PL188062B1

PL188062B1 - Sekwencja nukleotydowa promotora genów a1s1 lub als2 AHAS kukurydzy, konstrukt kwasu nukleinowego, wektor do transformacji, komórka roślinna, sposób otrzymywania roślin transgenicznych, zastosowanie sekwencji nukleotydowej, zastosowanie konstruktu kwasu nukleinowego

Info

Publication number: PL188062B1
Application number: PL95319053A
Authority: PL
Inventors: Gabriele Dietrich; Jane Smith; Jianying Peng
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2004-12-31
Also published as: ES2240978T3; DE69534101T2; NO971069D0; EE03933B1; DE69534101D1; MX9701684A; BR9509202A; CN1210404C; BG64062B1; HU221795B1; HUT77109A; EE9700213A; US6025541A; CA2198497C; MD2312B2; WO1996007746A1; BG101270A; FI970958A0; ATE291631T1; NZ293093A

Abstract

1. Sekwencja nukleotydowa promotora genów als1 lub als2 AHAS kukurydzy wy- brana jest z grupy sekwencji nukleotydowych wedlug Sekw. Id. Nr 1, Sekw. Id. Nr 2, Sekw. Id. Nr 3. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydową promotora genów als1 lub als2 AHAS kukurydzy, konstrukty kwasu nukleinowego, wektor do transformacji, komórka roślinna, sposób otrzymywania roślin transgenicznych, zastosowania sekwencji nukleotydowej, zastosowanie konstruktu kwasu nukleinowego. Królestwo roślin dzieli się na dwa typy Bryophyta i Tracheophyta. Typ Tracheophyta zawiera około 266000 gatunków zgrupowanych w cztery podtypy. Podtyp Pteropsida zawiera klasę Angiospermae. Klasa ta podzielona jest na dwie podklasy, dicotyledons (dwuliścienne) i monocotyledons (jednoliścienne).

Ponieważ jednoliścienne obejmują wiele ważnych zbóż i roślin uprawnych, genetycy roślin są żywo zainteresowani możliwościami wytwarzania transgenicznych roślin jednoliściennych.

188 062

Znanych jest około 50000 gatunków roślin jednoliściennych. Obejmują one lilie, palmy, orchidee, irysy, tulipany, turzyce i trawy. Trawy obejmują kukurydzę, pszenicę, ryż i wszystkie inne rośliny zbożowe. Niestety, rośliny jednoliścienne są wyjątkowo trudne do manipulacji genetycznych, wobec czego większość prac prowadzonych na roślinach dotyczy roślin dwuliściennych.

Rośliny dwuliścienne są większą z tych dwu grup roślin, z około 200000 znanymi gatunkami. Jaskier, lwia paszcza, goździk, magnolia, mak, kapusta, róża, groch, wilczomlecz, krzew bawełny, kaktus, marchew, czarna borówka, mięta, pomidor, słonecznik, wiąz, dąb i klon reprezentują 19 z 250 rodzin roślin dwuliściennych.

Informacja genetyczna zawarta w cząsteczce DNA zazwyczaj służy jako matryca do syntezy wielu krótszych cząsteczek RNA, z których większość służy dalej jako matryca do syntezy określonych łańcuchów polipeptydowych. Konkretne fragmenty nukleotydowe, (często nazywane promotorami), rozpoznawane są przez cząsteczki polimerazy RNA, które rozpoczynają syntezę RNA. Po transkrypcji funkcjonalnego łańcucha RNA, druga kłasa sygnałów prowadzi do terminacji syntezy RNA i do odłączenia cząsteczki polimerazy RNA od jej odpowiedniej matrycy DNA. Obecnie, istnieje wiele powszechnych promotorów używanych do kierowania ekspresją genu heterologicznego w roślinach jednoliściennych.

David McElroy i wsp., (1990) odnotował, że analizy przejściowej ekspresji (ang. transient expression) konstruktu, w którym promotor genu aktyny 1 (Actł) z ryżu został połączony z bakteryjnym genem β-glukuronidazy (GUS), w transformowanych protoplastach ryżu, wykazały, iż promotor nadaje wysoki poziom ekspresji genu. Ekspresja ta była około 6 razy wyższa od obserwowanej dla promotora genu dehydrogenazy alkoholowej 1 (Adh1) z kukurydzy i zależy od obecności nieuszkodzonego intronu 5'z Act1.

David McElroy i wsp., (1991) odnotował, że optymalne wektory do transformacji jednoliściennych są konstruowane przy zastosowaniu promotora 35S z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) albo promotora Actl. Analizy ekspresji przejściowej przeprowadzano zarówno na transformowanych protoplastach ryżu jak i kukurydzy. Dodanie intronu z Actł i optymalnego sygnału inicjacji translacji z GUS do każdej z sekwencji promotorowej znacząco podniosło ekspresję genu. Zauważono także, wynik nieopublikowany, w analizach przejściowej ekspresji, że promotor aktynowy wykazywał kierowanie ekspresją GUS w protoplastach pszenicy, owsa, jęczmienia i sorgo.

Wanggen Zhang i wsp., (1991) odnotował, że badania hybrydyzacyjne in situ transgenicznych roślin ryżu niosących fuzję Act1-GUS (promotor Act1 i gen GUS) pokazały, że promotor Act1 posiada konstytutywny wzór ekspresji zarówno w tkance wegetatywnej jaki i rozrodczej .

Jun Cao i wsp., (1992) odnotował, że transgeniczne rośliny ryżu selekcjonowano na bialofosie po transformacji genem bar, którego ekspresja znajduje się pod kontrolą promotora 35S z CaMV lub promotora Act1 z ryżu.

Alan H. Christensen i wsp., (1992) odnotował, że protoplasty kukurydzy transformowane fuzją Ubi-1-CAT (promotor Ubi-1 z kukurydzy i gen CAT) wykazują blisko 10-krotnie wyższe poziomy aktywności CAT niż komórki kukurydzy transformowane fuzją CaMV-35SGUS, w analizach ekspresji przejściowej. Analiza metodą Northern biot poziomów transkryptów Ubi-1 i Ubi-2 w siewkach kukurydzy poddanych szokowi termicznemu wykazała, że oba geny ulegają konstytutywnej ekspresji w 25°C, lecz są indukowane po szoku termicznym.

Seiichi Toki i wsp., (1992) odnotował, że stosując metodę elektroporacji i selekcji na bialofosie otrzymywano, po transformacji genem bar, którego ekspresja znajduje się pod kontrolą promotora Ubi-1 z kukurydzy, stabilnie stransformowane transgeniczne rośliny ryżu. Wynik ten wykazuje, ze promotor Ubi-1 może być użyty do kierowania ekspresją genu w ryżu na wystarczająco wysokich poziomach, co pozwala na selekcję i regenerację żywotnych transgenicznych roślin ryżu. J. Troy i wsp., (1993) odnotowali, że stabilnie stransformowane rośliny pszenicy otrzymywano po wstrzeliwaniu do kalusów pochodzących z nierozwiniętych zarodków, zarówno genu bar jak i GUS, których ekspresja znajduje się pod kontrolą promotora Ubi-1 z kukurydzy, selekcjonowanych następnie na bialofosie. Wynik ten wykazuje, ze w psze4

188 062 nicy promotor Ubi-1 może być wykorzystany do kierowania ekspresją genu na wystarczająco wysokich poziomach, co pozwala na selekcję i regenerację żywotnych transgenicznych roślin.

Yuechun Wan i Peggy G. Lemaux, (1994) odnotowali, że stabilnie stransformowane, żywotne rośliny jęczmienia otrzymano powstrzeliwamu do tkanek embrionalnych jęczmienia zarówno genu bar i GUS, których ekspresja jest pod kontrolą promotora Ubi-1 i selekcjonowaniu następnie na bialofosie. Wynik ten wykazuje, że w jęczmieniu, promotor Ubi-1 może być wykorzystany do kierowania ekspresją genu na wystarczająco wysokich poziomach, co pozwala na selekcję i regenercję żywotnych transgenicznych roślin. Doświadczenie wymagające wstrzeliwania do małej liczby roślin Ubi-bar albo CaMV 35S-bar nie pokazuje istotnych różnic w liczbie otrzymywanych transformantów. Junko Kyozuka i wsp., (1991) odnotowali, że w celu otrzymania transgenicznych roślin ryżu do protoplastów ryżu wprowadzono fuzję promotora Adhl z kukurydzy z genem GUS. W roślinach transgenicznych testowano aktywność GUS celem określenia wzoru ekspresji genu GUS. Stwierdzono, że promotor Adhl z kukurydzy podnosi konstytutywną ekspresję we wszystkich częściach badanych roślin. Jak wykazano wcześniej dla ekspresji Adhl w kukurydzy, kierowana przez promotor Adhl ekspresja GUS była indukowana w korzeniach warunkami beztlenowymi.

D. I. Last i wsp., (1991) opisał, że promotor Adhl z kukurydzy zmodyfikowany poprzez dodanie wielu kopii elementu odpowiedzialnego za indukcję w warunkach beztlenowych z genu ADH1 z kukurydzy i elementów ocs z genu kodującego syntazę oktopiny z Agrobacterium tumefaciens (pEmu). W testach przejściowej ekspresji, w protoplastach pochodzących z różnych gatunków roślin jednoliściennych transformowanych pEmu - GUS, najlepszy konstrukt dawał 10-50 razy wyższe poziomy ekspresji niż promotor 35S z CaMV w pszenicy, kukurydzy, ryżu, pszenicy samopszeji Lolium multiflorum.

Robert Bower i Robert G. Birch (1992) odnotowali, że stabilne transformanty otrzymywano po transformacji embrionalnego kalusa z trzciny cukrowej genem kodującym fosfotransferazę neomycyny, znajdującym się pod kontrolą promotora Emu.

D.A. Chamberlain i wsp., (1994) odnotował, że promotor Emu został użyty do kierowania ekspresją czterech różnych genów będących markerami selekcyjnymi (fosfotransferaza neomycynowa, fosfotransferaza higromycynowa, N-acetylotransferaza fosfinotricynowa i zmutowana syntaza acetomleczanowa nadająca oporność na herbicydy) transformowanych zarówno do pszenicy jak i ryżu. Otrzymanie kalusa pszenicy i stransformowanych roślin ryżu w wyniku selekcji transformantów wykazuje, że promotor ten może być użyty do kierowania ekspresją genów będących markerami selekcyjnymi celem otrzymania stransformowanych zbóż.

Artykuł przeglądowy na temat elementów promotorowych używanych do kontroli obcych genów w transgenicznych zbożach został ostatnio opublikowany i tutaj jest załączony jako referencja (McElroy i Brettel, 1994).

Wiele promotorów używa się obecnie do transformacji roślin dwuliściennych. Promotory te pochodzą z rozmaitych, różniących się źródeł. Jedna grupa powszechnie używanych promotorów została wyizolowana z Agrobacterium tumefaciens, gdzie funkcjonują one przy kierowaniu ekspresją genów kodujących syntazy opin niesionych w segmencie T-DNA, integrującym do genomu rośliny podczas infekcji. Promotory te obejmują promotor syntazy oktopiny (ocs) (L. Comai i wsp., 1985; C. Waldron i wsp., 1985), promotor syntazy mannopiny (mas) (L. Comai i wsp., 1985; K.E. McBride i K.R. Smmerfelt, 1990) i promotor syntazy nopaliny (nos) (M.W. Bevan i wsp., 1983; L. Herrera-Estrella i wsp., 1983, R.T. Fraley i wsp., 1983, M. De Block i wsp., 1984, R. Hain i wsp., 1985). Promotory te są aktywne w wielu różnorodnych tkankach roślinnych.

Do kierowania ekspresją genów heterologicznych w roślinach dwuliściennych używa się także kilka promotorów wirusowych (J.C. Kridl i R.M. Goodman, 1986). Promotor 35S z wirusa mozaiki kalafiora jest jednym z częściej używanych do transformacji roślin dwuliściennych, ponieważ daje wysokie poziomy ekspresji genu prawie we wszystkich tkankach (J. Odęli i wsp., 1985; D.W. Ow i wsp., 1986; D.M. Shah i wsp., 1986). Wykorzystywane są również modyfikacje tego promotora, w tym konfiguracja dwu tandemowych promotorów 35S (R. Kay i wsp.,1987) i promotora mas-35S (L. Comai i wsp., 1990), który składa się z promotora syntazy mannopiny w tandemie z promotorem 35S. Oba te promotory dają wyższe poziomy eks188 062 presji genu niż pojedyncza kopia promotora 35S. Wykorzystywane są też inne promotory wirusowe w tym promotor 19S z wirusa mozaiki kalafiora (J. Paszkowski i wsp., 1984; E. Balazs i wsp.) i promotor 34S z wirusa mozaiki trędownika (M. Sanger i wsp., 1990).

Badania nad ekspresją AHAS (syntazą acetylohydroksykwasów) w wielu roślinach wykazały, że AHAS ulega ekspresji we wszystkich tkankach roślinnych. Gaił Schmitt i Bijay K. Singh (1990) odnotowali, że oznaczenia enzymatyczne prowadzone na różnych tkankach fasoli (odmiana lima ) wykazały, iż aktywność AHAS była obecna we wszystkich testowanych tkankach włączając liście, łodygi, korzenie, kwiaty, strąki i merystemy. Stwierdzono, że aktywność AHAS jest całkowicie stała w łodygach, lecz zanika w liściach, korzeniach i merystemach wraz z wiekiem.

Sharon J. Kheeler i wsp., (1993) odnotowali, że tytoń zawiera dwa geny kodujące syntazę acetohydroksykwasów, SurA i SurB. Wydaje się, że oba geny ulegają ekspresji we wszystkich rodzajach tkanek, z około czterokrotną różnicą poziomu ekspresji w różnych tkankach. Wydaje się, że rozwijające się organy mają najwyższe poziomy ekspresji. Badania hybrydyzacji in situ wykazały, że najwyższe poziomy ekspresji były zgodnie obserwowane w komórkach aktywnych metabolicznie albo szybko dzielących się. Gen SurB ulegał ekspresji na wyższych poziomach niż SurA we wszystkich badanych tkankach.

Therese Ouellet i wsp., (1992) odnotowała, że gatunki Brassica posiadają wielogenowe rodziny kodujące syntazę acetohydrokwasów. Cztery z pięciu genów AHAS zidentyfikowano w Brassica napus. Celem określenia wzoru ekspresji dla różnych członków rodziny genów w różnych gatunkach Brassica prowadzono badania ochrony przed RNazą (ang. RNase protection assay) przy użyciu sond specyficznych do genu. Stwierdzono, że dwa z genów, AHAS1 i AHAS3, ulegają konstytutywnej ekspresji we wszystkich badanych tkankach. Transkrypty AHAS2 wykryto jedynie w organach rozrodczych i w dodatkowej tkance embrionalnej nasion. Transkrypty kodowane przez czwarty gen, AHAS4, nie zostały wykryte i dlatego przypuszcza się, że jest on pseudogenem.

Dale L. Shaner i N. Moorthy Mallipudi (1991) odnotowali, że porównanie aktywności AHAS w liściach młodej kukurydzy i komórkach BMS hodowanych w kulturach płynnych pokazało, że aktywność komórek BMS, na gram świeżej masy, była blisko 5,8 razy wyższa niż w próbkach liścia. Ponieważ komórki BMS dzielą się aktywnie, wynik ten jest zgodny z wynikami wcześniejszych badań przeprowadzanych na tytoniu i fasoli odmiany lima, które wykazywały, że aktywnie dzielące się tkanki mają większą aktywność AHAS niż tkanki starsze.

Zgodnie z wynalazkiem celem uzyskania wysokiego poziomu ekspresji genów wprowadzanych do różnych tkanek roślinnych stosuje się promotory AHAS z kukurydzy. Promotory genów alsl i als2 z kukurydzy sklonowano i zsekwencjonowano (fig. 1, fig. 2, fig. 3), rejony promotorowe tych genów wprowadzono następnie do plazmidu w obszar poprzedzający 5' koniec genu reporterowego, kodującego beta-glukuronidazę (GUS). Oba fragmenty promotorów pochodzą z kukurydzy linii XI12. Fragment promotora alsl ma długość blisko 1400 par zasad, podczas gdy promotor als2 zawiera 819 par zasad. Dla określenia aktywności promotorów AHAS plazmidy chimerowe wprowadzano do protoplastów kukurydzy Black Mexican Sweet i protoplastów ryżu celem określenia poziomów przejściowej ekspresji. Dla porówna nia protoplasty transformowano również plazmidem z promotorem 35S z CaMV kierującym genem reporterowym GUS. Ekspresję plazmidów chimerowych, w komórkach kukurydzy, określano poprzez oznaczanie aktywności enzymu GUS. W obu rodzajach komórek aktywność promotora als2 z kukurydzy była porównywalna lub wyższa od aktywności promotora 35S z CaMV (Fig. 4). Na fig. 5 przedstawiono wyniki oznaczenia beta-glukuronidazy w komórkach linii BMS z kukurydzy stabilnie stransformowanych pCD221B (plazmid als2-GUSocs terminator) lub pAC400 (plazmid CaMV 35S-GUS-ocs terminator). Analiza lokalizacji mRNA AHAS poprzez hybrydyzację in situ wyznakowanej radioaktywnie sondy RNA do tkanek roślinnych ujawniła, iż promotory AHAS z kukurydzy są aktywne w większości części rośliny (fig. 6, fig. 7, fig. 8).

Aktywność promotora AHAS z Arabidopsis badano w roślinach Arabidopsis stabilnie stransformowanych przy pomocy Agrobacterium tumefaciens. Obszar promotorowy genu AHAS pochodzącego z Arabidopsis połączony z genem reporterowym GUS, wprowadzono

188 062 do bifunkcjonalnego wektora pBIN19, i użyto do transformacji Arabidopsis. Badanie stransformowanych roślin ujawniło ekspresję GUS, (wykazując aktywność promotora) w większości części rośliny.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia sekwencję ALS1 promotora AHAS z kukurydzy XA17.

Fig. 2 przedstawia sekwencję ALS2 promotora AHAS z kukurydzy XA17.

Fig. 3 przedstawia sekwencję ALS2 promotora AHAS z kukurydzy XU2.

Fig. 4 jest diagramem przedstawiającym aktywność beta-glukoronidazy w oznaczeniach przejściowej ekspresji otrzymanych w wyniku transformacji protoplastów komórek kukurydzy Black Mexican Sweet lub zawiesiny komórek ryżu plazmidem pCD221B ( plazmid als2promotor-GUS-ocs terminator) lub pAC400 (plazmid CaMV 35S-GUS-ocs terminator). Aktywność GUS obliczano w pmol/min./mg białka. Wyniki pochodzą z trzech niezależnych doświadczeń.

Fig. 5 jest diagramem przedstawiającym aktywność beta-glukuronidazy w stabilnych transformantach linii komórkowych Black Mexican Sweet otrzymanych w wyniku transformacji pCD221B (plazmid als2 promotor-GUS-ocs terminator) lub pAC400 (CaMV 35S-GUSocs terminator). CK przedstawia nietransformowaną tkankę kontrolną. Aktywność GUS obliczano w pmol/min./mg białka.

Fig. 6 - Badania poprzez hybrydyzację in situ okółka liściowego z 2 tygodniowej siewki kukurydzy przy użyciu, jako sond, radioaktywnie wyznakowanych RNA. Przygotowywano skrawki tkanek, które hybrydyzowano z sondami RNA kodującymi zarówno sensowną (AHAS-) jak również antysensowną (AHAS+) nić AHAS. Dla porównania, jako sond używano również SSU (RUBISCO mała podjednostka) nić sensowną (SSU-) i antysensowną (SSU+). W każdym z przypadków oczekiwano jedynie hybrydyzacji antysensownej (+) nici z występującym w tkance mRNA. a) sonda SSU+; b) sonda SSU-; c) sonda AHAS+; d) sonda AHAS-.

Fig. 7 - Badania poprzez hybrydyzację in situ jądra kukurydzy w 12 dniu po zapyleniu przeprowadzone jak opisano na fig. 6, a) zarodek i wieszadełko, sonda AHAS+; b) zarodek i wieszadełko, sonda AHAS-; c) owocnia, warstwa aleuronowa i bielmo, sonda AHAS-; d) owocnia, warstwa aleuronowa i bielmo sonda AHAS+.

Fig. 8 - Badania przez hybrydyzację in situ merystemu wierzchołkowego młodej rośliny kukurydzy, przeprowadzone jak opisano na fig. 6 a) i b) sonda AHAS+; c) i d) sonda AHAS -. W celu nadania roślinom pożądanych właściwości naukowcy prowadzą badania nad możliwościami zastosowania modyfikacji genetycznych. Techniki inżynierii genetycznej zastosoawane do poprawy takich właściwości jak smak, struktura, wielkość, odporność na szkodniki i herbicydy, barwa, kwaśny lub słodki smak zbieranych owoców, są znacznie szybsze od tradycyjnych metod krzyżowania.

Wynalazek niniejszy dostarcza sekwencji nukleotydowej promotora, konstruktu kwasu nukleinowego, wektora do transformacji, komórki roślinnej, która umożliwia otrzymanie roślin transgenicznych. Sekwencja nukleotydową promotora genów alsl lub als2 AHAS kukurydzy według wynalazku wybrana jest z grupy sekwencji nukleotydowych według Sekw. Id. Nr 1, Sekw. Id. Nr 2, Sekw. Id. Nr 3.

Konstrukt kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową promotora AHAS z kukurydzy określoną powyżej funkcjonalnie połączoną z sekwencją kodującą genu heterologicznego. Korzystnie genem heterologicznym jest gen beta-Glukuronidazy (GUS).

W zakres wynalazku wchodzi wektor do transformacji obejmujący sekwencję nukleotydową lub konstrukt kwasu nukleinowego określone powyżej.

Komórka roślinna według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową lub konstrukt kwasu nukleinowego lub wektor do transformacji określone powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania roślin transgenicznych mających wbudowane określone promotory kierujące pożądaną ekspresją genów według wynalazku obejmuje etapy:

188 062

a) transformowania rekombinacyjnego rośliny lub żądanej części rośliny sekwencją nukleotydową lub konstruktem kwasu nukleinowego lub wektorem do transformacji określonymi powyżej i

b) wykrywania produktu ekspresji genu heterologicznego w transformowanej roślinie lub żądanej części rośliny.

W zakres wynalazku wchodzą również zastosowania sekwencji nukleotydowej określonej powyżej do ekspresji konstytutywnej genów na wysokich poziomach w roślinie i/lub w różnych tkankach rośliny. Korzystnie sekwencje te stosowane są do ekspresji genu w roślinach jednoliściennych lub dwuliściennych lub w żądanych częściach tych roślin, korzystnie do ekspresji genów kierowanych przez promotor AHAS kukurydzy nadającej oporność na herbicydy, detoksyfikację i/lub oporność na patogeny roślinne. Korzystnie sekwencja nukleotydową promotora według wynalazku jest stosowana do wytwarzania wektora do transformacji do roślin lub części roślin.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie konstruktu kwasu nukleinowego określonego powyżej do wytwarzania wektora do transformacji do roślin lub części roślin.

Dla celów tego zgłoszenia promotor jest definiowany jako sekwencja nukleotydową znajdująca się przed genem, która działa jako sygnał dla wiązania RNA polimerazy. Pochodzące z kukurydzy geny alsl i als2 zostały sklonowane i zsekwencjonowane, a obszary promotorowe tych genów zostały wprowadzone do plazmidów na koniec 5' genu reporterowego GUS. Dla celów tego zgłoszenia gen reporterowy jest definiowany jako sekwencja nukleotydową przyłączana za badanym promotorem tak, że gen reporterowy podlega zapoczątkowanej przez promotor transkrypcji. Geny reporterowe kodują enzymy o aktywności łatwej do mierzenia; przykładowo w niniejszym wynalazku ekspresja plazmidów chimerowych w komórkach kukurydzy jest określana przez badanie aktywności enzymatycznej beta-glukuronidazy (GUS). Należy rozumieć, iż promotory AHAS będąc wysoce aktywnymi w wielu różnych tkankach roślinnych, mogą być użyte do ekspresji nowych genów w różnych roślinach. Nowe geny obejmują między innymi geny warunkujące oporność na herbicydy, detoksyfikację i odporność na patogeny roślin.

Zastrzeżone promotory mogą być użyte do ekspresji obcych genów w roślinach jednoliściennych obejmujących między innymi kukurydzę, ryż, pszenicę, jęczmień, sorgo, owies, żyto i proso. Należy także rozumieć, że zastrzeżone promotory będą również kierowały ekspresją w roślinach dwuliściennych chociaż, należy oczekiwać iż ekspresja warunkowana promotorami z roślin jednoliściennych w roślinach dwuliściennych, będzie na niższym poziomie niż w roślinach jednoliściennych. Dla specjalisty jest oczywiste, że pochodzący z kukurydzy promotor als2 może być użyty do kierowania ekspresją genu w innych gatunkach roślin jednoliściennych. Przykładowo, pochodzący z ryżu promotor Actl kieruje ekspresją genu w protoplastach kukurydzy, promotor Emu z kukurydzy został użyty do selekcji transgenicznej pszenicy, jęczmienia i ryżu. Zastrzeżony promotor als2 z kukurydzy działa najlepiej w kukurydzy, lecz również kieruje ekspresją genów w innych roślinach jednoliściennych. Z badań przeprowadzonych na kukurydzy i innych gatunkach, wynika, że promotor ten powinien kierować konstytutywną ekspresją genu w całej roślinie. Najwyższy poziom ekspresji obserwowany jest zarówno w aktywnie dzielących się tkankach jak i w tkankach aktywnych metabolicznie.

Wiele różnorodnych technik, dobrze znanych specjalistom, obejmujących między innymi wstrzeliwanie, transformację z PEG, elektroporację i technikę z włóknami silikonowymi używano do transformacji jednoliściennych roślin uprawnych. Wszystkie te techniki wymagają użycia DNA wektorów jako nośnika sekwencji nukleotydowej w transformacji. Wektory użyteczne w niniejszym wynalazku obejmują między innymi wektory przenoszące geny markerowe użyte do selekcji transgenicznego materiału, w tym geny warunkujące oporność na higromycynę, kanamycynę, bialofos oraz herbicydy imidazolinonowe i sulfonylomocznikowe.

Poniższy przykład służy jedynie do zilustrowania wynalazku i w żaden sposób nie ogranicza wynalazku.

188 062

Przykład

Wydajność promotorów alsl i als2 oznaczana jest poprzez pomiar aktywności GUS w protoplastach kukurydzy i ryżu lub w liniach komórkowych kukurydzy niosących konstrukty, w których sekwencje tych promotorów połączono z genem GUS. Sposób przygotowania wektora i protokół transformacji przedstawiono poniżej.

Konstrukty zawierające geny chimerowe CaMV 35S-GUS, als1- GUS i als2-GUS.

Plazmid pAC400 jest pochodną plazmidu pUC19 zawierającą fuzję fragmentu EcoRIXbaI promotora 35S z CaMV o długości 418 par zasad (bp) sklonowanego przed fragmentem XbaI-PstI o długości 1,7 tys. par zasad (kb) zawierającym gen GUS z terminatorem syntazy oktopiny. Geny alsl i als2 otrzymano poprzez przeszukanie biblioteki genomowej z kukurydzy linii XI12. Fragment EcoRl-Ncol zawierający sekwencję o długości 1,4 kb, poprzedzającą inicjatorowy kodon ATG genu als1 subklonowano do pAC400 w miejsce promotora 35S z CaMV tworząc plazmid pCD223B. Fragment Pst1-NcoI o długości 819 bp, poprzedzający ATG w als2, subklonowano przed wcześniej omówioną fuzją GUS-ocs terminator w pBluescript KS-(Stratagene) tworząc pCD221B. Sekwencję promotora als2 z kukurydzy przedstawiono na fig. 3.

Transformacja i analiza protoplastów ryżu i kukurydzy.

Protoplasty izolowano z zawiesiny komórek ryżu (Nortai) lub kukurydzy (Black Mexican Sweet; BMS) i transformowano pAC221B lub pAC400 zgodnie z protokołem techniki wykorzystującej PEG, opisanej przez L.A. Lyznik i wsp. (1989) i J.Y. Peng i wsp. (1990). Dla oznaczenia przejściowej ekspresji stransformowane protoplasty ryżu wyszczepiano na filtry Millipore ułożone na powierzchni pożywki zawierającej komórki dożywiające, a stransformowane protoplasty BMS hodowano w 3 ml pożywki płynnej. W dwa dni po transformacji protoplasty zbierano i poddawano ekstrakcji buforem ekstrakcyjnym GUS. Aktywność GUS mierzono fluorometrycznie zgodnie z przepisem R.A. Jefferson (1987).

Celem odzyskania stabilnych transformantów z hodowli kukurydzy BMS, protoplasty kotransformowano pFF19K (zawierającym selekcyjny gen markerowy kodujący fosfotransferazę neomycyny) i pCD221B lub pAC400. Po transformacji protoplasty hodowano na filtrach Millipore umieszczonych na powierzchni pożywki zawierającej komórki dożywiające. Tydzień później hodowle protoplastów przenoszono do pożywki zawierającej komórki do żywiające i kanamycynę w stężeniu 100 mg/l. Hodowle protoplastów przenoszono do świeżej pożywki MS z kanamycyną w stężeniu 100 mg/1 i hodowano aż do pojawienia się opornego kalusa. Poszczególne, oporne na kanamycynę kalusy, zbierano i hodowano przez dwa do trzech tygodni w obecności kanamycyny. Oporne na kanamycynę kalusy barwiono przy użyciu X-Gluc lub oznaczano używając MUG zgodnie z przepisem R.A. Jefferson (1987) celem wyselekcjonowania kalusów GUS-pozytywnych. Kalus zidentyfikowany jako eksprymujący GUS sadzono w buforze ekstrakcyjnym i oznaczano; aktywność GUS mierzono fluorometrycznie.

Wyniki uzyskane w tych doświadczeniach przedstawiono na fig. 4 i 5.

Zmutowany gen AHAS z kukurydzy, warunkujący oporność na herbicydy imidazolinonowe, kierowany przez promotor als2 z kukurydzy stosowany był jako marker selekcyjny do otrzymania, po transformacji, transgenicznych kalusów zarówno komórek BMS i A188 x B73 jak i komórek ryżu. Wynik ten potwierdza hipotezę mówiącą, iż promotor als2 zapewnia dostatecznie wysoki poziom ekspresji kontrolowanego przez niego genu markerowego.

Hybrydyzacja in situ

Preparaty przygotowywano zasadniczo zgodnie z metodą opisaną przez J. A. Langdale i wsp. (1988). Tkankę utrwalano w 4% formaldehydzie, odwadniano w etanolu, oczyszczono ksylenem i zatapiano w parafilmie. Tkankę cięto na 8-10 pm skrawki i umieszczano na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną. Parafinę usuwano ksylenem, a tkankę uwadniano poprzez płukanie w etanolu i wodzie. Sondy RNA sporządzano z obu nici (+ i -) 172 nukleotydowego (nt) fragmentu regionu kodującego als2 i 392 nt fragmentu obszaru kodującego SSU stosując zestaw Ambion Maxiscript. Preparaty hybrydyzowano zgodnie z przepisem Meyerowitz i wsp. (1988) w 50°C przez noc w rozcieńczonym 1:4 roztworze SPB (100 pl 10 X sole (3M NaCl, 10mM Tris pH 6,8, 50 mM DTA); 400 pl formamidu; 200 pl 50% siarczanu dekstranu; 40 pl

188 062 mg/ml tRNA; 10 μΐ IM DTT; 50μ1 10 mg/ml poli A] z sondą zdenaturowaną w 50% formaldehydzie i 10 mM DTT w 80°C przez 30 sek. Preparaty płukano 2X 15 min. w buforze do płukania (IX sole, 50% formamid, 10 mM Tris pH 8, 1mM EDTA i 10 mM DTT) w 50°C, traktowano RNazą A (20 (pg/ml w NTE) przez 30 min. w 37°C, płukano 5X w buforze NTE w 37°C łącznie przez 1 godz., płukano 2 x 30 min. w buforze do płukania w 50°C, odwadniano w etanolu i suszono na powietrzu. Preparaty poddawano autoradiografii poprzez zanurzenie w emulsji uprzednio podgrzanej do 37°C w ciemni, po suszeniu od 30 minut do godziny przechowywano je w ciemni w 4°C, do wywołania. Preparaty wywoływano przez 2 min., płukano wodą, utrwalano, przez co najmniej 5 minut i ponownie płukano wodą. Tkankę barwiono w Alcien Blue i odbarwiano w etanolu i ksylenie. Po zatopieniu w Permount, tkankę oglądano stosując mikroskopowanie w ciemnym polu.

Wyniki otrzymane w doświadczeniu hybrydyzacji in situ przedstawione na fig. 6-8 pokazują, iż gen ten ulega również ekspresji w całym zarodku kukurydzy.

Możliwa jest ocena ekspresji z promotora AHAS przez:

1. konstrukcję fuzyjnego genu als2-GU5 i określenie wzoru aktywności GUS w transgenicznych roślinach kukurydzy lub ryżu. Wcześniejsze badania wykorzystujące promotor z kukurydzy wykazały możliwość oszacowania ekspresji z tego promotora w ryżu (Junko Kyozuka, i wsp., 1991). Po wyselekcjonowaniu transgenicznych roślin, wykonano analizy histochemiczne tkanek roślinnych w różnych stadiach ich rozwoju celem określenia zarówno tkankowej jak i komórkowej specyficzności. Techniki te są powszechnie używane do szacowania aktywności promotorów zarówno u jednoliściennych jak i dwuliściennych roślin.

2. oznaczenie przejściowej ekspresji wykonywanej na protoplastach sporządzanych z różnych gatunków roślin uprzednio transformowanych konstruktami als2-GUS. Oznaczenie to wykorzystuje się do oceny zdolności różnych promotorów do działania w heterologicznych gatunkach. Protoplasty transformowano badanym konstruktem i inkubowano pozwalając na ekspresję wprowadzonego genu i akumulację białka. Po inkubacji w komórkach oznaczano obecność białka kodowanego przez transgen, celem ustalenia wydajności promotora kierującego ekspresją transgenu.

188 062

Lista sekwencji (1) Ogólne informacje (i) Zgłaszający: Gabriele Dietrich (ii) Tytuł wynalazku: Niekodująca sekwencja DNA końca

5' ( promotor) genu strukturalnego kodującego syntazę acetohy droksy kwasów (AHAS) jest użyteczna przy ekspresji genów wprowadzanych do roślin.

(iii) Liczba sekwencji: 3 (iv) Adres do korespondencji:

A): American Cyanamid Company (B) Ulica: One Cyanamid Plaza (C) Miasto: Wayne (D) Stan: New Jersey (E) Kraj: Stany Zjednoczone (F) KOD: 01410-8426 (v) Forma zapisu komputerowego:

(A) Nośnik: dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) Dane bieżącego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: US (B) Data złożenia:

(C) Klasyfikacja:

188 062 (viii): Informacje o rzeczniku/pełnomocniku (A) Imię i nazwisko: James J. Harrington (B) Numer rejestracji: P38,711 (C) Numer sprawy: 32,348 (ix) Informacja o telekomunikacji:

(A) Telefon: 201-831-3246 (B) Telefax: 201-831-33B5 (2) Informacja o sekwencji SEK NR ID: 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 413 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici : pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczna: nie (iv) Antysensowny: nie (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 1:

TCTAGAGAAA 60	CTAAACTACT	AATAAAAATT	atttttagca	TATTTTAGTA	CTGTNGTTTA
TATTTNNAAA 120	TGATAAAGTT	TAACTAAAAG	TGCACCGCTA	AACCACCGTA	AATCCAAAGA
GACCGTAAAT 180	CTCTTCCACG	CACTCTGTCG	TGTACCAACG	TGCTGTGGAA	ACGCTCACGT
acctttgtgt 240	ATTATGTACG	GATTCGGGCA	ACGGACATTT	CGACGTCGGT	TTGCCAGTCC
NATTCCCATC 300	TGAACCACAC	ATCTCTGAAC	AAAAGTAGGG	GAGGCGCCCG	CGTAGCCCCC
TTTCCCACAA 360	TCCCACTCCG	TGCCAGGTGC	CACCCTCCCC	AAGCCCTCGC	GCCGCTCCGA
GACAGCCGCC 413	CGCAACCATG	GCCACCGCCG	CCACCGCGGC	CGCCGCGCTC	ACC

188 062 (2) Informacja o sekwencji SEK NR ID: 2:

(i) Charakterystyka sekwencji.:

(A) Długość: 509 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji.: SEK NR ID: 2:

CCGGATTTCC 60	CTGTTGCGGA	TTGCGGGTGG	CAGCCTGGCA	GGTGGGTGCG	ACCCCGTTTG
GATTCCCTTG 120	TCTGGGCCCC	TTGTGTCAGT	ACCGTCTGTA	CTCCGATGAC	ATGCACCGTC
GTCCACAGTC 180	AAGTCCAAAA	TCTCCCCTCT	TTTTTTTAAC	GGAACAGTTC	AAAACCTCCT
TGACGCACGC 240	TGTCGTGTAC	CAGCACTCGG	TGGACACCAC	GTTTGTAATC	CAGGCCGACA
CGTCGGTCCC 300	ACGTCGACAG	GCCCCACCGT	CCGGTCTGTA	GCGTGTACGT	ATTCGGGCGA
CGGACGTGTC 360	GTCGTCGTCT	TGCGAGTCCC	ATTCCCATCA	CCATCTGAGC	CACACATCCT
CTGAACAAAA 420	GCAGGGAGGC	CTCCACGCAC	ATCCCCCTTT	CTCCACTCCG	GTCCGTGGCA
CCCACCCCAA 480	ACCCTCGCGC	CGCCTCCGAG	ACAGCCGCCG	CAACCATGGC	CACCGCCGCC
GCCGCGTCTA	CCGCGCTCAC	TGGCGCCAC

509 (2) Informacja o sekwencji SEK NR ID: 3:

(i) Ctiaacałkt erystytka sekwencji :

(A) Długość: 829 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza

188 062 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 3:

CTGCAGGTCA ACGGATCACC 60

GTGGGTGAGT TGAGTCTGTC 120

AAAAACAGTT GAACAAGATT 180

TGAGCGAAAG GTGAGGAAAC 240

GGAGTTGAGC TTGATGACGA 300

CTGAAGCTGT CGCCGCCGCT 360

TGCGGGTGGC AGCCTGGCAG 420

GTGTCAGTAC CGTCTGTACT 480

TCTCCCCTCT TTTTTTAACG 540

TATCAACATC CCAGCTAAAA

TTGTGGAAAA AACGTTTTAG

GACTGTTCCT CCGGGAGGGT

AGAGCGGAGG GCTTGGAGGT

CACCGTACTG GCGTACCAGG

GCTCATCTTG TNGGCTGTGC

GTGGGTGCGA CCCGTTTGGA

CCGATGACAT GCACANCGTC

GAATAGTTNC AAAATCTCCT

ACAGTAAAAA GGGGGAAAAC

TTTCTCCTGG AATTAACAAT

TTGGAACATC GTTACAGATG

GACCTCGGTA GTCAGACGCC

CCTAGTAGTG AACACCGGGC

NCGGTGTCCC TGTTGCGGAT

CTCCCTGATC TGGGCCCTTT

GTCCACAGTC AAGTCCACAA

TGACGCACGC TATCGTGTAC

CAGCGCTCAC TGGACACCAC GTTTGTAATC CACGCCGACA CGTCGNTCCC ACGTCGACAG 600

GCCCCACCGT CCGGTCTGTA GCGTGTACGT ATTCGGGCAA CGGACGTGTC GTCGTCGTCT 660

TGCNNNNGTC CCANNNCCCA TCACCATCTG AGCCATCACA TCTCATGCGT GAANAAAAGC 720

AGGGAAGGCC TCTACGCACA TCCCCCTTTC TNNCTNNNNT CCGTGTCCGT GGCACCCAGG 780

GGAAACCCTC GCGCCGCCTC CGAGACAGCC GCCGCAACCA TGGCCACCG 829

188 062

LITERATURA

1. David McElroy et al., (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. The Plant Cell 2: 163-171.

2. David McElroy et al., (1991) Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Actl) 5' region for use in monocot transformation. Mol. Gen Genet. 231: 150-160.

3. Wanggen Zhang et al., (1991) Analysis of the Actl 5' region activity in transgenic rice plants. The plant Cell 3: 1155-1165.

4. Jun Cao et al., (1992) Regeneration of herbicide resistant transgenic rice plants following microprojectile-mediated transformation of suspension culture cells. Plant Cell Reports 11: 586-591.

5. Alan H. Christensen et al., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology 18: 675-689.

6. Seiichi Toki et al., (1992) Expression of a maize ubiquitin gene promoter-bar chimeric gene in transgenic rice plants. Plant Physiol. 100: 1503-1507.

7. J. Troy et al., (1993) Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aesfcivrun). Plant Physiol. 102: 1)77-1084.

8. Yuechun Wan and Peggy G. Lemaux, (1994) Generation of a large number of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 104: 37-48.

9. Junko Kyozuka et al., (1991) Anaerobic induction and tissue-specific expression of maize Adhl promoter in transgenic rice and their progeny. Mol. Gen. Genet. 228: 40-48.

10. D. I. Last et al., (1991) pEmu: an improved promoter for gene expression in cereal cells. Theor. Appl. Genet. 81: 581-588.

11. Robert Bower and Robert G. Birch (1992) Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment. The Plant Journal 2 (3): 409-416.

12. D. A. Chamberlain et al., (1994) The use of the Emu promoter with antibiotic and herbicide resistance genes for the selection of transgenic wheat callus and rice plants. Aust. J. Plat. Physiol., 21: 95-112.

13. L. Comai et al. (1985) Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurimn confers tolerance to glyphosate. Nature 317: 741-744.

14. C. Waldron et al. (1985) Resistance to hygromycin B: A new marker for plant transformation studies. Plant Mol. Biol. 5: 103-108.

15. Kevin E. McBride and Kristin R. Summerfelt 1990) Improved binary vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 14: 269-276.

16. Michael Bevan et al. (1983) A chimeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation. Nature 304: 184-187.

17. Luis Herrera-Estrella et al. (1983) Expression of chimeric genes transferred into plant cells using Ti-plasmid-derived vector. Nature 304: 209-213.

18. Robert T. Fraley et al. (1983) Expression of bacterial genes in plant cells. P.N.A S 80: 4803-4807.

19. Marc De Block et al. (1984) Expression of foreign genes in regenerated plants and in their progeny. EMBO J.3: 1681-1689.

20. R. Hain et al. (1985) Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plant protoplasts. Mol. Gen. Genet. 199: 161-168

21. J.C. Kridl and Robert M. Goodman (1986) Transcriptional regulatory sequences from plant viruses. Bio Essays 4:4-8.

22. Joan T. Odell et al. (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35s promoter. Nature 313: 810-812.

23. David W. Ow et al (1986) Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science 234: 856-959.

24. D.M. Shah et al. (1896) Engineering herbicide tolerance in transgenic plants. Science 233: 478-481.

25. Robert Kay et al. (1987) Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science 236: 1299-1302.

188 062

26. L. Comai et a1. (1990) Novel and useful properties of a chimeric plant promoter combining CaMV 35S and MAS elements. Plant Mol. biol. 15: 373-381.

27. J. Pazskowski et al. (1984) Direct gene transfer to plants. EMBOJ. 3: 2717-2722.

28. Ervin Balazs et al. (1985) Chimeric vector construction for higher-plant transformation. Gene 40: 343-348.

29. Margaret Ganger et al. (1990) Characteristics of a strong promoter from figwort mosaic virus: Comparison with the analogous 35S promoter from cauliflower mosaic virus and the regulated mannopine synthase promoter. Plant Mol. Biol. 14: 433-443.

30. Gail Schmidt and Bijay K. Singh (1990) Tissue distribution of acetohydroxyacid synthase activity at various developmental stages of lima bean. Pesticide Sci. 30 (4): 418-419.

31. Sharon J. Kheeler et al., (1993) Regulation of tobacco acteolactate synthase gene expression. Plant Physiol. 102:1009-1018.

32. Therese Ouellet et al., (1992) Members of the acetohydroxyacid synthase multigene family of Brassica napus have divergent patterns of expression. The Plant Journal 2: 321-330.

33. Dale L. Shaner and N. Moorthy Mallipudi (1991) Imidazolinone-Acetohydroxyacid synthase interactions. In The Imidazolinone Herbicides ed. Dale L. Shaner and Susan L. O'Connor CRC Press (Boca Raton, FL.)

34. R. A. Jefferson (1987). Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rept 5: 387-405.

35. L.A. Lyznik et al. (1989). Stable transformation of maize protoplasts with gusA and neo genes. Plant Mol biol 13: 151-161.

36. J.Y. Peng et al. (1990). Co-transformation of indica rice protoplasts with neo and gusA genes. Plant Cell Rept 9: 168-172.

37. J. A. Langdale et al., (1988), Cellular pattern of photosynthetic gene expression in developing maize leaves. Gene Dev. 2: 106-115.

38. E. Meyerowitz et al., (1988), In situ hybridization to RNA in plant tissue. Plant Mol. Bio. Rept., 5: 242-250.

188 062

TCTAGAGAAACTAAACTACTAATAAAAATTATTTTTAGCATATT nAGTACTGTNGnTATATHNNAAATGATAAAGKTAACTAAA

AGTGCACCGCTAAACCACCGTAAATCCAAAGAGACCGTAAATCT

CTTCCACGCACTCTGTCGTGTACCAACGTGCTGTGGAAACGCTC

ACGTACCTTTGTGTATTATGTACGGAnCGGGCAACGGACATTT

CGACGTCGGTTTGCCAGTCCNATTCCCATCTGAACCACACATCT

CTGAACAAAAGTAGGGGAGGCGCCCGCGTAGCCCCCTTTCCCAC

AATCCCACTCCGTGCCAGGTGCCACCCTCCCCAAGCCCTCGCGC

CGCTCCGAGACAGCCGCCCGCAACCATGGCCACCGCCGCCACCG

CGGCCGCCGCGCTCACC

FIG. 1

CCGGATTTCCCTGHGCGGATTGCGGGTGGCAGCCTGGCAGGTG

GGTGCGACCCCGTHGGATTCCCKGTCTGGGCCCCHGTGTCA

GTACCGTCTGTACTCCGATGACATGCACCGTCGTCCACAGTCAA

GTCCAAAATCTCCCCTCTTTTTTTTAACGGAACAGTTCAAAACC

TCCTTGACGCACGCTGTCGTGTACCAGCACTCGGTGGACACCAC

GKTGTAATCCAGGCCGACACGTCGGTCCCACGTCGACAGGCCC

CACCGTCCGGTCTGTAGCGTGTACGTAnCGGGCGACGGACGTG

TCGTCGTCGTCTTGCGAGTCCCATTCCCATCACCATCTGAGCCA

CACATCCTCTGAACAAAAGCAGGGAGGCCTCCACGCACATCCCC

CKTCTCCACTCCGGTCCGTGGCACCCACCCCAAACCCTCGCGC

CGCCTCCGAGACAGCCGCCGCAACCATGGCCACCGCCGCCGCCG

CGTCTACCGCGCTCACTGGCGCCAC

FIG.2

188 062

CTGCAGGTCA ACGGATCACC TATCAACATC CCAGCTAAAA ACAGTAAAAA GGGGGAAAAC GTGGGTGAGT TGAGTCTGTC TTGTGGAAAA AACGTTTTAG TTTCTCCTGG AATTAACAAT AAAAACAGTT GAACAAGATT GACTGTTCCT CCGGGAGGGT T7GGAACATC GTTACAGATG TGAGCGAAAG GTGAGGAAAC AGAGCGGAGG GCTTGGAGGT GACCTCGGTA GTCGACGCCG GAGTTGAGCT TGATGACGAC ACCGTACTGG CGTACCAGGC CTAGTAGTGA ACACCGGGCC TGAAGCTGTC GCCGCCGCTG CTCATCTTGT GGGCTGTGCC CGGTGTCCCT GTTGCGGATT GCGGGTGGCA GCCTGGCAGG TGGGTGCGAC CCGTTTGGAC TCCCTGATCT GGGCCCTTTG TGTCAGTACC GTCTGTACTC CGATGACATG CACACCGTCG TCCACAGTCA AGTCCACAAT CTCCCCTCTT TTTTTAACGG AATAGTTCAA AATCTCCTTG ACGCACGCTA TCGTGTACCA GCGCTCACTG GACACCACGT TTGTAATCCA CGCCGACACG TCGGTCCCAC GTCGACAGGC CCCACCGTCC GGTCTGTAGC GTGTACGTAT TCGGGCGACG GACGTGTCGT CGTCGTCTTG CGAGTCCCAT TCCCATCACC ATCTGAGCCA CACATCCTCT GAACAAAAGC AGGGAGGCCT CTACGCACAT CCCCCTTTCT CCCACTCCGT GTCCGTGGCA CCCACCCCAA ACCCTCGCGC CGCCTCCGAG AGAGCCGCCG CAACCATGGC CACCG

FIG.3

188 062

RYZ KOMÓRKI BMS

RICE	BMS
	ΕΧΡΓ I	ΕΧΡΤ IE	ΕΧΡΤ III	ΕΧΡΤ 1	ΕΧΡΤ 11	ΕΧΡΤ I
^aLS2 GUS	Dośw. I	Dośw. Tl	Dośw. ]II	Dośw. I	Oośw. II	2275
						6117
			1129			3234
	3040	8337	1033	3174		2060
	2413	SI 10	1187	1269	7295	4018
	2847	9021	1999	4145	9419	3369
AvFRAGE	2/6?	7157	1337	2B63	8357	3149
S7D DtV	323	1780	44b	1463		997

Średnie odchylenie

standardowe
3SS-GII5						334
						624
			1882			1032
	970		1097	348		341
	11/5	2430	1235	540	1021	384
	1732	3435	731	292	1228	359
AVERAGE	1292	2933	1236	393	1125	529
STO OEV	394		480	130		336

Średnie odchylenie standardowe

RAT JO OF ALS/J55 Poziom AlS/355

FIG.4A

188 062

FIG.4B

F1G.4C

188 062

- £ un o CO £= c =? o 3 10 (J) < >.=»

-M O i

c Jlu co 11 i IZ 3 O —I

Μ Γ-» Tf* ^cocnomcnoo^rOw-cocoo tOCnCMO’— Γ-ΟσΜ’Μ-ΟΟ^ΟΜ'Οΐ*')’— —-·— csjmmm^uDr^oocO’— *- cm

CnłOCNrOin-^COOm^rOlO — to cD’—com·—r^rsjton-5rnr*— i— o

LD

O

CM CM — — (e>({E!q/ snt) osoumX4>(V (N3lI0dd &iu/uHu/|ouid) A1I/\LLOV SD9

188 062

FIG.6C

FIG.6D

188 062

FIG.7A

FIG.7B

FIG.7D

FIG.7C

188 062

FIG.8A FIG.8B

FIG.8C FIG.8D

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sekwencja nukleotydową promotora genów alsl lub als2 AHAS kukurydzy wybrana jest z grupy sekwencji nukleotydowych według Sekw. Id. Nr 1, Sekw. Id. Nr 2, Sekw. Id. Nr 3.
2. Konstrukt kwasu nukleinowego obejmujący sekwencję nukleotydową promotora AHAS z kukurydzy określonego w zastrz. 1 funkcjonalnie połączoną z sekwencją kodującą genu heterologicznego.
3. Konstrukt według zastrz. 2, znamienny tym, że genem heterologicznym jest gen beta-Glukuronidazy (GUS).
4. Wektor do transformacji obejmujący sekwencję nukleotydową określoną w zastrz. 1 lub konstrukt kwasu nukleinowego określony w zastrz. 2 lub 3.
5. Komórka roślinna obejmująca sekwencję nukleotydową określoną w zastrz. 1 lub konstrukt kwasu nukleinowego określony w zastrz. 2 lub 3 lub wektor do transformacji określony w zastrz. 4.
6. Sposób otrzymywania roślin transgenicznych mających wbudowane określone promotory kierujące pożądaną ekspresją genów, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) transformowania rekombinacyjnego rośliny lub żądanej części rośliny sekwencją nukleotydową określoną w zastrz. 1 lub konstruktem kwasu nukleinowego określonym w zastrz. 2 lub 3 lub wektorem do transformacji określonym w zastrz. 4 i

b) wykrywania produktu ekspresji genu heterologicznego w transformowanej roślinie lub żądanej części rośliny.
7. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej określonej w zastrz. 1 do ekspresji konstytutywnej genów na wysokich poziomach w roślinie i/lub w różnych tkankach rośliny.
8. Zastosowanie według zastrz. 7 do ekspresji genu w roślinach jednoliściennych lub dwuliściennych lub w żądanych częściach tych roślin.
9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że ekspresja genów kierowanych przez promotor AHAS kukurydzy nadaje oporność na herbicydy, detoksyfikację i/lub oporność na patogeny roślinne.
10. Zastosowanie według zastrz. 7 do wytwarzania wektora do transformacji do roślin lub części roślin.
11. Zastosowanie konstruktu kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 2 lub 3 do wytwarzania wektora do transformacji roślin lub części roślin.