DE69534744T2

DE69534744T2 - Neue bacillus thuringiensis gene kodierend für toxine die gegen lepidopstere-schädlinge aktiv sind

Info

Publication number: DE69534744T2
Application number: DE69534744T
Authority: DE
Inventors: Cary Vance Hillsborough KRAMER; Curtis Thomas Chapel Hill CURRIER
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-05-30
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2015-05-31
Also published as: EP0764210B1; JP4038778B2; CA2191978C; EP0764210A1; ATE315650T1; ES2251718T3; NZ285165A; BR9507973A; US5530195A; WO1995034656A1; JPH10502525A; CA2191978A1; DE69534744D1; AU2417795A; DK0764210T3; PT764210E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Toxingene, die aus Bacillus thuringiensis var. kurstaki isoliert werden, die Proteine, die durch die Gene decodiert werden, rekombinante Stämme, die wenigstens eines der neuen Toxingene umfassen, und insektizide Zusammensetzungen, die wenigstens einen der rekombinanten Stämme enthalten, sowie transgene Pflanzen, die wenigstens eines der neuen Toxingene oder deren Derivate umfassen.
Bacillus thuringiensis gehört zur großen Gruppe von Gram-positiven, aeroben, Endosporen-bildenden Bakterien. Anders als andere, sehr eng verwandte Arten von Bacillus, wie zum Beispiel B. cereus oder B. anthracis, erzeugt die Mehrzahl der bislang bekannten Bacillus thuringiensis-Arten im Verlauf ihrer Sporenbildung einen parasporalen Einschlußkörper, der aufgrund seiner kristallinen Struktur allgemein auch als Kristallkörper bezeichnet wird. Dieser Kristallkörper ist aus insektizid aktiven kristallinen Protoxinproteinen zusammengesetzt, den sogenannten δ-Endotoxinen.
Diese Proteinkristalle sind verantwortlich für die Toxizität von Bacillus thuringiensis für Insekten. Das δ-Endotoxin weist seine insektizide Aktivität erst nach oraler Aufnahme des Kristallkörpers auf, wenn letzterer im Darmsaft der Zielinsekten aufgelöst wird. In den meisten Fällen wird die tatsächliche toxische Komponente aus dem Protoxin als Ergebnis von proteolytischer Spaltung freigesetzt, die durch die Wirkung von Proteasen aus dem Verdauungstrakt der Insekten verursacht wird.
Die δ-Endotoxine der verschiedenen Bacillus thuringiensis-Stämme sind durch ihre hohe Spezifität in bezug auf bestimmte Zielinsekten, speziell in bezug auf verschiedene Lepidoptera-, Coleoptera- und Diptera-Larven, und durch einen hohen Aktivitätsgrad gegen diese Larven gekennzeichnet. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von δ-Endotoxinen von Bacillus thuringiensis beruht auf der Tatsache, daß die Toxine harmlos für Menschen, andere Säugetiere, Vögel und Fische sind.
Mit der Einführung der Gentechnik und den daraus resultierenden neuen Möglichkeiten hat das Gebiet der Bacillus thuringiensis-Toxine neuen Schwung erhalten. Zum Beispiel ist bekannt, daß viele natürlich vorkommende Stämme mehr als ein Toxinprotein für Insekten besitzen können, was ein breites Spektrum von insektizider Aktivität dieser Stämme begründen kann. Jedoch ist es mit der Fähigkeit, Bacillus genetisch zu transformieren, möglich, rekombinante Stämme zu schaffen, die ein gewähltes Feld von Toxingenen für Insekten enthalten, die durch Isolierung und Klonierung aus natürlich vorkommenden Quellen erhalten werden. Solche rekombinanten Stämme können hergestellt werden, um jedwedes Spektrum insektizider Aktivität bereitzustellen, das für eine besondere Anwendung gewünscht sein könnte, beruhend auf dem Wissen der insektiziden Aktivität individueller Toxinproteine. Außerdem ist es auch möglich, rekombinante Toxinproteine zu schaffen, die eine gewählte Kombination von Funktionen aufweisen, die zur Steigerung des Grades insektizider Aktivität gegen ein besonderes Insekt oder eine besondere Insektenklasse geschaffen ist, oder das Spektrum von Insekten auszudehnen, gegen die das Toxinprotein aktiv ist.
Die verschiedenen insektiziden Kristallproteine aus Bacillus thuringiensis wurden auf Basis ihres Aktivitätsspektrums und ihrer Sequenzähnlichkeit klassifiziert. Die von Höfte und Whiteley, Microbiol. Rev. 53:242–255 (1989) vorgestellte Klassifikation plazierte die damals bekannten insektiziden Kristallproteine in vier Hauptklassen. Allgemein werden die Hauptklassen durch das Aktivitätsspektrum definiert, wobei die CryI-Proteine aktiv gegen Lepidoptera sind, CryII-Proteine aktiv gegen sowohl Lepidoptera als auch Diptera sind, CryIII-Proteine aktiv gegen Coleoptera sind und CryIV-Proteine aktiv gegen Diptera sind.
Innerhalb jeder Hauptklasse werden die δ-Endotoxine nach Sequenzähnlichkeit gruppiert. Die CryI-Proteine werden typischerweise als 130–140 kDa-Protoxinproteine erzeugt, die proteolytisch gespalten werden, um aktive Toxinproteine mit ca. 60–70 kDa zu erzeugen. Der aktive Teil des δ-Endotoxins sitzt im NH₂-terminalen Anteil des Moleküls voller Länge. Höfte and Whiteley, s.o., klassifzierten die damals bekannten CryI-Proteine in sechs Gruppen, IA(a), IA(b), IA(c), IB, IC und ID. Seit damals wurden auch Proteine charakterisiert, die als CryIE, CryIF, CryIG, CryIH und CryIX klassifiziert werden.
W.J. Moar et al. (Applied and environmental microbiology, Bd. 60(3), Seiten 896–902) beschreiben die insektizide Aktivität des CryIIA-Proteins aus dem NRD-12-Isolat von Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki.
Van Frankenhuyzen et al. (Journal of Invertebrate Pathology, Band 62, Seiten 295–301) vergleichen die insektizide Aktivität von CryIB-, CryIC-, CryID- und CryIE-delta-Endotoxinproteinen aus Bacillus thuringiensis gegen diejenige von CrylA-Toxinen für eine Reihe von Insektenarten.
Honée et al. (Molecular Microbiology, Band 5(11), Seiten 2799–2806) betrifft Bindungsuntersuchungen von Hybridkristallproteinen auf Basis von CryIA(b) und CryIC.
Das Spektrum insektizider Aktivität eines individuellen δ-Endotoxins aus Bacillus thuringiensis neigt relativ eng zu sein, wobei ein gegebenes δ-Endotoxin aktiv gegen nur einige Insekten ist. Spezifität ist das Ergebnis der Effizienz der verschiedenen Schritte, die an der Erzeugung eines aktiven Toxinproteins beteiligt sind, und seiner anschließenden Fähigkeit zur Wechselwirkung mit den Epithelzellen im Verdauungstrakt des Insekts.
Um insektizid zu sein, muß ein δ-Endotoxin zuerst von Insekt aufgenommen, solubilisiert und in den meisten Fällen proteolytisch gespalten werden, um ein aktives Toxin zu bilden. Sobald sie aktiviert sind, binden die δ-Endotoxine an spezifische Proteine, die auf der Oberfläche der Darm-Epithelzellen des Insekts vorhanden sind, durch die Vermittlung einer spezifischen Domäne auf dem Proteintoxin. In allen untersuchten Fällen erfolgt die Bindung des Proteintoxins mit dem Insektendarm immer, wenn Toxizität besteht. Nach der Bindung wird angenommen, daß eine unterschiedliche Domäne des δ-Endotoxins sich selbst in die Zellmembran einfügt, wodurch eine Pore geschaffen wird, die zum osmotischen Riß der Darm-Epithelzelle des Insekts führt. Es wird angenommen, daß die Spezifität des Proteintoxins für besondere Insekten größtenteils durch die Eigenschaften der Bindungsdomäne eines aktivierten δ-Endotoxins bestimmt wird.
Die Größe der Region eines δ-Endotoxins, die zur Bindung an das Bindungsprotein in der Insektendarmzelle erforderlich ist, ist unklar. Schnepf et al. (J. Biol. Chem. 265:20923–20930, 1990) haben gezeigt, daß die Region zwischen den Aminosäuren 332 und 722 wesentlich zur Spezifität von CryIA(c) in bezug auf Heliothis virescens beiträgt, und daß es Untersequenzen innerhalb dieser Region gibt, die additiv zu dieser Spezifität beitragen. Diese Region der Aminosäuren 332 bis 722 erstreckt sich sowohl über die Spezifität-bestimmende "Domäne II" als auch über die die strukturelle Orientierung bestimmende "Domäne III" wie von Li et al. definiert (Nature 353:815–821, 1991). Die Bedeutung der Untersequenzen innerhalb dieser breiten Region wird weiter durch die Befunde von Ge et al. betont (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:4037–4041, 1989), die eine Region von CryIA(a) von den Aminosäuren 332 bis 450 identifizierten, die die Spezifität der Toxiziotät des Proteins für die Seidenraupe (Bombyx mori, Lepidoptera) bestimmten.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Gene, die ein Toxinprotein codieren, und insektizide Zusammensetzungen, die diese umfassen, bereitzustellen.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf neue Toxingene des CryIE-Typs gerichtet, die aus Bacillus thuringiensis var. kurstaki erhältlich sind, wobei die Toxingene ein Toxinprotein vom CryIE-Typ codieren, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist.
Jedes der neuen Toxingene codiert ein Protein mit einer Größe von ca. 130 kDa und ist wirksam gegen Lepidoptera-Insekten. Den neuen Toxingenen wurden die Bezeichnungen CryIE(c) [SEQ ID NO:1] und CryIE(d) [SEQ ID NO:7] gegeben.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere ein isoliertes DNA-Molekül, daß das Toxinprotein CryIE(c) bzw. CryIE(d) codiert und das die in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:7 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist. Ferner ist ein isoliertes DNA-Molekül umfaßt, das trunkiert wurde, um das toxische Kernfragment des Toxinproteins CryIE(c) bzw. CryIE(d) zu codieren.
Auch eingeschlossen in der Erfindung sind die Proteine, die durch CryIE(c) [SEQ ID NO:2] bzw. CryIE(d) [SEQ ID NO:8] erzeugt werden, und/oder das toxische Kernfragment der Toxinproteine.
Die Erfindung umfaßt ferner rekombinante Gene und Proteine, die eine oder mehrere der Untersequenzen der neuen Gene besitzen, die Aktivität gegen Insekten der Gattung Heliothis verleihen.
Es ist somit eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein isoliertes DNA-Molekül bereitzustellen, das ein Toxinprotein codiert, worin das Toxinprotein eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3) und Untersequenz B (SEQ ID NO:4), erhältlich aus CryIE(c), bzw. Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) und Untersequenz B' (SEQ ID NO:10), erhältlich aus CryIE(d), besteht, und wirksam gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist. Auch eingeschlossen sind isolierte DNA-Moleküle, worin das Toxinprotein sowohl Untersequenz A (SEQ ID NO:3) als auch Untersequenz B (SEQ ID NO:4), erhältlich aus CryIE(c), oder sowohl Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) als auch Untersequenz B' (SEQ ID NO:10), erhältlich aus CryIE(d), oder Kombinationen daraus umfaßt. Die durch die DNA-Moleküle codierten Proteine sind auch im Umfang der Erfindung eingeschlossen.
Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung betrifft ein isoliertes DNA-Molekül, das das Toxinprotein CryIE(c) bzw. CryIE(d) codiert, und/oder ein isoliertes DNA-Molekül, das trunkiert wurde, um das toxische Kernfragment der Toxinproteine zu codieren, wobei das DNA-Molekül zur Expression in Pflanzen, aber speziell in Maispflanzen optimiert wurde.
Die Erfindung umfaßt ferner rekombinante Gene und Proteine, die eine oder mehrere der Untersequenzen der erfindungsgemäßen Gene von CryIE-Typ besitzen, aber speziell Untersequenzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3) und Untersequenz B (SEQ ID NO:4), erhältlich aus CryIE(c), oder Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) und Untersequenz B' (SEQ ID NO:10), erhältlich aus CryIE(d), besteht, die Aktivität gegen Insekten der Gattung Heliothis verleihen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das ein DNA-Molekül umfaßt, das ein Toxinprotein des CryIE-Typs codiert, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, aber speziell ein CryIE(c)- und CryIE(d)-Protein wie in SEQ ID NO:2 bzw. SEQ ID NO:8 angegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das ein chimäres Konstrukt umfaßt, worin das DNA-Molekül, das ein Toxinprotein des CryIE-Typs codiert, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, unter der Kontrolle von Expressionssequenzen ist, die funktionsfähig in Mikroorganismen und/oder Pflanzen sind.
Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung sind rekombinante, bioloisch reine mikrobielle Stämme, die mit wenigstens einem der neuen Gene transformiert sind und in insektiziden Formulierungen zur Bekämpfung von Lepidoptera-Insekten verwendet werden können. In einer spezifischen Ausführungsform betrifft die Erfindung Mikroorganismen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Mitgliedern der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Caulobacter, Agmellenum, Rhizobium und Clavibacter besteht; Baculoviren wie zum Beispiel das Kernpolyedervirus Autographica californica, und Hefe, z.B. Saccharomyces, Cryptococcus, Kluveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium.
Die Erfindung betrifft ferner insektizide Zusammensetzungen, die wenigstens eines der neuen Toxinproteine vom CryIE-Typ umfassen, aber speziell ein isoliertes Proteinmolekül mit der SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenz und/oder ein isoliertes Proteinmolekül mit der SEQ ID NO:8 angegebenen Sequenz und/oder ein isoliertes Proteinmolekül, das eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9), Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) und einer Kombination aus Untersequenz A, B, A' und B' besteht, worin das Toxinprotein aktiv gegen Heliothis-Arten ist, in einer insektizid wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine insektizide Zusammensetzung, die einen rekombinanten Mikroorganismus, aber speziell einen rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stamm umfaßt, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form oder ein Derivat oder eine Mutante davon enthält.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung sind Pflanzen, die mit wenigstens einem der neuen Toxingene oder aktiven Fragmenten davon transformiert sind, insbesondere wenn die transformierenden Sequenzen zur Expression in Pflanzen, aber speziell in Maispflanzen, optimiert wurden.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine transformierte Pflanze, die ein DNA-Molekül, das das Toxinprotein CryIE(c) bzw. CryIE(d) oder eine Kombination daraus codiert und die in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:7 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist, und/oder ein DNA-Molekül umfaßt, das trunkiert wurde, um das toxische Kernfragment der Toxinproteine zu codieren.
Die Erfindung betrifft ferner eine transformierte Pflanze, die ein DNA-Molekül umfaßt, das ein Toxinprotein codiert, worin das Toxinprotein eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9), Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) und einer Kombination aus Untersequenz A, B, A' und B' besteht, worin das Toxinprotein aktiv gegen Heliothis-Arten ist.
Bevorzugt innerhalb der Erfindung sind transformierte Pflanzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Mais, Weizen, Gerste, Reis, Tabak, Baumwolle und Sojabohne besteht.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen isolierten DNA-Moleküls oder eines Toxinproteins, das durch das DNA-Molekül codiert wird. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Mikroorganismen und Pflanzen, die das DNA-Molekül umfassen, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung enthalten, ebenso wie Verfahren zur Herstellung insektizider Zusammensetzungen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhalt eines isolierten DNA-Moleküls, das ein Toxinprotein des CryIE-Typs codiert, aber speziell des CryIE(c)- bzw. CryIE(d)-Typs, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Isolieren von Gesamt-DNA aus Bacillus thuringiensis var. kurstaki;
(b) Einrichten einer genomischen DNA-Bibliothek in einem geeigneten Wirtsorganismus;
(c) Sondieren der Bibliothek mit einem geeigneten Sondenmolekül;
(d) Isolieren eines Klons, der mit dem Sondenmolekül hybridisiert; und
(e) Testen des Klons auf insektizide Aktivität.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines isolierten Proteinmoleküls des CryIE-Typs, aber speziell des CryIE(d)- und CryIE(d)-Typs, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das ein chimäres Konstrukt umfaßt, worin das DNA-Molekül, das ein Toyinprotein des CryIE-Typs codiert, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, unter der Kontrolle von Expressionssequenzen ist, die funktionsfähig in dem Wirtsorganismus sind;
(b) Kultivieren des so transformierten Wirtsorganismus in einem geeigneten Medium; und
(c) Isolieren des rekombinanten Proteinprodukts, das durch den transformierten Wirtsorganismus bei Expression des Toxingens erzeugt wird.

Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, das das Transformieren der Pflanze mit einem rekombinanten DNA-Molekül umfaßt, das ein chimäres Konstrukt umfaßt, worin das DNA-Molekül, das ein Toxinprotein des CryIE-Typs codiert, aber speziell des CryIE(c)- bzw. CryIE(d)-Typs, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, unter der Kontrolle von Expressionssequenzen ist, die funktionsfähig in der Pflanze sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Mikroorganismus bereitzustellen, das das Transformieren des Mikroorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül umfaßt, das ein chimäres Konstrukt umfaßt, worin das DNA-Molekül, das ein Toxinprotein des CryIE-Typs codiert, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, unter der Kontrolle von Expressionssequenzen ist, die funktionsfähig in dem Mikroorganismus sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer insektiziden Zusammensetzung, das das Vermischen eines rekombinanten Mikroorganismus oder eines isolierten Proteinmoleküls gemäß der Erfindung in einer insektizid wirksamen Menge mit einem geeigneten Träger umfaßt.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen Schädigung bereitzustellen, die durch Insektenschädlinge verursacht wird, welche das Ausbringen, auf die Pflanze oder das Anbaugebiet, wenigstens eines der erfindungsgemäßen neuen Toxinproteine entweder direkt oder in Form einer insektiziden Zusammensetzung umfaßt, die wenigstens eines der Proteine oder einen rekombinanten Mikroorganismus umfaßt, aber speziell einen rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stamm, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form oder eine Derivat oder eine Mutante davon enthält. In einer weiteren Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße transgene Pflanze in einem Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen Schädigung verwendet werden, die durch einen Insektenschädling verursacht wird, welches das Pflanzen einer erfindungsgemäßen Pflanze innerhalb eines Gebiets umfaßt, in dem der Insektenschädling auftreten kann.
Die Isolierung und Reinigung der neuen Toxingene der vorliegenden Erfindung wird ausführlich in Beispiel 1 beschrieben. Gemäß dem Nomenklaturschema von Höfte und Whiteley, Microbiol. Rev. 53:242–255 (1989), würden die durch die neuen Toxingene der vorliegenden Erfindung codierten Proteine als ein CryIE-Typ klassifiziert und werden hier als CryIE(c) bezeichnet. Die codierende Region des neuen Toxingens (SEQ ID NO:1) erstreckt sich von der Nukleotidbasenposition 196 bis zur Position 3723. Das durch das neue Toxingen CryIE(c) erzeugte Protein hat die als SEQ ID NO:2 offenbarte Sequenz und wird ferner in Beispiel 5 charakterisiert.
Die codierende Region des neuen Toxingens CryIE(d) (SEQ ID NO:7) erstreckt sich von der Nukleotidbasenposition 1 bis zur Position 3528. Das durch das neue Toxingen CryI(d) erzeugte Protein hat die in SEQ ID NO:8 offenbarte Aminosäuresequenz und wird ebenfalls ferner in Beispiel 5 charakterisiert. Die Größe sowohl des CryIE(c)-Proteins (SEQ ID NO:2) als auch des CryIE(d)-Proteins (SEQ ID NO:8) gemäß Ableitung aus ihrer DNA- Sequenz beträgt 130,7 kDa. Dies ist eine ähnliche Größe wie bei anderen bekannten Proteinen vom CryIE-Typ. Trotz der offensichtlichen Größenähnlichkeit zeigt der Vergleich der Aminosäuresequenz der Proteine, die durch die neuen Toxingene codiert werden, mit derjenigen des zuvor angegebenen Proteins vom CryIE-Typ signifikante Unterschiede zwischen den beiden. Die CryIE(c)- und CryIE(d)-Proteine haben nur 81 % Ähnlichkeit mit dem CryIE(a)-Protein und nur 83 % Ähnlichkeit mit dem CryIE(b)-Protein.
Die neuen Toxingene CryIE(c) und CryIE(d) sind zu 99 % identisch miteinander auf der Proteinebene, wobei sie sich in den Aminosäuren nur in den in Tabelle 1 angegebenen Positionen unterscheiden.
Tabelle 1: Unterschiede der Aminosäurezusammensetzung zwischen dem CrvIE(c)-Protein (SEQ ID NO:2) und dem CryIE(d)-Protein (SEQ ID NO:8).
Ein Vergleich der Nukleotidbasensequenz der CryIE(c)- und der CryIE(d)-Gene der vorliegenden Erfindung mit den entsprechenden codierenden Regionen anderer fachbekannter Gene vom CryIE-Typ zeigt signifikante Unterschiede zwischen ihnen. Die CryIE(c)- und CryIE(d)-Gene der vorliegenden Erfindung haben nur 87 % Sequenzidentität mit dem als CryIE(a) bezeichneten bekannten Endotoxingen und nur 85 % Sequenzidentität mit dem als CryIE(b) bezeichneten bekannten Endotoxingen.
Obwohl die CryIE(c)- und CryIE(d)-Proteine der vorliegenden Erfindung eine begrenzte Sequenzähnlichkeit mit anderen bekannten Proteinen vom CryIE-Typ zeigen, weisen sie insektizide Aktivitäten auf, die sich von denjenigen der bekannten Proteine vom CryIE-Typ unterscheiden. Wie nachfolgend in Beispiel 4 und Tabelle 3 gezeigt wird, sind die durch die neuen Toxingene der vorliegenden Erfindung codierten Proteine aktiv gegen das Lepidoptera-Insekt Heliothis virescens. Es ist bekannt, daß zuvor angegebene Proteine vom CryIE-Typ nicht aktiv gegen diesen Insektenschädling sind. Außerdem ist bekannt, daß die zuvor angegebenen Proteine vom CryIE-Typ aktiv gegen des Lepidoptera-Insekt Spodoptera exigua sind, wohingegen die CryIE(c)- und CryIE(d)-Proteine der vorliegenden Erfindung diese Aktivität nicht besitzen.
CryIE(d) besitzt ferner Aktivität gegen Spodoptera frugiperda. Schließlich sind beide CryIE(d)- und CryIE(d)-Proteine aktiv gegen das Insekt Plutella xylostella, wohingegen die zuvor bekannten Proteine vom CryIE-Typ nicht toxisch für dieses besondere Insekt sind.
Die einzigartige insektizide Aktivität der CryIE(c)- und CryIE(d)-Proteine der vorliegenden Erfindung gegen Heliothis virescens ist das Ergebnis der zwei Untersequenzen, die sich in der Region befinden, die die Aminosäurereste 332 bis 622 des Proteins umspannt. Diese Region entspricht Regionen, die in anderen δ-Endotoxinproteinen als verantwortlich für Insektenspezifität ("Domäne II") und strukturelle Orientierung ("Domäne III") identifiziert wurden. Siehe Li et al. (Nature 353:815–821, 1991). Untersequenzen innerhalb dieser Region entsprechen den von Li et al., s.o., beschriebenen Domänen.
Die erste identifizierte Untersequenz, Untersequenz A [SEQ ID NO:3; aus CryIE(c)] und Untersequenz A' [SEQ ID NO:9; aus CryIE(d)], umspannt die Region von Aminosäuren 332 bis 465. Sie ist durch eine geringe Sequenzähnlichkeit zu anderen Toxinproteinen vom CryI-Typ gekennzeichnet, jedoch wird auf Basis der Arbeit von Schnepf et al. angeregt, daß sie additiv die Aktivität gegen Heliothis virescens bestimmt (J. Biol. Chem. 265:20923–20930, 1990). Untersequenz A entspricht auch der die Spezifität bestimmenden "Domäne II" wie von Li et al. beschrieben (Nature 353:815–821, 1991).
Die zweite identifizierte Untersequenz, Untersequenz B [SEQ ID NO:4; aus CryIE(c)] und Untersequenz B' [SEQ ID NO:10; aus CryIE(d)], umspannt die Region von Aminosäuren 466 bis 622. Diese Region ist durch ihre hohe Sequenzähnlichkeit mit der entsprechenden Region gekennzeichnet, die in einem anderen Protein aus Bacillus thuringiensis, CryIA(a), gefunden wird, das so aktiv an Heliothis virescens wie das neue Toxinprotein CryIE(c) oder CryIE(d) ist. Untersequenz B entspricht der "Domäne III" für die strukturelle Orientierung wie von Li et al. beschrieben (Nature 353:815–821, 1991). Die Ähnlichkeit zwischen Untersequenz B in CryIE(c) und der entsprechenden Region CryIA(a) für die zwei Proteine ist nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2: Angleichung der Regionen, die Untersequenz B aus CryIE(c) der vorliegenden Erfindung und CryIA(a) entsprechen.
Prozentuale Ähnlichkeit: 86, prozentuale Identität: 77. Ähnlichkeiten und Identitäten wurden unter Verwendung des GAP-Programms von UWGCG bestimmt.
Die hohe prozentuale Ähnlichkeit (86 %) zwischen der Region der Untersequenz B des neuen Toxinproteins CryIE(c) der vorliegenden Erfindung und der entsprechenden Region des CryIA(a)-Proteins zeigt die konservierte Natur der Region, die Toxizität für Heliothis virescens verleiht. Wenn Untersequenz B des neuen Toxinproteins CryIE(c) der vorliegenden Erfindung mit der entsprechenden Region für das verwandte Protein CryIE(a) verglichen wird, das nicht aktiv gegen Heliothis virescens ist, wird festgestellt, daß die prozentuale Ähnlichkeit nur 63 % beträgt.
Wenn CryIE(d) mit CryIE(c) verglichen wird, unterscheidet sich die Region von Aminosäurerest 466 bis Aminosäurerest 622 von CryIE(d) in nur zwei Aminosäuren. CryIE(d) hat ein Prolin in Position 482 und ein Isoleucin in Position 506, verglichen mit einem Threonin bzw. Methionin für CryIE(c). Diese Unterschiede beeinflussen nicht die prozentuale Ähnlichkeit, so daß Untersequenz B von CryIE(d) auch zu 86 % ähnlich mit der entsprechenden Region des CryIA(a)-Proteins ist.
Die vorliegende Erfindung soll Mutanten und rekombinante oder gentechnisch veränderte Derivate des CryIE(c)-Gens (SEQ ID NO:1) oder CryIE(d)-Gens (SEQ ID NO:7) umfassen. Zum Beispiel ist allgemein bekannt, daß Proteine vom CryI-Typ proteolytisch zu einem toxischen Kernfragment gespalten werden müssen, das das tatsächliche toxische Molekül ist (Höfte und Whiteley, Microbiol. Rev. 53:242–255 (1989)). Daher wird eine trunkierte DNA-Sequenz, die für das toxische Kernfragment des neuen Toxinproteins CryIE(c) und CryIE(d) codiert, als im Umfang der vorliegenden Erfindung befindlich betrachtet. Zusätzlich kann ein rekombinantes Toxinprotein unter Verwendung von fachbekannten Verfahren konstruiert werden, das wenigstens eine der Untersequenzen enthält, die Aktivität gegen Heliothis virescens verleihen, wie angegeben für CryIE(c) [siehe SEQ ID NOS:3 bis 4] oder das verwandte Gen CryIE(d) [SEQ ID NOS:9 bis 10]. Ein solches rekombinantes Protein würde Aktivität gegen Heliothis virescens haben, zusätzlich zu seinen nativen Eigenschaften. Mutanten der CryIE(c)- und der CryIE(d)-Gene der vorliegenden Erfindung sind auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Zum Beispiel können individuelle Nukleotide verändert werden, entweder durch natürliche Prozesse oder durch ortsgerichtete Mutagenese, was wiederum eine Veränderung der Aminosäuresequenz des codierten Proteins schafft. Zusätzlich kann die DNA-Sequenz der Gene entweder in der Form voller Länge oder in trunkierter Form verändert werden, so daß ihre Expression für Pflanzen optimiert wird, wobei die Codonen so gewählt werden, daß sie ein Protein mit der gleichen oder ähnlichen Aminosäuresequenz wie dasjenige erzeugen, das durch die native Form der CryIE(c)- oder CryIE(d)-Gene codiert wird. Andere Modifikationen des neuen Toxingens, die ein Protein mit insektiziden Eigenschaften liefern, die im wesentlichen die gleichen wie diejenigen des CryIE(c)-Proteins (SEQ ID NO:2) oder CryIE(d)-Proteins [SEQ ID NO:8] sind, sind auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Das CryIE(c)-Gen [SEQ ID NO:1] und CryIE(d)-Gen [SEQ ID NO:7] oder die Untersequenzen des Gens, die Spezifität gegen Heliothis virescens verleihen, sind auch nützlich als DNA-Hybridisierungssonde zum Auffinden ähnlicher oder eng verwandter Gene vom CryI-Typ, die aktiv gegen Heliothis virescens in anderen Bacillus thuringiensis-Stämmen sind. Die neuen Gene oder Teile oder Derivate davon können zur Verwendung als Hybridisierungssonde markiert werden, zum Beispiel mit einem radioaktiven Marker, wobei herkömmliche Verfahren verwendet werden. Die markierte DNA-Hybridisierungssonde kann dann in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise verwendet werden.
Die Nützlichkeit der in einem rekombinanten Stamm von Bacillus thuringiensis vorhandenen neuen Toxingene wird in Beispielen 3 und 4 erläutert. Es sollte auch erkannt werden, daß das isolierte neue Toxingen der vorliegenden Erfindung in einen beliebigen mikrobiellen Wirt übertragen werden kann und seine insektiziden Eigenschaften dem Wirt verleihen kann. Alternative Wirte für das neue Toxingen der vorliegenden Erfindung können nach Eignung für Klonierungszwecke, für Zwecke der Charakterisierung der Form und Funktion des Gens oder codierten Proteins, zur Verwendung als Fermentationswirt zur Erhöhung der Produktion des Toxinproteins, für Zwecke der wirksameren Übertragung wenigstens eines der Toxinproteine auf den Zielinsektenschädling oder Einführung des neuen Toxingens in Insektenpathogene wie Baculovirus [ein Kernpolyedervirus], z.B. [Autographica californica], zur Verbesserung ihrer Wirksamkeit ausgewählt werden.
Die neuen Toxingene oder rekombinanten Formen davon können in solche alternativen Wirte unter Verwendung einer Vielzahl fachlich anerkannter Verfahren transformiert werden. Ein solches bevorzugtes Verfahren ist die Elektroporation von mikrobiellen Zellen, wie zum Beispiel durch das von Dower beschriebene Verfahren ( US-PS 5,186,800 ). Ein anderes bevorzugtes Verfahren ist dasjenige von Shurter et al. (Mol. Gen. Genet. 218:117–181 (1989)), das auch in EP-A-O 342 633 offenbart wird, das hier in seiner Gesamtheit eingeführt wird.
Es wird vorgesehen, daß der alternative Wirt auf die Umgebung oder Pflanzen oder Tiere zur Insektenbekämpfung ausgebracht würde. Mikroorganismuswirte können ausgewählt werden, die dafür bekannt sind, die "Phytosphäre" (Phylloplane, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizoplane) einer oder mehrere Kulturpflanzen von Interesse zu besetzen. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, daß sie erfolgreich in der besonderen Umgebung mit den Mikroorganismen vom Wildtyp konkurrieren können, eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens vorsehen können, das das Polypeptidpestizid exprimiert, und wünschenswert einen verbesserten Schutz des Pestizids vor Umweltabbau und Inaktivierung vorsehen können.
Solche Mikroorganismen schließen Bakterien, Algen und Pilze ein. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen wie Bakterien, z.B. Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthobacter, Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes; Pilze, insbesondere Hefe, z.B. Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind solche Bakterienarten der Phytosphäre wie Bacillus spp., Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobion melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli und Azotobacter vinlandii; und Hefearten der Phytosphäre wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine insektizide Zusammensetzung bereit, die als aktiven Bestandteil wenigstens eines der erfindungsgemäßen neuen Toxine oder einen rekombinanten Mikroorganismus umfaßt, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, aber speziell einen rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stamm, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, oder ein Derivat oder eine Mutante davon, zusammen mit einem landwirtschaftlichen Hilfsstoff wie einem Träger, Verdünnungsmittel, Tensid oder ausbringungsfördernden Hilfsstoff. Die Zusammensetzung kann auch eine weitere biologisch aktive Verbindung enthalten. Die Verbindung kann sowohl ein Düngemittel oder Mikronährmitteldonor oder andere Zubereitungen sein, die das Pflanzenwachstum beeinflussen. Sie kann auch ein selektives Herbizid, Insektizid, Fungizid, Bakterizid, Nematozid, Molluskizid oder Mischungen aus mehreren dieser Zubereitungen sein, nach Wunsch zusammen mit weiteren landwirtschaftlich akzeptablen Trägern, Tensiden oder ausbringungsfördernden Hilfsstoffen, die üblicherweise auf dem Formulierungsgebiet eingesetzt werden. Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den Stoffen, die gewöhnlich in der Formulierungstechnologie eingesetzt werden, zum Beispiel natürliche oder regenerierte Mineralstoffe, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Benetzungsmittel, Klebrigmacher, Bindemittel oder Düngemittel.
Die Zusammensetzung kann 0,1 bis 99 Gew.% des aktiven Bestandteils, 1 bis 99,9 Gew.% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und 0 bis 25 % Gew.% eines Tensids umfassen. Der aktive Bestandteil, der wenigstens eines der erfindungsgemäßen neuen Toxine oder einen rekombinanten Mikroorganismus umfaßt, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, aber speziell einen rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stamm, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, oder ein Derivat oder eine Mutante davon, oder die Zusammensetzung, die den aktiven Bestandteil enthält, kann an die zu schützenden Pflanzen oder Kulturpflanzen zusammen mit bestimmten anderen Insektiziden oder Chemikalien (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Canada) ohne Wirksamkeitsverlust verabreicht werden. Er ist kompatibel mit den meisten anderen gewöhnlich verwendeten landwirtschaftlichen Spritzmaterialien, aber sollte nicht in extrem alkalischen Spritzlösungen verwendet werden. Er kann als Staub, Suspension, Spritzpulver oder in jeder anderen materiellen Form, die zur landwirtschaftlichen Ausbringung geeignet ist, verabreicht werden.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Bekämpfung oder Inhibierung von Insektenschädlingen durch Ausbringen eines aktiven Bestandteils, der wenigstens eines der erfindungsgemäßen neuen Toxine umfaßt, oder eines rekombinanten Mikroorganismus, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, oder einer Zusammensetzung, die den aktiven Bestandteil umfaßt, auf (a) eine Umgebung, in der der Insektenschädling auftreten kann, (b) eine Pflanze oder ein Pflanzenteil, um die Pflanze oder das Pflanzenteil vor Schädigung zu schützen, die durch einen Insektenschädling verursacht wird, oder (c) Saatgut bereit, um eine Pflanze, die sich aus dem Saatgut entwickelt, vor Schädigung zu schützen, die durch einen Insektenschädling verursacht wird.
Ein bevorzugtes Verfahren der Ausbringung auf dem Gebiet des Pflanzenschutzes ist die Ausbringung auf das Blattwerk der Pflanzen (Blattausbringung), wobei die Anzahl der Anwendungen und die Aufwandmenge von der zu schützenden Pflanze und dem Befallrisiko durch den fraglichen Schädling abhängt. Jedoch kann der aktive Bestandteil auch die Pflanzen durch die Wurzeln durchdringen (systemische Wirkung), falls der Locus der Pflanzen mit einer flüssigen Formulierung getränkt wird, oder falls der aktive Bestandteil in fester Form im Locus der Pflanzen aufgenommen wird, zum Beispiel im Boden, z.B. in granularer Form (Bodenausbringung). In Reisfeldanbauten können solche Granalien in dosierten Mengen auf das geflutete Reisfeld ausgebracht werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind auch geeignet zum Schutz von Pflanzenvermehrungsmaterial, z.B. Saatgut, wie Früchten, Knollen oder Körnern, oder Pflanzenschnittlingen, vor Insektenschädlingen. Das Vermehrungsmaterial kann mit der Formulierung vor dem Pflanzen behandelt werden: Saatgut kann zum Beispiel vor dem Aussäen gebeizt werden. Der aktive Bestandteil der Erfindung kann auch auf Körner aufgetragen werden (Beschichtung), entweder durch Imprägnieren der Körner mit einer flüssigen Formulierung oder durch deren Beschichtung mit einer festen Formulierung.
Die Formulierung kann auch auf den Pflanzort ausgebracht werden, wenn das Vermehrungsmaterial eingepflanzt wird, zum Beispiel auf die Saatgutfurche während des Säens. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Behandeln von Pflanzenvermehrungsmaterial und derart behandeltes Pflanzenvermehrungsmaterial.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil einen rekombinanten Mikroorganismus umfassen, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthalten, aber speziell einen rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stamm, der wenigstens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, oder ein Derivat oder eine Mutante davon, können in jedem für die Behandlung von Saatgut oder Boden mit bakteriellen Stämmen bekannten Verfahren angewendet werden. Siehe zum Beispiel US-PS 4,863,866 . Die Stämme sind wirksam zur biologischen Kontrolle selbst dann, wenn der Mikroorganismus nicht lebend ist. Bevorzugt ist jedoch die Ausbringung des lebenden Mikroorganismus.
Zielkulturpflanzen zum Schutz innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel die folgenden Arten von Pflanzen:
Getreide (Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum und verwandte Kulturpflanzen), Rübe (Zuckerrübe und Futterrübe), Futtergräser (Knaulgras, Schwingel und dgl.), Steinfrüchte, Kernobst und Beerenobst (Äpfel, Birnen, Pflaumen, Pfirsiche, Mandeln, Kirschen, Erdbeeren, Himbeeren und Brombeeren), Leguminosen (Bohnen, Linsen, Erbsen, Sojabohnen), Ölpflanzen (Raps, Senf, Mohn, Oliven, Sonnenblumen, Kokosnüsse, Rizinus, Kakaobohnen, Erdnüsse), Gurkenpflanzen (Gurke, Eierkürbis, Melonen), Faserpflanzen (Baumwolle, Flachs, Hanf, Jute), Citrusfrüchte (Orangen, Zitronen, Grapefruit, Mandarinen), Gemüse (Spinat, Salat, Spargel, Kohl und andere Brassicae, Zwiebeln, Tomaten, Kartoffeln, Paprika), Lauraceae (Avocados, Karotten, Zimt, Kampfer), Laubbäume und Nadelbäume (z.B. Linden, Eiben, Eichen, Erlen, Pappeln, Birken, Fichten, Lärchen, Kiefern) oder Pflanzen wie Mais, Tabak, Nüsse, Kaffee, Zuckerrohr, Tee, Wein, Hopfen, Bananen und Gummibaum sowie Zierpflanzen (einschließlich Mischpflanzen).
Ein rekombinanter Bacillus thuringiensis-Stamm, der wenigstens eines der neuen Gene in rekombinanter Form enthält, wird normalerweise in Form insektizider Zusammensetzungen ausgebracht und kann auch das zu behandelnde Kulturpflanzengebiet oder die zu behandelnde Pflanze gleichzeitig oder nacheinander mit weiteren biologisch aktiven Verbindungen ausgebracht werden. Diese Verbindungen können sowohl Düngemittel oder Mikronährstoffdonoren oder andere Zubereitungen sein, die das Pflanzenwachstum beein flussen. Sie können ebenfalls selektive Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematozide, Molluskizide oder Mischungen aus mehreren dieser Zubereitungen sein, nach Wunsch zusammen mit weiteren Trägern, Tensiden oder ausbringungsfördernden Hilfsstoffen, die gewöhnlich auf dem Gebiet der Formulierung eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße aktive Bestandteil kann in unmodifizierter Form oder zusammen mit jedem geeigneten landwirtschaftlich akzeptablen Träger verwendet werden. Solche Träger sind Hilfsstoffe, die herkömmlich auf dem Gebiet der landwirtschaftlichen Formulierung eingesetzt werden, und werden deshalb in bekannter Weise zu emulgierbaren Konzentraten, auftragbaren Pasten, direkt spritzfähigen oder verdünnbaren Lösungen, verdünnten Emulsionen, Spritzpulvern, löslichen Pulvern, Stäuben, Granulaten und auch Verkapselungen, zum Beispiel in Polymersubstanzen, formuliert. Wie die Natur der Zusammensetzungen werden die Verfahren der Ausbringung, wie zum Beispiel Versprühen, Atomisieren, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen, gemäß dem beabsichtigten Ziel und den vorherrschenden Umständen ausgewählt. Vorteilhafte Aufwandmengen sind normalerweise ca. 50 g bis 5 kg aktiver Bestandteil (a.i.) pro Hektar ("ha", ca. 2471 Acres), bevorzugt ca. 100 g bis ca. 2 kg a.i./ha. Wichtige Aufwandmengen sind ca. 200 g bis ca. 1 kg a.i./ha und 200 g bis 500 g a.i./ha. Für die Saatgutbeizung sind vorteilhafte Aufwandmengen 0,5 bis 1000 g a.i. auf 100 kg Saatgut, bevorzugt 3 bis 100 g a.i. auf 100 kg Saatgut oder 10 bis 50 g a.i. auf 100 kg Saatgut.
Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den Stoffen, die gewöhnlich in der Formulierungstechnologie eingesetzt werden, zum Beispiel natürliche oder regenerierte Mineralstoffe, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Benetzungsmittel, Klebrigmacher, Bindemittel oder Düngemittel. Die Formulierungen, d.h. die insektiziden Zusammensetzungen, Zubereitungen oder Mischungen, die den rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stamm, der das neue Gen in rekombinanter Form als aktiven Bestandteil enthält, oder Kombinationen daraus mit anderen aktiven Bestandteilen und nach Bedarf einen festen oder flüssigen Hilfsstoff enthalten, werden in bekannter Weise hergestellt, zum Beispiel durch homogenes Vermischen und/oder Mahlen der aktiven Bestandteile mit Streckmitteln, zum Beispiel Lösungsmitteln, festen Trägern und in manchen Fällen oberflächenaktiven Verbindungen (Tensiden).
Geeignete Lösungsmittel sind: aromatische Kohlenwasserstoffe, bevorzugt die Fraktionen, die 8 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, z.B. Xylol-Mischungen oder substituierte Naphthaline, Phthalate wie Dibutyl phthalat oder Dioctylphthalat, aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Cyclohexan oder Paraffine, Alkohole und Glykole und ihre Ether und Ester wie Ethanol, Ethylenglykolmonomethyl- oder -monoethylether, Ketone wie Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel wie N-Methyl-2-pyrrolidon, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid sowie pflanzliche Öle oder epoxidierte pflanzliche Öle wie epoxidiertes Kokosöl oder Sojaöl; oder Wasser.
Die verwendeten festen Träger, z.B. für Stäube und dispergierbare Pulver, sind normalerweise natürliche mineralische Füllstoffe wie Calcit, Talkum, Kaolin, Montmorillonit oder Attapulgit. Zur Verbesserung der physikalischen Eigenschaften ist es auch möglich, hochdispergierte Kieselsäure oder hochdispergierte absorbierende Polymere hinzuzugeben. Geeignete granulierte adsorptive Träger sind poröse Typen, zum Beispiel Bimsstein, gebrochener Ziegelstein, Sepiolit oder Bentonit; und geeignete nichtsorbierende Träger sind Stoffe sie Calcit oder Sand. Zusätzlich kann eine große Anzahl vorgranulierter Stoffe anorganischer oder organischer Natur verwendet werden, z.B. speziell Dolomit oder pulverisierte Pflanzenreste.
Abhängig von der Natur der zu formulierenden aktiven Bestandteile sind geeignete oberflächenaktive Verbindungen nichtionische, kationische und/oder anionische Tenside mit guten Emulgier-, Dispergier- und Benetzungseigenschaften. Der Begriff "Tenside" wird auch so verstanden, daß er Mischungen von Tensiden umfaßt. Geeignete anionische Tenside können sowohl wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische oberflächenaktive Verbindungen sein. Geeignete Seifen sind die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze oder unsubstituierten oder substituierten Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C₁₀-C₂₂), z.B. die Natrium- oder Kaliumsalze von Olein- oder Stearinsäure, oder von natürlichen Fettsäuremischungen, die z.B. aus Kokosöl oder Talgöl erhalten werden können. Weitere geeignete Tenside sind auch die Fettsäuremethyltaurinsalze sowie modifizierte und unmodifizierte Phospholipide.
Häufiger werden jedoch sogenannte synthetische Tenside verwendet, speziell Fettsulfonate, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazol-Derivate oder Alkylarylsulfonate. Die Fettsulfonate oder -sulfate sind gewöhnlich in den Formen von Alkalimetallsalzen, Erdalkalimetallsalzen oder unsubstituierten oder substituierten Ammoniumsalzen und enthalten allgemein einen C_8-22-Alkyl-Rest, der auch die Alkyl-Einheit von Acylresten einschließt, z.B. das Natrium- oder Calciumsalz von Lignosulfonsäure, von Dodecylsulfat oder von einer Mischung von Fettalkoholsulfaten, die aus natürlichen Fettsäuren erhalten werden. Diese Verbindungen umfassen auch die Salze von Schwefelsäureestern und Sulfonsäuren von Fettalkohol/Ethylenoxid-Addukten. Die sulfonierten Benzimidazol-Derivate enthalten bevorzugt zwei Sulfonsäure-Gruppen und einen Fettsäurerest, der ca. 8 bis 22 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele für Alkylarylsulfonate sind die Natrium-, Calcium- oder Triethanolaminsalze von Dodecylbenzolsulfonsäure, Dibutylnaphthalinsulfonsäure oder einem Naphthalinsulfonsäure/Formaldehyd-Kondensationsprodukt. Auch geeignet sind entsprechende Phosphate, z.B. Salze des Phosphorsäureesters eines Addukts von p-Nonylphenol mit 4 bis 14 Molen Ethylenoxid. Nichtionische Tenside sind bevorzugt Polyglykolether-Derivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen oder gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen, wobei die Derivate 3 bis 30 Glykolether-Gruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome in der (aliphatischen) Kohlenwasserstoff-Einheit und 6 bis 18 Kohlenstoffatome in der Alkyl-Einheit der Alkylphenole enthalten.
Weitere geeignete nichtionische Tenside sind die wasserlöslichen Addukte von Polyethylenoxid mit Polypropylenglykol, Ethylendiaminpolypropylenglykol und Alkylpolypropylenglykol, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome in der Alkylkette enthalten, wobei die Addukte 20 bis 250 Ethylenglykolether-Gruppen und 10 bis 100 Propylenglykolether-Gruppen enthalten. Diese Verbindungen enthalten gewöhnlich 1 bis 5 Ethylenglykol-Einheiten pro Propylenglykol-Einheit. Repräsentative Beispiele für nichtionische Tenside sind Nonylphenolpolyethoxyethanole, Rizinusölpolyglykolether, Polypropylen/Polyethylenoxid-Addukte, Tributylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Fettsäureester von Polyoxyethylensorbitan wie Polyoxyethylensorbitantrioleat sind auch geeignete nichtionische Tenside.
Kationische Tenside sind bevorzugt quaternäre Ammoniumsalze, die als N-Substituent wenigstens einen C_8-22-Alkyl-Rest und als weitere Substituenten niedere unsubstituierte oder halogenierte Alkyl-, Benzyloder Hydroxyniederalkyl-Reste enthalten. Die Salze sind bevorzugt in Form von Halogeniden, Methylsulfaten oder Ethylsulfaten, z.B. Stearyltrimethylammoniumchlorid oder Benzyldi-(2-chlorethyl)ethylammoniumbromid.
Die gewöhnlich auf dem Gebiet der Formulierung eingesetzten Tenside werden zum Beispiel beschrieben in "McCutcheons's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Pubblishing Corp. Ridgewood, N.J., 1979; Dr. Helmut Stache, "Tensid Taschenbuch", Carl Hanser Verlag, München/Wien.
Eine andere besonders bevorzugte Eigenschaft einer insektiziden Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist die Persistenz des aktiven Bestandteils nach Ausbringung auf Pflanzen und Boden. Mögliche Ursachen für Aktivitätsverlust schließen Inaktivierung durch UV-Licht, Hitze, Blattausscheidungen und pH ein. Zum Beispiel werden δ-Endotoxin-Kristalle bei hohem pH, insbesondere in Gegenwart von Reduktionsmittel, solubilisiert und somit der proteolytischen Inaktivierung stärker zugänglich. Ein hoher Blatt-pH könnte auch wichtig sein, insbesondere wenn die Blattoberfläche im Bereich von pH 8–10 sein kann. Die Formulierung einer insektiziden Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann diese Probleme ansprechen, indem entweder Additive eingeschlossen werden, um den Verlust an aktivem Bestandteil verhindern zu helfen, oder das Material in einer solchen Weise verkapselt wird, daß der aktive Bestandteil vor Inaktivierung geschützt wird. Die Verkapselung kann chemisch (McGuire und Shasha, J. Econ. Entomol. 85:1425–1433, 1992) oder biologisch (Barnes und Cummings, 1986; EP-A-O 192 319) erreicht werden. Die chemische Verkapselung beinhaltet ein Verfahren, in dem der aktive Bestandteil mit einem Polymer überzogen wird, während die biologische Verkapselung die Expression der δ-Endotoxingene in einer Mikrobe beinhaltet. Für die biologische Verkapselung wird die intakte Mikrobe, die das δ-Endotoxinprotein enthält, als aktiver Bestandteil in der Formulierung verwendet. Die Zugabe von UV-Schutzmitteln könnte wirksam die Strahlungsschädigung reduzieren. Inaktivierung aufgrund von Hitze könnte auch durch Einschließen eines geeigneten Additivs bekämpft werden.
Bevorzugt in der vorliegenden Anmeldung sind Formulierungen, die lebende Mikroorganismen als aktiven Bestandteil umfassen, entweder in Form der vegetativen Zelle oder besonders bevorzugt in Form von Sporen, falls verfügbar. Geeignete Formulierungen können zum Beispiel aus Polymergelen bestehen, die mit mehrwertigen Kationen vernetzt sind und diese Mikroorganismen umfassen. Dies wird zum Beispiel von D.R. Fravel et al., Phytopathology, Bd. 75, Nr. 7, 774–777, 1985, für Alginat als Polymermaterial beschrieben. Es ist auch aus dieser Veröffentlichung bekannt, daß Trägermaterialien zusammen verwendet werden können. Diese Formulierungen werden als Regel durch Vermischen von Lösungen der natürlich vorkommenden oder synthetischen gelbildenden Polymere, zum Beispiel Alginate, und wäßrigen Salzlösungen mehrwertiger Metallionen hergestellt, so daß sich individuelle Tröpfchen bilden, wobei es möglich ist, die Mikroorganismen in einer der zwei oder in beiden Reaktionslösungen zu suspendieren. Die Gelbildung beginnt mit dem Mischen in Tropfenform. Anschließendes Trocknen dieser Gelteilchen ist möglich. Dieser Prozeß wird als ionotrope Gelierung bezeichnet. Abhängig vom Trocknungsgrad werden kompakte und harte Teilchen aus Polymeren gebildet, die strukturell über mehrwertige Kationen vernetzt sind und die Mikroorganismen und einen Träger umfassen, die vorherrschend gleichförmig verteilt vorhanden sind. Die Größe der Teilchen kann bis zu 5 mm sein.
Zusammensetzung auf Basis von teilweise vernetzten Polysacchariden, die zusätzlich zu einem Mikroorganismus zum Beispiel auch feinverteilte Kieselsäure als Trägermaterial umfassen können, wobei die Vernetzung zum Beispiel über Ca⁺⁺-Ionen erfolgt, werden in EP-A1-0 097 571 beschrieben. Die Zusammensetzungen haben eine Wasseraktivität von nicht mehr als 0,3. W.J. Cornick et al. beschreiben in einem Übersichtsartikel [New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, Seiten 345–372, Alan R. Liss, Inc. (1990)] verschiedene Formulierungssysteme, Granalien mit Vermiculit als Träger und kompakte Alginatperlen, die durch das oben erwähnte ionotrope Gelierungsverfahren hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen werden auch offenbart von D.R. Fravel, Pesticide Formulations and Application Systems:11. Band, ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials, Philadelphia 1992, Seiten 173 bis 179, und können zur Formulierung der rekombinanten Mikroorganismen gemäß der Erfindung verwendet werden.
Die insektiziden Zusammensetzungen der Erfindung enthalten gewöhnlich ca. 0,1 bis ca. 99 %, bevorzugt ca. 0,1 bis ca. 95 % und am meisten bevorzugt ca. 3 bis ca. 90 % des aktiven Bestandteils, ca. 1 bis ca.
99,9 %, bevorzugt ca. 1 bis ca. 99 % und am meisten bevorzugt ca. 5 bis ca. 95 % eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und ca. 0 bis ca. 25 %, bevorzugt ca. 0,1 bis ca. 25 % und am meisten bevorzugt ca. 0,1 bis ca. 20 % eines Tensids.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die insektiziden Zusammensetzungen gewöhnlich 0,1 bis 99 %, bevorzugt 0,1 bis 95 % eines rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stammes, der wenigstens eines der neuen Gene in rekombinanter Form enthält, oder eine Kombination daraus mit anderen Bestandteilen, 1 bis 99,9 % eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und 0 bis 25 %, bevorzugt 0,1 bis 20 % eines Tensids.
Während kommerzielle Produkte bevorzugt als Konzentrate formuliert werden, wird der Endverbraucher gewöhnlich verdünnte Formulierungen mit wesentlich geringerer Konzentration einsetzen. Die insektiziden Zusammensetzungen können auch weitere Bestandteile wie Stabilisatoren, Antischaum mittel, Viskositätsregulatoren, Bindemittel, Klebrigmacher sowie Düngemittel oder andere aktive Bestandteile enthalten, um spezielle Wirkungen zu erhalten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung betrifft transgene Pflanzen, die wenigstens eines der erfindungsgemäßen neuen Toxingene umfassen. Eine Wirtspflanze, die die neuen Toxingene der Erfindung exprimiert, wird eine gesteigerte Resistenz gegen Insektenbefall aufweisen und wird somit besser ausgerüstet sein, um Ertragsverlusten zu widerstehen, die mit einem solchen Befall verbunden sind.
Mit Pflanze ist jede Pflanzenart gemeint, die genetisch durch fachbekannte Verfahren transformiert werden kann. Fachbekannte Verfahren zur Pflanzentransformation werden nachfolgend erörtert. Wirtspflanzen schließen ohne Beschränkung diejenigen Arten ein, die zuvor als Zielkulturpflanzen aufgeführt wurden.
Es wurde festgestellt, daß sich die Codonverwendung eines nativen Bacillus thuringiensis-Toxingens signifikant von derjenigen unterscheiden, die typisch für ein Pflanzengen ist. Insbesondere unterscheidet sich die Codonverwendung eines nativen Bacillus thuringiensis-Gens sehr stark von derjenigen eines Maisgens. Als Ergebnis mag die mRNA aus diesem Gen nicht effizient verwendet werden. Die Codonverwendung könnte die Expression von Genen auf der Ebene der Translation oder Transkription oder mRNA-Reifung beeinflussen. Zur Optimierung eines Toxin-Gens zur Expression in Pflanzen, zum Beispiel in Mais, wird die Codonverwendung durch Verwendung der Codonen optimiert, die am meisten bevorzugt in Mais (Mais-bevorzugte Codonen) in der Synthese eines synthetischen Gens sind, das das gleiche Protein codiert, wie es für die native Toxingensequenz gefunden wird. Die optimierte Mais-bevorzugte Codonverwendung ist wirksam zur Expression hoher Mengen des insektiziden Bt-Proteins. Weitere Einzelheiten zur Konstruktion von Mais-optimierten synthetischen Toxingenen können in WO 93/07278 gefunden werden, das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird.
Aus Mikroorganismen stammende Toxingene können sich auch von Pflanzengenen unterscheiden. Pflanzengene unterscheiden sich von Genen, die in Mikroorganismen gefunden werden, indem ihre transkribierte RNA keine definierte Ribosombindungsortsequenz besitzt, die benachbart zum einleitenden Methionin ist. Entsprechend können mikrobielle Gene durch den Einschluß einer eukaryontischen Consensus-Translationsstartsequenz am ATG verstärkt werden. Clontech (1993/1994 Katalog, Seite 210) hat die Sequenz GTCGACCATGGTC (SEQ ID NO:5) als Consensus-Translationsinitiator für die Expression des E. coli uidA-Gens in Pflanzen vorgeschlagen. Ferner hat Joshi (Nucl. Acids Res. 15:6643–6653 (1987)) viele pflanzliche Sequenzen, die zum ATG benachbart sind, verglichen und die Consensus-Sequenz TAAACAATGGCT (SEQ ID NO:6) vorgeschlagen. In Situationen, in denen Schwierigkeiten in der Expression mikrobieller ORFs in Pflanzen angetroffen werden, kann der Einschluß einer dieser Sequenzen am einleitenden ATG die Translation verbessern. In solchen Fällen mögen die letzten drei Nukleotide der Consensus-Sequenz nicht geeignet zum Einschluß in der modifizierten Sequenz aufgrund ihrer Modifikation des zweiten AA-Restes sein. Bevorzugte Sequenzen, die benachbart zum einleitenden Methionin sind, können sich zwischen unterschiedlichen Pflanzenarten unterscheiden. Durch Prüfen der Sequenz von Maisgenen, die in der GenBank/EMBL-Datenbank vorhanden sind, kann unterschieden werden, welche Nukleotide, die zum ATG benachbart sind, modifiziert werden sollten, um die Translation des in Mais eingeführten Toxingens zu steigern.
Zusätzlich wurde gezeigt, daß die Entfernung von inkorrekten Spleißorten die Expression und Stabilität eingeführter Gene steigern kann. Gene, die aus nicht-pflanzlichen Quellen kloniert und nicht zur Expression in Pflanzen optimiert sind, können Motive enthalten, die in Pflanzen als 5'- oder 3'-Spleißorte erkannt werden. Entsprechend kann der Transkriptionsprozeß vorläufig beendet werden, was trunkierte oder deletierte mRNA erzeugt. Die Toxingene können zur Entfernung dieser inkorrekten Spleißorte unter Verwendung der fachbekannten Techniken manipuliert werden.
Es ist allgemein bekannt, daß viele δ-Endotoxinproteine aus Bacillus thuringiensis tatsächlich als Protoxine exprimiert werden. Diese Protoxine werden in der alkalischen Umgebung des Insektendarms solubilisiert und proteolytisch durch Proteasen zu einem toxischen Kernfragment umgewandelt (Höfte und Whiteley, Microbiol. Rev. 53:242–255 (1989)). Für δ-Endotoxinproteine der CryI-Klasse befindet sich das toxische Kernfragment in der N-terminalen Hälfte des Protoxins. Es liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung, daß Gene, die entweder die Protoxinform voller Länge oder das trunkierte toxische Kernfragment des neuen Toxinproteins codieren, in Pflanzentransformationsvektoren verwendet werden können, um insektizide Eigenschaften auf die Wirtspflanze zu übertragen.
Die rekombinanten DNA-Moleküle können in die Pflanzenzelle in einer Reihe von fachlich anerkannten Wegen eingeführt werden. Die Fachleute werden einsehen, daß die Wahl des Verfahrens vom Typ der Pflanze, d.h. einkeimblättrig oder zweikeimblättrig, auf die zur Transformation abgezielt wird, abhängen könnte. Geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen schließen die Mikroinjektion (Crossway et al., Bio Techniques 4:320–334 (1986)), Elektroporation (Riggs et al., Proc. Natl. Sci. USA 83:5602–5606 (1986), Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., Biotechnology 6:915–921 (1988)), den direkten Gentransfer (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717:2722 (1984)) und die ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen ein, die erhältlich sind von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (siehe zum Beispiel Sanford et al., US-PS 4,945,050 ; und McCabe et al., Biotechnology 6:923–926 (1988)). Siehe auch Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421–477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27–37 (1987) (Zwiebel); Christou et al., Plant Physiol. 87:671–674 (1988) (Sojabohne); McCabe et al., Bio/Technology 6:923–926 (1988) (Sojabohne); Datta et al., Bio/Technology 8:736–740 (1990) (Reis); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305–4309 (1988) (Mais); Klein et al., Bio/Technology 6:559–563 (1988) (Mais); Klein et al., Plant Physiol. 91:440–444 (1988) (Mais); Fromm et al., Bio/Technology 8:833–839 (1990); und Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603–618 (1990) (Mais); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526–8530 (1990) (Tabakchloroplasten); Koziel et al., Biotechnology 11:194–200 (1993) (Mais); Shimamoto et al., Nature 338:274–277 (1989) (Reis); Christou et al., Biotechnology 9: 957–962 (1991) (Reis); EP-A 0 332 581 (Knaulgras und andere Pooideae); Vasil et al., Biotechnology 11:1553–1558 (1993) (Weizen); Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077–1084 (1993) (Weizen); Wan et al., Plant Physiol. 104:37–48 (1994) (Gerste); Umbeck et al., Bio/Technology 5:263–266 (1987) (Baumwolle).
Ein besonders bevorzugter Satz von Ausführungsformen zur Einführung von rekombinanten DNA-Molekülen in Mais durch Mikroprojektilbombardierung kann in WO 93/07278 gefunden werden, das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird. Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist das Protoplastentransformationsverfahren für Mais wie in EP-A-O 292 435 offenbart, hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt.
Ferner umfaßt im Umfang der vorliegenden Erfindung sind transgene Pflanzen, insbesondere transgene fruchtbare Pflanzen, die mittels der zuvor beschriebenen Verfahren transformiert sind, und ihre ungeschlechtliche und/oder geschlechtliche Nachkommenschaft, die noch ein isoliertes DNA-Molekül umfaßt, das ein erfindungsgemäßen Toxinprotein des CryIE-Typs codiert, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist.
Die erfindungsgemäße transgene Pflanze kann eine zweikeimblättrige oder eine einkeimblättrige Pflanze sein. Bevorzugt sind einkeimblättrige Pflanzen der Graminaceae-Familie, die Lolium-, Zea-, Triticum-, Triticale-, Sorghum-, Saccharum-, Bromus-, Oryzae-, Avena-, Hordeum-, Secale- und Setaria-Pflanzen beinhaltet.
Speziell bevorzugt sind transgener Mais, Weizen, Gerste, Sorghum, Roggen, Hafer, Ausläufergräser und Reis.
Unter den zweikeimblättrigen Pflanzen sind hier speziell Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Zuckerrübe, Ölraps und Sonnenblume bevorzugt.
Es versteht sich hier, daß der Ausdruck "Nachkommenschaft" sowohl "ungeschlechtlich" als auch "geschlechtlich" erzeugte Nachkommenschaft von transgenen Pflanzen umfaßt. Diese Definition soll auch alle Mutanten und Varianten einschließen, die mittels bekannter Verfahren wie zum Beispiel Zellfusion oder Mutantenselektion erhältlich sind, und die noch die charakteristischen Eigenschaften der ursprünglich transformierten Pflanze aufweisen, zusammen mit allen Kreuzungs- und Fusionsprodukten des transformierten Pflanzenmaterials.
Eine andere Aufgabe der Erfindung betrifft das Vermehrungsmaterial von transgenen Pflanzen.
Das Vermehrungsmaterial von transgenen Pflanzen wird in bezug auf die Erfindung als jedes Pflanzenmaterial definiert, das geschlechtlich oder ungeschlechtlich in vivo oder in vitro vermehrt werden kann. Besonders bevorzugt im Umfang der vorliegenden Erfindung sind Protoplasten, Zellen, Kalli, Gewebe, Organe, Samen, Embryos, Pollen, Eizellen, Zygoten, zusammen mit jedem anderen Vermehrungsmaterial das aus transgenen Pflanzen erhalten wird.
Teile von Pflanzen wie zum Beispiel Blüten, Stengel, Früchte, Blätter, Wurzeln, die aus transgenen Pflanzen oder ihrer Nachkommenschaft stammen, die zuvor mittels des Verfahrens der Erfindung transformiert wurden und deshalb zumindest teilweise aus transgenen Zellen bestehen, sind auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Die Transformation von Pflanzen kann mit einer einzelnen DNA-Spezies oder multiplen DNA-Spezies (d.h. Co-Transformation) vorgenommen werden, und diese beiden Techniken sind geeignet zur Verwendung mit den neuen Toxingenen der vorliegenden Erfindung.
Verfahren unter Verwendung entweder einer Form von direktem Gentransfer oder Agrobacterium-vermitteltem Transfer werden gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise, mit einem selektierbaren Marker unternommen, der Resistenz gegen ein Antibiotikum (Kanamycin, Hygromycin oder Methotrexat) oder ein Herbizid (Phosphinothricin) bereitstellen kann. Die Wahl des selektierbaren Markers zur Pflanzentransformation ist jedoch nicht kritisch für die Erfindung.
Zahlreiche Transformationsvektoren sind für die Pflanzentransformation verfügbar, und die Gene dieser Erfindung können in Verbindung mit allen solchen Vektoren verwendet werden. Die Selektion des Vektors zur Verwendung wird von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielart für die Transformation abhängen. Für bestimmte Zielarten können unterschiedliche Antibiotika- oder Herbizidselektionsmarker bevorzugt sein. Selektionsmarker, die routinemäßig in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen ein, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleiht (Messing & Vierra, Gene 19:259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184–187 (1983)), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625–631 (1990)), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4:2929–2931, 1984), und das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis et al., EMBO J. 2:1099–1104 (1983).
Viele Vektoren sind zur Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens verfügbar. Diese tragen typischerweise wenigstens eine T-DNA-Randsequenz und schließen Vektoren wie pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)) ein. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das neue Toxingen der vorliegenden Erfindung in einen der binären Vektoren pCIB200 und pCIB2001 zur Verwendung mit Agrobacterium inseriert werden. Diese Vektorkassetten für die Agrobaceterium-vermittelte Transformation können in der folgenden Weise konstruiert werden. pTJS75kan wurde durch NarI-Verdau an pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446–455 (1985)) geschaffen, was das Ausschneiden der Tetracyclinresistenzgens erlaubte, gefolgt von Insertion eines AccI-Fragments aus pUC4K, das ein NPTII trägt (Messing & Vierra, Gene 19:259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184–187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266–276 (1990)). XhoI-Linker wurden an das EcoRV-Fragment von pCIB7 ligiert, das die linken und rechten T-DNA-Ränder, ein pflanzenselektierbares chimäres nos/nptII-Gen und den pUC-Polylinker enthält (Rothstein et al., Gene 53:153–161 (1987)), und das XhoI-verdaute Fragment wurde in SalI-verdautes pTJS75kan kloniert, um pCIB200 zu schaffen (siehe auch EP 0 332 104 , Beispiel 19). pCIB200 enthält die folgenden besonderen Polylinker-Restriktionsorte: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI und SalI. pCIB2001 ist ein Derivat von pCIB200, das durch die Insertion von zusätzlichen Restriktionsorten in den Polylinker geschaffen wird. Besondere Restriktionsorte im Polylinker von pCIB2001 sind EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI und StuI. pCIB2001 hat zusätzlich dazu, daß es diese besonderen Restriktionsorte enthält, auch eine pflanzliche und bakterielle Kanamycinselektion, linke und rechte T-DNA-Ränder für die Agrobacterium-vermittelte Transformation, die aus RK2 stammende trfA-Funktion zur Mobilisierung zwischen E. coli und anderen Wirten und die OriT- und OriV-Funktionen auch aus RK2. Der pCIB2001-Polylinker ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.
Ein zusätzlicher Vektor, der nützlich zu Agrobacterium-vermittelten Transformation ist, ist der binäre Vektor pCIB10, der ein Gen, das Kanamycinresistenz für die Selektion in Pflanzen codiert, und rechte und linke T-DNA-Randsequenzen enthält und Sequenzen aus dem Plasmid pRK252 mit weitem Wirtebereich beinhaltet, die seine Vermehrung in sowohl E. coli als auch Agrobacterium erlauben. Seine Konstruktion wird von Rothstein et al. beschrieben (Gene 53:153–161 (1987)). Verschiedene Derivate von pCIB10 wurden konstruiert, die das Gen für Hygromycin B-Phosphotransferase beinhalten, beschrieben von Gritz et al. (Gene 25:179–188 (1983)). Diese Derivate ermöglichen die Selektion von transgenen Pflanzenzellen auf nur Hygromycin (pCIB743) oder auf Hygromycin und Kanamycin (pCIB715, pCIB717).
Andere Transformationstechniken, die nicht auf Agrobacterium beruhen, die sogenannten direkten Gentransferverfahren, sind auch nützlich zur Einführung des neuen Toxingens der vorliegenden Erfindung, einschließlich Transformation durch Mikroprojektilbombardierung, Protoplastenaufnahme (z.B. PEG und Elektroporation) und Mikroinjektion. Die Wahl des Vektors für dieses Verfahren hängt weitgehend von der bevorzugten Selektion für die transformierte Art ab.
Ein solcher Vektor, der nützlich für direkte Gentransfertechniken in Kombination mit Selektion durch das Herbizid Basta (oder Phosphinothricin) ist, ist pCIB3064. Dieser Vektor beruht auf dem Plasmid pCIB246, das den CaMV 35S-Promotor in operativer Fusion mit dem E. coli/GUS-Gen und den CaMV 35S-Transkriptionsterminator umfaßt, und wird in WO 93/07278 beschrieben, das hier durch Verweis eingeführt wird. Das Gen zur Bereitstellung von Resistenz gegen Phosphinothricin ist das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., EMBO J. 6:2519–2523 (1987)). Dieser Vektor ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.
Ein zusätzlicher Transformationsvektor ist pSOG35, der das E. coli-Gen für Dihydrofolatreduktase (DHFR) als selektierbaren Marker verwendet, der Resistenz gegen Methotrexat verleiht. PCR wurde verwendet, um den 35S-Promotor (–800 bp), Intron 6 aus dem Adhl-Gen aus Mais (–550 bp) [Lou et al., Plant J. 3:393–403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12:3983–4000, 1984] und 18 by aus der untranslatierten GUS-Leitsequenz aus pSOG10 zu amplifizieren [siehe auch Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8447–8451 (1986)]. Ein 250 bp-Fragment, das das E. coli Dihydrofolatreduktase Typ II-Gen codiert, wurde auch durch PCR amplifiziert, und diese zwei PCR-Fragmente wurden mit einem SacI-PstI-Fragment aus pBI221 (Clontech), das das pUC19-Vektorgerüst und den Nopalinsynthaseterminator umfaßte, zusammengesetzt. Die Zusammenfügung dieser Fragmente erzeugte pSOG19, das den 35S-Promotor in Fusion mit der Intron 6-Sequenz, der GUS-Leitsequenz, dem DHFR-Gen und dem Nopalinsynthaseterminator enthält. Austausch der GUS-Leitsequenz in pSOG19 gegen die Leitsequenz aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) erzeugte den Vektor pSOG35. pSOG19 und pSOG35 tragen das pUC-Gen für Ampicillinresistenz und haben HindIII-, SphI-, PstI- und EcoR2-Orte verfügbar zur Klonierung von fremden Sequenzen.
Die neuen Toxingene der vorliegenden Erfindung, entweder als ihre native Sequenz oder als optimierte synthetische Sequenzen wie oben beschrieben, können funktionsfähig an eine Vielzahl von Promotoren zur Expression in Pflanzen fusioniert werden, einschließlich konstitutiver, induzierbarer, zeitlich regulierter, entwicklungsmäßig regulierter, chemisch regulierter, gewebebevorzugter und gewebespezifischer Promotoren, um rekombinante DNA-Moleküle herzustellen, d.h. chimäre Gene. Bevorzugte konstitutive Promotoren schließen die CaMV 35S- und 19S-Promotoren ein [Fraley et al., US-PS 5,352,605 , erteilt am 4. Oktober 1994]. Ein zusätzlich bevorzugter Promotor stammt aus einem der mehreren Actingene, die dafür bekannt sind, in den meisten Zelltypen exprimiert zu werden. Die von McElroy et al. beschriebenen Promotorexpressionskassetten (Mol. Gen. Genet. 231:150–160 (1991)) können leicht zur Expression des neuen Toxingens modifiziert werden und sind besonders geeignet zur Verwendung in einkeimblättrigen Wirten.
Noch ein anderer bevorzugter konstitutiver Promotor stammt aus Ubiquitin, das ein anderes Genprodukt ist, das dafür bekannt ist, sich in vielen Zelltypen anzureichern. Der Ubiquitin-Promotor wurde aus mehreren Arten zur Verwendung in transgenen Pflanzen kloniert (z.B. Sonnenblume – Binet et al., Plant Science 79:87–94 (1991), Mais – Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12:619–632 (1989)). Der Mais-Ubiquitin-Promotor wurde in transgenen einkeimblättrigen Systemen entwickelt, und seine Sequenz und Vektoren, die für die einkeimblättrige Transformation konstruiert werden, werden in EP 0 342 926 offenbart. Der Ubiquitin-Promotor ist geeignet zur Expression des neuen Toxingens in transgenen Pflanzen, speziell in einkeimblättrigen Pflanzen.
Gewebespezifische oder gewebebevorzugte Promotoren, die nützlich zur Expression des neuen Toxingens in Pflanzen sind, insbesondere in Mais, sind diejenigen, die die Expression in Wurzel, Mark, Blatt oder Pollen ausrichten. Solche Promotoren werden in WO 93/07278 offenbart, das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird. Chemisch induzierbare Promotoren, die nützlich zur Ausrichtung der Expression des neuen Toxingens in Pflanzen sind, werden ein EP-A-O 332 104 offenbart, das hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt wird.
Zusätzlich zu Promotoren sind auch eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren zur Verwendung in der chimären Genkonstruktion unter Verwendung des neuen Toxingens der vorliegenden Erfindung verfügbar. Transkriptionsterminatoren sind verantwortlich für die Termination der Transkription über das Transgen hinaus und für seine korrekte Polyadenylierung. Geeignete Transkriptionsterminatoren und diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie in Pflanzen funktionieren, schließen den CaMV 35S-Terminator, den tml-Terminator, den Nopalinsynthaseterminator, den rbcS E9-Terminator aus Erbse und andere fachbekannte ein. Diese können sowohl in einkeimblättrigen als auch in zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet werden.
Es wurde auch festgestellt, daß zahlreiche Sequenzen die Genexpression aus der Transkriptionseinheit heraus steigern, und diese Sequenzen können in Verbindung mit dem neuen Toxingen dieser Erfindung verwendet werden, um ihre Expression in transgenen Pflanzen zu erhöhen.
Es wurde gezeigt, daß verschiedene Intronsequenzen die Expression steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß die Introns des Adhl-Gens aus Mais signifikant die Expression des Gens vom Wildtyp unter seinem erkennenden Promotor bei Einführung in Maiszellen steigern (Callis et al., Genes Develop. 1:1183– 1200 (1987)). Intronsequenzen werden routinemäßig in Pflanzentransformationsvektoren eingeführt, typischerweise mit der nicht-translatierten Leitsequenz.
Eine Anzahl nicht-translatierter Leitsequenzen, die aus Viren stammen, sind auch für die Steigerung der Expression bekannt, und diese sind besonders wirksam in zweikeimblättrigen Zellen. Spezifisch wurde gezeigt, daß Leitsequenzen aus dem Tabakmosaikvirus (TMV, die "Ω-Sequenz"), aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) und aus dem Luzernemosaikvirus (AMV) wirksam in der Steigerung der Expression sind (z.B. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:8693–8711 (1987); Skuzeski et al., Plant. Molec. Biol. 15; 65–79 (1990)).
Kurze Beschreibung der Figur
1. SDS-PAGE-Analyse der CryIE(c)- und CryIE(d)-Proteine, die individuell in den rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stämmen CGB311 bzw. CGB313 exprimiert werden.
Bahn 1, Molekulargewichtsmarker; Bahn 2 CGB311 5 1; Bahn 3, CGB313 10 1; Bahn 4 CGB311 20 1; 5, Molekulargewichtsmarker; 6, Molekulargewichtsmarker; Bahn 7, CGB313 5 1; Bahn 8 CGB313 10 1; Bahn 9, CGB313 20 1; Bahn 10 Molekulargewichtsmarker.
Beispiele
Die folgenden Beispiele beschreiben weiter die Materialien und Methoden, die in der Durchführung der Erfindung verwendet werden, und die anschließenden Ergebnisse. Sie werden zur Erläuterung angeboten, und ihre Aufführung sollte nicht als Beschränkung der beanspruchten Erfindung betrachtet werden.
Formulierungsbeispiele
Der in den folgenden Formulierungsbeispielen verwendete aktive Bestandteil sind die mit CGB311 und CGB313 bezeichneten rekombinanten Stämme von Bacillus thuringiensis, die pCIB5618 bzw. pCIB5621 enthalten und die neuen Toxingene CryIE(c) bzw. CryIE(d) exprimieren. Sowohl CGB313 als auch CGB311 wurden am 1. Juni 1994 beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA hinterlegt und wurden den Eingangsnummern NRRL B-21274 bzw. NRRL B-21273 zugewiesen.
A1. Spritzpulver

Die Sporen werden sorgfältig mit den Hilfsstoffen vermischt, und die Mischung wird sorgfältig in einer geeigneten Mühle gemahlen, was Spritzpulver liefert, die mit Wasser verdünnt werden können, um Suspensionen der gewünschten Konzentrationen zu ergeben. A2. Emulgierbares Konzentrat

Bacillus thuringiensis-Sporen	10 %
Octylphenolpolyethylenglykolether (4–5 Mole Ethylenoxid)	3 %
Calciumdodecylbenzolsulfonat	3 %
Rizinusölpolyglykolether (36 Mole Ethylenoxid)	4 %
Cyclohexanon	30 %
Xylolmischung	50 %

Emulsionen jeder erforderlichen Konzentration können aus diesem Konzentrat durch Verdünnung mit Wasser erhalten werden.
A3. Stäube
Gebrauchsfertige Stäube werden durch Vermischen des aktiven Bestandteils mit den Trägern und Mahlen der Mischung in einer geeigneten Mühle erhalten. A4. Extrudergranulat

Bacillus thuringiensis-Sporen 10 %

Natriumlignosulfonat 2 %

Carboxymethylcellulose 1 %

Kaolin 87 %
Der aktive Bestandteil oder die Kombination wird mit den Hilfsstoffen vermischt und gemahlen, und die Mischung wird anschließend mit Wasser ange feuchtet. Die Mischung wird extrudiert, granuliert und in einem Luftstrom getrocknet. A5. Überzogene Granalie

Bacillus thuringiensis-Sporen 3 %

Polyethylenglykol (Molekulargewicht 200) 3 %

Kaolin 94 %

Der aktive Bestandteil oder die Kombination wird gleichförmig in einem Mischer auf das mit Polyethylenglykol angefeuchtete Kaolin aufgetragen. Nicht-staubende überzogene Granulate werden auf diese Weise erhalten. A6. Suspensionskonzentrat

Bacillus thuringiensis-Sporen	40 %
Ethylenglykol	10 %
Nonylphenolpolyethylenglykolether (15 Mole Ethylenoxid)	6 %
Natriumlignosulfonat	10 %
Carboxymethylcellulose	1 %
37%ige wäßrige Formaldehyd-Lösung	0,2 %
Siliconöl in Form einer 75%igen wäßrigen Lösung	0,8 %
Wasser	32 %

Der aktive Bestandteil oder die Kombination wird innig mit den Hilfsstoffen vermischt, was ein Suspensionskonzentrat ergibt, aus dem Suspensionen jeder gewünschten Konzentration durch Verdünnung mit Wasser erhalten werden können.
Beispiel 1: Klonierung und Isolierung des neuen Toxingens
Gesamt-DNA wurde aus einem geeigneten Stamm von Bacillus thuringiensis var. kurstaki isoliert. Zur Isolierung von CryIE(c) war der verwendete Stamm CGB316, und für CryIE(d) war der verwendete Stamm CGB323. Eine Kultur des entsprechenden Stamms wurde über Nacht in L-Bouillon bei 25°C mit 150 U/min Schütteln in einer Umlaufschüttelmaschine kultiviert.
Die Kultur wurde dann zentrifugiert und in 8 % Saccharose, 100 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl und 2 mg/ml Lysozym resuspendiert und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. 50 μg/ml Proteinase K und SDS auf eine Endkonzentration von 0,2 % wurden dann hinzugegeben und die resultierende Mischung bei 50°C inkubiert, bis die Lösung sehr viskos wurde. Ein gleiches Volumen von Phenol/Chloroform wurde zur viskosen Mischung gegeben, verwirbelt und zentrifugiert, um die wäßrigen und organischen Phasen zu trennen. Die wäßrige Phase wurde dann mit 1 g/ml CsCl und 150 μg/ml Ethidiumbromid vermischt, in ein 33 ml Nalgene U1traLok-Röhrchen gegeben und mit 45 000 U/min für 16 Stunden in einer Beckman Ti50-Ultrazentrifuge zentrifugiert. Die resultierende DNA-Bande wurde mit einer UV-Lichtquelle visualisiert und mit einer Spritze unter Verwendung einer Nadel mit 16 Gauge entfernt. Kontaminierendes Ethidiumbromid wurde aus der DNA-Probe durch Extraktion mit Isoamylalkohol entfernt. Die isolierte DNA wurde mit 2 Volumina 100 % Ethanol präzipitiert und zentrifugiert. Das resultierende DNA-Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet wurde getrocknet und in 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA resuspendiert.
15 μg der isolierten DNA aus jedem Stamm wurden mit 0,1 Einheiten Sau3A/μg DNA bei 37°C verdaut. 3, 5 und 10 Minuten nach der Zugabe des Restriktionsenzyms wurden 5 μg-Proben aus der Verdaumischung entfernt, EDTA wurde auf eine Endkonzentration von 10 mM hinzugegeben, und sie wurden auf Eis gestellt. Eine Teilmenge jedes zeitlich entfernten Verdaus wurde auf ein 0,8 % Agarosegel unter Verwendung von Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press: New York (1989)) geladen und über Nacht mit 25 V in einem Gelelektrophorese-System IBI Modell MPH laufen gelassen [Kodak, Rochester, New York]. Mit HindIII verdaute Lambda-DNA wurde als Molekulargewichtsmarker für das gelaufene Gel verwendet. Nach Elektrophorese wurden DNA-Fragmente im 6–9 kb-Bereich aus dem Gel geschnitten. DNA wurde aus den Agarosegelscheiben durch Plazieren in eine Nanotrap-Elektroelutionsfalle [ISCO, Lincoln, Nebraska] und unter Verwendung eines ISCO Little Blue Tank [ISCO, Lincoln, Nebraska] mit einem Puffersystem und Strom unter Verwendung des vom Lieferanten der Vorrichtung beschriebenen Verfahrens elektroeluiert. Nach der Elektroelution wurde die isolierte DNA durch Zugabe von 1/10 Volumina 3M Natriumacetat pH 4,8, 2,5 Volumina 100 % Ethanol präzipitiert und dann zentrifugiert. Das resultierende DNA-Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde getrocknet und in 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA resuspendiert.
Ligation in pUC19 [New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA] der isolierten DNA-Fragmente mit Größen von 6–9 kb erfogte unter Verwendung von 4 μl der obigen DNA-Lösung, 1 μl einer 100 ng/ml-Lösung von pUC19, die zuvor mit BamHI verdaut und mit alkalischer Kälberphosphatase behandelt worden war, 1 μl 10X Ligationspuffer, 3 μl Wasser und 1 μl, das 3 Einheiten T4-Ligase enthielt. Die Mischung wurde bei 15°C über Nacht inkubiert. Die resultierenden pUC19-basierten Plasmide, die die inserierten DNA-Fragmente enthalten, isoliert aus dem Bacillus thuringiensis-Stamm, wurden in E. coli DHSα-kompetente Zellen [Stratagene, LaJolla, Kalifornien, USA] trans formiert. Dies wurde durch Kombinieren der Ligationsmischung mit 200 μl bakterieller Zellen, Stellen auf Eis für 1–2 Stunden und anschließendes Erwärmen auf 42°C für 90 Sekunden erreicht. Nach der Behandlung wurde die bakterielle Lösung mit 200 μl SOC-Medium (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press: New York (1989)) vermischt, für 45 Minuten bei 37°C aufbewahrt und auf L-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, zur Selektion auf Transformanten ausplattiert. Die Platten wurde über Nacht bei 37°C inkubiert.
Aus der Übernachtinkubation hervorgehende transformierte Kolonien wurden dem Koloniehybridisierungsverfahren wie in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press: New York (1989), beschrieben unterworfen. Kurz gesagt wurde ein 85 mm Nitroplus 2000-Filterkreis [Micron Separations, Westboro, Massachusetts, USA] auf jede Agarplatte plaziert, die transformierte Kolonien enthielt, und dann abgehoben. Nach Entfernung des Filters wurden die Platten erneut bei 37°C gehalten, bis wieder transformierte Kolonien sichtbar waren. Die Filter mit den Kolonien auf ihnen wurden zur Freisetzung von DNA aus den bakteriellen Zellen zuerst auf mit 10 % SDS gesättigtem Whatman-Papier, dann 0,5 N NaOH-1,5 M NaCl, dann 1,5 M NaCl-0,5 M Tris pH 7,4 für jeweils 3 Minuten behandelt. Die Filter wurden dann mit 2X SSC behandelt, und die freigesetzte bakterielle DNA wurde an die Filter durch UV-Vernetzung unter Verwendung eines Stratalinker (Stratagene) mit 0,2 mit fixiert.
Ca. 6 Platten mit 100–200 Kolonien/Platte wurden für die aus jedem Stamm von Bacillus thuringiensis isolierten DNA-Fragmente durchgeführt. Vorhybridisierung und Hybridisierung der Filter wurde in einer Lösung aus 10X Denhardt-Lösung [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press: New York (1989)], 150 g/ml gescherter Lachssperma-DNA, 1 % SDS, 50 mM Natriumphosphat pH 7, 5 mM EDTA, 6X SSC, 0,05 % Natriumpyrophosphat, durchgeführt. Vorhybridisierung erfolgte bei 65°C für 4 Stunden, und Hybridisierung erfolgte bei 65°C für 18 h mit 1 Millionen cpm/ml einer ³²P-dCTP-markierten Sonde in einem Volumen von 50 ml. Radiomarkierte DNA-Sonden wurden unter Verwendung eines BRL-Polypriming-Markierungssystems [GIBCO-BRL, Grand Island, New York, USA] hergestellt und nicht aufgenommene Impulse unter Verwendung von Nick-Säulen (Pharmacia) entfernt.
Filter wurden mit einem durch Polymerasekettenreaktion erzeugten radiomarkierten CryIB-Fragment sondiert. Das erzeugte Fragment umspannt die Region von 461–1366 by des CryIB-Gens. Hybridisierungssonden wurden für 5 min vor Zugabe zur Hybridisierungslösung gekocht. Die Filter wurden zweimal in 50 ml 2X SSC, 0,5 % SDS bei 65°C für 20 Minuten gewaschen. Die sondierten und gewaschenen Filter wurden mit Kodak X-Omat AR Röntgenfilm mit Dupont Cronex Lightning Plus-Intensivierungsschirmen bei –80°C belichtet. Diejenigen Kolonien, die gemäß Hybridisierung positiv waren, wurden identifiziert und aus den erneut kultivierten Platten gepickt. Gepickte Kolonien wurden auf L-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin ausgestrichen. Plasmid-DNA wurde aus jeder ausgestrichenen Kultur unter Verwendung des alkalischen Miniprep-Verfahrens isoliert, das beschrieben wird in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press: New York (1989).
Mit CGE5618 [die das Gen für CryIE(c) tragen] und CGE5621 [die das Gen für CryIE(d) tragen] bezeichnete Klone wurden isoliert. Beide Klone enthielten ein rekombinantes Plasmid, von dem durch das obige Verfahren gezeigt wurde, daß es ein aus dem Bacillus thuringiensis-Stamm CGB316 (CryIE(c)-Gen) und CGB323 (CryIE(d)-Gen) isoliertes DNA-Fragment besitzt, das positiv mit der CryIB-Sonde hybridisiert.
Das aus den geeigneten Bacillus thuringiensis-Stämmen isolierte und in den oben bezeichneten rekombinanten Plasmiden enthaltene DNA-Fragment wurde in pHT3101 re-kloniert [Arantes et al., Gene 108, 115–119, 1991], einen Shuttle-Vektor, der die Plasmidmanipulation in entweder E. coli oder Bacillus thuringiensis erlaubt. pHT3101 ist aus pUC18, einem Bt-Replikon und einem Erythromycin-Gen zur Selektion in Bt zusammengesetzt (Lereclus et al., FMS Microbiology Letters 60:211–218, 1989). Das rekombinante Plasmid, das die klonierte DNA aus Bacillus thuringiensis enthält, wurde aus den E. coli-Zellen unter Verwendung von Standardverfahren isoliert (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press: New Yorik (1989)). Zur Entfernung der klonierten Bacillus thuringiensis-DNA aus dem rekombinanten Plasmid wurde das isoleirte Plasmid aus jedem Klon mit den Restriktionsenzymen SacI und BbuI verdaut. Die Verdauungsmischungen wurden dann auf ein 1 % SeaPlaque^®-Agarosegel unter Verwendung eines TBE-Puffersystems geladen und über Nacht bei 25 V elektrophoretisch behandelt. Nach der Elektrophorese wurde ein DNA-Fragment mit einer Größe von ca. 7 kb aus dem Gel unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren isoliert. Das aus dem Gel isolierte DNA-Fragment wurde in pHT3101 unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens ligiert, indem 5 μl des geschmolzenen (65°C) Agarosefragments und 4 μl von 10 ng/μl von pHT3101 kombiniert wurden.
Die aus dem Stamm CGB316 isolierte und in pHT3101 ligierte Bacillus thuringiensis-DNA wurde mit pCIB5618 bezeichnet. Der E. coli-Stamm, der Plasmid pCIB5618 enthält, wurde mit CGE5618 bezeichnet. Die aus dem Stamm CGB323 isolierte und in pHT3101 ligierte DNA wurde mit pCIB5621 bezeichnet. Der E. coli-Stamm, der Plasmid pCIB5621 enthält, wurde mit CGE5621 bezeichnet. Sowohl CGE5621 als auch CGE5618 wurden am 1. Juni 1994 beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA hinterlegt und wurden den Eingangsnummern NRRL B-21276 bzw. NRRL B-21275 zugeordnet.
Beispiel 2: DNA-Sequenzanalyse von neuem Toxingen und Homologie der abgeleiteten Proteinsequenz mit anderen CryI-Genen
Die DNA-Sequenz jedes der neuen Toxingene der vorliegenden Erfindung wurde erhalten, indem zuerst Sequenzierungsprimer unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 380B DNA-Syntheseautomaten synthetisiert wurden. Die Primer wurden dann in den DNA-Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens durchgeführt (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467, 1977). Die Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des Sequenaee-Systems (US Biochemical Corp.) durchgeführt und die Gelanalyse an 40 cm Gelen aus 6 % Polyacrylamid mit 7 M Harnstoff in Tris-Borat-EDTA-Puffer (BRL Gel-Mix 6) durchgeführt. Für CryIE(d) wurde die DNA-Sequenzierung aus einem Applied Biosystem DNA-Sequenzer, Modell 373A gemäß dem vom Hersteller vorgeschlagenen Protokoll erhalten. Die Analyse der Sequenzen erfolgte unter Verwendung der Sequence Analysis Software von der University of Wisconsin Genetic Computer Group (UWGCG) und unter Verwendung des Sequenzierungsprogramms von Gene Codes Corp. (Ann Arbor, Michigan).
Gemäß dem Nomenklaturschema von Höfte und Whiteley, Microbiol. Rev. 53:242–255 (1989), würden die durch die neuen Toxingene codierten Proteine als ein CryIE-Typ klassifiziert werden und wurden hier als CryIE(c) und CryIE(d) bezeichnet. Beide Gene der vorliegenden Erfindung codieren ein Kristallprotein mit 1176 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 130,7 kDa. Die vollständige Nukleotidsequenz jedes isolierten neuen Toxingens wird in SEQ ID NO:1 für CryIE(c) und in SEQ ID NO:7 für CryIE(d) offenbart. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des codierten Proteins CryIE(c) wird in SEQ ID NO:2 offenbart, und das codierte Protein CryIE(d) wird in SEQ ID NO:8 offenbart. Unter Verwendung des in UWGCG verfügbaren FASTA-Programms haben die DNA-Sequenzen der zwei neuen Toxingene der vorliegenden Erfindung 99 % Sequenzidentität. Sowohl CryIE(c) als auch CryIE(d) haben jeweils 87 % Sequenzidentität mit dem bekannten, als CryIE(a) bezeichneten Endotoxingen (GenBank/EMBL, Eingangs-Nr. M73252) und 85 % Sequenzidentität mit dem bekannten Endotoxingen CryIE(b) (GenBank/EMBL Eingangs-Nr. M73252). Die abgeleiteten Proteinsequenzen für sowohl CryIE(c) als auch CryIE(d) haben 83 % Ähnlichkeit mit CryIE(b) und 81 % Ähnlichkeit mit CryIE(a).
Beispiel 3: Transformation von Bacillus thuringiensis mit neuen Toxingenen
Das klonierte Gen für das in den rekombinanten Plasmiden pCIB5618 und pCIB5621 vorhandene neue Toxin wurde in das als CGB234 bezeichnete nichtkristallführende Derivat von Bacillus thuringiensis transformiert. Die Transformation wurde durch das Verfahren von Schuter et al. erreicht (Mol. Gen. Genet. 218:177–181 (1989)), das auch in EP-A-O 342 633 offenbart wird, das hier in seiner Gesamtheit eingeführt wird.
Sporen von CGB324 wurden in 10 ml L-Bouillon geimpft und über Nacht bei 25°C an einer Umlaufschüttelmaschine mit 100 U/min inkubiert. Nach der Inkubation wird die Kultur 50-fach in L-Bouillon verdünnt und weiter bei 30°C an einer Umlaufschüttelmaschine mit 250 U/min inkubiert, bis die Kultur einen OD₅₅₀-Wert von 0,2 erreicht. Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet und in 1/40 Volumen von eiskaltem Elektroporationspuffer (400 mM Saccharose, 1 mM MgCl₂, 7 mM Phosphatpuffer pH 6,0, 20 % Glycerin) resuspendiert. Das Zentrifugieren und die Resuspension der Zellen wird wie oben beschrieben wiederholt. 400 μl der resuspendierten Zellen werden in die Küvette eines Genepulser mit einem 0,4 cm Elektrodenspalt gegeben. Plasmid-DNA wird zu den Zellen in der Küvette gegeben und für 10 Minuten bei 4°C gehalten. Die Plasmid-DNA wird in die Zellen durch Elektroporation unter Verwendung einer Kapazität von 25 F und einer Feldstärke von 1300 V übertragen. Die behandelten Zellen wurden dann für weitere 10 min bei 4°C gehalten, dann mit 1,6 ml L-Bouillon verdünnt und für 4 Stunden bei 30°C an einer Umlaufschüttelmaschine mit 250 U/min inkubiert. Die Zellen wurden dann auf T3-Agar (3 g Trypron, 2 g Tryptose, 1,5 Hefeextrakt, 0,05 g MgCl2, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8) plattiert, das 25 μg/ml Erythromycin enthielt, und bei 30°C für 24–36 Stunden zur Visualisierung von Kolonien inkubiert. Einzelne Kolonien wurden aus den Platten gepickt und auf frisches T3, das Erythromycin enthielt, ausgestrichen und zur Sporenbildung kultiviert. Transformierte Zellen von CGB324, die kristalline Proteinkörper erzeugten, was Indikativ für die Expression der neuen Toxingene ist, wurden mikroskopisch identifiziert.
Der rekombinante Stamm von Bacillus thuringiensis, der pCIB5618 enthält und das neue Toxingen CryIE(c) exprimiert, wurde mit CGB311 bezeichnet. Der rekombinante Stamm Bacillus thuringiensis, der pCIB5621 enthält und das neue Toxingen CryIE(d) exprimiert, wurde mit CGB313 bezeichnet. Sowohl CGB313 als auch CGB311 wurden am 1. Juni 1994 beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA hinterlegt und wurden den Eingangsnummern NRRL B-21274 und NRRL B-21273 zugeordnet.
Beispiel 4: Insekten-Bioassay der in rekombinantem Bacillus thuringiensis exprimierten neuen Toxingene
Insekten-Bioassays wurden durch Zugeben von Sporen/Kristall-Mischungen zu künstlichen Nährstoffzubereitungen durchgeführt. Zum Beispiel wurde geschmolzene künstliche Insektennahrung für die Schwarze Erdeule ("Black Cutworm") in 45 mm-Gellman-Petrischalen mit Schnappverschluß gegossen. Testlösungen von Sporen/Kristall-Mischungen aus dem rekombinanten Bacillus thuringiensis-Stamm CGB311 und CGB313 wurden unter Verwendung von Verdünnungen einer 1 mg/ml Suspension in 0,01 % Triton X-100 hergestellt, die zur Bereitstellung eines Bereichs von Testkonzentrationen für jede Probe entworfen wurden. Nach Verfestigung der geschmolzenen Nahrung wurden 100 μl der entsprechenden Verdünnung von Bt in 0,01 % Triton X-100 über die Oberfläche ausgebreitet, und die Platten wurden luftgetrocknet. 10 Insekten in der ersten Erscheinungsform von Spodoptera exigua (Zuckerrübeneule), S. fugiperda (Asiatischer Baumwollwurm) oder Ostrinia nubilalis (Maiszünsler), die weniger als 24 Stunden alt waren, wurden auf die Nahrungsoberfläche für insgesamt 30 Insekten in der ersten Erscheinungsform für jede untersuchte Konzentration von Sporen/Kristall gesetzt. Der Assay wurde bei 30°C in völliger Dunkelheit für 72 Stunden inkubiert. Die prozentuale Mortalität wurde am Ende des Testzeitraums aufgezeichnet.
Der Assay für Heliothis virescens (Tabakknospenwurm) war ähnlich dem obigen Test mit den folgenden Unterschieden. Costar-Kultur-Cluster mit 24 Vertiefungen wurden mit einer Oberfläche der einzelnen Vertiefung von 2,26 cm² verwendet, und 15 μl der Sporen/Kristall-Verdünnung wurden auf die Oberfläche der verfestigten künstlichen Nahrung aufgetragen. Eine H. virescens-Larve, die weniger als 24 Stunden alt ist, wird in jede Vertiefung für insgesamt 24 Insekten für jede untersuchte Konzentration von Sporen/Kristall gesetzt. Die Vertiefungen wurden mit zwei Stücken Parafilm und einem Stück Teri-Kimwipe^® [Fisher Scientific, Pittsburg, Pennsylvania, USA] bedeckt, um das Entkommen der Insekten aus den Vertiefungen zu verhindern. Der Assay wurde bei 30°C für 72 Stunden inkubiert, worauf die prozentuale Mortalität aufgezeichnet wurde. Die Hintergrundmortalität für alle Tests betrug 0–15 %.
Plutella xylostella-Bioassays wurden durch Aufnehmen von Teilmengen einer 50 mg/ml Sporen/Kristall-Mischung in geschmolzene künstliche P. xyostella-Nahrung (Biever and Boldt, Annals of Entomological Society of America, 1971; Shelton et al., J. Ent. Sci. 26:17) bei einer geeigneten Konzentration durchgeführt. Die 4 ml der gemischten toxischen Nahrung wurden in klare 1 oz.-Kunststoffbecher (Bioserve Produkt #9051) gegossen. Anschließende Verdünnungen wurden durch Zugabe von nicht-toxischer Nahrung auf die frühere Konzentration hergestellt. Sobald die Nahrung abgekühlt war, wurden 5 neugeborene P. xyostella aus einer an die Nahrung angepaßten Laborkolonie in jeden Nahrung enthaltenden Becher gesetzt und dann mit einem weißen Papierdeckel (Bioserve Produkt #9049) abgedeckt. 20 Larven wurden pro Konzentration getestet. Tabletts mit Bechern wurden in einen Inkubator für 3 Tage bei 72°F mit 14:10 (Stunden) hehll:dunkel-Zyklus gesetzt. Die prozentuale Mortalität wurde am Ende des Testzeitraums aufgezeichnet. Die Ergebnisse des Bioassys der neuen Toxine sind nachfolgend in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3: Relative Aktivitäten von neuen Toxinen auf ausgewählte Insekten

+++

= 1 ng/cm² ≤ LC₅₀ ≤ 10 ng/cm²

++

= 10 ng/cm2 ≤ LC₅₀ ≤ 100 ng/cm2

+

= 100 ng/cm2 ≤ LC₅₀ ≤ 1000 ng/cm2

–

= LC₅₀ ≥ 1000 ng/cm²

nv

= Daten nicht verfügbar

1/

= Daten aus Koziel et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Bd. 11, S. 171–228, 1993, Intercept Ltd., Hampshire, UK.

Beispiel 5: SDS-PAGE-Analyse des neuen Toxinproteins
Sporen/Kristall-Vorratslösungen des rekombinanten Stamms CGB311 und CGB331 wurden in 0,1 % X-100 aus lyophilisierten Pulvern hergestellt (20 mg/ml). Eine 100 μl-Portion der Vorratslösung wurde mit 25 μl von 0,4 N NaOH für 5 min bei Raumtemperatur und dann mit 125 μl von 4 % SDS, 20 % Glycerin, 10 % β-Mercaptoethanol, 0,01 % Bromphenolblau und 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8 behandelt (S.M. Brussock und T.C. Currier (1990), Analytical Chemistry of B. thuringiensis. L.A. Hickle und W.L. Fitch, Herausgeber, American Chemical Societey). Diese Lösung wurde dann für 2 min auf 100°C erhitzt. Die Proben wurden für 60 s mit 14 000 g in einer Eppendorf 5415–Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Proben wurden auf ein 4–12 % SDS-PAGE (Novex) aufgetragen und wie vom Hersteller beschrieben laufen gelassen. Gele wurden in 0,2 % Coomassie-Blau, 40 % Methanol und 10 % Essigsäure für 30 min bei Raumtemperatur angefärbt und mit 40 % Methanol, 10 % Essigsäure enfräbt. Die Gele wurden unter Verwendung eines Molecular Dynamics Personal Densitometer abgetastet, und die Daten wurden unter Verwendung von Microsoft Excel analysiert. 1 zeigt eine breite Proteinbande bei dem erwarteten Molekulargewicht auf Basis der abgeleiteten Proteinsequenz für jedes der neuen Toxingene.
Beispiel 6: Transformation von Mais mit dem neuen Toxingen
Die Transformation von Mais mit wenigstens einem der gemäß einem der obigen Verfahren hergestellten neuen Toxingene wird durch Mikroprojektilbombardierung von entweder unreifen zygotischen Embryos oder seriell vermehrungsfähigem embryogenem Kallus vom Typ I mit einem geeigneten Pflanzentransformationsvektor, der die Toxingene umfaßt, erreicht.
6.1 Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren
Zahlreiche Transformationsvektoren sind für die Pflanzentransformation verfügbar, und die Gene dieser Erfindung können in Verbindung mit jedem solchen Vektor verwendet werden. Die Selektion des Vektors zur Verwendung wird von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielart für die Transformation abhängen. Für bestimmte Zielarten können unterschiedliche Antibiotika- oder Herbizid-Selektionsmarker bevorzugt sein. Selektionsmarker, die routinemäßig in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen ein, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleiht (Messing & Vierra, Gene 19:259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184–187 (1983)), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor Appl. Genet. 79:625–631 (1990)), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4:2929–2931), und das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis et al., EMBO J. 2(7):1099–1104 (1983)).
(a) Konstruktion von zur Agrobacterium-Transformation geeigneten Vektoren
Viele Vektoren sind für die Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens verfügbar. Diese tragen typischerweise wenigstens eine T-DNA-Randsequenz und schließen Vektoren wie pBIN19 ein (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Nachfolgend wir die Konstruktion von zwei typischen Vektoren beschrieben.
Konstruktion von pCIB200 und pCIB2001
Die binären Vektoren pCIB200 und pCIB2001 werden zur Konstruktion von rekombinanten Vektoren zur Verwendung mit Agrobacterium verwendet und werden in der folgenden Weise konstruiert. pTJS75kan wird durch NarI-Verdau von pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446–455 (1985)), Zulassen des Ausschneidens des Tetracyclin-Resistenzgens, gefolgt von Insertion eines AccI-Fragments aus pUC4K geschaffen, das ein NPTII trägt (Messing & Vierra, Gene 19:259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184–187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266–276 (1990)). XhoI-Linker werden an das EcoRV-Fragment von pCIB7 ligiert, das die linken und rechten T-DNA-Ränder, ein pflanzenselektierbares chimäres nos/nptII-Gen und den pUC-Polylinker enthält (Rothstein et al., Gene 53:153–161 (1987)), und das XhoI-verdaute Fragment wird in SalI-verdautes pTJS75kan kloniert, um pCIB200 zu schaffen (siehe auch EP 0 332 104 , Beispiel 19 [1338]). pCIB200 enthält die folgenden besonderen Polylinker-Restriktionsorte: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI und SalI. pCIB2001 ist ein Derivat von pCIB200, das durch die Insertion von zusätzlichen Restriktionsorten in den Polylinker geschaffen wird. Besondere Restriktionsorte im Polylinker von pCIB2001 Sind EcoRI, SStI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI und StuI. pCIB2001 hat zusätzlich dazu, daß es diese besonderen Restriktionsorte enthält, auch eine pflanzliche und bakterielle Kanamycinselektion, linke und rechte T-DNA-Ränder für Agrobacteriumvermittelte Transformation, die aus RK2-stammende trfA-Funktion zu Mobilisierung zwischen E. coli und anderen Wirten und die OriT- und OriV-Funktionen auch aus RK2. Der pCIB2001-Polylinker ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.
Konstruktion von pCIB10 und Hygromycin-Selektionsderivaten davon
Die binäre Vektor pCIB10 enthält ein Gen, das Kanamycinresistenz zur Selektion in Pflanzen codiert, rechte und linke T-DNA-Randsequenzen und beinhaltet Sequenzen aus dem Plasmid pRK252 für einen weiten Wirtebereich, was seine Vervielfältigung sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium erlaubt. Seine Konstruktion wird von Rothstein et al. beschrieben, Gene 53: 153–161 (1987). Verschiedene Derivate von pCIB10 wurden konstruiert, die das Gen für Hygromycin B-Phosphotransferase beinhalten, beschrieben von Gritz et al., Gene 25:179–188 (1983)). Diese Derivate ermöglichen die Selektion von transgenen Pflanzenzellen nur auf Hygromycin (pCIB743), oder Hygromycin und Kanamycin (pCIB715, pCIB717) [Rothstein et al., Gene 53: 153–161 (1987)).
(2) Konstruktion von zur Nicht-Agrobacterium-Transformation geeigneten Vektoren
Die Transformation ohne die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens umgeht das das Erfordernis für T-DNA-Sequenzen in dem gewählten Transformationsvektor, und entsprechend können Vektoren, denen diese Sequenzen fehlen, zusätzlich zu Vektoren wie denjenigen verwendet werden, die oben beschrieben wurden, die T-DNA-Sequenzen enthalten. Transformationstechniken, die nicht auf Agrobacterium beruhen, schließen die Transformation über Partikelbombardierung, Protoplastenaufnahme (z.B. PEG und Elektroporation) und Mikroinjektion ein. Die Vektorwahl hängt weitgehend von der bevorzugten Selektion für die transformierte Art ab. Nachfolgend wird die Konstruktion einiger typischer Vektoren beschrieben.
Konstruktion von pCIB3064
pCIB3064 ist ein aus pUC stammender Vektor, der für direkte Gentransfertechniken in Kombination mit Selektion durch das Herbizid Basta (oder Phosphinothricin) geeignet ist. Das Plasmid pCIB246 umfaßt den CaMV 35S-Promotor in operativer Fusion an das E. coli GUS-Gen und den CaMV 35S-Transkriptionsterminator und wird in WO 93/07278 beschrieben. Der 35S-Promotor dieses Vektors enthält zwei ATG-Sequenzen 5' zum Startort. Diese Orte werden unter Verwendung von PCR-Standardtechniken in einer solchen weise mutiert, daß die ATGs entfernt und die Restriktionsorte SspI und PvuII erzeugt werden. Die neuen Restriktionsorte sind 96 und 37 by entfernt vom besonderen SalI-Ort und 101 und 42 by entfernt vom tatsächlichen Startort. Das resultierende Derivat von pCIB246 wird mit pCIB3025 bezeichnet. Das GUS-Gen wird dann aus pCIB3025 durch Verdauung mit SalI und SacI ausgeschnitten, die Enden abgestumpft und religiert, um Plasmid pCIB3060 zu erzeugen. Das Plasmid pJIT82 wird vom John Innes Centre, Norwich erhalten, und dann wird ein 400 by SmaI-Fragment, das das bar-Gen aus Streptomyces viridochromogenes enthält, ausgeschnitten und in den HpaI-Ort von pCIB3060 inseriert (Thompson et al., EMBO J. 6:2519–2523 (1987)). Dies erzeugt pCIB3064, das das bar-Gen unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und einen Terminator zur Herbizidselektion, ein Gen für Ampicillinresistenz (zur Selektion in E. coli) und einen Polylinker mit den besonderen Orten SphI, PstI, HindIII und BamHI umfaßt. Dieser Vektor ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.
Konstruktion von pSOG19 und pSOG35
pSOG35 ist ein Transformationsvektor, der das Gen aus E. coli für Dihydrofolatreduktase (DHFR) als selektierbaren Marker verwendet, der Resistenz gegen Methotrexat verleiht. PCR wird zur Amplifizierung des 35S-Promotors (-800 bp), Intron 6 aus dem Adhl-Gen von Mais (–550 bp) [Lou et al., Plant J. 3:393–403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12:3983–4000, 1984] und 18 by der untranslatierten GUS-Leitsequenz aus pSOG10 verwendet. Ein 250 bp-Fragment, das das Gen aus E. coli für Dihydrofolatreduktase Typ II codiert, wird auch durch PCR amplifiziert, und diese zwei PCR-Fragmente werden mit einem SacI-PstI-Fragment aus pBI221 (Clontech) zusammengesetzt, das das pUC19-Vektorgerüst und den Nopalinsynthase-Terminator umfaßte. Der Zusammenbau dieser Fragmente erzeugte pSOG19, das den 35S-Promotor in Fusion mit der Intron 6-Sequenz, die GUS-Leitsequenz, das DHFR-Gen und den Nopalinsynthase-Terminatur enthält. Austausch der GUS-Leitsequenz pSOG19 gegen die Leitsequenz aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) erzeugte den Vektor pSOG35. pSOG19 und pSOG35 tragen das pUC-Gen für Ampicillinresistenz und weisen HindIII-, SphI-, PstI- und EcoRI-Orte auf, die für die Klonierung von fremden Sequenzen verfügbar sind.
pSOG10
Dieser β-Glucuronidase-(GUS)-Expressionsvektor stammt aus Plasmid pBI121, erworben von Clontech Laboratories, Palo Alto, Kalifornien. Intron 6 aus dem Adhl-Gen aus Mais wird durch PCR aus Plasmid pB428, beschrieben in Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4125–4128 (1987), unter Verwendung der Oligonukleotidprimer SON0003 und SON0004 amplifiziert.

SON0003: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3'
SON0004: 5'-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3'

Das PCR-Reaktionsprodukt wird Restriktionsendonuklease BamHI verdaut, wobei der am 5'-Ende jedes PCR-Primers zugegebene BamHI-Ort gespalten wird. Das resultierende DNA-Fragment wird an einem Agarosegel gereinigt und in den BamHI-Ort von pBI121 ligiert, der zwischen dem CaMV35S-Promotor und dem GUS-Gen ist. Die ligierte DNA wird in E. coli transformiert, und Klone mit dem Adhl-Intron 6 in der gleichen Orientierung wie das GUS-Gen werden werden durch Restriktionsverdau identifiziert.
pSOG19
Dieser Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Expressionsvektor wird durch Fusionieren des 35S-Promotors und Adhl-Intron 6 aus pSOG10 an das DHFR-Gen aus Plasmid pHCO, beschrieben in Bourouis und Jarry, EMBO J. 2:1099–1104 (1983), abgeleitet. Der 35S-Promotor und Adhl Intron 6 werden durch PCR-Amplifikation des Fragments aus pSOG10 unter Verwendung der Primer SON0031 und SON0010 erzeugt.

SON0031: 5'-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3'
SON0010: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'

Das resultierende Fragment wird mit den Restriktionsendonukleasen PstI und BspHI verdaut und an einem Agarosegel gereinigt.
Die codierende DHFR-Region wird durch PCR-Amplifikation von pHCO unter Verwendung der Primer SON0016 und SON0017 erzeugt.

SON0016: 5'-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3'
SON0017: 5'-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3'

Das resultierende Fragment wird den Restriktionsendonukleasen NsoI und SacI verdaut und an einem Agarosegel gereinigt.
Die zwei oben beschriebenen Fragmente werden in ein Vektorfragment ligiert, das aus pBI121 durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen PstI und SacI und Reinigung des 3 kb-Fragments, das die Nos-Terminatorregion und pUC19-Region von pBl121 enthält, an einem Agarosegel hergestellt wurde.
Diese Dreiwege-Ligation fusioniert 35S-Promotor-AdhI-Intron 6-DHFR-Gen-Nos-Terminator in der richtigen Reihenfolge und Orientierung zur funktionellen Expression in Pflanzen.
pSOG30
Dieser GUS-Expressionsvektor stammt aus pSOG10 durch Insertion der Leitsequenz des chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV), beschrieben in Lommel et al., Virology 181:382–385 (1991), in die nicht-translatierte Leitsequenz des 35S-GUS-Gens durch eine Dreiwege-Ligation.
Beide Stränge der 17 by MCMV-Kapsid-Protein-Leitsequenz plus geeignete Restriktionsendonukleaseorte wirden synthetisiert und verschmolzen. Das resultierende doppelsträngige Fragment wird mit BamHI und NcoI verdaut und an einem Acrylamidgel gereinigt.
Die codierende Region des GUS-Gens wird durch PCR unter Verwendung der Primer SON0039 und SON0041 und mit pBI121 als Matrize amplifiziert.

SON0039: 5'-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3'
SON0041: 5'-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'

Diese Primer fügten einen NcoI-Ort an das 5'-Ende von GUS und einen SacI-Ort an das 3'-Ende von GUS. Das resultierende Fragment wird mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und SacI verdaut und an einem Agarosegel gereinigt.
Das GUS-Gen wird aus dem Plasmid pSOG10 durch Verdau mit Restriktionsendonuklease SacI und partiellen Verdau mit Restriktionsendonuklease BamHI entfernt. Der resultierende Vektor, der einen BamHI-Ort und einen SacI-Ort aufweist, in den eine codierende Region hinter das 35S-Promotor-Adhl-Intron 6 reinseriert werden soll, wird an einem Agarosegel gereinigt.
Die drei oben beschriebenen Fragmente werden in einer Dreiwege-Ligation ligiert, um eine Genfusion mit der Struktur: 35S-Promotor – Adhl Intron – MCMV-Leitsequenz – GUS – Nos-Terminator, alle im pUC19-Vektorgerüst, zu erzeugen.
pSOG35
Der selektierbare DHFR-Markervektor ist identisch mit pSOG19, außer daß die MCMV-Leitsequenz in die nicht-tranlsatierte Leitsequenz des DHFR-Gens inseriert wird, um die Translation zu steigern. Er wird in zwei Schritten erzeugt. Zuerst wird die GUS-codierende Region in pSOG32, einen zu pSOG30 identischer Vektor, außer daß er einen modifizierten Adh-Promotor anstelle von 35S enthält, mit der DHFR-codierenden Region aus pSOG19 durch Ausschneiden des GUS mit NcoI und SacI und Ligation in DHFR als NcoI-SacI- Fragment ausgetauscht. Dies führt zum Vektor pSOG33, der die Genstruktur Adh-Promotor – Adhl Intron 6 – MCMV-Leitsequenz – DHFR-codierende Region – Nos-Terminator mit einem BglII-Ort zwischen dem Promotor und Intron und einem SacI-Ort zwischen der codierenden Region und dem Terminator hat. Das BglII-SacI-Fragment wird durch Restriktionsendonukleaseverdau und Agarosegelreinigung isoliert und in die BamHI- und SacI-Orte von pSOG30 ligiert, wobei die Adhl IntronZ6 – MCMV-Leitsequenz – Gus-codierende Region von pSOG30 gegen die Adhl Intron – MCMV-Leitsequenz – DHFR-codierende Region von pSOG33 ersetzt wird.
6.2. Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten
Zur Expression in transgenen Pflanzen beabsichtige Gensequenzen werden zuerst in Expressionskassetten hinter einem geeigneten Promotor und stromaufwärts eines geeigneten Transkriptionsterminators zusammengesetzt. Diese Expressionskassetten können dann leicht auf die oben in Beispiel 6.1. beschriebenen Pflanzentransformationsvektoren übertragen werden.
Promotorselektion
Die Selektion eines in Expressionskassetten verwendeten Promotors wird das räumliche und zeitliche Expressionsmuster des Transgens in der transgenen Pflanze bestimmen. Ausgewählte Promotoren werden Transgene in spezifischen Zelltypen (wie Blatt-Epidermiszellen, Mesophyllzellen, Wurzelkortexzellen) oder in spezifischen Geweben oder Organen (zum Beispiel Wurzeln, Blätter oder Blüten) exprimieren, und diese Selektion wird den gewünschten Ort der Expression des Transgen widerspiegeln. Alternativ kann der ausgewählte Promotor die Expression des Gens unter einem lichtinduzierten oder anderen zeitlich regulierten Promotor antreiben. Eine weitere Alternative besteht darin, daß der ausgewählte Promotor chemisch reguliert wird. Dies würde die Möglichkeit zur Induzierung der Expression des Transgens nur nach Wunsch und verursacht durch Behandlung mit einem chemischen Induktor bereitstellen.
Transkriptionsterminatoren
Eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren sind zur Verwendung in Expressionskassetten verfügbar. Diese sind verantwortlich für die Termination der Transkription über das Transgen hinaus und seine richtige Polyadenylierung. Geeignete Transkriptionsterminatoren und diejenigen, die dafür bekannt sind, in Pflanzen zu funktionieren, schließen den CaMV 355-Terminator, den tml-Terminator, den Nopalinsynthaseterminator und den rbcS E9-Terminator aus der Erbse ein. Diese können sowohl in einkeimblättrigen als auch in zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet werden.
Sequenzen zur Steigerung oder Regulation der Expression
Es wurde festgestellt, daß zahlreiche Sequenzen die Genexpression aus der Transkriptionseinheit heraus steigern, und diese Sequenzen können in Verbindung mit den Genen dieser Erfindung verwendet werden, um ihre Expression in transgenen Pflanzen zu erhöhen.
Es wurde gezeigt, daß verschiedene Intronsequenzen die Expression steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß die Introns des Adhl-Gens aus Mais signifikant die Expression des Gens vom Wildtyp unter seinem erkennenden Promotor bei Einführung in Maiszellen steigern. Intron 1 wird als besonders wirksam festgestellt und steigerte die Expression in Fusionskonstrukten mit dem Chloramphenicolacetyltransferase-Gen (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183–1200 (1987)). Im gleichen experimentellen System hatte das Intron aus dem Bronze 1-Gen aus Mais eine ähnliche Wirkung auf die Steigerung der Expression (Callis et al., s.o.). Intronsequenzen werden routinemäßig in Pflanzentransformationsvektoren eingeführt, typischerweise mit der nichttranslatierten Leitsequenz.
Eine Anzahl von aus Viren stammenden nicht-translatierten Leitsequenzen sind auch für die Steigerung der Expression bekannt, und diese sind besonders wirksam in zweikeimblättrigen Zellen. Spezifisch wurde gezeigt, daß Leitsequenzen aus dem Tabakmosaikvirus (TMV, die "W-Sequenz"), dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) und dem Luzernemosaikvirus (AMV) wirksam in der Steigerung der Expression sind (z.B. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:8693–8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15:65–79 (1990)).
Targeting des Genprodukts innerhalb der Zelle
Verschiedene Mechanismen für das Targeting von Genprodukten sind bekanntermaßen in Pflanzen existent, und die Sequenzen, die das Funktionieren dieser Mechanismen kontrollieren, wurden in einem gewissen Detail charakterisiert. Zum Beispiel wird das Targeting von Genprodukten auf den Chloroplasten durch eine Signalsequenz kontrolliert, die am Aminoterminalen Ende verschiedener Proteine gefunden wird und die während des Chloroplastenimports abgespalten wird, was das reife Protein liefert (z.B. Comai et al., J. Biol. Chem. 263:15104–15109 (1988)). Diese Signalsequenzen können an heterologe Genprodukte fusioniert werden, um den Import heterologer Produkte in den Chloroplasten zu bewirken (van den Broeck et al., Nature 313:358–363 (1985)). DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann aus dem 5'-Ende der cDNAs isoliert werden, die das RUBISCO- Protein, das CAB-Protein, das EPSP-Synthaseenzym, das GS2-Protein und viele andere Proteine codieren, von denen bekannt ist, daß sie im Chloroplasten lokalisiert sind.
Andere Genprodukte sind in anderen Organellen wie dem Mitochondrium und dem Peroxisom lokalisiert (z.B. Unger et al., Plant Molec. Biol. 13: 411–418 (1989)). Die cDNAs, die diese Produkte codieren, können auch manipuliert werden, um das Targeting von heterologen Genprodukten auf diese Organellen zu bewirken. Beispiele für solche Sequenzen sind die kerncodierten ATPasen und spezifischen Aspartataminotransferase-Isoformen für Mitochondrien. Das Targeting auf zelluläre Proteinkörper wurde von Rogers et al. beschrieben, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512–6516 (1985).
Zusätzlich wurden Sequenzen charakterisiert, die das Targeting von Genprodukten auf andere Zellkompartimente verursachen. Amino-terminale Sequenzen sind verantwortlich für das Targeting auf das endoplasmatische Retikulum, den Apoplasten und extrazelluläre Sezernierung aus Aleuronzellen (Koehler & Ho, Plant Cell 2:769–783 (1990)). Zusätzlich sind Aminoterminale Sequenzen in Verbindung mit Carboxy-terminalen Sequenzen verantwortlich für das vakuolare Targeting von Genprodukten (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14:357–368 (1990)).
Durch die Fusion der oben beschriebenen geeigneten Targeting-Sequenzen mit Transgensequenzen von Interesse ist es möglich, das Transgenprodukt auf jede Organelle oder jedes Zellkompartiment zu richten. Für das Chloroplasten-Targeting wird zum Beispiel die Chloroplasten-Signalsegenz aus dem RUBISCO-Gen, dem CAB-Gen, dem EPSP-Synthase-Gen oder dem GS2-Gen im Raster mit dem Amino-terminalen ATG des Transgens fusioniert. Die ausgewählte Signalsequenz sollte den bekannten Spaltort einschließen, und die konstruierte Fusion sollte etwaige Aminosäuren nach dem Spaltort berücksichtigen, die zur Spaltung erforderlich sind. In manchen Fällen kann dieses Erfordernis durch die Addition einer kleinen Anzahl von Aminosäuren zwischen dem Spaltort und dem Transgen-ATG oder alternativ durch Austausch einiger Aminosäuren innerhalb der Transgensequenz erfüllt werden. Für den Chlorplastenimport konstruierte Fusionen können auf Wirksamkeit der Chloroplastenaufnahme durch in-vitro-Translation oder in-vitro-transkribierte Konstruktionen gefolgt von in-vitro-Chloroplastenaufnahme unter Verwendung von Techniken getestet werden, die beschrieben werden von Bartlett et al., Methods in Chloroplast Molecular Biology, Edelmann et al. (Hrsg.), Elsevier, S. 1081–1091 (1982); Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:446–453 (1986). Diese Konstruktionstechniken sind allgemein fachbekannt und gleichsam anwendbar auf Mitochondrien und Peroxisomen. Die Wahl des Targeting, das für die Expression der Transgene erforderlich sein mag, wird von der zellulären Lokalisierung des Vorläufers abhängen, der als Startpunkt für einen gegebenen Reaktionsweg erforderlich ist. Diese wird gewöhnlich cytosolisch oder chloroplastisch sein, obwohl sie in manchen Fällen mitochondrial oder peroxisomal sein kann. Die Produkte der Transgenexpression werden normalerweise kein Targeting auf das endoplasmatische Retikulum, den Apoplast oder die Vakuole erfordern.
Die oben beschriebenen Mechamismen für das zelluläre Targeting können nicht nur in Verbindung mit ihren erkennenden Promotoren verwendet werden, sondern auch in Verbindung mit heterologen Promotoren, um ein spezifisches Zell-Targeting-Ziel unter der Transkriptionsregulation eines Promotors zu bewirken, der ein Expressionsmuster hat, das sich von demjenigen des Promotors unterscheidet, aus dem das Targeting-Signal stammt.
6.3. Maistransformation
Zur Transformation unter Verwendung unreifer zygotischer Embryos werden Kolben selbstbestäubt, und unreife zygotische Embryos werden ca. 10 Tage später erhalten. Ca. achthuntert unreife zygotische Embryos werden auf unterschiedliche Zielplatten aufgeteilt, die ein Medium enthalten, das die Bildung von embryogenem Kallus induzieren und unterstützen kann. Die unreifen zygotischen Embryos werden unmittelbar auf das gleiche Medium übertragen, das aber 12 % Saccharose enthält. Nach 5 Stunden werden die unreifen zygotischen Embryos mit einem Plasmid oder Plasmiden unter Verwendung der PDS-1000/He-Vorrichtung von BioRad bombardiert. Das Plasmid oder die Plasmide umfassen einen selektierbaren Marker wie ein Gen, das Resistenz gegen Phosphinothricin verleiht, und das neue Toxingen, das zur Abgabe und Expression in Mais gemäß der obigen Beschreibung hergestellt wurde. Das Plasmid oder die Plasmide werden auf 1 μm Goldpartikel im wesentlichen gemäß dem veröffentlichten Verfahren von BioRad präzipitiert. Die Partikel werden unter Verwendung eines Berstdrucks von 1550 psi Helium abgegeben. Jede Zielplatte wird zweimal mit der Plasmid/Goldpartikel-Zubereitung beschossen. Da das Plasmid oder die Plasmide ein chimäres Gen umfassen, das für Resistenz gegen Phosphinothricin codiert, wird diese Substanz zur Selektion transformierter Zellen in vitro verwendet. Das Selektionsmittel wird mit 10 mg/l am Tag der Genabgabe angewendet und auf 40 mg/l nach ca. einem Monat erhöht. Der so erhaltene embryogene Kallus wird in Gegenwart des Selektionsmittels Phosphinothricin regeneriert. Pflanzen werden aus den Phosphinothricin-resistenten embryogenen Kallus- linien erhalten. Die regenerierten Pflanzen werden auf Resistenz gegen ein anfälliges Insekt untersucht. Alle Pflanzen, die resistent gegen das Insekt sind, exprimieren auch das eingeführte chimäre neue Toxingen gemäß Nachweis durch die Detektion des neuen Toxinproteins in der Pflanze unter Verwendung eines ELISA-Assays. Pflanzen, die resistent gegen das Insekt sind und das eingeführte neue Toxingen exprimieren, werden transformiert.
Zur Transformation unter Verwendung von embryogenem Kallus vom Typ I wird der Kallus aus unreifen zygotischen Embryos unter Verwendung von Standardkulturtechniken erhalten. Zur Genabgabe werden ca. 300 mg des Typ I-Kallus entweder durch Zerschneiden mit einer Skalpellklinge oder Sukultivieren 3–5 Tage vor der Genabgabe hergestellt. Vor der Genabgabe wird der hergestellte Kallus auf halbfestes Kulturmedium gegeben, das wieder 12 % Saccharose enthält. Nach ca. 4 Stunden wird das Gewebe unter Verwendung der PDS-1000/He Biolistic-Vorrichtung von BioRad bombardiert. Das Plasmid oder die Plasmide, die einen selektierbaren Marker wie ein Gen, das Resistenz gegen Phosphinothricin verleiht, und das neue Toxingen umfassen, das zur Abgabe und Expression in Mais gemäß der obigen Beschreibung hergestellt wurde, werden auf 1 μm Goldpartikel unter Verwendung im wesentlichen des Standardprotokolls von BioRad präzipitiert. Ca. 16 Stunden nach der Genabgabe wird der Kallus auf Standardkulturmedium überführt, der 2 % Saccharose in 1 mg/l Phosphinothricin enthält. Der Kallus wird nach Selektion für 8 Wochen subkultiviert, worauf überlebender und wachsender Kallus auf Standardregenerationsmedium zur Produktion von Pflanzen übertragen wird. Die regenerierten Pflanzen werden für Resistenz auf ein anfälliges Insekt getestet. Alle Pflanzen, die resistent gegen das Insekt sind, exprimieren auch das eingeführte chimäre neue Toxingen gemäß Nachweis durch die Detektion von neuem Toxinprotein in der Pflanze unter Verwendung eines ELISA-Assays. Pflanzen, die resistent gegen das Insekt sind und das eingeführte neue Toxingen exprimieren, werden transformiert.
Alle in dieser Beschreibung angegebenen Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind Indikativ für den Qualifikationsgrad der Fachleute, an die sich diese Erfindung richtet. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hier durch Verweis im gleichen Ausmaß eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Verweis eingeführt angegeben wäre.
Obwohl die vorhergehende Erfindung in einigem Derail durch Erläuterung und Beispiel für die Zwecke der Klarheit des Verständnisses beschrieben wurde, wird es offensichtlich sein, daß gewisse Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der anhängenden Patentansprüche vorgenommen werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, das ein Toxinprotein codiert, worin das Toxinprotein eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) und Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) besteht, und aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, worin das Toxinprotein sowohl Untersequenz A (SEQ ID NO:3) als auch Untersequenz B (SEQ ID NO:4) umfaßt.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, worin das Toxinprotein sowohl Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) als auch Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) umfaßt.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, worin das Toxinprotein CryIE(c) mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, worin das Toxinprotein CryIE(d) mit der in SEQ ID NO:8 dargestellten Aminosäuresequenz ist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 4 mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleotidsequenz.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 5 mit der in SEQ ID NO:7 dargestellten Nukleotidsequenz.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Toxinprotein ein rekombinantes Protein ist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, das zur Expression in Pflanzen optimiert wurde.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 9, das zur Expression in Mais optimiert wurde.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 4 bis 10, das das toxische Kernfragment des Toxinproteins CryIE(c) bzw. CryIE(d) codiert.
Isoliertes Proteinmolekül, das eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) und Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) besteht, und das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist.
Isoliertes Proteinmolekül gemäß Anspruch 12, das sowohl Untersequenz A (SEQ ID NO:3) als auch Untersequenz B (SEQ ID NO:4) umfaßt.
Isoliertes Proteinmolekül gemäß Anspruch 12, das sowohl Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) als auch Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) umfaßt.
Isoliertes Proteinmolekül gemäß Anspruch 12 mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Sequenz.
Isoliertes Proteinmolekül gemäß Anspruch 12 mit der in SEQ ID NO:8 dargestellten Sequenz.
Isoliertes Proteinmolekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, das ein rekombinantes Protein ist.
Rekombinantes DNA-Molekül, das wenigstens eines der DNA-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt und ein Toxinprotein codiert, das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist.
Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 18, das ein chimäres DNA-Konstrukt umfaßt, worin das DNA-Molekül unter der Kontrolle von Expressionssequenzen ist, die in Mikroorganismen und/oder Pflanzen funktionsfähig sind.
Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 19, das ein chimäres DNA-Konstrukt umfaßt, worin das DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 unter der Kontrolle von Expressionssequenzen ist, die in Pflanzen funktionsfähig sind.
Rekombinanter Mikroorganismus, der mit wenigstens einem der isolierten DNA-Moleküle gemäß Anspruch 19 transformiert ist.
Rekombinanter Mikroorganismus, der wenigstens ein DNA-Molekül umfaßt, das ein Toxinprotein codiert, worin das Toxinprotein eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9), Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) und einer Kombination aus Untersequenzen A (SEQ ID NO:3), B (SEQ ID NO:4), A' (SEQ ID NO:9) und/oder B' (SEQ ID NO:10) besteht, worin das Toxinprotein aktiv gegen Heliothis-Arten ist.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Ansprüchen 21 oder 22, worin der rekombinante Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mitgliedern der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Caulobacter, Agmellenum, Rhizobium und Clavibacter besteht, oder ein Baculovirus oder eine Hefe ist.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 23, worin der rekombinante Mikroorganismus das Kernpolyedervirus Autographica californica ist.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 23, worin der rekombinante Mikroorganismus Bacillus thuringiensis ist.
Insektizide Zusammensetzung, die den rekombinanten Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25 in einer insektizid wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt.
Insektizide Zusammensetzung, die ein isoliertes Proteinmolekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 in einer insektizid wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt.
Transformierte Pflanze, die wenigstens ein DNA-Molekül umfaßt, das ein Toxinprotein codiert, worin das Toxinprotein eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9), Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) und einer Kombination aus Untersequenzen A (SEQ ID NO:3), B (SEQ ID NO:4), A' (SEQ ID NO:9) und/oder B' (SEQ ID NO:10) besteht, worin das Toxinprotein aktiv gegen Heliothis-Arten ist.
Transformierte Pflanze, die das DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt.
Transgene Pflanze, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 transformiert ist.
Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 30, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 20 transformiert ist.
Transformierte Pflanzenzelle, die das DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt.
Transformierte Pflanzenzelle, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 transformiert ist.
Transformierte Pflanzenzelle gemäß Anspruch 33, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 20 transformiert ist.
Transformierte Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 32 bis 34, die eine Pollenzelle oder eine Zygote ist.
Transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 28 bis 35, worin die Pflanze oder Pflanzenzelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen, Gerste, Reis, Tabak, Baumwolle und Sojabohne besteht.
Transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle gemäß Anspruch 36, die eine Maispflanze oder eine Zelle aus einer Maispflanze ist.
Verfahren zum Erhalt eines isolierten DNA-Moleküls, das ein Toxinprotein codiert, das eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) und Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) besteht, und das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Isolieren von Gesamt-DNA aus Bacillus thuringiensis var. kurstaki; (b) Einrichten einer genomischen DNA-Bibliothek in einem geeigneten Wirtsorganismus; (c) Sondieren der Bibliothek mit einem Sondenmolekül, das DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt; (d) Isolieren eines Klons, der mit dem Sondenmolekül hybridisiert; und (e) Sondieren des Klons auf seine insektizide Aktivität.
Verfahren zur Herstellung eines isolierten Proteinmoleküls, das eine Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Untersequenz A (SEQ ID NO:3), Untersequenz B (SEQ ID NO:4), Untersequenz A' (SEQ ID NO:9) und Untersequenz B' (SEQ ID NO:10) besteht, und das aktiv gegen Heliothis-Arten ist, aber keine Aktivität gegen Spodoptera exigua aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20; (b) Kultivieren des so transformierten Wirtsorganismus in einem geeigneten Medium; und (c) Isolieren des rekombinanten Proteinprodukts, das durch den transformierten Wirtsorganismus bei Expression des Toxingens hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Mikroorganismus, das das Transformieren des Mikroorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 28 bis 37, das das Transformieren der Pflanze oder Pflanzenzelle mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer insektiziden Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 26 oder 27, das das Vermischen des rekombinanten Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25 oder eines isolierten Proteinmoleküls gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 in einer insektizid wirksamen Menge mit einem geeigneten Träger umfaßt.
Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen Schädigung, die durch einen Insektenschädling verursacht wird, das das Ausbringen einer insektiziden Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 26 oder 27 auf die Pflanze oder das Anbaugebiet der Pflanze umfaßt.
Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen Schädigung, die durch einen Insektenschädling verursacht wird, das das Ausbringen eines Toxinproteins gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 auf die Pflanze umfaßt.
Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen Schädigung, die durch einen Insektenschädling verursacht wird, das das Pflanzen einer Pflanze gemäß einem der Ansprüche 28 bis 31, 36 und 37 innerhalb eines Gebiets umfaßt, in dem der Insektenschädling auftreten kann.
Verwendung einer insektiziden Zusammensetzung gemäß Anspruch 26 oder 27 zum Schützen von Pflanzen gegen Schädigung, die durch einen Insektenschädling verursacht wird.