JPH05244970A - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法Info
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- JPH05244970A JPH05244970A JP4211461A JP21146192A JPH05244970A JP H05244970 A JPH05244970 A JP H05244970A JP 4211461 A JP4211461 A JP 4211461A JP 21146192 A JP21146192 A JP 21146192A JP H05244970 A JPH05244970 A JP H05244970A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 エシェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタ
ミン酸の生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グル
タミン酸の製造法を提供する。 【構成】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生産能
を有する変異株またはこれらの性質に加えａｃｅオペロ
ンの発現が構成的となっている変異株を液体培地で培養
し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法。
ミン酸の生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グル
タミン酸の製造法を提供する。 【構成】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生産能
を有する変異株またはこれらの性質に加えａｃｅオペロ
ンの発現が構成的となっている変異株を液体培地で培養
し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は食品、医
薬品等として重要なアミノ酸である。
ミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は食品、医
薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】従来Ｌ−グルタミン酸は主としてブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるグルタミン酸生産菌また
はそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている
（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５
頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、スト
レプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方
法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナ
ス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ
属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８
５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グル
タミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需
要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率
的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められてい
る。
バクテリウム属、コリネバクテリウム属またはミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるグルタミン酸生産菌また
はそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている
（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５
頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法による
Ｌ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、スト
レプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方
法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナ
ス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ
属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８
５７号）等が知られている。従来の方法によりＬ−グル
タミン酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需
要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率
的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発が求められてい
る。
【０００３】大腸菌はその増殖速度の大きさ並びに遺伝
子解析の進み方から将来的に優れたＬ−グルタミン酸生
産菌として利用される可能性を有しているが、従来の報
告では大腸菌によるＬ−グルタミン酸の蓄積量は２．３
ｇ／ｌと極めて低いレベルにある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、第５０巻、１６４〜１６５頁、１９６１年）。
子解析の進み方から将来的に優れたＬ−グルタミン酸生
産菌として利用される可能性を有しているが、従来の報
告では大腸菌によるＬ−グルタミン酸の蓄積量は２．３
ｇ／ｌと極めて低いレベルにある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、第５０巻、１６４〜１６５頁、１９６１年）。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エ
シェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能
を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造
法を提供することである。
シェリヒア属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能
を向上させ、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造
法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、大腸菌の
変異株によるＬ−グルタミン酸の製造法について鋭意研
究を重ねた結果、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ
（以下、α−ＫＧＤＨと略す）活性が欠損もしくは低下
しかつＬ−グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタ
ミン酸生産能を有する大腸菌の変異株並びにこれらの性
質に加えマレートシンターゼ（ａｃｅＢ）・イソシトレ
ートリアーゼ（ａｃｅＡ）・イソシトレートデヒドロゲ
ナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペロ
ン（以下、ａｃｅオペロンと略す）の発現が構成的にな
った変異株が高いＬ−グルタミン酸生産能を持つことを
見いだし、本発明を完成するに至った。
変異株によるＬ−グルタミン酸の製造法について鋭意研
究を重ねた結果、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ
（以下、α−ＫＧＤＨと略す）活性が欠損もしくは低下
しかつＬ−グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタ
ミン酸生産能を有する大腸菌の変異株並びにこれらの性
質に加えマレートシンターゼ（ａｃｅＢ）・イソシトレ
ートリアーゼ（ａｃｅＡ）・イソシトレートデヒドロゲ
ナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（ａｃｅＫ）オペロ
ン（以下、ａｃｅオペロンと略す）の発現が構成的にな
った変異株が高いＬ−グルタミン酸生産能を持つことを
見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、エシェリヒア属に属
し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生産能
を有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グ
ルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供
するものである。また本発明は、エシェリヒア属に属
し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、さらにａｃｅオペロンの
発現が構成的になっており、Ｌ−グルタミン酸生産能を
有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グル
タミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供す
るものである。
し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生産能
を有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グ
ルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供
するものである。また本発明は、エシェリヒア属に属
し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつＬ−グ
ルタミン酸分解活性が低下し、さらにａｃｅオペロンの
発現が構成的になっており、Ｌ−グルタミン酸生産能を
有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ−グル
タミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を提供す
るものである。
【０００７】本発明で使用する変異株は、エシェリヒア
属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつ
Ｌ−グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸
生産能を有する変異株並びにこれらの性質に加えａｃｅ
オペロンの発現が構成的になった変異株である。さらに
これらの性質に加えてＬ−グルタミン酸生産能の向上に
有効な公知の性質、例えば各種栄養要求性、薬剤耐性、
薬剤感受性、薬剤依存性等の性質を併せ持っていてもよ
い。変異株の具体例としては次のものが挙げられる。
属に属し、α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下しかつ
Ｌ−グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸
生産能を有する変異株並びにこれらの性質に加えａｃｅ
オペロンの発現が構成的になった変異株である。さらに
これらの性質に加えてＬ−グルタミン酸生産能の向上に
有効な公知の性質、例えば各種栄養要求性、薬剤耐性、
薬剤感受性、薬剤依存性等の性質を併せ持っていてもよ
い。変異株の具体例としては次のものが挙げられる。
【０００８】 エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５４） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５３）
３８５４） エシェリヒア・コリＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８５３）
【０００９】本発明の変異株を誘導するために使用され
る親株としては、エシェリヒア属に属する微生物で病原
性のない菌株が用いられる。具体的な例としては、次の
ような株が挙げられる。
る親株としては、エシェリヒア属に属する微生物で病原
性のない菌株が用いられる。具体的な例としては、次の
ような株が挙げられる。
【００１０】 エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）
【００１１】これら親株から本発明の変異株を得る方法
としては、通常の変異処理法、例えばＸ線や紫外線の照
射あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（以下、ＮＧと略す）等の変異剤に接触せしめ
る等の方法が適用できる。また、このような変異株は、
他の遺伝的手法、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、
細胞融合法等によっても誘導することができる。
としては、通常の変異処理法、例えばＸ線や紫外線の照
射あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（以下、ＮＧと略す）等の変異剤に接触せしめ
る等の方法が適用できる。また、このような変異株は、
他の遺伝的手法、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、
細胞融合法等によっても誘導することができる。
【００１２】変異株取得のためのより具体的な手段は次
のようなものである。
のようなものである。
【００１３】α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した
変異株は、例えば好気的培養条件下でグルコースを含む
最少培地で生育できないかもしくは生育速度が著しく低
下し、コハク酸またはリジン・メチオニンを添加したグ
ルコース培地で生育可能な変異株または嫌気的培養条件
下でグルコースを含む最少培地で生育可能な変異株とし
て分離できる（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、第１０５巻、１８２〜１９０頁、１９６９年）。
変異株は、例えば好気的培養条件下でグルコースを含む
最少培地で生育できないかもしくは生育速度が著しく低
下し、コハク酸またはリジン・メチオニンを添加したグ
ルコース培地で生育可能な変異株または嫌気的培養条件
下でグルコースを含む最少培地で生育可能な変異株とし
て分離できる（Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、第１０５巻、１８２〜１９０頁、１９６９年）。
【００１４】ａｃｅオペロンの発現が構成的になった変
異株は、フォスフォエノールピルベートシンターゼ（ｐ
ｐｓ）欠損株を親株とし、乳酸を炭素源とする最少培地
で生育し、ピルビン酸または酢酸・ピルビン酸を炭素源
とする最少培地では生育できない株として得られる他、
好気的培養条件下でα−ＫＧＤＨ欠損もしくは低下株の
生育を改善する変異株としても得られる（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．、第９６巻、２１８５〜２１８６頁、１９
６８年）。
異株は、フォスフォエノールピルベートシンターゼ（ｐ
ｐｓ）欠損株を親株とし、乳酸を炭素源とする最少培地
で生育し、ピルビン酸または酢酸・ピルビン酸を炭素源
とする最少培地では生育できない株として得られる他、
好気的培養条件下でα−ＫＧＤＨ欠損もしくは低下株の
生育を改善する変異株としても得られる（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．、第９６巻、２１８５〜２１８６頁、１９
６８年）。
【００１５】Ｌ−グルタミン酸の分解能が低下した変異
株は、単一炭素源としてグルコースの代わりにＬ−グル
タミン酸を含む最少培地または単一窒素源として硫酸ア
ンモニウムの代わりにＬ−グルタミン酸を含む最少培地
で生育できないかもしくは生育速度が著しく低下する変
異株として分離できる。但し、栄養要求性を有する変異
株を用いる場合は、生育に必要な栄養素の必要最少限量
を当然培地に添加しなければならない。
株は、単一炭素源としてグルコースの代わりにＬ−グル
タミン酸を含む最少培地または単一窒素源として硫酸ア
ンモニウムの代わりにＬ−グルタミン酸を含む最少培地
で生育できないかもしくは生育速度が著しく低下する変
異株として分離できる。但し、栄養要求性を有する変異
株を用いる場合は、生育に必要な栄養素の必要最少限量
を当然培地に添加しなければならない。
【００１６】かくして得られる本発明の変異株は、ＴＣ
Ａサイクルのα−ケトグルタル酸を経てＬ−グルタミン
酸に至る生合成経路の流れが改善されており、かつ生成
したＬ−グルタミン酸の分解活性が著しく低い変異株ま
たはさらにａｃｅオペロンが構成的に発現するために生
育が改善した変異株であるため、Ｌ−グルタミン酸の生
産能が向上している。
Ａサイクルのα−ケトグルタル酸を経てＬ−グルタミン
酸に至る生合成経路の流れが改善されており、かつ生成
したＬ−グルタミン酸の分解活性が著しく低い変異株ま
たはさらにａｃｅオペロンが構成的に発現するために生
育が改善した変異株であるため、Ｌ−グルタミン酸の生
産能が向上している。
【００１７】以上の方法で取得した変異株を用いてＬ−
グルタミン酸を生産せしめるには、炭素源、窒素源、無
機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法に
より行うことができる。合成培地または天然培地のいず
れも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素
源は、使用菌の利用可能なものならばいずれの種類を用
いてもよい。炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が
使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独
あるいは他の炭素源と併用して用いられる。窒素源とし
ては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アン
モニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用され
る。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂
肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カ
ザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用す
る場合には要求される栄養素を補添する事が必要であ
る。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
グルタミン酸を生産せしめるには、炭素源、窒素源、無
機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法に
より行うことができる。合成培地または天然培地のいず
れも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素
源は、使用菌の利用可能なものならばいずれの種類を用
いてもよい。炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が
使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独
あるいは他の炭素源と併用して用いられる。窒素源とし
ては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アン
モニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用され
る。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂
肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カ
ザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用す
る場合には要求される栄養素を補添する事が必要であ
る。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
【００１８】培養方法は、発酵温度２０ないし４５℃、
ｐＨを５ないし９に制御しつつ通気培養を行う。培養中
にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、
アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０
時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著
量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
ｐＨを５ないし９に制御しつつ通気培養を行う。培養中
にｐＨが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、
アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして１０
時間ないし４日間程度培養することにより培養液中に著
量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
【００１９】培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸
を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよ
い。例えば培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する
方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって
採取される。
を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよ
い。例えば培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する
方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって
採取される。
【実施例】次に実施例によって本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
【００２０】実施例１ （１）Ｌ−グルタミン酸の分解活性が低下した変異株の
誘導。 酵母エキス０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウ
ム０．５％（ｐＨ７．０）を含むＬブロスで３７℃、３
時間培養して得たエシェリヒア・コリＷ３１１０の生菌
体を５００μｇ／ｍｌの濃度のＮＧで３７℃、１５分間
処理することにより変異を誘導後、レプリカ法により表
１に示す基本最少培地上には生育するが、同じく表１に
示すＬ−グルタミン酸を単一炭素源とする最少培地
（Ａ）上およびＬ−グルタミン酸を単一窒素源とする最
少培地（Ｂ）上では生育が著しく遅れる変異株エシェリ
ヒア・コリＧＨ−１を取得した（培養温度：３７℃、培
養日数２日間）。
誘導。 酵母エキス０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウ
ム０．５％（ｐＨ７．０）を含むＬブロスで３７℃、３
時間培養して得たエシェリヒア・コリＷ３１１０の生菌
体を５００μｇ／ｍｌの濃度のＮＧで３７℃、１５分間
処理することにより変異を誘導後、レプリカ法により表
１に示す基本最少培地上には生育するが、同じく表１に
示すＬ−グルタミン酸を単一炭素源とする最少培地
（Ａ）上およびＬ−グルタミン酸を単一窒素源とする最
少培地（Ｂ）上では生育が著しく遅れる変異株エシェリ
ヒア・コリＧＨ−１を取得した（培養温度：３７℃、培
養日数２日間）。
【００２１】
【表１】
【００２２】得られた変異株のＬ−グルタミン酸分解活
性を調べるために、本変異株および親株であるエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０を上記３種類の最少培地と同じ組
成の液体培地で３７℃、４８時間培養し生育度を測定し
た。その結果を表２に示す。エシェリヒア・コリＧＨ−
１は親株に比べてＬ−グルタミン酸を単一炭素源または
単一窒素源とする最少培地での生育が著しく悪く、Ｌ−
グルタミン酸分解活性が低下していた。
性を調べるために、本変異株および親株であるエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０を上記３種類の最少培地と同じ組
成の液体培地で３７℃、４８時間培養し生育度を測定し
た。その結果を表２に示す。エシェリヒア・コリＧＨ−
１は親株に比べてＬ−グルタミン酸を単一炭素源または
単一窒素源とする最少培地での生育が著しく悪く、Ｌ−
グルタミン酸分解活性が低下していた。
【００２３】
【表２】
【００２４】（２）α−ＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低
下した変異株の誘導。 上述のようにして得られたエシェリヒア・コリＧＨ−１
株を（１）と同様の方法で変異処理し、レプリカ法によ
り表１に示す基本最少培地上では生育が著しく遅れる
が、同じく表１に示すコハク酸を添加した最少培地
（Ｃ）上およびＬ−リジンとＬ−メチオニンを添加した
最少培地（Ｄ）上では良好に生育する変異株エシェリヒ
ア・コリＡＪ１２６２８を取得した（培養温度３７℃、
培養日数２日間）。
下した変異株の誘導。 上述のようにして得られたエシェリヒア・コリＧＨ−１
株を（１）と同様の方法で変異処理し、レプリカ法によ
り表１に示す基本最少培地上では生育が著しく遅れる
が、同じく表１に示すコハク酸を添加した最少培地
（Ｃ）上およびＬ−リジンとＬ−メチオニンを添加した
最少培地（Ｄ）上では良好に生育する変異株エシェリヒ
ア・コリＡＪ１２６２８を取得した（培養温度３７℃、
培養日数２日間）。
【００２５】本変異株並びに比較のためにエシェリヒア
・コリＷ３１１０のα−ＫＧＤＨ活性をＲｅｅｄらの方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第
１３巻、５５頁、１９６９年）により測定した。その結
果を表３に示す。エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８に
はα−ＫＧＤＨ活性は検出されなかった。
・コリＷ３１１０のα−ＫＧＤＨ活性をＲｅｅｄらの方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第
１３巻、５５頁、１９６９年）により測定した。その結
果を表３に示す。エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８に
はα−ＫＧＤＨ活性は検出されなかった。
【００２６】
【表３】
【００２７】（３）ａｃｅオペロンの発現が構成的にな
った変異株の誘導。 大腸菌ジェネティックストックセンター（米国エール
大）より入手したａｃｅオペロンの構成的発現株エシェ
リヒア・コリＰＬＫ８３１（ｉｃｌＲ７、ｇａｌ、ｔｒ
ｐＥ、ｐｙｒＦ、ｆｎｒ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＲ）を供与
菌とし、（２）で得られたエシェリヒア・コリＡＪ１２
６２８を受容菌としてＰ１ｖｉｒファージによるｉｃｌ
Ｒマーカーの形質導入をおこなった。Ｌ−ブロスを用い
て対数増殖期まで培養したエシェリヒア・コリＰＬＫ８
３１の培養液に２．５×１０-3ＭとなるようにＣａＣｌ
2を加え、次いでＰ１ｖｉｒをｍ．ｏ．ｉ．すなわち１
細胞当りのファージ数が５となるように加えた後、３７
℃で９０分間培養を続け溶菌液を得た。この溶液にクロ
ロホルムを加え残存菌を死滅させた後遠心分離して上清
をファージ溶液とした。次にＬ−ブロスで対数増殖期ま
で培養したエシェリヒア・コリＡＪ１２６２８の培養液
にＣａＣｌ2を上と同じ濃度加え、続いてファージ溶液
をｍ．ｏ．ｉ．が０．２となるように加え、３７℃で３
０分間静置した。その後遠心分離により上清を除き、
２．５×１０-3ＭのＣａＣｌ2を含む生理食塩水に菌体
を懸濁し希釈して表１の（Ｄ）に示したプレート培地に
播種した。３７℃、２日間培養後、エシェリヒア・コリ
ＡＪ１２６２８より生育が速くなった株としてエシェリ
ヒア・コリＡＪ１２６２４を取得した。
った変異株の誘導。 大腸菌ジェネティックストックセンター（米国エール
大）より入手したａｃｅオペロンの構成的発現株エシェ
リヒア・コリＰＬＫ８３１（ｉｃｌＲ７、ｇａｌ、ｔｒ
ｐＥ、ｐｙｒＦ、ｆｎｒ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＲ）を供与
菌とし、（２）で得られたエシェリヒア・コリＡＪ１２
６２８を受容菌としてＰ１ｖｉｒファージによるｉｃｌ
Ｒマーカーの形質導入をおこなった。Ｌ−ブロスを用い
て対数増殖期まで培養したエシェリヒア・コリＰＬＫ８
３１の培養液に２．５×１０-3ＭとなるようにＣａＣｌ
2を加え、次いでＰ１ｖｉｒをｍ．ｏ．ｉ．すなわち１
細胞当りのファージ数が５となるように加えた後、３７
℃で９０分間培養を続け溶菌液を得た。この溶液にクロ
ロホルムを加え残存菌を死滅させた後遠心分離して上清
をファージ溶液とした。次にＬ−ブロスで対数増殖期ま
で培養したエシェリヒア・コリＡＪ１２６２８の培養液
にＣａＣｌ2を上と同じ濃度加え、続いてファージ溶液
をｍ．ｏ．ｉ．が０．２となるように加え、３７℃で３
０分間静置した。その後遠心分離により上清を除き、
２．５×１０-3ＭのＣａＣｌ2を含む生理食塩水に菌体
を懸濁し希釈して表１の（Ｄ）に示したプレート培地に
播種した。３７℃、２日間培養後、エシェリヒア・コリ
ＡＪ１２６２８より生育が速くなった株としてエシェリ
ヒア・コリＡＪ１２６２４を取得した。
【００２８】次にこれらの株を同上の液体培地で好気的
に培養し、イソシトレートリアーゼ活性をＶａｎｄｅｒ
ｗｉｎｋｅｌらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１２巻、１５７頁、１
９６３年）により測定した。その結果を表４に示す。エ
シェリヒア・コリＡＪ１２６２４は親株であるエシェリ
ヒア・コリＡＪ１２６２８に比較してイソシトレートリ
アーゼ活性が著しく高まっており、形質導入の結果ａｃ
ｅオペロンの発現が構成的になっていることが示され
た。
に培養し、イソシトレートリアーゼ活性をＶａｎｄｅｒ
ｗｉｎｋｅｌらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１２巻、１５７頁、１
９６３年）により測定した。その結果を表４に示す。エ
シェリヒア・コリＡＪ１２６２４は親株であるエシェリ
ヒア・コリＡＪ１２６２８に比較してイソシトレートリ
アーゼ活性が著しく高まっており、形質導入の結果ａｃ
ｅオペロンの発現が構成的になっていることが示され
た。
【００２９】
【表４】
【００３０】（４）得られた変異株によるＬ−グルタミ
ン酸の生産。 エシェリヒア・コリＷ３１１０、ＧＨ−１、ＡＪ１２６
２８及びＡＪ１２６２４をそれぞれ表５の組成の培地２
０ｍｌを注入した５００ｍｌ容振とうフラスコに接種し
て、３７℃にて添加糖が消費されるまで振とう培養した
ところ、表６に示すようにＬ−グルタミン酸の生成蓄積
が認められた。この結果から明らかなように、α−ＫＧ
ＤＨ活性が欠損しかつＬ−グルタミン酸分解能が低下
し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する変異株ではＬ−グ
ルタミン酸の蓄積量の著しい向上が認められた。さらに
これらの性質に加えａｃｅオペロンの発現が構成的にな
っている変異株は発酵時間の大幅な短縮効果が確認され
た。
ン酸の生産。 エシェリヒア・コリＷ３１１０、ＧＨ−１、ＡＪ１２６
２８及びＡＪ１２６２４をそれぞれ表５の組成の培地２
０ｍｌを注入した５００ｍｌ容振とうフラスコに接種し
て、３７℃にて添加糖が消費されるまで振とう培養した
ところ、表６に示すようにＬ−グルタミン酸の生成蓄積
が認められた。この結果から明らかなように、α−ＫＧ
ＤＨ活性が欠損しかつＬ−グルタミン酸分解能が低下
し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する変異株ではＬ−グ
ルタミン酸の蓄積量の著しい向上が認められた。さらに
これらの性質に加えａｃｅオペロンの発現が構成的にな
っている変異株は発酵時間の大幅な短縮効果が確認され
た。
【００３１】
【表５】
【００３２】
【表６】
【００３３】（５）コハク酸もしくはＬ−リジンとＬ−
メチオニンの無添加培養 エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８、ＡＪ１２６２４を
それぞれ表７の組成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍ
ｌ容振とうフラスコに接種して、３７℃にて添加糖が消
費されるまで振とう培養した。表７の生産培地Ｂは、表
５に示されるものと同一のものである。
メチオニンの無添加培養 エシェリヒア・コリＡＪ１２６２８、ＡＪ１２６２４を
それぞれ表７の組成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍ
ｌ容振とうフラスコに接種して、３７℃にて添加糖が消
費されるまで振とう培養した。表７の生産培地Ｂは、表
５に示されるものと同一のものである。
【００３４】表８に示すようにａｃｅオペロンが構成的
に発現していないＡＪ１２６２８ではコハク酸もしくは
Ｌ−リジンとＬ−メチオニンを添加することにより発酵
時間の大幅な短縮が観察された。これに対してａｃｅオ
ペロンを構成的に発現しているＡＪ１２６２４ではコハ
ク酸もしくはＬ−リジンとＬ−メチオニンを添加しなく
とも、ＡＪ１２６２８に比して発酵時間の短縮が認めら
れた。これらよりａｃｅオペロンを構成的に発現させる
ことにより、培地へコハク酸もしくはＬ−リジンとＬ−
メチオニンを添加せずに発酵時間を短縮することができ
ることを確認した。すなわち、ａｃｅオペロンを構成的
に発現させることにより、培地の組成を単純にすること
が可能であり、かつ高価なＬ−リジンとＬ−メチオニン
の培地への添加を不要とすることができる。
に発現していないＡＪ１２６２８ではコハク酸もしくは
Ｌ−リジンとＬ−メチオニンを添加することにより発酵
時間の大幅な短縮が観察された。これに対してａｃｅオ
ペロンを構成的に発現しているＡＪ１２６２４ではコハ
ク酸もしくはＬ−リジンとＬ−メチオニンを添加しなく
とも、ＡＪ１２６２８に比して発酵時間の短縮が認めら
れた。これらよりａｃｅオペロンを構成的に発現させる
ことにより、培地へコハク酸もしくはＬ−リジンとＬ−
メチオニンを添加せずに発酵時間を短縮することができ
ることを確認した。すなわち、ａｃｅオペロンを構成的
に発現させることにより、培地の組成を単純にすること
が可能であり、かつ高価なＬ−リジンとＬ−メチオニン
の培地への添加を不要とすることができる。
【００３５】
【表７】
【００３６】
【表８】
【００３７】
【発明の効果】本発明の方法により、エシェリヒア属に
属する変異株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることが
でき、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造するこ
とができる。
属する変異株のＬ−グルタミン酸生産能を高めることが
でき、Ｌ−グルタミン酸を安価かつ効率的に製造するこ
とができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 河原 義雄 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 エシェリヒア属に属し、α−ケトグルタ
ル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下しかつＬ
−グルタミン酸分解活性が低下し、Ｌ−グルタミン酸生
産能を有する変異株を液体培地に培養し、培養液中にＬ
−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法。 - 【請求項２】 該変異株がさらにマレートシンターゼ
（ａｃｅＢ）・イソシトレートリアーゼ（ａｃｅＡ）・
イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファ
ターゼ（ａｃｅＫ）オペロンの発現が構成的になった変
異株である請求項１記載のＬ−グルタミン酸の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-197774 | 1991-08-07 | ||
| JP19777491 | 1991-08-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244970A true JPH05244970A (ja) | 1993-09-24 |
| JP3106714B2 JP3106714B2 (ja) | 2000-11-06 |
Family
ID=16380129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04211461A Expired - Fee Related JP3106714B2 (ja) | 1991-08-07 | 1992-08-07 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5378616A (ja) |
| JP (1) | JP3106714B2 (ja) |
| BR (1) | BR9203053A (ja) |
| FR (1) | FR2680178B1 (ja) |
| PH (1) | PH30131A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1997008294A1 (fr) * | 1995-08-23 | 1997-03-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production d'acide l-glutamique par fermentation |
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| WO2006001380A1 (ja) | 2004-06-25 | 2006-01-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 物質の製造法 |
| WO2008075483A1 (ja) | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2008090770A1 (ja) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2008114721A1 (ja) | 2007-03-14 | 2008-09-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
| WO2008126784A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | グルタチオンおよびγ-グルタミルシステインの製造法 |
| WO2008133161A1 (ja) | 2007-04-17 | 2008-11-06 | Ajinomoto Co., Inc. | カルボキシル基を有する酸性物質の製造法 |
| WO2010027045A1 (ja) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2010027022A1 (ja) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸生産菌及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2011024583A1 (ja) | 2009-08-25 | 2011-03-03 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
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| WO2015005405A1 (ja) * | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| WO2015005406A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| WO2015041265A1 (ja) | 2013-09-17 | 2015-03-26 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ－アミノ酸の製造方法 |
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