JPH10508204A - イズロン酸を高含有量有する多糖類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ａ）大腸菌からの多糖Ｋ５若しくはヘパラン硫酸のＮ−脱アセチル化、又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸のＯ−脱硫酸化を行う段階と、ｂ）段階ａ）から得られた生成物をＮ−硫酸化する段階と、ｃ）Ｃ５エピメラーゼ酵素の存在下、エピマー化する段階と、ｄ）少なくとも幾つかの遊離水酸基を硫酸化する段階とから成り、しかも、段階ｃ）は、ＨＥＰＥＳ、塩化カリウム、ＥＤＴＡによって構成される伝統的緩衝液と、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００とから成る反応媒体であって、その反応媒体へ適切な添加剤が添加された反応媒体の中で行う、上記方法。

Description

【発明の詳細な説明】 イズロン酸を高含有量有する多糖類 従来技術 グリコサミノグリカンは、例えば、腸粘膜、肺等、種々の起源(origin)を有す る動物組織を抽出することによって得られる物質であり、詳しくは、イズロン酸 を含有する多糖類に属する。ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸及び ヒアルロン酸は、多糖類群に属する。 種々のグリコサミノグリカンは、種々の化学構造を有し、ウロン酸及びヘキソ サミンの繰り返しによって構成される多糖類鎖によって形成される。特に、ヘパ リン及びヘパラン硫酸の場合、ウロン酸はグルクロン酸又はイズロン酸によって 形成され、ヘキソサミンの場合はグリコサミンによって形成される。 グリコサミンは、選択的にＮ−アセチル化され（ヘパラン硫酸）又は選択的に Ｎ−硫酸化され（ヘパリン）、かつ６−０硫酸化される。更に、硫酸基はグリコ サミンの３の位置にも見いだすことができる。ウロン酸は２−０硫酸化される。 ヘパリンは、抗凝固薬(anticoagulant)及び抗血栓症薬(antithrombotic)とし て臨床実務において非常に重要である。 かかる治療上の用途の他に、他の幾つかの病理におけるヘパリン及びヘパラン 硫酸の有用な利用、例えば、抗高脂血症機能、抗増殖機能、抗ウィルス機能、抗 腫瘍機能及び抗血管形成機能に関する利用が期待される。 これらの新規な治療応用において、ヘパリン及びヘパラン硫酸を利用するため には、抽出法とは異なる方法、特に、異なる構造の調製を認めた一層柔軟性のあ る方法によって、これらの生成物又は同等の生成物を入手する必要がある。 また、動物組織からの抽出方法では、ウィールスを含んでいない生成物を入手 することが保証されない。 抗凝固薬のグリコサミノグリカンの、生合成による製法は、特許出願ＷＯ ９ ２／１７５０７号明細書に記載されている。この方法では、次の反応シーケンス ー Ｎ−脱アセチル化、 - Ｎ−硫酸化、 - Ｄ−グルクロン酸の少なくとも幾らかの残渣をＬ−イズロン酸の残渣に転化 するためのエピマー化、及び - 少なくとも幾らかの遊離水酸基の硫酸化 を受ける、大腸菌からの多糖類Ｋ５は、出発化合物として使用する。 この方法で重要な段階は、最大２０％まで制限されるエピマー化によって構成 される。このエピマー化は、ＨＥＰＥＳ、塩化カリウム、ＥＤＴＡ及びＴＲＩＴ ＯＮ Ｘ−１００によって構成されるｐＨ７．４までの伝統的反応媒体中の、Ｄ −グルクロニル−Ｌ−イズロニル−Ｃ５−エピメラーゼ酵素の存在下、室温で２ 日間行う。ウロン酸の３分の１まで制限されるエピマー化は、従来説明されてき た（Ｍ．フック(Hook)等：ザ・ジェイ・オブ・バイオケミ(The J．of Biol．Che m.)，２４９，１２ ３９０８〜３９１５，１９７４年６月２５日）。しかも、 このエピマー化度は、今まで克服できていないように思える。更に、この資料で は、細胞雰囲気におけるエピマー化は、生合成方法に関するあらゆる要因が存在 する条件での、ネズミの肥満細胞腫について記載されていることを考慮する必要 がある。 しかし、既知の技術から得られるようなエピマー化度は、種々の治療処理のた めに要求される諸特性を有する生成物を得ることを可能にしない。 実際、イズロン酸はグルクロン酸に関する生成物に優れた適応性(flexibility ,柔軟性)を与える［カズ(Casu)Ｂ．，ペチト(Petitou)Ｍ．，プロファゾリ(Prov asoli)Ｍ．及びジネイ(Sinay)Ｐ．（１９８８），「配座適応性(Conformational flexibility)：イズロン酸含有グリコサミノグリカンの結合特性及び生物特性 を説明するための新しい概念」，トレンド・バイオケミ科学(Trends Biochem．S ci．１３，２２１〜２２５］。ヘパラン硫酸に比べてヘパリンの一層大きい抗凝 固性と抗血栓症活性と、基礎線維母細胞成長要因(basic fibroblast growth fac tor)（ｂＦＧＦ）に関するものの他の活性とによって指摘されている通り、イズ ロン酸を高い率で含有する生成物は、グルクロン酸を含有するものと比べ一層活 性であるという結果になり、しかも、イズロン酸は、活性点の極めて重要な部分 であることが認識されている［マッカラナ(Maccarana)Ｍ．，カズ(Casu)Ｂ． 及びリンダール(Lindahl)Ｕ．（１９９３），「基礎線維母細胞成長要因の結合 のために必要なヘパリン／ヘパラン硫酸の最小シーケンス(Minimal sequence in Heparin/Heparan Sulfate Required for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor)」，Ｊ．バイオケミ(Biol．chem.)，２６８，２３８９８〜２３９０５ ］。従って、工業的観点に従って受け入れられる収率と時間とを満たす、高いエ ピマー化度を有する生成物を得ることを可能にする方法を見いだす課題が存在す る。 概要 ａ）多糖Ｋ５若しくはヘパラン硫酸のＮ−脱アセチル化、又はヘパリン若しく はヘパラン硫酸のＯ−脱硫酸化を行う段階と、 ｂ）段階ａ）から得られた生成物をＮ−硫酸化する段階と、 ｃ）Ｄ−グルクロニル−Ｌ−イズロニル−Ｃ５−エピメラーゼ酵素の存在下、 １回以上のエピマー化処理を行う段階と、 ｄ）少なくとも幾つかの遊離水酸基を硫酸化する段階と から成る方法であって、前記エピマー化段階は、ＨＥＰＥＳ、塩化カリウム及び ＥＤＴＡによって形成されるｐＨ７．４の伝統的緩衝液から成る反応媒体であっ て、その反応媒体へ、エチレングリコール、グリセロール、ポリビニルピロリド ン、ポリエチレングリコール及びホスファチジルコリンから成る群から選ばれた １種以上の添加剤及びＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００が添加された反応媒体の中で行 うことを特徴とする方法によって、大腸菌からの多糖Ｋ５から、又はヘパリン若 しくはヘパラン硫酸から出発して、大きい含有量のイズロン酸を有する多糖類が 得られることを、我々は見いだした。 本発明の方法によって、ウロン酸全含有量に基づき５０％よりも大きい含有量 のイズロン酸を有する多糖類が得られる。 発明の詳細な説明 本発明の方法と得られた多糖類との特徴及び利点は、次の詳細な説明の中にほ とんど示される。 マンゾニ(Manzoni)Ｍ．，ベルゴミ(Bergomi)Ｓ．，カバゾニ(Cavazzoni)Ｖ． ［ジャーナル・オブ・バイオアクティブ・アンド・コンパティブル・ポリマーズ (Journal of Bioactive and Compatible Polymers)，第VIII巻，１９９３年７月 ，２５１〜２５７］に説明されている、大腸菌からの多糖Ｋ５は、本発明の方法 のための出発物質として使用するのに特に適した物質である。 ヘパリン及びヘパラン硫酸は、プロセスの第１段階の操作条件の幾らかの変動 はあるが、出発物質として使用することもできる。 出発物質は、２，０００〜５０，０００以上の範囲に及ぶ分子量を持っていて もよい。 多糖Ｋ５を使用するとき、その構造は先ずＮ−脱アセチル化によって変性され る。Ｎ−脱アセチル化は、ヒドラジンと硫酸ヒドラジンとの混合物で処理するこ とによって、又は水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの塩基雰囲気中で処理す ることによって行う。 そこで、Ｎ−硫酸化は、トリエチルアミン−三酸化イオウ又はトリメチルアミ ン−三酸化イオウで処理することによって続けられる。種々に（例えば２５％か ら１００％まで）Ｎ−硫酸化された生成物は、かかる操作によって得ることがで きる。 Ｎ−脱アセチル化及びＮ−硫酸化は、既知の技術に従って、例えば、特許出願 番号ＷＯ ９２／１７５０７明細書に従って行う。 ヘパリンを出発物質として使用するとき、先ずＯ−脱硫酸化を、次いで、Ｏ− 脱硫酸化の間に硫酸基を失ったアミノ位置を再度硫酸化すべくＮ−硫酸化を行う 。 ヘパラン硫酸を出発物質として使用するとき、Ｎ−脱アセチル化もＯ−脱硫酸 化も結果としてのＮ−再硫酸化も行う。 上記の通り、多糖Ｋ５から又はヘパラン硫酸から得たＮ−硫酸化済み生成物は 、グルクロン酸をイズロン酸に転化すべくエピマー化プロセスにかける。一方、 ヘパリンから得た生成物は、イズロン酸からグルクロン酸を得るべく酵素で処理 する。 エピマー化は、ウシの肝臓から抽出し、「Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５５，３８７８〜３ ８８３（１９８０）」でＡ．マルムストレン(Malmstron)によって記載された方 法を用いて精製したＤ−グルクロニル−Ｌ−イズロニル−Ｃ５−エピメラーゼ酵 素（以下、単に、Ｃ５エピメラーゼという）の存在下で行う。 驚愕すべきことに、出願人は、伝統的反応媒体を適切な添加剤で変性すること によって、非常に高度のエピマー化を得た。 本発明による反応媒体は、ＨＥＰＥＳ、塩化カリウム、ＥＤＴＡ及びＴＲＩＴ ＯＮ Ｘ−１００によって構成されるｐＨ７．４の緩衝液であり、エチレングリ コール、グリセロール、ポリビニルピロリドン、特に１５，０００〜９０，００ ０の分子量を有するポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及びホスフ ァチジルコリンから成る群から選ばれた１種以上の添加剤を、緩衝液の粘度を１ ．１〜３センチストークの範囲の値に増加させるのに適した量で添加する。 特に、反応媒体は、ｐＨ７．４を有する次の緩衝液：ＨＥＰＥＳ ０．０４Ｍ 、ＫＣｌ ０．４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍから出発し、次いで、この緩衝液の ２５ｍｌへ１００〜１０００μｌのＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００と、０．５ｍｌ〜 ６０ｍｌの添加剤と、蒸留水を１００ｍｌになるまで添加して調製する。 エピマー化するための多糖は、５〜１０００ｍｇの量の前記反応媒体へ添加し 、溶液Ａを得る。 Ｃ５エピメラーゼは、別個に、１００ｍｌ当り２１〜２０００μｇの量の、前 記と同じ反応媒体に溶解し、溶液Ｂを得る。 溶液Ｂは、混合物１００ｍｌ当りＣ５エピメラーゼ１．５〜１５．０００μｇ の含有量を得るような割合で溶液Ａへ添加し、エピマー化を行う。混合物は、攪 拌を行って均一にし、次いで、恒温室中で３０〜４０°Ｃの範囲の温度で９０分 〜１５時間の範囲の時間の間加温する。 反応は、混合物を１００°Ｃで５分間加温して停止させる。生成物は、緩衝液 として（ＮＨ₄）ＨＣＯ₃ ０．０５Ｍを使用したＤＥＡＥ−セファセル(Sephace l)カラムを通して精製し、生成物は（ＮＨ₄）ＨＣＯ₃ ２Ｍの緩衝液を用いて溶 出する。 集めた画分はセファデックス(Sephadex)Ｇ−１５カラムによって脱塩し、生成 物を含有する画分は減圧下で凍結乾燥し、次いで、生成物は１Ｈ−ＮＭＲで分析 する。 Ｄ−グルクロン酸とＬ−イズロン酸の含有量は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによ って計算する。得られた生成物は、溶液Ａに再溶解し、溶液Ｂで再度処理し、更 にエピマー化処理を行って、Ｌ−イズロン酸の含有量を増加させる。 抗凝固性と抗血栓症活性度を評価すべく、エピマー化済み生成物は、硫酸化剤 としてピリジン−三酸化イオウを使用し、例えば、「第ＸIV回国際炭水化物シン ポジウム(the ＸIV International Carbohydrate Symposium)（１９８８年８月 １４〜１９日），ストックホルム」のアブストラクトでオガモ(Ogamo)等が説明 した方法を用いてＯ−硫酸化を行う。本発明の方法によって得られた、例１、３ 、４、５、６、７及び９の生成物は、後で説明する通り、Ｏ−硫酸化を行い、優 れた抗凝固性と抗血栓症活性度を示した。一方、既知の技術によって得られた、 例２及び８の生成物は、非常に小さい活性度を示した。 得られた結果は、本発明による生成物は、抗凝固性と抗血栓症機能とによる臨 床用途に適した特性を有する。従って、この生成物は、補助薬(adjuvant)物質及 び添加剤(excipient)物質と混合した適切な薬剤組成物を調製するために使用し 得る。 本発明による方法を説明すべく、次の例を公表する。 例１ ＨＥＰＥＳ ０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍ、ＫＣｌ ０．４Ｍを含有す るｐＨ７．４の緩衝液を調製し、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ ２７μｌと、１０ ％ポリビニルピロリドンＫ１５水溶液９ｍｌと、エチレングリコール１．６２ｍ ｌと、全体積が１８ｍｌになるまでの水とを前記緩衝液４．５ｍｌへ添加した。 この溶液は、１．４１センチストークの粘度を示した。この溶液に、１００％ Ｎ−脱アセチル化Ｎ−硫酸化済みＫ５の１ｍｇを溶解し、溶液Ａを得た。１０ ％ポリビニルピロリドンＫ１５の水溶液１．６ｍｌと、エチレングリコール２８ ８μｌと、全体積が３．２ｍｌになるまでの水とを、８．９μｇのＣ５エピメラ ーゼを含有したｐＨ７．４の同一出発緩衝液０．８ｍｌへ添加し、溶液Ｂを得た 。 溶液Ａを１．６ｍｌの溶液Ｂと混合し、その混合物を温室中３７°Ｃで４時間 保持した。４時間後、溶液Ｂ １．６ｍｌを添加し、次いで、その反応は一夜３ ７°Ｃに保持した。その反応は、１００°Ｃで５分間加熱することによって停止 した。 生成物は、緩衝液として０．０５Ｍ（ＮＨ₄）ＨＣＯ₃を使用しながら、ＤＥＡ Ｅ−セファセル・カラム(Sephacel column)（２×１．５ｃｍ）によって精製し 、得られた生成物は、２Ｍ（ＮＨ₄）ＨＣＯ₃を用いて溶出した。 生成物を含有する分画は、セファデックス(Sephadex)Ｇ−１５カラム（０．３ ×５ｃｍ）で脱塩し、凍結乾燥した。 生成物は、１Ｈ−ＮＭＲで分析し、そのスペクトルを図１に示す。 全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、５５であった。 例２（比較） ポリビニルピロリドン及びエチレングリコールを添加しないという相違を持っ て、例１を繰り返した。使用した緩衝液は、水にほぼ等しい粘度、即ち約ゼロの 粘度を有した。 得られた生成物に関する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図２に示す。イズロン酸と グルクロン酸との総量に基づくＬ−イズロン酸の含有量は、１８％に等しいこと が分かった。 例３ Ｎ−脱アセチル化し５０％Ｎ−硫酸化した多糖Ｋ５を出発物質として使用した という相違を持って、例１を繰り返した。 得られた生成物は１Ｈ−ＮＭＲで分析し、関連スペクトルを図３に示す。 Ｌ−イズロン酸の含有量は、Ｎ−硫酸化済みグリコサミンへの局部的な全ウロ ン酸に基づき５１％に等しいことが分かった。 例４ ＥＤＴＡ ０．０６Ｍと、ＫＣｌ ０．４Ｍ（ｐＨ７．４）と、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ ３０μｌと、１０％ポリビニルピロリドンＫ１５の水溶液１０． ６ｍｌと、エチレングリコール０．８５ｍｌと、水４．４２ｍｌとを、ＨＥＰＥ Ｓ ０．０４Ｍを含有する緩衝液５．３ｍｌへ添加した。 この溶液は、１．２センチストークの粘度を示した。 この溶液の９ｍｌに、１００％ Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたＫ５ の２ｍｇを溶解し、溶液Ａを得た。 Ｃ５エピメラーゼ１．７μｇを同溶液の８ｍｌに溶解し、溶液Ｂを得た。 生成物は、例１に記載の通りに精製した。 凍結乾燥した後、精製済み生成物は、溶液Ａの１ｍｌに溶解し、次いでＣ５エ ピメラーゼ８．９μｇを含有する溶液Ｂの３．２ｍｌと混合した。 この混合物は、一夜３７°Ｃに保持し、酵素は１００°Ｃで５分間加熱するこ とによって不活性化した。生成物は、例１に記載の通りに精製し、図４に示す通 り、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。 全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、５３であった。 例５ ＨＥＰＥＳ ０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍ、ＫＣｌ ０．４Ｍを含有す るｐＨ７．４の緩衝液を調製し、次いで、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ ２２．８ μｌと、１００％ Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたＫ５の１ｍｇと、エ チレングリコール４０％を含有する、２０％ポリビニルピロリドンＫ１５の溶液 ４ｍｌと、全体積が８ｍｌになるまでの水とを、この溶液２ｍｌへ添加した。Ｈ ＥＰＥＳ ０．０１Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０１５Ｍ、ＫＣｌ ０．０１Ｍ、ＴＲＩ ＴＯＮ Ｘ−１００ ０．０１５％及びＣ５エピメラーゼ１３４．４μｇをこの 溶液の６ｍｌに添加した。 得られた溶液は、１．３６センチストークの粘度を示した。 この混合物は、３７°Ｃに１時間保持した。反応は１００°Ｃで５分間煮沸す ることによって停止した。 生成物は、例１に記載の通りに精製した。 凍結乾燥した後、生成物は、ＨＥＰＥＳ ０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍ 及びＫＣｌ ０．４Ｍの６．２５ｍｌを含有するｐＨ７．４の緩衝液と、ポリビ ニルピロリドンＫ１５ ２．５ｇと、エチレングリコール２．５ｍｌと、ＴＲＩ ＴＯＮ Ｘ−１００ ７１．２μｌと、全体積が２５ｍｌになるまでの水との中 に溶解した。 ＨＥＰＥＳ ０．０１Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０１５Ｍ及びＫＣｌ ０．１Ｍのｐ Ｈ７．４の１２ｍｌ（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ ０．０１５％を含有する）に 溶解したＣ５エピメラーゼ１．９μｇを、得られた混合物１２ｍｌへ添加した。 混合物は、１．４センチストークの粘度を示した。 この反応は、一夜３７°Ｃに保持した。反応の終りに、溶液を１００°Ｃで５ 分間加熱することによって酵素を不活性化した。生成物は、例１に記載の通りに 精製し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをとった（図５）。 全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、５２であった。 例６ 例５を繰り返した。但し、第一段階の反応は３７°Ｃで４時間保持した。 例１と同じ条件で精製し、凍結乾燥した後、生成物を水１ｍｌに溶解し、次い で、ＨＥＰＥＳ ０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍ及びＫＣｌ ０．４Ｍのｐ Ｈ７．４の５０ｍｌを含有する緩衝液と、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００の２８３． ５μｌと、１０％ポリビニルピロリドンＫ１５の１００ｍｌと、エチレングリコ ール２０ｍｌと、９０％グリセロール２ｍｌと、Ｃ５エピメラーゼ１．９μｇと 、全体積が２００ｍｌになるまでの水とへ添加した。混合物は、１．４１センチ ストークの粘度を示した。 反応は３７°Ｃで４時間保持し、酵素は１００°Ｃ、５分間で不活性化した。 生成物は、例１に記載の通りに精製し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをとった（図 ６）。 全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、５５であった。 例７ １００％ Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたＫ５の１．５ｍｇを、ＨＥ ＰＥＳ ０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍ、ＫＣｌ ０．４ＭのｐＨ７．４の ７ｍｌを含有する緩衝液と、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００の２１０μｌと、ポリビ ニルピロリドンＫ１５の１．４ｇと、エチレングリコール２．８ｍｌと、Ｃ５エ ピメラーゼ１．５ｍｇと、全体積が２８ｍｌになるまでの水との中へ添加した。 溶液は、１．３６センチストークの粘度を示した。 反応は３７°Ｃで４時間保持し、酵素は１００°Ｃ、５分間で不活性化した。 生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで凍結乾燥した。次いで、生成物 は、Ｃ５エピメラーゼ１．３ｍｇを含有する同じ溶液の２４ｍｌに溶解し、反応 は３７°Ｃで４時間保持し、酵素は１００°Ｃ、５分間で不活性化した。 生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで凍結乾燥した。次いで、生成物 は、Ｃ５エピメラーゼ１ｍｇを含有する同じ溶液の８．４ｍｌに溶解し、反応は ３７°Ｃで４時間保持した。 生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをとっ た（図７）。 全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、８０であった。 例８（比較） １００％ Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたＫ５の１ｍｇを、ＨＥＰＥ Ｓ ０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍ、ＫＣｌ ０．４ＭのｐＨ７．４の３ｍ ｌを含有する緩衝液と、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００の１８μｌと、アセトン１． ２ｍｌと、Ｃ５エピメラーゼ１．９μｇと、全体積が１２ｍｌになるまでの水と の中で溶解した。 溶液は、０．０９センチストークの粘度を示した。 反応は３７°Ｃで４時間保持した。 生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをとっ た（図８）。 全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、０であった。 例９ １００％ Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたＫ５の１ｍｇを、ＨＥＰＥ Ｓ ０．０４Ｍ、ＥＤＴＡ ０．０６Ｍ、ＫＣｌ ０．４ＭのｐＨ７．４の２ｍ ｌを含有する緩衝液と、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００の１２μｌと、２．４％ポリ ビニルピロリドンＫ９０の１．３３６ｍｌと、Ｃ５エピメラーゼ３０４μｇと、 全体積が８ｍｌになるまでの水との中で溶解した。 溶液は、１．２９センチストークの粘度を示した。 反応は３７°Ｃで４時間保持し、酵素は１００°Ｃ、５分間で不活性化し、次 いで、溶液は、０．２２μｍデバイスで濾過した。 Ｃ５エピメラーゼ３０４μｇを含有する同じ混合物８ｍｌを、前記濾過済み溶 液へ添加し、反応は３７°Ｃで４時間保持し、酵素は１００°Ｃ、５分間で不活 性化し、次いで、その溶液は０．２２μｍデバイスで濾過した。 Ｃ５エピメラーゼ３０４μｇを含有する同じ混合物８ｍｌを、この溶液へ添加 し、反応は３７°Ｃで４時間保持し、酵素は１００°Ｃ、５分間で不活性化し、 次いで、その溶液は０．２２μｍデバイスで濾過した。 生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをとっ た（図９）。 全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、５９であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１０月３日 【補正内容】 請求の範囲 １． ａ）多糖Ｋ５若しくはヘパラン硫酸のＮ−脱アセチル化、又はヘパリン若 しくはヘパラン硫酸のＯ−脱硫酸化を行う段階と、 ｂ）段階ａ）から得られた生成物をＮ−硫酸化する段階と、 ｃ）Ｃ５エピメラーゼ酵素の存在下、１回以上のエピマー化処理を行う段階と 、 ｄ）少なくとも幾つかの遊離水酸基を硫酸化する段階と から成る、大腸菌からの多糖Ｋ５から、又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸から 出発して、ウロン酸全含有量に基づき５０％よりも大きい含有量のＬ−イズロン 酸を有する多糖類を調製する方法であって、 前記エピマー化段階は、ＨＥＰＥＳ、塩化カリウム及びＥＤＴＡによって構成 されるｐＨ７．４の伝統的緩衝液から成る反応媒体であって、その反応媒体へ、 前記緩衝液の粘度を１．１〜３ｍｍ²／秒（１．１〜３センチストーク）の範囲 の値へ増加させるのに適した量の１種以上の添加剤及びＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１０ ０が添加された反応媒体の中で行い、しかも、前記１種以上の添加剤は、エチレ ングリコール、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール 及びホスファチジルコリンから成る群から選ぶことを特徴とする、上記方法。 ２．添加剤は、１５，０００〜９０，０００の分子量を有するポリビニルピロリ ドンである、請求項１記載の方法。 ３．添加剤を、緩衝液２５ｍｌにつき０．５〜６０ｍｌの量で緩衝液へ添加する 、請求項１記載の方法。 ４．出発化合物を、反応媒体中に１００ｍｌ当り５〜１０００ｍｇの量で溶解さ せる、請求項１記載の方法。 ５．Ｃ５エピメラーゼを、反応媒体中に１００ｍｌ当り２１〜２０００μｇの量 で溶解させる、請求項１記載の方法。 ６．エピマー化のための混合物は、Ｃ５エピメラーゼを、その混合物１００ｍｌ 当り１．５〜１５，０００μｇの量で含有する、請求項１記載の方法。 ７．エピマー化反応は、恒温室中、３０〜４０°Ｃの範囲の温度で行う、請求項 １記載の方法。 ８．出発生成物は、２５％〜１００％ Ｎ−硫酸化する、請求項１記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）多糖Ｋ５若しくはヘパラン硫酸のＮ−脱アセチル化、又はヘパリン若し くはヘパラン硫酸のＯ−脱硫酸化を行う段階と、 ｂ）段階ａ）から得られた生成物をＮ−硫酸化する段階と、 ｃ）Ｃ５エピメラーゼ酵素の存在下、１回以上のエピマー化処理を行う段階と 、 ｄ）少なくとも幾つかの遊離水酸基を硫酸化する段階と から成る、大腸菌からの多糖Ｋ５から、又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸から 出発して、ウロン酸全含有量に基づき５０％よりも大きい含有量のＬ−イズロン 酸を有する多糖類を調製する方法であって、 前記エピマー化段階は、ＨＥＰＥＳ、塩化カリウム及びＥＤＴＡによって構成 されるｐＨ７．４の伝統的緩衝液から成る反応媒体であって、その反応媒体へ、 前記緩衝液の粘度を１．１〜３ｍｍ²／秒（１．１〜３センチストーク）の範囲 の値へ増加させるのに適した量の１種以上の添加剤及びＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１０ ０が添加された反応媒体の中で行うことを特徴とする、上記方法。 ２．添加剤は、エチレングリコール、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポ リエチレングリコール及びホスファチジルコリンから成る群から選ぶ、請求項１ 記載の方法。 ３．添加剤は、１５，０００〜９０，０００の分子量を有するポリビニルピロリ ドンである、請求項１記載の方法。 ４．添加剤を、緩衝液１００ｍｌにつき２〜２４０ｍｌの量で緩衝液へ添加する 、請求項１記載の方法。 ５．出発化合物を、反応媒体中に１００ｍｌ当り５〜１０００ｍｇの量で溶解さ せる、請求項１記載の方法。 ６．Ｃ５エピメラーゼを、反応媒体中に１００ｍｌ当り２１〜２０００μｇの量 で溶解させる、請求項１記載の方法。 ７．エピマー化のための混合物は、Ｃ５エピメラーゼを、その混合物１００ｍｌ 当り１．５〜１５，０００μｇの量で含有する、請求項１記載の方法。 ８．エピマー化反応は、恒温室中、３０〜４０°Ｃの範囲の温度で行う、請求項 １記載の方法。 ９．出発生成物は、２５％〜１００％ Ｎ−硫酸化する、請求項１記載の方法。 １０．多糖類はウロン酸全含有量に基づき５０％よりも大きい含有量のＬ−イズ ロン酸を有し、請求項１記載の方法によって得られることを特徴とする、上記多 糖類。 １１．抗凝固性及び抗血栓症活性を有する製薬組成物を調製するために、請求項 １０記載の多糖類を使用する方法。