JPH10500949A - 蛍光性ｄｎａとしてのプテリジンヌクレオチド類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、生理学的条件下に高度に蛍光性であり、そして蛍光性オリゴヌクレオチドの化学的合成において使用できる新規なプテリジンヌクレオチドを提供する。本発明は、１または２以上のプテリジンヌクレオチドを含んでなる蛍光性オリゴヌクレオチドをさらに提供する。さらに、本発明は、DNA 増幅法において構成モノマーとして使用できるプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光性DNA としてのプテリジンヌクレオチド類似体発明の背景 合成オリゴヌクレオチドは、ゲノムおよび相補的DNA ライブラリーのスクリー ニングのためのプローブとして、DNA 合成、配列決定、および増幅のプライマー として、そしてDNA −タンパク質の相互作用の研究において、分子生物学におい て多数の用途を見出す。さらに、オリゴヌクレオチドプローブは、インサイチュ ・ハイブリダイゼーションの技術を使用するin vitro遺伝子発現をアッセイする ために有用であることが明らかになった。 DNA 配列決定法、蛍光性標識、および検出系における最近の改良は、これらの 用途のすべてにおいて蛍光標識化オリゴヌクレオチドの使用を劇的に増加した。 典型的には、オリゴヌクレオチドは蛍光性マーカーで、共有結合により直接（例 えば、炭素リンカー）標識化するか、または間接的に標識化することができ、間 接的標識化において、オリゴヌクレオチドを分子、例えば、ビオチンまたはジオ キシゲニンに結合し、次いでこれを蛍光標識化した結合部分（例えば、ストレプ チアビジンまたは標識化モノクローナル抗体）にカップリングさせる。 しかしながら、これらの蛍光標識化系は、蛍光性複合体およびそれらの結合部 分が比較的大きいという欠点に悩まされる。大きい蛍光標識および関連するリン カーの存在は、配列決定におけるようにゲルを通して、または細胞の種々の区画 を通して、オリゴヌクレオチドの移動度を変更することがある。 さらに、これらのマーカーの存在は、化学的相互作用または立体 障害を通して、オリゴヌクレオチドと他の分子との相互作用を変更する。したが って、これらのマーカーの存在は、DNA と他の分子、例えば、タンパク質との相 互作用の研究を困難とする。タンパク質−DNA の相互作用の研究は、相互作用が 生物学における最も基本的メカニズムのあるものを含むので、非常に重要である 。相互作用は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さに沿ったDNA ポリメラーゼま たは逆転写酵素の進行、AP１またはステロイドホルモン経路におけるように遺伝 子転写の活性、またはHIV IN酵素により仲介されるようなウイルスDNA の宿主ゲ ノムの中への挿入を包含する。これらの理由で、ピリミジンまたはプリンヌクレ オチドに構造が類似しかつオリゴヌクレオチドの中に組込むすることができる蛍 光性成分を得ることは望ましい。このような成分は、オリゴヌクレオチドの大き さまたは化学的性質を変更しないで、オリゴヌクレオチド分子を蛍光性とするこ とが好ましい。 ヌクレオチドの多数の類似体がられている。それらの中にはプテリジン誘導体 がある。プリンヌクレオチドに構造的に類似する、これらの産物の合成法はよく 知られている。事実、新しい生物学的に活性な化合物を発見する希望をもって、 多数のプテリジン由来の類似体が合成されてきている。こうして、Pfleiderer（ 米国特許第 3,798,210号および米国特許第 3,792,036号）は、抗菌および抗ウイ ルス特性を有する多数のプテリジン−グリコシドを開示した。しかしながら、Pf leidererはこれらの化合物の蛍光性を研究しなかった。 同様に、Schmidt et al.，Chem．Ber．106：1952-1975（1973）は、１系列の プテリジン誘導体をリボシド化してヌクレオチドグアノシンの構造類似体を生成 することを記載しているが、Harris et al.，Liebigs Ann．Chem．1457-1468(19 81)はアデノシンに構造的 に類似するプテリジン誘導体の合成を記載している。再び、いずれの参考文献も ヌクレオシドの蛍光性の測定を記載していない。 ルマジン誘導体を組込んだオリゴヌクレオチドの合成は、Bannwarth et al.， Helvetica Chimica Acta．74：1991-1999(1991)，Bannwarth et al.，Helvetica Chimica Acta．74：2000-2007(1991)およびBannwarth et al.,(欧州特許出願第 0439036A2号)に記載された。Bannwarth et al.はルマジン誘導体をバソフェナ ンスロリン−ルテニウム複合体と組み合わせてエネルギー転移系として利用し、 ここでルマジン誘導体はエネルギードナーとして作用し、そしてルテニウム複合 体はエネルギーレセプターとして作用した。２つの化合物を接近させて蛍光を発 生させるとき、エネルギー転移は起こった。この系は２つの基を有する分子の相 互作用を研究するのためのメカニズムを提供した。しかしながら、この参考文献 はオリゴヌクレオチドにおいてルマジン誘導体を単独で使用することを記載しな かった。さらに、Bannwarth は、ルマジン誘導体の主要な欠点は「・・・ルマジ ン発色団の長波長の吸収についての比較的低い吸光係数（ε＝8900ｍ^-1cm^-1，32 4nm，pH6.9）」であることを認識した。Bannwarth et al.，Helv．Chim．Acta． 74：1991-1999（1991）。 本発明は、プリンヌクレオチドに構造が類似し、通常の生理学的条件下に高度 に蛍光性であり、そしてオリゴヌクレオチドの化学的合成において使用するため に適当である、多数のプテリジンヌクレオチドを提供することによって、これら の先行技術の制限を克服する。発明の要約 本発明は、下記の形態のプテリジンヌクレオチドを提供する： 式中、Ｒ¹¹はＲ¹²と組合わされて二重結合により環の頂点４に結合する単一のオ キソ酸素を形成するか、またはＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間の二重結合 を形成し；Ｒ¹²はＲ³と組合わされないとき、NH₂、および保護基で１または２置 換されたNH₂から成る群より選択される構成員であり；Ｒ¹³はＲ¹¹と結合しない とき、低級アルキルまたはＨであり；Ｒ¹⁴はＨ、低級アルキルまたはフェニルで あり；Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に結合する単一のオ キソ酸素を形成するか、またはＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間の二重結合 を形成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキ酸素を有し； そしてＲ¹⁶はＲ¹⁵と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、NH₂、および保護基で １または２置換されたNH₂から成る群より選択される構成員である。Ｒ¹⁵がＲ¹⁶ と組合わされないとき、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に 接合した単一のオキソ酸素を形成する。Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされるとき、Ｒ¹⁸は Ｒ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はＨまた は低級アルキルである。Ｒ¹⁷はＲ¹⁵と結合しないとき、かつＲ²⁰はＲ¹⁸と結合し ないとき、 の化合物であり、式中、記号Ｒ²¹は水素、保護基、またはトリホスフェートを表 し；記号Ｒ²²は水素、ヒドロキシル、または保護基で置換されたヒドロキシルを 表し；そしてＲ²³はＨ、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホ ネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の 支持体に共有結合したヘミスクシネート、ジシクロヘキシルカーボジイミド、お よび固体の支持体に共有結合したジシクロヘキシルカーボジイミドを表す。Ｒ¹³ がＨでありかつＲ²³がＨであるとき、Ｒ²¹はトリホスフェートであり、そしてＲ¹¹ がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成でありかつＲ²³がＨ であるとき、Ｒ²¹はトリホスフェートである。 これらの化合物は通常の生理学的条件下に高度に蛍光性であり、かつオリゴヌ クレオチドの化学的合成において使用するために適当である。本発明は、さらに 、これらのプテリジンヌクレオチドを組み込んだオリゴヌクレオチドを提供する 。 さらに、本発明は、種々のDNA 増幅法において利用することができるプテリジ ンヌクレオチドトリホスフェートを提供する。DNA 増幅法において使用するとき 、ヌクレオチドトリホスフェートは増幅されたDNA 配列の中に直接組込んでそれ を蛍光性とする。これは増幅された生成物の存在または非存在についての急速な アッセーを提供する。特定の態様の説明 本明細書において使用するとき、用語「低級アルキル」は直鎖状または分枝鎖 状であることができる飽和炭化水素（例えば、エチル、イソプロピル、ｔ−アミ ル、または２，５−ジメチルヘキシル）を意味する。好ましいアルキル基は１〜 ６個の炭素原子を含有するものである。この明細書および請求の範囲におけるす べての数の範囲は、それらの上限および下限を含むことを意図する。 用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチ ド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド 類似体、デオキシリボヌクレオチド類似体、または本発明のプテリジン誘導体を 意味する。オリゴヌクレオチドの正確な使用は、多数の因子およびオリゴヌクレ オチドの究極の機能または使用に依存する。一般に、化学的に合成したオリゴヌ クレオチドは長さが２〜200 塩基の範囲であるが、オリゴヌクレオチドを一緒に 結合してより長い配列することができることはよく知られている。本明細書おい て使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、また、これらの長い配列を包 含する。また、相補的配列とのハイブリダイゼーションによるか、または酵素的 にプライマー伸長により、二本鎖ポリヌクレオチドをつくることができることは 認識されている。オリゴヌクレオチドという用語は、この出願において使用する とき、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドを包含する。 用語「固体の支持体」は、ポリヌクレオチド合成において使用するモノマーの カップリングを可能とするように官能化されている固体の物質を意味する。固体 の支持体は、典型的には、フラノース上の３’−炭素への共有結合を通してヌク レオシドモノマーにカップリングされている。固体の支持体の物質は、典型的に は、ポリヌク レオチドの合成の間において非反応性であり、そして成長するポリヌクレオチド を定着する下層を単に提供する。固体の支持体は、ポリアクリロイルモルホリド 、シリカ、コントロールされた孔のガラス(CPG)、ポリスチレン、ポリスチレン ／ラテックス、およびカルボキシル変性テフロンを包含するが、これらに限定さ れない。 固相オリゴヌクレオチド合成における用語「切断」は、固体の支持体にオリゴ ヌクレオチドが結合する結合の破壊を意味する。典型的には、切断は取り付けら れたオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルと固体の支持体との間のスクシネ ートエステル結合の加水分解を包含する。 用語「脱保護」は、オリゴヌクレオチドの複素環式塩基の還外アミンからの保 護基の除去を意味する。典型的には、脱保護は還外アミンと、アミノ保護基、例 えば、ベンゾイル、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル、ジ−ｎ−ブチルアミ ノメチリデン、およびジメチルアミノメチレンアミノとから成るアミド部分の加 水分解から成る。脱保護という用語は、また、オリゴヌクレオチドのホスフェー トジエステル（インタヌクレオチドホスフェート）からの保護基の除去を意味す る。このような保護基がメトキシであるとき、「脱保護」は、本明細書おいて使 用するとき、それらの除去を包含しないことがある。その代わり、「チオレート 」オリゴヌクレオチドの生成のために、標準的チオフェノールを含有する試薬を 使用する追加の処理が望ましいことがある。 用語「プテリジンヌクレオチド」または「プテリジンモノマー」は、本明細書 において、３’−ホスフェート基をもつ本発明のフラノシルプテリジン誘導体を 意味するために使用する。適切に述べると、プテリジンはプリンまたはピリミジ ンではないので、フラノシルプテリジン誘導体はヌクレオチドではないことが認 識される。し かしながら、フラノシルプテリジン誘導体はプリンヌクレオチドに構造的に類似 し、そして本発明のフラノシルプテリジンはヌクレオチドと同一の方法で使用さ れるので、双方をヌクレオチドと呼ぶ。本明細書おいて使用するとき、プテリジ ンヌクレオチドまたはプテリジンモノマーはポリヌクレオチド合成において使用 するために完全に保護することができるか、またはトリホスフェートとしてを使 用するとき、またはオリゴヌクレオチドの中に組込むとき、脱保護することがで きる。 用語「ヌクレオチドモノマー」は、本明細書おいて使用するとき、プテリジン ヌクレオチド、「標準的」ヌクレオチド；アデノシン、グアノシン、シチジン、 チミジン、およびウラシル、またはこれらのヌクレオチドの誘導体を意味する。 このような誘導体は、５−ブロモデオキシシチジン、５−ブロモ−デオキシウリ ジン、Ｎ⁶−メチル−デオキシアデノシンおよび５−メチル−デオキシシチジン を包含するが、これらに限定されない。 本明細書において使用するとき、用語「保護基」は、分子上の反応性基（例え ば、ヒドロキシルまたはアミン）に結合するか、またはそれと置換される基を意 味する。保護基は化学反応の１または２以上の段階の間の特定の基の反応を防止 するように選択される。一般に、特定の保護基は、後の時間における除去を可能 として、分子の中に存在する反応性基を変更しないで反応性基を回復するように 選択される。保護基の選択は、保護すべき特定の基およびその基が暴露される化 合物の関数である。保護基の選択は当業者によく知られている。参照、例えば、 Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis 、第２版、John Wil ey & Sons，Inc.，Somerset，N．J．（1991）、これは引用することによって本 明細書の一部とされる。 本明細書おいて使用するとき、用語「保護されたアミン」は、アミノ保護基と 反応したアミンを意味する。アミノ保護基は、誘導化プテリジンヌクレオチドの 合成の間またはそのヌクレオチドを使用するDNA またはRNA の化学的合成の間の アミド官能基の反応を防止する。アミノ保護基は、分子の中に存在他の基を変更 しなで、後の時間において除去してアミノ基を回復することができる。例えば、 還外アミンをジメチルホルムアミド−ジエチルアセタールと反応させて、ジメチ ルアミノメチレンアミノ官能基を形成することができる。アミノ保護基は、一般 に、カルバメート、ベンジル基、イミデート、およびこの分野において知られて いる他の基を包含する。好ましいアミノ保護基は、ｐ−ニトロフェニルエトキシ カルボニルまたはジメチルアミノメチレンアミノを包含するが、これらに限定さ れない。 用語「カップリング」は、一般に、DNA 合成において、１つのヌクレオチドモ ノマーを他のヌクレオチドモノマーに、またはオリゴヌクレオチドの５’末端に 接合することを意味するために使用される。カップリングは、一般に、１つのヌ クレオチドモノマーの３’−ホスフェートから第２モノマーまたはオリゴヌクレ オチドの５’−ヒドロキシルへのホスホジエステル結合の形成により達成される 。カップリングは、また、初期のヌクレオチドの固体の支持体への接合を意味す る。 用語「キャッピング」は、縮合できず、次の誘導化されたヌクレオチドと首尾 よくカップリングする未反応の５’−ヒドロキシル基をブロックする段階を意味 する。これにより、引き続く反応が所望の配列の鎖を拡大することによってのみ 進行することが保証される。典型的には、キャッピングは５’−ヒドロキシル官 能基のアセチル化を包含する。通常、これは４−ジメチルアミノピリジン（DMAP ）により触媒された酸無水物により達成される。当業者に知られている他の試薬 は適当である。 用語「合成サイクル」は、合成されるオリゴヌクレオチドの５’末端にヌクレ オチドモノマーをカップリングさせるために必要な反応の順序を意味する。典型 的には、合成サイクルは、オリゴヌクレオチドの末端上の５’−ヒドロキシル基 の除去、ホスホジエステル結合を形成するためのヌクレオチドモノマーのホスフ ァイト誘導体との反応、および引き続くカッブリングが不成功であった場合の分 子のキャッピングを包含する。 用語「通常の生理学的条件」は、本明細書において、生きている生物または細 胞の内部において典型的である条件を意味する。いくつかの器官は極端な条件を 提供することが認識されているが、生物の内部および細胞の内部の環境は通常pH ７付近(すなわち、 pH6.5〜pH7.5)で変化し、主要な溶媒として水を含有し、そ して０℃以上かつ50℃以下の温度において存在する。 本発明は、通常の生理学的条件下に高度に蛍光性でありかつ蛍光性オリゴヌク レオチドを製造するオリゴヌクレオチドの化学的合成において利用することがで きる、多数のプテリジンヌクレオチドを提供する。これらの蛍光性オリゴヌクレ オチドは、例えば、ゲノムおよび相補的DNA ライブラリーのスクリーニングのた めのプローブ、インサイチュ・ハイブリダイゼーションのためのプローブ、DNA 合成、配列決定、および増幅のためのプライマー、そしてDNA −タンパク質の相 互作用を研究するためのモデルの基質を包含する多数の用途を有する。 １つの態様において、本発明のプテリジンヌクレオチドはオリゴヌクレオチド の化学的合成において使用するために適当である。一般に、これは下記のステッ プを必要とする：プテリジン上の還外ア ミンのブロッキング；考える特定の合成化学に適当な反応性基をもつホスファイ ト部分の誘導化；および合成の間に除去できる保護基による５’−ヒドロキシル 基のブロッキング、このブロッキングは成長するオリゴヌクレオチドの５’末端 への誘導化ヌクレオチドの段階的カップリングを促進する。プテリジン誘導体の 糖がリボースである場合、反応性２’−ヒドロキシル基をまた保護しなくてはな らない。 好ましい態様において、本発明は下記の式Ｉのヌクレオチドモノマーを提供す る： これらのヌクレオチドモノマーは示すように環の頂点１〜８をもつプテリジン 誘導体であり、式中、Ｒ¹¹はＲ¹²と組合わされて二重結合により環の頂点４に接 合する単一のオキソ酸素を形成するか、またはＲ¹³と結合して環の頂点３と４と の間の二重結合を形成し、Ｒ¹²はＲ¹¹と組合わされないとき、NH₂、および保護 基NH₂で１または２置換されたNH₂であり、Ｒ¹³はＲ¹¹と結合しないとき、低級ア ルキルまたはＨであり；Ｒ¹⁴はＨ、低級アルキルまたはフェニルであり、Ｒ¹⁵は Ｒ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合する単一のオキソ酸素を形 成するか、またはＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形成し、こ うして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、そしてＲ¹⁶ はＲ¹⁵と組 合わされないとき、Ｈ、フェニル、NH₂、および保護基で１または２置換されたN H₂から成る群より選択される構成員である。Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされないとき、 Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸 素を形成する。Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされるとき、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の頂点 ７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はＨまたは低級アルキルである。 Ｒ¹⁷はＲ¹⁵と結合しないとき、かつＲ²⁰はＲ¹⁸と結合しないとき、式IIの化合物 である。 式中、記号Ｒ²¹は水素、保護基またはトリホスフェートを表し、記号Ｒ²²は水 素、ヒドロキシル、または保護基で置換されたヒドロキシルを表し、そしてＲ²³ は水素、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホスホ ロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の支持体に共有結 合したヘミスクシネート、ジシクロヘキシルカーボジイミド、および固体の支持 体に共有結合したジシクロヘキシルカーボジイミドを表す。Ｒ¹³がＨでありかつ Ｒ²³がＨであるとき、Ｒ²¹はトリホスフェートであり、そしてＲ¹¹がＲ¹³と結合 して環の頂点３と４との間で二重結合を形成しかつＲ²³がＨであるとき、Ｒ²¹は トリホスフェートである。 他の好ましい態様において、Ｒ¹⁴は水素、メチルまたはフェニル、特に水素ま たはメチルである。 なお他の好ましい態様において、Ｒ¹⁶は、Ｒ¹⁵と結合しないとき 、水素、フェニル、アミノ基、または保護基で２置換されたNH₂である。特に、 Ｒ¹⁶は水素およびフェニルである。 しかも他の好ましい態様において、Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹は水素ま たはメチルである。 なおしかも他の好ましい態様において、Ｒ¹⁴は水素、メチルおよびフェニルで あり、Ｒ¹⁶は、Ｒ¹⁵と組合わされないとき、水素、フェニルまたはアミノであり 、そしてＲ¹⁸がＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹は水素またはメチルである。 本発明の化合物の中で、９つの態様が特に好ましい。第１好ましい態様におい て、Ｒ¹¹はＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂ 、および保護基で１または２置換されたNH₂であり、Ｒ¹⁴は水素であり、Ｒ¹⁵は Ｒ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶はフェニルであ り、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキ ソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式IIである。この態様は式IIIにより例示される 。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ¹²がNH₂であるとき、式IIIにより例示さ れる。 第２態様において、Ｒ¹¹はＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を 形成し、Ｒ¹²はNH₂、および保護基で１または２置換されたNH₂であり、Ｒ¹⁴はフ ェニルであり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し 、Ｒ¹⁶は水素であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接 合した単一 のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式IIである。この態様は式IVにより例示さ れる。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ¹²がNH₂であるとき、式IVにより例 示される。 第３の好ましい態様において、Ｒ¹¹はＲ¹²と組合わされて二重結合により環の 頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹³はCH₃であり、Ｒ¹⁴はＨであ り、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶はNH₂ であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一 のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式IIである。この態様は式Ｖにより例示さ れる。この態様の１つの特に好ましい化合物は、式IIのＲ²³がＨであり、そして 特に式IIのＲ²¹，Ｒ²²、およびＲ²³のすべてがＨであるとき、式Ｖにより例示さ れるヌクレオシドである。 第４の好ましい態様において、Ｒ¹¹はＲ¹²と組合わされて二重結合により環の 頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹³は水素であり、Ｒ¹⁴は水素で あり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶は NH₂または保護基で１または２置換されたNH₂であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて 二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰ は式IIである。この態様は式VIにより例示される。この態様の特に好ましい化合 物は、Ｒ¹⁶がNH₂であるとき、式VIにより例示される。 第５の好ましい態様において、Ｒ¹¹はＲ¹²と組合わされて二重結合により環の 頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹³は水素であり、Ｒ¹⁴はCH₃で あり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶は NH₂または保護基で１または２置換されたNH₂であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて 二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は 式IIである。この態様は式VIIにより例示される。この態様の特に好ましい化合 物は、Ｒ¹⁶がNH₂であるとき、式VIIにより例示される。 第６の好ましい態様において、Ｒ¹¹はＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で 二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂または保護基で１または２置換されたNH₂であり、 Ｒ¹⁴はCH₃であり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合 した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式IIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の 頂点７と８ との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はCH₃である。この態様は式VIIIにより 例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ¹²がNH₂であるとき、式VIII により例示される。 第７の好ましい態様において、Ｒ¹¹はＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で 二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂または保護基で１または２置換されたNH₂であり、 Ｒ¹⁴は水素であり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合 した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式IIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の 頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はCH₃である。この態様は式I Xにより例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ¹²がNH₂であるとき、 式IXにより例示される。 第８の好ましい態様において、Ｒ¹¹はＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で 二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂であり、Ｒ¹⁴はCH₃であり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わさ れて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式 IIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そ してＲ¹⁹はＨである。この態様は式Ｘにより例示される。この態様の特に好ま しい化合物は、Ｒ¹²がNH₂であるとき、式Ｘにより例示される。 第９の好ましい態様において、Ｒ¹¹はＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で 二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂または保護基で１または２置換されたNH₂であり、 Ｒ¹⁴はＨであり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合し た単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式IIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の頂 点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はＨである。この態様は式III により例示される。この態様の特に好ましい化合物は、Ｒ¹²がNH₂であるとき、 式ＸＩにより例示される。 前述したように、プテリジンの還外アミンは一般にオリゴヌクレオチド合成の 間に保護しなくてはならない。プテリジンの還外アミンのブロッキングために適 当な保護基は、この分野において広く知られている。一般に、保護基はプテリジ ン誘導体を組込んだオリゴヌクレオチドの合成の間の還外アミンの望ましくない 反応を防止するであろう。これらの基は望ましくない反応を防止するためにプテ リジン誘導体の実際の合成の間に保護ことが必要であることはもちろん認識され ている。保護基は、分子の他の反応性基を変更しない で、オリゴヌクレオチドの合成後除去してアミン基を回復することができるべき である。 典型的には、アミン基は、アシル化により、通常カルバメート、ベンジル基、 イミデート、およびこの分野において知られている他の保護基により保護される 。保護基の例は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ベンゾイル、 ４−メトキシベンゾイル、フェノキシアセチル、ジフェニルアセチル、イソブチ リル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ジメチルアミノメチレン アミノ、ジメルチアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルお よびジメチルホルムアミド−ジエチルアセタール。ｐ−ニトロフェニルエトキシ カルボニルまたはジメチルアミノメチレンアミノは特に好ましい。多数の適当な 保護基の説明については、下記の参考文献を参照のこと：Reese，Tetrahedron， 34：3143-3179（1978）；Ohtsuka et al.，Nucleic Acids Res.，10：6553-6570 （1982）、およびNarang，Tetrahedron 39：3-22(1983)これらは引用することに よって本明細書の一部とされる。 こうして、好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹²およびＲ¹⁶が独立してベン ゾイル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ジメチ ルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびジメチルア ミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１または２置換されたNH₂ である、式Ｉのヌクレオチドモノマーを提供する。特に、Ｒ¹²はジ−ｎ−ブチ ルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル、およびジメルチ アミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１置換されたNH₂であ る。 オリゴヌクレオチド合成の間に、プテリジンモノマーの５’−ヒドロキシル基 をブロックして望ましくない反応を防止しなくてはな らない。しかしながら、このブロッキング基は、また、合成の間に除去して、成 長するオリゴヌクレオチドの５’末端への新しいモノマーの段階的カップリング を可能とすることができなくてはならない。適当な保護基はこの分野においてよ く知られており、そしてトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル 、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレン、およびジメチルアミノメチリ デンを包含するが、これらに限定されない。ジメトキシトリチルは、５’−ヒド ロキシル基のブロッキング基として一般に好ましい。 こうして、好ましい態様において、本発明は、Ｒ²⁰が式IIであり、Ｒ²¹がＨ、 トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、フタロイル、ジ−ｎ− ブチルアミノメチリレン、またはジメチルアミノメチリデンである、式Ｉのヌク レオチドモノマーを提供する。さらに詳しくは、Ｒ²¹はジメトキシトリチル、ジ −ｎ−ブチルアミノメチリデン、またはジメチルアミノメチリデンである。 プテリジン誘導体の糖がリボフラノースである場合、２’−ヒドロキシル基を また保護しなくてはならない。好ましい２’−ヒドロキシル基保護基は下記のも のを包含するが、これらに限定されない；トリチル、モノメトキシトリチル、ジ メトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、４−メトキシテトラヒドロ ピラン−４−イル、１−（２−クロロ−４−メチル）フェニル−４−メトキシピ ペリジン−４−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｐ−ニトロフェニルエチルス ルホニル、テトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、２−ニ トロベンジル、９−フェニルキサンテン−９−イルおよびｐ−ニトロフェニルエ チルである。好ましい態様において、２’−ヒドロキシル基はｔ−ブチルジメチ ルシリル基で置換することによって保護されるであろう。 こうして、好ましい態様において、本発明は、Ｒ²⁰が式IIであり 、Ｒ²²がＨ，OHまたは置換OHであり、前記置換OHはトリチル、モノメトキシトリ チル、ジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、４−メトキシテト ラヒドロピラン−４−イル、１−（２−クロロ−４−メチル）フェニル−４−メ トキシピペリジン−４−イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｐ−ニトロフェニル エチルスルホニル、テトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル 、２−ニトロベンジル、９−フェニルキサンテン−９−イルまたはｐ−ニトロフ ェニルエチルで置換されている、式Ｉのヌクレオチドモノマーを提供する。特に 、Ｒ²²はＨまたはジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１−イル、ｔ−ブ チルジメチルシリル、２−ニトロベンジルもしくはｐ−ニトロフェニルエチルで 置換されたOHである。 本発明のβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト化合物は 、オリゴヌクレオチド合成のモノマーとして好ましい。これらの化合物は、合成 のプロトコールを変更しないで、大部分の商業的DNA 合成において一般に利用す ることができる。しかしながら、大規模の合成を望む場合、またはホスフェート 結合の中に硫黄基または他の変更を加えたい場合、本発明のＨ−ホスホネート化 合物は合成試薬として好ましいことがある。オリゴヌクレオチド合成に適当な他 のホスファイト誘導体の合成および使用は、この分野においてよく知られている 。これらはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、およびホスホトリエステ ルを包含するが、これらに限定されない。 本発明の好ましい態様は、プテリジンヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成 において試薬として使用するために誘導化および保護されている化合物である。 特に反応性還外アミンを保護し、そして３’−ヒドロキシルをＨ−ホスホネート またはホスホルアミダイト として誘導化する。この方法において誘導体化された式III〜ＸＩにより例示さ れる化合物は特に好ましい。 こうして、好ましい第１態様は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂で あり、そしてＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダ イトである、式IIIにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチル であり、Ｒ²²はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホ スホルアミダイトである。なお特に、Ｒ¹²はジメチルアミノメチレンアミノであ る。 好ましい第２態様は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そし てＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである 、式IVにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²² はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダ イトである。なお特に、Ｒ¹²はジメチルアミノメチレンアミノである。 好ましい第３態様は、Ｒ²⁰が式IIでありそしてＲ²³がＨ−ホスホネートまたは ホスホルアミダイトである、式IVにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメト キシトリチルであり、Ｒ²²はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイ ソプロピルホスホルアミダイトである。 好ましい第４態様は、Ｒ¹⁶が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そし てＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである 、式VIにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²² はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダ イトである。なお特に、Ｒ¹⁶はジメチルアミノメチレンアミノである。 好ましい第５態様は、Ｒ¹⁶が保護基で１または２置換されたNH₂ であり、そしてＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミ ダイトである、式VIIにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチ ルであり、Ｒ²²はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル ホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ¹⁶はジメチルアミノメチレンアミノで ある。 好ましい第６態様は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そし てＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである 、式VIIIにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²² はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミ ダイトである。なお特に、Ｒ¹²はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである 。 好ましい第７態様は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そし てＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである 、式IXにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²² はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダ イトである。なお特に、Ｒ¹²はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。 好ましい第８態様は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そし てＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである 、式Ｘにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²² はＨでありそしてＲ²³はβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダ イトである。なお特に、Ｒ¹²はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。 好ましい第９態様は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そし てＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がＨ−ホスホネートまたはホスホルアミダイトである 、式Ｘにより例示される。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²² はＨでありそしてＲ²³はβ −シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである。なお特に、Ｒ¹² はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。 本発明のオリゴヌクレオチドは、固相においてまた溶液中で合成することがき る。一般に、固相合成は好ましい。ホスファイトトリエステル、ホスホトリエス テル、およびＨ−ホスホネートの化学によるオリゴヌクレオチドの固相合成の手 法の詳細な説明は広く入手可能である。参照、例えば、Itakura 、米国特許第 4 ,401,796号；Caruthers et al.、米国特許第 4,458,066号および米国特許第 4,5 00,707号；Beaucage et al.，Tetrahedron Lett.，22：1859-1862（1981）；Mat teucci et al.，J．Am．Chem．Soc．103：3185-3191（1981）；Caruthers et al .，Genetic Engineering，４：1-17（1982）；Jones，chapter 2，Atkinson et al.，chapter 3、およびSproar et al.，chapter 4，Gait編、Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press，Washington D．C．（1984）；F roehler et al.，Tetrahedron Lett.，27：469-472（1986）；Froehler et al. ，Nucleic Acids Res.，14：5399-5407（1986）；Sinha et al.，Tetrahedron L ett.，24.5843-5846（1983）；およびSinha et al.，Nucl．Acids Res.，12：45 39-4557（1984）これらは引用することによって本明細書の一部とされる。 一般に、カップリングサイクルにおいて利用する試薬の供給のタイミングおよ び濃度は、商業的DNA 合成において使用する未修飾の商用ホスホルアミダイトに ついて典型的なプロトコールと異なる。これらの場合において、本発明のプテリ ジン誘導体を含有する溶液を、商業的合成装置（例えば、380B型、Applied Bios ystems、米国カリフォルニア州フォスターシティー）上に余分のホスホルアミダ イトのために設けられた口上の容器に単に添加することができる。しかしながら 、特定の誘導化プテリジン化合物のカップリング効率 が他のホスホルアミダイトより実質的に低い場合、合成を最適化するために試薬 の供給のタイミングおよび濃度を変更することが必要であることがある。低いカ ップリング効率を補正するためにオリゴヌクレオチド合成のプロトコールを最適 化する手段は、この分野においてよく知られている。一般に、試薬の濃度または 試薬の供給量を単に増加して、より高いカップリング効率を達成する。また、カ ップリング効率を決定する方法はよく知られている。例えば、５’−ヒドロキシ ル基がジメトキシトリチル(DMT)である場合、酸ステップ(DMT基を除去する）に おけるDMT カチオン濃度を測定することによって、カップリング効率を決定する ことができる。DMT カチオン濃度は、通常、酸性洗浄液を分光光度計でモニター することによって決定される。酸／DMT 溶液は鮮明なオレンジ色である。また、 カップリングが起こらなかった場合、キャッピングはオリゴヌクレオチドのさら にエクステンションを防止するので、例えば、毛管電気泳動またはHPLCを使用し て、切形／全長のオリゴヌクレオチドの比を比較することによって、カップリン グ効率を推定することができる。 固相オリゴヌクレオチド合成は、多数の固体の支持体を使用して実施すること ができる。適当な支持体は、合成されたオリゴヌクレオチドにおいて３’末端塩 基となるであろう保護されたモノマーを取り付ける官能基を提供する支持体であ る。支持体は、特定の合成化学において利用される試薬に対して不活性でなくて はならない。固体の支持体物質は、ポリアクリロイルモルホリド、シリカ、コン トロールされた孔のガラス(CPG)、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、 およびカルボキシル変性テフロンを包含するが、これらに限定されない。好まし い支持体は、アミノ官能化コントロールされた孔のガラスおよびカルボキシル官 能化テフロンである。 固相オリゴヌクレオチド合成は、出発点として、固体の支持体にカップリング された完全に保護されたモノマー（例えば、プテリジンヌクレオシド）を必要と する。このカップリングは典型的にはリンカーに共有結合した３’−ヒドロキシ ル（カップリングしたときオキソ）であり、次いでこれを固体の支持体に共有結 合させる。次いで、第１合成サイクルはモノマーを、その３’−ホスフェートを 介して、３’−５’ホスホジエステル結合を形成する縮合反応により結合ヌクレ オシドの５’−ヒドロキシルにカップリングさせる。引き続く合成サイクルは、 最後の結合ヌクレオシドの５’−ヒドロキシルにヌクレオチドモノマーを付加す る。この方法において、オリゴヌクレオチドは３’→５’の方向に合成されて、 固体の支持体にその３’末端を結合した「成長する」オリゴヌクレオチドを生成 する。 固体の支持体にヌクレオシドモノマーを結合する多数の手段は当業者に知られ ているが、スクシネートまたはヘミスクシネートを通してコントロールされた孔 のガラスに共有結合したモノマーは一般に好ましい。ヘミスクシネートを通して コントロールされた孔のガラスにカップリングした慣用の保護されたヌクレオシ ドは、多数の源から商業的に入手可能である（例えば、Glen Research 、米国バ ーモント州スターリング、Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスタ ーシティー、Pharmacia LKB 、米国ニュージャージイ州ピスカタウェイ）。 オリゴヌクレオチドの３’末端におけるプテリジンヌクレオチドの配置は、固 体の支持体に結合した完全にブロックされたフラノシルプテリジンを使用してオ リゴヌクレオチド合成を開始することを必要とする。好ましい態様において、プ テリジンヌクレオチドの結合はまずプテリジンヌクレオチドをヘミスクシネート として誘導化 することによって達成される。次いで、縮合剤としてメシチレン−２−スルホニ ルクロライド／１−メチル−1H−イミダゾールを使用する縮合反応において、ヘ ミスクシネートをアミノ官能化されたコントロールされた孔のガラスに取り付け ることができる。多数の異なる反応性基で官能化されたコントロールされた孔の ガラスは商業的に入手可能である（例えば、Sigma Chemicals、米国ミゾリー州 セントルイス）。同様なカップリングスキームは下記の参考文献に記載されてい る：Atkinson et al.，chapter 3，Gait編、Oligonucleotide Synthesis：A Pra ctical Approach，IRL Press，Washington D．C．(1984)。また、トリイソプロ ピルベンゼンスルホニルクロライド、イミダゾリド、トリアゾリドまたはさらに テトラゾリドを縮合剤として使用することができる。ジシクロヘキシルカーボジ イミド(DCC)および構造類似体はまた適当なリンカーである。他のリンカーおよ び適当な縮合剤は当業者によく知られている。 好ましい態様において、したがって、本発明は、５’−ヒドロキシルがヘミス クシネートとして誘導体化され、次いで固体の支持体に、特にコントロールされ た孔のガラスに共有結合させることができる、プテリジンヌクレオチドを提供す る。この方法において誘導化された式III〜ＸＩにより例示される化合物は特に 好ましい。 こうして、第１の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹²が保護基で１または ２置換されたNH₂であり、そしてＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がヘミスクシネート、 または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式IIIの化合物を 提供する。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨであり、そ してＲ²³はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートであ る。なお特に、Ｒ¹²はジメチルアミノメチレンアミノである。 第２の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹²が保護基で１また は２置換されたNH₂であり、そしてＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がヘミスクシネート 、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式IVの化合物を 提供する。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨであり、そ してＲ²³はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートであ る。なお特に、Ｒ¹²はジメチルアミノメチレンアミノである。 第３の好ましい態様において、本発明は、Ｒ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がヘミスク シネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式Ｖの 化合物を提供する。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨで あり、そしてＲ²³はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネ ートである。 第４の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹⁶が保護基で１または２置換され たNH₂であり、そしてＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がヘミスクシネート、または固体 の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式VIの化合物を提供する。特 に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨであり、そしてＲ²³はコ ントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に 、Ｒ¹⁶はジメチルアミノメチレンアミノである。 第５の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹⁶が保護基で１または２置換され たNH₂であり、そしてＲ²⁰が式IIであり、Ｒ²³がヘミスクシネート、または固体 の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式VIIの化合物を提供する。 特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨであり、そしてＲ²³は コントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特 に、Ｒ¹⁶はジメチルアミノメチレンアミノである。 第６の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換され たNH₂であり、そしてＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がヘミ スクシネート、または固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式 VIIIの化合物を提供する。特に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²² はＨであり、そしてＲ²³はコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミス クシネートである。なお特に、Ｒ¹²はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルで ある。 第７の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換され たNH²であり、そしてＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がヘミスクシネート、または固体 の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式IXの化合物を提供する。特 に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨであり、そしてＲ²³はコ ントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に 、Ｒ¹²はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。 第８の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換され たNH₂であり、そしてＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がヘミスクシネート、または固体 の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式Ｘの化合物を提供する。特 に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨであり、そしてＲ²³はコ ントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に 、Ｒ¹²はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。 第９の好ましい態様において、本発明は、Ｒ¹²が保護基で１または２置換され たNH₂であり、そしてＲ¹⁷が式IIであり、Ｒ²³がヘミスクシネート、または固体 の支持体に共有結合したヘミスクシネートである、式Ｘの化合物を提供する。特 に、式IIのＲ²¹はジメトキシトリチルであり、Ｒ²²はＨであり、そしてＲ²³はコ ントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである。なお特に 、Ｒ¹²はｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである。 還外アミンがｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルにより保護 されている態様において、脱保護試薬は、また、３’末端ヌクレオシドを固体の 支持体に結合するトリスクシニルスペーサーのエステル官能基を切断することが できる。この場合において、Stengele et al.，Tetrahedron Lett.，18：2549-2 552(1990)（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載され ているカップリングスキームは好ましい。この方法において、固体の支持体（ジ ヒドロキシプロピル−CPG，500Åおよび1400Å，Fluka AG、スイス国、カタログ No．27754，27764，2770）をまずＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールと反応さ せ、次いで脂肪族第２アミンスペーサーとして１，６−ビスメチルアミノヘキサ ンと反応させる。次いでこの化合物を適当に保護された２’−ヌクレオシド−３ ’−Ｏ−スクシネートとカップリングさせ、引き続いて固体の支持体の遊離ヒド ロキシル基を酢酸無水物および４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）とカップリ ングさせる。このリンカーはｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルおよびｐ− ニトロフェニルエチレン基について使用した脱保護条件下に完全に安定であるが 、マトリックスからの切断は通常濃アンモニア中の加水分解条件下に２時間より 短い時間で達成することができる。 いったん全長のオリゴヌクレオチドか合成されると、保護基を除去し（オリゴ ヌクレオチドを脱保護し）、次いで使用する前にオリゴヌクレオチドを固体の支 持体から切断する。（テフロンの固体の支持体を使用する場合、オリゴヌクレオ チドを支持体に永久的に取り付けてアフィニティーカラムを調製することができ る。）切断および脱保護は同時にまたは任意の順序で順次に実施することができ る。２つの手法は介在させ、こうしていくつかの保護基をオリゴヌクレオチドか ら除去した後、それを固体の支持体から切断し、そして他の基を溶液中で切断し たオリゴヌクレオチドから脱保護する。 事象の順序は存在する特定のブロッキング基、固体の支持体の特定の結合、およ び合成を実施する個人の好みに依存する。脱保護が切断に先行する場合、保護基 を固体の支持体に結合したままであるオリゴヌクレオチドから洗浄除去すること ができる。逆に、切断に引き続いて脱保護を実施する場合、除去した特定の基は オリゴヌクレオチドとともに溶液の中に残るであろう。しばしばオリゴヌクレオ チドは使用する前にこれらの保護基から単離することが必要であろう。 好ましい態様、および大部分の商業的DNA 合成において、５’−ヒドロキシル 上の保護基を合成の最後の段階において除去する。次いでオリゴヌクレオチドを 固体の支持体から切断し、残りの脱保護基を溶液中で実施する。５’−ヒドロキ シル保護基の除去は、典型的には、次のヌクレオチドモノマーのカップリング前 に末端の５’−ヒドロキシル基を除去するために、合成を通じて利用する同一試 薬で処理することをちょうど必要とする。５’−ヒドロキシル保護基はジメトキ シトリチル基である場合、脱保護は酢酸、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を 使用する処理により達成することができる。 典型的には、まず固相支持体に取り付けられたオリゴヌクレオチド（塩基不安 定性結合）を切断剤に約１〜２時間暴露し、こうしてオリゴヌクレオチドが固体 の支持体から解放されるようにし、次いで解放されたオリゴヌクレオチドを含有 する切断試薬を少なくとも20〜60分間約80〜90℃に加熱し、こうして還外アミン に取り付けられた保護基を除去することによって、還外アミンの切断および脱保 護の双方を実施する。また、脱保護ステップはより低い温度において実施するこ とができるが、より大きい時間の間実施しなくてはならない。（例えば、加熱は ５時間の間55℃であることができる）。 一般に、好ましい切断および脱保護は濃アンモニアである。 オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドでありそして２’−ヒドロキシル基が ｔ−ブチルジメトキシトリチルシリル(TBDMS)によりブロックされている場合、 後者の基はテトラブチルアンモニウムフルオライドを使用して合成の終わりにお いて除去することができる。Wu et al.，J．Org．Chem．55：4717-4724(1990)参 照。フェノキシアセチル基はアルコール中で無水アンモニアを使用して除去する ことができる（これらの条件下にTBDMS 基は安定であり、そしてオリゴヌクレオ チドは切断されない）。シチジンのベンゾイル保護基は、また、アルコール中の 無水アンモニアで除去される。 還外アミンをｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル基で保護しそして固体の 支持体へのカップリングがスクシネートヌクレオシドと縮合した１，６−ビス− メチルアミノヘキサンを介する場合、アミノ基は好ましくは１ＭのDBU(１，８− ジアザ−ビシクロ〔５．４．０〕−ウンデク−７−エン)を使用する処理により 脱保護される。次いで、固体の支持体からのオリゴヌクレオチドの切断は濃アン モニアを使用する処理により達成される。 脱保護に対するこの後者のアプローチを使用する場合、それぞれ、アミドおよ びアミンの保護のためにｐ−ニトロフェニルエチルおよひｐ−ニトロフェニルエ トキシカルボニル基を使用して保護されたプテリジン、アデニン、チミジン、グ アノシン、シチジン、ウラシル、および修飾されたヌクレオチドモノマーを使用 してオリゴヌクレオチドを合成することが好ましい。Barone et al.，Nucleic A cids Res．12．4051-4061（1984）を引用するStengeleおよびPfleiderer，Tetra hedron Lett.，31：2549-2552(1990)を参照のこと。次いで、単一の脱保護のプ ロトコールはオリゴヌクレオチドのすべての構成ヌクレオチドを脱保護するであ ろう。 切断されそして完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドは多数の用途において 直接使用することができる（凍結乾燥または蒸発させて脱保護試薬を除去した後 ）か、または使用前に精製することができる。脱保護工程において除去された保 護基から、そして最も重要なことには、次のヌクレオチドとカップリングできな かったオリゴヌクレオチドを合成の間にキャッピングするとき形成した切形オリ ゴヌクレオチドから、全長のオリゴヌクレオチドを単離するために、合成オリゴ ヌクレオチドの精製は一般に望ましい。 オリゴヌクレオチドの精製技術は当業者によく知られている。方法は下記のも のを包含するが、これらに限定されない：シリカプレート上の薄層クロマトグラ フィー(TLC)、ゲル電気泳動、大きさ分画（例えば、Sephadexカラムを使用して ）、逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）およびアニオン交換クロマトグ ラフィー（例えば、モノＱカラム、Pharmacia-LKB 、米国ニュージャージイ州ピ スカタウェイ、を使用する）。オリゴヌクレオチドの精製の説明については、下 記の参考文献を参照のこと：McLaughlin et al.，chapter 5、およびWu et al. ，chapter 6，Gait編、Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IR L Press，Washington D．C．(1984)。 本発明のオリゴヌクレオチドは、配列に対して内部または末端における、配列 の１または２以上の位置にプテリジンヌクレオチドを含有する。本発明のオリゴ ヌクレオチドは１または２以上の位置に単一のプテリジン誘導体を含有すること ができるか、または２またはそれ以上の異なるプテリジン誘導体を含有すること ができる。オリゴヌクレオチドは完全にプテリジンヌクレオチドから成るか、ま たは天然に存在するおよび／または修飾されたヌクレオチドを含有することがで きる。修飾されたヌクレオチドは当業者によく知られ ており、そして下記のものを包含するが、これらに限定されない：イノシン、５ −ブロモデオキシシチジン、５−ブロモ−デオキシウリジン、Ｎ⁶−メチル−デ オキシアデノシンおよび５−メチル−デオキシシチジン。これらのヌクレオチド のホスホルアミダイトの形態は、例えば、下記の会社を包含する多数の源から商 業的に入手可能である：Applied Biosystems，Inc.、米国カリフォルニア州フォ スターシティー、Clonetech 、米国カリフォルニア州パロアルト、およびGlen R esearch、米国バーモント州スターリング。 好ましい態様において、本発明は、下記式ＸIIを有する１種または２種以上の ヌクレオチドモノマーを含んでなるオリゴヌクレオチドを提供する。 ヌクレオチドモノマーは示すように環の頂点１〜８をもつプテリジン誘導体であ り、式中Ｒ¹⁶，Ｒ¹⁸、およびＲ¹⁹は式Ｉについて記載されている通りであるが、 ただし保護基は排除されている。こうして、Ｒ¹²は、Ｒ¹¹と組合わされないとき 、NH₂であり、そしてＲ¹⁶はＲ¹⁵と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、またはN H₂であり、Ｒ¹⁷は、Ｒ¹⁵と結合しないとき、そしてＲ²⁰はＲ¹⁸と結合しないとき 、式ＸIIIの化合物である。 式中、記号Ｒ²²は水素またはヒドロキシルを表す。 好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノマーを含 んでなり、式中Ｒ¹⁴は水素、メチルまたはフェニル、特に水素またはメチルであ る。 他の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノマー を含んでなり、式中Ｒ¹⁶はＲ¹⁵と結合しないとき、水素、フェニル、またはアミ ノ基であり、特に水素およびフェニルである。 なお他の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノ マーを含んでなり、式中Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹は水素またはメチルで ある。 さらに好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは式ＸIIのモノマ ーを含んでなり、式中Ｒ¹⁴は水素、メチル、またはフェニルであり、Ｒ¹⁶は水素 、フェニルまたはアミノであり、そして、Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹は水 素またはメチルである。 本発明の組成物の中で、９つのヌクレオチドモノマーの１または２以上のを含 んでなるオリゴヌクレオチドは特に好ましい。第１の好ましいヌクレオチドモノ マーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間 で二重結合を形成し、Ｒ¹²はアミノ基であり、Ｒ¹⁴は水素であり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と 結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶はフェニルであり、Ｒ¹⁸ はＲ¹⁹と組合わされて環の頂点７に二重結合により接合した単一 のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式ＸIVである。このヌクレオチドモノマー は式ＸIVにより例示され、式中Ｒ²²はOHであり、より好ましくはＲ²²はＨである 。 第２の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹³ と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂であり、Ｒ^{1 4} はフェニルであり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を 形成し、Ｒ¹⁶は水素であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて環の頂点７に二重結合に より接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式ＸIIIである。このヌ クレオチドモノマーは式ＸＶにより例示され、式中Ｒ²²はＨであり、より好まし くはＲ²²はＨである。 第３の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹² と結合して環の頂点４に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、 Ｒ¹³はCH₃であり、Ｒ¹⁴はＨであり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との 間で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶はNH₂であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて環の頂点 ７に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式ＸIII である。このヌクレオチドモノマーは式ＸVIにより例示され、式中Ｒ²²はＨまた はOHであり、より好ましくはＲ²²はＨである。 第４の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹² と結合して環の頂点４に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、 Ｒ¹³はＨであり、Ｒ¹⁴はＨであり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間 で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶はNH₂であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて環の頂点７ に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式ＸIIIで ある。このヌクレオチドモノマーは式ＸVIIIにより例示され、式中Ｒ²²はＨまた はOHであり、より好ましくはＲ²²はＨである。 第５の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹² と組合わされて環の頂点４に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成 し、Ｒ¹³は水素であり、Ｒ¹⁴はCH₃であり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁷と結合して環の頂点１と ２との間で二重結合を形成し、Ｒ¹⁶はNH₂であり、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて環 の頂点７に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰は式 ＸIIIである。このヌクレオチドモノマーは式ＸVIIIにより例示され、式中Ｒ²² はＨまたはOHであり、より好ましくはＲ²²はＨである。 第６の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹³ と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂であり、Ｒ^{1 4} はCH₃であり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わさ れて環の頂点２に二重結合により接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式 ＸIIIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し 、そしてＲ¹⁹はCH₃である。このヌクレオチドモノマーは式ＸIXにより例示され 、式中Ｒ²²はＨまたはOHであり、より好ましくはＲ²²はＨである。 第７の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹³ と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂であり、Ｒ^{1 4} はＨであり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて環の頂点２に二重結合により接合した 単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式ＸIIIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の 頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はCH₃である。このヌクレオ チドモノマーは式ＸＸにより例示され、式中Ｒ²²はＨまたはOHであり、より好ま しくはＲ²²はＨである。 第８の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹³ と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂であり、Ｒ^{1 4} はCH³であり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて環の頂点２に二重結合により接合した 単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式ＸIIIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の 頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はＨである。このヌクレオチ ドモノマーは式ＸＸＩにより例示され、式中Ｒ²²はＨまたはOHであり、より好ま しくはＲ²²はＨである。 第９の好ましいヌクレオチドモノマーは式ＸIIにより例示され、式中Ｒ¹¹はＲ¹³ と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、Ｒ¹²はNH₂であり、Ｒ^{1 4} はＨであり、Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて環の頂点２に二重結合により接合した 単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹⁷は式ＸIIIであり、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の 頂点７と８との間で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はＨである。このヌクレオチ ドモノマーは式ＸＸIIにより例示され、式中Ｒ²²はＨまたはOHであり、より好ま しくはＲ²²はＨである。 特定のプテリジンヌクレオチドおよびそれらの位置の選択は、オリゴヌクレオ チドを意図する特定の用途に依存するであろう。当業者は認識するように、プテ リジン誘導体の蛍光シグナルはpHおよび付近の分子の特定の化学jこより影響を 受けるであろう。一般に、付近のプリンは付近のピリミジンよりも多くシグナル をクエンチングする傾向があるであろう。プリンは主要な付近の物質としてシグ ナルを厳しくクエンチングし、そして２次付近の物質としてさえ有意な作用を有 する。第３プリンはクエンチャーとして強力ではない。さらに、ヌクレオチドの 末端付近においてシグナルのクエンチングは最小となる。したがって、完全なオ リゴヌクレオチドから強いシグナルを望む場合、プテリジンヌクレオチドは末端 にまたはその付近に位置し、そして１または２以上のピリミジンに隣接してシグ ナルのクエンチングを減少することが好ましい。逆に、オリゴヌクレオチドを切 断する（例えば、エンドヌクレアーゼにより）ときのみオリゴヌクレオチドがシ グナルを提供することを望む場合、プテリジン誘導体をクエンチング基（プリン ）に密接させるが、オリゴヌクレオチドを切断するとき、クエンチング塩基から プテリジンを含有する鎖を分離することが期待された位置に配置し、これにより 蛍光シグナルを解放することが好ましい。後者のアプローチは実施例12に例示さ れている。 したがって、１つの態様において、プテリジンヌクレオチドは３’末端に位置 するが、他の実施態様において、プテリジンヌクレオチドは本発明のオリゴヌク レオチドの５’末端に位置する。 なお他の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは１〜10ピリミジンモノ マーにより囲まれているプテリジンヌクレオチドのモノマーを含んでなる。 本発明のオリゴヌクレオチドは短い一本鎖の配列に限定されない。当業者は認 識するように、オリゴヌクレオチドの合成は典型的にはほぼ200塩基の上限を有 するが、多数のオリゴヌクレオチドを一緒に結合してより長い配列を形成するこ とができる。さらに、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを一緒にハイブリ ダイゼーションして二本鎖の分子を形成することができる。オリゴヌクレオチド をハイブリダイゼーションおよび結合して長い二本鎖の分子を形成する方法はよ く知られている。参照、例えば、Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Labo ratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New Yo rk，1985)。 本発明のプテリジン誘導体は、天然に存在するプリンに構造的に類似する。オ リゴヌクレオチドの中に組込むとき、プテリジン誘導体は蛍光性標識として作用 するが、現在入手可能な蛍光性標識と同程度に厳しくはオリゴヌクレオチドの生 理的および化学的性質を変更しない。ある場合において、混乱は非常に小さいの で、酵素機能にとって重要であることが知られている部位において置換を行った ときでえ、酵素を触媒とする反応を可能とする酵素基質としてオリゴヌクレオチ ドは作用することができる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは DNA− タンパク質の相互作用の研究において特に有用である。 １つのこのような相互作用は、DNA とウイルス組込み（IN）タン パク質との間の相互作用により例示される。インテグラーゼは、ヒトゲノムの中 へのHIV ウイルス遺伝子の組込みに関係づけられたウイルス組込みタンパク質で ある。Engleman et al.，Cell，67：1211-1221(1991)。したがって、インテグラ ーゼは細胞のHIV 感染に対して重要であるように思われ、そしてエイズ抗ウイル スの研究にとって極めて重要な標的を提供することがある。 特定のDNA 配列（５’−GTG TGG AAA ATC TCT AGC AGT −３’、配列識別No： １）は、HIV インテグラーゼ酵素のための有効なモデルとして使用されてきてい る。同上。この酵素は、段階的方法で、宿主細胞のゲノムの中へのHIV ゲノムの 調製および実際の挿入を達成する機能をする。このメカニズムにおける第１ステ ップは、配列の配列の３’末端からジヌクレオチドの切断して５’オーバーハン グを残すように思われる。本発明の多数のプテリジンヌクレオチド（例えば、式 Ｖまたは式VIにより例示される化合物）はグアノシンに構造的に類似するので、 インテグラーゼにより切断されるジヌクレオチドにおいてグアノシンの代わりに 使用することができる。完全なDNA 配列において、付近のプリンはプテリジンヌ クレオチドのシグナルをクエンチするであろう。インテグラーゼによる鎖からの ヌクレオチドの切断はクエンチされた蛍光シグナルを解放し、そして蛍光の増加 の検出により反応の実時間のモニターを可能とする。これはインテグラーゼ酵素 の活性についての簡単かつ急速なアッセイを提供する。 したがって、なお他の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、 HIV− １DNA のＵ５末端をつくり、インテグラーゼの基質として作用し、そして下記の 配列から成る群より選択される： および 。 ここでＡはアデノシンヌクレオチドであり、Ｃはシトシンヌクレオチドであり 、Ｇはグアノシンヌクレオチドであり、Ｔはチミジンヌクレオチドであり、そし てＮは式ＸVI、式ＸVII、または式ＸVIIIのプテリジンヌクレオチドであり、式 中Ｒ²²はＨまたはOHであり、より好ましくはＲ²²はＨである。 もちろん、プテリジンヌクレオチドおよびプテリジンオリゴヌクレオチドは、 多数の関係においてDNA と他の分子との相互作用を研究するために利用すること ができる。例えば、式ＸIX，ＸＸ，ＸＸＩ、およびＸＸIIのプテリジンヌクレオ チドは、他の特許請求した 化合物の大部分とのエネルギー転移を達成することができる。これらの化合物は 宿主ゲノムの中への外来DNA の挿入をモニターするために使用することができ、 ここでヌクレオチドを含有するDNA 鎖は他の特許請求した化合物の１つを含有す るDNA 鎖に対して近接させる。これはエネルギー転移を発生させ、その結果新し い不連続のシグナルを放射させる。 当業者は認識するように、本発明のプテリジン誘導体は、また、ほとんど任意 の生物学的分子を標識化するための蛍光標識として単に使用することができる。 未保護のプテリジン単独は、直接に、またはリンカーまたはスペーサーを通して 、プテリジン１Ｎまたは８Ｎにより、標識化しようとする組成物に結合すること ができる。また、プテリジンヌクレオシドは蛍光標識として使用することができ る。プテリジンヌクレオシドは、好ましくは５’−ヒドロキシル、３’−ホスフ ェート、または２’−ヒドロキシル（リボフラノースの場合において）を通して 直接、またはリンカーを通して、標識化しようとする組成物に結合することがで きる。このような標識化組成物は、生物学的分子、例えば、抗体、リガンド、細 胞表面レセプター、および酵素を包含するが、これらに限定されない。 in vitroまたはin vivo において係合標識化されたオリゴヌクレオチドを検出 する方法は当業者によく知られている。これらの手段は、直接可視化、蛍光顕微 鏡検査、フルオロメーター、写真的検出、画像増強を使用する検出、光電子倍増 管、ビデオカメラなどを包含するが、これらに限定されない。もちろん、特定の 方法は特定の実験に依存する。例えば、オリゴヌクレオチドを酵素活性について 、または１対の分子の間のエネルギー転移についてのアッセイとして使用する場 合、反応はフルオロメーターにより溶液中で実施することができる。オリゴヌク レオチドをインサイチュ・ハイブリダイ ゼーションのプローブとして使用する場合、画像獲得システム（例えば、蛍光顕 微鏡と画像処理システムとの組み合わせを有するCCD ビデオカメラ）を使用して 検出を実施することができる。 本発明のヌクレオチドトリホスフェート化合物は、DNA 増幅技術、例えば、ポ リメラーゼ連鎖反応（Innis，et al.，PCR Protocols，A Guide to Methods and Application，Academic Press，Inc．San Diego，(1990)）、リガーゼ連鎖反応 （LCR）(参照、Wu et al.，Genomics，４：560(1989)，Landegren，et al.，Sci ence，241：1077(1988)およびBarringer，et al.，Gene，89：117(1990))、転写 増幅(参照、Kwoh，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．(U．S．A.)，86：1173(198 9))および自己持続配列複製（参照、Guatelli，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．(U．S．A.)，87：1874（1990）においてDNA 合成のモノマーとして利用するこ とができる。本発明のプテリジンヌクレオチドを利用する増幅は、特定のDNA 配 列について急速なアッセイを提供する。特定のDNA 配列の存在または非存在が病 理的症状（例えば、AIDS）の診断である場合、プテリジンヌクレオチドトリホス フェートを使用する増幅は極端に感受性の急速な診断道具を提供する。 例えば、PCR 増幅を使用する場合、問題のDNA 配列をフランキングするDNA 配 列に対して相補的である１対のPCR プライマーを選択する。適切な標的配列が試 料の中に存在する場合、プライマーの間のDNA 配列を増幅されるであろう。この 増幅されたDNA 配列はプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを含有するであ ろう。増幅された配列は、混合物の中に残留するモノマーから、簡単な大きさ分 画（例えば、NAP カラム、Pharmacia−LKB 、米国ニュージャージイ州ピスカタ ェイ）またはよく知られている他の技術により分離することができる。次いで、 増幅された配列の存在または非存在は、 残留する混合物の蛍光を測定することによって直ちに検出することができる。 また、蛍光偏光（FP）の測定を使用して、プライマーおよびヌクレオチドモノ マーからのPCR 生成物の分離を必要としないで、陽性または陰性のPCR 反応を検 出することができる。この技術はプテリジンヌクレオチドのモノマー、またはプ テリジンヌクレオチドのモノマーを組込んだ比較的短い、各々約25塩基対のプラ イマーを使用する。PCR 法が完結した後、得られる混合物をFPを使用して、励起 波長の偏光ビームを混合物に通過させることによって分析する。標的配列が出発 混合物の中に存在しない場合、蛍光性プライマーは溶液の中に比較的小さい一本 鎖の断片として残留するか、または蛍光性ヌクレオチドモノマーは溶液の中に比 較的小さい分子として残留するであろう。モノマーまたは短いプライマー断片は 、比較的散乱した、非偏光の蛍光を放射するであろう。対照的に、標的配列が存 在する場合、プテリジンモノマーまたは蛍光性プライマーは励起シグナルに対し て応答していっそうゆっくり動く、より大きい二本鎖のセグメントの中に組込ま れ、そして混合物が放射する蛍光はいっそう偏光されているであろう。参照、欧 州特許（EP）第382433号、これはこの技術を詳細に記載している。 したがって、本発明は式Ｉのプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを提供 する。式III〜ＸＩのトリホスフェート化合物は特に好ましい。したがって、第 １の好ましいトリホスフェートは式IIIであり、式中Ｒ¹²はNH₂であり、そしてＲ²⁰ は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、そして Ｒ²³はＨである。 第２の好ましいトリホスフェートは式IVであり、式中Ｒ¹²はNH₂であり、そし てＲ²⁰は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートで あり、Ｒ²²はＨであり、そしてＲ²³はＨである。 第３の好ましいトリホスフェートは式Ｖであり、式中Ｒ²⁰は式IIであり、式中 Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、そしてＲ²³はＨである。 第４の好ましいトリホスフェートは式VIであり、式中Ｒ¹⁶はNH₂であり、そし てＲ²⁰は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、そ してＲ²³はＨである。 第５の好ましいトリホスフェートは式VIIであり、式中Ｒ¹⁶はNH₂であり、そし てＲ²⁰は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、そ してＲ²³はＨである。 第６の好ましいトリホスフェートは式VIIIであり、式中Ｒ¹²はNH₂であり、そ してＲ¹⁷は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、 そしてＲ²³はＨである。 第７の好ましいトリホスフェートは式IXであり、式中Ｒ¹²はNH₂であり、そし てＲ¹⁷は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、そ してＲ²³はＨである。 第８の好ましいトリホスフェートは式Ｘであり、式中Ｒ¹²はNH₂であり、そし てＲ¹⁷は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、そ してＲ²³はＨである。 第９の好ましいトリホスフェートは式ＸＩであり、式中Ｒ¹²はNH₂であり、そ してＲ¹⁷は式IIであり、式中Ｒ²¹はトリホスフェートであり、Ｒ²²はＨであり、 そしてＲ²³はＨである。 本発明の追加の面は、前述のアッセイの実施において有用なキットに関する。 これらのキットは種々の形態を取ることができ、そして配列の特定の増幅プライ マーおよび１または２以上のプテリジンヌクレオチドトリホスフェートを含有す る１または２以上の容器を含んでなる。キットの他の任意の成分は、例えば、ポ リメラーゼ、 モノマーを増幅された混合物から分離するために使用する手段、およびPCR また は他の増幅反応のための適当な緩衝液を包含する。上記成分に加えて、キットは また前述の方法を実施するための説明書を含有することができる。 特許請求するプテリジンヌクレオチドは、当業者によく知られている標準的方 法により合成することができる。一般に、保護されたプテリジン誘導体を４−ク ロロベンゾイルまたはパラトルエンスルホニルエステルとして保護された３’− または５’−ヒドロキシルを有するクロロフラノースと反応させて、プテリジン ヌクレオシドを生成する。参照、例えば、Kiriasis et al.，p．49-53，Chemist ry and Biology of Pteridines，Kisliuk およびBrown 編、Elsevier North Hol land，Inc.，N．Y．(1979)，Schmid et al.，Chem．Ber．106：1952-1975(1973) ，Pfleidere 、米国特許第 3,798,210号、Pfleidere 、米国特許第 3,792,036号 、Herris et al.，Liebigs Ann．Chem.，1457-1468（1981）、これらは種々のプ テリジンヌクレオシドの合成を例示し、そして引用することによって本明細書の 一部とされる。参照、また、実施例１〜４、これらはプテリジンヌクレオシドの 合成を記載している。カップリング後、保護基を除去し、５’−ヒドロキシルを そのジメトキシトリチルエーテルに交換する。引き続いて５’−ヒドロキシルを Ｈ−ホスホネート、ホスホアミダイト、またはヘミスクシネートに変換すると、 所望の化合物が得られる。 還外アミンまたは保護されたアミンを生成物において望む場合、それはいくつ かの段階の任意の段階において導入することができる。例えば、出発プテリジン は、それ以上の操作の前に保護アミン置換基を含有することができる（例えば、 式IIIの化合物を参照のこと）。また、アミンは後の段階においてオキソ部分を チオンに変換し 、次いでアンモニアでアミン化することによって導入することができる（例えば 、式IIIのホスホアミダイトの合成を記載する実施例８を参照のこと）。アミン を導入するなお他の方法は、２位にメチルチオ置換基を有する出発プテリジンを 使用する（例えば、式Ｖのホスホアミダイトの合成を記載する実施例７を参照の こと）。所望のクロロフラノースとのカップリング後、保護基を除去し、メチル チオ基をアンモニアと置換する。 ヌクレオシドの５’−ヒドロキシルを保護基（好ましくはジメトキシトリチル ）でブロックする。保護基をカップリングする手段は当業者によく知られている 。特に、ジメトキシトリチル基のカップリングは実施例６〜９において例示され ている。簡単に述べると、これは乾燥ピリジン中のヌクレオシドとジメトキシト リチルクロライドとの反応により達成される。他のプロトコールは一般に当業者 に知られている。参照、例えば、Atkinson et al.，chapter 3，Gait編、Oligon ucleotide Synthesis ：A Practical Aproach(IRL Press，Washington，D．C.， 1984)、これは引用することによって本明細書の一部とされる。 プテリジンヌクレオチドの３’−ヒドロキシルは、この分野においてよく知ら れている方法を使用して、そのそれぞれのヘミスクシネート（上に定義したCPG へのカップリングのために）、ホスホアミダイト、Ｈ−ホスホネート、またはト リホスフェートに変換することができる。例えば、ヌクレオシド３’−ヒドロキ シルのヘミスクシネートへの変換は、無水コハク酸との反応により達成すること ができる。Atkinson et al.，chapter 3，Gait編、Oligonucleotide Synthesis ：A Practical Approach（IRL Press，Washington，D．C.，1984）（これは引用 することによって本明細書の一部とされる）は、コントロールされた孔のガラス の官能化およびヌクレオシ ド−３’−Ｏスクシネートの合成およびカップリングを記載している。 ヌクレオシドをホスホアミダイトに変換する方法は、また、当業者によく知れ ている。参照、例えば、Atkinson et al.，chapter 3，Gait編、Oligonucleotid e Synthesis ： A Practical Approach（IRL Press，Washington，D．C.，1984 ）（これは引用することによって本明細書の一部とされる）、これはMcBride お よびCaruthers，Tetrahedron Lett.，24：245（1983）。他のアプローチは実施 例７および８において例示されており、ここにおいてヌクレオシドをβ−シアノ エチル−ビス−ジイソプロピルホスファンとテトラゾール中で反応させる。ホス ホアミダイトの引き続く単離はそれらの実施例に記載されている。 同様に、ヌクレオシドをＨ−ホスホネートに変換する手段は、また、当業者に よく知られている。１つアプローチにおいて、三臭化リン（III）誘導体を使用 して、ヌクレオシドの３’−ヒドロキシルホスフィチレートを直接ホスフィチル 化する。さらに詳しくは、リン（III）トリイミダゾリドを使用して、３’−ヒ ドロキシルをホスフィチル化することができる。この方法は、Garegg et al.，C hemica Scripta，25：280-282（1985）およびTocik et al.，Nucleic Acids Res .，18 193(1987)（それらの双方は引用することによって本明細書の一部とされ る）に詳細に記載されている。同様に、トリス−（１，１，１，３，３，３−ヘ キサフルオロ−２−プロピル）ホスファイトを使用してリボヌクレオシド−Ｈ− ホスホネートを製造することは、Sakatsume et al.，Nucleic Acids Res.，17： 3689-3697(1989)（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記 載されている。ジオキシヌクレオシド−Ｈ−ホスホネートを製造する同一の試薬 の使用は、Sakatsume et al.，Nucleic Ac ids Res.，18：3327-3331(1990)（これは引用することによって本明細書の一部 とされる）に記載されている。Ｈ−ホスホネートを製造する３’−ヒドロキシル の誘導化の他のアプローチは、Sekine et al.，J．Org．Chem.，47：571-573（1 982）；Marugg et al.，Tetrahedron Lett.，23：2661-2664（1986）、およびPo n et al.，Tetrahedron Lett.，26：2525-2528(1985)の中に見出すことができる 。 ３’−ヒドロキシルのトリホスフェートとしての誘導化は、当業者に知られて いる多数の手段により達成することができる。プテリジンヌクレオシドが酵素基 質として活性するために十分な自然ヌクレオチドに対する類似体を有する場合、 モノホスフェートを後述するように化学的に合成し、次いで、それぞれ適当なヌ クレオチドモノホスフェートおよびジホスフェートキナーゼを使用して、酵素的 にジホスフェートに、次いでトリホスフェートに変換することができる。 また、ヌクレオシドはトリホスフェートとして化学的に誘導化することができ る。これはヌクレオシドをトリメチルホスフェートおよびPOCl₃と反応させ、次 いでトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液を添加してヌクレオチドモノホスフ ェートを生成し、次いでこれをクロマトグラフィーにより精製することができる 。次いでヌクレオチドモノホスフェートをカルボニルイミダゾールを使用して活 性化し、トリブチルアンモニウムピロホスフェートとカップリングしてヌクレオ チドトリホスフェートを生成する。次いでヌクレオチドトリホスフェートをトリ エチルアンモニウム塩より安定なナトリウム塩として沈澱させ、分解なしに貯蔵 することができる。 ヌクレオシドのヌクレオチドトリホスフェートへの誘導化は、実施例10におい て詳細に説明されている。 本発明のプテリジン誘導体の合成は実施例に詳細に記載されている。特に、式 III，VI，IX，ＸおよびＸＩのプテリジンヌクレオチドの合成は、それぞれ、実 施例１〜５において例示されている。式IV，Ｖ，VIIIおよびVIIのプテリジンヌ クレオチドホスホアミダイトの合成は、実施例６〜９において例示されている。 プテリジンヌクレオシドのプテリジンヌクレオチドトリホスフェートへの変換は 、実施例10において例示されている。特許請求するプテリジンヌクレオチドの１ つを組込んだジオキシオリゴヌクレオチドの合成、切断および脱保護は実施例11 において例示されている。最後に、インテグラーゼ活性についてのアッセイにお ける特許請求するオリゴヌクレオチドの使用は実施例12において例示されている 。下記の実施例により、本発明を例示するが、これらの実施例は本発明を限定し ない。実施例１ 式IIIのヌクレオシド：４−アミノ−２−フェニル−８−（２−デオキシ−β− Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−７−オン（５）の合成 ａ）イソニトロソマロノニトリルの銀塩（１） 工程（ｂ）において使用するイソニトロソマロノニトリルの銀塩の合成は、Lo ngo，Gazz．Chim．Ital.，61：575（1931）に記載された。酢酸およびH₂O(１／ １)の 120mlの溶液に、20ｇ（0.3mole）（Fluka AG、スイス国）を添加した。こ の混合物を、マロノニトリルが溶解するまで加熱および撹拌した。次いでこの混 合物を０℃に冷却し、 100mlのH₂O中の23ｇ（0.33mole）の亜硝酸ナトリウムの 溶液を撹拌しながらゆっくり添加した。次いでこの溶液を室温において暗所で12 時間撹拌した。このオレンジ色溶液に、 100mlのH₂O中の52ｇ（0.3mole）の溶液 を添加した。生ずる沈殿を集め、低い真空下に濾過し、エーテルで洗浄し、次い でデシケーター中でP₄O₁₀ の存在下に真空下に乾燥すると、１が59.7ｇ（99％の収率、融点＞350℃）。 ｂ）２−フェニル−４，６−ジアミノ−５−ニトロソピリミジン（２） ２−フェニル−４，６−ジアミノ−５−ニトロソピリミジンの合成は、Taylor et al.，J．Am．Chem．Soc.，81：2442-2448（1959）に記載された。小さい部 分、0.11moleの微細なイソニトロソマロノニトリルの銀塩（１）を、 100mlのメ タノール中の0.1moleのベンゾアミジンハイドロハライドの撹拌溶液に添加した 。添加の完結後、１時間撹拌した。この時まで、黄色銀塩は消失し、白色ハロゲ ン化銀の重い沈殿が分離した。反応混合物を濾過し、黄色濾液を室温において減 圧下に蒸発乾固した。粗生成物の収率はほぼ定量的であった。酢酸エチルから再 結晶化させると、イソニトロソマロノニトリルの純粋なベンゾアミジン塩が淡黄 色結晶の形態で得られた（融点 151−150 ℃）。Ｃ₁₀Ｈ₅Ｎ₅Ｏについての分析、 計算値：Ｃ，55.8；Ｈ，4.2；Ｎ，32.5。実測値：Ｃ，55.7；Ｈ，4.0；Ｎ，32.6 。 10mlの２ｇのα−ピコリン中のイソニトロソマロノニトリルのベンゾアミジン 塩の混合物を125〜130 ℃に0.5時間加熱した。塩は急速に溶解し、この混合物の 色は除々に緑色になった。次いで反応混合物を冷却し、H₂Oで希釈した。放置後 濾過すると、２が２−フェニル−５，６−ジアミノ−５−ニトロソピリミジンの 青色がかった結晶として得られた（融点 243−244 ℃）。Ｃ₁₀Ｈ₉Ｎ₅Ｏについて の分析、計算値：Ｃ，55.8；Ｈ，4.2；Ｎ，32.5。実測値：Ｃ，55.9；Ｈ，3.9； Ｎ，32.6。 Ｃ）４−アミノ−２−フェニル−プテリジン−７−オン（３） ４−アミノ−２−フェニル−プテリジン−７−オンは、Harris e t al.，Liebigs Ann．Chem．1457-1468(1981)に記載された。200mlのメタノール に、2.15ｇ（10mole）の２−フェニル−４，６−ジアミノ−５−ニトロソピリミ ジン（２）を添加した。反応が止むまで（ほぼ２時間）、５％炭素担持パラジウ ム触媒の存在下に水素を使用して混合物を撹拌機中で室温において水和した。無 色の溶液を濾過し、20mlのH₂O 中の１ｇのNaの溶液と一緒にし、加熱沸騰させ、 次いで活性炭で処理し、熱時濾過した。濾液を氷酢酸でpH５にし、放置し、冷却 した。沈殿をジメチルホルムアミドから再結晶化させると、３が 1.0ｇの褐色が かった結晶として得られた（42％の収率、融点 330-332 ℃）。 ｄ）４−アミノ−２−フェニル−８−〔２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（４ −クロロベンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−７−オン（４） 1.0ｇ（4.2mole）の４−アミノ−２−フェニル−プテリジン−７−オン（３） および数個の結晶の硫酸アンモニウムの混合物を、１00mlのヘキサメチルジシラ ザン（HMDS）中で還流下に４時間加熱した。冷却後、HMDSを真空下に蒸留し、残 留物をう100mの乾燥トルエン中に溶解した。この混合物に、2.17ｇ（4.6mole） の２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−リボフ ラノシルクロライド（実施例３におけるようにして製造した、トルイル誘導体に ついて工程（ａ））および 0.476ｇ(2.3mole)の銀過塩素酸塩を添加した。次い でこの溶液を無水条件下に室温において24時間撹拌し、次いで 200mlのCH₂Cl₂で 希釈した。生ずるAgCl沈殿をシリカで濾過し、濾液を 100mlの飽和水性炭酸水素 ナトリウム溶液で処理し、次いで 100mlの飽和塩化ナトリウム溶液で処理した。 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、次いで濾液を蒸発させた。 残留物を少量の酢酸エチル中に溶解し、シリカゲルのカラム上に置き、次いで ｎ−ヘキサン／酢酸エチル５：１を溶離した。主要な画分を集め、蒸発させ、残 留物をCHCl₃／メタノールから２回再結晶化させると、４が1.43ｇ（54％の収率 ）の無色の結晶として得られた（融点 175-178 ℃）。Ｃ₃₁Ｈ₂₃Ｃｌ₂Ｎ₅Ｏ₆（63 2.5）についての分析：Ｃ，58.87；Ｈ，3.67；Ｎ，11.07。実測値：Ｃ，58.62； Ｈ，3.74；Ｎ，11.10。 ｅ）４−アミノ−２−フェニル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ ル）プテリジン−７−オン（５） 50mlの無水メタン中の10mgのナトリウムの溶液に、0.632ｇ（１mmol）の４− アミノ−２−フェニル−８−〔２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（４−クロロベ ンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−７−オン（４）を添加した 。この溶液を室温において１時間撹拌した。次いでこの溶液をAcOHの添加により 中和し、次いで蒸発させた。残留物をメタノール／H₂O から再結晶化させると、 ５が0.323ｇ（91％の収率）の無色の結晶（融点 169−172 ℃）。Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₄ （355.4）についての分析：Ｃ，57.46；Ｈ，4.81；Ｎ，19.71 。実測値：Ｃ，5 7.04；Ｈ，4.88；Ｎ，20.01 。実施例２ 式IVのヌクレオシド：２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−イソキサント プテリン（15）の合成 ２，４，５−トリアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（９）の合成、工 程（ａ）〜（ｄ）は、Pfeiderer et al.，Chem．Ber.，94：12-18（1961）に記 載された。 ａ）６−クロロ−２，４−ジアミノ−ピリミジン（６） 500ml)新しく蒸留したPOCl₃に80〜90℃の温度において、 100ｇの２，４−ジ アミノ−６−オキソ−ジヒドロピリミジン（Aldrich 、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）を添加した。この混合物を、ほぼ２時 間後、混合物が完全に溶解するまで、還流下に蒸留した。残留POCl₃を真空を使 用して吸引し、残留するシロップ状物を氷上にゆっくり排出した。高度に酸性の 溶液を濃アルミン酸ナトリウム溶液で冷却し、最後の段階において固体状炭酸ナ トリウムを使用して、注意して中和した。完結したとき、溶液の合計の体積はほ ぼ1800mlである。冷却すると、黄色がかった沈殿が分離し、これを吸引し、真空 デシケーター中で乾燥した。大部分非有機塩を含有する最終生成物を３回沸騰さ せ、各回１リットルのアセトン（活性炭を添加した）を使用する。抽出液を冷却 し、生ずる透明な沈殿を集める。濾液を蒸発させると、追加の画分が得られる。 ｂ）２，４−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（７） 100mlのベンジルアルコール中の 3.8ｇの溶液を、油浴中で、21.6ｇの６−ク ロロ−２，４−ジアミノ−ピリミジン（６）とともに 160℃において３時間加熱 する。余分のアルコールを真空下に蒸留する。 ａ）油状残留物を温水でよく洗浄し、これによりゴム状物質が得られる。この 温かい溶液を温かい30％酢酸中に溶解し、活性炭で脱色し、希薄アンモニアでpH ６にする。ゆっくり冷却すると、油状塊が最初に分離し、次いで結晶質物質が分 離する。結晶を撹拌、デカンテーションおよび濾過により凝固した油状物から分 離する。次いで油状残留物を数回加熱および冷却して結晶化させる。プールした 画分を、それらがいったん真空デシケーター中で乾燥させると、少量のクロロホ ルム中に溶解し、次いで活性炭および酸化アルミニウムで処理し、再び−20℃以 下の温度に強く凍結することによって分離する。この方法を数回反復した後、ク ロマトグラフィー的に純粋な７が得られる。 ｂ）別精製法において、アルコールを含有しない反応残留物をベンゾール中に 溶解し、活性炭で処理し、濾液をよく蒸発させる。冷却したとき、分離する生成 物をベンゾールから数回再結晶化させると、７が得られる。 ｃ）５−ニトロソ−２，４−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（８ ） 250mlの温かい30％酢酸中の16ｇの２，４−ジアミノ−６−ベンジルオキシ− ピリミジン（７）の溶液に、25mlのH₂O 中の７ｇの亜硝酸ナトリウムの溶液を添 加する。亜硝酸ナトリウムの溶液を70〜80℃に保持し、連続的に撹拌しながら滴 下する。ヨウ化カリウム澱粉紙が陽性の反応を示すまで、亜硝酸ナトリウム溶液 を添加する。紫−赤色の沈殿を冷却し、吸引し、次いでエタノールまたはアセト ンから再結晶化させると、８が得られる。 ｄ）２，４，５−トリアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（９） ナトリウムジチオナイトを 300mlのH₂O 中の17ｇの５−ニトロソ−２，４−ジ アミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジン（８）の懸濁液に50℃において、赤色 ニトロソ化合物が完全に還元されるまで、少しずつ添加する。水性アンモニアの 添加により、遊離塩基を分離させる。粗生成物を冷却し、吸引し、活性炭および 微量のナトリウムジチオナイトを添加した水から結晶化させると、９が得られる 。 ｅ）２，４−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−５−エトキシカルボニルメチレ ンイミノ−ピリミジン（10） ２，４−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−５−エトキシカルボニルメチレンイ ミノ−ピリミジンの合成は、PfleidererおよびReisser，Chem．Ber.，95：1621 −1628（1961）に記載されている。 250 mlのH₂O 中の2.39ｇの２，４，５−トリアミノ−６−ベンジルオキシ−ピリミジ ン（９）の懸濁液を、室温において３ｇのエチルグリオキシレート−ヘミエチル アセタール中で３時間撹拌する。生ずる鮮明な黄色沈殿を低い真空下に濾過し、 洗浄し、 100℃の温度において乾燥する。沈殿をエタノールから再結晶化させる と、10が得られる。 ｆ）２−アミノ−４−ベンジルオキシプテリジン−７−オン（11） ２−アミノ−４−ベンジルオキシプテリジン−７−オンの合成は、Pfleidererお よびReisser，Chem．Ber.，95：1621-1628(1961)に記載されている。 190mlのエ タノール中１ｇの２，４−ジアミノ−６−ベンジルオキシ−５−エトキシカルボ ニルメチレンイミノ−ピリミジン（10）の溶液に30mlの１Ｎ NaHCO₃を添加する 。この溶液を還流下に１時間蒸留し、この溶液を少量の残留する未溶解物質から 加熱分離する。20mlの氷酢酸で濾液を酸性化することによって沈殿するプテリジ ンを冷却後吸引し、ベンジルアルコールから再結晶化させると、11が得られる。 ｇ）４−ベンジルオキシ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレンイミノ）− プテリジン−７−オン（12） 100mlの無水DMF に、2.88ｇ（10.7mmol）の２−アミノ−４−ベンジルオキシ プテリジン−７−オン（11）および1.92ml（11.2mmol）のＮ，Ｎ−ジメチルホル ムアミドジエチルアセタールを添加する。この混合物を室温において４時間撹拌 し、その時間までに混合物は透明な溶液となる。DMF を高真空下に50℃以下にお いて蒸留する。次いでこの残留物に、１mlのメタノールおよび50mlのジエチルエ ーテルの溶液を添加する。10分後、沈殿を集める。濾液を再び蒸発乾固し、生ず る残留物を10mlのジエチルエーテル中で撹拌すると、 第２沈殿が得られる。沈殿をプールし、高真空下に乾燥すると、12が得られる。 ｈ）４−ベンジルオキシ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレンイミノ）− ８−（２−デオキシ−３，５−ジ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル） −プテリジン−７−オン（13） 3.24ｇ（10mmol）の４−ベンジルオキシ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチ レンイミノ）−プテリジン−７−オン（12）に、 100mlの無水アセトニトリルを 添加する。次いで1.87ml（12.5mmol）のDBU を添加し、この溶液を約10分後透明 になるまで撹拌する。この溶液に、 4.5ｇ（11mmol）の１−クロロ−２−デオキ シ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノースを除々に添加す る。次いで30分間撹拌する。生ずる沈殿を集めると、乾燥後、α，β−アノマー 混合物が得られる。濾液を蒸発乾固し、残留物を 100mlのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解し 、H₂O で２回洗浄してDBU を除去する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次い で蒸発させる。生ずる残留物をトルエン／酢酸エチル１／３中のシリカゲルのカ ラムクロマトグラフィーにより精製する。主要な画分を集め、蒸発させると、α ，β−アノマー混合物が得られる。両方の収穫物をプールし、酢酸エチル／メタ ノール20／１から再結晶化させると、13が得られる。 ｉ）８−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフ ラノシル）−イソキサントプテリン（14） 100mlのメタノール中に、3.38ｇ（５mmol）の４−ベンジルオキシ−２−（Ｎ ，Ｎ−ジメチルアミノメチレンイミノ）−８−（２−デオキシ−３，５−ジ−ｐ −トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（13）を溶解 させる。次いで 0.2ｇの５％炭素担持パラジウムを添加し、この混合物を水素雰 囲気下に１日 間震盪させる。触媒を濾過し、濾液を蒸発乾固させる。残留物をメタノールから 再結晶化させると、14が得られる。 ｊ）８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イソキサントプテリン （15） 30mlのメタノール中のアンモニアの飽和溶液に、 1.0ｇ（２mmol）の８−（２ −デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−イ ソキサントプテリン（14）を添加する。この混合物を室温において一夜撹拌する 。次いでこの溶液を蒸発乾固し、残留物を少量のH₂O から数滴の酢酸の添加によ り再結晶化させる。冷却すると、15が得られる。実施例３ 式IXのヌクレオシド：４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ ル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（23）の合成 ａ）２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシ ル−クロライド（16） 工程（ｅ）において使用する２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル −α−Ｄ−リボフラノシルクロライドは、Hoffer，Chem．Ber.，93：2777-2781 （1960）に記載されている。 243mlのメタノールに、13.6ｇ(0.1mole)の２−デ オキシ−Ｄ−リボース（Aldrich、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）およ び27mlの１％メタノール性 HClを添加する。この混合物を12〜15分間密閉放置し てメチルグルコシドを形成する。次いで、 3.5ｇの炭酸銀を混入してすべての炭 化水素を直ちに結合させる。透明な濾過溶液を真空下に沸騰させると、シロップ 様コンシステンシーが得られ、真空下に沸騰を反復する同時に少量の乾燥ピリジ ンを添加して、残留するメタノールを分離する。最後に、混合物を80mlのピリジ ン中に溶解し 、34ｇ（0.22mole）のｐ−トルイルクロライドでアシル化する。次いでこの混合 物を40〜50℃に２時間加熱するか、または室温において一夜放置する。水を添加 し、次いで混合物 200mlのエーテルで分配する。次いでエーテル溶液をH₂O 、次 いで希薄硫酸、次いで炭酸水素カリウム溶液で洗浄してピリジンを除去する。次 いで混合物を真空下に沸騰して、蜂蜜−黄色のシロップ状物を形成する。このシ ロップ状物から、結晶化した３，５−ジ−ｐ−トルイル−メチル−２−デオキシ −Ｄ−リボフラノシドをシード添加により得ることができる。 クロライドを単離するために、シロップ状物を20〜50mlの氷酢酸中に溶解し、 この溶液を80mlの塩化水素で飽和させた酢酸と一緒にビーカーに入れる。この溶 液を10℃に保持し、塩化水素導入して、混合物を約10分間後濃厚な結晶質ペース トに固化させる。30分以内に、結晶質物質をフィルター上で低い真空下に無水エ ーテルで洗浄する。洗浄工程は好ましくは２回反復する。次いで、この物質を真 空デシケーター中でソーダライムおよび五酸化リンで乾燥し、そしてこの物質は 数週間この状態で安定に止まる。所望ならば、２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ− ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシル−クロライド（16）をトルエンまたは 四塩化炭素から再結晶化させる。 ｂ）２−ヒドロキシ−４，６−ジアミノピリミジンサルフェート（17） ４，６−ジアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンサルフェートの合成は、Bend ich et al.，J．Amer．Chem．Soc.，70：3109-3113(1948)に記載されている。5. 40ｇの４，６−ジアミノ−２−チオピリミジン（Aldrich 、米国ウィスコンシン 州ミルウォーキー）および 5.5ｇのクロロ酢酸に、75mlの沸騰するH₂O を添加す る。この溶 液を1.25時間還流させる。冷却しないで、 9.5mlの18Ｎ硫酸を添加し、還流をさ らに１時間続ける。ノーライトを添加し、冷却すると、17が得られる。 ｃ）４，６−ジアミノ−５−ホルミルアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジン（ 18） ４，６−ジアミノ−５−ホルミルアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンの合成 は、Pfleiderer，Chem．Ber．90：2272-2276（1957）に記載されている。54mlの ホルムアミドに９ｇの４，６−ジアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンサルフェ ート（17）および4.5 ｇの亜硝酸ナトリウムを添加する。この溶液を60℃に加熱 し、10mlのギ酸を滴下する。これは赤色懸濁液を形成し、これを 110℃にさらに 加熱する。黄色化が得られるまで、少量のナトリウムジチオナイトを添加する。 この時間の間に、温度は 130℃を超えてはならない。この混合物を冷却し、沈殿 を高真空下に濾過する。最後に、18を大量のH₂O（動物活性炭を含む）から再結 晶化させる。 ｄ）４，５，６−トリアミノ−ピリミジン−２−オン塩酸塩（19） ４，５，６−トリアミノ−ピリミジン−２−オン塩酸塩の合成は、Pfleiderer ，Chem．Ber．90．2272-2276(1957)に記載されている。３ｇの４，６−ジアミノ −５−ホルミルアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジン（18）に、50mlの10％〜15 ％のメタノール性 HClを添加する。この溶液を７時間還流させ、次いで放冷する 。冷却すると、混合物を低い真空下に濾過し、次いでアルコール中で洗浄し、乾 燥チャンバー中で乾燥する。次いでこの塩酸塩を室温においてH₂O 中に溶解し、 １Ｎアンモニアの添加により中和する。生ずる沈殿を集め、エタノールで洗浄し 、乾燥チャンバー中で乾燥すると、19が得られる。 ｅ）４−アミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（20） 50mlの水中に、1.77ｇ（0.01mole）の４，５，６−トリアミノ−ピリミジン− ２−オン塩酸塩（19）を溶解する。溶液のpHを５に調節し、次いで４mlの40％水 性メチルグリオキサル（FLUKA AG、スイス国）を添加し、この溶液を還流下に30 分間加熱する。生ずる沈殿を集め、大量のH₂O から再結晶化させると、20が得ら れる。 ｆ）４−ベンゾルアミノ−７−メチル−プテリジン−２−オン（21） 20mlのピリジン中に、1.63ｇ（0.01mole）の４−アミノ−７−メチル−プテリ ジン−２−オン（20）を溶解する。次いで3.12ｇ（0.02mole）の塩化ベンゾイル を混合物を撹拌しながら滴下する。この混合物を80℃に30分間加熱し、次いで氷 上に注ぐ。生ずる沈澱を集め、エタノールおよびエーテルで洗浄し、次いでDMF から再結晶化させると、21が得られる。 ｇ）４−ベンゾイルアミノ−１（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオ イル−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（22） 60mlの無水アセトニトリルに、2.83ｇ（0.01mmol）の４−ベンゾイルアミノ− ７−メチル−プテリジン−２−オン（21）を添加する。次いで 1.5ml（11mmol） の 1.8−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデク−７−エン(DBU)を添加し、こ の混合物を室温において15分間撹拌する。撹拌後4.26ｇ（11mmol）の２−デオキ シ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシルクロライドを溶 液に添加し、室温において１時間撹拌する。次いでこの溶液を蒸発乾固し、残留 物をCHCl₃中に溶解し、重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を硫酸ナトリウ ムで乾燥する。小さい体積に濃縮した後、物質を酢酸エチル／アセトン４／１中 のシリカゲルのカラムクロマ トグラフィーにより精製する。主要な画分を蒸発させ、残留物をエタノールから 再結晶化させると、22が得られる。 ｈ）４−アミノ−１（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル −プテリジン−２−オン（23） 50mlの飽和メタノール性アンモニアに、1.65ｇ(0.005mole)の４−ベンゾイル アミノ−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボ フラノシル）−７−メチル−プテリジン−２−オン（22）を添加する。この混合 物を室温において一夜撹拌する。次いで混合物を蒸発乾固し、残留物をエタノー ル／H₂O 20：１から再結晶化させると、２３が得られる。実施例４ 式Ｘのヌクレオシド：４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ ル）−６−メチル−プテリジン−２−オン（28）の合成 ａ）メチルグリオキサルモノアルドキシム（24） メチルグリオキサルアルドキシムは、G．Charrier Gazz．Chim．Italy 37：14 5（1907）のプロトコールに従い合成することができる。30mlの酢酸／H₂O 溶液 （１／１）に 5.8ｇ(0.1mole)のアセトンを添加する。次いでこの溶液を０℃に 冷却する。20mlのH₂O 中の 7.6ｇ（0.11mole）の亜硝酸ナトリウムの溶液を撹拌 しながら滴下する。次いでこの溶液を室温においてさらに３時間撹拌し、次いで 真空下に注意して蒸発させる。残留物をベンゼンで抽出し、部分的に蒸発させる と、24が無色の結晶として得られる。結晶を高真空下に昇華によりさらに精製す ることができる。 ｂ）４−アミノ−６−メチル−プテリジン−２−オン（25） 50mlのH₂O に、1.77ｇ（0.01mole）の４，５，６−トリアミノ−ピリミジン− ２−オン塩酸塩（19）（実施例３参照）を添加する。 pHを５に調節し、混合物を撹拌しながら、1.74ｇ（0.02mole）のメチルグリオキ サルモノアルドキシム（24）を添加する。対応するシッフ塩基の生ずる沈澱を集 め、次いで25mlの80％硫酸中に溶解し、30分間 100℃に加熱する。冷却した後、 この混合物を氷上に注ぎ、次いでNaHCO₃により注意して中和し、これにより沈澱 が形成する。生成物を濾過し、次いで大量のH₂O から再結晶化させると、25が得 られる。 ｃ）４−ベンゾイルアミノ−６−メチル−プテリジン−２−オン（26） ４−ベンゾイルアミノ−６−メチル−プテリジン−２−オンの合成は、実施例 ３、工程（ｄ）におけるようにして、 ４−アミノ−６−メチル−プテリジン−２−オン（25）を４−アミノ−７−メ チル−プテリジン−２−オン（20）の代わりに使用して実施する。 ｄ）４−ベンゾイルアミノ−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トル オイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチルプテリジン−２−オン（27） ４−ベンゾイルアミノ−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイ ル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチルプテリジン−２−オンの合成は、実 施例３、工程（ｅ）におけるようにして、４−ベンゾイルアミノ−６−メチル− プテリジン−２−オン（26）を４−ベンゾイルアミノ−７−メチル−プテリジン −２−オン（21）の代わりに使用して実施する。 ｅ）４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチ ル−プテリジン−２−オン（28） ４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチル− プテリジン−２−オン（27）の合成は、実施例３、工 程（ｆ）におけるようにして、４−ベンゾイルアミノ−１−（２−デオキシ−３ ，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メチルプテリ ジン−２−オン（27）を４−ベンゾイルアミノ−１（２−デオキシ−３，５−ジ −Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−７−メチル−プテリジン− ２−オン（22）の代わりに使用して実施する。実施例５ 式ＸＩのヌクレオシド：４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノ シル）−プテリジン−２−オン（32）の合成 ａ）４，５，６−トリアミノ−２−ヒドロキシピリミジンサルフェート（29） 化合物17、４，６−ジアミノ−２−ヒドロキシ−ピリミジンサルフェートは、 実施例３工程（ｅ）に記載するように合成する。17の４，５，６−トリアミノ− ２−ヒドロキシピリミジンサルフェート（29）への変換は、Bendich et al.，J ．Amer．Chem．Soc.，70：3109-3113(1948)に記載されている。 110mlの氷酢酸 および 110mlのH₂O の混合物に、15.3ｇの非常に微細な17を添加する。この混合 物を約５℃に保持し、25mlのH₂O 中の11.0ｇの亜硝酸ナトリウムを一定に撹拌し ながら添加する。カーマイン赤色の沈澱を２時間後に集め、３つの小さい部分の 冷却H₂O で洗浄する。湿潤沈澱を 400mlのH₂O の中に懸濁させ、この混合物を３ 分間沸騰させ、その期間内に物質は漂白される。この溶液に、53mlの18Ｎ硫酸を 注意して添加する。この混合物を数分間沸騰させ、ノーライト処理後、濾過し、 冷却すると、29が得られ、これは２Ｎ硫酸から再結晶化させることができる。 ｂ）４−アミノ−プテリジン−２−オン（30） ４−アミノ−プテリジン−２−オンの合成は、Taylor et al.，J ．Amer．Chem．Soc．71：2538-2541(1949)に記載されている。冷却NaOHでpH５に 調節した50mlのH₂O 中の 2.0ｇ（0.0084mole）の４，５，６−トリアミノ−２− ヒドロキシピリミジンサルフェート（29）の溶液に、 3.0ｇ（0.0113mole）のグ リオキサルビサルファイトを添加する。反応混合物を加熱沸騰させ、pHを９に調 節し、15分間沸騰させる。希塩酸で中和し、冷却し、濾過した後、薄黄褐色固体 状物をH₂O で、次いでアセトンで洗浄し、真空下に乾燥する。この固体状物を熱 0.5Ｎ NaOH中に溶解し、次いでノーライトで処理する。次いで熱濾液を酢酸で 酸性化する。最後に、 0.5Ｎ酢酸から再結晶化させると、30が得られる。 ｃ）４−アミノ−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β −Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（31） 20mlのヘキサメチルジシラザン（HMDS）に2.98ｇ（0.02mole）の４−アミノ− プテリジン−２−オン（30）を添加する。この混合物を還流下に、湿気を排除し て、24時間加熱すると、透明な溶液が得られる。過剰のHMDSを真空下に除去する と、１−トリメチルシリルアミノ−２−トリメチルシリルオキシ−プテリジンが 粘性油状物として得られる。残留物を200mlのベンゼン中に溶解し、次いで9.37 ｇ(0.022mole)の２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−α−Ｄ−リ ボフラノシルクロライド、４ｇのHgO 、および４ｇのHgBr₂を添加し、この混合 物を５時間還流させる。冷却後、沈澱を濾過し、濾液を蒸発乾固し、残留物を 1 00mlのCHCl₃中に溶解する。この溶液を２回 100mlの20％Klで抽出する。次いで 有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、再び蒸発させ、残留物を少量の酢酸エチル中 に溶解し、酢酸エチル／アセトン７：３を使用するシリカゲルのカラムクロマト グラフィーにかける。第１画分は過剰の糖を含有し、 第２画分はα−アノマーを含有し、そして最後の溶出画分はβ−デオキシリボシ ドを含有する。蒸発させ、残留物をエタノールから再結晶化させると、31が得ら れる。 ｄ）４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジ ン−２−オン（32） 0.51ｇ（１mmol）の４−アミノ−１−（２−デオキシ３，５−ジ−Ｏ−ｐ−ト ルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２−オン（31）に、50mlの 0.0005Ｎナトリウムメトキシドを添加する。この混合物を室温において24時間撹 拌する。次いで、この混合物をAcOHで中和し、蒸発乾固し、２回H₂O と共蒸発さ せる。次いで残留物を50mlのエタノールから再結晶化させると、32が得られる。実施例６ 式IVのヌクレオシドのホスホアミダイト：４−アミノ−６−フェニル−８−（５ −Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリ ジン−７−オン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホ ルアミダイト（41）の合成 ４，６−ジアミノ−５−ニトロソ−ピリミジンの合成、工程（ａ）〜（ｃ）は 、Evans et al.，J．Chem．Soc.，4106(1956)に記載された。 ａ）４，６ジアミノピリミジン−２−スルフィン酸（33） ２Ｎ NaOH(200ml)中の50ｇの４，６−ジアミノ−２−メルカプトピリミジン （Aldrich、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）の溶液に、 750mlの３％過 酸化水素溶液を添加した。この溶液を20℃より低い温度に維持した。撹拌をさら に30分間続け、透明な薄黄色溶液を酢酸（約50ml）で酸性化した。沈澱をH₂O で 洗浄し、空気乾燥すると、33が58ｇ（95％の収率）の灰色アモルファス酸が得ら れた（融点 168−170 ℃分解）。分析のために、試料を希薄水性ア ンモニア中に溶解し、酢酸で再沈澱させた。Ｃ₄Ｈ₆Ｎ₄Ｏ₂Ｓについての分析：実 測値：Ｃ，27.6；Ｈ，3.5 ；Ｎ，32.2。実測値：Ｃ，27.8；Ｈ，3.8 ；Ｎ，32.2 。 ｂ）４，６−ジアミノ−ピリミジン塩酸塩（34） 2.5Ｎエタノール性塩化水素(150ml)を含有する 500mlの乾燥エタノールに、50 ｇの４，６−ジアミノピリミジン−２−スルフィン酸（33）を添加した。この混 合物を30分間震盪した。次いでこの混合物を０℃に冷却し、１時間後、結晶を取 り出し、エーテルで洗浄し、乾燥すると、23ｇの薄黄色針状結晶が得られた（融 点 196−198 ℃）。もとの濾液を 250mlに濃縮し、次いで 750mlのエーテルを添 加すると、それ以上の収穫物の15ｇのほとんど白色の針状結晶が得られた（融点 203−204 ℃）。Ｃ₄Ｈ₆Ｎ₄ＨＣｌについての分析：実測値：Ｃ，32.8；Ｈ，4.8 ；Ｎ，24.2。実測値：Ｃ，33.3；Ｈ，4.8 ；Ｎ，24.1。 次いでスルフィン酸（５ｇ）を室温において塩酸（15ml，ｄ1.18）に少しずつ 添加した。反応は激しく、二酸化硫黄が自由に発生した。塩酸を生ずるスラリー から減圧下に除去した。残留物をアセトンで、次いでエーテルで洗浄すると、4. 05ｇの７が得られた（融点 195℃）。試料をスピリットから再結晶化させると、 融点 は201−202 ℃上昇した。 ｃ）４，６−ジアミノ−５−ニトロソ−ピリミジン（35） 250mlの２Ｎ HClに、 8.0ｇ（55mmol）の４，６−ジアミノ−ピリミジン塩酸 塩（34）を添加した。４，６−ジアミノ−ピリミジン塩酸塩を溶解させた。次い でこの溶液を０℃に冷却し、15mlのH₂O 中に溶解した 4.2ｇ（61mmol）のNaNO₂ の溶液を20分以内に撹拌しながら滴下した。０℃においてさらに30分間撹拌し、 次いで室温において２時間撹拌した。紫色の溶液をNaHCO₃で中和し、沈澱を集め 、H₂O およびエタノールで洗浄し、乾燥すると、35が 6.3ｇ（82％の収率）の青 −紫色の結晶質粉末状物として得られた（融点＞ 350℃）。 ｄ）４−アミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オン（36） ４−アミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オンの合成は、Harris et al. ，Liebigs Ann．Chem．1457-1468(1981)に記載された。50mlの無水エタノール中 の 0.5Naの溶液に、1.38ｇ（10mmol）の４，６−ジアミノ−５−ニトロソ−ピリ ミジン（35）および 2.0ｇのフェニル酢酸エチルエステルを添加した。この物質 を溶解させ、次いで溶液を還流下に１時間加熱した。沈降した沈澱を冷却し、集 めた。次いで沈澱を100H₂O中で加熱し、不溶性ニトロソ化合物から濾過し、次い で希塩酸でpH２に酸性化した。いったんゼラチン状生成物が沈澱すると、それが 微結晶質の状態に到達するまで、それを加熱した。次いでゼラチン状生成物をジ メチルホルムアミドから再結晶化させると、36が結晶として得られた（融点＞ 3 20℃）。Ｃ₁₂Ｈ₉Ｎ₅Ｏについての分析：実測値：Ｃ，60.24 ；Ｈ，3.79；Ｎ，29 .28 。実測値：Ｃ，60.35 ；Ｈ，3.78；Ｎ，29.53 。 ｅ）４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレンイミノ−６−フェニル−プテリジン −７−オン（37） 400mlの乾燥DMF 、2.39ｇ(10mmole)の４−アミノ−６−フェニル−プテリジン −７−オン（36）および 2.5mlのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド−ジエチルアセ タールの混合物を60℃において５時間撹拌した。この溶液を真空下に蒸発乾固し 、残留物をイソプロパノールから再結晶化させると、37が2.83ｇ（96％の収率） の無色の結晶として得られた（融点 284−286 ℃）。Ｃ₁₅Ｈ₁₄Ｎ₆Ｏ(294.3)につ いての分析：Ｃ，61.21；Ｈ，4.79；Ｎ，28.55 。実測値：Ｃ，60.88；Ｈ，5.00 ，Ｎ，28.15 。 ｆ）４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレンイミノ−６−フェニル−８−〔２− デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシ ル〕プテリジン−７−オン（38） 60mlの乾燥アセトニトリルに2.94ｇ（10mmol）の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ メチレンイミノ−６−フェニル−プテリジン−７−オン（37）および1.49ml（11 mmol）の１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデク−７−エン(DBU)を添 加した。この溶液を透明になるまで15分間撹拌した。この溶液に、4.72ｇ（11mm ol）の２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−α−Ｄ−リ ボフラノシルクロライド（トリイル誘導体についての実施例３、工程（ａ）にお けるようにして製造した）を添加した。次いでこの溶液を室温において２時間撹 拌し、その期間内に黄色がかった沈澱が形成した。この固体状沈澱を集め、CHCl₃ ／メタノールから再結晶化させると、38が 5.3ｇ（83％の収率）の黄色がかっ た結晶として得られた（融点 171−174 ℃）。Ｃ₃₄Ｈ₂₈Ｃｌ₂Ｎ₆Ｏ₆・１／２H₂O （696.6）についての分析：Ｃ，58.62；Ｈ，4.05；Ｎ，12.06。実測値：Ｃ，58. 71；Ｈ，4.16；Ｎ，11.91 。 ｇ）４−アミノ−６−フェニル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ ル）プテリジン−７−オン（39） 25mlの無水メタノール中の70mgのK₂CO₃から成るの溶液に、４−Ｎ，Ｎ−ジメ チルアミノメチレンイミノ−６−フェニル−８−〔２−デオキシ−３，５−ジ− Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−７−オ ン（38）を添加した。次いで 0.7mlの濃アンモニアをこの懸濁液に添加した。こ の溶液を室温において２日間撹拌した後AcOHの添加により中和し、生ずる黄色沈 澱(0.2ｇ，56％の収率)を集めた。濾液を蒸発乾固し、残留物をメタノールから 再結晶化させると、39が他の0.12ｇ（34％の収率）の 黄色結晶として得られた（融点 163℃分解）。Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₄１／２Ｈ₂Ｏ(364. 4)についての分折：Ｃ，56.32；Ｈ，4.97；Ｎ，19.22 。実測値：Ｃ，56.16；Ｈ ，4.75；Ｎ，19.14 。 ｈ）４−アミノ−６−フェニル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デ オキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（40） 10mlの無水ピリミジン中の 0.355ｇ（１mmol）の４−アミノ−６−フェニル− ８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−７−オン（39）の 溶液に、多少のモレキュラーシーブおよび 0.407ｇ(1.2mmol)のジメトキシトリ チルクロライドを添加した。この溶液を室温において12時間撹拌した。残留物を 30mlのCH₂Cl₂中に溶解し、次いでNaHCO₃の飽和溶液、次いでNaClの飽和溶液で抽 出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで再び抽出し、残留物をシリカ ゲルのカラムのクロマトグラフィーかけ、トルエン／EtOAc １：１で溶離した。 生成物の画分を蒸発させ、再び少量のCH₂Cl₂中に溶解し、次いでｎ−ヘキサンに 撹拌しながら滴下し、真空デシケーター中で乾燥すると、40が0.46ｇ（70％）の 黄色結晶粉末状物として得られた（融点 114℃分解）。Ｃ₃₈Ｈ₃₅Ｎ₅Ｏ₆(657.7) についての分析：Ｃ，69.39；Ｈ，5.36；Ｎ，10.64 。実測値Ｃ，68.91；Ｈ，5. 67；Ｎ，10.44 。 ｉ）４−アミノ−６−フェニル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デ オキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン−３’−Ｏ−（β− シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（41） 15mlのCH₂Cl₂中の 0.657ｇ（ａmmol）の４−アミノ−６−フェニル−８−（５ −Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリ ジン−７−オン（40）の溶液に、 0.452 ｇ(1.5mmol)の２−シアノエチル−ビス−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホス ファンおよび35mg(0.5mmol)のテトラゾールを添加した。次いでこの混合物をア ルゴン雰囲気下に室温において12時間撹拌した。反応溶液を15mlのCH₂Cl₂で希釈 し、次いでNaHCO₃およびNaClの飽和溶液で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで 乾燥し、濾過し、蒸発させた。残留物をシリカゲルのカラムのクロマトグラフィ ーにかけ、少量のトリエチルアミンを含有するトルエンEtOAc ３：２で溶離した 。生成物の画分を 100mlのｎ−ヘキサンに撹拌しながら滴下すると、0.78ｇ（91 ％）の微結晶質粉末状物として得られた（融点＞100 ℃分解）。Ｃ₄₇Ｈ₅₂Ｎ₇Ｏ₇ Ｐ(858.0)についての分析：Ｃ，65.80；Ｈ，6.11；Ｎ，11.43 。実測値：Ｃ，66 .13；Ｈ，6.20；Ｎ，11.03 。実施例７ 式Ｖのホスホアミダイト：（３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメト キシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン−３’−Ｏ−（ β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト）（51）の合成 ａ）２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ピリミジン（42） ２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソピリミジンの合成は、Johns et al.，J．Biol．Chem.，14：381-387（1913）に記載された。NaOHの10％溶液 の 100mlに、25ｇの４−アミノ−２−メルカプト−６−オキソピリミジン粉末(A ldrich、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）を添加した。この溶液に、25ｇ の工業用ジメチルサルフェートを少しずつ添加し、各添加後よく震盪した。ある 場合において、生ずる沈澱が濃厚になり過ぎて混合が不可能となったので、溶液 をH₂O で希釈ことが必要であった。混合物を室温にお いて15分間放置した後、それは酸性反応を示し、沈澱を吸引濾過した。このよう にして得られたメルカプトピリミジンをまだ湿潤している間にフラスコに取り出 し、 200mlのアルコールを添加し、この混合物をアルコールのベンゾイルペルオ キシドに加熱した。次いで、フラスコを冷却し、室温において１時間放置した。 濾過すると、20〜25ｇの純粋な42が得られた。これは計算重量の75〜90％であっ た。 ｂ）４−アミノ−１−メチル−２−メチルチオ−６−オキソジヒドロピリミジ ン（43） ４−アミノ−１−メチル−２−メチルチオ−６−オキソジヒドロピリミジンの 合成は、Johns et al.，J．Biol．Chem.，20：153-160（1915）に記載された。6 5mlの１Ｎ水酸化カリウムの溶液に、10ｇの２−メチルメルカプト−４−アミノ −６−オキソ−ピリミジン（42）を添加した。この溶液に、９ｇのジメチルサル フェートを添加すると同時にこの溶液を頻繁に振盪することによって撹拌した。 白色の結晶質沈澱がほとんど直ちに形成し始め、これはすぐに非常に大量となっ た。溶液がリトマスに対して酸性となるとすぐに、結晶を吸引濾過した。濾液を NaOHで中和し、蒸発乾固した。残留物を冷水で洗浄し、固体状物を濾過し、既に 得られた結晶に添加した。次いで一緒に固体状物を希薄アンモニアで粉砕して、 未変化の２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ピリミジンを溶解し 、その少量は存在することがわかった。アンモニア中に溶解しない残留物の部分 は、融点とエーテル中の溶解度が異なる２つの化合物から成っていた。低い融点 を有する化合物はエーテルに非常に可溶性であったが、高い融点を有する化合物 はこの溶媒にほとんど不溶性であった。したがって、いずれもこれらの化合物を 互いに分離する。手段として働いた。 エーテル中に可溶性の化合物は２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−メト キシピリミジンであった。次いで固体状残留物をアルコールから再結晶化させる と、43が細長いプリズムとして得られた（収率＝60％、融点 255℃）。C₆H₉ON₃S について分析：Ｎ，24.57。実測値：Ｎ，24.71 。 ｃ）６−アミノ−３−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロソ−ピリミジン− ４−オン（44） ６−アミノ−３−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロソ−ピリミジン−４− オン（＝４−アミノ−１−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロソ−６−オキソ ジヒドロピリミジン）の合成は、Schneider et al.，Chem．Ber．107．3377-339 4（1974）に記載された。１リットルの30％酢酸中の４−アミノ−１−メチル− ２−メチルチオ−６−オキソジヒドピリミジン（43）の懸濁液に、 100mlのH₂O 中の50ｇの亜硝酸ナトリウムの溶液を滴下した。この混合物を室温においてさら に１時間撹拌し、次いで冷蔵庫中で一夜冷却した。沈澱を集め、H₂O で洗浄し、 次いでアセトンで洗浄し、 100℃において乾燥した。これにより、 119.5ｇ（92 ％）のクロマトグラフィー的に均一な粗生成物が得られた（融点 230℃分解）。 この物質の１ｇを 240mlのH₂O から再結晶化させると、44が0.52ｇの青色結晶と して得られた（融点 234℃分解）。 ｄ）５，６−ジアミノ−３−メチル−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン （45） 4.0ｇ（0.02mole）の６−アミノ−３−メチル−２−メチルチオ−５−ニトロ ソ−ピリミジン−４−オン（44）に、40mlの20％水性硫化アンモニウム溶液を添 加した。この混合物を還流下に30分間加熱した。冷却後、沈澱を集め、少量のエ タノールで洗浄し、デシケーター中で乾燥すると、45が2.72ｇ（75％収率）の無 色の結晶とし て得られた（融点 211−212 ℃）。 ｅ）１−メチル−２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソ−ジヒドロ ピリミジン−アゾチメン炭酸−５エチルエステル（46） １−メチル−２−メチルメルカプト−４，５−ジアミノ−６−オキソ−ジヒド ロピリミジン（５，６−ジアミノ−３−メチル−２−メチルチオ−ピリミジン− ４−オン）からの３−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７−ジオンの 合成、工程ｃおよびｄは、Pfleiderer，Chem．Ber．91：1670（1958）に記載さ れた。この溶液を室温に冷却し、次いで６ｇのエチルグリオキシレート−ヘミエ チルアセタールと一緒にした。直ちに生ずる濃厚な沈澱を１時間後取り出し、エ タノールから再結晶化させると、46ｇの８ｇの鮮明な黄色結晶が得られた（融点 178℃）。Ｃ₁₀Ｈ₁₄Ｎ₄Ｏ₃Ｓ・Ｈ₂Ｏ：Ｃ，41.66；Ｈ，5.59；Ｎ，19.44 。実測 値：Ｃ，42.18；Ｈ，5.75；Ｎ，19.32 。 ｆ）３−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７−ジオン（47） 200mlの 0.5Ｎ NaHCO₃に、８ｇの１−メチル−２−メチルメルカプト−４− アミノ−６−オキソ−ジヒドロピリミジン−アゾメチン炭酸−５エチルエステル （46）を添加した。この溶液を30分間還流させた。この透明な溶液を動物活性炭 で処理し、次いでpH１に加熱酸性化した。いったん冷却すると、沈澱を集め、H₂ O から再結晶化させると、47が 4.5ｇの３−メチル−２−メチルチオ−ピリミジ ン−４，７−ジオンの薄黄色結晶として得られた（融点 292−294℃）。Ｃ₈Ｈ₈ Ｎ₄Ｏ₂Ｓ：Ｃ，42.86；Ｈ，3.60；Ｎ，24.99。 実測値：Ｃ，42.70；Ｈ，3.58;Ｎ，24.73 。 ｇ）３−メチル−２−メチルチオ−８−〔２−デオキシ−３，５ −ジ−ｏ−（４ｔ−クロロ−β−Ｄ−リボフラノシル〕プテリジン−４，７−ジ オン（48） ３−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７−ジオン（47）の結晶を、 高真空下に 100℃において乾燥炉中で乾燥した。次いで 5.6ｇ（25mmol）の乾燥 した結晶を、 250mlの無水アセトニトリル中にアルゴン雰囲気下に、12.9ｇの２ −デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−Ｄ−リボフラノシル クロライド（トリイル誘導体について実施例３、工程（ａ）におけるようにして 製造した）とともに懸濁させた。次いで３mlのヘキサメチルジシラザンおよび２ mlのトリエチルシリルクロライドを添加した。この混合物を30分間撹拌し、次い で 7.4mlのSnCl₄を２分以内に滴下した。正確に20分の反応後、この混合物を120 0mlの重炭酸ナトリウムの冷却した飽和水溶液の中にゆっくり注いだ。次いで溶 液を３回各 200mlの酢酸エチルで抽出した。プールした有機層をNaClで飽和溶液 で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発乾固し、３回CH₂Cl₂とともに共蒸発 させた。 主としてα，β−アノマーヌクレオシド混合物から成る生ずる残留物を分別結 晶化により分離した。第１の結晶化を 200mlのメタノール／350ml の酢酸エチル で実施した。生ずる沈澱を再び 200mlのメタノール／280ml の酢酸エチルから再 結晶化させ、次いで生ずる固体状物をもう一度 200mlのメタノール／500ml の酢 酸エチルから再結晶化させると、4.45ｇの純粋なα−ヌクレオシドから成る無色 の結晶が得られた（融点 188−191 ℃，29％収率）。濾液を一緒にし、蒸発させ 、残留物を 100mlのメタノール／130ml の酢酸エチルから再結晶化させると、 1 .8ｇのα，β−混合物が得られた（12％収率）。その濾液を再び蒸発乾固し、残 留物を50mlの酢酸エチル／50mlのエーテルから再結晶化させると、48が6.79ｇ（ 44％の収率） のクロマトグラフィー的に純粋な結晶質β−ヌクレオシドとして得られた（融点 130−133 ℃）。Ｃ₂₇Ｈ₂₂Ｃｌ₂Ｏ₇Ｓ：Ｃ，52.52；Ｈ，3.59；Ｎ，9.07。実測 値：Ｃ，52.45；Ｈ，3.61；Ｎ，8.90。 ｈ）３−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサン トプテリン（２−アミノ−３−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラ ノシル）プテリジン−４，７−ジオン）（49） 100mlの乾燥アセトニトリル中の 3.3ｇ（４mmol）の３−メチル−２−メチル チオ−８−〔２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−（４ｔ−クロロ−β−Ｄ−リボフ ラノシル〕プテリジン−４，７−ジオン）（48）の溶液を、 100mlの飽和メタノ ール性アンモニアに室温において添加した。少量の不溶性物質を濾過し、濾液を 蒸発乾固した。メタノールとの２回の共蒸発後、沈澱を20mlの温かいメタノール 中に溶解した。次いで50mlのエチルエーテルを添加し、この混合物をアイスボッ クス中で３日間冷却した。沈澱を集め、60℃において真空下に乾燥すると、49が 1.46ｇ（88％収率）の無色の結晶として得られた（融点＞250 ℃）。Ｃ₁₂Ｈ₁₅Ｎ₅ Ｏ₅・１／２Ｈ₂Ｏについての分析：Ｃ，45.28 ；Ｈ，5.07；Ｎ，22.00 。実測 値：Ｃ，45.55；Ｈ，5.07；Ｎ，21.92 。 ｉ）３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ −リボフラノシル）イソキサントプテリン（50） 3.1ｇ（10mmol）の３−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ ル）イソキサントプテリン（49）に、50mlの乾燥ピリジンを添加した。次いでこ の溶液を共蒸発させた。共蒸発を各50mlの乾燥ピリジンで３回反復した。次いで 残留物を50mlの乾燥ピリジン中に懸濁させた。この溶液に、 5.1ｇ（15mmol）の ジメトキシト リチルクロライドを添加し、トリメチルシリル室温において撹拌した。10分後、 透明溶液が得られ、10mlのメタノールの添加により反応を停止させた。この溶液 を蒸発させ、残留物をCH₂Cl₂中に溶解し、次いで重炭酸ナトリウムの５％水溶液 で２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾液を再び蒸発させた。 残留物を少量のCH₂Cl₂／メタノール中に溶解し、フラッシュクロマトグラフィー のためにシリカゲルのカラム（３×20cm、トルエン／酢酸エチルとともにパック された）上に置いた。溶媒混合物の勾配を適用して、精製を達成しなくてはなら なかった： 500mlのトルエン／酢酸エチル１：１， 2.5リットルの酢酸エチル、 １リットルの酢酸エチル／メタノール99：１および２リットルの酢酸エチル／メ タノール98：２。酢酸エチル／メタノール中の物質の画分を蒸発させ、高真空下 に乾燥すると、50が 3.9ｇ（63％）の無色のアモルファス固体状物として得られ た。Ｃ₃₃Ｈ₃₃Ｎ₅Ｏ₇・１／２Ｈ₂Ｏについての分析：Ｃ，63.86；Ｈ；5.52；Ｎ， 11.28 。実測値：Ｃ，63.90；Ｈ，5.82；Ｎ，10.86 。 ｊ）３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ −リボフラノシル）イソキサントプテリン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ −ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（51） 3.06ｇ(4.9mmol)の３−メチル−８−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシト リチル−β−Ｄ−リボフラノシル）イソキサントプテリン（50）および0.18ｇ（ 25mmol）のテトラゾールの懸濁液を、アルゴン雰囲気下に、 2.2ｇ(7.3mmol)の β−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピルホスファンとともに撹拌した。この 懸濁液は30分後透明となり、反応を４時間後に停止させた。反応溶液を重炭酸ナ トリウムの５％水溶液で１回抽出し、次いで有機層を硫酸マグネシ ウムで乾燥し、濾液を蒸発乾固させた。シリカゲルのカラム（３×20cm）上のフ ラッシュクロマトグラフィーにより、 200mlのヘキサン／酢酸エチル２：１、次 いで２リットルのヘキサン／酢酸エチル１：１中において、精製を実施した。生 成物の画分を集め、蒸発乾固し、高真空下に乾燥すると、51が2.38ｇ（59％の収 率）の無色のアモルファス固体状物として得られた。Ｃ₄₂Ｈ₅₀Ｎ₇Ｏ₈Ｐ・Ｈ₂Ｏ( 820.8)についての分析：Ｃ，61.45；Ｈ，6.26；Ｎ，11.94 。 実測値：Ｃ，61.56；Ｈ，6.47；Ｎ，11.51 。実施例８ 式VIIIのホスホルアミダイト：（６，７−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロ フェニル）エトキシカルボニル）アミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメト キシ−トリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン−３’−Ｏ− （β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（59）の合成 ａ）４，５−ジアミノウラシル−塩酸塩（52） 工程（ｂ）において使用する４，５−ジアミノウラシル−塩酸塩は、Sherman およびTaylor，Org．Syn．Coll．Vol.IV，247 に記載されている。還流冷却器お よび効率よい撹拌機を装備した３リットルの３首フラスコの中に、１リットルの 無水（99.8％）のエタノールを入れた。これに、39.4ｇ（（1.72ｇ原子）のナト リウムを添加し、溶解が完結した後、91.5ml（97.2ｇ，0.86mole）のエチルシア ノアセテートおよび51.5ｇ（0.86mmol）の尿素を添加した。この混合物を水蒸気 浴上で還流下に激しく撹拌しながら４時間加熱した。約２時間後、反応混合物を 実際に固体状物となり、撹拌を停止しなくてはならない。反応時間の終わりにお いて、１リットルの熱（80℃）H₂O を反応混合物に添加し、撹拌を再開する。完 全に溶解した後、撹拌混合物を80℃に15分間加熱し、次いで氷酢酸でリトマスに 対して中和する。追加の氷酢酸（75ml）を添加し、次いで70mlのH₂O 中に溶解し た64.8ｇ（0.94mole）の亜硝酸ナトリウムを注意して添加した。バラ赤色のニト ロソ化合物は膨張した沈澱としてほとんど直ちに分離し、これをは撹拌機をほと んど停止させた。数分後、ニトロソ化合物を濾過により除去し、少量の氷水で２ 回洗浄した。湿潤物質を３リットルのフラスコに戻し、 460mlの温かいH₂O(50℃ )を添加した。 スラリーを水蒸気浴上で加熱しながら撹拌し、ニトロソ化合物の赤色が完全に 消失するまで、固体状ナトリウムヒドロサルファイトを添加した。次いで、追加 の30ｇのナトリウムヒドロサルファイトを添加し、薄黄褐色懸濁液を加熱しなが らさらに15分間撹拌し、放冷した。密なジアミノウラシル重亜硫酸塩を冷却した 溶液から濾過し、H₂O でよく洗浄し、部分的に乾燥した。 粗生成物はその塩酸塩への変換により容易に精製された。重亜硫酸塩を広口の １リットルのフラスコに移し、生ずる混合物のコンシステンシーが機械的撹拌を 可能とするまで、濃塩酸を添加した(100〜200ml の酸)。スラリーを水蒸気浴上 で撹拌しながら１時間加熱した。黄褐色のジアミノウラシル塩酸塩を焼結ガラス の漏斗上に濾過し、アセトンでよく洗浄し、五酸化リンの存在下に真空乾燥する と、 104〜124 ｇの52（68〜81％）が得られた。 ｂ）６，７−ジメチルルマジン（53） ６，７−ジメチルルマジンの合成は、Pfleiderer et al.，Chem．Ber.，106： 3149-3174（1973）に記載されている。50mlのH₂O ，20mlのエタノール、および １mlの濃HCl から成るの溶液に、20mlのジアセチルを添加した。この溶液を加熱 沸騰させ、 450mlのH₂O 中の20ｇの４，５−ジアミノウラシル塩酸塩（52）の溶 液の数滴をゆっくり添加した。この混合物を還流下に２時間加熱し、アイスボッ クス中で冷却し、生ずる沈澱（18.7ｇ）を集めた。沈澱が溶解するまで希薄アル ミン酸ナトリウム溶液を添加した 500mlのH₂O 中に沈澱を溶解することによって 、沈澱を精製した。溶液を活性炭を通して濾過し、次いで濾液を沸騰する希薄酢 酸の中に滴下した。冷却後、混合物を 100℃の温度において減圧下に乾燥すると 、53が17.0ｇ（79％の収率）の事実上無色の結晶として得られた（融点＞360 ℃ ）。 ｃ）６，７−ジメチル−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル− β−Ｄ−リボフラノシル）ルマジン（54） ６，７−ジメチル−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β− Ｄ−リボフラノシル）ルマジンの合成は、Ritzmannet al.，Liebigs Ann．Chem. ，1217-1234(1977)に記載されている。50mlのヘキサメチルジシラザンに、7.68 ｇの６，７−ジメチルルマジン（53）および数個の硫酸アンモニウム結晶を添加 した。この溶液が透明となるまで、これを還流下に約24加熱した。次いで過剰の ヘキサメチルジシラザンを真空下に蒸留除去した。残留物を 220mlの無水ベンゾ ール中に溶解し、16ｇの３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−ｄ− エリスロ−ペントフラノシルクロライドを添加し、この溶液を室温において乾燥 条件下に１週間撹拌した。この溶液に、５mlのメタノールを添加した。この溶液 を蒸発乾固し、残留物を 200mlのメタノールから再結晶化させた。ほぼDC純粋な ６，７−ジメチル−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β −Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（β−異性体）を沈澱させた。 300 mlのメタノールからのこの第１画分の更新した再結晶化は、2.36ｇの純粋なβ異 性体を与えた。濾液を精製し、蒸発乾固し、次いでシリカゲルのカラム（70×５ cm）のクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム／メタノール（30：１）を使用 した。第１の主要な画分は、それを無色のアモルファス固体状物に蒸発させた後 、 6.5ｇのDC純粋な６，７−ジメチル−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ− ｐ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（β−異性体） を与えるように思われる。引き続く混合した画分をまた蒸発乾固させ、 100mlの メタノールから再結晶化させ、次いで追加の2.67ｇのβ異性体の無色の結晶が沈 澱した（融点 154−155 ℃）。濾液を再び蒸発乾固させ、シリカゲルのカラム(9 00ｇ)上に注ぎ、クロロホルム／アセトン（９：１）で展開した。追加の 2.7ｇ のα異性体がより大きいＲ_F値を有する主要な画分から得られ、そして追加の0.4 3ｇのβ異性体が低いＲ_F値を有する画分から得られた。合計の収量は5.46ｇ（25 ％）の無色の結晶（融点 154-155 ℃）の形態のβ異性体および 9.2ｇ（43％） のアモルファス固体状物（融点 126−132 ℃）としてα異性体として得られた（ 融点54から成っていた。α−およびβ−Ｄ−アノマーの帰属は、Ritzman et al. の論文後に、Cao et al.，Helv．Chim．Acta.，75：1267-1273(1992)により逆転 されたことに注意すべきである。 ｄ）６，７−ジメチル−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイ ル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（55） 20mlのトルエン中の 0.871ｇ(1.6mmol)の６，７−ジメチル−１−（２−デオ キシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ルマジン（54） および 0.403ｇ（１mmol）のラウェッソン（Lawesson）試薬の混合物を20時間還 流させた。次いでこの混合物を蒸発させ、残留物を20mlのCH₂Cl₂の中に取り、次 いで重炭酸ナトリウムの飽和溶液で２回処理した。水性相を３回各10mlのCH₂Cl₂ で抽出し、一緒にした抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、 再び蒸発させた。残留物を 150mlのメタノールから再結晶化させると、55が0.65 ｇ（75％収率）のオレンジ色結晶として得られた（融点 166-168 ℃）。Ｃ₂₉Ｈ_{2 8} Ｎ₄Ｏ₆Ｓ・Ｈ₂Ｏ(578.6)についての分析：Ｃ，60.20；Ｈ，5.22；Ｎ，9.68。実 測値：Ｃ，60.43；Ｈ，5.06；Ｎ，9.72。 ｅ）４−アミノ−６，７−ジメチル−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラ ノシル）プテリジン−２−オン（56） オートクレープ中で、25mlのメタノール中のアンモニアの飽和溶液中の0.42ｇ （0.75mmol）の６，７−ジメチル−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ− トルオイル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−チオルマジン（55）を 100℃に16 時間加熱した。冷却後、溶液を蒸発させ、残留物をCH₂Cl₂で処理した。固体状物 質を集め、エーテルで洗浄し、高真空下に乾燥すると、56が 0.207ｇ（91％の収 率）の無色の結晶粉末状物として得られた（融点＞℃分解）。Ｃ₁₃Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₄・ Ｈ₂Ｏについての分析 Ｃ，49.36；Ｈ，5.74；Ｎ，22.14 。実測値：Ｃ，49.17 ；Ｈ，5.47；Ｎ，21.80 。 ｆ）６，７−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニ ル〕アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−２ −オン（57） 80mlの無水DMF 中の1.54ｇ（５mmol）の４−アミノ−６，７−ジメチル−１− （２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン（56）および 1.87ｇ（６mmol）の１−メチル−３−〔２（４−ニトロフェニル）エトキシカル ボニル〕イミダゾリウムクロライド（参照、Himmelsbach，et al．Tetrahedron 40：59(1984)これは引用することによって本明細書の一部とされる）の混合物を 室温において一夜撹拌した。この溶液に、 100mlのH₂O を撹拌しながらゆっくり 添加した。次いでこの溶液を冷却し、沈澱を吸引に より集め、メタノールおよびエーテルで洗浄し、デシケーター中で乾燥すると、 57が 2.0ｇ（80％の収率）の無色の結晶として得られた（融点 154-155 ℃）。 Ｃ₂₂Ｈ₂₄Ｎ₆Ｏ₈・Ｈ₂Ｏについての分析：Ｃ，59.96；Ｈ，5.01；Ｎ，16.21 。実 測値：Ｃ，50.51；Ｈ，5.15；Ｎ，15.84 。 ｇ）６，７−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニ ル〕アミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボ フラノシル）プテリジン−２−オン（58） 2.0ｇ（４mmol）の６，７−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エ トキシカルボニル〕アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）− プテリジン−２−オン（57）から、結晶を20mlの無水ピリジンとともに２回共蒸 発させることによって、水を除去した。残留物を 100mlの乾燥ピリジン中に溶解 し、これに1.63ｇ(4.8mmol)のジメトキシトリチルクロライドを添加した。次い でこの混合物を室温において18時間撹拌した。反応を10mlのメタノールの添加に よりクエンチングし、次いで蒸発させ、最後に残留物をCH₂Cl₂中に溶解した。こ の溶液を重炭酸ナトリウムの飽和溶液で処理した。分離後、有機層を硫酸ナトリ ウムで乾燥し、濾過し、再び蒸発させた。残留物を少量のCHCl₃中に溶解し、シ リカゲルのカラム上に置き、次いでトルエン／酢酸エチル４：１〜１：１の勾配 で溶離した。主要な画分がトルエン／酢酸エチル２：で得られ、蒸発させると、 58が2.84ｇ（88％の収率）の無色のアモルファス固体状物として得られた。Ｃ₄₃ Ｈ₄₂Ｎ₆Ｏ₁₀についての分析：Ｃ，64.33；Ｈ，5.27；Ｎ，10.47 。実測値：Ｃ， 64.51；Ｈ，5.23；Ｎ，10.24 。 ｈ）６，７−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エト キシカルボニル〕アミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシ−トリチル −β−Ｄ−リボフラノシル）プテリジン−２−オン−３’−Ｏ−（β−シアノエ チル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（59） 40mlの乾燥CH₂Cl₂および20mlの乾燥アセトニトリルに、 1.0ｇ（1.25mmol）の ６，７−ジメチル−４−〔２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル〕ア ミノ−１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノ シル）プテリジン−２−オン（58）、44mg（0.63mmol）のテトラゾールおよび 0 .754ｇ(2.5mmol)のβ−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピル−ホスファンを 撹拌しながら添加した。18時間後、この溶液を50mlのCH₂Cl₂で希釈し、次いで重 炭酸ナトリウムの飽和溶液で抽出し、有機層硫酸ナトリウムで乾燥し、最後に蒸 発させた。残留物を少量のCH₂Cl₂中に溶解し、次いでシリカゲルのクロマトグラ フィーにより精製し、トルエン／酢酸エチル４：１〜１：１の勾配を使用した。 主要な画分を蒸発させ、高真空下に乾燥すると、59が0.98ｇ（78％の収率）のア モルファス固体状物として得られた。Ｃ₅₂Ｈ₅₉Ｎ₈Ｏ₁₁（1003.1）についての分 析：Ｃ，52.27；Ｈ，5.93；Ｎ，11.17 。実測値：Ｃ，62.00；Ｈ，6.01；Ｎ，10 .65 。実施例９ 式VIIのホスホルアミダイト：２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニ ルエチル−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフ ラノシル）−プテリジン−７−オン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイ ソプロピル）ホスホルアミダイト（71）の合成 ５，６−ジアミノ−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン（２−メチルメル カプト−４，５−ジアミノ−６−オキソピリミジン） の合成、工程（ａ）〜（ｃ）は、Jons et al.，J．Biol．Chem.，14：381-388(1 913)に記載されているように実施した。 ａ）２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキシ−ピリミジン）（42） ２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキシピリミジンの合成は、Jons e t al.，J．Biol．Chem.，14：381-388(1913)に記載されており、そして実施例６ 、工程（ａ）に例示されている。 ｂ）２−メチルメルカプト−４−アミノ−５−ニトロソ−６−オキソピリミジ ン（60） 350mlのH₂O に、20ｇの２−メチルメルカプト−４−アミノ−６−オキソピリ ミジン（42）および 5.1ｇのNaOHを添加した。40mlの水中の亜硝酸ナトリウムの 溶液を添加した。次いで、この混合物を17ｇの氷酢酸の徐々の添加により酸性化 した。形成する沈澱は白色であったが、短時間で青色に変化した。混合物を室温 において一夜放置し、次いで沈澱を濾過し、冷水で洗浄し、乾燥しないで、２− メチルメルカプト−４，５−ジアミノ−６−オキソピリミジンの製造に使用した 。ニトロソ誘導体の収率はほとんど定量的であった。それはわずかに熱水または アルコール中に可溶性であり、ベンゼン中で可溶性ではなかった。それはアルカ リ中で赤色溶液を形成し、そして酸中で青色溶液を形成した。一部分を分析のた めにアンモニア中に溶解し、酢酸で沈澱させることによって精製した。この物質 は溶融せず、約 255℃において分解し始めた。Ｃ₅ＨＯ₂Ｎ₄Ｓについての分析 Ｎ，30.10 。実測値 Ｎ，30.16 。 ｃ）５，６−ジアミノ−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オン（61） １リットルのフラスコに、50mlの硫化アンモニウムの10％溶液を添加した。こ の溶液を水蒸気浴上で加熱した。前の実験において得 られた湿潤２−メチルメルカプト−４−アミノ−５−ニトロソ−６−オキソ−ピ リミジン（60）を徐々に添加した。ニトロソ化合物が過剰に存在することを示す ように溶液が赤色になったとき、硫化アンモニウムをまた添加した。硫化アンモ ニウムは過剰に存在したとき、溶液は黄色であった。ニトロソ化合物のすべてが 還元されたとき、過剰の硫化アンモニウムの添加は回避すべきであるか、または 得られたジアミノ化合物は高度に着色するであろう。 ｄ）６−エトキシカルボニルメチル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７− ジオン（62） 17.2ｇ(0.1mole)の５，６−ジアミノ−２−メチルチオ−ピリミジン−４−オ ン（61）および22.6ｇのナトリウムエチルオキサリルアセテートの混合物を、 2 00mlの氷酢酸中で80℃に30分間加熱した。冷却後、沈澱を集め、H₂O で洗浄し、 乾燥した。次いで粗物質を再びEtOH／H₂O１：１中で加熱することによって溶解 させ、 170mlの飽和NaHCO₃を添加した。熱溶液を活性炭で処理し、濾液をゆっく り 200mlの熱氷酢酸中に撹拌しながら注いだ。黄色沈澱を濾過し、H₂O およびエ タノールで洗浄し、 100℃において乾燥すると、62が18.9ｇ（64％）の輝く結晶 として得られた（融点 213℃）。Ｃ₁₁Ｈ₁₂Ｎ₄Ｏ₄Ｓ(296.3)についての分析：Ｃ ，44.59；Ｈ，4.08；Ｎ，18.91 。実測値：Ｃ，44.49；Ｈ，4.03；Ｎ，18.88 。 ｅ）６−メチル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７−ジオン（63） 120mlの 2.5Ｎ NaOH中の19.7ｇ（66.5mmol）の６−エトキシカルボニルメチ ル−２−メチルチオ−プテリジン−４，７−ジオン（62）の溶液を80℃において 30分間撹拌した。熱溶液を活性炭で処理し、濾過し、濾液を50mlの熱氷酢酸の中 にゆっくり添加した。沈澱を冷却後集め、H₂O およびアセトンて洗浄し、 100℃ において乾燥 すると、63が14.3ｇ（96％）の黄色結晶粉末状物として得られた（融点 275℃分 解）。Ｃ₈Ｈ₈Ｎ₄Ｏ₂Ｓ(224.3)についての分析：Ｃ，42.85；Ｈ，3.60；Ｎ，24.9 9 。実測値：Ｃ，42.79；Ｈ，3.59；Ｎ，25.06 。 ｆ）６−メチル−２−メチルチオ−８−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル− ２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−４，７−ジオン（64） 240mlの無水アセトニトリル中の 4.0ｇ(17.83mmol)の６−メチル−２−メチル チオ−プテリジン−４，７−ジオン（63）の懸濁液に、８ml（53.6mmol）のDBU を添加した。この混合物を室温において30分間撹拌した。生ずる透明な溶液に、 4.62ｇ（11.9mmol）の３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−α−Ｄ −リボフラノシルクロライド（16）を添加し、次いで混合物を室温において湿気 を排除して６時間撹拌した。この溶液に、 100mlのジクロロメタン中の 2.4mlの 氷酢酸を添加した。この溶液を５分間撹拌し、次いで減圧下に蒸発乾固させると 、シロップ状物が得られ、これをシリカゲルのカラム(16×8.5cm)のクロマトグ ラフィーにかけ、まず 3.5リットルのトルエン／酢酸エチル１：１、次いで 2.5 リットルのトルエン／アセトン１：２、最後に３リットルのジクロロメタン／メ タノール 100：３で溶離した。生成物の画分を集め、蒸発させ、残留物をトルエ ンから再結晶化させると、64が2.12ｇ（31％）の無色の結晶として得られた（融 点 196−197 ℃）。Ｃ₂₉Ｈ₂₈Ｎ₄ＯＳ(576.6)についての分析：Ｃ，60.41；Ｈ，4 .89；Ｎ，9.72。実測値：Ｃ，60.26；Ｈ，4.96；Ｎ，9.68。 ｇ）６−メチル−２−メチルチオ−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（ ３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）− プテリジン−７−オン（65） 75mlのジオキサン中の2.19ｇ(3.8mmol)の６−メチル−２−メチルチオ−８− （３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル） −プテリジン−４，７−ジオン（64），9.95ｇ（5.69mmol）のｐ−ニトロ−フェ ニルエタノールおよび1.52ｇ（5.69mmol）のトリフェニルホスファンの溶液に、 1.16ｇ(5.7mmol)のエチルアゾジカルボキシレートを添加した。この混合物を室 温において 2.5時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、残留物をシリカゲルのカ ラム(5.3×15cm)のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、 300mlのトル エン、 250mlのトルエン／酢酸エチル８：１および 650mlのトルエン酢酸エチル ６：１を使用した。生成物の画分を集め、蒸発乾固し、残留物CH₂Cl₂／AcoEt か ら再結晶化させると、65が2.31ｇ（85％の収率）の無色の結晶として得られた（ 融点 122-125 ℃）。Ｃ₃₇Ｈ₃₅Ｎ₅Ｏ₉Ｓ(727.8)についての分析：Ｃ，61.23；Ｈ ，4.86；Ｎ，9.65。実測値：Ｃ，61.18；Ｈ，4.95；Ｎ，9.67。 ｈ）６−メチル−２−メチルスルホニル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ− ８−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシ ル）−プテリジン−７−オン（65） 100mlの無水CH₂Cl₂中の2.27ｇ（3.13mmol）の６−メチル−２−メチルチオ− ４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２ −デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（65）の溶液に 、撹拌しながら1.35ｇ（＞6.25mmol）のｍ−クロロ過安息香酸（80〜90％の純度 ）を添加した。24時間撹拌した後、この溶液を減圧下に10mlに濃縮し、ｍ−クロ ロ過安息香酸の沈澱を濾過し、CH₂Cl₂（92×５ml）で洗浄し、次いで双方の濾液 を蒸発させた。残留物をシリカゲルのカラム(5.3×14cm)上に置き、生成物をト ルエン／AcOEt ５：２で溶離した。生成 物の画分を小さい体積に濃縮し、これにより66は溶液の中から外に結晶化して 2 .4ｇ（86％）の無色の結晶が得られた（融点 193℃）。Ｃ₃₇Ｈ₃₅Ｎ₅Ｏ₁₁Ｓ(757. 8)についての分析：Ｃ，58.65；Ｈ，4.66；Ｎ，9.24。実測値：Ｃ，58.77；Ｈ， 4.69；Ｎ，9.30。 ｉ）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（３， ５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテ リジン−７−オン（67） 撹拌しながら、1.89ｇ(2.5mmol)の６−メチル−２−メチルスルホニル−４− ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デ オキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（65）に、気体NH₃ を80分間泡立てて通入した。次いでこの溶液を蒸発させ、２回CH₂Cl₂とともに共 蒸発させ、生ずる残留物をシリカゲルのカラム(5.5×８cm)上に置き、クロマト グラフィーにかけ、トルエン／AcOEt ５：２で溶離した。生成物の画分を小さい 体積に濃縮し、これにより67は溶液の中から外に結晶化して1.68ｇ（97％）の無 色の結晶が得られた（融点 208−209 ℃）。Ｃ₃₆Ｈ₃₄Ｎ₆Ｏ₉(694.7)についての 分析：Ｃ，62.24；Ｈ，4.93；Ｎ，12.10 。実測値：Ｃ，61.98；Ｈ，4.94；Ｎ， 12.14 。 ｊ）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（２− デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（68） 30mlのCH₂Cl₂および60mlのMeOH中の1.17ｇ（1.69mmol）の２−アミノ−６−メ チル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイ ル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（67）の 溶液に、0.45ｇ（3.37mmol）のナトリウムチオフェノレートを添加した。この溶 液を室温におて16時間撹拌した。次いで11ｇのフラッシュシリカゲルを反応混合 物に添加し、減圧下に蒸発させた。生ずる混合物をCH₂Cl₂／MeOH混合物(500mlの 100：１， 300mlの50：１および９：１)で前もって平衡化したシリカゲルのカラ ム(5.3×8.5cm)上に置いた。生成物の画分をプールし、蒸発させると、68が0.63 ｇ（81％）の微結晶質粉末状物として得られた（融点＞220 ℃分解）。Ｃ₂₀Ｈ₂₂ Ｎ₆Ｏ₇(458.4)についての分析：Ｃ，52.40；Ｈ，4.84；Ｎ，18.34 。実測値：Ｃ ，52.31；Ｈ，4.76；Ｎ，18.22 。 ｋ）２−アミノ−６−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル ）−プテリジン−４，７−ジオン〔６−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ− リボフラノシル）−イソキサントプテリン（69） 15mlのピリジン中の0.195ｇ(0.425mmol)の２−アミノ−６−メチル−４−ｐ− ニトロフェニルエトキシ−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プ テリジン−７−オン（68）の溶液に、1.12ml（1.14mmol）のDBU を添加した。こ の溶液を室温において３時間撹拌した。次いでこの溶液を減圧下に蒸発させ、残 留物を25mlのH₂O 中に溶解し、CH₂Cl₂（３×25ml）で洗浄した。水性相をHCl に よりpH７に中和し、次いで小さい体積（５ml）に濃縮した。この混合物をアイス ボックスの中に入れ、69は0.84ｇ（71％）の無色の結晶として得られた（融点 3 00℃分解）。Ｃ₁₂Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₃・１／２Ｈ₂Ｏ(318.3)についての分析：Ｃ，44.28 ；Ｈ，5.06；Ｎ，22.00 。実測値：Ｃ，45.42；Ｈ，4.91；Ｎ，21.86 。 １）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（５− Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジ ン−７−オン（70） 15mlの無水ピリジン中の0.57ｇ（1.22mmol）の２−アミノ−６−メチル−８− （２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリ ジン−４，７−ジオン〔６−メチル−８−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノ シル）−イソキサントプテリン（69）の溶液に、 0.454ｇ（1.34mmol）のジメト キシトリチルクロライドを添加した。この混合物を室温において 1.5時間撹拌し た。次いで、５mlのMeOHを添加し、この溶液を５分間撹拌し、次いで 100mlのCH₂ Cl₂で希釈した。生ずる溶液を 100mlの飽和NaHCO₃溶液で洗浄し、H₂O（100ml） で２回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残留物をクロマ トグラフィーのためにシリカゲルのカラム（３×15ml）上に置き、トルエン／Ac OEt １：１で溶離した。生成物の画分を蒸発させると、70が 0.5ｇ（54％）の固 体状泡状物として得られた。Ｃ₄₀Ｈ₄₀Ｎ₆Ｏ₉(760.8)についての分析：Ｃ，63.14 ；Ｈ，5.30；Ｎ，11.05 。実測値：Ｃ，63.06；Ｈ，5.21；Ｎ，10.91 。 ｍ）２−アミノ−６−メチル−４−ｐ−ニトロフェニルエトキシ−８−（５− Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジ ン−７−オン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホル アミダイト（71） 15mlの無水CH₂Cl₂中の0.76ｇ（１mmol）の２−アミノ−６−メチル−４−ｐ− ニトロフェニルエトキシ−８−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−デオキシ− β−Ｄ−リボフラノシル）−プテリジン−７−オン（70）の溶液に、アルゴン雰 囲気下に、 0.425ｇ(1.5mmol)の２−シアノエチル−ビス−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ ピルアミノ−−ホスファンおよび35mg(0.5mmol)のテトラゾールを添加した。こ の溶液を室温において12時間撹拌した。次いでこの混合物を15mlのCH₂Cl₂で希釈 し、１回10mlの飽和NaHCO₃溶液で、２回飽和NaCl溶液で抽出した。有機層を硫酸 ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残留物をクロマトグラフィーのためにシリカゲ ルのカラム上に置き、少量のトリエチルアミンを含有するトルエン／AcOEt で溶 離した。生成 物の画分を集め、蒸発させると、黄色がかった泡状物が得られ、これを少量のト ルエン中に溶解し、 100mlのｎ−ヘキサンの中に撹拌しながら滴下すると、吸引 濾過および乾燥後、71が 0.865ｇ（90％）の黄色がかった粉末状物として得られ た（融点＞150 ℃分解）。Ｃ₅₀Ｈ₅₇Ｎ₈Ｏ₁₀Ｐ(960.9)についての分析：Ｃ，62.9 7；Ｈ，5.98；Ｎ，12.32 。実測値：Ｃ，62.81；Ｈ，5.88；Ｎ，12.20 。実施例10 ２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−プテリジン−５’−トリホスフェー トの一般的合成 ａ）トリエチルアンモニウムプテリジン−２’−デオキシリボヌクレオシド− ５’−モノホスフェート（72） 15mlのトリメチルホスフェートに、 6.5mMの適当なプテリジン−β−Ｄ−２’ −デオキシリボヌクレオシドを添加する。すべての湿気を排除して、この混合物 を−６℃に冷却する。次いでこの混合物を撹拌し、 1.5ml（16.3mmol）のPOCl₃ を５分かけて滴下し、次いで混合物を０℃において２時間撹拌して透明溶液を得 る。この溶液に、 120mlの 0.5Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩の緩衝液pH7. 5 を添加する。この溶液を15分間撹拌し、次いで真空蒸発させる。メタノールと ともに数回共蒸発させた後、残留物H₂O 中に溶解し、DEAE−セファデックスカラ ム(2.5×80cm；HCO₃型)上に置く。０〜0.3 Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩 の緩衝液pH7.5 の直線の勾配を使用してクロマトグラフィーを実施し、８〜10リ ットルの緩衝液を使用する。 主要な画分は 0.2〜0.3 Ｍの緩衝液濃度において溶離される。この画分を30℃ において真空蒸発させ、次いで生ずる残留物をメタノールとともに数回共蒸発さ せる。高真空下に乾燥すると、固体状物72が得られる。 ｂ）トリエチルアンモニウムプテリジン−２’−デオキシリボヌクレオシド− ５’−トリホスフェート（73） トリエチルアンモニウムプテリジン−２’−デオキシリボヌクレオシド−５’ −モノホスフェート（58）（１mmol）を無水ピリジンとともに３回共蒸発させ、 次いで10mlの無水ジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解する。無水条件下に 0.8 ｇ（５mmol）のカルボニルジイミダゾールを添加した後、この溶液を一夜撹拌す る。0.33mlの無水メタノールを溶液に添加し、１時間撹拌することによって、過 剰のカルボニルジイミダゾールをクエンチングする。この溶液に、50mlの無水DM F 中の５mMのｔ−ブチルアンモニウムピロホスフェートの懸濁液を添加する。次 いでこの混合物を室温において連続的20時間撹拌する。生ずる沈澱を濾過し、DM F で洗浄し、濾液を高真空下に30℃において蒸発させる。残留物をメタノールお よびH₂O とともに数回共蒸発させ、次いでH₂O 中に溶解し、DEAE−セファデック スカラム(2.5×80cm；HCO₃型)上に置き、トリエチルアンモニウム重炭酸塩の緩 衝液pH7.5 の直線の勾配で溶離し、約10リットルを使用する。生成物は 0.7Ｍの 緩衝液濃度の画分の中に溶離される。画分をポリし、次いでメタノールとともに 数回共蒸発させる。次いで混合物を高真空下に乾燥すると、73がアモルファス固 体状物として得られる。 ｃ）ナトリウムプテリジン−２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリホ スフェート（74） 10mlの無水メタノールの中に、 0.5mMのトリエチルアンモニウムプテリジン− ２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（73）を溶解する。 この溶液を撹拌し、 1.5当量のアセトン中の１Ｎ NaI溶液をゆっくり滴下してナ トリウム塩の沈澱を形成する。この懸濁液を 100mlのアセトンで希釈し、30分撹 拌し、次いで 固体状物を磁器の漏斗を通して吸引により集める。固体状物を小さい部分のアセ トンで洗浄し、高真空下に乾燥すると、74が得られ、これはトリエチルアンモニ ウム塩よりも安定であり、分解しないで貯蔵することができる。実施例11 プテリジン誘導体を含有するオリゴヌクレオチドの合成 下記のオリゴヌクレオチドをABI DNA 合成装置（380B型、Applied Biosystems 、カリフォルニア州フォスターシティー）により合成した： 各オリゴヌクレオチドにおいて、１または２以上のグアノシンを式ＸＶのプテリ ジンデオキシリボヌクレオチド（Ｎと表示する）で置換した。 プテリジンヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを合成するために、ジ メトキシトリチルでブロックしたプテリジンホスホルアミダイトをDNA 合成装置 上のボトルの口＃５の中に入れた。 濃アンモニアの処理によりオリゴヌクレオチドの固体の支持体から切断し、ア ンモニア溶液を55℃に５時間加熱することによって脱保護した。次いで試料をス ピード・バク・コンセントレーター（Speed Vac Concentrator）（Savant 、米 国ニューヨーク州ファーミングデール）中で蒸発乾固させた。19：１の20％ポリ アクリルアミドゲルの電気泳動により、オリゴヌクレオチドを精製した。バンド を紫外線吸収により検出し、切除し、粉砕およびソーキング方法により 0.3Ｍの 酢酸ナトリウムpH5.2 の中に溶離した。最後に、MgCl₂を添加して 0.1Ｍの濃度 を達成し、試料をエタノール中で沈降させた。 TRIS緩衝液pH7.8 中のオリゴヌクレオチドの蛍光分析は、下表１に示す相対的 量子を明らかにした。 360nmの励起波長を使用して、蛍光測定を行った。硫酸キ ニンを標準として使用し、測定をフルオロメーター（8000型、 SLM−Aminco、米 国イリノイ州アーバナ）。表１：種々の位置においてグアノシンと置換したプテ リジンヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドの相対的量子収量 実施例12 プテリジン誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを利用するインテグラーゼ活性 の実時間検出 オリゴヌクレオチド５’−GTGTGGAAAATCTCTAGCANT−３’（配列No：６）およ びその相補体５’−ACTGCTAGAGATTTTCCACAC−３’を実施例11の方法に従い合成 した。次いでオリゴヌクレオチドを一緒に 100mMのNaCl溶液中で85℃に加熱し、 この溶液を室温にゆっくり冷却することによってアニーリングした。これにより 、モデルの基質の二本鎖DNA 分子が形成した： ここでＮはプテリジンヌクレオチドを表す。 HIV−１インテグラーゼｐ−トルオイルー（3.5pmol／反応）を大腸菌（Esche rchia Coli）の発現ベクターを介して、Bushmann et al.，Science，249：1555- 1558(1990)に記載されているように、生産した。タンパク質は−70℃において１ ＭのNaCl／20mMのHepes，pH7.6／１mMのEDTA／１mMのジチオスレイトール／20％ のグリセロ ール(wt／vol)中で貯蔵した。 ストックｐ−トルオイル−（0.44mg／ml）をまずタンパク質貯蔵緩衝液（１Ｍ のNaCl／20mMのHepes，pH7.6／１mMのEDTA／１mMのジチオスレイトール／20％(w r／vol)グリセロール）中で１：３に希釈した。引き続く酵素の希釈は反応緩衝 液（25mMの Mops，pH7.2／7.5mM のMnCl₂／ウシ血清アルブミン、 100μｇ／ml ／10mMの２−メルカプトエタノール）中で１：20であった。反応体積は60μｌで あった。最終の反応混合物は50mMのNaCl，１mMのHepes,50μＭのEDTAおよび50μ Ｍのジチオスレイトール、10％(et／vol)のグリセロール、7.5mM のMnCl₂，0.1m g／mlウシ血清アルブミン、10mMの２−メルカプトエタノール、および20mMのMOP S，pH7.2 を含有した。 反応を酵素の添加により開始し、フルオロメーター（8000型、 SLM−Aminco、 米国イリノイ州アーバナ）を使用して蛍光強度の変化を観測することによって、 実時間において10〜20分間モニターした。励起波長は 360nmであり、そして放射 波長は 460nmであった。 インテグラーゼは上記に示すモデル基質と反応して、下記の配列を生成した： プテリジンヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの中に組込んだとき、プテリジン ヌクレオチドの蛍光はかなりクェンチングした（0.14の量子収量）。切断反応は この反応はこのクエンチを解放し、シグナルの４倍増加を生じた（モノマーにつ いて0.88の量子収量）。したがって、蛍光の増加を測定することによって、イン テグラーゼの活性はアッセイされた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ // Ｃ０９Ｋ 11/06 7508−4Ｈ Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デービス，マイケル ディーン アメリカ合衆国，メリーランド 20852, ロックビル，ロックビル プレース 11801 (72)発明者 バリス，フランク アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベセスダ，ロックハースト ロード 6310

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記に示すように環の頂点１〜８をもつ式； （式中、 Ｒ¹¹はＲ¹²と組合わされて二重結合により環の頂点４に結合する単一のオキソ 酸素を形成するか、またはＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間の二重結合を形 成し、 Ｒ¹²はＲ¹¹と組合わされないとき、NH₂、および保護基で１または２置換され たNH₂から成る群より選択される構成員であり、 Ｒ¹³はＲ¹¹と結合しないとき、低級アルキルまたはＨであり、 Ｒ¹⁴はＨ、低級アルキルまたはフェニルから成る群より選択される構成員であ り、 Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合する単一のオキソ 酸素を形成するか、またはＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形 成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、 Ｒ¹⁶はＲ¹⁵と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、NH₂、および保護基１また は２置換されたNH₂から成る群より選択される構成員であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶組合わされないとき、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹組合わされて二 重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされるとき、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間 で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はＨおよび低級アルキルから成る群より選択さ れる構成員であり、そして Ｒ¹⁷はＲ¹⁵と結合しないとき、かつＲ²⁰はＲ¹⁸と結合しないとき、 であり、式中、 Ｒ²¹はＨ、トリホスフェート、および保護基から成る群より選択される構成員 であり、 Ｒ²²はＨ、OHおよび保護基で置換されたOHから成る群より選択される構成員で あり、 Ｒ²³はＨ、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、ホ スホロチオエート、ホスホトリエステル、ヘミスクシネート、固体の支持体に共 有結合したヘミスクシネート、ジシクロヘキシルカーボジイミド、および固体の 支持体に共有結合したジシクロヘキシルカーボジイミドから成る群より選択され る構成員であり、 Ｒ¹³がＨでありかつＲ²³がＨであるとき、Ｒ²¹はトリホスフェートであり、そ して Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成しかつＲ²³がＨ であるとき、Ｒ²¹はトリホスフェートである） を有する化合物。 ２．Ｒ¹⁴がＨ，CH₃およびフェニルから成る群より選択される、請求項１に記 載の化合物。 ３．Ｒ¹⁴がＨおよびCH₃から成る群より選択される、請求項１に記載の化合物 。 ４．Ｒ¹⁶が、Ｒ¹⁵と結合しないとき、Ｈ、フェニル、NH₂、および保護基で２ 置換されたNH₂から成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。 ５．Ｒ¹⁶が、Ｒ¹⁵と結合しないとき、Ｈおよびフェニルから成る群より選択さ れる、請求項１に記載の化合物。 ６．Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹がＨおよびCH₃から成る群より選択され る、請求項１に記載の化合物。 ７．Ｒ¹⁴がＨ，CH₃およびフェニルから成る群より選択される構成員であり、 Ｒ¹⁶が、Ｒ¹⁵と結合しないとき、Ｈ、フェニルおよびNH₂から成る群より選択さ れる構成員であり、そして、Ｒ¹⁸かＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹がＨおよびCH₃か ら成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。 ８．Ｒ¹²がベンゾイル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメ チリデン、ジメチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル およびジメチルアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護基で１また は２置換されたNH₂である、請求項１に記載の化合物。 ９．Ｒ¹²がジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカ ルボニル、およびジメルチアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護 基で１置換されたNH₂である、請求項１に記載の化合物。 10．Ｒ¹⁶がベンゾイル、イソブチリル、フタロイル、ジ−ｎ−ブ チルアミノメチリデン、ジメチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキ シカルボニルおよびジメチルアミノメチレンアミノから成る群より選択される保 護基で１または２置換されたNH₂である、請求項１に記載の化合物。 11．Ｒ¹⁶がジ−ｎ−ブチルアミノメチリデン、ｐ−ニトロフェニルエトキシカ ルボニル、およびジメルチアミノメチレンアミノから成る群より選択される保護 基で１置換されたNH₂である、請求項１に記載の化合物。 12．Ｒ²¹がＨ、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、フタ ロイル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレン、およびジメチルアミノメチリデンか ら成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。 13．Ｒ²¹がジメトキシトリチル、ジ−ｎ−ブチルアミノメチリレン、およびジ メチルアミノメチリデンから成る群より選択される、請求項１に記載の化合物。 14．Ｒ²²がＨ，OHおよび置換OHから成る群より選択される構成員であり、前記 置換OHはトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、テトラヒドロ ピラン−１−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、１−（２−ク ロロ−４−メチル）フェニル−４−メトキシピペリジン−４−イル、ｔ−ブチル ジメチルシリル、ｐ−ニトロフェニルエチルスルホニル、テトラヒドロピラニル 、４−メトキシテトラヒドロピラニル、２−ニトロベンジル、９−フェニルキサ ンテン−９−イルおよびｐ−ニトロフェニルエチルから成る群より選択される構 成員で置換されている、請求項１に記載の化合物。 15．Ｒ²²がＨおよび置換OHから成る群より選択される構成員であり、前記置換 OHがジメトキシトリチル、テトラヒドロピラン−１− イル、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−ニトロベンジル、およびｐ−ニトロフェ ニルエチルから成る群より選択される構成員で置換されている、請求項１に記載 の化合物。 16．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂、および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され 、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がフェニルであり、 Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項１に記載の化合物。 17．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂、および保護基で１または２置換されたNH₂から成る 群より選択され、 Ｒ¹⁴がフェニルであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がＨであり、 Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項１に記載の化合物。 18．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ を形成し、 Ｒ¹³がCH₃であり、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がNH₂であり、 Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項１に記載の化合物。 19．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹²と組合わされて二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、 Ｒ¹³がＨであり、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がNH₂および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され、 Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項１に記載の化合物。 20．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹²と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹³がＨであり、 Ｒ¹⁴がCH₃であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がNH₂および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され、 Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と組合わされて二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項１に記載の化合物。 21．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂、および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され 、 Ｒ¹⁴がCH₃であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、 Ｒ¹⁷が であり、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がCH₃である、 請求項１に記載の化合物。 22．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂、および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され 、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹⁷が であり、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がCH₃である、 請求項１に記載の化合物。 23．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂、および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され 、 Ｒ¹⁴がかCH₃であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、 Ｒ¹⁷が であり、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がＨである、 請求項１に記載の化合物。 24．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂、および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され 、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ 酸素を形成し、 Ｒ¹⁷が であり、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がＨである、 請求項１に記載の化合物。 25．Ｒ¹²がNH₂である、請求項16に記載の化合物。 26．式中、 Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項16に記載の化合物。 27．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項16に記載の化合物。 28．Ｒ¹²がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項27に記載の化合物。 29．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項26に記載の化合物。 30．Ｒ¹²がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項29に記載の化合物。 31．Ｒ¹²がNH₂である、請求項17に記載の化合物。 32．式中、 Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項17に記載の化合物。 33．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項32に記載の化合物。 34．Ｒ¹²がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項33に記載の化合物。 35．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項32に記載の化合物。 36．Ｒ¹²がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項35に記載の化合物。 37．Ｒ²³がＨ，Ｈ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、 および固体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される 構成員である、請求項18に記載の化合物。 38．式中、 Ｒ²¹がＨであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項37に記載の化合物。 39．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項37に記載の化合物。 40．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項37に記載の化合物。 41．Ｒ¹⁶がNH₂である、請求項19に記載の化合物。 42．式中、 Ｒ¹⁶が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項19に記載の化合物。 43．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項42に記載の化合物。 44．Ｒ¹⁶がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項43に記載の化合物。 45．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項42に記載の化合物。 46．Ｒ¹⁶がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項45に記載の化合物。 47．Ｒ¹⁶がNH₂である、請求項20に記載の化合物。 48．式中、 Ｒ¹⁶が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項21に記載の化合物。 49．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項48に記載の化合物。 50．Ｒ¹⁶がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項49に記載の化合物。 51．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項48に記載の化合物。 52．Ｒ¹⁶がジメチルアミノメチレンアミノである、請求項51に記載の化合物。 53．Ｒ¹²がNH₂である、請求項21に記載の化合物。 54．式中、 Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項21に記載の化合物。 55．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項54に記載の化合物。 56．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項55に記載の 化合物。 57．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項54に記載の化合物。 58．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項57に記載の 化合物。 59．Ｒ¹²がNH₂である、請求項22に記載の化合物。 60．式中、 Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項22に記載の化合物。 61．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項60に記載の化合物。 62．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項61に記載の 化合物。 63．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項60に記載の化合物。 64．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項63に記載の 化合物。 65．Ｒ¹²がNH₂である、請求項23に記載の化合物。 66．式中、 Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項23に記載の化合物。 67．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項66に記載の化合物。 68．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項67に記載の 化合物。 69．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項66に記載の化合物。 70．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項69に記載の 化合物。 71．Ｒ¹²がNH₂である、請求項24に記載の化合物。 72．式中、 Ｒ¹²が保護基で１または２置換されたNH₂であり、そして Ｒ²³がＨ−ホスホネート、ホスホルアミダイト、ヘミスクシネート、および固 体の支持体に共有結合したヘミスクシネートから成る群より選択される構成員で ある、 請求項24に記載の化合物。 73．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がβ−シアノエチル、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、 請求項72に記載の化合物。 74．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項73に記載の 化合物。 75．式中、 Ｒ²¹がジメトキシトリチルであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がコントロールされた孔のガラスに共有結合したヘミスクシネートである 、 請求項72に記載の化合物。 76．Ｒ¹²がｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニルである、請求項75に記載の 化合物。 77．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項16に記載の化合物。 78．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項17に記載の化合物。 79．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項18に記載の化合物。 80．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項19に記載の化合物。 81．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項20に記載の化合物。 82．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項21に記載の化合物。 83．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項22に記載の化合物。 84．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項23に記載の化合物。 85．式中、 Ｒ²¹がトリホスフェートであり、 Ｒ²²がＨであり、そして Ｒ²³がＨである、 請求項24に記載の化合物。 86．下記に示すように環の頂点１〜８をもつ式 （式中、 Ｒ¹¹はＲ¹²と組合わされて二重結合により環の頂点４に結合する単一のオキソ 酸素を形成するか、またはＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間の二重結合を形 成し、 Ｒ¹²はＲ³と組合わされないとき、NH₂であり、 Ｒ¹³はＲ¹¹と結合しないとき、低級アルキルまたはＨであり、 Ｒ¹⁴はＨ、低級アルキルまたはフェニルから成る群より選択される構成員であ り、 Ｒ¹⁵はＲ¹⁶と組合わされて二重結合により環の頂点２に結合する単一のオキソ 酸素を形成するか、またはＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間の二重結合を形 成し、こうして環の頂点２および４は集合的に最大１つのオキソ酸素を有し、 Ｒ¹⁶はＲ¹⁵と組合わされないとき、Ｈ、フェニル、およびNH₂から成る群より 選択される構成員であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされないとき、Ｒ¹⁸はＲ¹⁹と組合わされて二 重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と組合わされるとき、Ｒ¹⁸はＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間 で二重結合を形成し、そしてＲ¹⁹はＨおよび低級アルキルから成る群より選択さ れる構成員であり、そして Ｒ¹⁷はＲ¹⁵と結合しないとき、かつＲ²⁰はＲ¹⁸と結合しないとき、 であり、式中、 Ｒ²²はＨおよびOHから成る群より選択される構成員である） を有するプテリジン誘導体である１種または２種以上のヌクレオチドモノマーを 含んでなるオリゴヌクレオチド。 87．Ｒ¹⁴がＨ，CH₃およびフェニルから成る群より選択される、請求項86に記 載の化合物。 88．Ｒ¹⁴がＨおよびCH₃から成る群より選択される、請求項86に記載の化合物 。 89．Ｒ¹⁶が、Ｒ¹⁵と結合しないとき、Ｈ、フェニル、およびNH₂から成る群よ り選択される、請求項86に記載の化合物。 90．Ｒ¹⁶が、Ｒ¹⁵と結合しないとき、Ｈおよびフェニルから成る群より選択さ れる、請求項86に記載の化合物。 91．Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹がＨおよびCH₃から成る群より選択され る、請求項86に記載の化合物。 92．Ｒ¹⁶がＨ，CH₃およびフェニルから成る群より選択される構 成員であり、Ｒ¹⁶が、Ｒ¹⁵と結合しないとき、Ｈ、フェニルおよびNH₂から成る 群より選択される構成員であり、そして、Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合するとき、Ｒ¹⁹がＨ およびCH₃から成る群より選択される、請求項86に記載の化合物。 93．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂であり、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がフェニルであり、 Ｒ¹⁶がＲ¹⁹と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項86に記載の化合物。 94．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂であり、 Ｒ¹⁴がフェニルであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がＨであり、 Ｒ¹⁶がＲ¹⁹と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項86に記載の化合物。 95．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹²と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹³がCH₃であり、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がNH₂であり、 Ｒ¹⁶がＲ¹⁹と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項86に記載の化合物。 96．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹²と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹³がＨであり、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がNH₂であり、 Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項86に記載の化合物。 97．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹²と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹³がＨであり、 Ｒ¹⁴がCH₃であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹⁶がNH₂および保護基で１または２置換されたNH₂から成る群より選択され、 Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と結合して二重結合により環の頂点７に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、そして Ｒ²⁰が である、 請求項86に記載の化合物。 98．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂であり、 Ｒ¹⁴がCH₃であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と結合して二重結合により環のj頁点２に接合した単一のオキソ酸 素を形成し、 Ｒ¹⁷が である、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がCH₃である、 請求項86に記載の化合物。 99．式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂であり、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹⁷が であり、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がCH₃である、 請求項86に記載の化合物。 100． 式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂であり、 Ｒ¹⁴がCH₃であり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹⁷が であり、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がＨである、 請求項86に記載の化合物。 101． 式中、 Ｒ¹¹がＲ¹³と結合して環の頂点３と４との間で二重結合を形成し、 Ｒ¹²がNH₂であり、 Ｒ¹⁴がＨであり、 Ｒ¹⁵がＲ¹⁶と結合して二重結合により環の頂点２に接合した単一のオキソ酸素 を形成し、 Ｒ¹⁷が であり、 Ｒ¹⁸がＲ²⁰と結合して環の頂点７と８との間で二重結合を形成し、そして Ｒ¹⁹がＨである、 請求項86に記載の化合物。 102． 前記ヌクレオチドモノマーか前記オリゴヌクレオチドの３’末端に存在 する、請求項86に記載の化合物。 103． 前記ヌクレオチドモノマーが前記オリゴヌクレオチドの５’末端に存在 する、請求項86に記載の化合物。 104． 前記ヌクレオチドモノマーが１〜10ピリミジンモノマーにより囲まれて いる、請求項86に記載の化合物。 および 、 から成る群より選択され、ここでＡはアデノシンヌクレオチドであり、Ｃはシト シンヌクレオチドであり、Ｇはグアノシンヌクレオチドであり、Ｔはチミジンヌ クレオチドであり、そしてＮはプテリジンヌクレオチドであり、式中Ｒ¹¹がＲ¹² と結合して二重結合により環の頂点４に接合した単一のオキソ酸素を形成し、Ｒ¹³ がCH₃またはＨであり、Ｒ¹⁴がＲ¹⁷と結合して環の頂点１と２との間で二重結 合を形成し、Ｒ¹⁶がNH₂であり、Ｒ¹⁸がＲ¹⁹と結合して二重結合により環の頂点 ７に接合した単一のオキソ酸素を形成し、そしてＲ²⁰が であり、式中Ｒ²²がＨである、請求項86に記載の化合物。