JPH1084946A - ラクトバチラス・ファーメンタムｕｋｕ−２株及びｄ−乳酸脱水素酵素の製造方法 - Google Patents
ラクトバチラス・ファーメンタムｕｋｕ−２株及びｄ−乳酸脱水素酵素の製造方法Info
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- JPH1084946A JPH1084946A JP8244526A JP24452696A JPH1084946A JP H1084946 A JPH1084946 A JP H1084946A JP 8244526 A JP8244526 A JP 8244526A JP 24452696 A JP24452696 A JP 24452696A JP H1084946 A JPH1084946 A JP H1084946A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高いＤ−乳酸脱水素酵素産生能を有する微生
物及びそれを用いたＤ−ＬＤＨの製造方法を提供する。 【解決手段】 Ｄ−乳酸脱水素酵素産生能を有すること
を特徴とするラクトバチラス・ファーメンタム（Lactob
acillus fermentum ）ＵＫＵ−２株。
物及びそれを用いたＤ−ＬＤＨの製造方法を提供する。 【解決手段】 Ｄ−乳酸脱水素酵素産生能を有すること
を特徴とするラクトバチラス・ファーメンタム（Lactob
acillus fermentum ）ＵＫＵ−２株。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−乳酸脱水素酵
素（以下Ｄ−ＬＤＨと略記する）産生能を有する菌株及
びそれを用いたＤ−ＬＤＨの製造方法に関するものであ
り、さらに詳しくは、Ｄ−ＬＤＨ産生能の高いラクトバ
チラス・ファーメンタム（Lactobacillusfermentum ）
ＵＫＵ−２株及びそれを用いたＤ−ＬＤＨの製造方法に
関するものである。
素（以下Ｄ−ＬＤＨと略記する）産生能を有する菌株及
びそれを用いたＤ−ＬＤＨの製造方法に関するものであ
り、さらに詳しくは、Ｄ−ＬＤＨ産生能の高いラクトバ
チラス・ファーメンタム（Lactobacillusfermentum ）
ＵＫＵ−２株及びそれを用いたＤ−ＬＤＨの製造方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素は、その反応がマイルドな条
件で起こること、基質との結合が特異的であること、反
応を光学的に定量することが容易であること等の優れた
点が注目され、医療分野や食品の成分分析等に広く利用
されている。そのなかでＤ−ＬＤＨは臨床検査等の分野
で、血清や尿中のピルビン酸の定量、トランスアミナー
ゼやピルビン酸キナーゼの活性測定等に用いられてい
る。また、Ｄ−ＬＤＨは、Ｄ−乳酸の工業的製造にも用
いられている。
件で起こること、基質との結合が特異的であること、反
応を光学的に定量することが容易であること等の優れた
点が注目され、医療分野や食品の成分分析等に広く利用
されている。そのなかでＤ−ＬＤＨは臨床検査等の分野
で、血清や尿中のピルビン酸の定量、トランスアミナー
ゼやピルビン酸キナーゼの活性測定等に用いられてい
る。また、Ｄ−ＬＤＨは、Ｄ−乳酸の工業的製造にも用
いられている。
【０００３】従来、Ｄ−ＬＤＨを産生する微生物として
は、ラクトバチラス（Lactobacillus ）属、ロイコノス
トック（Leuconostoc ）属、スタフィロコッカス（Stap
hylococcus）属等に属する微生物が知られている〔マイ
クロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Re
views ）、４４巻、１０６〜１３９頁（１９８０
年）〕。また、特表平７−５０８１６５号公報には、Ｄ
−ＬＤＨ産生能が高い微生物として、ラクトバチラス
（Lactobacillus ）属のＤ−ＬＤＨ遺伝子で形質転換さ
れた酵母が開示されており、この酵母のＤ−ＬＤＨ含有
量は１０Ｕ／ｍｇ（蛋白）にまで高められている。
は、ラクトバチラス（Lactobacillus ）属、ロイコノス
トック（Leuconostoc ）属、スタフィロコッカス（Stap
hylococcus）属等に属する微生物が知られている〔マイ
クロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Re
views ）、４４巻、１０６〜１３９頁（１９８０
年）〕。また、特表平７−５０８１６５号公報には、Ｄ
−ＬＤＨ産生能が高い微生物として、ラクトバチラス
（Lactobacillus ）属のＤ−ＬＤＨ遺伝子で形質転換さ
れた酵母が開示されており、この酵母のＤ−ＬＤＨ含有
量は１０Ｕ／ｍｇ（蛋白）にまで高められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この酵母でも
まだＤ−ＬＤＨの産生量が低いため、Ｄ−ＬＤＨを大量
生産するには効率が悪いという問題があった。本発明
は、Ｄ−ＬＤＨ産生能が高い微生物及びそれを用いたＤ
−ＬＤＨの製造方法を提供することを目的とするもので
ある。
まだＤ−ＬＤＨの産生量が低いため、Ｄ−ＬＤＨを大量
生産するには効率が悪いという問題があった。本発明
は、Ｄ−ＬＤＨ産生能が高い微生物及びそれを用いたＤ
−ＬＤＨの製造方法を提供することを目的とするもので
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために、土壌、堆肥、鶏糞、牛糞等よ
りＤ−ＬＤＨ産生能の高い菌株を探索した結果、ラクト
バチラス（Lactobacillus ）属に属するＤ−ＬＤＨ産生
能の高い菌株を見出し、本発明を完成するに至った。す
なわち、第１の発明はＤ−ＬＤＨ産生能を有することを
特徴とするラクトバチラス・ファーメンタム（Lactobac
illus fermentum ）ＵＫＵ−２株（ＦＥＲＭＰ−１５７
７９）を要旨とするものである。また、第２の発明は上
記の菌株を培養し、培養物からＤ−ＬＤＨを採取するこ
とを特徴とするＤ−ＬＤＨの製造方法を要旨とするもの
である。
な課題を解決するために、土壌、堆肥、鶏糞、牛糞等よ
りＤ−ＬＤＨ産生能の高い菌株を探索した結果、ラクト
バチラス（Lactobacillus ）属に属するＤ−ＬＤＨ産生
能の高い菌株を見出し、本発明を完成するに至った。す
なわち、第１の発明はＤ−ＬＤＨ産生能を有することを
特徴とするラクトバチラス・ファーメンタム（Lactobac
illus fermentum ）ＵＫＵ−２株（ＦＥＲＭＰ−１５７
７９）を要旨とするものである。また、第２の発明は上
記の菌株を培養し、培養物からＤ−ＬＤＨを採取するこ
とを特徴とするＤ−ＬＤＨの製造方法を要旨とするもの
である。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
菌株は、堆肥から単離された菌株であり、下記化学式で
示す反応を触媒するＤ−ＬＤＨを産生する。
菌株は、堆肥から単離された菌株であり、下記化学式で
示す反応を触媒するＤ−ＬＤＨを産生する。
【０００７】
【化１】
【０００８】この菌株の菌学的性質を以下に示す。 （ａ）形態的特徴 細胞の形及び大きさ 桿菌 運動性 無 胞子形成能の有無 無
【０００９】 （ｂ）培養的性質 スラント培養 青色コロニー 液体培養 ガス発生、凝固、表面発育無
【００１０】 （ｃ）生理学的性質 グラム染色性 陽性 カタラーゼ活性 陰性 生育の範囲 １５℃不生育 ４５℃生育 酸素に対する態度 通性嫌気性 生成乳酸 ＤＬ 糖の発酵性 アラビノース 有 キシロース 無 グルコース 有 マンノース 無 フラクトース 有 Ｄ−ガラクトース 有 マルトース 有 シュークロース 有 ラクトース 有 トレハロース 無 ソルビトール 無 マンニトール 無 アミグダリン 無 セロビオース 無 エスクリン 無 グルコネイト 有 メレチトース 無 メリビオース 有 ラフィノース 有 ラムノース 無 リボース 有 サリシン 無 グルコースからのガスの生成 有 グルコネイトからのガスの生成 有 菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（モル％） ５２
【００１１】以上に示した菌学的性質から、バージィの
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology ）
第２巻 １９８６年版及び微生物 第６巻 ３頁 １
９９０年版に基き検索した結果、この菌株はラクトバチ
ラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum ）に
属する細菌と判明した。この菌株は、従来のものに比べ
Ｄ−ＬＤＨ産生能が高いため、新菌株と判断し、ラクト
バチラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum
）ＵＫＵ−２株と命名し、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した。その寄託番号は、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５７７９である。
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology ）
第２巻 １９８６年版及び微生物 第６巻 ３頁 １
９９０年版に基き検索した結果、この菌株はラクトバチ
ラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum ）に
属する細菌と判明した。この菌株は、従来のものに比べ
Ｄ−ＬＤＨ産生能が高いため、新菌株と判断し、ラクト
バチラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum
）ＵＫＵ−２株と命名し、通産省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した。その寄託番号は、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５７７９である。
【００１２】本発明の菌株を培養する際に用いられる栄
養培地において、炭素源としては、グルコース、シュー
クロース、マルトース等が使用でき、窒素源としては、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス等の無機又は有機物が使用できる。さ
らに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、亜
鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、必要に応
じて微量金属塩、ビタミン類等を使用してもよい。
養培地において、炭素源としては、グルコース、シュー
クロース、マルトース等が使用でき、窒素源としては、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス等の無機又は有機物が使用できる。さ
らに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウム、亜
鉛、鉄、マグネシウム、マンガン等の各塩類、必要に応
じて微量金属塩、ビタミン類等を使用してもよい。
【００１３】培養は通常、嫌気的あるいは微好気的な条
件下で行うことが好ましい。培養温度としては、２０〜
４０℃が好ましく、さらに３０〜４０℃が好ましく、特
に３５〜４０℃が好ましい。このような条件下で３〜３
０時間、好ましくは６〜１０時間培養することにより、
菌体内にＤ−ＬＤＨが生成、蓄積される。
件下で行うことが好ましい。培養温度としては、２０〜
４０℃が好ましく、さらに３０〜４０℃が好ましく、特
に３５〜４０℃が好ましい。このような条件下で３〜３
０時間、好ましくは６〜１０時間培養することにより、
菌体内にＤ−ＬＤＨが生成、蓄積される。
【００１４】このようにして培養した菌体からＤ−ＬＤ
Ｈを精製する方法としては、一般にＤ−ＬＤＨの精製に
用いられている方法によって精製すればよい。具体的に
は、まず、上記のようにして培養した菌体を、例えば、
自己消化、超音波、フレンチプレス等による破砕、界面
活性剤処理、リゾチーム処理等した後、遠心分離により
細胞片を除去する等して得られたＤ−ＬＤＨの粗酵素液
を、クロマトグラフィー用の樹脂に接触させてＤ−ＬＤ
Ｈを吸着させる。
Ｈを精製する方法としては、一般にＤ−ＬＤＨの精製に
用いられている方法によって精製すればよい。具体的に
は、まず、上記のようにして培養した菌体を、例えば、
自己消化、超音波、フレンチプレス等による破砕、界面
活性剤処理、リゾチーム処理等した後、遠心分離により
細胞片を除去する等して得られたＤ−ＬＤＨの粗酵素液
を、クロマトグラフィー用の樹脂に接触させてＤ−ＬＤ
Ｈを吸着させる。
【００１５】このときに用いられる樹脂としては、例え
ば、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥ
ＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）等のイオン交
換樹脂、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ、レッドセファ
ロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）等のアフィニテ
ィークロマト用樹脂、フェニルセファロースＦＦ（ファ
ルマシア社製）、ブチルトーヨーパール（東ソー）等の
疎水クロマト用樹脂、ウルトロゲルＡｃＡ−３４、セフ
ァデックスＧ−１００（ファルマシア社製）等のゲル濾
過用担体又は樹脂が挙げられる。
ば、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥ
ＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）等のイオン交
換樹脂、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ、レッドセファ
ロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）等のアフィニテ
ィークロマト用樹脂、フェニルセファロースＦＦ（ファ
ルマシア社製）、ブチルトーヨーパール（東ソー）等の
疎水クロマト用樹脂、ウルトロゲルＡｃＡ−３４、セフ
ァデックスＧ−１００（ファルマシア社製）等のゲル濾
過用担体又は樹脂が挙げられる。
【００１６】接触方法としては、特に限定されるもので
はなく、カラム法、バッチ法のいずれの方法でもよい。
このときの溶液の量としては、特に限定されるものでは
ないが、樹脂の吸着能以上であると樹脂に吸着されずに
漏出してしまうため、カラム体積の０．００１〜１００
００倍量が好ましく、さらに１〜１００倍量が好まし
い。また、カラム法で接触させる場合の通液速度として
は、０．００１〜１０００カラム体積／時が好ましい。
はなく、カラム法、バッチ法のいずれの方法でもよい。
このときの溶液の量としては、特に限定されるものでは
ないが、樹脂の吸着能以上であると樹脂に吸着されずに
漏出してしまうため、カラム体積の０．００１〜１００
００倍量が好ましく、さらに１〜１００倍量が好まし
い。また、カラム法で接触させる場合の通液速度として
は、０．００１〜１０００カラム体積／時が好ましい。
【００１７】次いで、樹脂を洗浄した後、溶出液を用い
てＤ−ＬＤＨを溶出させる。樹脂からＤ−ＬＤＨを溶出
する際の溶出液としては、水及び酢酸、クエン酸、リン
酸、イミダゾール、グッド等の緩衝液を用いることがで
き、これらにＮａＣｌやＫＣｌ等の塩を加えてもよい。
溶出液の塩濃度としては、０．００１〜４Ｍが好まし
く、さらに０．１〜１Ｍが好ましい。溶出液のｐＨとし
ては、１〜１３が好ましく、さらに４〜１０が好まし
い。また、溶出液の量としては、カラム体積に対して
０．１〜１０００倍量が好ましく、さらに４〜１０倍量
が好ましい。
てＤ−ＬＤＨを溶出させる。樹脂からＤ−ＬＤＨを溶出
する際の溶出液としては、水及び酢酸、クエン酸、リン
酸、イミダゾール、グッド等の緩衝液を用いることがで
き、これらにＮａＣｌやＫＣｌ等の塩を加えてもよい。
溶出液の塩濃度としては、０．００１〜４Ｍが好まし
く、さらに０．１〜１Ｍが好ましい。溶出液のｐＨとし
ては、１〜１３が好ましく、さらに４〜１０が好まし
い。また、溶出液の量としては、カラム体積に対して
０．１〜１０００倍量が好ましく、さらに４〜１０倍量
が好ましい。
【００１８】このようにして精製したＤ−ＬＤＨの理化
学的性質を以下に示す。 （１）作用 以下の反応式に示す反応を触媒する。
学的性質を以下に示す。 （１）作用 以下の反応式に示す反応を触媒する。
【００１９】
【化２】
【００２０】（２）基質特異性 Ｄ−乳酸に対するＫｍ値：１８．５ｍＭ ピルビン酸に対するＫｍ値：０．６９ｍＭ ＮＡＤに対するＫｍ値：０．３６ｍＭ ＮＡＤＨに対するＫｍ値：０．１２ｍＭ （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 ｐＨ８付近に至適ｐＨを有し（測定温度３０℃）、ｐＨ
４〜８で安定である（測定温度４℃）。 （４）作用適温の範囲 ４０℃まで（１００ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ７．５
で測定）。 （５）分子量 ゲルろ過法による測定で約９０，０００であり、ＳＤＳ
電気泳動法による測定で３８，０００である。
４〜８で安定である（測定温度４℃）。 （４）作用適温の範囲 ４０℃まで（１００ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ７．５
で測定）。 （５）分子量 ゲルろ過法による測定で約９０，０００であり、ＳＤＳ
電気泳動法による測定で３８，０００である。
【００２１】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、Ｄ−ＬＤＨの活性測定は３．０ｍＭのピル
ビン酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨを含むトリス緩衝液
（ｐＨ７．７）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した
後、分光光度計（日立製作所製）で３４０ｎｍにおける
吸光度変化を測定することによって行った。測定は、３
０℃で行い、１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨをＮＡ
Ｄ+ に変換する酵素量を１単位（Ｕ）とした。また、蛋
白量は、バイオラッド社製のプロテインアッセイキット
II（５００−０００２）を用いて測定した。
する。なお、Ｄ−ＬＤＨの活性測定は３．０ｍＭのピル
ビン酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨを含むトリス緩衝液
（ｐＨ７．７）に酵素溶液を加え、緩やかに混和した
後、分光光度計（日立製作所製）で３４０ｎｍにおける
吸光度変化を測定することによって行った。測定は、３
０℃で行い、１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨをＮＡ
Ｄ+ に変換する酵素量を１単位（Ｕ）とした。また、蛋
白量は、バイオラッド社製のプロテインアッセイキット
II（５００−０００２）を用いて測定した。
【００２２】実施例１、比較例１、２ グルコース ３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵
母エキス １．０％、ペプトン ０．５％、クエン酸三
ナトリウム・二水和物 ０．５％、酢酸ナトリウム
０．２％、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．０２％、
硫酸マンガン・四〜五水和物 ０．００５％、ツイン８
０ ０．１容量％よりなる培地（ｐＨ６．４）２５リッ
トルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込
み、１２１℃で１５分間滅菌した後、ラクトバチラス・
ファーメンタム（Lactobacillus fermentum ）ＵＫＵ−
２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７９）を接種し、３７℃で
６時間、１４０ｒｐｍで撹拌し、通気しない条件下、４
ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。
培養終了後、遠心分離により菌体を採取して約２５０ｇ
の湿菌体を得た。得られた湿菌体を圧破砕器（８００ｂ
ａｒ：大日本製薬社製）により破砕し、遠心分離して細
胞片を除去した後、得られた溶液のＤ−ＬＤＨ活性を測
定したところ、菌体当たりのＤ−ＬＤＨ活性は１３００
万Ｕ／ｋｇ（菌体）であった。また、蛋白当たりのＤ−
ＬＤＨ活性は３０Ｕ／ｍｇ（蛋白）であった。この結果
から、本発明の菌株は、従来の遺伝子操作により得られ
たラクトバチラス（Lactobacillus)由来のＬＤＨを産生
する酵母の約３倍のＤ−ＬＤＨを含有していることがわ
かる。
母エキス １．０％、ペプトン ０．５％、クエン酸三
ナトリウム・二水和物 ０．５％、酢酸ナトリウム
０．２％、硫酸マグネシウム・七水和物 ０．０２％、
硫酸マンガン・四〜五水和物 ０．００５％、ツイン８
０ ０．１容量％よりなる培地（ｐＨ６．４）２５リッ
トルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込
み、１２１℃で１５分間滅菌した後、ラクトバチラス・
ファーメンタム（Lactobacillus fermentum ）ＵＫＵ−
２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７９）を接種し、３７℃で
６時間、１４０ｒｐｍで撹拌し、通気しない条件下、４
ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。
培養終了後、遠心分離により菌体を採取して約２５０ｇ
の湿菌体を得た。得られた湿菌体を圧破砕器（８００ｂ
ａｒ：大日本製薬社製）により破砕し、遠心分離して細
胞片を除去した後、得られた溶液のＤ−ＬＤＨ活性を測
定したところ、菌体当たりのＤ−ＬＤＨ活性は１３００
万Ｕ／ｋｇ（菌体）であった。また、蛋白当たりのＤ−
ＬＤＨ活性は３０Ｕ／ｍｇ（蛋白）であった。この結果
から、本発明の菌株は、従来の遺伝子操作により得られ
たラクトバチラス（Lactobacillus)由来のＬＤＨを産生
する酵母の約３倍のＤ−ＬＤＨを含有していることがわ
かる。
【００２３】また、比較のため、Ｄ−ＬＤＨ産生菌株で
あるロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lact
is）ＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０：比較例
１））及びロイコノストック・ラクティス（Leuconosto
c lactis）ＳＨＯ５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１：
比較例２）を上記と同様の方法で培養した。培養終了
後、遠心分離により、菌体を採取してそれぞれ約１６０
ｇ、１８０ｇの湿菌体を得た。さらに、上記と同様にし
てそれぞれの菌体のＤ−ＬＤＨ含有量を測定したとこ
ろ、菌体１ｋｇ当たりそれぞれ２５０万Ｕ、１９０万Ｕ
であった。以上の結果を表１に示す。
あるロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lact
is）ＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０：比較例
１））及びロイコノストック・ラクティス（Leuconosto
c lactis）ＳＨＯ５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１：
比較例２）を上記と同様の方法で培養した。培養終了
後、遠心分離により、菌体を採取してそれぞれ約１６０
ｇ、１８０ｇの湿菌体を得た。さらに、上記と同様にし
てそれぞれの菌体のＤ−ＬＤＨ含有量を測定したとこ
ろ、菌体１ｋｇ当たりそれぞれ２５０万Ｕ、１９０万Ｕ
であった。以上の結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】表１に示した結果から、本発明の菌株は、
他のＤ−ＬＤＨ産生菌であるＳＨＯ４７株及びＳＨＯ５
４株に比べ、８〜９．５倍のＤ−ＬＤＨ産生能を有して
いることがわかる。
他のＤ−ＬＤＨ産生菌であるＳＨＯ４７株及びＳＨＯ５
４株に比べ、８〜９．５倍のＤ−ＬＤＨ産生能を有して
いることがわかる。
【００２６】実施例２ 実施例１で得た湿菌体のうちの約５０ｇを２ｍＭのＥＤ
ＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して２５０ミ
リリットルとした。これを圧破砕器（８００ｂａｒ：大
日本製薬社製）に通液して破砕して破砕液を得た。得ら
れた破砕液２５０ミリリットルに、除核酸を目的として
高分子凝集剤であるユニフロッカーＵＦ３０５（ユニチ
カ社製）の１重量％の水溶液３８ミリリットルをゆっく
りと添加して約３０分程度攪拌した後、遠心分離して沈
澱物を除去し、Ｄ−ＬＤＨの粗酵素液３００ミリリット
ルを得た。
ＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して２５０ミ
リリットルとした。これを圧破砕器（８００ｂａｒ：大
日本製薬社製）に通液して破砕して破砕液を得た。得ら
れた破砕液２５０ミリリットルに、除核酸を目的として
高分子凝集剤であるユニフロッカーＵＦ３０５（ユニチ
カ社製）の１重量％の水溶液３８ミリリットルをゆっく
りと添加して約３０分程度攪拌した後、遠心分離して沈
澱物を除去し、Ｄ−ＬＤＨの粗酵素液３００ミリリット
ルを得た。
【００２７】この粗酵素液３００ミリリットルにリン酸
二カリウムを加えてｐＨを８．０に調整し、これを予め
２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化したＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社製）
カラム３５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着さ
せた後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、塩化カリ
ウムの濃度を徐々に上げて（０〜０．４Ｍ）溶出を行っ
たところ、塩化カリウム濃度０．３Ｍ付近にＤ−ＬＤＨ
が溶出した。
二カリウムを加えてｐＨを８．０に調整し、これを予め
２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化したＤＥＡＥセファロースＦＦ（ファルマシア社製）
カラム３５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着さ
せた後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、塩化カリ
ウムの濃度を徐々に上げて（０〜０．４Ｍ）溶出を行っ
たところ、塩化カリウム濃度０．３Ｍ付近にＤ−ＬＤＨ
が溶出した。
【００２８】この溶出画分に２５重量％となるように硫
酸アンモニウムを加え、これを予め２５重量％の硫酸ア
ンモニウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ファ
ルマシア社製）カラム１０ミリリットルに通液してＤ−
ＬＤＨを吸着させた後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を
用い、硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げて（２５〜０
重量％）溶出を行ったところ、硫酸アンモニウム濃度１
０〜２０重量％付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
酸アンモニウムを加え、これを予め２５重量％の硫酸ア
ンモニウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ファ
ルマシア社製）カラム１０ミリリットルに通液してＤ−
ＬＤＨを吸着させた後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を
用い、硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げて（２５〜０
重量％）溶出を行ったところ、硫酸アンモニウム濃度１
０〜２０重量％付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
【００２９】この溶出画分を回収し、透析により脱塩し
た後、予め２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＤＥＡＥトリスアクリル（ファルマシ
アＬＫＢ社製）カラム５ミリリットルに通液してＤ−Ｌ
ＤＨを吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄し、同
緩衝液を用い、塩化カリウムの濃度を徐々に上げて（０
〜０．３Ｍ）溶出を行ったところ、塩化カリウム濃度
０．１５Ｍ付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
た後、予め２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＤＥＡＥトリスアクリル（ファルマシ
アＬＫＢ社製）カラム５ミリリットルに通液してＤ−Ｌ
ＤＨを吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄し、同
緩衝液を用い、塩化カリウムの濃度を徐々に上げて（０
〜０．３Ｍ）溶出を行ったところ、塩化カリウム濃度
０．１５Ｍ付近にＤ−ＬＤＨが溶出した。
【００３０】この溶出画分に硫酸アンモニウムを２５重
量％となるように加え、予め２５重量％の硫酸アンモニ
ウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化したブチルトーヨーパール（東ソー社製）カラ
ム５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着させた
後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、硫酸アンモニ
ウム濃度を徐々に下げて（２５〜０重量％）溶出を行っ
たところ、硫酸アンモニウム濃度１２〜２０重量％付近
にＤ−ＬＤＨが溶出した。このようにして得られたＤ−
ＬＤＨ精製標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果は、単一なバンドであった。このようにして得られた
Ｄ−ＬＤＨは前記と同様の理化学的性質を有していた。
以上の精製の結果を表２に示す。
量％となるように加え、予め２５重量％の硫酸アンモニ
ウム、２ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化したブチルトーヨーパール（東ソー社製）カラ
ム５ミリリットルに通液してＤ−ＬＤＨを吸着させた
後、同緩衝液で洗浄し、同緩衝液を用い、硫酸アンモニ
ウム濃度を徐々に下げて（２５〜０重量％）溶出を行っ
たところ、硫酸アンモニウム濃度１２〜２０重量％付近
にＤ−ＬＤＨが溶出した。このようにして得られたＤ−
ＬＤＨ精製標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果は、単一なバンドであった。このようにして得られた
Ｄ−ＬＤＨは前記と同様の理化学的性質を有していた。
以上の精製の結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【発明の効果】本発明の菌株は、高いＤ−ＬＤＨ産生能
を有しているため、Ｄ−ＬＤＨの大量生産が可能とな
る。また、本発明の製造方法によれば、用途の多いＤ−
ＬＤＨを効率よく大量生産することが可能となる。
を有しているため、Ｄ−ＬＤＨの大量生産が可能とな
る。また、本発明の製造方法によれば、用途の多いＤ−
ＬＤＨを効率よく大量生産することが可能となる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 鈍寳 宗彦 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 内田 和之 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｄ−乳酸脱水素酵素産生能を有すること
を特徴とするラクトバチラス・ファーメンタム（Lactob
acillus fermentum)ＵＫＵ−２株（ＦＥＲＭＰ−１５７
７９）。 - 【請求項２】 請求項１記載の菌株を培養し、培養物か
らＤ−乳酸脱水素酵素を採取することを特徴とするＤ−
乳酸脱水素酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8244526A JPH1084946A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | ラクトバチラス・ファーメンタムｕｋｕ−２株及びｄ−乳酸脱水素酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8244526A JPH1084946A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | ラクトバチラス・ファーメンタムｕｋｕ−２株及びｄ−乳酸脱水素酵素の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084946A true JPH1084946A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=17120007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8244526A Pending JPH1084946A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | ラクトバチラス・ファーメンタムｕｋｕ−２株及びｄ−乳酸脱水素酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1084946A (ja) |
-
1996
- 1996-09-17 JP JP8244526A patent/JPH1084946A/ja active Pending
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