン受容体はベ−タ（hＴＲβ）と
称せられる。ラット神経細胞型はニワトリの受容体とよ
り一層関連が深いので、それはアルファ（rＴＲα）と
呼ばれている。ステロイドホルモン受容体との類似性に
より、甲状腺ホルモン受容体のシステインに富む領域は
ＤＮＡ結合ドメインであると予想される（実験の部III
およびIIを参照；また文献１０を参照）。この領域にお
いて、 rＴＲα蛋白質は cＴＲα蛋白質と９７％のアミ
ノ酸同一性を有し、そして hＴＲβと９０％のアミノ酸
同一性を有する。これらの蛋白質はまた、ステロイド受
容体から類推して、ホルモン結合ドメインであると思わ
れるカルボキシル末端部分において十分に保存されてい
る（実験の部IIおよび文献１１を参照）。 rＴＲαのこ
の領域は cＴＲαと９４％のアミノ酸同一性を示し、そ
して hＴＲβと８５％のアミノ酸同一性を示す。
【０２７０】VII．Ｅ．新しい甲状腺ホルモン受容体の
同定 塩基配列データに基づくと、我々が分離したｃＤＮＡは
以前に同定されたヒト甲状腺ホルモン受容体とは異なる
蛋白質をコードすると思われる（実験の部IIIを参
照）。神経細胞クローンが別の遺伝子産物であることを
立証するために、rbeＡ１２を用いてサザンブロットお
よび染色体分析によりヒト相同体を同定した。種々の制
限酵素で消化したヒト胎盤ＤＮＡはアガロースゲル上で
分離し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてラットま
たはヒトＴＲ特異的プローブ（それぞれの遺伝子の重複
領域から誘導されたもの）とハイブリダイズさせた（第
４８（Ａ）および（Ｂ）図）。試験した全ての制限酵素
に対して異なるハイブリダイゼーションパターンが観察
され、このことは２つのｃＤＮＡが全く別の遺伝子であ
ることを示している。rbeＡ１２由来の同じプローブ
は、ヒトリンパ様細胞から調製したレーザー選別染色体
とハイブリダイズさせた（第４８（Ｃ）図）。ハイブリ
ダイゼーションは染色体１７にのみ観察され、c−erb−
Ａ遺伝子をヒト染色体１７に局在化した以前のマッピン
グ実験と一致した（８）。これはヒト染色体３に存在す
る hＴＲβと rＴＲαとを区別している（実験の部IIを
参照）。
同定 塩基配列データに基づくと、我々が分離したｃＤＮＡは
以前に同定されたヒト甲状腺ホルモン受容体とは異なる
蛋白質をコードすると思われる（実験の部IIIを参
照）。神経細胞クローンが別の遺伝子産物であることを
立証するために、rbeＡ１２を用いてサザンブロットお
よび染色体分析によりヒト相同体を同定した。種々の制
限酵素で消化したヒト胎盤ＤＮＡはアガロースゲル上で
分離し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてラットま
たはヒトＴＲ特異的プローブ（それぞれの遺伝子の重複
領域から誘導されたもの）とハイブリダイズさせた（第
４８（Ａ）および（Ｂ）図）。試験した全ての制限酵素
に対して異なるハイブリダイゼーションパターンが観察
され、このことは２つのｃＤＮＡが全く別の遺伝子であ
ることを示している。rbeＡ１２由来の同じプローブ
は、ヒトリンパ様細胞から調製したレーザー選別染色体
とハイブリダイズさせた（第４８（Ｃ）図）。ハイブリ
ダイゼーションは染色体１７にのみ観察され、c−erb−
Ａ遺伝子をヒト染色体１７に局在化した以前のマッピン
グ実験と一致した（８）。これはヒト染色体３に存在す
る hＴＲβと rＴＲαとを区別している（実験の部IIを
参照）。
【０２７１】VII．Ｆ．発現実験 rＴＲαｃＤＮＡが機能的な受容体蛋白質をコードする
か否かを調べるために、発現実験を行った。rＴＲの遺
伝子の産物は初めにin vitro 転写それに続くinvitro翻
訳により同定された。in vitro転写のために、rbeＡ１
２のＥcoＲＩ挿入物は、発現ベクターpＧＥＭ１にサブ
クローニングすることによりバクテリオファージＳＰ６
プロモーターへ連結した。第２構築物のrbeＡ１２Ｂは
翻訳効率を高める目的で作製された。ヌクレオチド位置
９７までの５’非翻訳領域は欠失させて、この領域内の
３つの短いオープン・リーディング・フレームのうち２
つを除去した。ＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成した転
写物はウサギ網状赤血球溶解液と共に in vitro で翻訳
し、［35Ｓ］メチオニン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析した（第４９(Ａ)図）。約５２，
４８，３５および３３ＫＤの４種の蛋白質がセンス鎖を
翻訳したときだけ観察された。同じ４種のバンドがrbe
Ａ１２およびrbeＡ１２Ｂについて観察された。これら
の翻訳産物はその後甲状腺ホルモン結合を試験するため
に使用した。
か否かを調べるために、発現実験を行った。rＴＲの遺
伝子の産物は初めにin vitro 転写それに続くinvitro翻
訳により同定された。in vitro転写のために、rbeＡ１
２のＥcoＲＩ挿入物は、発現ベクターpＧＥＭ１にサブ
クローニングすることによりバクテリオファージＳＰ６
プロモーターへ連結した。第２構築物のrbeＡ１２Ｂは
翻訳効率を高める目的で作製された。ヌクレオチド位置
９７までの５’非翻訳領域は欠失させて、この領域内の
３つの短いオープン・リーディング・フレームのうち２
つを除去した。ＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成した転
写物はウサギ網状赤血球溶解液と共に in vitro で翻訳
し、［35Ｓ］メチオニン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析した（第４９(Ａ)図）。約５２，
４８，３５および３３ＫＤの４種の蛋白質がセンス鎖を
翻訳したときだけ観察された。同じ４種のバンドがrbe
Ａ１２およびrbeＡ１２Ｂについて観察された。これら
の翻訳産物はその後甲状腺ホルモン結合を試験するため
に使用した。
【０２７２】VII．Ｇ．ホルモン結合実験 甲状腺ホルモン結合は〔125Ｉ〕３，５，３’−トリヨ
ード−Ｌ−チロニン(12 5Ｉ−Ｔ3）を用いて測定した。r
ＴＲαの特定蛋白質を含む試料のみがＴ3 結合を示し
た。ホルモン新和性はスカッチャード分析により決定
し、解離定数(Ｋd)２.９×１０-11Ｍを与え（第４９
（Ｂ）図）、これは hＴＲβ蛋白質について観察された
Ｋd値（５×１０-11Ｍ）と類似するが（４，５)、cＴＲ
α蛋白質に対して測定されたＫd 値（２.１×１０-10〜
３.３×１０-10 Ｍ）よりも低かった（実験の部IIIを参
照）。得られたＫd 値の差異は使用した検定系が異なる
ことによるのかも知れない。競合実験において、in vi
tro 翻訳したrＴＲα蛋白質はhＴＲβ蛋白質と同じくＬ
−Ｔ3およびＬ−チロキシン（Ｌ−Ｔ4）に対して特有の
新和性を示したが、３，５’，３’−トリヨードチロ酢
酸（ＴＲＩＡＣ）に対しては異なるパターンを示した
（第４９（Ｃ）図）。ＴＲＩＡＣは hＴＲβ蛋白質の場
合Ｔ3 結合に対して比較的良好に競合したが、 rＴＲα
蛋白質への結合に対してはＴ3とほぼ同程度に競合し
た。 hＴＲβおよび cＴＲαの蛋白質の場合のように、
過剰のアルドステロン、エストロゲン、プロゲステロ
ン、テストステロンまたはビタミンＤ1による rＴＲα
蛋白質へのＴ3結合に対する競合は見られなかった。従
って、我々は以前に開示された甲状腺ホルモン受容体と
類似した結合特性をもつが、それとは同一でない甲状腺
ホルモン受容体を単離したと思われる（実験の部IIIお
よび文献７を参照）。
ード−Ｌ−チロニン(12 5Ｉ−Ｔ3）を用いて測定した。r
ＴＲαの特定蛋白質を含む試料のみがＴ3 結合を示し
た。ホルモン新和性はスカッチャード分析により決定
し、解離定数(Ｋd)２.９×１０-11Ｍを与え（第４９
（Ｂ）図）、これは hＴＲβ蛋白質について観察された
Ｋd値（５×１０-11Ｍ）と類似するが（４，５)、cＴＲ
α蛋白質に対して測定されたＫd 値（２.１×１０-10〜
３.３×１０-10 Ｍ）よりも低かった（実験の部IIIを参
照）。得られたＫd 値の差異は使用した検定系が異なる
ことによるのかも知れない。競合実験において、in vi
tro 翻訳したrＴＲα蛋白質はhＴＲβ蛋白質と同じくＬ
−Ｔ3およびＬ−チロキシン（Ｌ−Ｔ4）に対して特有の
新和性を示したが、３，５’，３’−トリヨードチロ酢
酸（ＴＲＩＡＣ）に対しては異なるパターンを示した
（第４９（Ｃ）図）。ＴＲＩＡＣは hＴＲβ蛋白質の場
合Ｔ3 結合に対して比較的良好に競合したが、 rＴＲα
蛋白質への結合に対してはＴ3とほぼ同程度に競合し
た。 hＴＲβおよび cＴＲαの蛋白質の場合のように、
過剰のアルドステロン、エストロゲン、プロゲステロ
ン、テストステロンまたはビタミンＤ1による rＴＲα
蛋白質へのＴ3結合に対する競合は見られなかった。従
って、我々は以前に開示された甲状腺ホルモン受容体と
類似した結合特性をもつが、それとは同一でない甲状腺
ホルモン受容体を単離したと思われる（実験の部IIIお
よび文献７を参照）。
【０２７３】VII．Ｈ．組織特異性実験 甲状腺ホルモンに対する代謝応答の組織特異性により、
この甲状腺ホルモン受容体は特定の組織において発現さ
れるものかも知れないと考えた。こうして、rＴＲα遺
伝子の発現パターンがノザンブロット分析により調べら
れた（第５０図）。いろいろなラット組織から分離した
全ＲＮＡはホルムアルデヒド−アガロ−スゲル上で分画
化し、ニトロセルロ−スへ移行させ、そしてサザンブロ
ット分析および染色体マッピングの際に使用したものと
同じ rbeＡ１２フラグメントとハイブリダイズさせた。
２.６Ｋb ＲＮＡ が肝臓を除いて試験した全ての組織に
観察された。このＲＮＡは下垂体や筋肉にも存在し、そ
してＧＣ、ラット−１およびＰＣ１２細胞株において発
現される。デンシトメ−タ−走査は、rＴＲαの発現レ
ベルが試験した他のどの組織よりも脳において１０〜２
０倍高いことを示した。約５.０Ｋbと６.０Ｋbの別の２
種類のＲＮＡが全ての組織にほぼ等しい量で存在する
が、それらは２.６Ｋb ＲＮＡ よりもはるかに少量であ
る。これらのバンドは２.６Ｋb ＲＮＡの前駆体または
関連遺伝子の産物でありうる。
この甲状腺ホルモン受容体は特定の組織において発現さ
れるものかも知れないと考えた。こうして、rＴＲα遺
伝子の発現パターンがノザンブロット分析により調べら
れた（第５０図）。いろいろなラット組織から分離した
全ＲＮＡはホルムアルデヒド−アガロ−スゲル上で分画
化し、ニトロセルロ−スへ移行させ、そしてサザンブロ
ット分析および染色体マッピングの際に使用したものと
同じ rbeＡ１２フラグメントとハイブリダイズさせた。
２.６Ｋb ＲＮＡ が肝臓を除いて試験した全ての組織に
観察された。このＲＮＡは下垂体や筋肉にも存在し、そ
してＧＣ、ラット−１およびＰＣ１２細胞株において発
現される。デンシトメ−タ−走査は、rＴＲαの発現レ
ベルが試験した他のどの組織よりも脳において１０〜２
０倍高いことを示した。約５.０Ｋbと６.０Ｋbの別の２
種類のＲＮＡが全ての組織にほぼ等しい量で存在する
が、それらは２.６Ｋb ＲＮＡ よりもはるかに少量であ
る。これらのバンドは２.６Ｋb ＲＮＡの前駆体または
関連遺伝子の産物でありうる。
【０２７４】VII．Ｉ．論議および結論 第２の哺乳動物甲状腺ホルモン受容体の分離は、以前の
生化学的研究が単一の甲状腺ホルモン受容体よりも多く
の受容体の存在を予告していないので、驚くべきことで
ある。振り返ってみると、多くの臨床生理学的研究は複
数の受容体の存在を示すものとして解釈することができ
る。機能的異質性の１つの形態は、家族性甲状腺ホルモ
ン抵抗（甲状腺ホルモンに対する末梢応答が喪失または
減少するが、神経細胞機能は維持される）を有する患者
の確認により示唆された（１２，１３）。さらに、循環
性甲状腺ホルモンの低レベルと関連した苛酷な発生学的
作用（クレチン病）は、神経系に強く影響を与えるタイ
プと周辺機能により劇的に作用するタイプとに分類され
た（１３，１４）。
生化学的研究が単一の甲状腺ホルモン受容体よりも多く
の受容体の存在を予告していないので、驚くべきことで
ある。振り返ってみると、多くの臨床生理学的研究は複
数の受容体の存在を示すものとして解釈することができ
る。機能的異質性の１つの形態は、家族性甲状腺ホルモ
ン抵抗（甲状腺ホルモンに対する末梢応答が喪失または
減少するが、神経細胞機能は維持される）を有する患者
の確認により示唆された（１２，１３）。さらに、循環
性甲状腺ホルモンの低レベルと関連した苛酷な発生学的
作用（クレチン病）は、神経系に強く影響を与えるタイ
プと周辺機能により劇的に作用するタイプとに分類され
た（１３，１４）。
【０２７５】構造的に異なる形の甲状腺ホルモン受容体
の存在を証明したのに加えて、我々が同定した受容体は
ラット中枢神経系において高レベルで発現される。in
situハイブリダイゼーションを利用する予備実験は海
馬、視床下部、大脳皮質および扁桃での高レベル発現を
明らかにした。ＲＮＡハイブリダイゼーション実験もま
た小脳において異例に高いレベルを示す。甲状腺ホルモ
ンは初期の脳発生において重要な役割を演ずることが知
られているが（１４）、この高レベル発現は予期されな
いことである。なぜならば、生化学的研究により、脳は
他の多くの組織よりも甲状腺ホルモン受容体が少なく
（５，１６）、しかも成人の脳はリン酸脱水素酵素活性
によって甲状腺ホルモンに応答しないことが示されたか
らである。（１７）。
の存在を証明したのに加えて、我々が同定した受容体は
ラット中枢神経系において高レベルで発現される。in
situハイブリダイゼーションを利用する予備実験は海
馬、視床下部、大脳皮質および扁桃での高レベル発現を
明らかにした。ＲＮＡハイブリダイゼーション実験もま
た小脳において異例に高いレベルを示す。甲状腺ホルモ
ンは初期の脳発生において重要な役割を演ずることが知
られているが（１４）、この高レベル発現は予期されな
いことである。なぜならば、生化学的研究により、脳は
他の多くの組織よりも甲状腺ホルモン受容体が少なく
（５，１６）、しかも成人の脳はリン酸脱水素酵素活性
によって甲状腺ホルモンに応答しないことが示されたか
らである。（１７）。
【０２７６】発現実験からの第２の興味ある結果は、こ
の転写物が肝臓に存在しないということである。肝臓は
通常甲状腺ホルモン受容体が分離される組織である。こ
の不在はさらに別の形の甲状腺ホルモン受容体の存在を
暗示している。この提案は、肝臓と心臓に薬理学的に区
別しうる甲状腺ホルモン応答が存在することを示すＵnd
erwoodらのデータ（１８）と一致するであろう。さら
に、ＤＮＡハイブリダイゼーション実験からのデータ
は、哺乳動物甲状腺ホルモン受容体のｃＤＮＡクローン
とハイブリダイズする複数の遺伝子座の存在を示し、異
なる関連遺伝子座が５つも存在しうることを示唆する
（実験の部IIIおよび文献８を参照）。これらの遺伝子
座のいくつかは恐らく別の機能分子をコードすると思わ
れ、このことは発生およびホメオスタシス機能をコント
ロールする遺伝子の重なり合ったネットワークを協調的
に調整する甲状腺ホルモン受容体のファミリーの存在を
うかがわせる。
の転写物が肝臓に存在しないということである。肝臓は
通常甲状腺ホルモン受容体が分離される組織である。こ
の不在はさらに別の形の甲状腺ホルモン受容体の存在を
暗示している。この提案は、肝臓と心臓に薬理学的に区
別しうる甲状腺ホルモン応答が存在することを示すＵnd
erwoodらのデータ（１８）と一致するであろう。さら
に、ＤＮＡハイブリダイゼーション実験からのデータ
は、哺乳動物甲状腺ホルモン受容体のｃＤＮＡクローン
とハイブリダイズする複数の遺伝子座の存在を示し、異
なる関連遺伝子座が５つも存在しうることを示唆する
（実験の部IIIおよび文献８を参照）。これらの遺伝子
座のいくつかは恐らく別の機能分子をコードすると思わ
れ、このことは発生およびホメオスタシス機能をコント
ロールする遺伝子の重なり合ったネットワークを協調的
に調整する甲状腺ホルモン受容体のファミリーの存在を
うかがわせる。
【０２７７】VII．Ｊ．実験の部VIIに関する図面の詳細
な説明 第４６（Ａ）および（Ｂ）図 ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地
図、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。
（Ａ）ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの
模式図；通常の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をいく
つか示す。斜線ボックスは推定されたコード領域を示
す。ハイブリダイゼーション実験で用いた５００bp Ｐv
uII フラグメント（ヌクレオチド位置６０７−１１１３
に相当する）は制限地図の下に実線で示す。（Ｂ）rbe
Ａ１２の完全なヌクレオチド配列を、長いオープン・リ
ーディング・フレーム上の推定アミノ酸配列と共に示
す。５’非翻訳領域内の３つの短いオープン・リーディ
ング・フレームは肉太の活字で示され、終結コドンには
アンダーラインが引いてある。クロ−ンrbeＡ１２はニ
ック・トランスレーションしたプローブとしてpheＡ４
（Ｓigma社）の全ＥcoＲＩ挿入物を用いて、Ｊ．Ａrriz
a から得たラット脳ｃＤＮＡライブラリーからの約１０
6 個のファージをスクリーニングすることにより分離し
た（１９）。３個の陽性クローンが分離され、そのうち
で最も大きいもの（rbeＡ１２）の完全ヌクレオチド配
列をＭaxam ＆ Ｇilbertの化学的切断法（２０）により
両鎖について決心した。
な説明 第４６（Ａ）および（Ｂ）図 ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地
図、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。
（Ａ）ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの
模式図；通常の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をいく
つか示す。斜線ボックスは推定されたコード領域を示
す。ハイブリダイゼーション実験で用いた５００bp Ｐv
uII フラグメント（ヌクレオチド位置６０７−１１１３
に相当する）は制限地図の下に実線で示す。（Ｂ）rbe
Ａ１２の完全なヌクレオチド配列を、長いオープン・リ
ーディング・フレーム上の推定アミノ酸配列と共に示
す。５’非翻訳領域内の３つの短いオープン・リーディ
ング・フレームは肉太の活字で示され、終結コドンには
アンダーラインが引いてある。クロ−ンrbeＡ１２はニ
ック・トランスレーションしたプローブとしてpheＡ４
（Ｓigma社）の全ＥcoＲＩ挿入物を用いて、Ｊ．Ａrriz
a から得たラット脳ｃＤＮＡライブラリーからの約１０
6 個のファージをスクリーニングすることにより分離し
た（１９）。３個の陽性クローンが分離され、そのうち
で最も大きいもの（rbeＡ１２）の完全ヌクレオチド配
列をＭaxam ＆ Ｇilbertの化学的切断法（２０）により
両鎖について決心した。
【０２７８】第４７図 ラット甲状腺ホルモン受容体（rＴＲα）蛋白質とヒト
甲状腺ホルモン受容体（hＴＲβ）およびニワトリ甲状
腺ホルモン受容体（cＴＲα）蛋白質との略図による比
較。ボックス上の番号はアミノ酸残基を示し；ボックス
内の数字は閉じた領域内の rＴＲα蛋白質とのアミノ酸
同一性のパーセントを示す。ＤＮＡはヒトグルココルチ
コイド受容体（アミノ酸４２１から４８６まで）との類
似性から推定されたＤＮＡ結合ドメインを表し、一方Ｔ
3／Ｔ4は推定上のホルモン結合ドメインを表す。
甲状腺ホルモン受容体（hＴＲβ）およびニワトリ甲状
腺ホルモン受容体（cＴＲα）蛋白質との略図による比
較。ボックス上の番号はアミノ酸残基を示し；ボックス
内の数字は閉じた領域内の rＴＲα蛋白質とのアミノ酸
同一性のパーセントを示す。ＤＮＡはヒトグルココルチ
コイド受容体（アミノ酸４２１から４８６まで）との類
似性から推定されたＤＮＡ結合ドメインを表し、一方Ｔ
3／Ｔ4は推定上のホルモン結合ドメインを表す。
【０２７９】第４８（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）図 rＴＲα遺伝子のサザンブロット分析およびヒト染色体
局在化。ヒト胎盤ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、
０.８％ アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース
へ移行させ、ＤＮＡ結合領域を含むrbeＡ１２由来の５
００bp ＰvuIIフラグメント（Ａ）または hＴＲβ由来
の４５０bp ＳstＩフラグメント(実験の部IIIを参照）
（Ｂ）とハイブリダイズさせた。両ブロットは５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ（０.１５Ｍ ＮaＣｌ、０.０
１Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4、０.００１Ｍ ＥＤＴＡ）、１×デ
ンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、およびサケ精子ＤＮＡ
（１００μｇ／ｍｌ）中４２℃でハイブリダイズさせ、
２×ＳＳＣ(standard saline citrate)および０.１％Ｓ
ＤＳを用いて６８℃で洗浄した。ラムダＨindIIIマーカ
ーのサイズをキロ塩基対で示す。（Ｃ）、 rＴＲα遺伝
子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレーザー
サイトフルオロメトリー（２１）で分離し、上記条件と
同じ条件下でrbeＡ１２の５００bp ＰvuIIフラグメント
とハイブリダイズさせた。
局在化。ヒト胎盤ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、
０.８％ アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース
へ移行させ、ＤＮＡ結合領域を含むrbeＡ１２由来の５
００bp ＰvuIIフラグメント（Ａ）または hＴＲβ由来
の４５０bp ＳstＩフラグメント(実験の部IIIを参照）
（Ｂ）とハイブリダイズさせた。両ブロットは５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ（０.１５Ｍ ＮaＣｌ、０.０
１Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4、０.００１Ｍ ＥＤＴＡ）、１×デ
ンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、およびサケ精子ＤＮＡ
（１００μｇ／ｍｌ）中４２℃でハイブリダイズさせ、
２×ＳＳＣ(standard saline citrate)および０.１％Ｓ
ＤＳを用いて６８℃で洗浄した。ラムダＨindIIIマーカ
ーのサイズをキロ塩基対で示す。（Ｃ）、 rＴＲα遺伝
子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレーザー
サイトフルオロメトリー（２１）で分離し、上記条件と
同じ条件下でrbeＡ１２の５００bp ＰvuIIフラグメント
とハイブリダイズさせた。
【０２８０】第４９（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 rＴＲαのin vitro翻訳および甲状腺ホルモン結合。
（Ａ）rＴＲαはin vitroで転写し、ウサギ網状赤血球
溶解液中で翻訳した。［35Ｓ］メチオニン標識産物は
７.５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、
フルオログラフィーで視覚化した。レーン１、添加ＲＮ
Ａなし；レーン２、全５'非翻訳領域を含むrbeＡ１２；
レーン３、９７bp の５’非翻訳配列のみを含む rbeＡ
１２Ｂ。蛋白質マーカーのサイズ：ウシ血清アルブミ
ン、６６．２ＫＤ；卵アルブミン、４５ＫＤ；カルボニ
ックアンヒドラーゼ、３１ＫＤ。（Ｂ）in vitro 翻訳
したrＴＲαに対する125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチャード
分析。in vitro 翻訳したrbeＡ１２Ｂ転写物を含む溶解
液は、125Ｉ−Ｔ3の異なる濃度で結合したホルモン量を
測定することにより、甲状腺ホルモン結合活性について
検定した。Ｋd＝２.９×１０-11Ｍ。（Ｃ）in vitro翻
訳した rＴＲαへの125Ｉ−Ｔ3結合に対する甲状腺ホル
モン類似体の競合。rbeＡ１２Ｂ プログラム化溶解液か
らの試料は、標識ホルモンと競合させるべく次第に増加
する濃度の未標識甲状腺ホルモンまたは類似体と混合し
た。特異的に結合した125Ｉ−Ｔ3は競合化合物の濃度に
対してプロットする。４つの別々の実験において同じ競
合パターンが観察された。in vitro転写／翻訳およびホ
ルモン結合は記載した通りに行った（２２，２３）。白
の円はＴＲＩＡＣ、黒の円はＬ−Ｔ3、黒の三角形はＬ
−Ｔ4を表す。
（Ａ）rＴＲαはin vitroで転写し、ウサギ網状赤血球
溶解液中で翻訳した。［35Ｓ］メチオニン標識産物は
７.５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、
フルオログラフィーで視覚化した。レーン１、添加ＲＮ
Ａなし；レーン２、全５'非翻訳領域を含むrbeＡ１２；
レーン３、９７bp の５’非翻訳配列のみを含む rbeＡ
１２Ｂ。蛋白質マーカーのサイズ：ウシ血清アルブミ
ン、６６．２ＫＤ；卵アルブミン、４５ＫＤ；カルボニ
ックアンヒドラーゼ、３１ＫＤ。（Ｂ）in vitro 翻訳
したrＴＲαに対する125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチャード
分析。in vitro 翻訳したrbeＡ１２Ｂ転写物を含む溶解
液は、125Ｉ−Ｔ3の異なる濃度で結合したホルモン量を
測定することにより、甲状腺ホルモン結合活性について
検定した。Ｋd＝２.９×１０-11Ｍ。（Ｃ）in vitro翻
訳した rＴＲαへの125Ｉ−Ｔ3結合に対する甲状腺ホル
モン類似体の競合。rbeＡ１２Ｂ プログラム化溶解液か
らの試料は、標識ホルモンと競合させるべく次第に増加
する濃度の未標識甲状腺ホルモンまたは類似体と混合し
た。特異的に結合した125Ｉ−Ｔ3は競合化合物の濃度に
対してプロットする。４つの別々の実験において同じ競
合パターンが観察された。in vitro転写／翻訳およびホ
ルモン結合は記載した通りに行った（２２，２３）。白
の円はＴＲＩＡＣ、黒の円はＬ−Ｔ3、黒の三角形はＬ
−Ｔ4を表す。
【０２８１】第５０図 rＴＲαｍＲＮＡの組織分布。全ＲＮＡはグアニジンチ
オシアネートを用いて種々のラット組織から分離し（２
４）、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離
し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてrbeＡ１２由
来のニック・トランスレーションした５００bp ＰvuII
フラグメントとハイブリダイズさせた。組織型および負
荷した全ＲＮＡ量を各レーンの上に示す。ＣＨＯ−Ｂの
ｃＤＮＡ（試験したすべての組織において等しいレベル
で発現されたチャイニーズハムスター卵巣細胞ｍＲＮ
Ａ）（２５）を内部標準として使用した。２８Ｓおよび
１８ＳリボソームＲＮＡの位置を示す。
オシアネートを用いて種々のラット組織から分離し（２
４）、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離
し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてrbeＡ１２由
来のニック・トランスレーションした５００bp ＰvuII
フラグメントとハイブリダイズさせた。組織型および負
荷した全ＲＮＡ量を各レーンの上に示す。ＣＨＯ−Ｂの
ｃＤＮＡ（試験したすべての組織において等しいレベル
で発現されたチャイニーズハムスター卵巣細胞ｍＲＮ
Ａ）（２５）を内部標準として使用した。２８Ｓおよび
１８ＳリボソームＲＮＡの位置を示す。
【０２８２】VII．Ｋ．実験の部VIIで引用した文献 １．Ｗolff，Ｅ．Ｃ．and Ｗolff，Ｊ．in Ｔhe Ｔh
yroid Ｇland，Ｐitt−Ｒivers，Ｒ．Ｖ．and Ｔrott
er，Ｗ．Ｒ．，Ｅds．（Ｂutterworths，Ｌondon，196
4），vol.１，pp．237−282；Ｓchwartz， Ｈ.Ｌ.，in
Ｍolecular Ｂas is of Ｔhyroid Ｈormone Ａctio
n，Ｏppenheimer，Ｊ．Ｈ．and Ｓamuels，Ｈ．Ｈ．，
Ｅds．（Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork，13），pp．4
13−444。 ２．Ｅberhardt，Ｎ.Ｌ．，Ａpriletti，Ｊ．Ｗ.，Ｂax
ter，Ｊ．Ｅ.，in Ｂioc hemical Ａctions of Ｈorm
ones，Ｌiewack，Ｇ．，Ｅd． （Ａcademic Ｐress，
Ｎew Ｙork，1980），vol.7，pp．311−394。 ３．Ｏppenheimer,Ｊ.Ｈ.，Ｋoerner，Ｄ.，Ｓchwart
z，Ｈ.Ｌ.，Ｓurks，Ｍ．Ｊ.Ｊ.，Ｊ.Ｃlin．Ｅndocrin
al Ｍetab.，35：330（1972)；Ｓamuels，Ｈ.Ｈ．and
Ｔsai，Ｊ.Ｓ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.
Ａ.， 70：3488（1973）。 ４．Ｔata，Ｊ.Ｒ．and Ｗidnell，Ｃ.Ｃ.，Ｂioche
m．Ｊ.，98：604（1966）；Ｍartial，Ｊ.Ａ.，Ｂaxte
r，Ｊ.Ｄ.，Ｇoodman，Ｈ.Ｍ.，Ｓeeburg，Ｐ.Ｈ.，Ｐr
oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，74：1816（197
7）；Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，Ｂimberg，Ｎ.Ｃ.，Ｒosenfel
d，Ｍ.Ｇ.，ibid.，79：7659（1982）。 ５．Ｓchwartz，Ｈ.Ｌ.，and Ｏppenheimer，Ｊ.Ｈ.，
Ｅndocrinology，103：267（1978）。 ６．Ｗeinberger，Ｃ.，et al.，Ｎature，324：641
（1986）。 ７．Ｓap，Ｊ．et al.，ibid.，p.635。 ８．Ｓpurr，Ｎ.Ｋ.，et al．ＥＭＢＯ Ｊ.，3：159
（1984）；Ｄayton，Ａ．Ｊ．et al．Ｐroc．Ｎatl．Ａ
cad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，81：4495（1984）； Ｊhanwa
r，Ｓ.Ｃ.，Ｃhaganti，Ｒ．Ｓ．Ｋ.，Ｃroce，Ｃ.
Ｍ.，Ｓomaric ＣellＭol．Ｇenet．，11：99（198
5）。 ９．Ｇiguere，Ｖ.，Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｒosenfel
d，Ｍ.Ｇ.，Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，Ｃell，46：645（198
6）。 10．Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｇiguere，Ｖ.，Ｓegui，
Ｐ.，Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，ib id.，49：39（1987）。 11．Ｋumar，Ｖ.，Ｇreen，Ｓ.，Ｓtaud，Ａ.，Ｃhambo
n，Ｐ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：2231（1986）。 12．Ｍenezes−Ｆerreira，Ｍ．Ｍ．，Ｂil，Ｃ.,Ｗort
sman，Ｊ.，Ｗeintraub,Ｂ．Ｄ.,Ｊ．Ｃlin．Ｅndocrin
al Ｍetab.,59；1081（1984）。 13．Ｂurrow，Ｇ.Ｎ.，in Ｅndocrinology and Ｍeta
bolism，Ｆelig，Ｐ.,Ｂaxter，Ｊ.Ｄ.，Ｂroadhus，
Ａ.Ｅ.,Ｆrohman,Ｌ.Ａ.，Ｅds.（ＭcＧraw −Ｈill，
Ｎew Ｙork，1981），pp．351−385。 14. ＤeＧroot，Ｌ.Ｊ. and Ｓtanbury，Ｊ.Ｂ.，Ｔhe
Ｔhyroid and Ｉt’s Ｄiseases （Ｗiley，Ｎew Ｙor
k，ed．4，1975）。 15. Ｂayrs，Ｊ．Ｔ.,Ｂr.Ｊ．Ａnim．Ｂehav.,1：144
（1953)；Ｆord，Ｄ.Ｈ．and Ｃramer，Ｅ.Ｂ.，in Ｔh
yroid Ｈormones and Ｂrain Ｄevelopment，Ｇrave，
Ｇ.,Ｅd．(Ｒaven，Ｎew Ｙork，1977）．pp. 1−17。 16. Ｏppenheimer，Ｊ.Ｈ.,Ｓchwartz,Ｈ.Ｌ.,Ｓurks,
Ｍ.Ｉ.,Ｅndocrinology，95：895(1974)。 17. Ｂarker，Ｓ.Ｐ．and Ｋlitgaard，Ｈ.Ｍ.，Ａm.
Ｊ.Ｐhysiol.,170：80（1952）；Ｌee，Ｙ．Ｐ．and
Ｌardy，Ｈ．Ａ.,Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.,240： 1427(196
5)。 18. Ｕnderwood，Ａ．Ｈ．et al.,Ｎature，324:425(19
86)。 19. ラット脳ｃＤＮＡライブラリーは全ライブラリー脳
からオリゴ(ｄＴ)選別ＲＮＡを用いて作製された。第１
鎖合成のためにモロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−Ｍ
n ＬＶ）の逆転写酵素（ＲＴ）を使用し；第２鎖合成は
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用し、その後
Ｍ−Ｍn ＬＶ ＲＴ−cＤＮＡはＳＩヌクレアーゼで処理
し、メチル化し、セファロース４Ｂ上でサイズにより分
画化し、ラムダgtIIアームへ連結し、そしてパッケージ
ングを行った。このライブラリーは５００bp 以上の挿
入物を含む２５×１０6個の独立した組換え体から成
る。 20. Ｍaxam，Ａ.Ｍ. and Ｇilbert,Ｗ.,Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,74：560（1977）。 21. Ｌebo，Ｒ．Ｖ.et al．,Ｓcience，225：57（198
4）。 22. Ｋrieg，Ｐ．Ａ．and Ｍelton，Ｄ．Ａ.,Ｎucleic
Ａcids Ｒes，12：7057（1984）；Ｈollenberg，Ｓ.
Ｍ．et al.，Ｎature，318：635（1985）。 23. in vitro転写のために、rbeＡ１２の全ＥcoＲＩ挿
入物は pＧＥＭ１(Promega Ｂiotec 社）にクローニン
グした。２２７bpの５’非翻訳配列を欠く第２構築物
（rbeＡ１２Ｂ）は、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼ修復したrb
eＡ１２のＢglI−ＳmaＩフラグメント（ヌクレオチド位
置２２７からポリリンカーまで）を pＧＥＭ３のＳmaＩ
部位に挿入することにより作製した。甲状腺ホルモン結
合のために、転写はＳＰ６ポリメラーゼおよびＳstＩで
線状化したrbe Ａ１２Ｂ５〜１０μgを用いて行った。
転写物はＰ６０クロマトグラフィーで精製し、１５０〜
２００μｌのウサギ網状赤血球溶解液（Ｐromege Ｂiot
ec社）中で製造者の指示した条件下に翻訳した。スカッ
チード分析および競合分析の両方において、甲状腺ホル
モン結合は同じ方法で測定した（但し、スカッチャード
分析の場合には未標識蛋白質を使用した。）。
〔125Ｉ〕３，３’５−トリヨードチロニン（Ｎew Engl
andＮuclear社、2220Ｃi／m mol、最終濃度0.3nＭ）は
Ｔ3結合緩衝液中でin vitro合成したrＴＲαポリペプ
チド（結合反応あたり溶解液２００μｌの５〜８μｌ）
と０℃で２時間２５０μｌの最終容量にて混合した。特
異的ホルモン結合は 1000倍過剰未標識ホルモンを加え
ることにより測定し、セファデックスＧ−２５ファイン
（Ｐharmacia社）0.9×4.0cmカラムから排除容量中に溶
出される放射能をカウントすることにより検定した。 24. Ｃhirgwin，Ｊ.Ｍ.,Ｐrzbyla，Ａ.Ｆ.,ＭacDonal
d，Ｒ.Ｊ.，Ｒutter，Ｗ．Ｆ.，Ｂiochemistry，18：52
94（1974）。 25. Ｈarpold,Ｍ．Ｍ.,Ｅvans，Ｒ．Ｍ.,Ｓalditt−Ｇo
eorgieff，Ｍ.,Ｄarnell，Ｊ．Ｅ．，Ｃell，17：1025
（1979）。
yroid Ｇland，Ｐitt−Ｒivers，Ｒ．Ｖ．and Ｔrott
er，Ｗ．Ｒ．，Ｅds．（Ｂutterworths，Ｌondon，196
4），vol.１，pp．237−282；Ｓchwartz， Ｈ.Ｌ.，in
Ｍolecular Ｂas is of Ｔhyroid Ｈormone Ａctio
n，Ｏppenheimer，Ｊ．Ｈ．and Ｓamuels，Ｈ．Ｈ．，
Ｅds．（Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork，13），pp．4
13−444。 ２．Ｅberhardt，Ｎ.Ｌ．，Ａpriletti，Ｊ．Ｗ.，Ｂax
ter，Ｊ．Ｅ.，in Ｂioc hemical Ａctions of Ｈorm
ones，Ｌiewack，Ｇ．，Ｅd． （Ａcademic Ｐress，
Ｎew Ｙork，1980），vol.7，pp．311−394。 ３．Ｏppenheimer,Ｊ.Ｈ.，Ｋoerner，Ｄ.，Ｓchwart
z，Ｈ.Ｌ.，Ｓurks，Ｍ．Ｊ.Ｊ.，Ｊ.Ｃlin．Ｅndocrin
al Ｍetab.，35：330（1972)；Ｓamuels，Ｈ.Ｈ．and
Ｔsai，Ｊ.Ｓ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.
Ａ.， 70：3488（1973）。 ４．Ｔata，Ｊ.Ｒ．and Ｗidnell，Ｃ.Ｃ.，Ｂioche
m．Ｊ.，98：604（1966）；Ｍartial，Ｊ.Ａ.，Ｂaxte
r，Ｊ.Ｄ.，Ｇoodman，Ｈ.Ｍ.，Ｓeeburg，Ｐ.Ｈ.，Ｐr
oc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，74：1816（197
7）；Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，Ｂimberg，Ｎ.Ｃ.，Ｒosenfel
d，Ｍ.Ｇ.，ibid.，79：7659（1982）。 ５．Ｓchwartz，Ｈ.Ｌ.，and Ｏppenheimer，Ｊ.Ｈ.，
Ｅndocrinology，103：267（1978）。 ６．Ｗeinberger，Ｃ.，et al.，Ｎature，324：641
（1986）。 ７．Ｓap，Ｊ．et al.，ibid.，p.635。 ８．Ｓpurr，Ｎ.Ｋ.，et al．ＥＭＢＯ Ｊ.，3：159
（1984）；Ｄayton，Ａ．Ｊ．et al．Ｐroc．Ｎatl．Ａ
cad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，81：4495（1984）； Ｊhanwa
r，Ｓ.Ｃ.，Ｃhaganti，Ｒ．Ｓ．Ｋ.，Ｃroce，Ｃ.
Ｍ.，Ｓomaric ＣellＭol．Ｇenet．，11：99（198
5）。 ９．Ｇiguere，Ｖ.，Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｒosenfel
d，Ｍ.Ｇ.，Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，Ｃell，46：645（198
6）。 10．Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｇiguere，Ｖ.，Ｓegui，
Ｐ.，Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，ib id.，49：39（1987）。 11．Ｋumar，Ｖ.，Ｇreen，Ｓ.，Ｓtaud，Ａ.，Ｃhambo
n，Ｐ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，5：2231（1986）。 12．Ｍenezes−Ｆerreira，Ｍ．Ｍ．，Ｂil，Ｃ.,Ｗort
sman，Ｊ.，Ｗeintraub,Ｂ．Ｄ.,Ｊ．Ｃlin．Ｅndocrin
al Ｍetab.,59；1081（1984）。 13．Ｂurrow，Ｇ.Ｎ.，in Ｅndocrinology and Ｍeta
bolism，Ｆelig，Ｐ.,Ｂaxter，Ｊ.Ｄ.，Ｂroadhus，
Ａ.Ｅ.,Ｆrohman,Ｌ.Ａ.，Ｅds.（ＭcＧraw −Ｈill，
Ｎew Ｙork，1981），pp．351−385。 14. ＤeＧroot，Ｌ.Ｊ. and Ｓtanbury，Ｊ.Ｂ.，Ｔhe
Ｔhyroid and Ｉt’s Ｄiseases （Ｗiley，Ｎew Ｙor
k，ed．4，1975）。 15. Ｂayrs，Ｊ．Ｔ.,Ｂr.Ｊ．Ａnim．Ｂehav.,1：144
（1953)；Ｆord，Ｄ.Ｈ．and Ｃramer，Ｅ.Ｂ.，in Ｔh
yroid Ｈormones and Ｂrain Ｄevelopment，Ｇrave，
Ｇ.,Ｅd．(Ｒaven，Ｎew Ｙork，1977）．pp. 1−17。 16. Ｏppenheimer，Ｊ.Ｈ.,Ｓchwartz,Ｈ.Ｌ.,Ｓurks,
Ｍ.Ｉ.,Ｅndocrinology，95：895(1974)。 17. Ｂarker，Ｓ.Ｐ．and Ｋlitgaard，Ｈ.Ｍ.，Ａm.
Ｊ.Ｐhysiol.,170：80（1952）；Ｌee，Ｙ．Ｐ．and
Ｌardy，Ｈ．Ａ.,Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.,240： 1427(196
5)。 18. Ｕnderwood，Ａ．Ｈ．et al.,Ｎature，324:425(19
86)。 19. ラット脳ｃＤＮＡライブラリーは全ライブラリー脳
からオリゴ(ｄＴ)選別ＲＮＡを用いて作製された。第１
鎖合成のためにモロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−Ｍ
n ＬＶ）の逆転写酵素（ＲＴ）を使用し；第２鎖合成は
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用し、その後
Ｍ−Ｍn ＬＶ ＲＴ−cＤＮＡはＳＩヌクレアーゼで処理
し、メチル化し、セファロース４Ｂ上でサイズにより分
画化し、ラムダgtIIアームへ連結し、そしてパッケージ
ングを行った。このライブラリーは５００bp 以上の挿
入物を含む２５×１０6個の独立した組換え体から成
る。 20. Ｍaxam，Ａ.Ｍ. and Ｇilbert,Ｗ.,Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,74：560（1977）。 21. Ｌebo，Ｒ．Ｖ.et al．,Ｓcience，225：57（198
4）。 22. Ｋrieg，Ｐ．Ａ．and Ｍelton，Ｄ．Ａ.,Ｎucleic
Ａcids Ｒes，12：7057（1984）；Ｈollenberg，Ｓ.
Ｍ．et al.，Ｎature，318：635（1985）。 23. in vitro転写のために、rbeＡ１２の全ＥcoＲＩ挿
入物は pＧＥＭ１(Promega Ｂiotec 社）にクローニン
グした。２２７bpの５’非翻訳配列を欠く第２構築物
（rbeＡ１２Ｂ）は、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼ修復したrb
eＡ１２のＢglI−ＳmaＩフラグメント（ヌクレオチド位
置２２７からポリリンカーまで）を pＧＥＭ３のＳmaＩ
部位に挿入することにより作製した。甲状腺ホルモン結
合のために、転写はＳＰ６ポリメラーゼおよびＳstＩで
線状化したrbe Ａ１２Ｂ５〜１０μgを用いて行った。
転写物はＰ６０クロマトグラフィーで精製し、１５０〜
２００μｌのウサギ網状赤血球溶解液（Ｐromege Ｂiot
ec社）中で製造者の指示した条件下に翻訳した。スカッ
チード分析および競合分析の両方において、甲状腺ホル
モン結合は同じ方法で測定した（但し、スカッチャード
分析の場合には未標識蛋白質を使用した。）。
〔125Ｉ〕３，３’５−トリヨードチロニン（Ｎew Engl
andＮuclear社、2220Ｃi／m mol、最終濃度0.3nＭ）は
Ｔ3結合緩衝液中でin vitro合成したrＴＲαポリペプ
チド（結合反応あたり溶解液２００μｌの５〜８μｌ）
と０℃で２時間２５０μｌの最終容量にて混合した。特
異的ホルモン結合は 1000倍過剰未標識ホルモンを加え
ることにより測定し、セファデックスＧ−２５ファイン
（Ｐharmacia社）0.9×4.0cmカラムから排除容量中に溶
出される放射能をカウントすることにより検定した。 24. Ｃhirgwin，Ｊ.Ｍ.,Ｐrzbyla，Ａ.Ｆ.,ＭacDonal
d，Ｒ.Ｊ.，Ｒutter，Ｗ．Ｆ.，Ｂiochemistry，18：52
94（1974）。 25. Ｈarpold,Ｍ．Ｍ.,Ｅvans，Ｒ．Ｍ.,Ｓalditt−Ｇo
eorgieff，Ｍ.,Ｄarnell，Ｊ．Ｅ．，Ｃell，17：1025
（1979）。
【０２８３】明細書の要約 前述の説明により、当分野で通常の知識を有する者は、
本発明がグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコ
イド受容体または甲状腺ホルモン受容体のホルモン結合
特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質をコ
ードする配列から成る実質的に純粋なＤＮＡを提供する
ことを理解できるであろう。本発明はまた本発明ＤＮＡ
の実例となる受容体配列を含む種々のプラスミドを提供
する。本発明の代表的なプラスミドは特許目的のために
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
された。
本発明がグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコ
イド受容体または甲状腺ホルモン受容体のホルモン結合
特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質をコ
ードする配列から成る実質的に純粋なＤＮＡを提供する
ことを理解できるであろう。本発明はまた本発明ＤＮＡ
の実例となる受容体配列を含む種々のプラスミドを提供
する。本発明の代表的なプラスミドは特許目的のために
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
された。
【０２８４】本発明はさらに本発明ＤＮＡ（またはｍＲ
ＮＡ）から発現された受容体蛋白質（その修飾された機
能形体を含む）を提供する。
ＮＡ）から発現された受容体蛋白質（その修飾された機
能形体を含む）を提供する。
【０２８５】新規な受容体ＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白質
組成物に加えて、本発明は受容体蛋白質の機能性を調べ
るためのバイオアッセイを包含する。それはまた遺伝子
工学的に処理された細胞において所望蛋白質を生産する
ための２つの新しい方法を包含する。第１の方法は受容
体と結合したホルモンによって転写が活性化される遺伝
子の転写を誘発する方法である。第２の方法は細胞を遺
伝子工学的に操作し、その後受容体蛋白質と結合したホ
ルモンによって転写が活性化される遺伝子によりコード
される蛋白質の生産を増大し且つ制御する方法である。
組成物に加えて、本発明は受容体蛋白質の機能性を調べ
るためのバイオアッセイを包含する。それはまた遺伝子
工学的に処理された細胞において所望蛋白質を生産する
ための２つの新しい方法を包含する。第１の方法は受容
体と結合したホルモンによって転写が活性化される遺伝
子の転写を誘発する方法である。第２の方法は細胞を遺
伝子工学的に操作し、その後受容体蛋白質と結合したホ
ルモンによって転写が活性化される遺伝子によりコード
される蛋白質の生産を増大し且つ制御する方法である。
【０２８６】本発明ＤＮＡは、ホルモン受容体蛋白質お
よびその機能的修飾体を以前には不可能であった量で生
産させるべく使用できる。本発明の結果として利用し得
る受容体の量を用いれば、今やこの蛋白質の詳細な構造
解析が受容体結晶を分析するＸ線回折法により可能であ
る。さらに、受容体体蛋白質の十分な供給は、重合体−
アゴニストまたは受容体−アンタゴニスト活性について
多くの化合物をスクリーニングするために、それらを使
用しうることを意味している。また、受容体蛋白質の利
用可能性は、診断検定においてそれらを使用しうること
を意味している。
よびその機能的修飾体を以前には不可能であった量で生
産させるべく使用できる。本発明の結果として利用し得
る受容体の量を用いれば、今やこの蛋白質の詳細な構造
解析が受容体結晶を分析するＸ線回折法により可能であ
る。さらに、受容体体蛋白質の十分な供給は、重合体−
アゴニストまたは受容体−アンタゴニスト活性について
多くの化合物をスクリーニングするために、それらを使
用しうることを意味している。また、受容体蛋白質の利
用可能性は、診断検定においてそれらを使用しうること
を意味している。
【０２８７】本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく、当業者は多種多様の用法および条件に適合させる
べく本発明をいろいろに変更および修飾することができ
る。これらの変更および修飾は当然であり、公正であ
り、そして次の請求の範囲の均等の範囲内に含まれるも
のである。
なく、当業者は多種多様の用法および条件に適合させる
べく本発明をいろいろに変更および修飾することができ
る。これらの変更および修飾は当然であり、公正であ
り、そして次の請求の範囲の均等の範囲内に含まれるも
のである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤ
ＮＡ配列決定法を示す図である。
ＮＡ配列決定法を示す図である。
【図２】 図２は、ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤ
ＮＡクローンの模式図を示す図である。
ＮＡクローンの模式図を示す図である。
【図３】 図３は、ヒトグルココルチコイド受容体（ｈ
ＧＲ）のｃＤＮＡおよび推定一次蛋白質配列を示す図で
ある。（配列Ｉ−２は２部分に分かれている：図３およ
び図４）。
ＧＲ）のｃＤＮＡおよび推定一次蛋白質配列を示す図で
ある。（配列Ｉ−２は２部分に分かれている：図３およ
び図４）。
【図４】 図４は、ヒトグルココルチコイド受容体（ｈ
ＧＲ）のｃＤＮＡおよび推定一次蛋白質配列を示す図で
ある。（配列Ｉ−２は２部分に分かれている：図３およ
び図４）。
ＧＲ）のｃＤＮＡおよび推定一次蛋白質配列を示す図で
ある。（配列Ｉ−２は２部分に分かれている：図３およ
び図４）。
【図５】 図５Ａは、ヒトグルココルチコイド受容体β
−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’末端の制限地図を示す
図である。図５Ｂは、ヒトグルココルチコイド受容体β
−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’末端のヌクレオチド配
列を示す図である。
−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’末端の制限地図を示す
図である。図５Ｂは、ヒトグルココルチコイド受容体β
−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’末端のヌクレオチド配
列を示す図である。
【図６】 図６ＡおよびＢは、インビトロで翻訳された
ｈＧＲと細胞抽出物からのインビボｈＧＲとのイムノブ
ロット比較に関する図である。図６Ａは、ｈＧＲｃＤＮ
Ａ配列のインビトロ転写のために構成されたベクターを
示す図である。図６Ｂは、インビトロ翻訳生成物および
細胞抽出物のウェスターンブロット分析を示す、電気泳
動を表す写真図面である。
ｈＧＲと細胞抽出物からのインビボｈＧＲとのイムノブ
ロット比較に関する図である。図６Ａは、ｈＧＲｃＤＮ
Ａ配列のインビトロ転写のために構成されたベクターを
示す図である。図６Ｂは、インビトロ翻訳生成物および
細胞抽出物のウェスターンブロット分析を示す、電気泳
動を表す写真図面である。
【図７】 図７は、インビトロで翻訳されたアルファ−
ｈＧＲ（ＧＲ１０７）のステロイド結合を示すグラフで
ある。
ｈＧＲ（ＧＲ１０７）のステロイド結合を示すグラフで
ある。
【図８】 図８Ａは、発現プラスミド pＧＥＲＲ１の模
式図である。図８Ｂは、発現プラスミド pＧＥＲＲ２の
模式図である。プラスミド pＧＥＲＲ１はエストロゲン
関連受容体ｈＧＲＲ１の発現に用いられ； pＧＥＲＲ２
はｈＥＲＲ２の発現に用いられた。
式図である。図８Ｂは、発現プラスミド pＧＥＲＲ２の
模式図である。プラスミド pＧＥＲＲ１はエストロゲン
関連受容体ｈＧＲＲ１の発現に用いられ； pＧＥＲＲ２
はｈＥＲＲ２の発現に用いられた。
【図９】 図９は、ｈＧＲ機能的アッセイ法を模式的に
表わした図である。
表わした図である。
【図１０】 図１０は、ｈＧＲ蛋白質の発現を表わすウ
ェスタンブロット分析を示す、電気泳動を表す写真図面
である。
ェスタンブロット分析を示す、電気泳動を表す写真図面
である。
【図１１】 図１１は、ｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導
を示すブロットを示す、電気泳動を表す写真図面であ
る。
を示すブロットを示す、電気泳動を表す写真図面であ
る。
【図１２】 図１２ＡおよびＢは、ｈＧＲによるＣＡＴ
活性の誘導を示すグラフである。図１２Ａは、ｐＲＳｈ
ＧＲαのＤＥＸに対する用量応答を示し、図１２Ｂはｐ
ＲＳｈＧＲαの滴定を示す。
活性の誘導を示すグラフである。図１２Ａは、ｐＲＳｈ
ＧＲαのＤＥＸに対する用量応答を示し、図１２Ｂはｐ
ＲＳｈＧＲαの滴定を示す。
【図１３】 図１３は、ｈＧＲにおける機能区の位置を
示す模式図である。
示す模式図である。
【図１４】 図１４は、ヒト胎盤 c−erb−ＡｃＤＮＡ
の制限地図および配列決定法を示す図である。
の制限地図および配列決定法を示す図である。
【図１５】 図１５は、ヒト胎盤 c−erb−ＡｃＤＮＡ
のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。（配列
III−１Ｂは２部分に分かれている：図１５および図１
６）。
のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。（配列
III−１Ｂは２部分に分かれている：図１５および図１
６）。
【図１６】 図１６は、ヒト胎盤 c−erb−ＡｃＤＮＡ
のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。（配列
III−１Ｂは２部分に分かれている：図１５および図１
６）。
のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。（配列
III−１Ｂは２部分に分かれている：図１５および図１
６）。
【図１７】 図１７は、v−erb−Ａ発癌遺伝子生成物、
ヒト胎盤 c−erb−Ａポリペプチド、ならびにヒトグル
ココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ
末端部分間のアミノ酸配列比較を示す図である。
ヒト胎盤 c−erb−Ａポリペプチド、ならびにヒトグル
ココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ
末端部分間のアミノ酸配列比較を示す図である。
【図１８】 図１８Ａ、ＢおよびＣは、c−erb−Ａ Ｄ
ＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサザーン分析およ
び染色体マッピングを示すブロットを示す、電気泳動を
表す写真図面である。図１８Ａは、エンドヌクレアーゼ
により消化し、アガロースゲル上で分離したヒト満期胎
盤ＤＮＡを示す。図１８Ｂは、c−erb−Ａ をプローブ
として用いた胎盤ＤＮＡの分析を示す。図１８Ｃは、ヒ
ト c−e rb−Ａ 遺伝子の染色体マッピングを示す。
ＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサザーン分析およ
び染色体マッピングを示すブロットを示す、電気泳動を
表す写真図面である。図１８Ａは、エンドヌクレアーゼ
により消化し、アガロースゲル上で分離したヒト満期胎
盤ＤＮＡを示す。図１８Ｂは、c−erb−Ａ をプローブ
として用いた胎盤ＤＮＡの分析を示す。図１８Ｃは、ヒ
ト c−e rb−Ａ 遺伝子の染色体マッピングを示す。
【図１９】 図１９ＡおよびＢは、ヒト c−erb−Ａ 発
現を示す、電気泳動を表す写真図面である。図１９Ａ
は、ヒト細胞系およびヒト胎盤から得たＲＮＡのノーザ
ン分析を示すブロットである。図１９Ｂは、インビトロ
における erb−Ａポリペプチドの合成を示す。
現を示す、電気泳動を表す写真図面である。図１９Ａ
は、ヒト細胞系およびヒト胎盤から得たＲＮＡのノーザ
ン分析を示すブロットである。図１９Ｂは、インビトロ
における erb−Ａポリペプチドの合成を示す。
【図２０】 図２０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、インビトロ
で合成された erb−Ａポリペプチドへの甲状腺ホルモン
の結合に関連する４種のグラフである。図２０Ａは、イ
ンビトロで形成された erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ
−Ｔ3の結合のスカッチャード（Ｓcatchard）分析であ
る。図２０Ｂは、インビトロにおける甲状腺ホルモン同
族体の競合を示す。図２０Ｃは、インビトロで合成され
た erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ−Ｔ3結合に対するト
リヨードチロニン異性体の競合を示す。図２０Ｄは、0.
4 ＫＣｌＨeＬa 細胞核抽出物への125Ｉ−Ｔ3結合に対
する甲状腺ホルモン同族体の競合を示す。
で合成された erb−Ａポリペプチドへの甲状腺ホルモン
の結合に関連する４種のグラフである。図２０Ａは、イ
ンビトロで形成された erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ
−Ｔ3の結合のスカッチャード（Ｓcatchard）分析であ
る。図２０Ｂは、インビトロにおける甲状腺ホルモン同
族体の競合を示す。図２０Ｃは、インビトロで合成され
た erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ−Ｔ3結合に対するト
リヨードチロニン異性体の競合を示す。図２０Ｄは、0.
4 ＫＣｌＨeＬa 細胞核抽出物への125Ｉ−Ｔ3結合に対
する甲状腺ホルモン同族体の競合を示す。
【図２１】 図２１は、ステロイドホルモンおよび甲状
腺ホルモン受容体を比較した模式図である。
腺ホルモン受容体を比較した模式図である。
【図２２】 図２２は、ヒト甲状腺ホルモン受容体ｈＥ
ＲＢＡ 8.7のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定一次
蛋白質配列を示す図である。（甲状腺ホルモン受容体 h
ＦＡ８の配列はｈＥＲＢＡ 8.7に関連がある。発明の説
明の項を参照されたい）。
ＲＢＡ 8.7のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定一次
蛋白質配列を示す図である。（甲状腺ホルモン受容体 h
ＦＡ８の配列はｈＥＲＢＡ 8.7に関連がある。発明の説
明の項を参照されたい）。
【図２３】 図２３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ｈＧＲ遺伝
子に関連するゲノム配列の単離に関する図である。図２
３Ａは、指示されたヌクレアーゼにより消化したヒト胎
盤ＤＮＡの高ストリンジェンシーサザーン分析を示す、
電気泳動を表す写真図面である。図２３Ｂは、指示され
たヌクレアーゼにより消化したヒト胎盤ＤＮＡの低スト
リンジェンシーサザーン分析を示す、電気泳動を表す写
真図面である。図２３Ｃ図は、ラムダＨＧＨと表示され
るクローンにおけるゲノム配列の単離を示すサザーンブ
ロットを示す、電気泳動を表す写真図面である。図２３
Ｄは、ラムダＨＧＨゲノム断片のイントロン−エクソン
構造およびそれとｈＧＲとの相同を示す模式図である。
子に関連するゲノム配列の単離に関する図である。図２
３Ａは、指示されたヌクレアーゼにより消化したヒト胎
盤ＤＮＡの高ストリンジェンシーサザーン分析を示す、
電気泳動を表す写真図面である。図２３Ｂは、指示され
たヌクレアーゼにより消化したヒト胎盤ＤＮＡの低スト
リンジェンシーサザーン分析を示す、電気泳動を表す写
真図面である。図２３Ｃ図は、ラムダＨＧＨと表示され
るクローンにおけるゲノム配列の単離を示すサザーンブ
ロットを示す、電気泳動を表す写真図面である。図２３
Ｄは、ラムダＨＧＨゲノム断片のイントロン−エクソン
構造およびそれとｈＧＲとの相同を示す模式図である。
【図２４】 図２４は、ヒトミネラロコルチコイド受容
体のｃＤＮＡの若干の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
の線図と並んだｈＭＲの複合構造を示す。
体のｃＤＮＡの若干の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
の線図と並んだｈＭＲの複合構造を示す。
【図２５】 図２５は、ヒトミネラロコルチコイド受容
体のｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびその一次推定
アミノ酸配列を示す。（配列IV−２は２部分に分かれて
いる：図２５および図２６）。
体のｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびその一次推定
アミノ酸配列を示す。（配列IV−２は２部分に分かれて
いる：図２５および図２６）。
【図２６】 図２６は、ヒトミネラロコルチコイド受容
体のｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびその一次推定
アミノ酸配列を示す。（配列IV−２は２部分に分かれて
いる：図２５および図２６）。
体のｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびその一次推定
アミノ酸配列を示す。（配列IV−２は２部分に分かれて
いる：図２５および図２６）。
【図２７】 図２７は、ミネラロコルチコイド受容体と
グルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を示す図であ
る。
グルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を示す図であ
る。
【図２８】 図２８Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、発現したｈ
ＭＲのステロイド結合特性に関する図および３種のグラ
フである。図２８Ａは、発現プラスミドｐＲＳｈＭＲ、
すなわちｈＭＲの発現に用いたプラスミドの構造を示
す。図２８Ｂは、ｐＲＳｈＭＲトランスフェクションし
たＣＯＳ細胞から調製した抽出物におけるトリチウム化
アルドステロン結合のスカッチャード分析を示す。図２
８ＣおよびＤは、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞
における［3Ｈ］アルドステロンとの結合に対する非標
識ステロイド類の競合を示すグラフである。
ＭＲのステロイド結合特性に関する図および３種のグラ
フである。図２８Ａは、発現プラスミドｐＲＳｈＭＲ、
すなわちｈＭＲの発現に用いたプラスミドの構造を示
す。図２８Ｂは、ｐＲＳｈＭＲトランスフェクションし
たＣＯＳ細胞から調製した抽出物におけるトリチウム化
アルドステロン結合のスカッチャード分析を示す。図２
８ＣおよびＤは、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞
における［3Ｈ］アルドステロンとの結合に対する非標
識ステロイド類の競合を示すグラフである。
【図２９】 図２９Ａ、ＢおよびＣは、トランスフェク
ションしたＣＶ−１細胞におけるｈＭＲおよびｈＧＲ発
現プラスミドによる ＭＭＴＶ ＬＴＲの転写活性化を示
す図である。図２９Ａは、プラスミドＧＭＣＡＴの模式
図である。図２９Ｂは、正常血清によるｈＭＲまたはｈ
ＧＲトランスフェクション後に見られたＣＡＴ酵素活性
の差を示すブロットを示す、電気泳動を表す写真図面で
ある。図２９Ｃは、ｈＭＲまたはｈＧＲによりトランス
フェクションした細胞における、アルドステロンまたは
デキサメタゾンによるＣＡＴ活性誘導の差を示すブロッ
トを示す、電気泳動を表す写真図面である。
ションしたＣＶ−１細胞におけるｈＭＲおよびｈＧＲ発
現プラスミドによる ＭＭＴＶ ＬＴＲの転写活性化を示
す図である。図２９Ａは、プラスミドＧＭＣＡＴの模式
図である。図２９Ｂは、正常血清によるｈＭＲまたはｈ
ＧＲトランスフェクション後に見られたＣＡＴ酵素活性
の差を示すブロットを示す、電気泳動を表す写真図面で
ある。図２９Ｃは、ｈＭＲまたはｈＧＲによりトランス
フェクションした細胞における、アルドステロンまたは
デキサメタゾンによるＣＡＴ活性誘導の差を示すブロッ
トを示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図３０】 図３０は、ラット組織におけるミネラロコ
ルチコイド受容体ｍＲＮＡのノーザーン分析を示すブロ
ットを示す、電気泳動を表す写真図面である。
ルチコイド受容体ｍＲＮＡのノーザーン分析を示すブロ
ットを示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図３１】 図３１は、マイクロセルハイブリッドのサ
ザーン分析によるｈＭＲ遺伝子の染色体局在を示す、電
気泳動を表す写真図面である。
ザーン分析によるｈＭＲ遺伝子の染色体局在を示す、電
気泳動を表す写真図面である。
【図３２】 図３２は、ｈＧＲ，ｈＭＲおよび hＰＲ構
造のアミノ酸比較を示す模式図である。
造のアミノ酸比較を示す模式図である。
【図３３】 図３３は、ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡの若干の
制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲ
Ｒ１の複合構造を示す。
制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲ
Ｒ１の複合構造を示す。
【図３４】 図３４は、ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−１（Ｂ）は２部分に分れている：図３４およ
び図３５）。
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−１（Ｂ）は２部分に分れている：図３４およ
び図３５）。
【図３５】 図３５は、ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−１（Ｂ）は２部分に分れている：図３４およ
び図３５）。
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−１（Ｂ）は２部分に分れている：図３４およ
び図３５）。
【図３６】 図３６は、ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡの若干の
制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲ
Ｒ２の複合構造を示す。
制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲ
Ｒ２の複合構造を示す。
【図３７】 図３７は、ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−２（Ｂ）は２部分に分れている：図３７およ
び図３８）。
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−２（Ｂ）は２部分に分れている：図３７およ
び図３８）。
【図３８】 図３８は、ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−２（Ｂ）は２部分に分れている：図３７およ
び図３８）。
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−２（Ｂ）は２部分に分れている：図３７およ
び図３８）。
【図３９】 図３９は、ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ヒト
エストロゲンおよびグルココルチコイド受容体のカルボ
キシ末端領域間のアミノ酸配列比較を示す図である。
エストロゲンおよびグルココルチコイド受容体のカルボ
キシ末端領域間のアミノ酸配列比較を示す図である。
【図４０】 図４０Ａは、ラットおよびヒトの組織にお
けるｈＥＲＲ１ｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダ
イゼーション分析を示す、電気泳動を表す写真図面であ
る。図４０Ｂは、ラットおよびヒトの組織におけるｈＥ
ＲＲ２ｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーシ
ョン分析を示す、電気泳動を表す写真図面である。
けるｈＥＲＲ１ｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダ
イゼーション分析を示す、電気泳動を表す写真図面であ
る。図４０Ｂは、ラットおよびヒトの組織におけるｈＥ
ＲＲ２ｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーシ
ョン分析を示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図４１】 図４１は、ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２,
ｈＥＲおよびヒト甲状腺ホルモン受容体（hＴ3Ｒβ）の
間のアミノ酸の比較を示す図である。
ｈＥＲおよびヒト甲状腺ホルモン受容体（hＴ3Ｒβ）の
間のアミノ酸の比較を示す図である。
【図４２】 図４２Ａ、ＢおよびＣは、ラットＧＨ５’
側非翻訳配列を含む種々の遺伝子融合体の甲状腺ホルモ
ン応答性に関する図である。図４２Ａは、ラットＧＨ遺
伝子の５’側および３’側欠失体の応答性を示す図であ
る。図４２Ｂは、推定Ｔ3 受容体結合部位の機能分析を
示す図である。図４２Ｃは、ｍＲＮＡ転写開始部位分析
を示す、電気泳動を表す写真図面である。
側非翻訳配列を含む種々の遺伝子融合体の甲状腺ホルモ
ン応答性に関する図である。図４２Ａは、ラットＧＨ遺
伝子の５’側および３’側欠失体の応答性を示す図であ
る。図４２Ｂは、推定Ｔ3 受容体結合部位の機能分析を
示す図である。図４２Ｃは、ｍＲＮＡ転写開始部位分析
を示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図４３】 図４３ＡおよびＢは、ビオチン−１１− d
ＵＴＰを含むオリゴヌクレオチドプローブへのＴ3 受容
体の結合に関する図である。図４３Ａは、ＧＨ５’側非
翻訳配列へのＴ3 受容体の結合をアッセイするために用
いられる２種のオリゴヌクレオチドプローブの模式図で
ある。図４３Ｂは、各種オリゴヌクレオチドプローブに
よる、ＧＣ２核抽出物からの 125Ｉ−Ｔ3標識Ｔ3受容体
の沈殿を示すグラフである。
ＵＴＰを含むオリゴヌクレオチドプローブへのＴ3 受容
体の結合に関する図である。図４３Ａは、ＧＨ５’側非
翻訳配列へのＴ3 受容体の結合をアッセイするために用
いられる２種のオリゴヌクレオチドプローブの模式図で
ある。図４３Ｂは、各種オリゴヌクレオチドプローブに
よる、ＧＣ２核抽出物からの 125Ｉ−Ｔ3標識Ｔ3受容体
の沈殿を示すグラフである。
【図４４】 図４４は、ＧＣ２核抽出物によるラットＧ
Ｈエンハンサー要素のＤＮアーゼＩフットプリンティン
グ（footprinting）を示す、電気泳動を表す写真図面で
ある。
Ｈエンハンサー要素のＤＮアーゼＩフットプリンティン
グ（footprinting）を示す、電気泳動を表す写真図面で
ある。
【図４５】 図４５は、６４および２９塩基対を含むオ
リゴヌクレオチドへの、ラット下垂体細胞Ｔ3受容体お
よびhc−erb−Ａインビトロ翻訳生成物の５’側非翻訳
ＧＨ配列の結合を示すグラフである。
リゴヌクレオチドへの、ラット下垂体細胞Ｔ3受容体お
よびhc−erb−Ａインビトロ翻訳生成物の５’側非翻訳
ＧＨ配列の結合を示すグラフである。
【図４６】 図４６Ａは、ラット脳クローン rbeＡ１２
由来の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地図であ
る。図４６Ｂは、ラット脳クローン rbeＡ１２由来の甲
状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定
アミノ酸配列を示す模式図である。
由来の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地図であ
る。図４６Ｂは、ラット脳クローン rbeＡ１２由来の甲
状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定
アミノ酸配列を示す模式図である。
【図４７】 図４７は、ラット甲状腺ホルモン受容体
（rＴＲアルファ)蛋白質をヒト甲状腺ホルモン受容体
（hＴＲベータ）およびニワトリ甲状腺ホルモン受容体
（cＴＲアルファ)蛋白質と比較した模式図である。
（rＴＲアルファ)蛋白質をヒト甲状腺ホルモン受容体
（hＴＲベータ）およびニワトリ甲状腺ホルモン受容体
（cＴＲアルファ)蛋白質と比較した模式図である。
【図４８】 図４８Ａ、ＢおよびＣは、rＴＲアルファ
遺伝子のサザーンブロット分析およびヒト染色体局在を
示す、電気泳動を表す写真図面である。図４８Ａは、rb
eＡ１２由来の５００−bp ＰvuII断片にハイブリダイズ
したヒト胎盤ＤＮＡを示すブロットである。図４８Ｂ
は、hＴＲベータ由来の４５０−bp ＳstＩ断片にハイブ
リダイズした胎盤ＤＮＡを示す。図４８Ｃは、rＴＲア
ルファ遺伝子の染色体マッピングを示す。
遺伝子のサザーンブロット分析およびヒト染色体局在を
示す、電気泳動を表す写真図面である。図４８Ａは、rb
eＡ１２由来の５００−bp ＰvuII断片にハイブリダイズ
したヒト胎盤ＤＮＡを示すブロットである。図４８Ｂ
は、hＴＲベータ由来の４５０−bp ＳstＩ断片にハイブ
リダイズした胎盤ＤＮＡを示す。図４８Ｃは、rＴＲア
ルファ遺伝子の染色体マッピングを示す。
【図４９】 図４９Ａ、ＢおよびＣは、rＴＲアルファ
のインビトロ翻訳および甲状腺ホルモン結合に関する図
である。図４９Ａは、rＴＲアルファのインビトロ翻訳
生成物を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの、電気
泳動を表す写真図面である。図４９Ｂは、インビトロ翻
訳された rＴＲアルファへの125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチ
ャード分析を示すグラフである。図４９Ｃは、インビト
ロ翻訳された rＴＲアルファへの 125Ｉ−Ｔ3 結合に対
する甲状腺ホルモン同族体の競合を示すグラフである。
のインビトロ翻訳および甲状腺ホルモン結合に関する図
である。図４９Ａは、rＴＲアルファのインビトロ翻訳
生成物を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの、電気
泳動を表す写真図面である。図４９Ｂは、インビトロ翻
訳された rＴＲアルファへの125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチ
ャード分析を示すグラフである。図４９Ｃは、インビト
ロ翻訳された rＴＲアルファへの 125Ｉ−Ｔ3 結合に対
する甲状腺ホルモン同族体の競合を示すグラフである。
【図５０】 図５０は、rＴＲアルファｍＲＮＡの組織
分布を示すゲルの、電気泳動を表す写真図面である。
分布を示すゲルの、電気泳動を表す写真図面である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図３１】
【図５０】
【図１２】
【図１３】
【図２１】
【図３０】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図３３】
【図２０】
【図２３】
【図３６】
【図２２】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２８】
【図２９】
【図４２】
【図３２】
【図３４】
【図３５】
【図４１】
【図３７】
【図４５】
【図３８】
【図４７】
【図３９】
【図４０】
【図４３】
【図４８】
【図４４】
【図４９】
【図４６】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 596086505 10010 Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ ｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 92037，Ｕｎｉｔｅ ｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 エバンズ，ロナルド・マーク アメリカ合衆国カリフォルニア州92110, サン・ディエゴ，クラーク・ストリート 3702 (72)発明者 ウェインバーガー，キャリー・エイ アメリカ合衆国メリーランド州20906，シ ルバー・スプリング，デールウッド・ドラ イブ 12620 (72)発明者 ホーレンバーグ，スタンレイ・マーク アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，カミノ・ジョネート 7894 (72)発明者 ギグエル，ビンセント アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，レボン・ドライブ 3425，ナンバー 731 (72)発明者 アリザ，ジェフリー・ルイス アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールスバッド，レッドウッド 331 (72)発明者 トンプソン，キャサリン・キャロライン アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ミラマー・ストリート 3903 (72)発明者 オング，エステリタ・セバスティアン アメリカ合衆国カリフォルニア州92117, サン・ディエゴ，ハノン・コート 6307
Claims (42)
- 【請求項１】 センスストランドが、ミネラルコルチコ
イド受容体および甲状腺ホルモン受容体よりなる群から
選ばれるホルモン受容体に特有のホルモン結合特性およ
び／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次配列を
コードするトリプレットの配列を有するセグメントから
なり、該セグメントが上記蛋白質に発現可能である、実
質的に純粋な二重鎖ＤＮＡ。 - 【請求項２】 該セグメントにおけるトリプレットの配
列が、ミネラルコルチコイド受容体に特有のホルモン結
合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質の
一次配列をコードする、請求の範囲第１項に記載の実質
的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項３】 該セグメントにおけるトリプレットの配
列が、甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン結合特性
および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次配
列をコードする、請求の範囲第１項に記載の実質的に純
粋なＤＮＡ。 - 【請求項４】 該セグメントにおけるトリプレットの配
列が、哺乳類または鳥類のミネラルコルチコイド受容体
に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化特
性を有する蛋白質の一次配列をコードする、請求の範囲
第２項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項５】 該セグメントにおけるトリプレットの配
列が、ヒトミネラルコルチコイド受容体に特有のホルモ
ン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
質の一次配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の
実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項６】 該セグメントにおけるトリプレットの配
列が、哺乳類または鳥類の甲状腺ホルモン受容体に特有
のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有
する蛋白質の一次配列をコードする、請求の範囲第３項
に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項７】 該セグメントにおけるトリプレットの配
列が、ヒト甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン結合
特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一
次配列をコードする、請求の範囲第６項に記載の実質的
に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項８】 甲状腺ホルモン受容体がヒト甲状腺ホル
モン受容体アルファおよびヒト甲状腺ホルモン受容体ベ
ータよりなる群から選ばれる、請求の範囲第７項に記載
の実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項９】 ｐＲＳｈＭＲ（ＡＴＣＣ ＃６７２０
１）、ｐｅＡ１０１（ＡＴＣＣ ＃６７２４４）、ｒｂ
ｅＡ１２（ＡＴＣＣ ＃６７２８１）、ＧＭＣＡＴ（Ａ
ＴＣＣ ＃６７２８２）、ＰＥ４（ＡＴＣＣ ＃６７３
０９）、ｐＨＫＡ（ＡＴＣＣ ＃６７３１０）、ｐｈＥ
ＲＢＡ８．７（ＡＴＣＣ ＃４０３７４）、ｐｈＦＡ８
（ＡＴＣＣ ＃４０３７２、およびｐｈＨ３（ＡＴＣＣ
＃４０３７３）よりなる群から選ばれるプラスミド。 - 【請求項１０】 （ａ）翻訳終止コドンに相当する１ト
リプレットであって、翻訳開始コドンに相当するトリプ
レットと同じリーディングフレーム内にあり、かつ翻訳
開始コドンに相当するトリプレットの下流にあるもの、
ならびに（ｂ）最長オープンリーディングフレームとし
て、ヒトミネラルコルチコイド受容体；ヒト甲状腺ホル
モン受容体；ならびにｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２とし
て知られているヒトステロイドホルモン受容体よりなる
群から選ばれる蛋白質の一次配列をコードするトリプレ
ットの配列を有する実質的に純粋なセグメントを含むＤ
ＮＡセグメント。 - 【請求項１１】 ヒト甲状腺ホルモン受容体がｈＥＲＢ
Ａ８．７、ｈＦＡ８、およびｐｅＡ１０１として知られ
るＤＮＡよりなる群から選ばれるアルファまたはベータ
受容体である、請求の範囲第１０項に記載の実質的に純
粋なＤＮＡ。 - 【請求項１２】 第ＩＩＩ−１（Ｂ）−およびＩＩＩ−
１（Ｂ）−２図（ｈＴＲベータ）、第ＩＩＩ−７図（ｈ
ＴＲアルファ）、第ＩＶ−２（Ｂ）−１およびＩＶ−２
（Ｂ）−２図（ｈＭＲ）、第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ
−１（Ｂ）−２図（ｈＥＲＲ１）、ならびに第Ｖ−２
（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図（ｈＥＲＲ２）に
示されたＤＮＡ配列よりなるＤＮＡ配列群から選ばれる
実質的に純粋なＤＮＡ配列。 - 【請求項１３】 第ＩＩＩ−１（Ｂ）図（ｈＴＲベー
タ）、第ＩＩＩ−７図（ｈＴＲアルファ）、第ＩＶ−２
（Ｂ）図（ｈＭＲ）、第Ｖ−１（Ｂ）図（ｈＥＲＲ
１）、および第Ｖ−２（Ｂ）図（ｈＥＲＲ２）に示され
たアミノ酸配列よりなる群から選ばれるアミノ酸配列か
らなる実質的に純粋な一次蛋白質配列。 - 【請求項１４】 ヒトミネラルコルチコイド受容体をコ
ードする実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項１５】 受容体がヒト甲状腺ホルモン受容体ア
ルファおよびヒト甲状腺ホルモン受容体ベータよりなる
群から選ばれる、ヒト甲状腺ホルモン受容体をコードす
る実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項１６】 受容体がｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２
よりなる群から選ばれる、エストロゲン関連受容体をコ
ードする実質的に純粋なＤＮＡ。 - 【請求項１７】 請求の範囲第１項ないし第１６項のい
ずれかに記載のＤＮＡのいずれかと実質的な配列相同性
を有するＤＮＡ。 - 【請求項１８】 請求の範囲第１項ないし第１６項のい
ずれかに記載のＤＮＡのいずれかの変異体。 - 【請求項１９】 請求の範囲第１項ないし第１６項のい
ずれかに記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列のいずれかか
ら転写されたｍＲＮＡ。 - 【請求項２０】 請求の範囲第１項ないし第１６項のい
ずれかに記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列のいずれかに
よりコードされる実質的に純粋な蛋白質。 - 【請求項２１】 哺乳類および鳥類の甲状腺ホルモン受
容体、哺乳類および鳥類のミネラルコルチコイド受容
体、ならびに哺乳類および鳥類のステロイド系ホルモン
受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２よりなる群から選ば
れる実質的に純粋な受容体蛋白質。 - 【請求項２２】 甲状腺ホルモン受容体が甲状腺ホルモ
ン受容体アルファおよび甲状腺ホルモン受容体ベータよ
りなる群から選ばれる、請求の範囲第２１項に記載の実
質的に純粋な甲状腺ホルモン受容体。 - 【請求項２３】 請求の範囲第１項ないし第１６項のい
ずれかに記載の実質的に純粋なＤＮＡのいずれかにより
形質転換された細胞。 - 【請求項２４】 （ａ） 受容体陰性の細胞中へ、作動
性レポーター遺伝子に機能性結合した本質的に作動性ホ
ルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素からなる
第１プラスミド、および本質的に、ホルモン受容体蛋白
質（Ｒ）またはその修飾された機能性形態（ｒ）をコー
ドする作動性ＤＮＡ配列からなる第２の受容体発現プラ
スミドを共トランスフェクションし、 （ｂ） 工程（ａ）で得た共トランスフェクションされ
た細胞を、第１プラスミドのホルモン応答性プロモータ
ー／エンハンサー要素を活性化しうるホルモンまたはそ
の同族体の存在下または不在下に培養し、 （ｃ） 該細胞において上記レポーター遺伝子のＤＮＡ
配列の生成物の誘導を監視し、そして （ｄ） 該細胞において、上記第２プラスミドのＤＮＡ
配列によりコードされるホルモン受容体蛋白質（Ｒ）ま
たはその修飾された機能性形態（ｒ）の発現およびステ
ロイド結合能を測定することよりなる、修飾された機能
性形態（ｒ）は受容体（Ｒ）が有する転写活性化特性を
備えており、かつ（Ｒ）および（ｒ）は発現可能なＤＮ
Ａ配列によりコードされるものである、ホルモン受容体
（Ｒ）またはその工学的に処理された、修飾された機能
性形態（ｒ）の機能性を測定するためのバイオアッセイ
法。 - 【請求項２５】 受容体陰性の細胞がＣＶ−１およびＣ
ＯＳ細胞よりなる群から選ばれる、請求の範囲第２４項
に記載のバイオアッセイ法。 - 【請求項２６】 第１および第２プラスミドがＳＶ−４
０の複製開始点をも含む、請求の範囲第２４項に記載の
バイオアッセイ法。 - 【請求項２７】 第１および第２プラスミドが選択可能
なマーカーをも含む、請求の範囲第２４項に記載のバイ
オアッセイ法。 - 【請求項２８】 作動性ホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素がマウス乳腺腫瘍ウィルス長鎖ターミ
ナルリピート（ＭＴＶ ＬＴＶ）および哺乳類成長ホル
モンプロモーターよりなる群から選ばれ、レポーター遺
伝子がＣＡＴである、請求の範囲第２４項に記載のバイ
オアッセイ法。 - 【請求項２９】 ホルモン受容体蛋白質（Ｒ）がグルコ
コルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラルコルチコイド受
容体（ＭＲ）および甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）より
なる群から選ばれる、請求の範囲第２８項に記載のバイ
オアセッイ法。 - 【請求項３０】 遺伝子（Ｇ）−すなわちホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）が受容体（Ｒ）または
その修飾された機能性形態（ｒ）との複合体を形成した
状態でかつこの［（Ｈ）または（ａＨ）／（Ｒ）または
（ｒ）］複合体が遺伝子（Ｇ）の位置するクロマチン上
の転写制御要素に結合した状態でその転写がホルモン
（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）によって活性化される
遺伝子−を含む細胞（Ｃ）において、遺伝子（Ｇ）の発
現を誘導し、結果的に遺伝子（Ｇ）によりコードされる
蛋白質（Ｐ）の生成を誘導する方法であって、（１）
細胞（Ｃ）において、受容体（Ｒ）、または受容体
（Ｒ）の転写活性化特性を有するその修飾された機能性
形態（ｒ）をコードするＤＮＡを発現させ、そして
（２）遺伝子（Ｇ）の発現、すなわち結果的に蛋白質
（Ｐ）の生成を誘導するのに十分な水準にまで細胞
（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａ
Ｈ）の濃度を増大させることよりなる方法。 - 【請求項３１】 ホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａ
Ｈ）の濃度の増大が、遺伝子（Ｇ）の転写、従って蛋白
質（Ｐ）の生成を制御すべく制御される、請求の範囲第
３０項に記載の方法。 - 【請求項３２】 細胞（Ｃ）が真核細胞である、請求の
範囲第３０項および第３１項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３３】 真核細胞（Ｃ）が哺乳類の細胞であ
る、請求の範囲第３０項および第３１項のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項３４】 真核細胞（Ｃ）がヒトの細胞である、
請求の範囲第３０項および第３１項のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項３５】 ホルモン（Ｈ）がグルココルチコイド
ホルモン、ミネラルコルチコイドホルモンおよび甲状腺
ホルモン、ならびにそれらの同族体よりなる群から選ば
れるホルモンである、請求の範囲第３０項および第３１
項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３６】 受容体（Ｒ）がグルココルチコイド受
容体、ミネラルコルチコイド受容体および甲状腺ホルモ
ン受容体よりなる群から選ばれる受容体である、請求の
範囲第３０項および第３１項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３７】 細胞を工学的に処理し、そして遺伝子
（Ｇ）−すなわちホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａ
Ｈ）が受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態
（ｒ）との複合体を形成した状態でかつこの［（Ｈ）ま
たは（ａＨ）／（Ｒ）または（ｒ）］複合体が遺伝子
（Ｇ）の位置するクロマチン上の転写制御要素に結合し
た状態でその転写がホルモン（Ｈ）またはその同族体
（ａＨ）によって活性化される遺伝子−によりコードさ
れる蛋白質（Ｐ）を製造する方法であって、（１） 転
写制御要素に結合した状態の［（Ｈ）または（ａＨ）／
（Ｒ）または（ｒ）］複合体によって活性化されうる転
写制御要素の制御下に遺伝子（Ｇ）が置かれるべく遺伝
子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置し；（２） 受容体
（Ｒ）、または受容体（Ｒ）が有する転写活性化特性を
備えたその修飾された機能性形態（ｒ）をコードするＤ
ＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転換し；そして（３）遺伝
子（Ｇ）の発現、すなわち結果的に蛋白質（Ｐ）の生成
を誘導および制御するのに十分な水準にまで細胞（Ｃ）
におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃
度を増大させることよりなる方法。 - 【請求項３８】 細胞（Ｃ）が真核細胞である、請求の
範囲第３７項に記載の方法。 - 【請求項３９】 真核細胞（Ｃ）が哺乳類の細胞であ
る、請求の範囲第３８項に記載の方法。 - 【請求項４０】 真核細胞（Ｃ）がヒトの細胞である、
請求の範囲第３９項に記載の方法。 - 【請求項４１】 ホルモン（Ｈ）がグルココルチコイド
ホルモン、ミネラルコルチコイドホルモンおよび甲状腺
ホルモン、ならびにそれらの同族体よりなる群から選ば
れるホルモンである、請求の範囲第３７項に記載の方
法。 - 【請求項４２】 受容体（Ｒ）がグルココルチコイド受
容体、ミネラルコルチコイド受容体および甲状腺ホルモ
ン受容体よりなる群から選ばれる受容体である、請求の
範囲第３７項に記載の方法。
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