JPH11262398A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高いＬ−グルタミン酸生産能を有するＬ−グ
ルタミン酸生産菌を取得し、安価かつ効率的なＬ−グル
タミン酸の製造法の開発につなげる。 【解決手段】 アリサイクロバチルス属に属し、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を有する微生物、好ましくはＬ−グル
タミン酸代謝拮抗物質に耐性の微生物を、培地中で培養
してＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを培地から
採取することによりＬ−グルタミン酸を製造する。
ルタミン酸生産菌を取得し、安価かつ効率的なＬ−グル
タミン酸の製造法の開発につなげる。 【解決手段】 アリサイクロバチルス属に属し、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を有する微生物、好ましくはＬ−グル
タミン酸代謝拮抗物質に耐性の微生物を、培地中で培養
してＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを培地から
採取することによりＬ−グルタミン酸を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、
食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、
食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン
酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製
造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９
５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発
酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチル
ス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物
を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シ
ュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キ
ャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，
５６３，８５７号）、エシェリヒア・コリの変異株を用
いる方法（特開平５−２４４９７０）等が知られてい
る。
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン
酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製
造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９
５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発
酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチル
ス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物
を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シ
ュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キ
ャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，
５６３，８５７号）、エシェリヒア・コリの変異株を用
いる方法（特開平５−２４４９７０）等が知られてい
る。
【０００３】上記のような微生物の育種や製造法の改良
により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まっては
いるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さ
らに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発
が求められている。
により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まっては
いるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さ
らに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発
が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、高い
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン
酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸
の製造法の開発につなげることにある。
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン
酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸
の製造法の開発につなげることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、従来の微生物とは異なった微生物で
あって、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を
広く検索、研究した結果、アリサイクロバチルス属に属
する微生物由来の誘導株が高いＬ−グルタミン酸生産能
を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
を解決するために、従来の微生物とは異なった微生物で
あって、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を
広く検索、研究した結果、アリサイクロバチルス属に属
する微生物由来の誘導株が高いＬ−グルタミン酸生産能
を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００７】（１）アリサイクロバチルス属に属し、Ｌ
−グルタミン酸生産能を有する微生物を、好気的条件下
で培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積
せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ
−グルタミン酸の製造法。
−グルタミン酸生産能を有する微生物を、好気的条件下
で培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積
せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ
−グルタミン酸の製造法。
【０００８】（２）上記方法において、微生物がアリサ
イクロバチルス・アシドカルダリウスである方法。
イクロバチルス・アシドカルダリウスである方法。
【０００９】（３）上記方法において、微生物がＬ−グ
ルタミン酸代謝拮抗物質に耐性である方法。
ルタミン酸代謝拮抗物質に耐性である方法。
【００１０】（４）上記方法において、微生物がアリサ
イクロバチルス・アシドカルダリウス由来のアザセリン
耐性株である方法。
イクロバチルス・アシドカルダリウス由来のアザセリン
耐性株である方法。
【００１１】（５）Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質に耐
性であるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスに
属する菌株。
性であるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスに
属する菌株。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる微生物は、アリサイクロバチルスに属
し、Ｌ−グルタミン酸を蓄積するものであれはいかなる
菌株でも良い。
本発明に用いる微生物は、アリサイクロバチルスに属
し、Ｌ−グルタミン酸を蓄積するものであれはいかなる
菌株でも良い。
【００１３】アリサイクロバチルス属に属する菌株とし
ては、例えば以下のようなものがある。 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclo
bacillus acidocaldarius） アリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclo
bacillus acidoterrestris） アリサイクロバチルス・シクロヘプタニカス（Alicyclo
bacillus cycloheptanicus）
ては、例えば以下のようなものがある。 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclo
bacillus acidocaldarius） アリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclo
bacillus acidoterrestris） アリサイクロバチルス・シクロヘプタニカス（Alicyclo
bacillus cycloheptanicus）
【００１４】さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げ
られる。 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス ＪＣＭ５２６０ アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス ＪＣＭ５２６１ アリサイクロバチルス・アシドテレストリス ＡＴＣＣ４９０２５ アリサイクロバチルス・アシドテレストリス ＡＴＣＣ４９０２６ アリサイクロバチルス・アシドテレストリス ＡＴＣＣ４９０２７ アリサイクロバチルス・シクロヘプタニカス ＡＴＣＣ８０３８ アリサイクロバチルス・シクロヘプタニカス ＡＴＣＣ３５６７０ これらの菌株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）あるいはＪ
ＣＭ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｒｉｋｅｎ）より分譲を受け
ることができる。
られる。 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス ＪＣＭ５２６０ アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス ＪＣＭ５２６１ アリサイクロバチルス・アシドテレストリス ＡＴＣＣ４９０２５ アリサイクロバチルス・アシドテレストリス ＡＴＣＣ４９０２６ アリサイクロバチルス・アシドテレストリス ＡＴＣＣ４９０２７ アリサイクロバチルス・シクロヘプタニカス ＡＴＣＣ８０３８ アリサイクロバチルス・シクロヘプタニカス ＡＴＣＣ３５６７０ これらの菌株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）あるいはＪ
ＣＭ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｒｉｋｅｎ）より分譲を受け
ることができる。
【００１５】一般に、アミノ酸生産能を有する微生物を
得るためには、目的とするアミノ酸の代謝拮抗物質耐性
の株を取得する手法が用いられている。アリサイクロバ
チルス属に属するＬ−グルタミン酸生産能を有する微生
物を取得する際にもこのような手法が適用しうる。
得るためには、目的とするアミノ酸の代謝拮抗物質耐性
の株を取得する手法が用いられている。アリサイクロバ
チルス属に属するＬ−グルタミン酸生産能を有する微生
物を取得する際にもこのような手法が適用しうる。
【００１６】本発明にいうＬ−グルタミン酸代謝拮抗物
質とは、アリサイクロバチルス属細菌の生育を阻害し、
その生育阻害がＬ−グルタミン酸の添加により回復する
物質である。または、Ｌ−グルタミン酸生合成系に関与
する酵素の発現を抑制する作用または該酵素の活性を阻
害する作用を有し、その抑制または阻害がＬ−グルタミ
ン酸の添加により回復する物質である。
質とは、アリサイクロバチルス属細菌の生育を阻害し、
その生育阻害がＬ−グルタミン酸の添加により回復する
物質である。または、Ｌ−グルタミン酸生合成系に関与
する酵素の発現を抑制する作用または該酵素の活性を阻
害する作用を有し、その抑制または阻害がＬ−グルタミ
ン酸の添加により回復する物質である。
【００１７】上記のようなＬ−グルタミン酸と拮抗して
生育阻害作用を有する化合物としては、例えばアザセリ
ン、４−フロログルタミン酸、α−メチルグルタミン
酸、Ｎ−メチルグルタミン酸等が挙げられる。これらの
化合物以外にも、Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質は、次
のようにして選択することができる。アリサイクロバチ
ルス属細菌の菌体を含む軟寒天を平板培地に重層し、そ
の上に候補となる化合物を適当量置き、その位置と別の
位置にＬ−グルタミン酸を適当量置く。このまま培養
し、設置した化合物の周辺に阻止円を形成し、Ｌ−グル
タミン酸の周辺では菌の生育が回復した化合物は、Ｌ−
グルタミン酸と拮抗するアナログであると判断される。
生育阻害作用を有する化合物としては、例えばアザセリ
ン、４−フロログルタミン酸、α−メチルグルタミン
酸、Ｎ−メチルグルタミン酸等が挙げられる。これらの
化合物以外にも、Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質は、次
のようにして選択することができる。アリサイクロバチ
ルス属細菌の菌体を含む軟寒天を平板培地に重層し、そ
の上に候補となる化合物を適当量置き、その位置と別の
位置にＬ−グルタミン酸を適当量置く。このまま培養
し、設置した化合物の周辺に阻止円を形成し、Ｌ−グル
タミン酸の周辺では菌の生育が回復した化合物は、Ｌ−
グルタミン酸と拮抗するアナログであると判断される。
【００１８】Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質耐性株の取
得は、Ｘ線や紫外線を照射する方法、あるいはＮ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下「Ｎ
Ｇ」と略す）、エチルメタンスルホン酸等の変異剤で処
理する方法を適用して親株に変異を導入した後、親株が
生育できないような濃度のＬ−グルタミン酸代謝拮抗物
質を含む寒天培地で生育可能な菌株を採取すればよい。
得は、Ｘ線や紫外線を照射する方法、あるいはＮ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下「Ｎ
Ｇ」と略す）、エチルメタンスルホン酸等の変異剤で処
理する方法を適用して親株に変異を導入した後、親株が
生育できないような濃度のＬ−グルタミン酸代謝拮抗物
質を含む寒天培地で生育可能な菌株を採取すればよい。
【００１９】親株が生育できないようなＬ−グルタミン
酸代謝拮抗物質の濃度は、種々の濃度でＬ−グルタミン
酸代謝拮抗物質を含む培地にアリサイクロバチルス属細
菌を接種し、生育の有無を調べることによって決定する
ことができる。次に、こうして決定された濃度、好まし
くは生育できない最小濃度でＬ−グルタミン酸代謝拮抗
物質を含む寒天培地に、変異処理を行ったアリサイクロ
バチルス属細菌をまき、コロニーを形成する株を選択す
ればよい。選択は、１回でもよく、複数回行ってもよ
い。また、Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質に耐性な株の
選択は、１種のＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質について
行ってもよく、複数のＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質に
ついて行ってもよい。
酸代謝拮抗物質の濃度は、種々の濃度でＬ−グルタミン
酸代謝拮抗物質を含む培地にアリサイクロバチルス属細
菌を接種し、生育の有無を調べることによって決定する
ことができる。次に、こうして決定された濃度、好まし
くは生育できない最小濃度でＬ−グルタミン酸代謝拮抗
物質を含む寒天培地に、変異処理を行ったアリサイクロ
バチルス属細菌をまき、コロニーを形成する株を選択す
ればよい。選択は、１回でもよく、複数回行ってもよ
い。また、Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質に耐性な株の
選択は、１種のＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質について
行ってもよく、複数のＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質に
ついて行ってもよい。
【００２０】本発明において、Ｌ−グルタミン酸代謝拮
抗物質に耐性であるアリサイクロバチルス属細菌として
具体的には、上記のようにして決定される野生株の生育
を阻害する最小濃度またはそれ以上の濃度のＬ−グルタ
ミン酸代謝拮抗物質を含むグルコース最少培地上でコロ
ニーを形成することができる変異株が挙げられる。より
具体的には、アザセリン０．５ｇ／Ｌを含むグルコース
最少培地上でコロニーを形成することができる変異株が
挙げられる。
抗物質に耐性であるアリサイクロバチルス属細菌として
具体的には、上記のようにして決定される野生株の生育
を阻害する最小濃度またはそれ以上の濃度のＬ−グルタ
ミン酸代謝拮抗物質を含むグルコース最少培地上でコロ
ニーを形成することができる変異株が挙げられる。より
具体的には、アザセリン０．５ｇ／Ｌを含むグルコース
最少培地上でコロニーを形成することができる変異株が
挙げられる。
【００２１】以上のようにして得られるＬ−グルタミン
酸代謝拮抗物質に耐性な変異株の具体例としては、アザ
セリンに耐性なアリサイクロバチルス・アシドカルダリ
ウスＡＪ１３４０９が挙げられる。アリサイクロバチル
ス・アシドカルダリウスＡＪ１３４０９は、平成１０年
２月２４日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６６２として寄託さ
れている。
酸代謝拮抗物質に耐性な変異株の具体例としては、アザ
セリンに耐性なアリサイクロバチルス・アシドカルダリ
ウスＡＪ１３４０９が挙げられる。アリサイクロバチル
ス・アシドカルダリウスＡＪ１３４０９は、平成１０年
２月２４日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６６２として寄託さ
れている。
【００２２】アリサイクロバチルス属に属し、Ｌ−グル
タミン酸生産能を有する微生物を用いてＬ−グルタミン
酸を生産させるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その
他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うこと
ができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能
である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養す
る菌株の利用可能なものならばよい。
タミン酸生産能を有する微生物を用いてＬ−グルタミン
酸を生産させるには、炭素源、窒素源、無機塩類、その
他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うこと
ができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能
である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養す
る菌株の利用可能なものならばよい。
【００２３】炭素源としてはグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュークロース、マルトース、マン
ノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の
糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等
も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
ル、フラクトース、シュークロース、マルトース、マン
ノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の
糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等
も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【００２４】窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩また
は硝酸塩等が使用される。
ウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩また
は硝酸塩等が使用される。
【００２５】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異
株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が
必要である。
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異
株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が
必要である。
【００２６】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度３０ないし７０℃、ｐＨを２ない
し７に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨがこの
範囲を越えて低下する場合にはアンモニアガス等のアル
カリで中和する。かくして１０時間ないし４日間程度培
養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が
蓄積される。
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度３０ないし７０℃、ｐＨを２ない
し７に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨがこの
範囲を越えて低下する場合にはアンモニアガス等のアル
カリで中和する。かくして１０時間ないし４日間程度培
養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が
蓄積される。
【００２７】培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グ
ルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って
行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃
縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィ
ー等によって単離することができる。
ルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って
行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃
縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィ
ー等によって単離することができる。
【００２８】
【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００２９】（１）アリサイクロバチルス・アシドカル
ダリウスのＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質の検索 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＪＣＭ５２
６０株をＢＡＭ（ＪＣＭ）液体培地（グルコース ０．
５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マグ
ネシウム７水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウ
ム ０．３ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩 ０．１２５ｇ
／Ｌ、酵母エキス ０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ３〜４）にて５
０℃一夜培養し、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ４．５）にて洗菌したものを指示菌として用い
た。
ダリウスのＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質の検索 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＪＣＭ５２
６０株をＢＡＭ（ＪＣＭ）液体培地（グルコース ０．
５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マグ
ネシウム７水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウ
ム ０．３ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩 ０．１２５ｇ
／Ｌ、酵母エキス ０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ３〜４）にて５
０℃一夜培養し、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ４．５）にて洗菌したものを指示菌として用い
た。
【００３０】５０℃に保温したグルコース最少培地（グ
ルコース ０．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ０．１ｇ／
Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、リン酸
２水素カリウム ０．３ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩
０．１２５ｇ／Ｌ、ｐＨ４）軟寒天プレート（寒天濃度
０．８％）に上記指示菌を加えて通常の寒天濃度のグル
コース最少培地プレートに重層した。このとき菌濃度が
およそ１０6個細胞/cm 2程度になるように指示菌添加量
を調整した。
ルコース ０．５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ０．１ｇ／
Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、リン酸
２水素カリウム ０．３ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩
０．１２５ｇ／Ｌ、ｐＨ４）軟寒天プレート（寒天濃度
０．８％）に上記指示菌を加えて通常の寒天濃度のグル
コース最少培地プレートに重層した。このとき菌濃度が
およそ１０6個細胞/cm 2程度になるように指示菌添加量
を調整した。
【００３１】こうして作製したプレートに種々の化合物
（アザセリン、４−フロログルタミン酸、ＤＬ−α−メ
チルグルタミン酸、Ｎ−メチルグルタミン酸等）を耳掻
き一杯分ずつ置き、その位置から約３．５ｃｍ離してＬ
−グルタミン酸を同様に耳掻き一杯分を置いた。このま
ま１〜３日間、５０℃にて培養し、設置した化合物の周
辺に阻止円を形成し、Ｌ−グルタミン酸の周辺では菌の
生育が回復した化合物を、Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物
質であると判断した。種々の化合物に関して、生育阻害
及びＬ−グルタミン酸との拮抗を調べた結果、アザセリ
ンがアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＪＣＭ
５２６０株においてＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質とし
て作用することが判った。
（アザセリン、４−フロログルタミン酸、ＤＬ−α−メ
チルグルタミン酸、Ｎ−メチルグルタミン酸等）を耳掻
き一杯分ずつ置き、その位置から約３．５ｃｍ離してＬ
−グルタミン酸を同様に耳掻き一杯分を置いた。このま
ま１〜３日間、５０℃にて培養し、設置した化合物の周
辺に阻止円を形成し、Ｌ−グルタミン酸の周辺では菌の
生育が回復した化合物を、Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物
質であると判断した。種々の化合物に関して、生育阻害
及びＬ−グルタミン酸との拮抗を調べた結果、アザセリ
ンがアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＪＣＭ
５２６０株においてＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質とし
て作用することが判った。
【００３２】（２）アリサイクロバチルス・アシドカル
ダリウス由来のアザセリン耐性株の取得 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＪＣＭ５２
６０株をＢＡＭ（ＪＣＭ）液体培地（グルコース ０．
５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マグ
ネシウム７水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウ
ム ０．３ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩 ０．１２５ｇ
／Ｌ、酵母エキス ０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ３〜４）５０ｍ
ｌにて５０℃一夜培養し、菌体を遠心分離により集菌し
た。５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ５）に懸
濁し、再度集菌する操作を２度繰り返すことによって菌
体を洗浄した後、２ｇ／ＬのＮＧを含む同バッファー８
ｍｌに懸濁し、５０℃、６０分間静置した後、遠心分離
により集菌した。同バッファーに菌体を懸濁し、遠心分
離により集菌した。さらに２度同じ操作を行い菌体を洗
浄した後、４０ｍｌのＢＡＭ（ＪＣＭ）液体培地を加
え、５０℃、１２時間振とう培養することによって変異
を固定した。集菌後、アザセリン０．５ｇ／Ｌを含むグ
ルコース最少培地プレートに塗布し、５０℃で２４時間
培養した。
ダリウス由来のアザセリン耐性株の取得 アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスＪＣＭ５２
６０株をＢＡＭ（ＪＣＭ）液体培地（グルコース ０．
５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ０．１ｇ／Ｌ、硫酸マグ
ネシウム７水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウ
ム ０．３ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩 ０．１２５ｇ
／Ｌ、酵母エキス ０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ３〜４）５０ｍ
ｌにて５０℃一夜培養し、菌体を遠心分離により集菌し
た。５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ５）に懸
濁し、再度集菌する操作を２度繰り返すことによって菌
体を洗浄した後、２ｇ／ＬのＮＧを含む同バッファー８
ｍｌに懸濁し、５０℃、６０分間静置した後、遠心分離
により集菌した。同バッファーに菌体を懸濁し、遠心分
離により集菌した。さらに２度同じ操作を行い菌体を洗
浄した後、４０ｍｌのＢＡＭ（ＪＣＭ）液体培地を加
え、５０℃、１２時間振とう培養することによって変異
を固定した。集菌後、アザセリン０．５ｇ／Ｌを含むグ
ルコース最少培地プレートに塗布し、５０℃で２４時間
培養した。
【００３３】アザセリン０．５ｇ／Ｌを含むグルコース
最少培地上に出現したコロニーを釣り上げ、同組成の培
地にて単コロニー分離を行い、アザセリン耐性株ＡＪ１
３４０９を分離した。親株であるＪＣＭ５２６０株はア
ザセリン０．５ｇ／Ｌを含むグルコース最少培地に塗布
した場合、全く生育できず、コロニーの形成は見られな
かった。
最少培地上に出現したコロニーを釣り上げ、同組成の培
地にて単コロニー分離を行い、アザセリン耐性株ＡＪ１
３４０９を分離した。親株であるＪＣＭ５２６０株はア
ザセリン０．５ｇ／Ｌを含むグルコース最少培地に塗布
した場合、全く生育できず、コロニーの形成は見られな
かった。
【００３４】（３）Ｌ−グルタミン酸生産株の培養及び
Ｌ−グルタミン酸生産 上記のようにして分離したアザセリン耐性株ＡＪ１３４
０９、及びその親株であるＪＣＭ５２６０を、ＢＡＭ
（ＪＣＭ）寒天培地にて２４時間培養した後、１２０
℃、１０分間蒸気滅菌したＢＡＭ２培地（グルコース
４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、硫酸マグネ
シウム７水塩 ０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ２
ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、硫酸
第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩
０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩 ０．７２ｍｇ／Ｌ、
硫酸銅５水塩 ０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩
０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸 ０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデ
ン酸ナトリウム２水塩 １．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス
０．５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム ５ｇ／Ｌ、ｐＨ２．
５）２５ｍｌを注入した５００ｍｌ容振とう坂口フラス
コに植菌して、５０℃もしくは６０℃にて糖が枯渇する
まで振とう培養したところ表１に示すような結果を得
た。
Ｌ−グルタミン酸生産 上記のようにして分離したアザセリン耐性株ＡＪ１３４
０９、及びその親株であるＪＣＭ５２６０を、ＢＡＭ
（ＪＣＭ）寒天培地にて２４時間培養した後、１２０
℃、１０分間蒸気滅菌したＢＡＭ２培地（グルコース
４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／Ｌ、硫酸マグネ
シウム７水塩 ０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ２
ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水塩 ０．２５ｇ／Ｌ、硫酸
第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩
０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩 ０．７２ｍｇ／Ｌ、
硫酸銅５水塩 ０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩
０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸 ０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデ
ン酸ナトリウム２水塩 １．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス
０．５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム ５ｇ／Ｌ、ｐＨ２．
５）２５ｍｌを注入した５００ｍｌ容振とう坂口フラス
コに植菌して、５０℃もしくは６０℃にて糖が枯渇する
まで振とう培養したところ表１に示すような結果を得
た。
【００３５】
【表１】 表１ Ｌ−グルタミン酸蓄積量 ─────────────────────────── Ｌ−グルタミン酸蓄積量（ｍｇ／Ｌ） 菌 株 ────────────────── ５０℃ ６０℃ ─────────────────────────── ＪＣＭ５２６０ ８ １３ ＡＪ１３４０９ ５６４ ４８３ ───────────────────────────
【００３６】ＪＣＭ５２６０はほとんどＬ−グルタミン
酸を蓄積しなかったのに対して、アザセリン耐性株ＡＪ
１３４０９は著量のＬ−グルタミン酸を蓄積した。ＡＪ
１３４０９株以外にも多数のアザセリン耐性株を分離
し、（３）に示した方法で評価したところＡＪ１３４０
９と同様に著量のＬ−グルタミン酸を蓄積した株が多数
見いだされた。
酸を蓄積しなかったのに対して、アザセリン耐性株ＡＪ
１３４０９は著量のＬ−グルタミン酸を蓄積した。ＡＪ
１３４０９株以外にも多数のアザセリン耐性株を分離
し、（３）に示した方法で評価したところＡＪ１３４０
９と同様に著量のＬ−グルタミン酸を蓄積した株が多数
見いだされた。
【００３７】
【発明の効果】本発明に用いる微生物は、高いＬ−グル
タミン酸生産能を有することから、コリネ型Ｌ−グルタ
ミン酸生産菌等で従来知られている育種手法等を用いて
さらに高い生産能を付与できると考えられ、また培養条
件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン
酸製造法の開発につながるものと期待される。
タミン酸生産能を有することから、コリネ型Ｌ−グルタ
ミン酸生産菌等で従来知られている育種手法等を用いて
さらに高い生産能を付与できると考えられ、また培養条
件等の検討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン
酸製造法の開発につながるものと期待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (5)
- 【請求項１】 アリサイクロバチルス属に属し、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を有する微生物を、好気的条件下で培
地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せし
め、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−グ
ルタミン酸の製造法。 - 【請求項２】 微生物がアリサイクロバチルス・アシド
カルダリウスである請求項１記載のＬ−グルタミン酸の
製造法。 - 【請求項３】 微生物がＬ−グルタミン酸代謝拮抗物質
に耐性である請求項１または２記載のＬ−グルタミン酸
の製造法。 - 【請求項４】 微生物がアリサイクロバチルス・アシド
カルダリウス由来のアザセリン耐性株である請求項２ま
たは３記載のＬ−グルタミン酸の製造法。 - 【請求項５】 Ｌ−グルタミン酸代謝拮抗物質に耐性で
あるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスに属す
る菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6905598A JPH11262398A (ja) | 1998-03-18 | 1998-03-18 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6905598A JPH11262398A (ja) | 1998-03-18 | 1998-03-18 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11262398A true JPH11262398A (ja) | 1999-09-28 |
Family
ID=13391513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6905598A Pending JPH11262398A (ja) | 1998-03-18 | 1998-03-18 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11262398A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008133161A1 (ja) | 2007-04-17 | 2008-11-06 | Ajinomoto Co., Inc. | カルボキシル基を有する酸性物質の製造法 |
-
1998
- 1998-03-18 JP JP6905598A patent/JPH11262398A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008133161A1 (ja) | 2007-04-17 | 2008-11-06 | Ajinomoto Co., Inc. | カルボキシル基を有する酸性物質の製造法 |
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