JPH10502525A - 鱗翅目有害生物に対して活性のある毒素をコード化する新規なバチルス・チュリンジエンシス遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はバチルス・チュリンジエンシス，クルスタキ変種（Bacillus thuringiensis var kurstaki）から精製されおよび単離され、そして名称ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）が与えられた新規な毒素遺伝子を記載する。新規な毒素遺伝子は約１３０ｋＤａの大きさのタンパク質をコード化し、そして鱗翅目の昆虫に対して活性がある。ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）によりコード化されたタンパク質もまた本発明に含む。さらにＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）から誘導された組換え遺伝子およびタンパク質も開示する。鱗翰目の昆虫を防除するための殺昆虫性製剤に使用できる新規な毒素遺伝子の少なくとも１種により形質転換された生物学的に純粋な細菌の菌株をも提供する。さらにまた本発明の他の見地は、少なくとも１種の毒素遺伝子またはその活性フラグメントにより形質転換された植物体であり、特に、その形質転換配列がトウモロコシにおける発現のために最適化されたものである。

Description

【発明の詳細な説明】 鱗翅目有害生物に対して活性のある毒素をコード化する新規なバチルス・チュ リンジエンシス遺伝子 本発明はバチルス・チュリンジエンシス，クルスタキ変種（Bacillus thuring iensis var kurstaki）から単離された新規な毒素遺伝子、該遺伝子によってコ ード化されるタンパク質、新規な毒素遺伝子の少なくとも１種を含む組換え菌株 および組換え菌株の少なくとも１種を含む殺昆虫組成物、ならびに新規な毒素遺 伝子またはそれらの誘導体の少なくも１種を含むトランスジェニック植物に関す る。 バチルス・チュリンジエンシスはグラム陰性、嫌気性内生胞子形成細菌の大き い群に属する。バチルス（Bacillus）属の種に関し非常に近接する他の種、例え ばバチルス・セレウス（Bacillus cereus）またはバチルス・アントラシス（Bac illus anthracis）とは違って、従来公知のバチルス・チュリンジエンシス（Bac illus thuringiensis）種の大多数は、それらの胞子形成の間に、その結晶性構 造によりそれはまた一般的に結晶体としても表される、副芽胞封入体(a paraspo ral inclusion body)を生産する。この結晶体は、殺虫剤活性の結晶性プロトキ シンタンパク質である、いわゆるδ−内毒素からなる。 これらのタンパク質はバチルス・チュリンジエンシスの昆虫への毒性の原因で ある。δ−内毒素は結晶体の経口摂取の後、結晶体が標的昆虫の腸液に溶解する ときまでは殺虫剤活性を示さない。殆どの場合、実際の毒性成分がプロトキシン から放出され、プロテアーゼの作用による昆虫の消化管からのタンパク質加水分 解性の開裂が引き起こされる結果となる。 種々のバチルス・チュリンジエンシス菌株は一定の標的昆虫に関して、特に種 々の鱗翅目、鞘翅目および双翅目の幼虫に関し高い特異性により、およびこれら の幼虫に対する高い度合いの活性により特徴付けられる。バチルス・チュリンジ エンシスのδ−内毒素を使用する別の利点は、毒素が人、他の哺乳類、鳥類およ び魚類に無害であるという事実にある。 遺伝子工学の導入およびそれから得られる新しい可能性により、バチルス・チ ュリンジエンシス毒素の分野は新しい勢いを享受している。例えば多くの天然起 源の菌株は１より多くの、これらの菌株の殺虫剤活性の広範囲のスペクトルをも たらす昆虫毒素タンパク質をもつことが知られている。しかし、バチルス属の遺 伝子的形質転換の能力により、天然起源のものからの単離およびクローニングに より得られる昆虫毒素遺伝子の選択された配列を含むことのできる組換え菌株の 創成が可能である。このような組換え菌株は、個々の毒素タンパク質の殺虫剤活 性の知識に基づく特別な適用のため望ましいであろ ういかなる殺虫剤活性のスペクトルをも提供する。さらに、特別な昆虫または昆 虫部類に対して殺虫剤活性の程度を拡大することを意図する機能の選択された組 合せをもつ組換え毒素タンパク質を創作することまたは毒性タンパク質が活性の ある昆虫類に対してそれのスペクトルを拡張することもでまたできる。 バチルス・チュリンジエンシスからの種々の殺虫剤性結晶タンパク質はそれら の活性のスペクトルおよび配列の類似点に基づいて分類される。この分類は、そ の時公知の殺虫性結晶性タンパク質を４つの主なクラスに配置した、Hofte and Whiteley，Microbiol.Rev.53:242-255(1989)に述べられる。一般的に主なクラス は、鱗翅目に対するＣｒｙＩタンパク質活性、鱗翅目および双翅目の両方に対す るＣｒｙIIタンパク質活性、鞘翅目に対するＣｒｙIIIタンパク質活性および鞘 翅目に対するＣｒｙIVタンパク質活性を用いて活性のスベクトルにより定義され る。 おのおのの主なクラスの範囲内で、δ−内毒素は配列の類似によって類別され る。ＣｒｙＩタンパク質は代表的には、タンパク質加水分解的に開裂して約６０ ないし７０ｋＤａの活性毒素タンパク質を生成する１３０ないし１４０ｋＤａの プロトキシンタンパク質として生産される。δ−内毒素の活性部分は完全な長さ の分子(full-length molecule)のＮＨ₂末端部分に存在する。上記のHofte とWhi teleyはその時公知のＣｒｙＩタンパク質を ＩＡ（ａ），ＩＡ（ｂ），ＩＡ（ｃ），ＩＢ，ＩＣおよびＩＤの６つの群に分類 した。その後、ＣｒｙＩＥ，ＣｒｙＩＦ，ＣｒｙＩＧ，ＣｒｙＩＨおよびＣｒｙ ＩＸとして分類されたタンパク質にも特徴づけられている。バチルス・チュリン ジエンシスからの個々のδ−内毒素の殺虫剤活性のスペクトルは、与えられたδ −内毒素が数種の昆虫に対してのみ活性があることにより、極めて低い傾向にあ る。特異性は活性毒素タンパク質を生産しそして続いて昆虫消化管の上皮細胞と 相互作用するその能力に包含される種々の段階の有効性の結果である。 殺虫剤性であるためには、δ−内毒素はまず昆虫により消化され、溶解されそ して多くの場合タンパク質加水分解により開裂されて活性毒素を形成しなければ ならない。一度活性化すると、δ−内毒素はタンパク質毒素における特定のドメ インの作用により昆虫の腸上皮細胞の表面に存在する特定のタンパク質と結合す る。すべての場合が試された中で、それらが毒性である場合はいつも昆虫の腸へ のタンパク質毒素の結合が起こる。結合の後、δ−内毒素の異なるドメインは、 それ自体細胞膜中に進入して昆虫の腸上皮細胞の浸透圧による破壊を引き起こす 孔を創成することが考えられる。特別な昆虫へのタンパク質毒素の特異性は活性 化されたδ−内毒素の結合部位の特性によって多くの部分で、測定されることが 考えられる。 昆虫の腸細胞に結合するために必要とされるδ−内毒 素の領域の大きさは不明である。Schnepf ら(J.Biol.Chem.265：20923-20930,19 90)は、アミノ酸３３２および７２２の間の領域がヘリオチス・ヴィレセンス（H eliothis virescens）へのＣｒｙＩＡ（ｃ）の特異性に実質的に寄与し、そして この領域内にこの特異性にさらに寄与するサブシーケンスがあることを示した。 このアミノ酸３３２ないし７２２の領域は、liら(Nature 353：815-821,1991)に よって定義された、特異的に決定する「ドメインII」および構造的に配向して決 定する「ドメインIII」の両方に広がっている。この広い領域内のサブシーケン スの重要性は、アミノ酸３３２ないし４５０からカイコ（Bombyx mori；鱗翅目 ）へのタンパク質毒性の特異性を決定したＣｒｙＩＡ（ａ）の領域を確認した、 Geら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：4037-4041,1989)の調査結果によって、さら に強調されている。 本発明の目的は、毒素タンパク質をコード化する新規な遺伝子およびそれを含 む殺昆虫性組成物(entomocidal composition)を提供することである。 特に本発明はバチルス・チュリンジエンシス，クリスタキ変種（Bacillus thu ringiensis var kurstaki）から得られるＣｒｙＩＥ型の新規な毒素遺伝子であ って、ヘリオチス（Heliothis）種に対して活性があるがスポドプテラ・エクシ グア（Spodoptera exigua）に対しては活性を示さない、ＣｒｙＩＥ型毒素タン パク質をコード化する毒素遺伝子を示す。 新規な毒素遺伝子のそれぞれは大きさ約１３０ｋＤａで、鱗翅目の昆虫に対し て活性のあるタンパク質でをコード化する。新規な毒素遺伝子は名称ＣｒｙＩＥ （ｃ）〔配列番号(SEQ ID NO)：１〕およびＣｒｙＩＥ（ｄ）〔配列番号：７〕 に示されている。 従って本発明は特に、それぞれ配列番号：１および配列番号：７に示されるヌ クレオチド配列をもつ毒素タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ） をそれぞれコード化する単離されたＤＮＡ分子に関する。さらに切断されて、毒 素タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）の毒性コアフラグメント をそれぞれコード化する単離されたＤＮＡ分子を含む。本発明にまた含まれるの は、ＣｒｙＩＥ（ｃ）〔配列番号：２〕およびＣｒｙＩＥ（ｄ）〔配列番号：８ 〕それぞれによって、および／または上記毒素タンパク質の毒性コアフラグメン トによって製造されるタンパク質である。 本発明はヘリオチス属の昆虫に対して活性を与える新規な遺伝子のサブシーケ ンスの１またはそれ以上をもつ組換え遺伝子およびタンパク質をさらに包含する 。 従って、本発明の他の目的は毒素タンパク質をコード化する単離されたＤＮＡ 分子であって、それぞれヘリオチス種に対して活性がある、ＣｒｙＩＥ（ｃ）か ら得られるサブシーケンスＡ（配列番号：３）およびサブシーケンスＢ（配列番 号：４）または、ＣｒｙＩＥ（ｄ）から得られるサブシーケンスＡ’（配列番号 ：９）および サブシーケンスＢ’（配列番号：１０）よりなる群から選択される毒素タンパク 質をコード化するＤＮＡ分子を提供することである。 本発明はまた前記毒素タンパク質が、それぞれＣｒｙＩＥ（ｃ）から得られる サブシーケンスＡ（配列番号：３）およびサブシーケンスＢ（配列番号：４）の 両方または、ＣｒｙＩＥ（ｄ）から得られるサブシーケンスＡ’（配列番号：９ ）およびサブシーケンスＢ’（配列番号：１０）の両方、またはそれらの組合せ を含む、単離されたＤＮＡ分子をも含む。 上記ＤＮＡ分子によりコード化されるタンパク質もまた本発明の範囲に含まれ る。 本発明の特別な具体例は、それぞれ毒性タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣ ｒｙＩＥ（ｄ）をコード化する単離されたＤＮＡ分子、および／または上記毒素 タンパク質の毒性コアフラグメントをコード化するために切断された単離された ＤＮＡ分子であって、このＤＮＡ分子が植物における、特にトウモロコシ植物に おける発現に最適化されるものに関する。 本発明はさらに、本発明によるＣｒｙＩＥ型遺伝子のサブシーケンスの１以上を 、しかし特には、それぞれヘリオチス種に対して活性がある、ＣｒｙＩＥ（ｃ） から得られるサブシーケンスＡ（配列番号：３）およびサブシーケンスＢ（配列 番号：４）または、ＣｒｙＩＥ（ｄ）から得られるサブシーケンスＡ’（配列番 号：９）およ びサブシーケンスＢ’（配列番号：１０）よりなる群から選択されるサブシーケ ンスをもつ組換え遺伝子およびタンパク質を包含する。 特に、本発明はヘリオチス種に対して活性があるがスポドプテラ・エクシグア に対しては活性を示さない、ＣｒｙＩＥ型、特には、それぞれ配列番号：２およ び配列番号：８で与えられるＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）の毒素タ ンパク質をコード化するＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。好ましい 具体例では、本発明はキメラ構造体からなり、ヘリオチス種に対して活性がある がスポドプテラ・エクシグアに対しては活性を示さない、ＣｒｙＩＥ型の毒素タ ンパク質をコード化するＤＮＡ分子が微生物および／または植物中で操作可能な 発現の調節下にある、組換えＤＮＡ分子に関する。 本発明の更なる見地は、鱗翅目の昆虫の防除のための殺昆虫剤配合物において 使用できる新規な遺伝子の少なくとも１種により形質転換された組換体、生物学 的に精製した菌株である。特別な具体例では、本発明は微生物が、バチルス（Ba cillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、カウロバクター（Caulobacter ）属、アグメレナム（Agmellenum）属、リゾビウム（Rhizobium）属および、ク ラビバクター（Clavibacter）あるいはバキュロウイルス例えば、核多角体病ウ イルスであるオートグラフィカ・カリホルニカ（Autographica californi ca）または酵母、例えばサッカロマイセス属（Saccharomyces），クリプトコッ カス属（Cryptococcus），クルイベロマイセス属（Kluyveromyces），スポロボ ロマイセス属（Sporobolomyces），ロドトルラ属（Rhodotorula）およびアウレ オバシジウム（Aueobasidium）属の員からなる群から選択される微生物に関する 。 本発明はさらにまた、適当な担体とともに、新規なＣｒｙＩＥ型毒素タンパク 質分子の少なくとも１種、しかし特には、配列番号：２に示される配列をもつ単 離されたタンパク質および／または配列番号：８に示される配列をもつ単離され たタンパク質および／または、それぞれヘリオチス種に対して活性がある、サブ シーケンスＡ（配列番号：３）、サブシーケンスＢ（配列番号：４）、サブシー ケンスＡ’（配列番号：９）、サブシーケンスＢ’（配列番号：１０）よりなる 群から選択される配列ならびにサブシーケンスＡ，Ｂ，Ａ’およびＢの組合せを 含む単離されたタンパク質分子を殺虫剤有効量で含む殺昆虫性組成物に関する。 好ましい具体例では、本発明は組換え微生物、特に組換形態のまたはその誘導 体または変異体の新規な毒素遺伝子の少なくとも１種を含む、組換えバチルス・ チュリンジエンシス菌株を含む殺昆虫性組成物に関する。 本発明のさらに別の見地は、新規な毒素遺伝子またはその活性フラグメントの 少なくとも１種により形質転換された植物であって、その形質転換する配列が植 物、し かし特にトウモロコシ植物における発現に最適にされたものに関する。 特に、本発明は毒素タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）をそ れぞれ、またはその組合せをコード化するＤＮＡ分子を含み、ならびにそれぞれ 配列番号：１および配列番号：７に示されるヌクレオチド配列をもつ形質転換植 物、および／または上記毒素タンパク質の毒性コアフラグメントをコード化する ために切断された単離ＤＮＡ分子に関する。 本発明はさらにヘリオチス種に対して活性がある、サブシーケンスＡ（配列番 号：３）、サブシーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号 ：９）、サブシーケンスＢ’（配列番号：１０）よりなる群から選択される配列 、ならびにサブシーケンスＡ，Ｂ，Ａ’およびＢの組合せを含む毒素タンパク質 をコード化するＤＮＡ分子を含む形質転換された植物にも関する。 本発明の中で好ましいものはトウモロコシ、小麦、大麦、イネ、タバコ、綿お よび大豆よりなる群から選択された形質転換植物である。 本発明はさらに本発明による単離されたＤＮＡ分子のまたは上記ＤＮＡ分子に よってコード化されている毒素遺伝子を製造する方法に関する。上記ＤＮＡ分子 を含む組換え微生物および植物を製造する方法、ならびに殺昆虫性組成物を製造 する方法もまた本発明によって具体化される。 特に本発明はさらに、ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エ クシグアに対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型の、しかし特にはそれぞれＣｒｙ ＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）型の毒素タンパク質をコード化する単離され たＤＮＡ分子を製造する方法であって、 （ａ）バチルス・チュリンジエンシス，クルスタキ変種（Bacillus thurigiensi s var．kurstaki）から全てのＤＮＡを分離すること； （ｂ）適当な宿主有機体中にゲノムＤＮＡライブラリーを作ること； （ｃ）適当なプローブ分子により前記ライブラリーをプローブすること； （ｄ）ブローブ分子とハイブリダイズしたクローンを単離すること； （ｅ）その殺虫剤活性について前記クローンを検定することからなる方法に関す る。 本発明はさらにヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグ アに対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型の、しかし特にはそれぞれＣｒｙＩＥ（ ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）型の単離されたタンパク質分子を製造する方法であ って （ａ）キメラ構造体からなり、ヘリオチス種に対して活性があるがスポドプテラ ・エクシグアに対しては活性を示さない、ＣｒｙＩＥ型の毒素タンパク質をコー ド化す るＤＮＡ分子が微生物および／または植物中で操作可能な発現配列の調節下にあ る、組換えＤＮＡ分子により適当な宿主有機体を形質転換し； （ｂ）この形質転換された宿主有機体を適当な培地で生育させ；そして （ｃ）毒素遺伝子が発現されたとき形質転換された宿主有機体により生成された 組換えタンパク質生成物を単離することからなる方法にも関する。 本発明はさらに、トランスジェニック植物を製造する方法であって、該方法が キメラ構造体からなり、ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エ クシグアに対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型の、しかし特にはそれぞれＣｒｙ ＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）の毒性タンパク質をコード化する上記ＤＮＡ 分子が、上記植物中で操作可能な発現配列の調節の下にある、組換えＤＮＡによ って上記植物を形質転換することからなる方法を含む。 本発明の別の目的は、組換え微生物を製造する方法であって、該方法がキメラ 構造体からなり、ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグ アに対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型のの毒性タンパク質をコード化する上記 ＤＮＡ分子が、上記微生物中で操作可能な発現配列の調節の下にある、組換えＤ ＮＡによって該微生物を形質転換することからなる方法を提供する。 本発明はまた、適当な担体とともに、本発明により組換え微生物または単離さ れたタンパク質分子を殺虫剤有効量で混合することからなる殺昆虫性組成物を製 造する方法にも関する。 本発明の別の目的は、本発明のよる新規な毒素タンパク質の少なくとも１種を 直接、あるいは上記毒素タンパク質の少なくとも１種を含む殺昆虫性組成物、ま たは組換え形態またはその誘導体もしくは変異体において新規な毒素遺伝子の少 なくとも１種を含む組換え微生物、しかし特に組換えバチルス・チュリンジエン シス菌株からなる殺昆虫性組成物の形態で上記植物または該植物の生育区域に施 用することからなる昆虫の有害生物に起因する損傷に対し植物を保護する方法に 関する。 本発明の別の具体例は、本発明による昆虫の有害生物が発生するであろう区域 内に、本発明による植物を栽培することにより上記昆虫の有害生物に起因する損 傷に対して植物を保護する方法において、本発明のトランスジェニック植物を使 用できることである。 本発明の新規な毒素遺伝子の単離および精製は実施例 ev.53:242-255(1989)に従って、本発明の新規な毒性遺伝子はＣｒｙＩＥ型と分 類され、ここではＣｒｙＩＥ（ｃ）と呼ぶ。新規な毒性遺伝子（配列番号：１） のコーディング領域はヌクレオチド塩基位置１９６から位置３７２３までにわた る。新規な毒素遺伝子ＣｒｙＩＥ （ｃ）により生成するタンパク質は配列番号：２に開示したアミノ酸配列をもち そしてさらに実施例５にて述べる。 新規な毒性遺伝子ＣｒｙＩＥ（ｄ）（配列番号：７）のコーディング領域はヌ クレオチド塩基位置１ないし３５２８までに及ぶ。新規な毒素遺伝子ＣｒｙＩＥ （ｃ）により生成するタンパク質は配列番号：８に開示したアミノ酸配列をもち そしてさらに実施例５にて述べる。それらのＤＮＡ配列から推測される、Ｃｒｙ ＩＥ（ｃ）タンパク質（配列番号：２）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）タンパク質（配 列番号：８）の両方の大きさは１３０．７ｋＤａである。これは他の公知のＣｒ ｙＩＥ型タンパク質の大きさと類似している。見掛けの大きさが類似しているに も係わらず、新規な毒素遺伝子によりコード化されたタンパク質のアミノ酸配列 と従来報告されたＣｒｙＩＥ型タンパク質のアミノ酸配列との比較ではこれらの ２つの間に明らかな違いがみられる。ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ） タンパク質はＣｒｙＩＥ（ａ）タンパク質と８１％のみの類似度をもち、そして ＣｒｙＩＥ（ｂ）タンパク質と８３％のみの類似度をもつ。 新規な毒素遺伝子ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）はタンパク質レベ ルにおいては互いに９９％同一であり、表１に示した位置におけるアミノ酸残基 のみが異なる。 技術的によく知られたＣｒｙＩＥ型遺伝子の相当するコーディング領域と比較 して、本発明のＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）遺伝子のヌクレオチド 塩基配列はそれらとの間に明らかな違いを示す。本発明のＣｒｙＩＥ（ｃ）およ びＣｒｙＩＥ（ｄ）遺伝子は、公知のＣｒｙＩＥ（ａ）に示される内毒素遺伝子 と８７％のみの配列の同一性および公知のＣｒｙＩＥ（ｂ）に示される内毒素遺 伝子と８５％のみの配列の同一性をもつ。 本発明のＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）タンパク質が公知のＣｒｙ ＩＥ型タンパク質と類似する限られた配列を示すと同時に、それらは公知のＣｒ ｙＩＥ型タンパク質とは異なる殺虫剤活性を示す。以下の実施例４および表３に 示されるように、本発明の新規な毒素 遺伝子によってコード化されるタンパク質は鱗翅目昆虫であるヘリオチス・ヴィ レッセンス（Heliothis virescens）に対して活性がある。従来報告されている ＣｒｙＩＥ型タンパク質は昆虫の有害生物に対して活性があることは知られてい ない。さらに従来報告されているＣｒｙＩＥ型タンパク質は鱗翅目の昆虫である スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）に対しては活性があることが 知られているが、本発明のＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）タンパク質 がこれらの活性をもたない。 ＣｒｙＩＥ（ｄ）はさらにスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugipe rda）に対して活性をもつ。最後にＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）タ ンパク質の両方は昆虫プルテラ・キロステラ（Plutella sylostella）に対して 活性があるが、従来より公知のＣｒｙＩＥ型タンパク質はこの特別な昆虫に毒性 がない。 ヘリオチス・ヴィレッセンスに対する、本発明のＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒ ｙＩＥ（ｄ）のタンパク質の独特の殺虫剤活性は、タンパク質のアミノ酸残基３ ３２ないし６２２に及ぶ領域に配置される２つのサブシーケンスの結果である。 この領域は、昆虫特異性（「ドメインII」）および構造的な配向（「ドメインII I」）に起因する他のδ−内毒素タンパク質において確認される領域に相当する 。Liらを参照(Nature 353:815-821,1991)。この領域内のサブシーケンスは、前 記Liらにより記載され たドメインに相当する。 確認された第一のサブシーケンスである、サブシーケンスＡ〔配列番号：３； ＣｒｙＩＥ（ｃ）から〕およびサブシーケンスＡ’〔配列番号：９；ＣｒｙＩＥ （ｄ）から〕はアミノ酸３３２から４６５までの領域に及ぶ。それは、Schnepf らの研究（J.Biol.Chem.265:20923-20930,1990）に基づいてヘリオチス・ヴィレ ッセンスに対する活性をさらに決定することが提案される、なお他のＣｒｙＩ型 毒素タンパク質に類似しする低い配列をもつことを特徴とする。サブシーケンス Ａはまた、Liらにより記載されるように(Nature，353:815-821，1991)「ドメイ ンII」を決定する特異性にも相当する。 確認された第二のサブシーケンスである、サブシーケンスＢ〔（配列番号：４ ）；ＣｒｙＩＥ（ｃ）から〕およびサブシーケンスＢ’〔（配列番号：１０）； ＣｒｙＩＥ（ｄ）から〕はアミノ酸４６６から６２２までの領域に及ぶ。この領 域は、新規な毒素タンパクＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）と同様にヘ リオチス・ヴィレッセンスにおいて活性がある、バチルス・チュリンジエンシス からの他のタンパク質、ＣｒｙＩＡ（ａ）において見いだされた、相当する領域 と類似する、その高い配列により特徴付けられる。サブシーケンスＢはLiらによ り記載される(Nature，353:815-821，1991)構造的な配向「ドメインIII」に相当 する。２つのタンパク質についてのＣｒｙＩＥ（ｃ）のサブシーケンスＢおよび Ｃ ｒｙＩＡ（ａ）の相当する領域間の類似度を以下の表２に示す。 本発明の新規な毒素タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）のサブシーケンスＢ領域とＣ ｒｙＩＡ（ａ）タンパク質の相当する領域との高い類似度の百分率（８６％）は 、ヘリオチス・ヴィレッセンスに対する毒性を与える領域の保護された性質を示 す。本発明の新規な毒性タンパク質Ｃ ｒｙＩＥ（ｃ）のサブシーケンスＢが、関係するヘリオチス・ヴィレッセンスに 対して活性のないタンパク質ＣｒｙＩＥ（ａ）のための相当する領域とを比較し た場合に、その類似度の百分率は６３％のみであることが見いだされている。Ｃ ｒｙＩＥ（ｄ）がＣｒｙＩＥ（ｃ）と比較される場合、ＣｒｙＩＥ（ｄ）のアミ ノ酸残基４６６からアミノ酸残基６２２の領域は２個のアミノ酸のみが異なる。 ＣｒｙＩＥ（ｄ）は位置４８２においてプロリンおよび位置５０６においてイソ ロイシンをもち、ＣｒｙＩＥ（ｃ）に対するそれぞれスレオニンおよびメチオニ ンに相当する。これらの違いは類似性に影響せず、従ってＣｒｙＩＥ（ｄ）のサ ブシーケンスＢもＣｒｙＩＡ（ａ）タンパク質の相当する領域と８６％類似であ る。 本発明は、ＣｒｙＩＥ（ｃ）遺伝子（配列番号：１）またはＣｒｙＩＥ（ｄ） 遺伝子（配列番号：７）の変異体および組換体または遺伝子工学による誘導体を も包含することを意図する。例えば、ＣｒｙＩ−型タンパク質がタンパク質加水 分解により開裂された、実際の毒性分子である毒性コアフラグメントとなること が良く知られ 2-255(1989)〕。このため、新規な毒素タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒ ｙＩＥ（ｄ）の毒性コアフラグメントに対してコード化する切断されたＤＮＡ配 列は本発明の範囲内に入るとみなされる。さらに、技術的によく知られた方法を 使用して、ＣｒｙＩＥ（ｃ）〔配列番 号：３ないし４参照〕ないし関連するＣｒｙＩＥ（ｄ）〔配列番号：９ないし１ ０参照〕に示される、ヘリオチス・ヴィレッセンスに対する活性を与えるサブシ ーケンスの少なくとも１種を含む、組換え毒素タンパク質を構築できる。このよ うな組換えタンパク質は、その本来の特性に加えて、ヘリオチス・ヴィレッセン スに対する活性をもつ。本発明のＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）遺伝 子の変異体はまた、本発明により包含される。例えば、個々のヌクレオチドは、 自然的方法によりまたは、コード化されたタンパク質のアミノ酸配列に順次変更 を作る部位−指示突然変異誘発(Site-directed mutagenesis)のいずれかによっ て変更できる。さらに、遺伝子の完全な長さまたは切断形態のＤＮＡ配列は、Ｃ ｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）遺伝子の未変性の形態によりコード化さ れるタンパク質と同じまたは類似のアミノ酸配列をもつタンパク質を製造するよ うにコドンが選択される場合、それらの発現が植物に対して最適であるように変 化できる。本来的にＣｒｙＩＥ（ｃ）タンパク質〔配列番号：２〕またはＣｒｙ ＩＥ（ｄ）タンパク質〔配列番号：８〕のものと同様の殺虫剤特性をもつタンパ ク質を生産する新規な毒素遺伝子の他の変性は本発明により包含される。 ＣｒｙＩＥ（ｃ）遺伝子〔配列番号：１〕およびＣｒｙＩＥ（ｄ）遺伝子〔配 列番号：７〕、またはヘリオチス・ヴィレッセンスに対する特異性を与える遺伝 子のサ ブシーケンスはまた、他のバチルス・チュリンジエンシスにおいてヘリオチス・ ヴィレッセンスに対して活性のある同様にまたは近似して関係するＣｒｙＩ−型 または遺伝子を探すためのＤＮＡハイブリッド形成プローブとして有用である。 新規な遺伝子またはその部分または誘導体は、ハイブリッド形成プローブとして 使用するために、例えば慣用の方法を使用して放射線ラベルによって、ラベル化 できる。ラベル化されたＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは実施例１に記 載される方法で使用される。 バチルス・チュリンジエンシスの組換え菌株に存する新規な毒性遺伝子は実施 例３ないし４で説明する。それはまた、本発明の単離された新規な遺伝子がいず れかの微生物宿主中に転移され、それらが宿主に殺虫特性を与えることができる ことと認識されるだろう。本発明の新規な毒素遺伝子のための中間宿主(alterna te hosts)は、クローニング法のために、遺伝子またはコード化されたタンパク 質の形態および機能を特徴づける目的のために、毒素タンパク質の製造を増加す るために宿主を醗酵に使用するために、毒性タンパク質の少なくとも１種を標的 の昆虫有害生物により有効に配達する目的のために、またはそれらの有効性を改 良するため、あるいは新規な毒性遺伝子の、バキュロウイルス（核多角体病ウイ ルス）例えば、オートグラフィカ・カリホルニカ（Audtographica californica ）のような昆虫病原体中への導入のた めに、適当なものとして選択できる。 新規な毒素遺伝子またはその組換体は種々の技術的に認識されている方法を使 用してこのような中間宿主中に形質転換され得る。このような好ましい方法の一 つは例えば、Dower の方法(米国特許第5,186,800 号）によって記載される微生 物細胞のエレクトロポレーションである。他の好ましい方法は、そこに完全に含 まれるＥＰ−Ａ−０３４２６３３にもまた記載される、Schurterら〔Mol.Gen.Ge net.218:177-181(1989)〕の方法である。 上記中間宿主は昆虫の防除のために環境または植物または動物に適用すること が考えられる。微生物宿主は、関心のある１またはそれ以上の作物の"植物圏(ph ytosphere)"(植物表面(Phylloplane),葉圏(phyllosphere),根圏(rhizosphere), および／またはrizoplana(根の表面)に生ずると知られるものから選択される。 これらの微生物はとくに野性型微生物のいる環境で成功裏に競争できるように 、ポリペプチド有害生物防除剤を発現する遺伝子の安定な維持および発現を提供 できるように、および望ましくは環境的な分解および不活性化から有害生物防除 剤の改良された保護を提供できるように選択される。 このような微生物は、細菌類、藻類および糸状菌類である。特に重要な微生物 は、細菌例えば、バチルス（Bacillus）属、カウロバクター（Caulobacter）属 、アグメネルム（Agmenellum）属、シュードモナス（Pseudomo nas）属、エルウィナ（Erwinia）属、セラティア（Serratia）属、クレブシエラ （Klebsiella）属、ザントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトマイセス（Str eptomyces）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドシュードモナス（Rodopseudo monas）属、メチリウス（Methlius）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium） 属、アセトバクター（Acetobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、 アルトロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、ロ イコノストック（Leuconostoc）属、およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属； 糸状菌、特に酵母例えば、サッカロマイセス（Saccaharomyces）属、クリプトコ ッカス（Cryptococcus）属、クルイヴェロマイセス（Kluyveromyces）属、スポ ロボロマイセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotrula）属およびオー レオバシジウム（Aureobasidium）属である。重要なものは植物圏の種、例えば バチルス（Bacillus）属の種、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syri ngae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラ ティア・マルセスセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キリナム （Acetobacter xylinum）、アグロバクテリア（Agrobacteria）、ロドシュード モナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、ザントモナス・カ ムペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオチ（Rhizobium meliot i）、アルカリゲネス・エントロフス（Alcaligenes entorophus）、クラヴィバ クター・キリ(Clavibacter xyli およびアゾトバクター・ヴィンランディ（Azot obacter vinlandii）ならびに植物圏の酵母の種ロドトルラ・ルブラ（Rhodotoru la rubra）、ロドトルラ・グルチニス（R．glutinis）、ロドトルラ・マリナ（R ．marina）、ロドトルラ・アウランチアカ（R．aurantiaca）、クリプトコッサ ス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ディフルエンス （C．diffluens）、クリプトコッカス・ラウレンティー（C．laurentii）、サッ カロマイシス・ローゼイ（Saccharomyces rosei）、サッカロマイセス・プレト リエンシス（S．pretoriensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（S．cereviis iae）、スポロボロマイセス・ロスエス（Sporobolomyces rosues）、スポロボロ マイセス・オドルス（S．odorus）、クルイヴェロマイセス・ベロナ（Kluyverom yces veronae）、およびアウレオバシディウム・ポルランス（Aureobasidium） である。重要なものは色素をもつ微生物（pigmented microorganisms）である。 本発明はさらに、農業用の補助剤、例えば、担体、希釈剤、界面活性剤または 適用促進補助剤(application-promoting adjuvant)とともに、有効成分として、 本発明の新規な毒素の少なくとも１種あるいは、組換体の中に新規な毒素遺伝子 の少なくとも１種を含む組換え微生物、特に組換体の中に新規な毒素の少なくと も１種を含む組 換えバチルス・チュリンジエンシス菌株あるいは、それらの誘導体または突然変 異体を含む殺昆虫性組成物(entomocidal composition)を提供する。 組成物はまた別の生物学的に活性のある化合物を含むことができる。前記化合 物は、肥料または微量栄養素供与体(micronutrient donor)または植物成長に影 響する他の製剤であってもよい。それらはまた、選択性除草剤、殺虫剤、殺真菌 剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはそれらの製剤の数種の混合物であ り、所望ならば、製剤技術において慣用に使用される、農業において許容される 担体、界面活性剤または適用促進補助剤とさらに一緒に使用してよい。適当な担 体および補助剤は固体または液体であり製剤技術で使用される通常の物質、例え ば天然または再生無機物質、溶媒、分散剤、湿展剤、粘着付与剤、結合剤または 肥料である。 組成物は有効成分を０．１ないし９９％、固体または液体補助剤を１ないし９ ９．９％、そして界面活性剤を０ないし２５％を含むことができる。本発明の新 規な毒素の少なくとも一種、または組換体の中に新規な毒素遺伝子の少なくとも １種を含む組換え微生物、特に組換体の中に新規な毒素の少なくとも１種を含む 組換えバチルス・チュリンジエンシス菌株あるいは、それらの誘導体または突然 変異体からなる有効成分、または前記有効成分を含む組成物は、ある種の他の殺 虫剤または化学品（1993 Crop Protection Chemicals Reference，Chemic al and Pharmaceutical Press，Canada）とともに、効力を損失することなく、 保護される植物または作物に投与できる。それは大部分の他の一般に使用されて いる農業用噴霧材料と共用できるが、極端なアルカリ噴霧溶液中での使用はする べきでない。それは、粉剤、懸濁液、水和剤または農業的用途のために適当なあ らゆる他の物質形態で投与される。 本発明はさらに、本発明による毒素の少なくとも１種または組換体の中に新規 な毒素遺伝子の少なくとも１種を含む組換え微生物からなる有効成分、または前 記有効成分を含む組成物を、 （ａ）昆虫有害生物が発生するであろう環境に、（ｂ）昆虫有害生物に起因する 損傷から植物または植物の部位を保護するためのその植物または植物の部位に、 または（ｃ）昆虫有害生物に起因する損傷から種子からの発育する植物を保護す るためにその種子に、施用することによる、昆虫有害生物の防除または抑制のた めの方法を提供する。 植物保護分野の施用の好ましい方法は、施用の回数および割合が問題となる有 害生物による攻撃の危険性に依存して、植物の葉への施用（葉への施用）である 。しかし、有効成分はまた、液体製剤を植物の作地に含浸させるか、あるいは固 体の形態、例えば粒剤の形態で有効成分を植物の作地、例えば土壌に物質を混入 する場合に（土壌への施用）、植物根系を介して植物に到達するこ とも可能である（浸透作用）。パディライス（paddy rice）作物の場合、そのよ うな粒子はその水田に浸水するように計量して施用できる。 本発明による組成物はまた昆虫性有害生物に対する植物繁殖材料例えば果実、 塊茎もしくは穀粒等の種子またはさし木の保護にも適当である。繁殖材料は植え る前に製剤で処理でき、例えば種子では播種の前に粉衣できる。本発明の有効成 分は、また穀粒を液体製剤に含浸させるか、または固体製剤を塗布することによ り、種子穀粒に施用できる（コーティング）。繁殖材料が生長した場合に、製剤 は生育する地に施用でき例えば播種の期間に種子の畦溝に施用できる。さらに本 発明は植物繁殖材料を処理する方法およびこのように処理された植物繁殖材料に 関する。 有効成分として、組換体の中に新規な毒素遺伝子の少なくとも１種を含む組換 え微生物、特に組換体の中に新規な毒素の少なくとも１種を含む組換えバチルス ・チュリンジエンシス菌株あるいは、それらの誘導体または突然変異体を含む本 発明による組成物は、細菌株による種子または土壌の処理のためのいずれかの公 知の方法により施用できる。例えば、米国特許第4,863,866 号参照。この菌株は 、微生物が生存していない場合においても生物防除に有効である。しかし好まし いのは生存している微生物の施用である。 標的作物として適当なものは次のものである：特に、 穀類（小麦、大麦、ライ麦、オート麦、米、トウモロコシ、ソルガムおよび関連 作物）；ビート（砂糖および飼料用ビート）；飼料用牧草（カモガヤ、ウシノゲ グサ類等）；核果、梨状果、および軟果実（リンゴ、梨、プラム、桃、アーモン ド、サクランボ、またはイチゴ、ラズベリーおよびブラックベリーのようなベリ ー類）；マメ科植物（ソラ豆、レンズ豆、エンドウ豆または大豆）；油用植物（ アブラナ、マスタード、ポピー、オリーブ、サンフラワー、ココナッツ、ヒマシ 油植物、ココア豆または落花生）；ウリ科植物（カボチャ、キュウリまたはメロ ン）；繊維植物（綿、亜麻、大麻または黄麻）；橙属植物（オレンジ、レモン、 グレープフルーツまたはマンダリン）；野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラ ガス、キャベツ、他のアブラナ科のもの、玉葱、トマト、馬鈴薯またはピーマン ）；クスノキ科（アボガド、シナモンまたは樟脳）；落葉樹および針葉樹（例え ばリンデン、イチイ、カシ、ハンノキ、ポプラ、カバノキ、モミ、カラマツ、マ ツ）および、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウの木、ホップ 、バショウおよび天然ゴム植物、ならびに観賞植物（キク科植物を含む）。 新規な遺伝子の少なくとも１つを組換え体に含む組換えバチルス・チュリンジ エンシス菌株は通常殺昆虫組成物の形態で施用されおよび同時にまたは引き続い て他の生物学的活性化合物とともに作物区域または処理される植物に施用できる 。これらの化合物は肥料または微量栄 養素供与体(micronutrient donor)または植物成長に影響する他の製剤であって もよい。それらはまた、選択性除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、 軟体動物駆除剤またはそれらの製剤の数種の混合物であり、所望ならば、製剤技 術において慣用に使用される、農業において許容される担体、界面活性剤または 適用促進補助剤とさらに一緒に使用してよい。 本発明の有効成分はそのままでまたは他の適当な農業的に許容される担体とも に使用できる。このような担体は農薬製剤の分野で慣用に使用される補助剤であ り、従って公知の方法で、乳剤原液、塗布可能ペースト、直接噴霧可能な、また は希釈可能な溶液、希釈乳剤、水和剤、水溶剤、散剤、粉剤、粒剤または例えば 、ポリマー物質によるカプセル化剤に製剤化できる。 組成物の性質と同様に施用の方法、例えば噴霧、霧化、散粉、はけ塗り、種子粉 衣、散水および注水が目的とする対象および使用環境に応じて選ばれる、施用の 有利な施用割合は１ヘクタール（”ｈａ”，約２．４７１エーカー）当たり有効 成分（a.i.ｉ．）約５０ｇないし約５ｋｇであり、好ましくは約１００ｇないし 約２ｋｇa.i./ha である。重要な施用割合は約２００ｇないし１ｋｇ a.i./ha および２００ｇないし５００ｇa.i./ha である。 種子粉衣(seed dressing)のために有利な施用割合は種子１００ｋｇ当たり０ ．５ｇないし１０００ｇ a.i.、 a.i.または種子１００ｋｇ当たり１０ｇないし５０ｇ a.i.である。 適当な担体および補助剤は固体または液体であってよく、一般に製剤技術で使 用される物質に相当し、例えば天然または再生、無機物質、溶媒、分散剤、湿展 剤、粘着付与剤、結合剤、または肥料である。 製剤、即ち有効成分として組換え体として新規な遺伝子を含んでいる組換えバ チルス・チュリンジエンシス菌株または他の有効成分との組合せおよび、適当な らば、固体又は液体の補助剤を含む、殺昆虫組成物、調合物または混合物は、公 知の方法により、例えば有効成分を溶媒、固体担体および適当な場合には表面活 性化合物（界面活性剤）のような増量剤と十分に混合および／又は摩砕すること により、製造される。 適当な溶媒は次のものである。：芳香族炭化水素、好ましくは炭素原子数８な いし１２の部分、例えばキシレン混合物または置換ナフタレン、ジブチルフタレ ートまたはジオクチルフタレートのようなフタル酸エステル；パラフィンまたは シクロヘキサンのような脂肪族炭化水素；エタノール、エチレングリコール、エ チレングリコールモノメチルエーテルまたはエチレングリコールモノエチルエー テルのようなアルコールおよびグリコール並びにそれらのエーテルおよびエステ ル；シクロヘキサノンのようなケトン；Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチル スルホキシドまたはジメチルホルムアミドのような 強極性溶媒；ならびにエポキシ化または非エポキシ化植物油例えばエポキシ化コ コナッツ油または大豆油；または水。 例えば粉剤および分散性粉末に使用する固体担体は通常、方解石、タルク、カ オリン、モンモリロナイトまたはアタパルジャイトのような無機充填剤である。 物性を改良するため、高分散ケイ酸または高分散吸収性ポリマーを添加すること もできる。適当な粒剤、粒状化吸着性担体は多孔性型のもので、例えば、軽石、 破壊レンガ、セピオライトまたはベントナイトであり、ならびに適当な非吸収性 担体は例えば方解石または砂である。さらに広範囲の前もって粒状化した無機質 または有機質の物質、特にドロマイトまたは粉末化植物残骸が使用されうる。 製剤化された式Ｉで表わされる有効成分の性質により、適する界面活性化合物 は、良好な乳化、分散および湿展性を有する非イオン性、陽イオン性および／又 は陰イオン性界面活性剤である。界面活性剤の用語はまた界面活性剤の混合物も 意味するものと理解すべきである。 適当なアニオン性界面活性剤はいわゆる水溶性石ケンおよび水溶性合成界面活 性成分はの両方である。 適当な石ケンは高級脂肪酸（Ｃ₁₀〜Ｃ₂₂）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金 属塩、または未置換または置換のアンモニウム塩、例えばオレイン酸またはステ アリン酸、あるいは例えばココナッツ油または獣脂から得られる天然脂肪酸混合 物のナトリウムまたはカリウム塩であ る。脂肪酸メチルタウリン塩もさらにまた適する。 しかし、いわゆる合成界面活性剤は、さらに頻繁には、特に脂肪アルコールス ルホネート、脂肪アルコールスルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導 体またはアルキルアリールスルホネートが使用される。 脂肪アルコールスルホネートまたは脂肪アルコールスルフェートは一般に、ア ルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、または未置換または置換のアンモニウム塩 の形態であり、アシル基のアルキル部分をも含む炭素原子数８ないし２２のアル キル基を含み、例えば、リグノスルホン酸、ドデシルサルフェートまたは天然脂 肪酸から得られる脂肪アルコールサルフェートの混合物のナトリウムまたはカル シウム塩である。これらの化合物はまた、硫酸エステルの塩、および脂肪酸アル コール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸の塩も含まれる。スルホン化ベン ズイミダゾール誘導体は、好ましくは二つのスルホン酸基と８ないし２２の炭素 原子を含む一つの脂肪酸基とを含む。アルキルアリールスルホネートの例は、ド デシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸またはナフタレンス ルホン酸およびホルムアルデヒド縮合物のナトリウム、カルシウムまたはトリエ タノールアミン塩である。 対応するホスフェート、例えば、エチレンオキシド４ないし１４モルを持つｐ −ノニルフェノールの付加物のリン酸エステルの塩があげられ、またはリン脂質 もまた さらに適当である。 非イオン性界面活性剤は好ましくは主に、脂肪族または脂環式アルコール、ま たは飽和または不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテ ル誘導体であり、該誘導体は３ないし３０個のグリコールエーテル基、および（ 脂肪族）炭化水素基に８ないし２０個の炭素原子、そしてアルキルフェノールの アルキル部分に６ないし１８個の炭素原子を含み得る。 他の非イオン性界面活性剤はポリプロピレングリコール、エチレンジアミノポ リプロピレングリコールおよびアルキル鎖中に１ないし１０個の炭素原子を含む アルキルポリプロピレングリコールとのポリエチレンオキシド水溶性付加物であ り、その付加物は２０ないし２５０個のエチレングリコールエーテル基、および １０ないし１００個のプロピレングリコールエーテル基を含む。上記の化合物は 通常、プロピレングリコール単位当たり１ないし５のエチレングリコール単位を 含む。 非イオン性界面活性剤の代表的例は、ノニルフェノール−ポリエトキシエタノ ール、ヒマシ油ポリグリコール・エーテル、ポリプロピレン／ポリエチレン・オ キシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレン・ グリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。 ポリオキシエチレンソルビタントリオレートのようなポリオキシエチレンソル ビタンの脂肪酸エステルもさら に適当な非イオン性界面活性剤である。 カチオン性界面活性剤は、特にＮ−置換基として少なくとも一つの炭素原子数 ８ないし２２のアルキル基と、他の置換基として未置換のまたは低級ハロゲン化 アルキル基、ベンジル基または低級ヒドロキシアルキル基とを含む第四アンモニ ウム塩である。塩はハライド、メチルスルフェートまたはエチルスルフェート、 例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリドまたはベンジルジ（２−ク ロロエチル）エチルアンモニウムブロマイドの形態が好ましい。 製剤業界で慣用的に使用されている界面活性剤は特に、以下の刊行物に記載さ れている。 − ”マクカッチャンズ デタージェンツ アンド エマルジファイアーズ ア ニュアル（McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual），マック出版社 、リッジウッド、ニュージャージー州、１９７９年； − ヘルムト スタック(Dr．Helmut Stache)著、”テンシ ド−タッシェンブ ーフ（Tensid-Taschenbuch）〔Surfactants Guide〕”、カルラーハンザー出版 社、ミュンヘン／ウイーン（Carl Hauser-Verlag，Munich/Vienna）。 本発明の殺昆虫性組成物の他の特に好ましい特徴は、植物および土壌に施用さ れる場合に有効成分の持続性である。活性の損失に対する起こりうる原因は、紫 外線、熱、葉の浸出作用（leaf exudate）およびｐＨによる不活性化を含む。例 えば、高いｐＨにおいて特に、還元剤の存在下で、δ−内毒素結晶は可溶となり そのためタンパク質加水分解による失活をより受けやすくなる。特に葉面がｐＨ ８−１０の範囲にあり得る場合、高い、葉のｐＨもまた重要となるであろう。本 発明の殺昆虫組成物の製剤化は、有効成分の損失の防止を助ける添加剤を含むこ とまたは有効成分を失活から保護するような方法で材料を封入することのいずれ かにより、これらの問題を扱うことができる。封入は化学的に(McGuire and Sha sha,J Econ Entomol 85:1425-1433,1992)または生物学的に(Barnes and Cumming s,1986:EP-A-0192319)達成できる。 化学的封入は有効成分をポリマーによって被覆することを含むが、生物学的封 入はδ−内毒素遺伝子を微生物中で発現させることを含む。生物学的封入のため 、δ−内毒素タンパク質を含む完全な微生物が有効成分として製剤に使用される 。紫外線保護剤の添加は照射による損傷を有効に減少させるであろう。熱による 失活はまた適当な添加剤を含ませることにより調整できる。 本発明の適用の範囲で好ましいものは、利用可能であれば、有効成分として、 栄養細胞の形態でまたはより好ましくは胞子の形態のいずれかで生存する微生物 を含む製剤で ある。適当な製剤は、例えば、多価カチオンで架橋されそしてそれら微生物を含 むポリマーゲルよりなっていてよい。これらは、例えば、ポリマー材料としてア ルギン酸に関して、D.R.Fravel et al．in Phytopathology,Vol.75,No.7，774-7 77,1985によって記載される。この文献からは、担体材料がともに使用できるこ ともわかる。これらの製剤は一般に天然起源のまたは合成ゲル形態のポリマー、 例えばアルギン酸、の溶液と、個々に小滴形態のような多価金属イオンの塩水溶 液とを混合することにより製造され、微生物を上記２つのうち１つまたは両方の 反応溶液中に懸濁することも可能である。ゲル形成は小滴形態中で混合すること により開始する。次いでこれらのゲル粒子の乾燥が可能である。この方法はイオ ノトロピックゲル化（ionotropic gelling）と呼ばれる。乾燥の程度により、多 価カチオンにより構造的に架橋されおよび、上記微生物およびより優れた均質な 分配がされて存在する担体を含むポリマーの圧縮および硬質粒子が形成される。 粒子の大きさは５ｍｍまでが可能である。 微生物に加えて、例えば担体材料としての細かく分割したケイ酸を含むことも でき、Ｃａ⁺⁺によって架橋が行われる、部分的に架橋された多糖に基づく組成物 は、EP-A1-0097 571に記載される。この組成物は０．３以下の水分活性(water a ctivity)をもつ。W.J.Cornnik らは概説論文〔New Directions in Biological C ontrol: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases,pag es 3 45-372,Alan R.Inc.(1990)〕において、多様な製剤系、担体としてバーミキュラ イトをもつ粒子および上述したイオノトロピックゲル化法により製造された圧縮 アルギニン酸ビーズを記載する。このような組成物はD.R.FravelによってPestic ide Formulations and Application Systems:11th Volume，ASTM STP 1112 Amer ican Society for Testing and Materials,Philadelpha,1992,page 173-179にお いての記載され、および本発明による組換え微生物の製剤化に使用できる。 本発明の殺昆虫性組成物は通常、有効成分約０．１ないし約９９％、好ましく は約０．１ないし約９５％および最も好ましくは約３ないし約９０％；固体また は液体補助剤約１ないし約９９．９％、好ましくは約１ないし約９９％および最 も好ましくは約５ないし９５％；界面活性剤約０ないし約２５％、好ましくは約 ０．１ないし約２５％および最も好ましくは約０．１ないし約２０％を含む。 本発明の好ましい具体例では、殺昆虫性組成物が通常、組換え体中に新規な遺 伝子の少なくとも１種を含む組換えバチルス・チュリンジエンシス菌株、または 他の有効成分とその組合せ０．１ないし９９％、好ましくは０．１ないし９５％ ；固体または液体補助剤１ないし９９％および界面活性剤０ないし２５％、好ま しくは０．１ないし２０％を含む。 市販される製品は好ましくは原液として製剤化されるが、最終使用者は通常、 実質的により低い濃度の希釈製剤を 使用するであろう。殺昆虫性組成物はまた、他の成分、例えば安定剤、消泡剤、 粘度調節剤、結合剤、粘着付与剤ならびに肥料または特定の効果を得るための他 の有効成分をも含んでいてよい。 本発明の他の目的は本発明による新規な毒性遺伝子の少なくとも１種を含むト ランスジェニック植物に関する。本発明の新規な毒性遺伝子を発現する宿主植物 は昆虫の攻撃に対する耐性を向上し、およびこのような攻撃に関する作物の損傷 に良好な耐性をより良く与える。 植物は、技術的によく知られた方法により遺伝学的に形質転換できるいずれか の植物種を意味する。植物の形質変換の為に技術的によく知られた方法は以下で 討論される。宿主植物は、標的作物として前記に列挙した種を含むがそれに限定 しない。 天然のバチルス・チュリンジエンシス毒性遺伝子のコドンの取扱い(codon usa ge)は、植物遺伝子に典型的にあるそれとは著しく異なる。特に、天然のバチル ス・チュリンジエンシスのコドンの取扱いはトウモロコシ遺伝子のもとと非常に 異なる。結果として、この遺伝子からのｍＲＮＡは有効に利用することができな い。コドンの取扱いは翻訳または転写またはｍＲＮＡ製造のレベルにおける遺伝 子の発現に影響するかもしれない。植物、例えばトウモロコシにおける発現のた めの毒性遺伝子を最適にするため、天然の毒素遺伝子配列について見出されたと 同じタンパク質を配列する合成遺伝子の合成においては、コドンの取扱はト ウモロコシ中で最も好ましいコドン〔トウモロコシ好適コドン(maize preferred codon)〕を使用することによって最適にする。最適化されたトウモロコシ好適 コドンの取扱いはバチルス・チュリンジエンシスタンパク質の高レベルの発現に 対して有効である。トウモロコシ最適化合成毒素遺伝子(maize-optimized synth etic toxin genes)を構築するためのより詳細はWO93/07278に見出すことができ 、参考文献によってそのままここに組み込むことができる。 微生物から誘導される毒素遺伝子はまた植物遺伝子とも異なっていてよい。植 物遺伝子は、微生物に見出される遺伝子とそれらが開始メチオニンに隣接したリ ボゾーム結合部位の配列で定義される転写されるＲＮＡをもたないという点で異 なる。 結果として、微生物遺伝子はＡＴＧにおける真核生物の共通翻訳イニシエーター （eukaryotic consensus translation initiator）の細胞含有物(inclusion)に より拡張することができる。Clontech(1993/1994 catalog，page 210)は植物中 の大腸菌（E.coli）uidA 遺伝子の発現のための共通翻訳イニシエーターとして 、配列：ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣ（配列番号：５）を提案した。さらに，Jo shi(Nucl Acid Res 15:6643-6653(1987))はＡＴＧに隣接する多くの植物の配列 を比較しそしてコンセンサス(consences)：ＴＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴ（配列番号 ：６）を提案している。植物中の微生物ＯＲＦｓの発現において困難に遭遇する 状況では、開始ＡＴＧにおけるこれらの配列の１つの 包含は翻訳を改良できる。これらの場合にはこのコンセンサスの最後の３つのヌ クレオチドは第二番目のＡＡ残基のそれらの改変のため、改変された配列への包 含に適さない。開始メチオニンに隣接する好ましい配列は異なる植物種の間で異 なるだろう。GenBank/EMBLデータベースに存在するトウモロコシ遺伝子の配列を 調査することにより、そのＡＴＧに隣接するヌクレオチドがトウモロコシに導入 される毒素遺伝子の翻訳を向上させるため改良されることを識別することができ る。 さらに、非正統的スプライス部位（illegitimate splice site）の除去が導入 される遺伝子の発現および安定性を向上させる。非植物源からのクローン化され 植物の発現に最適化されていない遺伝子は５’または３’スプライス部位として 植物中で認識できるモチーフを含むことができる。結果として転写工程は早期に 終結して、切断されたまたは削除されたｍＲＮＡを生じる。毒素遺伝子は技術的 によく知られた技術手法を使用してこれらの非正統的スプライス位置を除去する 処理が可能である。多くのバチルス・チュリンジエンシスからのδ−内毒素タン パク質は実際にプロトキシンを発現できることが知られている。これらのプロト キシンは昆虫の腸のアルカリ環境下で溶解しそしてプロテアーゼによってタンパ ク質加水分解的に毒性のコアフラグメントに変換される（Hofte and Whiteley， Microbiol.Rev.53:242-255(1989)）。ＣｒｙＩ類のδ−内毒素タンパク質に対し 、毒性のコアフラグメントはプロトキシンの 半ばのＮ末端に位置する。完全な長さのプロトキシン形態または新規な毒素タン パク質の切断された毒性のコアフラグメントの何れかからコード化された遺伝子 は植物において、宿主植物上に殺虫特性を与える形質転換ベクターに使用でき、 これは本発明の範囲の中にある。 組換えＤＮＡ分子は多くの技術的に認識された方法で植物細胞に導入すること ができる。当業者は方法の選択が、形質転換に対して標的となる植物のタイプ例 えば、単子葉または双子葉であるか、に依存するであろうことを認識するであろ う。植物細胞を形質転換する適当な方法は微量注入法（Crossway et al.BioTech niques 4:320-334(1986)）、エレクトロポレーション(Riggs et al.,Proc．Natl ．Acad．Sci USA 83 :5602-5606(1986))、アグロバクテリウム−媒介形質転換(H inchee et al.,Biotechnology 6:915-921(1988))、遺伝子直接導入(Paszkowski et al.,EMBO J.3:2717-2722(1984))およびアグラセタス社(Agracetus,Inc.,Madi son,Wisconsin and Dupont,Inc,Wilmington,Delaware)から入手できる装置を使 用する弾丸粒子促進(ballistic particle accelerataion)（Sanford et al.，米 国特許第4,945,050 号参照；およびMcCabe et al.,Biotechnology6 ,923-926(19 88)参照）。さらにヴェイシンガーら(Weissinger et al.,Annual Rev．Genet． 22 :421-477(1988));サンフォードら（Sanford et al.,Particulate Science an d Technology 5:27-37(1987)）(タマネギ);クリストウら(Christou et al.，Pla nt Physol．87:671-674(1988))（ 大豆）；マクケイブら(McCabe et al.，Bio/Technology 6 :923-926(1988)(大豆 )；Datta et al.,Bio/Technology 8 :736-740(1990)(イネ)；クラインら(Klei n et al.,Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:4305-4309(1988))(トウモロコシ)； クラインら(Klein et al．,Bio/Technology 6 :559-563(1988)(トウモロコシ) ；クラインら(Klein et al.Plant Physiol． 91:440-444(1988))(トウモロコシ) ;フロムら(Fromm et al.，Bio/Technology 8 :833-839(1990));およびゴールド ン−カームら(Gordon-Kamm et al.，Plant Cell 2:603-618(1990))(トウモロコ シ);スヴァブら(Svab et al.,Proc．Natl.Acad．Sci.USA 87:8526-8530(1990))( タバコクロロプラスト);コズィエルら(Koziel et al.,(Biotechnology 11:194-2 00(1993))(トウモロコシ);シマモトら(Shimamoto et al.,Nature 338:274-277(1 989))(イネ);クリストウら Chrisou et al.,Biotechnology 9:957-962(1992)(イ ネ);ＥＰ 0 332 581（カモガヤおよび他のPooideae）;ヴァジルら（Vasil et al .）,(Biothechnology 11:1553-1558(1993)（小麦）；ウイークら(Weeks et al) ,(Plant Physiol.102: 1077-1084(小麦);ワら(Wan et al.),(Plant Physol 104: 37-48(1994)(大麦);ウムベックら(Umbeck et al.),(Bio/Technology 5:263-266( 1987)(綿) マイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment) による、トウモロコシへの組換えＤＮＡ分子の導入のために具体例の特に好まし いセットはＷ Ｏ 93／07278 に見いだされ、参照によりそのまま本明細書に編入される。別の 好ましい具体例は欧州特許出願ＥＰ0 292 435 に記載されるトウモロコシのため のプロトプラスト形質転換であり、参照によりそのまま本明細書に編入される。 さらに本発明の範囲に含まれるものは前記方法によって形質転換されたトラン スジェニック植物体特に稔性の植物体、ならびに本発明によるヘリオチス種に対 して活性があるがスポドプテラ・エクシグアに対しては活性を示さない、Ｃｒｙ ＩＥ型の毒素タンパク質をコード化する単離されたＤＮＡ分子をなお含む無性お よび／または有性の後代である。 本発明のトラスジェニック植物体は双子葉植物および単子葉植物であってよい 。好ましいものはロリウム（Lolium）、ゼア（Zea）、トリチカム（Trticum）、 ソルガム（Sorghum）、サッカラム（Saccharum）、ブロムス（Bromus）、オリザ （Oryzae）、アヴェナ（Avena）、ホルデウム（Hordeum）、セケール（Secale） およびステラリア（Seatria）植物を包含するイネ科の単子葉植物である。 特に好ましいのはトウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム、ライ麦、オーツ麦、 芝（turf grasses）およびイネである。 双子葉植物の中では大豆、綿、タバコ、シュガービート、ナタネおよびヒマワ リがここでは、特に好ましい。 表現「後代」は「無性的に」および「有性的に」発生し たトランスジェニック植物体の後代の両方を包含すると理解すべきである。この 定義は公知の方法、例えば細胞融合または突然変異体選択によって得られそして 形質転換植物材料の交雑および融合生成物のすべてとともに、最初の形質転換植 物の特性を未だ示す、全ての突然変異体および変異体を含むことを意味する。 本発明の他の目的はトランスジェニック植物体の増殖に関する。 トランスジェニック植物体の増殖は本発明に関連してin vivo またはin vitro で有性的にまたは無性的に繁殖できるいずれかの植物材料として定義される。 特に好ましい本発明の範囲にはいるものは、トランスジェニック植物体から得 られるいずれかの繁殖材料とともに、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器 官、種子、胚、花粉、卵細胞、接合体である。 トランスジェニック植物または本発明の方法により予め形質転換されたそれら の後代から生じおよびそのためトランスジェニック細胞の部分の少なくとも１種 からなる植物体の部分、例えば花、茎、果実、葉、根もまた本発明の目的である 。 植物体の形質転換は単一ＤＮＡ種または多重ＤＮＡ種（即ち共形質転換）で行 われ、そしてこれらの技術の両方は本発明の新規な毒素遺伝子とともに使用する のに適当である。 遺伝子直接導入の形態またはアグロバクテリウム−媒介 導入トランスファーのいずれかを、通常使用する方法は、必ずしもではないが、 抗生物質（カナマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキセート）または除草 剤（ホスフィノトリシン）に対する耐性を提供する選択的マーカーとともに行わ れる。植物形質転換のための選択的マーカーの選択はしかし、本発明においては 重要ではない。 植物形質転換に対し多くの形質転換ベクターが利用でき、そして本発明の遺伝 子はこの様なベクターのいずれかとともに使用できる。使用のためのベクターの 選択は好ましい形質転換技術および形質転換のための標的種に依存するであろう 。ある標的種に対しては種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。 形質転換のルーチン的に使用するマーカーの選択はカナマイシンおよび関係する 抗生物質の耐性を与えるnptII 遺伝子（Messing & Vierra,Gene 19:259-268(198 2);Bevan et al.,Nature 304:184-187(1983)）、除草剤ホスフィノトリシンに対 して耐性を与えるbar 遺伝子(White et al.,Nucl Acid Res 18:1062(1990),Spen cer et al.,Theor Appl Genet 79:625-631(1990))、抗生物質ハイグロマイシン に対して耐性を与えるhph 遺伝子(Blochinger & Diggelmann,Mol Cell Biol 4:2 929-2931)およびメトトレキセートに対して耐性を与えるdhfr遺伝子(Bourouis e tal.,EMBO J．2(7):1099-1104)を含む。 多くのベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tum efaciens)を使用する形質転換に利用できる。これらは代表的には少なくとも１ つのＴ−ＤＮ Ａ境界配列をもち、ｐＢＩＮ１９のようなベクターを含む(Bevan,Nucl.Acid Res .(1984))。ある本発明の好ましい具体例では本発明の新規な毒素遺伝子はアグロ バクテリウムとともに使用するためのバイナリーベクターｐＣＩＢ２００および ｐＣＩＢ２００１のいずれかに挿入できる。これらのアグロバクテリウム−媒介 形質転換のためのベクターカセットは以下の手法で構築できる。テトラサイクリ ン−耐性遺伝子の切除を可能にする、ｐＴＪＳ７５（Schmidhauser & Helinski ，J.Bacteriol．164 :446-455(1985)）のNarl消化、続いてＮＰＩII（Messing & Vierra,Gene 19:259-268(1982); Bevan,Nature 304:184-187(1983);McBride et al.,Plant Molecular biology 14 :266-276(1990)）をもつｐＵＣ４ＫからのA cclフラグメントの挿入によりｐＴＪＳ７５ｋａｎを作る。XhoIリンカーを；左 および右のＴ−ＤＮＡ境界配列（left and right T-DNA borders）、nos/nPtII キメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカー(Rothsein et al.,Gene 53:153-161(198 7))を含む、ｐＣＩＢ７のEcoRV フラグメントと連結し、そして XhoI −消化し たフラグメントをSaII−消化したｐＴＫＳ７５ｋａｎ中でクローニングしてｐＣ ＩＢ２００を創成する（ＥＰ 0 332 104参照）。ｐＣＩＢ２００は以下のユニー クなポリリンカー制限部位を含む：EcoRI、SstI、KpnI、BgIII、XbaIおよびSaII 。ｐＣＩＢ２００１は追加の制限部位のポリリンカー中への挿入によって創成さ れるｐＣＩＢ２０ ０の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーにおけるユニークの制限部 位はEcoRI、SstI、KpnI、BgIII XbaI、SaII、MluI、BcII、AvrII、ApaI、HpaI およびStuIである。これらのユニークの制限部位を含むことに加えて、ｐＣＩＢ ２００１はまた、植物およびバクテリアのカナマイシン選択物、アグロバクテリ ウム−媒介形質転換のための左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列、大腸菌（E.coli ）と他の宿主間の動体化のためのＲＫ−２誘導trfAファンクションおよびさらに ＲＫ２から誘導されたOriTおよびOriVファンクションを有する。このｐＣＩＢ２ ００１ポリリンカーは自身の調節信号を含む植物発現カセットのクローニングに 適当である。 アグロバクテリウム−媒介形質転換に対して有益なさらなるベクターは；植物 体の選択のためのカナマイシン耐性をコード化する遺伝子、Ｔ−ＤＮＡ右および 左境界配列配列をもち、そして大腸菌(E.coli)及びアグロバクテリウムの両方に おいて複製できる広い宿主範囲のプラスミドｐＲＫ２５２からの配列を取込む、 バイナリーベクターｐＣＩＢ１０である。これの構築はロスシュタインら（Roth stein et al.）によって記載されている(Gene 53 :163-161(1987))。ｐＣＩＢ１ ０の種々の誘導体が構築されており、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ ーゼに対する遺伝子を取り込むものはグリッツら（Gritz et al.）によって記載 されている（Gene 25:179-188(1983)）。これらの誘導体は、ハイグロマイシン のみ（ｐＣＩＢ７４３）、また はハイグロマイシンおよびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）に おいて、トランスジェニック植物細胞の選択が可能である。 アグロバクテリウムに依存しない他の形質転換技術、いわゆる遺伝子直接導入 法はまた本発明の新規な毒性遺伝子の導入に有益であり、マイクロプロジェクテ ィルボンバードメント(microprojectile bombardment)およびプロトプラストの 取込み(protoplast uptake)および微量注入法を含む。これらの方法のためのベ クターの選択は形質転換される種の好ましい選択に多大に依存する。除草剤バス タ(Basta)(またはホスフィノトリシン)による選択と一緒の遺伝子直接導入技術 に有益なこのようなベクターの一つはｐＣＩＢ３０６４である。このベクターは 、プラスミドｐＣＩＢ２４６をベースとし、E.coliＧＵＳ遺伝子への操作可能な 融合におけるＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネー ターを含み、そして国際公開公報ＷＯ93/07278に記載され、参照により本明細書 に編入される。ホスフィノトリシンへの耐性を供給する遺伝子はストレプトマイ セス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）からのbar 遺伝子で ある（Thompson et al．EMBO J.6:2519-2523(1987)）。このベクターはそれらの 調節信号を含んでいる植物発現カセットのクローニングに適当である。 追加の形質転換ベクターはメトトレキセートへの耐性を与える選択可能なマー カーとしての大腸菌（E.coli）遺伝 子ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を利用できるｐＳＯＧ３５である。Ｐ ＣＲは３５Ｓプロモーター（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子（〜 ５５０ｂｐ）からのイントロン６［Lou et al.,Plant J 3:393-403,1993;Dennis et al,Nucl Acids Res 12:3983-4000］および１８ｂｐのＧＵＳ非翻訳リーダー 配列［Jefferson et al.，Proc Natl Acad Sci USA 83:8847-8451(1986)も参照 ］を増幅するのに使用された。大腸菌（E.coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼII型 遺伝子をコード化する２５０ｂｐフラグメントはまたＰＣＲによって増幅され、 そしてこれら２つのＰＣＲフラグメントはｐＵＣ１９ベクターのバックボーンお よびノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢＩ２２１（Clontech）からの SacI-Pstl フラグメントと会合した。これらのフラグメントの会合は、イントロ ン６配列との融合における３５Ｓプロモーター、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝 子およびノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＳＯＧ１９を生じる。ｐＳ ＯＧ１９においてＧＵＳリーダーをトウモロコシ緑斑病ウイルス（Maize Chloro tic Mottle Virus check（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列への置き換えによりベ クターｐＳＯＧ３５が生じる。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５はアンピシリン 耐性に対するｐＵＣをもたらし、および外来の配列のクローンニングに利用でき るHindIII、SphI、PstI、EcRI部位をもつ。 上記に記載した、未処理の配列としてまたは最適にされた合成配列としての本 発明の新規な毒素遺伝子は、組換え ＤＮＡ分子、例えばキメラ遺伝子を製造するための、構成的、誘導的、一時的調 節の、発生的調節の、化学的調節の組織に好適のおよび組織に特異的なプロモー ターを含む、植物体における発現のための多様なプロモーターに操作可能に融合 できる。好ましい構成的プロモーターはＣａＭＶ３５Ｓおよび１９Ｓプロモータ ーを含む〔1994年10月4 日に発行されたFraley et al.,米国特許第5,352,605 号 ］。加えて好ましいプロモーターは、多くの細胞型で発現することが知られるア クチン遺伝子の幾つかのいずれか１つから誘導されるものである。マクエロイら （McElroy et al.）(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))により記載されたプロ モーター発現カセットは新規な毒素遺伝子の発現を容易に改変しそして特に単子 葉植物宿主における使用に適当である。 さらに他の好ましい構成的プロモーターは、多くの細胞型において蓄積するこ とが知られている他の遺伝子生成物であるユビキチンから誘導される。ユビキチ ンプロポーターはトランスジェニック植物体で使用するために数種からクローン 化されている（例えば、ヒマワリ−Binet et al Plant Science 79 ,87-94(1991 )、トウモロコシ−Christensen et al．Plant Molec.Biol.12:619-632(1989)） 。トウモロコシユビキチンプロモーターはトランスジェニック単子葉系で開発さ れおよび、単子葉植物形質転換のために構築されるその配列およびベクターはＥ Ｐ0 342 926 公開公報に開示されている。ユビキチンプロモーターはトラン スジェニック植物体、特に単子葉植物体における新規な毒素遺伝子の発現に適当 である。 植物体における新規な毒素遺伝子の発現のために適当な組織−特異的または組 織−好適性（tissue-specific ortissue-preferiential）プロモーターは、根、 髄、葉または花粉において発現を指示するものである。このようなプロモーター はＷＯ93/07278に記載され、参照によりそのまま本明細書に編入される。植物体 における新規な毒素遺伝子の発現のために適当な化学的に誘導可能なプロモータ ーはＥＰ−Ａ−0 332 104 に記載され、参照によりそのまま本明細書に編入され る。 プロモーターに加えて、多様な転写ターミネーターもまた本発明の新規な毒素 遺伝子を使用するキメラ遺伝子の構築おける使用に利用できる。 転写ターミネーターはトランス遺伝子をこえる転写の終結およびその正しいポ リアデニル化をになう。適当な転写ターミネーターおよび植物体における機能が 知られたものはＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、tmI ターミネーター、ノパリン シンターゼターミネーター、エンドウrbcSＥ９ターミネーターおよび技術的に知 られるたのものである。これらは、単子葉植物および双子葉植物の両方に使用で きる。 多数の配列はまた転写単位範囲内からの遺伝子の発現を向上することが見いだ され、およびこれらの配列が本発明の新規な毒素遺伝子に関して使用して、トラ ンスジェニッ ク植物体におけるそれらの発現を向上できる。 種々のイントロン配列は、特に単子葉植物の細胞における発現を向上させるこ とが示されている。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンはトウモロコ シ細胞へ導入された場合野性型遺伝子の、その同族プロモーターの下での発現を 著しく向上することが見いだされている(Callis et al.,Genes Develop 1:1183- 1200(1987)）。イントロン配列はルーチン的に植物形質転換ベクターに代表的に は非翻訳リーダー内に取り込まれる。 ウイルスから誘導された多くの非翻訳リーダー配列はまた発現を向上すること が知られており、これらは特に双子葉植物細胞に有効である。特別にはタバコモ ザイクウィルス（ＴＭＶ，Ω−配列）、トウモロコシ緑斑病ウィルス（ＭＣＭＶ ）およびアルファルファモザイクウィルス（ＡＭＶ）からのリーダー配列は発現 を向上させるのに有効であることが示されている（例えばGalle et al.Nucl．Ac ids Res. 15:8693-8711(1987);Skuzeski et．al．Plant Molec．Biol．15:65-79 (1990)）。図面の簡単な説明 第１図 それぞれ組換えバチルス・チュリンジエンシス菌株ＣＧＢ３１１および ＣＧＢ３１３において別々に発現されたＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ ）タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 レーン１，分子量マーカー；レーン２，ＣＢＧ311 5 1； レーン３，ＣＢＧ313 10 1；レーン４，ＣＢＧ311 20 1； レーン５，分子量マーカー；レーン６，分子量マーカー； レーン７，ＣＢＧ313 5 1；レーン８，ＣＢＧ313 10 1； レーン９，ＣＢＧ313 20 1；レーン10，分子量マーカー； 実施例 以下の実施例は本発明を達成するのに使用する材料および方法ならびにそれに 続く結果をさらに説明する。これらは説明のために提供され、これらの列挙は記 載された発明を限定するものとみるべきではない。製剤実施例 以下の製剤に使用される有効成分はｐＣＩＢ５６１８およびｐＣＩＢ５６２１を それぞれ含み、新規な毒素遺伝子ＣｒｙＥ（ｃ）および遺伝子ＣｒｙＥ（ｄ）を 発現するＣＧＢ３１１およびＣＧＢ３１３と呼ばれるバチルス・チュリンジエン シスの組換え菌株である。ＣＧＢ３１３およびＣＧＢ３１１の両方は、１９９４ 年６月１日にAgricultural Research Service，Patent Culture Collection(NRR L),Nothern Regional Research Center，1815 North University Street,Peoria ,Illinois 61604,U.S.A.に寄託され、それぞれ受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２７ ４およびＮＲＲＬ Ｂ−２１２７３が与えられている。 A1．水和剤 胞子は添加剤と十分に混合し、混合物を適当なミルですっかり混合する。所望の 濃度の懸濁液を得るために、水で希釈できる水和剤を得る。 A2．乳剤原液バチルス・チュリンジエンシス 胞子 10％オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル 3％ （エチレンオキシド4-5モル）ドデシルベンゼンスルホン 酸カルシウム 3％ヒマシ 油ポリエチレングリコールエーテル 4％ （エチレンオキシド36モル） シクロヘキサノン 30％ キシレン混合物 50％ いずれかの必要な濃度の乳剤も、この原液を水で希釈することによって得られる 。 A3．粉剤 有効成分を担体と混合しそして適当なミルで混合物を粉砕することにより、すぐ に使用できる粉剤が得られる。 A4．押し出し粒剤バチルス・チュリンジエンシス 胞子 10％ リグニンスルホン酸ナトリウム 2％ カルボキシメチルセルロース 1％ カオリン 87％ 有効成分または組合せを混合し、補助剤と粉砕し、さらに続いて水で湿らせる。 混合物を押し出し、押出物を空気流で乾燥する。 A5．被覆粒剤バチルス・チュリンジエンシス 胞子 3％ ポリエチレングリコール（分子量200） 3％ カオリン 94％ 有効成分または組合せをポリエチレングリコールで湿らせたカオリンに、ミキサ ー中で均一に施用する。この方法で、非粉塵性の粉剤の被覆粒剤が得られる。 A6．懸濁原液バチルス・チュリンジエンシス 胞子 40％ エチレングリコール 10％ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル 6％ （エチレンオキシド15モル） リグノスルホン酸ナトリウム 10％ カルボキシメチルセルロース 1％ 37％水性ホルムアルデヒド溶液 0.2％ 75％水性乳剤形態のシリコン油 0.8％ 水 32％ 有効成分または組合せを補助剤と均一に混合する。この方法により水と希釈する ことによってあらゆる所望の濃度の懸濁液が作れる懸濁原液が得られる。 実施例１：新規な毒素遺伝子のクローンニングおよび単離 バチルス・チュリンジエンシス，クルスタキ変種(Bacillus thuringiensis va r Kurstaki)の適当な菌株から全ＤＮＡを単離する。ＣｒｙＥ（ｃ）の単離のた め、使用される菌株はＣＧＢ３１６であり、ＣｒｙＥ（ｄ）のため使用される菌 株はＣＧＢ３２３である。適当な菌株の培養をＬ−ブロス(L-broth)中で２５℃ で、回転振とう器中で１５０ｒｐｍで振とうして、一夜生育させる。培養を次に 遠心分離にかけ、そして８％スクロース、１００ｍＭのトリスｐＨ８、１０ｍＭ のＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍｇ／ｍｌのリゾチームに再懸濁し、 ３７℃で３０分間インキュベートする。５０μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫおよび ＳＤＳを０．２％の最終濃度になるまで添加し、そして得られた混合物を溶液が 非常に粘稠になるまで得られた混合物を５０℃でインキュベートする。フェノー ル／クロロホルムの等容量をこの粘稠な混合物を添加し、振動攪拌し（vortexed ）および遠心分離して水相と有機相を分離する。水相を１ｇ／ｍｌのＣｓＣｌと １５０μｇ／ｍｌの臭化エチジウムと一緒に混合し、３３ｍｌのナルジーンウル トラロック試験管(Nalgene Ultralok tube)に入れそしてベックマンＴｉ５０超 遠心ローター(Beckman Ti50 ultracentrifuge rotor)中で４５，０００ｒｐｍで １６時間遠心分離する。得られたＤＮＡバンドは紫外線光源で可視化されそして １６ゲージの針を使用して注射器で取り出す。イソアミルアルコールによる抽出 により混ざった臭化エチジ ウムをこのＤＮＡ試料から取り除く。単離されたＤＮＡは１００％エタノール２ 倍容量で沈澱させそして遠心分離する。得られたＤＮＡペレットを７０％エタノ ールで洗浄する。このＤＮＡペレットを乾燥しそして１０ｍＭのトリス，ｐＨ８ ．０；１ｍＭのＥＤＴＡで再度懸濁させる。 それぞれの菌株から単離されたＤＮＡ１５μｇを３７℃において０．１単位Ｓ ａｕ３Ａ／μｇＤＮＡにより消化する。制限酵素５μｇの添加の３，５，および １０分後、試料を消化混合物から取り出し、ＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度にな るまで加え、氷上に移す。おのおの設定した時間の消化物の等分をトリス−ボレ ート−ＥＤＴＡ緩衝液(ＴＢＥ；Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Samb rook et al．eds．Cold Spring Habor Press: New York(1989))を使用する０． ８％アガロースゲル上に加えそして一夜２５ボルトで、ＩＢＩ Ｍｏｄｅｌ Ｍ ＰＩゲル電気泳動装置〔Kodak，Rochester,New York〕で電気泳動を行う。HindI IIによって消化されたラムダＤＮＡを上記電気泳動のための分子量マーカーとし て使用する。電気泳動の後、６−９ｋｂの範囲のＤＮＡフラグメントをゲルから 切り出す。ＤＮＡをそれらをナノトラップ電気溶出トラップ(Nanotrap electroe lution trap)〔ISCO,Licoln,Nebraska〕に入れそして緩衝液系および電流により ＩＳＣＯリトルブルータンク(ISCO Little Blue Tank)〔ISCO,Licoln,Nebraska 〕を使用して、下記装置の供給者が記載する手順を使用してアガロースゲル片か ら電気溶出する。電気溶出後 、単離されたＤＮＡを３Ｍの酢酸ナトリウム，ｐＨ４．８の１／１０容量、１０ ０％エタノールの２．５容量を加えて沈澱させ、次に遠心分離する。得られたＤ ＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄しそして遠心分離する。このＤＮＡペレ ットを乾燥し１０ｍｌトリスｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁する。６− ９ｋｂの大きさの単離されたＤＮＡフラグメントのｐＵＣ１９〔New England Bi olabs,Beverly,Massachusetts,USA〕への連結反応は上記ＤＮＡ溶液４μｌ、前 もってＢａｍＨＩにより消化させそして子牛アルカリホスホターゼで処理したｐ ＵＣ１９の１００ｎｇ／μｌの溶液１μｌ、１０×連結反応緩衝液１μｌ、水３ μｌおよびＴ４リガーゼの３単位を含む１μｌを使用して行う。混合物を１５℃ で一夜インキュベートする。得られた、バチルス・チュリンジエンシス菌株から 単離された挿入ＤＮＡフラグメントを含むｐＵＣ１９−ベースのプラスミドは大 腸菌(E.coli)ＤＨ５α〔Stratagene,Lajolla,Califronia,USA〕能力細胞中に形 質転換される。これは、細菌細胞２００μｌとともに連結反応混合物を氷上で１ −２時間、次いで４０℃で９０秒間置いて、配合することにより完成される。処 理の後、細菌溶液を３７℃に、４５分間置いて、ＳＯＣ培地（Molecular Clonin g,A Laboratory Manual, Sambrook et al.eds.Cold Spring Habor Press:New Yo rk(1989)）２００μｌと混合し、形質転換体を選択する１００μｇ／ｍｌアンピ シリンを含むＬ−寒天平板培地上で培養する。この平板培地を一夜３７℃でイン キ ュベートする。 一夜後発生した形質転換されたコロニーは、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Sambrook et al.eds.Cold Spring Habor Press:New York(1989)に記載 されるコロニーハイブリッド形成法にかける。 簡単に説明すると、８５ｍｍニトロプラス(Nitroplus)２０００円形フィルタ ー〔Micron Separation,Westboro,Massachusetts，USA〕を形質変換されたコロ ニーを含むそれぞれの寒天平板培地上に置き、次に取り出す。フィルターを除去 した後、平板培地を再び３７℃で形質転換されたコロニーが再度目視できるまで 培養する。上にコロニーの付いたフィルターを、最初に１０％ＳＤＳで飽和した ワットマンペーパー(Whatman paper)上で、つぎに０．５Ｎ ＮａＯＨ−１．５ Ｍ ＮａＣｌ、次に１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ トリス，ｐＨ７．４でそれ ぞれ３分間処理して細菌細胞からＤＮＡを放出させる。フィルターを次に２×Ｓ ＳＣで処理しそして放出された細菌ＤＮＡをスタラリンカー（Stratalinker）（ Stratagene）を０．２ｍジュールで使用して紫外線架橋によりフィルター上に固 定する。 バチルス・チュリンジエンシスのそれぞれの菌株から単離されたＤＮＡフラグ メントに対して１００−２００コロニー／平板培地をもつおおよそ６つの平板培 地が得られる。フィルターのプレハイブリッド形成およびハイブリッド形成は１ ０×デンハート溶液〔Molecular Cloning,A Labo ratory Manual, Sambrook et al.eds.Cold Spring Habor Press:New York(1989) 〕、１５０ｇ／ｍｌのシアリングされた(sheared)サケ精子ＤＮＡ、１％ＳＤＳ ：５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．５；５ｍＭ ＥＤＴＡ，６×ＳＳＣ、０ ．０５％ピロリン酸ナトリウムの溶液中で行われる。プレハイブリッド形成は６ ５℃で４時間、５０ｍｌの体積中、³²Ｐ−ｄＣＴＰラベルされたプローブの１ミ リオンｃｐｍ／ｍｌとともにハイブリッド形成は６５℃で１８時間である。放射 線ラベルされたＤＮＡプローブはＢＲＬランダムプライムラベリングシステム（ BRL random prime labeling system〔BIBCO-BRL，Grand Island,NewYork,USA〕 を使用して生成され、ユニコーポレートされた(unicorporated)数はニックカラ ム(Nick Columns,Pharmacia)を使用して取り除かれる。 フィルターはポリメラーゼ連鎖反応により生成したｃｒｙＩＢの放射線ラベル されたフラグメントによりプローブする。生じたフラグメントはｃｒｙＩＢ遺伝 子の４６１−１３６６ｂｐまでの領域におよぶ。ハイブリッド形成プローブはハ イブリッド形成の溶液に添加する前に５分間煮沸する。フィルターを６５℃で２ ０分間、２×ＳＳＣ ５０ｍｌ、０．５％ＳＤＳで２回洗浄する。プローブされ 洗浄さたフィルターをデュポン クロネック ライトニングプラス補力スクリー ン(Dupont Cronex Lightning Plus intensifying screens)とともに、８０℃で 、コダックＸ−Ｏｍａｔ ＡＲ Ｘ線フィルムに露光する。ハイブリッド 形成によりポジであるこれらのコロニーを確認し再度生育した平板培地から採取 する。採取されたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−寒天培 地にストリークする。プラスミドＤＮＡをMolecular Cloning,A Laboratory Man ual, Sambrook et al.eds.Cold Spring Habor Press:New York(1989)に記載され たアルカリミニプレップ法（alkaline miniprep method）を使用してそれぞれの ストリークした培養から単離する。 ＣＧＥ５６１８〔ＣｒｙＥ（ｃ）に関する遺伝子をもつ〕およびＣＣＥ５６２ １〔ＣｒｙＥ（ｄ）に関する遺伝子をもつ〕と称するクローンが単離される。両 方のクローンは、上記の方法によって、バチルス・チュリンジエンシス菌株ＣＧ Ｂ３１６（ＣｒｙＥ（ｃ）遺伝子）およびＣＧＢ３２３（ＣｒｙＥ（ｄ）遺伝子 ）から単離されたＤＮＡフラグメントをもつことが示され、ＣｒｙＩＢプローブ とポジティヴにハイブリッド形成する、組換えプラスミドを含む。 適当なバチルス・チュリンジエンシス菌株から単離されおよび上記に示した組 換えプラスミドを含んだＤＮＡフラグメントは、大腸菌(E.coli)またはバチルス ・チュリンジエンシス中でプラスミド操作を許容するシャトルベクターｐＨＴ３ １０１〔Arantes et al,Gene 108,115-119,1991〕に再度クローン化される(re-c loned)。 ｐＨＴ３１０１はｐＵＣ１８，BtレプリコンおよびBt中の選択のためのエリス ロマイシン遺伝子からなる(Lereclu s et al.,FMS Microbiology Letter 60：211-218,1989)。バチルス・チュリンジ エンシスからのクローン化ＤＮＡを含む組換えプラスミドは標準的手法を使用し て、大腸菌(E.coli)細胞から単離される（Molecular Cloning,A Laboratory Man ual, Sambrook et al.eds.Cold Spring Habor Press:New York(1989)）。クロー ン化バチルス・チュリンジエンシスＤＮＡを組換えプラスミドから取り出すため 、それぞれのクローンから単離されたプラスミドは制限酵素Sac ＩおよびBbu Ｉ により消化される。消化混合物をＴＢＥ緩衝液系を使用して１％登録商標シープ ラーク(SeaPlaque)アガロースゲルに加えそして２５ボルトで一夜電気泳動を行 う。電気泳動の後、上記手順を使用して大きさ約７ｋｂのＤＮＡフラグメントが ゲルから単離される。ゲルから単離されたＤＮＡフラグメントは、前に記載した 手法を使用して、融解した（６５℃）アガロースフラグメント５μｌおよび１０ ｎｇ／μｌのｐＨＴ３１０１を４μｌを配合することにより、ｐＨＴ３１０１中 に連結される(ligated)。 菌株ＣＧＢ３１６から単離されおよびｐＨＴ３１０１中に連結されたバチルス ・チュリンジエンシスＤＮＡはｐＣＩＢ５６１８と呼ぶ。プラスミドｐＣＩＢ５ ６１８を含んでいる大腸菌（E.coli）菌株をＣＧＥ５６１８と呼ぶ。菌株ＣＧＢ ３２３から単離されおよびｐＨＴ３１０１中に連結されたバチルス・チュリンジ エンシスＤＮＡはｐＣＩＢ５６２１と呼ぶ。プラスミドｐＣＩＢ５６２１を含ん でい る大腸菌（E.coli）菌株をＣＧＥ５６２１と呼ぶ。ＣＧＥ５６２１およびＣＧＥ ５６１８の両方は１９９４年６月１日にAgricultural Research Service，Paten t Culture Collection(NRRL),Nothern Regional Research Center，1815 North University Street,Peoria,Illinois 61604,U.S.A.に寄託され、それぞれ受託番 号ＮＲＲＬ Ｂ−２１２７６およびＮＲＲＬ Ｂ−２１２７５が与えられている 。実施例２：新規な毒素遺伝子のＤＮＡ配列分析および他のＣｒｙＩ遺伝子との推 定されるタンパク質配列の相同性 本発明による新規な毒性遺伝子のおのおのＤＮＡ入れ悦は最初にアプライド バイオシステム モデル 380Ｂ ＤＮＡ シンセサイザー(Applied Biosystems model 380 Ｂ DNA Sythesizer)を使用して配列決定用のプライマー（sequensing primers）を合成することにより得られる。このプライマーを次にＤＮＡ配列決 定反応に使用する。 配列決定はジデオキシ鎖−終結法(dideoxy chain-termination method)(Sange r et al.,Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467,1977)を使用して行う。配列分 析反応はシーケナーゼ システム(US Biochemcal Cor.)を使用して行いそしてゲ ル分析はトリス−ボレート−ＥＤＴＡ緩衝液(BRL Gel-Mix 6)中の７Ｍ 尿素を 含む６％ポリアクリルアミドの４０ｃｍゲルについておこなう。ＣｒｙＥ（ｄ） については、ＤＮＡ配列分析は製造元の提案した手順に従ってアプライド バイ オシステム ＤＮＡ シーケンサーモデル 373Ａ(Applied Biosystems DNA Seqe ncer,Model 3 73A)から得られる。配列の分析はthe University of Wisconsin Genetic Comput er Group Sequence Analysis Software(UWGCG)を使用しておよびGene Codes Cor p.(Ann Arbor,Michigan)配列決定プログラムによって行われる。 Hofte and Whiteley,Microbiol.Rev.53:242-255(1989)の分類体系に従って新 規な毒素遺伝子によってコード化されたタンパク質はＣｒｙＥ型として分類され 、ここでＣｒｙＥ（ｃ）およびＣｒｙＥ（ｄ）と表す。本発明の両方の遺伝子は 予想される分子量１３０ｋＤａである１１７６個のアミノ酸の結晶性タンパク質 をコード化している。おのおの単離された新規な毒素遺伝子の完全なヌクレオチ ド配列はＣｒｙＥ（ｃ）に対しては配列番号：１およびＣｒｙＥ（ｄ）に対して は配列番号：７に示される。コード化されたタンパク質ＣｒｙＥ（ｃ）の推定さ れるアミノ酸配列は配列番号：２に開示されそしてコード化されたタンパク質Ｃ ｒｙＥ（ｄ）の推定されるアミノ酸配列は配列番号：８に開示される。ＵＷＧＣ Ｇにより利用できるＦＡＳＴＡプログラムを使用することにより、本発明の２つ の新規な毒素遺伝子が９９％の配列の同一性を示す。ＣｒｙＥ（ｃ）およびＣｒ ｙＥ（ｄ）の両方はそれぞれＣｒｙＥ（ａ）（GenBank/BMBL 受託番号M73252） と称される公知の内毒素遺伝子と８７％の配列同一性をもち、ＣｒｙＥ（ｂ）（ GenBank/BMBL 受託番号M73252）と称される公知の内毒素遺伝子と８３％の配列 同一性をもつ。ＣｒｙＥ（ｃ）およびＣｒｙＥ（ｄ）の両方に対する推定される タンパク質配 列はＣｒｙＥ（ａ）に対して８３％の類似度およびＣｒｙＥ（ｂ）に対して８１ ％の類似度をもつ。実施例３：新規な毒素遺伝子によりバチルス・チュリンジエンシスの形質転換 組換え遺伝子ｐＣＩＢ５６１８およびｐＣＩＢ５６２１中に存在する新規な毒 素に対するクローン化された遺伝子はＣＧＢ３２４と呼ばれるバチルス・チュリ ンジエンシスのアクリスタリフェラス(acrystallifeous)誘導体中へ形質転換さ れる。形質転換はＥＰ−Ａ ０３４２６３３にも記載される、Schurterらの方法 (Mol．Gen．Genet．218:177-181(1989))によって行われ、参照によりそのまま本 明細書に編入される。 ＣＧＢ３２４の胞子をＬ−ブロス１０ｍｌに接種し、２５℃で１００ｒｐｍの 回転振とう器で一夜インキュベートする。インキュベートの後培養をＬ−ブロス 中で５０倍に希釈し、３０℃で２５０ｒｐｍの回転振とう器で培養がＯＤ₅₅₀が ０．２に達するまでインキュベートする。細菌細胞は遠心分離により採取されそ して（４００ｍＭスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ、７ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ ６．０、２０％グリセロール）１／４０容量の氷冷エレクトロポレーション緩衝 液に再度懸濁させる。遠心分離および細胞の再度懸濁を上記に記載されたと同様 繰り返す。再度懸濁された細胞４００μｌを０．４ｃｍの電極のギャップをもつ ジーンプラサー(Genepulser)のキュベットに加える。プラスミドＤＮＡをキュベ ット中の細胞に加え、４℃で１ ０分間保持する。プラスミドＤＮＡをキャパシタンス２５Ｆおよび電場の強度１ ３００Ｖを使用してエレクトロポレーションによって細胞中に形質転換する。処 理された細胞を４℃でさらに１０分間保持し、次いでＬ−ブロス１．６ｍｌで希 釈しそして２５０回転の回転振とう器で３０℃で４時間インキュベートする。細 胞を、２５μｇ／ｍｌエリソロマイシンを含むＴ３寒天培地（トリプトン３ｇ、 トリプトース２ｇ、酵母抽出物１．５ｇ、ＭｇＣｌ₂０．０５ｇ、５０ｍＭリン 酸ナトリウムｐＨ６．８）で平板培養にしそして３０℃で２４−３６時間の間、 コロニーが目視されるまでインキュベートする。一つのコロニーを平板から採取 し、新たなエリスロマイシンを含むＴ３培地にストリークしそして胞子形成まで 生育させる。新規な毒素遺伝子の発現を示す結晶性のタンパク質体を生産するＣ ＧＢ３２４の形質転換細胞が顕微鏡的に確認される。 ｐＣＩＢ５６１８を含み、新規な毒素遺伝子ＣｒｙＥ（ｃ）を発現するバチル ス・チュリンジエンシスの組換え菌株はＣＧＢ３１１と呼ばれる。ｐＣＩＢ５６ ２１を含み、新規な毒素遺伝子ＣｒｙＥ（ｄ）を発現するバチルス・チュリンジ エンシスの組換え菌株はＣＧＢ３１３と呼ばれる。ＣＧＢ３１３およびＣＧＢ３ １１の両方は、１９９４年６月１日にAgricultural Research Service，Patent Culture Collection(NRRL),Nothern Regional Research Center，1815 North Un iversity Street,Peoria,Illinois 61604,U.S.A.に寄託され、それぞれ受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−２ １２７４およびＮＲＲＬ Ｂ−２１２７３が与えられている。実施例４： 組換えバチルス・チュリンジエンシスに発現された新規な毒素遺伝子 の昆虫生物検定 昆虫生物検定(insect bioassay)は胞子／結晶混合物を人工食餌調整品に添加 することにより行われる。例えば脱皮した黒ネキリムシ(Black Cutworm)人工食 餌を４５ｍｍゲルマンスナップキャップペトリ皿(Gellman snap-cap Petri dish es)に注ぎいれる。組換えバチルス・チュリンジエンシス菌株ＣＧＢ３１１およ びＣＧＢ３１３からの胞子／結晶混合物の試験溶液をそれぞれの試料の試験濃度 範囲で用意することを意図して０．０１％のトリトン Ｘ−１００中に１ｍｇ／ ｍｌの希釈液を使用して作る。溶融した食餌を凝固させた後、０．０１％のトリ トン Ｘ−１００中のＢｔの適当な希釈液１００μｌを平板の表面に塗り付け、 その平板を空気乾燥する。スポドプテラ・エクシグア(Spodoptera exgua)(beet armyworm)、スポドプテラ・フギペルダ(S.fugiperda)(fall armyworm)またはオ ストリニア・ヌビラリス(Ostorinia nubilalis)(Buropian corn borer)の第一齢 にあり、２４時間齢未満である昆虫を、第一齢における胞子／結晶のおのおのの 濃度で試験するために総数３０匹の昆虫のための食餌の表面に置く。検定は３０ ℃で完全な暗がり中で７２時間保温される。死滅率の百分率は検定期間の終わり に記録される。 ヘリオチス・ヴィレッセンス(Heliothis viresces)(ta bacco budworm)に対する検定はは以下の違いはあるが上記と同様の検定である。 一つのウエル表面積が２．２６ｃｍ²をもつコスター２４−ウエル細胞培養クラ スター（Costar 24-well cell culture clusters）が使用されそして胞子／結晶 希釈液１５μｌを凝固した人工食餌の表面に塗布する。２４時間齢未満の１匹の ヘリオチス・ヴィレッセンスを各ウェルにいれ、合計２４匹の昆虫について、胞 子／結晶のそれぞれの濃度に対して試験される。昆虫がウェルから逃げ出すこと を防ぐため、このウェルをパラフィルムの２切れおよび登録商標テリ−キムワイ プ(Teri-Kimwipe)[Fisher Scientific,Pittsberg,Pennsylvania,USA]の１切れで 覆う。検定は３０℃で７２時間保温し、その後の死滅率の百分率で記録する。全 ての検定のためのバックグラウンドの死滅率は０−１５％である。 プルテラ・キロステラ(Plutella xylostella)生物検定は５０ｍｇ／ｍｌ胞子 ／結晶混合物の等量を、溶融した、人工のプルテラ・キロステラ食餌（Biever a nd Boldt，Annals of Entomological Society of America,1971;Shelton et al ．J．Ent．Sci 26：17）に適当な濃度において混入することにより行われる。混 合された毒性の食餌４ｍｌをｌｏｚ．の透明なプラスチックカップ（Bioserve P roduct #9051）に注ぐ。次いで希釈液を予めの濃度まで毒性でない食餌を添加す ることにより作成する。食餌を冷却したらすぐに食餌に適合させた実験室コロニ ー(a diet-adapted lab colony)からの５匹の新生のプルテラ・キロステラ を食餌の入ったカップにおきそして次に白紙の蓋（Bioserve Product #9049）で 覆う。カップの乗ったトレーを３日間７２°Ｆ、明：暗周期が１４：１０（時間 ）であるインキュベーターに置く。死滅率の百分率は検定期間の終わりに記録す る。 新規な毒素の生物検定の結果を以下の表３にまとめる。 実施例５：新規な毒素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 凍結乾燥粉末からトリトン Ｘ−１００中の組換え菌株ＣＧＢ３１１およびＣ ＧＢ３１３の胞子／結晶のストックを製造する（２０ｍｇ／ｍｌ）。ストックの １００μｌの部分を室温で５分間かけて０．４Ｎ ＮａＯＨ２５μｌで処理し、 次いで４％ＳＤＳ、グリセロール、１０％β−メルカプト−エタノール、０．０ １％ブロモフェノールブルーおよび０．１２５Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８ 、の１２５μｌで処理する（Brussock，S.M.and T.C.Currier(1990),In:Analyti cal chemistry of B.thuringiensis L.A.Hickle and W.L.Fitch,editor,America n Chemical Society）。この溶液を次に１００で２分間加熱する。試料はエッペ ンドルフ５４１５マイクロフュージ(Eppendorf 5415 microfuge)中で１４，００ ０ｇ、６０秒間遠心分離する。試料を４−１２％ＳＤＳ−ＰＥＧ(Novex)に加え 、供給者による記載に従って実施する。ゲルは０．２％のコーマシ ーブルー（Coomassie blue）、４０％メタノールおよび１０％酢酸中、室温で３ ０分間染色し、４０％メタノールおよび１０％酢酸で脱色する。ゲルをモレキュ ラーダイナミクスパーソナルデンシオメーター(Molecular Dynamics Personal D ensiometer)を使用して走査し、そしてデータはマイクロソフト社のエクセル(Mi crosoft Excel)で解析する。図１は、新規な毒性遺伝子のおのおのに対して推定 されるタンパク質配列に基づいて予期される分子量におけるタンパク質バンドを 示す。実施例６：新規な毒素遺伝子によるトウモロコシの形質変換 上記方法のいずれかに従って製造された新規な毒素の少なくとも１種によるト ウモロコシの形質転換は、上記毒素遺伝子を含む適当な植物形質変換ベクターに より、未分化の接合体の胚または連続的に繁殖可能なＴｙｐｅＩ胚遺伝子のカル スのいずれかのミクロプロジェクティルボンバードメント(microprojectile bom bardment)により達成できる。 ６．１ 植物形質転換ベクターの構築 多数の形質転換ベクターが植物の形質転換に利用でき、そして本発明の遺伝子 はそれらのベクターのいずれかと関連して使用できる。ベクターの選択は好まし い形質転換技術および形質転換のための標的種に依存するであろう。ある標的種 に対しては種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換のル ーチン的に使用するマーカ ーの選択はカナマイシンおよび関係する抗生物質の耐性を与えるnptll 遺伝子（ Messing & Vierra,Gene 19:259-268(1982);Bevan et al.,Nature 304:184-187(1 983)）、除草剤ホスフィノトリシンに対して耐性を与えるbar 遺伝子(White et al.,Nucl Acid Res 18:1062(1990),Spencer et al.,Theor Appl Genet 79:625-6 31(1990))、抗生物質ヒグロマイシンに対して耐性を与えるhPh 遺伝子(Bloching er & Diggelmann,Mol Cell Biol 4:2929-2931)およびメトトレキセートに対して 耐性を与えるdhfr遺伝子(Bourouis et al.,BMBO J．2(7):1099-1104)を含む。 （ａ）アグロバクテリウム形質転換に適当なベクターの構築 多くのベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tum efaciens)を使用する形質転換に利用できる。これらは代表的には少なくとも１ つのＴ−ＤＮＡ境界配列をもち、ｐＢＩＮ１９のようなベクターを含む(Bevan,N ucl.Acid Res.(1984))。以下に２つの代表的なベクターの構築を記載する。ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築 バイナリーベクター（binary vectors）ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００ １はアグロバクテリウムとともに使用するための組換えベクターの構築のために 使用され、そしてそして以下の方法で構築される。 テトラサイクリン−耐性遺伝子の切除を可能にするｐＴＪＳ７５（Schmidhaus er & Helinski，J.Bacteriol．164 :446-455(1985)）のNarl消化、続いてＮＰＩII（Messing & Vierra,Gene 19:259 -268(1982); Bevan,Nature 304:184-187(1983);McBride et al.,Plant Molecula r biology 14 :266-276(1990)）をもつｐＵＣ４ＫからのAcclフラグメントの挿 入によりｐＴＪＳ７５ｋａｎを作る。 XhoIリンカーを；左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列（left and right T-DNA b orders）、nos/nptIIキメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカー（Rothsein et al. ,Gene 53:153-161(1987)）を含む、ｐＣＩＢ７のEcoRV フラグメントと連結し、 そして XhoI −消化したフラグメントをSaII−消化したｐＴＫＳ７５ｋａｎ中で クローニングしてｐＣＩＢ２００を創成する（ＥＰ 0 332 104参照）。ｐＣＩＢ ２００は以下のユニークなポリリンカー制限部位を含む：EcoRI、SstI、KpnI、B gIII、 XbaIおよびSaII。ｐＣＩＢ２００１は追加の制限部位のポリリンカー中への挿 入によって創成されるｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリ リンカーにおけるユニークの制限部位はEcoRI、SstI、KpnI、BgIII、XbaI、SaII 、MluI、BcII、AvrII、ApaI、HpaIおよびStuIである。これらのユニークの制限 部位を含むことに加えて、ｐＣＩＢ２００１はまた、植物およびバクテリアのカ ナマイシン選択物、アグロバクテリウム−媒介形質転換のための左および右のＴ −ＤＮＡ境界配列、大腸菌（E.coli）と他の宿主間の動体化のためのＲＫ−２誘 導trfAファンクションおよびさらにＲＫ２から誘導されたOriTおよびOr iVファンクションを有する。このｐＣＩＢ２００１ポリリンカーは自身の調節信 号を含む植物発現カセットのクローニングに適当である。ｐＣＩＢ１０の構築およびそのハイグロマイシン選択誘導体 バイナリーベクターｐＣＩＢ１０は、植物体の選択のためのカナマイシン耐性 をコード化する遺伝子、Ｔ−ＤＮＡ右および左境界配列をもち、そして大腸菌(E .coli)及びアグロバクテリウムの両方において複製できる広い宿主範囲のプラス ミドｐＲＫ２５２からの配列を取込む。これの構築はロスシュタインら（Rothst ein et al.）によって記載されている(Gene 53 :163-161(1987))。ｐＣＩＢ１０ の種々の誘導体が構築されており、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ に対する遺伝子を取り込むものはグリッツら（Gritz et al.）によって記載され ている(Gene 25:179-188(1983))。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ（ ｐＣＩＢ７４３）、またはヒグロマイシンおよびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５ 、ｐＣＩＢ７１７）において、トランスジェニック植物細胞の選択が可能である 。（Rothstein etａl.,Gene 53:153-161(1987)） （２）非−アグロバクテリウム形質転換に適当なベクターの構築 アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用しない他の形質転換は、選択さ れた形質転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、結果として、 Ｔ−ＤＮＡ配 列を含む上記に記載されたようなベクターに加えてこれらの配列を欠損するベク ターが使用できる。アグロバクテリウムに依存しない形質転換技術は、マイクロ プロジェクティルボンバードメント（microprojectile bombardment）およびプ ロトプラストの取込み(protoplast uptake)および微量注入法による形質転換を 含む。これらの方法のためのベクターの選択は形質転換される種の好ましい選択 に多大に依存する。以下に幾つかの代表的なベクターの構築を記載するｐＣＩＢ３０６４の構築 ｐＣＩＢ３０６４は除草剤バスタ(Basta)(またはホスフィノトリシン)による選 択を伴う遺伝子直接導入技術に適当なｐＵＣ−誘導ベクターである。プラスミド ｐＣＩＢ２４６は、E.coliＧＵＳ遺伝子への操作可能な融合におけるＣａＭＶ３ ５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーターを含み、そして国際 公開公報ＷＯ93/07278に記載される。この３５Ｓプロモーターは開始部位の２つ のＡＴＧ配列５’を含む。これらの部位をＡＴＧｓを除去し制限部位SsPIおよび PvuIIを発生させる方法である標準ＰＣＲ技法を使用して、突然変異を起こさせ る。新しい新しい制限部位はユニークのSaII部位から９６および３７ｂｐ離れて おりそして実際の開始部位から１０１および４２ｂｐ離れている。ｐＣＩＢ２４ ６の得られた誘導体をｐＣＩＢ３０２５と呼ぶ。ＧＵＳ遺伝子を次にSaIIおよび SacIで消化することによりｐＣＩＢ３０２５から切除し、末端 をブラントにしおよび連結してプラスミドｐＣＩＢ３０６０を生じさせる。プラ スミドｐＪＩＴ８２はJohn Innes Center,Norwich から得られ、そしてそのスト レプトマイセス・ヴィリドクロモゲンス（Streptomyces viridochromogens）か らのbar 遺伝子を含む４００ｂｐSmaIフラグメントを切除しそしてｐＣＩＢ３０ ６０のHpaI部位に挿入する（Thompson et al．BMBO J 6:2519-2523(1987)）。こ れによりｐＣＩＢ３０６４が生じ、それはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御 下のbar 遺伝子および除草剤選択のためのターミネーター、アンピリシン耐性遺 伝子fro（大腸菌E.Coliにおける選択のため）およびユニーク部位SphI、PstI、H indIII およびBamHI をもつポリリンカーを含む。このベクターは自身の調節信 号を含む植物表現カセットのクローニングに適当である。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築 ｐＳＯＧ３５はメトトレキセートへの耐性を与える選択可能なマーカーとして の大腸菌（E.coli）遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を利用できる 。ＰＣＲは３５Ｓプロモーター（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子 （〜５５０ｂｐ）からのイントロン６［Lou et al.,Plant J 3:393-403,1993;De nnis et al,Nucl Acids Res 12:3983-4000］およびｐＳＯＧ１０からの１８ｂｐ のＧＵＳ非翻訳リーダー配列を増幅するのに使用される。大腸菌（E.coli）ジヒ ドロ葉酸レダクターゼII遺伝子をコー ド化する２５０ｂｐフラグメントはまたＰＣＲによって増幅され、そしてこれら ２つのＰＣＲフラグメントはｐＵＣ１９ベクターのバックボーンおよびノパリン シンターゼターミネーターを含むｐＢＩ２２１（Clontech）からのSacI-PstI フ ラグメントと会合する。これらのフラグメントの会合は、イントロン６配列との 融合における３５Ｓプロモーター、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパ リンシンターゼターミネーターを含むｐＳＯＧ１９を生じる。ｐＳＯＧ１９にお いてＧＵＳリーダーをトウモロコシ緑斑病ウイルス（Maize Chlorotic Mottle V irus check（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列への置き換えによりベクターｐＳＯ Ｇ３５が生じる。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５はアンピシリン耐性に対する ｐＵＣをもたらし、および外来の配列のクローンニングに利用できるHindIII、S phI、PstI、EcRI部位をもつ。ｐＳＯＧ１０ このβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現ベクターを、クローンテックラボラト リー（Clonetech Laboratories，Palo Alto,California)から購入したプラスミ ドｐＢＩ１２１から誘導する。オリゴヌクレオチドプライマーＳＯＮ０００３お よびＳＯＮ０００４を使用して、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロン６はプラ スミドｐＢ４２８からのＰＣＲによって増幅される、それはBennetzen et al.,P roc.Natl.Acad．Sci,USA 81:4124-4128(1987)に記載されている。 ＰＣＲ反応生成物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより消化し各々ＰＣ Ｒプライマーの５末端上に加えられたＢａｍＨＩを開裂する。得られたＤＮＡフ ラグメントをアガロースゲル上で精製しおよびｐＢＩ１２１の、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターとＧＵＳ遺伝子との間のＢａｍＨＩ部位中に連結する。連結された ＤＮＡを大腸菌（E.Coli）の中へ形質転換しそしてＧＵＳ遺伝子と同様の配向に おけるAdh1イントロン６をもつクローンを制限消化物(restriction digest)によ り確認する。ｐＳＯＧ１９ このジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）発現ベクターはｐＳＯＧ１０の３ ５ＳプロモーターおよびAdh1イントロン６をプラスミドｐＨＣＯからのＤＨＦＲ に融合することにより誘導され、Bourouis and Jarry,BMBO J．2:1099-1104(198 3)に記載されている。３５ＳプロモーターおよびAdh1イントロン６はプライマー ＳＯＮ００３１およびＳＯＮ００１０を使用してｐＳＯＧ１０からのフラグメン トのＰＣＲ増幅によって製造される。 得られたフラグメントは制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩおよびＢｓｐＨＩに より消化しそしてアガロースゲル上で精製する。 プライマーＳＯＮ００１６およびＳＯＮ００１７を使用してＤＨＦＲコーディ ング領域をｐＣＨＯのＰＣＲ増幅により製造する。 得られたフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＮｓｏＩおよびＳａｃＩによ り消化しそしてアガロースゲルで精製する。 制限エンドヌクレアーゼＮｓｏＩおよびＳａｃＩによって上記に記載した２つ のフラグメントをｐＢＩ１２１から製造されたベクターフラグメント中へ連結し 、そして３ｋｂフラグメントの精製物はアガロースゲル上のＮｏｓターミネータ ー領域およびｐＢＩ１２１のｐＵＣ１９領域を含む。この３つの方法のリゲーシ ョン（Ligation）を３５ＳプロモーターAdhIイントロン−ＤＨＦＲ遺伝子−Ｎｏ ｓターミネーターを植物における機能的発現のために正確な順序および配向で融 合する。ｐＳＯＧ３０ トウモロコシ緑斑病ウイルス（ＭＣＭ）リーダーを、３方法のリゲーションに よる３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝子非翻訳リーダー中への挿入によって、このＧＵＳ発現 ベクターをｐＳＯＧ１０から誘導し、それは（Lommel et al.,Virology 181:382 -385(1991)に記載されている。１７ｂｐＭＣＭＶキャプシド(capsid)タンパク質 リーダー配列の両方のストランド、それに加えて適当な制限エンドヌクレアーゼ サイト(sight)を合成しそしてアニールする。得られた二本鎖フラグメントをＢ ａｍＨＩおよびＮｃｏ１で消化しそしてアクリルアミドゲル上で精製する。 ＧＵＳ遺伝子コーディング領域はプライマーＳＯＮ００３９およびＳＯＮ００ ４１および鋳型としてのｐＢＩ１２１を使用してＰＣＲにより増幅する。 これらのプライマーはＧＵＳの５’末端へのＮｃｏＩ部位およびＧＵＳの３末 端へのＳａｃＩ部位に加えられる。得られたフラグメントを制限エンドンヌクレ アーゼＮｃｏＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてアガロースゲル上で精製する。 ＧＵＳ遺伝子は制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩによる消化および制限エンド ヌクレアーゼＢａｍＨＩによる部分的消化によりプラスミドｐＳＯＧ１０から除 去される。そ こで３５Ｓプロモーター−Adh1イントロン６の背後のコーディング領域を再挿入 する、ＢａｍＨＩ部位およびＳａｃＩ部位をもつ得られたベクターはアガロース ゲル上で精製される。 上記三つのフラグメントを３つの方法のリゲーションによって連結して、すべ てｐＵＣ１９ベクターバックボーンにある、構造：３５Ｓプロモーター−Adh1イ ントロン６−ＭＣＭＶリーダー−ＧＵＳ−ＮＯＳターミネーターをもつ遺伝子融 合物を製造する。ｐＳＯＧ３５ ＤＨＦＲ選択可能なマーカーベクターは、翻訳を向上させるためＭＣＭＶリー ダーがＤＨＦＲ遺伝子の非翻訳リーダー中に挿入されていることを除いてｐＳＯ Ｇ１９と同じである。それは２つの段階で創成される。最初に、ＮｃｏＩおよび ＳａｃＩによりＧＵＳを切除し、そしてＮｃｏＩ−ＳａｃＩフラグメントとして ＤＨＦＲを連結することにより、ｐＳＯＧ３２のＧＵＳコーディング遺伝子領域 、改良された３５Ｓより改変されたAdh プロモーターを含むことを除いてｐＳＯ Ｇ３０と同じベクターをＤＨＦＲコーディング領域により置き換える。これは、 プロモーターとイントロンとの間にＢｇIII 部位、コーディング領域とターミネ ーターとの間にＳａｃＩ部位をもつ、遺伝子構造Adh プロモーター−Adh1イント ロン６−ＭＣＭＶリーダー−ＤＨＦＲコーディング領域−Ｎｏｓターミネーター を持つベクターｐＳＯＧ３３を生じる結果となる。 ＢｇIII−ＳａｃＩフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼ消化により単離 されそしてアガロースゲル精製およびｐＳＯＧ３０のＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ 部位中に連結され、ｐＳＯＧ３０のAdh1イントロンＺ６−ＭＣＭＶリーダー−Ｇ ＵＳコーディング領域をｐＳＯＧ３３のAdh1イントロン６−ＭＣＭＶリーダー− ＤＨＦＲコーディング領域により置き換える。６．２ 植物発現カセットの構築 トランスジェニック植物体における発現のために意図される遺伝子配列は最初 に、適当なプロモーターおよび適当な転写ターミネーターの上流の背後の発現カ セットに会合される。これら発現カセットは次に実施例６．１に記載した植物形 質転換ベクターに容易に転移できる。プロモーターの選択 発現カセットにおいて使用されるプロモーターの選択はトランスジェニック植 物におけるトランス遺伝子の空間的および時間的発現パタンを決める。選択され たプロモーターは特定の細胞型（例えば葉上皮細胞、葉肉細胞、根皮質細胞）ま たは特定の組織または器官（例えば根、葉または花）におけるトランス遺伝子を 発現し、この選択はトランス遺伝子の発現の望ましい配置を反映する。代わりに 、選択されたプロモーターは光誘発されたまたは他に時間的に調節されたプロモ ーターの下で遺伝子の発現を操作できる。さらに別には、選択されたプロモータ ーは化学的に調節されることである。このことは望ましい場合および化学的 誘導体による処理に起因する場合のみトランス遺伝子の発現を誘導する可能性を 提供することである。転写ターミネーター 多様な転写ターミネーターが発現カセットにおける使用に利用できる。 これらはトランス遺伝子をこえる転写の終結およびその正しいポリアデニル化 をになう。適当な転写ターミネーターおよび植物体における機能が知られたもの はＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、tmI ターミネーター、ノパリンシンターゼタ ーミネーター、エンドウrbcSＥ９ターミネーターおよび技術的に知られるもので ある。これらは、単子葉植物および双子葉植物の両方に使用できる。発現の向上と調節に対する配列 多数の配列はまた転写単位範囲内からの遺伝子の発現を向上することが見いだ され、およびこれらの配列が本発明の新規な毒素遺伝子に関して使用して、トラ ンスジェニック植物体におけるそれらの発現を増加できる。 種々のイントロン配列は、特に単子葉植物の細胞における発現を向上させるこ とが示されている。例えば、トウモロコシAdh1遺伝子のイントロンはトウモロコ シ細胞へ導入された場合野性型遺伝子の、その同族プロモーターの下での発現を 著しく向上することが見いだされている。イントロン１はクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をもつ融合構築物中において特に有効で発現 を向上することが見いだされている(Callis et al.,Genes Dev elop 1:1183-1200(1987))。同じ実験系では、トウモロコシbrnze1遺伝子からの イントロンが発現を向上することに同様の有効性をもっていた（(Callis et al. 同上）。イントロン配列はルーチン的に植物形質転換ベクターに代表的には非翻 訳リーダー内に取り込まれる。 ウイルスから誘導された多くの非翻訳リーダー配列はまた発現を向上すること が知られており、これらは特に双子葉植物細胞に有効である。特別にはタバコモ ザイクウィルス（ＴＭＶ，ω−配列）、トウモロコシ緑斑病ウィルス（ＭＣＭＶ ）およびアルファルファモザイクウィルス（ＡＭＶ）からのリーダー配列は発現 を向上させるのに有効であることが示されている（例えばGalle et al.Nucl．Ac ids Res. 15:8693-8711(1987);Skuzeski et．al．Plant Molec．Biol．15:65-79 (1990)）。細胞内の遺伝子産物の標的化 (Targeting) 植物体中に存在する遺伝子産物を標的にするための種々の機構は公知であり、 これらの機構の機能を調整する配列は幾つかは詳細に特徴づけられている。例え ば、クロロプラストに関する遺伝子産物は種々のタンパク質のアミノ末端におい て見出される信号配列により調整されており、それはクロロプラストが完全なタ ンパク質を産生して取り込む間に裂開する(例えばComai et.al.J.Biol.Chem.263 :15104-15109(1988))。これらの信号配列は異種の遺伝子産物と融合してクロロ プラストの中への異種産物の取り込みを行わせることもできる（van den Broeck et al．Nature 3 13:358-363(1985)）。適当な信号配列のためのＤＮＡのコード化はＲＵＢＩＳＣ Ｏタンパク質、ＣＡＢタンパク質、ＥＰＳＰ合成酵素、ＧＳ２タンパク質および クロロプラストに局在することが知られている他の多くのタンパク質をコード化 するｃＤＮＡｓの５’末端から単離できる。 他の遺伝子産物は他のオルガネラ、例えばミトコンドリアおよびペルオキシソ ームに局在する（Unger et al．Plant Molec．Biol．13:411-418(1989)）。これ らの産物をコード化する cＤＮＡs はまたそれらのオルガネラに対する異種遺伝 子産物の標的化を行うことを操作することも出来る。このような配列の実例は核 コード化ＡＴＰアーゼおよびミトコンドリアのための特定のイソ型アスパラギン 酸トランスフェラーゼである。細胞性タンパク質体に関する標的化はRogers et al.,Proc Natl．Acad．Sci．USA 82:6512-6516(1985)に記載されている。 加えて、配列は他の細胞画分（cell compartment）への遺伝子産物の標的化の 原因となることを特徴としている。アミノ末端配列はＥＲ、アポプラスト、アリ ューロン細胞からの細胞外分泌物への標的化をになっている（Koehler & Ho，Pl ant Cell 2:769-783(1990)）。さらにカルボキシル末端配列に関連するアミノ末 端配列は遺伝子産物の標的としている液泡よるものである（Shinshi et al．Pla nt Molec．Biol.14:357-368(1990)）。 上記に記載した適当な標的配列の、関心あうトランス遺伝子への融合によって 、トランス遺伝子産物をいずれかの オルガネラまたは細胞画分に向けることができる。クロロプラストの標的化のた めに、例えばＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼの遺伝 子またはＧＳ２遺伝子からクロロプラスト信号配列はトランス遺伝子のアミノ末 端ＡＴＧに対するフレーム内で融合される。選択された信号配列は公知の開裂部 位を含みおよび構築された融合物は、開裂に要求される開裂部位の後のいずれか のアミノ酸を考慮するべきである。ある場合にはこの要求は開裂部位とトランス 遺伝子ＡＴＧとの間の少数のアミノ酸の添加によりあるいは、トランス遺伝子配 列内の幾つかのアミノ酸の置き換えにより完全に満たすことができる。クロロプ ラスト取込みのために構築された融合物は(Bartolett et al．In: Edelmann et al.(Eds)Methods in Cloroplast Molecular biology,Elesevier pp 1081−1091( 1982));Wasmann et al.Mol．Gen.Genet.205:446-453(1986))に記載された技術を 使用して、in vitroで転写された構築物のin vitroでの翻訳、続くin vitroでの クロロプラストの取込みによってクロロプラスト摂取の効力について試験できる 。これらの構築技術は技術的によく知られており、ミトコンドリアおよびペルオ キソムに等しく許容される。トランス遺伝子の発現のために要求できる標的化の 選択は与えられた経路に対する開始点として要求される前駆体の細胞上の配置に 依存する。これは一般に細胞質ゾルまたはクロロプラストに関するものであるが 、しかしある場合ミトコンドリアのまたはペルオキソームのものであってよい。 ト ランス遺伝子発現の生産物は、一般にＥＲ、アポプラストまたは液胞に対する標 的化を要求しないであろう。細胞の標的化のための上記に記載された機構はそれ らの同種のプロモーターに関してだけでなく、異種のプロモーターに関してもま た、標的信号を誘導するプロモーターの転写調節の発現パタンとは異なる発現パ タンをもつプロモーターの下で特定の細胞の標的化の終点に達するように、利用 できる。６．３．トウモロコシ形質転換 未成熟接合胚を用いる形質転換のために、雌穂が自家受粉され、そして未成熟 接合胚が約１０日後に得られる。約８００の未成熟接合胚が胚形成性カルスの形 成を誘導および支持し得る培地を含有する異なる標的プレートに分配される。未 成熟接合胚が同一であるが１２％ショ糖を含有する培地にすぐに移される。５時 間後、未成熟接合胚はバイオラドからのＰＤＳ−１０００／Ｈｅ装置を用いてプ ラスミドが打ち込まれる。プラスミドは選択性マーカー、例えばホスフィノトリ シンに対する耐性を付与する遺伝子および上記に係るトウモロコシへの伝達およ びトウモロコシ内での発現のために調製された新規毒素遺伝子を含有する。プラ スミドはバイオラドから発行されている方法に実質的に従って１μｍ金粒子上に 沈澱される。粒子はヘリウム１５０ｐｓｉの破壊圧力を用いて伝達される。各標 的プレートにはプラスミドおよび金粒子調製物を用いて２回打ち込まれる。プラ スミドはホスフィノトリシンに対する耐性を コードするキメラ遺伝子を含むので、この物質は試験管内で形質転換された細胞 を選択するために使用される。選択剤は遺伝子伝達の１０日目に１０ｍｇ／Ｌで 添加され、そして約１ヵ月後４０ｍｇ／Ｌに増加される。そのようにして得られ た胚形成性カルスは選択剤ホスフィノトリシンの存在下で再生される。植物体は ホスフィノトリシン耐性の胚形成性カルス系から得られる。再生された植物体は 感受性昆虫に対する耐性がアッセイされる。昆虫に対して耐性である全ての植物 体はＥＬＩＳＡ（エリザ）アッセイを用いる植物における新規毒素タンパク質の 検出により明らかにされるように、導入された新規毒素遺伝子を発現する。昆虫 に対して耐性で、導入されたキメラ新規毒素遺伝子を発現する植物は形質転換さ れている。 Ｉ型胚形成性カルスを用いるトウモロコシの形質転換のために、カルスは標準 的培養法を用いて未成熟接合胚から得られる。遺伝子伝達のために、Ｉ型カルス 約３００ｍｇが外科用メスでの切断または遺伝子伝達の３−５日前の継代培養に より調製される。遺伝子伝達の前に、調製されたカルスを再び１２％ショ糖を含 有する半固体培養培地上に載せる。約４時間後、バイオラドからのＰＤＳ−１０ ００／Ｈｅバイオリスティック装置を用いて組織に打ち込む。選択性マーカー、 例えばホスフィノトリシンに対する耐性を付与する遺伝子および上記に係るトウ モロコシへの伝達およびトウモロコシ内での発現のために調製された新規毒素遺 伝子を含有するプラスミドはバイオラドからの標準的 プロトコルを実質的に用いて１μｍ金粒子上に沈澱される。遺伝子伝達の約１６ 時間後、カルスは２％ショ糖および１ｍｇ／Ｌホスフィノトリジンを含有する標 準培養培地に移される。カルスは選択のために８週間継代培養され、その後、生 き残り、そして増殖するカルスが植物体作出のための標準的再生培地に移される 。再生された植物体は感受性昆虫に対する耐性がアッセイされる。昆虫に対して 耐性である全ての植物体はまた、ＥＬＩＳＡアッセイを用いる植物における新規 毒素タンパク質の検出により明らかにされるように、導入された新規毒素遺伝子 を発現する。昆虫に対して耐性で、導入されたキメラ新規毒素遺伝子を発現する 植物は形質転換されている。 本明細書中に挙げられた全ての出版物および特許明細書は、本発明が関する技 術分野における当業者の技術水準を示すものである。全ての出版物および特許明 細書は、各々個々の出版物または特許明細書が参照により編入されることが個々 に示されているのと同じようにして、参照により本明細書中に編入される。 これまで本発明は説明により、および理解の明確化のための実施例によりいく ぶん詳細に記載されてきたけれども、ある種の変化および変形が添付の請求の範 囲の範囲内で行われ得ることは明確であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年７月１６日 【補正内容】 請求の範囲 １．ヘリオチス種（Heliothis species）に対して活性があるが、スポドプテ ラ・エクシグア（Spodoptera exigua）に対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型の 毒素タンパク質をコード化する単離されたＤＮＡ分子。 ２．サブシーケンスＡ（Sub-Sequence A）（配列番号(SEQ ID NO)：３）およ びサブシーケンスＢ（配列番号：４）よりなる群から選択される配列からなり、 そしてヘリオチス種に対して活性がある、毒素タンパク質をコード化する請求項 １に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ３．上記毒素タンパク質がサブシーケンスＡ（配列番号：３）およびサブシー ケンスＢ（配列番号：４）の両方を含む請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子 。 ４．サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシーケンスＢ’（配列番 号：１０）よりなる群から選択される配列からなり、そしてヘリオチス種に対し て活性がある、毒素タンパク質をコード化する請求項１に記載の単離されたＤＮ Ａ分子。 ５．上記毒素タンパク質がサブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシ ーケンスＢ’（配列番号：１０）の両方を含む請求項１に記載の単離されたＤＮ Ａ分子。 ６．上記毒性タンパク質が配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するＣｒ ｙＩＥ（ｃ）である、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ７．上記毒素タンパク質が配列番号：８に示されるアミノ酸配列を有するＣｒ ｙＩＥ（ｄ）である、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ８．配列番号：１に示されるヌクレオチド配列を有する請求項６に記載の単離 されたＤＮＡ分子。 ９．配列番号：７に示されるヌクレオチド配列を有する請求項７に記載の単離 されたＤＮＡ分子。 １０．上記毒素タンパク質が組換えタンパク質である請求項１ないし９の何れか 一項記載の単離されたＤＮＡ分子。 １１．植物における発現のために最適化された請求項１ないし１０の何れか一項 記載の単離されたＤＮＡ分子。 １２．トウモロコシにおける発現のために最適化された請求項１１記載の単離さ れたＤＮＡ分子。 １３．毒素タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）の毒性のコアフ ラグメントをそれぞれコード化する請求項６ないし１２の何れか一項記載の単離 されたＤＮＡ分子。 １４．請求項１ないし１３の何れか一項記載の単離されたＤＮＡ分子の何れかの 突然変異体または変種であって、上記ＤＮＡ分子と実質的に同類であり、そして ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して活性を 示さないＣｒｙＩＥ型のタンパク質を生じる、突然変異体または変種。 １５．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型のタ ンパク質の分離されたタンパク質分子。 １６．配列番号：２に示された配列をもつ請求項１５に記載の単離されたタンパ ク質分子。 １７．配列番号：８に示された配列をもつ請求項１５に記載の単離されたタンパ ク質分子。 １８．サブシーケンスＡ（配列番号：３）およびサブシーケンスＢ（配列番号： ４）よりなる群から選択される配列からなり、そしてヘリオチス種に対して活性 がある、単離されたタンパク質分子。 １９．サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシーケンスＢ’（配列番 号：１０）よりなる群から選択される配列からなり、そしてヘリオチス種に対し て活性がある、単離されたタンパク質分子。 ２０．サブシーケンスＡ（配列番号 Ｎｏ：３）およびサブシーケンスＢ（配列 番号 Ｎｏ：４）の両方を含む請求項１８に記載の単離されたタンパク質分子。 ２１．サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシーケンスＢ’（配列番 号：１０）の両方を含み、そしてヘリオチス種に対して活性がある、請求項１９ に記載の単離されたタンパク質分子。 ２２．組換えタンパク質である請求項１５ないし２２の何れか一項記載の単離さ れたタンパク質分子。 ２３．請求項１５ないし２２の何れか一項記載の単離されたタンパク質分子の突 然変異体または変種であって、上記タンパク質分子と実質的に同類であり、かつ 依然とし てＣｒｙＩＥ型であるヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エク シグアに対して活性を示さない、突然変異体または変種。 ２４．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型の毒性タンパク質をコード化するＤＮＡ分子からな る組換えＤＮＡ分子。 ２５．請求項２ないし１４の何れか一項記載のＤＮＡ分子の少なくとも１種を含 む組換えＤＮＡ分子。 ２６．キメラＤＮＡ構成物からなり、ヘリオチス種に対して活性があるが、スポ ドプテラ・エクシグアに対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型の毒性タンパク質を コード化する上記ＤＮＡ分子が、微生物および／または植物中で操作可能である 発現配列の調節の下にある、請求項２４に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２７．キメラＤＮＡ構成物からなり、請求項２ないし１４の何れか一項記載の上 記ＤＮＡ分子が、微生物および／または植物中で操作可能である発現配列の調節 の下にある、請求項２６に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２８．キメラＤＮＡ構成物からなり、請求項１１または１２の何れか一項記載の 上記ＤＮＡが、植物中で操作可能である発現配列の調節の下にある、請求項２７ に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２９．請求項２６ないし２７の何れか一項記載の単離されたＤＮＡ分子の少なく とも１種により形質転換された、 組換え微生物。 ３０．毒素タンパク質をコード化する少なくとも１種のＤＮＡを含む組換え微生 物であって、上記毒素タンパク質が、サブシーケンスＡ（配列番号：３）、サブ シーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサ ブシーケンスＢ’（配列番号：１０）、ならびにサブシーケンスＡ（配列番号： ３）、サブシーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９ ）および／またはサブシーケンスＢ’（配列番号：１０）の組合せよりなる群か ら選択される配列からなり、上記毒素タンパク質がヘリオチス種に対して活性が ある、組換え微生物。 ３１．上記組換え微生物が、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudo monas）属、カウロバクター（Caulobacter）属、アグメレナム(Agmellenum)属、 リゾビウム（Rhizobium）属および、クラビバクター（Clavibacter）あるいはバ キュロウイルスまたは酵母からなる群より選ばれる、請求項２９または３０項に 記載の組換え微生物。 ３２．上記組換え微生物が核多角体病ウイルスであるオートグラフィカ・カリホ ルニカ（Autographica californica）である請求項３１に記載の組換え微生物。 ３３．上記組換え微生物がバチルス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringie nsis）である請求項３１に記載の組換え微生物。 ３４．適当な担体とともに殺虫剤有効量における請求項２９ないし３３の何れか 一項記載の組換え微生物を含む殺昆虫性組成物(entomocidal composition)。 ３５．適当な担体とともに殺虫剤有効量における請求項１５ないし２３の何れか 一項記載の単離されたタンパク質分子を含む殺昆虫性組成物。 ３６．毒素タンパク質をコード化するＤＮＡの少なくとも１種を含む形質転換植 物であって、上記毒素タンパク質が、サブシーケンスＡ（配列番号：３）、サブ シーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９）、サブシ ーケンスＢ’（配列番号：１０）、ならびにサブシーケンスＡ（配列番号：３） 、サブシーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９）お よび／またはサブシーケンスＢ’（配列番号：１０）の組合せよりなる群から選 択される配列からなり、上記毒素タンパク質がヘリオチス種に対して活性がある 、形質転換植物。 ３７．請求項１ないし１４の何れか一項記載のＤＮＡ分子を含む形質転換された 植物。 ３８．請求項２４ないし２８の何れか一項記載の組換えＤＮＡ分子により形質転 換されているトランスジェニック植物。 ３９．請求項２８記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換されている請求項３８ に記載のトランスジェニック植物。 ４０．請求項１ないし１４の何れか一項記載のＤＮＡ分子 を含む形質転換された植物細胞。 ４１．請求項２４ないし２８の何れか一項記載の組換えＤＮＡ分子により形質転 換された植物細胞。 ４２．請求項２８に記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換されている請求項４ １に記載の形質転換された植物細胞。 ４３．花粉細胞または接合体である請求項４０ないし４２の何れか一項記載の形 質転換された植物細胞。 ４４．植物および植物細胞がそれぞれ、トウモロコシ、小麦、大麦、イネ、タバ コ、綿および大豆よりなる群から選択された請求項３６ないし３９の何れか一項 記載の形質転換植物または植物細胞。 ４５．それぞれ、トウモロコシ植物およびトウモロコシ植物からの細胞である、 請求項４４に記載の形質転換された植物または植物細胞。 ４６．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型の毒素タンパク質をコード化する単離されたＤＮＡ 分子を製造する方法であって、 （ａ）バチルス・チュリンジエンシス，クルスタキ変種（Bacillus thurigien sis var．kurstaki）からＤＮＡ全体を分離すること； （ｂ）適当な宿主有機体中にゲノムＤＮＡライブラリーを作ること； （ｃ）適当なプローブ分子により前記ライブラリーをプ ローブすること； （ｄ）ブローブ分子とハイブリダイズするクローンを単離すること； （ｅ）その殺虫剤活性について前記クローンをプローブすることからなる方法 。 ４７．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型のタンパク質の単離されたタンパク質分子を製造す る方法であって （ａ）請求項２４ないし２８の何れか一項記載の組換えＤＮＡにより適当な宿 主有機体を形質転換し； （ｂ）この形質転換された宿主有機体を適当な培地で生育させ；そして （ｃ）毒素遺伝子が発現されたとき形質転換された宿主有機体により生成され た組換えタンパク質生成物を単離することからなる方法。 ４８．請求項２４ないし２７の何れか一項記載の組換えＤＮＡにより上記微生物 を形質転換することからなる組換え微生物を製造する方法。 ４９．植物および植物細胞をそれぞれ、請求項２４ないし２８の何れか一項記載 の組換えＤＮＡによって形質転換することからなる請求項３６ないし４５の何れ か一項記載のトランスジェニック植物または植物細胞を製造する方法。 ５０．適当な担体とともに、請求項２９ないし３３の何れ か一項記載の組換え微生物、あるいは請求項１５ないし２３の何れか一項記載の 単離されたタンパク質分子を殺虫剤有効量で混合することからなる請求項３４ま たは３５の何れか一項記載の殺昆虫性組成物を製造する方法。 ５１．請求項３４または３５の何れか一項記載の殺昆虫性組成物を植物または該 植物の生育区域に施用することからなる昆虫の有害生物に起因する損傷に対し植 物を保護する方法。 ５２．請求項１５ないし２３の何れか一項記載の毒素タンパク質を植物に施用す ることからなる昆虫の有害生物に起因する損傷に対して植物を保護する方法。 ５３．昆虫の有害生物が発生するであろう区域内に、請求項３６ないし３９およ び４４ないし４５の何れか一項記載の植物を栽培することからなる上記昆虫の有 害生物に起因する損傷に対して植物を保護する方法。 ５４．昆虫である有害生物に起因する損傷に対して植物を保護するための請求項 ３４または３５に記載の殺昆虫性組成物の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 9636−4Ｈ Ａ０１Ｎ 63/00 Ａ // Ａ０１Ｎ 63/00 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/325 Ｃ０７Ｋ 14/325 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＵ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヘリオチス種（Heliothis species）に対して活性があるが、スポドプテ ラ・エクシグア（Spodoptera exigua）に対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型の 毒素タンパク質をコード化する単離されたＤＮＡ分子。 ２．サブシーケンスＡ（Sub-Sequence A）（配列番号(SEQ ID NO)：３）およ びサブシーケンスＢ（配列番号：４）よりなる群から選択される配列からなり、 そしてヘリオチス種に対して活性がある、毒素タンパク質をコード化する請求項 １に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ３．上記毒素タンパク質がサブシーケンスＡ（配列番号：３）およびサブシー ケンスＢ（配列番号：４）の両方を含む請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子 。 ４．サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシーケンスＢ’（配列番 号：１０）よりなる群から選択される配列からなり、そしてヘリオチス種に対し て活性がある、毒素タンパク質をコード化する請求項１に記載の単離されたＤＮ Ａ分子。 ５．上記毒素タンパク質がサブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシ ーケンスＢ’（配列番号：１０）の両方を含む請求項１に記載の単離されたＤＮ Ａ分子。 ６．上記毒性タンパク質が配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するＣｒ ｙＩＥ（ｃ）である、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ７．上記毒素タンパク質が配列番号：８に示されるアミノ酸配列を有するＣｒ ｙＩＥ（ｄ）である、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ８．配列番号：１に示されるヌクレオチド配列を有する請求項６に記載の単離 されたＤＮＡ分子。 ９．配列番号：７に示されるヌクレオチド配列を有する請求項７に記載の単離 されたＤＮＡ分子。 １０．上記毒素タンパク質が組換えタンパク質である請求項１ないし９の何れか 一項記載の単離されたＤＮＡ分子。 １１．植物における発現のために最適化された請求項１ないし１０の何れか一項 記載の単離されたＤＮＡ分子。 １２．トウモロコシにおける発現のために最適化された請求項１１記載の単離さ れたＤＮＡ分子。 １３．毒素タンパク質ＣｒｙＩＥ（ｃ）およびＣｒｙＩＥ（ｄ）の毒性のコアフ ラグメントをそれぞれコード化する請求項６ないし１２の何れか一項記載の単離 されたＤＮＡ分子。 １４．請求項１ないし１３の何れか一項記載の単離されたＤＮＡ分子の何れかの 突然変異体または変種であって、上記ＤＮＡ分子と実質的に同類であり、そして ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して活性を 示さないＣｒｙＩＥ型のタンパク質を生じる、突然変異体または変種。 １５．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型のタ ンパク質の分離されたタンパク質分子。 １６．配列番号：２に示された配列をもつ請求項１５に記載の単離されたタンパ ク質分子。 １７．配列番号：８に示された配列をもつ請求項１５に記載の単離されたタンパ ク質分子。 １８．サブシーケンスＡ（配列番号：３）およびサブシーケンスＢ（配列番号： ４）よりなる群から選択される配列からなり、そしてヘリオチス種に対して活性 がある、単離されたタンパク質分子。 １９．サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシーケンスＢ’（配列番 号：１０）よりなる群から選択される配列からなり、そしてヘリオチス種に対し て活性がある、単離されたタンパク質分子。 ２０．サブシーケンスＡ（配列番号 Ｎｏ：３）およびサブシーケンスＢ（配列 番号 Ｎｏ：４）の両方を含む請求項１８に記載の単離されたタンパク質分子。 ２１．サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサブシーケンスＢ’（配列番 号：１０）の両方を含み、そしてヘリオチス種に対して活性がある、請求項１９ に記載の単離されたタンパク質分子。 ２２．組換えタンパク質である請求項１５ないし２２の何れか一項記載の単離さ れたタンパク質分子。 ２３．請求項１５ないし２２の何れか一項記載の単離されたタンパク質分子の突 然変異体または変種であって、上記タンパク質分子と実質的に同類であり、かつ 依然とし てＣｒｙＩＥ型であるヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エク シグアに対して活性を示さない、突然変異体または変種。 ２４．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型の毒性タンパク質をコード化するＤＮＡ分子からな る組換えＤＮＡ分子。 ２５．請求項２ないし１４の何れか一項記載のＤＮＡ分子の少なくとも１種を含 む組換えＤＮＡ分子。 ２６．キメラＤＮＡ構成物からなり、ヘリオチス種に対して活性があるが、スポ ドプテラ・エクシグアに対して活性を示さないＣｒｙＩＥ型の毒性タンパク質を コード化する上記ＤＮＡ分子が、微生物および／または植物中で操作可能である 発現配列の調節の下にある、請求項２４に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２７．キメラＤＮＡ構成物からなり、請求項２ないし１４の何れか一項記載の上 記ＤＮＡ分子が、微生物および／または植物中で操作可能である発現配列の調節 の下にある、請求項２６に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２８．キメラＤＮＡ構成物からなり、請求項１１または１２の何れか一項記載の 上記ＤＮＡが、植物中で操作可能である発現配列の調節の下にある、請求項２７ に記載の組換えＤＮＡ分子。 ２９．請求項２６ないし２７の何れか一項記載の単離されたＤＮＡ分子の少なく とも１種により形質転換された、 組換え微生物。 ３０．毒素タンパク質をコード化する少なくとも１種のＤＮＡを含む組換え微生 物であって、上記毒素タンパク質が、サブシーケンスＡ（配列番号：３）、サブ シーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９）およびサ ブシーケンスＢ’（配列番号：１０）、ならびにサブシーケンスＡ（配列番号： ３）、サブシーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９ ）および／またはサブシーケンスＢ’（配列番号：１０）の組合せよりなる群か ら選択される配列からなり、上記毒素タンパク質がヘリオチス種に対して活性が ある、組換え微生物。 ３１．上記組換え微生物が、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudo monas）属、カウロバクター（Caulobacter）属、アグメレナム（Agmellenum）属 、リゾビウム（Rhizobium）属および、クラビバクター（Clavibacter）あるいは バキュロウイルスまたは酵母からなる群より選ばれる、請求項２９または３０項 に記載の組換え微生物。 ３２．上記組換え微生物が核多角体病ウイルスであるオートグラフィカ・カリホ ルニカ（Autographica californica）である請求項３１に記載の組換え微生物。 ３３．上記組換え微生物がバチルス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringie nsis）である請求項３１に記載の組換え微生物。 ３４．適当な担体とともに殺虫剤有効量における請求項２９ないし３３の何れか 一項記載の組換え微生物を含む殺昆虫性組成物(entomocidal composition)。 ３５．適当な担体とともに殺虫剤有効量における請求項１５ないし２３の何れか 一項記載の単離されたタンパク質分子を含む殺昆虫性組成物。 ３６．毒素タンパク質をコード化するＤＮＡの少なくとも１種を含む形質転換植 物であって、上記毒素タンパク質が、サブシーケンスＡ（配列番号：３）、サブ シーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９）、サブシ ーケンスＢ’（配列番号：１０）、ならびにサブシーケンスＡ（配列番号：３） 、サブシーケンスＢ（配列番号：４）、サブシーケンスＡ’（配列番号：９）お よび／またはサブシーケンスＢ’（配列番号：１０）の組合せよりなる群から選 択される配列からなり、上記毒素タンパク質がヘリオチス種に対して活性がある 、形質転換植物。 ３７．請求項１ないし１４の何れか一項記載のＤＮＡ分子を含む形質転換された 植物。 ３８．請求項２４ないし２８の何れか一項記載の組換えＤＮＡ分子により形質転 換されているトランスジェニック植物。 ３９．請求項２８記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換されている請求項３８ に記載のトランスジェニック植物。 ４０．請求項１ないし１４の何れか一項記載のＤＮＡ分子 を含む形質転換された植物細胞。 ４１．請求項２４ないし２８の何れか一項記載の組換えＤＮＡ分子により形質転 換された植物細胞。 ４２．請求項２８に記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換されている請求項３ ８に記載の形質転換された植物細胞。 ４３．花粉細胞または接合体である請求項４０ないし４２の何れか一項記載の形 質転換された植物細胞。 ４４．植物および植物細胞がそれぞれ、トウモロコシ、小麦、大麦、イネ、タバ コ、綿および大豆よりなる群から選択された請求項３６ないし３９の何れか一項 記載の形質転換植物または植物細胞。 ４５．それぞれ、トウモロコシ植物およびトウモロコシ植物からの細胞である、 請求項３２に記載の形質転換された植物または植物細胞。 ４６．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型の毒素タンパク質をコード化する単離されたＤＮＡ 分子を製造する方法であって、 （ａ）バチルス・チュリンジエンシス，クルスタキ変種（Bacillus thurigien sis var．kurstaki）からＤＮＡ全体を分離すること； （ｂ）適当な宿主有機体中にゲノムＤＮＡライブラリーを作ること； （ｃ）適当なプローブ分子により前記ライブラリーをプ ローブすること； （ｄ）ブローブ分子とハイブリダイズするクローンを単離すること； （ｅ）その殺虫剤活性について前記クローンをプローブすることからなる方法 。 ４７．ヘリオチス種に対して活性があるが、スポドプテラ・エクシグアに対して 活性を示さないＣｒｙＩＥ型のタンパク質の単離されたタンパク質分子を製造す る方法であって （ａ）請求項２４ないし２８の何れか一項記載の組換えＤＮＡにより適当な宿 主有機体を形質転換し； （ｂ）この形質転換された宿主有機体を適当な培地で生育させ；そして （ｃ）毒素遺伝子が発現されたとき形質転換された宿主有機体により生成され た組換えタンパク質生成物を単離することからなる方法。 ４８．請求項２４ないし２７の何れか一項記載の組換えＤＮＡにより上記微生物 を形質転換することからなる組換え微生物を製造する方法。 ４９．植物および植物細胞をそれぞれ、請求項２４ないし２８の何れか一項記載 の組換えＤＮＡによって形質転換することからなる請求項３６ないし４５の何れ か一項記載のトランスジェニック植物または植物細胞を製造する方法。 ５０．適当な担体とともに、請求項２９ないし３３の何れ か一項記載の組換え微生物、あるいは請求項１５ないし２３の何れか一項記載の 単離されたタンパク質分子を殺虫剤有効量で混合することからなる請求項３４ま たは３５の何れか一項記載の殺昆虫性組成物を製造する方法。 ５１．請求項３４または３５の何れか一項記載の殺昆虫性組成物を植物または該 植物の生育区域に施用することからなる昆虫の有害生物に起因する損傷に対し植 物を保護する方法。 ５２．請求項１５ないし２３の何れか一項記載の毒素タンパク質を植物に施用す ることからなる昆虫の有害生物に起因する損傷に対して植物を保護する方法。 ５３．昆虫の有害生物が発生するであろう区域内に、請求項３６ないし３９およ び４４ないし４５の何れか一項記載の植物を栽培することからなる上記昆虫の有 害生物に起因する損傷に対して植物を保護する方法。 ５４．昆虫である有害生物に起因する損傷に対して植物を保護するための請求項 ３４または３５に記載の殺昆虫性組成物の使用。