JPH11507236A - 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング - Google Patents
操作された組換え部位を使用する組換えクローニングInfo
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Abstract
(57)【要約】
組換えクローニングが、所望の特性（単数もしくは複数）および／またはDNAセグメント（単数もしくは複数）を有するキメラDNA分子を提供するための操作された組換え部位および組換えタンパク質を用いてDNA分子のセグメントを移動または交換するための、インビトロおよびインビボにおける、核酸、ベクターおよび方法の使用により、提供される。
Description
【発明の詳細な説明】
操作された組換え部位を使用する組換えクローニング
発明の背景
発明の分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。操作された組換え部位を有するDNAお
よびベクターが、組換えタンパク質を用いるDNAセグメントの効率的かつ特異的
な組換えを可能にする組換えクローニング方法における使用のために提供される
。このDNA、ベクターおよび方法は、インビトロまたはインビボにおける、DNAの
サブクローニングのような種々のDNA交換のために有用である。
関連技術
部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、いくつかのウイル
スおよび細菌において存在する酵素であり、そしてエンドヌクレアーゼ特性およ
びリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これらのリコンビナーゼ
は（いくつかの場合においては会合タンパク質とともに）、DNA中の特異的塩基
の配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するDNAセグメントを交換す
る。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、集合的に「組換えタンパク質」と
いわれる（例えば、Landy，A.，Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(
1993)を参照のこと）。
種々の生物由来の多数の組換え系が記載されている。例えば、Hoessら、Nucle
ic Acids Research 14(6):2287(1986)；Abremskiら、J．Biol．Chem．261(1):39
1(1986)；Campbell，J．Bacteriol．174(23):7495(1992)；Qianら、J．Biol．Ch
em．267(11):7794(1992)；Arakiら、J．Mol．Biol．225(1):25(1992)；Maeserお
よびKahnmann(1991)Mol．Gen．Genet．230:170-176。
これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Argo
sら、EMBO J．5：433-440(1986)）。おそらく、これらの中で最も十分に研究さ
れたのは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ/att系（Landy．A．Curr
ent Opinions in Genetics and Devel．3:699-707(1993)）、バクテリオファー
ジP1由来のCre/loxP系（HoessおよびAbremski（1990）Nucleic Acids and Molec
ular Biology、第４巻、EcksteinおよびLilley編、Berlin-Heidelberg: Springe
r-Verlag；90-109頁）、およびSaccharomyces serevisiae２μ環状プラスミド由
来のFLP/FRT系（Broachら、Cell 29:227-234(1982)）である。
これらの組換え系は特定の生物について特徴付けられたが、関連技術は、イン
ビボにおける組換えについて、組換え部位により隣接される組換えDNAを用いて
教示されたのみである。
Backman（米国特許第4,673,640号）は、野生型組換え部位attBおよびattPを用
いる酵素的部位特異的組換えによりDNAセグメントを産生するタンパク質を組み
換えるためのλリコンビナーゼのインビボにおける使用を開示する。
HasanおよびSzybalski（Gene 56:145-151(1987)）は、プロモーターに隣接す
る野生型attP部位とattB部位との間の分子内組換えのためのインビボにおけるλ
Intリコンビナーゼの使用を開示する。これらの部位の方向は互いに関して逆で
あるので、これは目的の遺伝子に対して不可逆的なプロモーター領域のフリッピ
ング（flipping）を引き起こす。
Palazzoloら、Gene 88:25-36(1990)は、クローン化されるDNA配列の外側およ
び野生型loxP部位間に配置された制限部位を含有するバクテリオファージλアー
ムを有するファージλベクターを開示する。これらのファージベクターでの、Cr
eリコンビナーゼを発現するE．coli細胞の感染は、loxP部位間での組換えおよび
プラスミドレプリコン（クローン化cDNAを含む）のインビボ切り出しを生じる。
つの野生型FRT認識配列により隣接される選択マーカーを有する部分的発現ベク
ターを挿入するための方法を開示する。細胞中に存在するFLP部位特異的リコン
ビナーゼが、ベクターをゲノム中に所定の部位において組み込むために使用され
る。レプリコンが機能的である条件下において、このクローン化ゲノムDNAは増
幅され得る。
Bebeeら（米国特許第5,434,066号）は、２つのloxP部位を含むDNAのためのCre
のような部位特異的リコンビナーゼの使用が部位間のインビボ組換えのために使
用されることを開示する。
Boyd（Nucl．Acids Res．21:817-821(1993)）は、E．coli宿主細胞中に存在す
るCre部位特異的リコンビナーゼにより作用される野生型loxP部位を含有する脱
リン酸化されたベクターの分子間連結を促進する条件を用いて平滑末端DNAのク
ローニングを容易にする方法を開示する。
Waterhouseら（PCT第93/19172号およびNucleic Acids Res．21（9）:2265(199
3)）は、特定の抗体のＬ鎖およびＨ鎖がloxPおよびloxP 511部位の間で異なるフ
ァージベクター中にクローン化され、そしてそれを使用して新たなE．coli細胞
を形質転換するインビボ方法を開示する。Cre（宿主細胞において２つの親分子
（１つはプラスミド、１つはファージ）に作用する）は４つの産物を平衡して産
生した：２つの異なるコインテグレート（cointegrate）（loxP部位またはloxP
511部位のいずれかにおける組換えにより産生される）、および２つの娘分子（
その１つが所望された産物であった）。
他の関連技術とは対照的に、SchlakeおよびBobe（Biochemistry 33:12746-127
51(1994)）は、各々が野生型およびスペーサー変異されたFRT組換え部位により
隣接される、規定された染色体位置において発現カセットを交換するためのイン
ビボ方法を開示する。二重交換交叉（double-reciprocal crossover）が部位特
異的組換えのためにこのFLP/FRT系を用いることにより培養哺乳動物細胞におい
て媒介された。
トランスポゼース。酵素トランスポゼースのファミリーもまた、レプリコン間
で遺伝子情報を移動するために使用されている。トランスポゾンは構造的に可変
性であるが（単純（simple）または複合（compound）と記載される）、代表的に
は逆方向に構成されるDNA配列により隣接されるリコンビナーゼ遺伝子をコード
する。トランスポゾンの組み込みは、ランダムであり得るかまたは高度に特異的
であり得る。Tn7（これは高度に部位特異的である）のような代表物が、レプリ
コン間のDNAセグメントのインビボにおける移動に適用された（Lucklowら、J．V
iol．67:4566-4579(1993)）。
DevineおよびBoeke Nucl．Acids Res．22:3765-3772(1994)は、DNAセグメント
のインビトロにおけるレシピエントDNA分子中への挿入のための人工トランス
ポゾンの構築を開示する。この系は、酵母TY1ウイルス様粒子のインテグラーゼ
を利用する。目的のDNAセグメントは、標準的な方法を用いて、トランスポゾン
様エレメントTY1の末端間にクローン化される。TY1インテグラーゼの存在下にお
いて、生じるエレメントは第２の標的DNA分子中へランダムに組み込まれる。
DNAクローニング。DNAセグメントのクローニングは、現在、多数の研究所にお
ける日常的な慣例として、そして多数の遺伝子解析における事前に必要な工程と
して生じている。しかし、これらのクローニングの目的は多様であり、２つの一
般的な目的は以下にように考えられ得る：（1）大きなDNAまたはRNAセグメント
（染色体、YAC、PCRフラグメント、mRNAなど）からのDNAの最初のクローニング
（pUC、pGem、pBlueScriptのような比較的少ない公知のベクターにおいて実施さ
れる）、および（2）これらのDNAセグメントの特殊化されたベクター中への機能
的分析のためのサブクローニング。多量の時間および努力が、DNAセグメントの
最初のクローニングにおいて、およびDNAセグメントの最初のクローニングベク
ターからより特殊化されたベクターへの移動においての両方で費やされている。
この移動なサブクローニングと呼ばれる。
クローニングのための基本的な方法は長年知られており、そしてその時間でほ
とんど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは以下とおりである：
（1）目的のDNAを１つまたは２つの制限酵素で消化し；
（2）既知の場合目的のDNAセグメントをゲル精製し；
（3）適切な制限酵素での切断、アルカリホスファターゼでの処理、ゲル精製
など（適切なように）によりベクターを調製し；
（4）未切断および自己連結されたベクターのバックグラウンドを概算するた
めの適切なコントロールを有して、DNAセグメントをベクターに連結し；
（5）生じるベクターをE．coli宿主細胞中に導入し；
（6）選択されたコロニーをひろい、そして小培養物を一晩増殖させ；
（7）DNAミニプレップを作製し；そして
（8）アガロースゲルで（しばしば診断的制限酵素消化の後）またはPCRにより
、単離されたプラスミドを分析する。
DNAセグメントをサブクローニングするために使用される特殊化されたベクタ
ーは、機能的に多様である。これらは、以下を包含するがこれらに限定されない
：種々の生物において遺伝子を発現させるための；遺伝子発現を調節するための
；タンパク質精製を補助するためのまたは細胞におけるタンパク質の追跡を可能
にするためのタグを提供するための；クローン化されたDNAセグメントを改変す
るための（例えば、欠失の生成）；プローブの合成のための（例えば、リボプロ
ーブ）；DNA配列決定のためのテンプレートの調製のための；タンパク質コード
領域の同定のための；種々のタンパク質コード領域の融合のための；多量の目的
のDNAを提供するための、などのベクター。特定の研究が、目的のDNAセグメント
をいくつかの異なる特殊化されたベクター中へサブクローニングする工程を包含
することは一般的である。
当該分野において公知であるように、単純なサブクローニングは１日で実施さ
れ得る（例えば、DNAセグメントは大きくなく、そして制限部位がサブクローニ
ングベクターの制限部位と適合性である）。しかし、他の多くのサブクローニン
グ（特に、未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な配
置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング）は、数週
間かかり得る。従って、DNAフラグメントのサブクローニングは、しばしば、可
能な限り少ない回数で実施されるべき面倒な仕事であるとみなされる。
DNAセグメントのクローニングを容易にするいくつかの方法が、例えば以下の
参考文献におけるように記載されている。
Ferguson，J.ら、Gene 16:191(1981)は、酵母DNAのフラグメントのサブクロー
ニングのためのベクターのファミリーを開示する。このベクターは、カナマイシ
ン耐性をコードする。より長い酵母DNAセグメントのクローンが部分的に消化さ
れ得、そしてサブクローニングベクター中に連結され得る。もとのクローニング
ベクターがアンピシリンに対する耐性を有する場合には、形質転換の前に精製は
必要ではない。なぜなら、選択はカナマイシンについてであるからである。
Hashimoto-Gotoh，T.ら、Gene 41:125(1986)は、ストレプトマイシン感受性遺
伝子内のユニークなクローニング部位を有するサブクローニングベクターを開示
し；ストレプトマイシン耐性宿主において、優勢感受性遺伝子における挿入また
は欠失を有するプラスミドのみが、ストレプトマイシン選択を生き残る。
従って、制限酵素およびリガーゼを用いる伝統的なサブクローニング方法は、
時間がかかり、そして比較的信頼できない。かなりの労働が費やされ、そして２
日以上後に所望のサブクローンが候補プラスミドの中で見出され得なければ、次
いで、全体のプロセスが計画される別の条件で繰り返されなければならない。部
位特異的リコンビナーゼがDNAをインビボにおいて組換えるために使用されたが
、インビトロにおけるこのような酵素の成功する使用は、いくつかの問題を抱え
ると予想された。例えば、部位特異性および効率は、インビトロにおいて異なる
と予想され；トポロジー的に連結された産物が予想され；そしてDNA基質および
組換えタンパク質のトポロジーがインビトロにおいて顕著に異なると予想された
（例えば、Adamsら、J．Mol．Biol．226:661-73(1992)を参照のこと）。インビ
ボにおいて長時間続き得る反応は、酵素が不活性になる前にインビトロにおいて
顕著に短い時間で生じると予想された。複数のDNA組換え産物が使用される生物
学的宿主において予想され、サブクローニングの不満足な信頼性、特異性または
効率を生じた。インビトロ組換え反応は、所望のレベルの産物を生じるに十分に
効率的であるとは予想されなかった。
従って、制限酵素およびリガーゼの公知の使用を超えて利点を提供する別のサ
ブクローニング系を提供する長い間感じられていた必要が存在する。
発明の要旨
本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質および操作
された組換え部位を用いる、キメラ核酸を得るための、核酸、ベクターおよび方
法を提供する。これらの方法は、関連する背景技術において開示または示唆され
る方法より、高度に特異的であり、迅速でありかつ労働集約的でない。本発明の
改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的のために有用な
DNAまたはRNAのサブクローニング、調節または交換を容易にする。このような目
的は、DNAセグメントのインビトロにおける組換えおよび転写される、複製され
る、単離されるまたはゲノムのDNAまたはRNAの、インビトロまたはインビボにお
ける挿入または改変を包含する。
本発明は、少なくとも１つの操作された組換え部位および少なくとも１つの組
換えタンパク質を用いて、所望の特性（単数または複数）および／あるいはDNA
セグメント（単数または複数）を有するキメラDNA分子を提供する、DNAのセグメ
ントを移動または交換するための、核酸、ベクターおよび方法に関する。一般に
、１つ以上の親DNA分子が組換えられて、１つ以上の娘分子を与え、その少なく
とも１つが所望の産物DNAセグメントまたはベクターである。従って、本発明は
、交換をもたらすための、ならびに／または１つ以上の所望の産物を選択するた
めの、DNA、RNA、ベクターおよび方法に関する。
本発明の１つの実施態様は、キメラDNAの作製方法に関し、この方法は以下の
工程を包含する
（a）インビトロまたはインビボにおいて
（i）第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNA
セグメントを含む、インサートドナーDNA分子、ここで第１および第２の組換え
部位は互いに組換えない；
（ii）第３の組換え部位および第４の組換え部位を含むベクタードナーDNA
分子、ここで、第３および第４の組換え部位は互いに組換えない；
（iii）第１および第３の組換え部位ならびに／または第２および第４の組
換え部位を組換え得る１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
を組み合わせ；
それにより、組換えを生じさせ、その結果少なくとも１つのコインテグレート
DNA分子、上記所望のDNAセグメントを含む少なくとも１つの所望の産物DNA分子
、および任意に副産物DNA分子を産生する工程；および、次いで、任意に、
（b）産物または副産物DNA分子について選択する工程。
本発明の別の実施態様は、少なくとも１つの容器（container）をその中に受
けるまたは保持するように区画化されたキャリア（carrier）または入れ物（rec
eptacle）を含むキットに関し、ここで、第１の容器は、本明細書に記載のよう
に、クローニング部位または選択マーカーに隣接する少なくとも２つの組換え部
位を有するベクターを含むDNA分子を含む。キットは任意に、以下を含む：
（i）その一方もしくは両方が１つ以上の操作された組換え部位により隣接
される、サブクローニングベクターおよび／または選択マーカーを含むベクター
ド
ナープラスミドを含む第２の容器；ならびに／あるいは
（ii）少なくとも１つの上記組換え部位を認識し、そして組換え得る、少な
くとも１つの組換えタンパク質を含む第３の容器。
他の実施態様は、本発明の方法において有用なDNAおよびベクターを包含する
。特に、ベクタードナー分子が１つの実施態様において提供され、ここでベクタ
ードナー内のDNAセグメントが、（i）環状ベクタードナーにおいて、少なくとも
２つの組換え部位において、または（ii）直鎖状ベクタードナーにおいて、少な
くとも１つの組換え部位において、のいずれかにより分離され、ここで、組換え
部位は、好ましくは、組換えの特異性または効率を増強するように操作される。
１つのベクタードナーの実施態様は、第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセ
グメントを含み、第１または第２のセグメントは選択マーカーを含む。第２のベ
クタードナーの実施態様は、第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを
含み、第１または第２のDNAセグメントは、毒性遺伝子を含む。第３のベクター
ドナーの実施態様は、第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを含み、
第１または第２のDNAセグメントは、少なくとも１つの選択マーカーの不活性フ
ラグメントを含み、ここで選択マーカーの不活性フラグメントは、第１または第
２の組換え部位を少なくとも１つの選択マーカーの別の不活性フラグメントをわ
たって組み換えられる場合に機能的な選択マーカーを再構成し得る。
本発明の組換えクローニング方法は、以前のインビボ方法を超えていくつかの
利点を有する。組換え産物の単一の分子が生物学的宿主中へ導入され得、他のDN
A分子（例えば、出発分子、中間体、および副産物）の非存在下における所望の
産物DNAの増殖が、より容易に実現される。反応条件は、酵素活性を最適化する
ように自由に調整され得る。DNA分子は、所望の生物学的宿主に非適合性であり
得（例えば、YAC、ゲノムDNAなど）、使用され得る。多様な供給源由来の組換え
タンパク質が、一緒にまたは逐次的に用いられ得る。
他の実施態様は、当該分野において公知であることと組み合わせて本明細書に
含まれる教示から当業者に明らかである。
図面の簡単な説明
図１は、本明細書の１つの一般的な方法を示す。ここで、開始（親）DNA分子
は、環状または直鎖状であり得る。目標は、新たなサブクローニングベクターＤ
をもとのクローニングベクターＢと交換することである。１つの実施態様におい
て、ＡＤについて、およびすべての他の分子（コインテグレートを含む）に対し
て選択することが所望される。四角および丸は、組換えの部位（例えば、loxP部
位、att部位など）である。例えば、セグメントＤは、発現シグナル、新たな薬
剤マーカー、新たな複製起点、またはマッピングもしくはDNA配列決定のための
特殊化された機能を含み得る。
図２Ａは、インサートドナープラスミド（ここでは、pEZC705）をベクタード
ナープラスミド（ここでは、pEZC726）と組換え、そして産物DNAおよび副産物娘
分子を得るインビトロにおける方法を示す。２つの組換え部位は、ベクタードナ
ー上のattPおよびloxPである。これらの部位により規定される１つのセグメント
上に、そのプロモーターがトランスポゾンTn10由来のtetOPオペレーター／プロ
モーターにより置換されているカナマイシン耐性遺伝子が存在する。Sizemoreら
、Nucl．Acids Res．18(10):2875(1990)を参照のこと。tetリプレッサータンパ
ク質の非存在下において、E．coli RNAポリメラーゼは、tetOPからカナマイシン
耐性遺伝子を転写する。tetリプレッサーが存在する場合、それはtetOPに結合し
、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転写をブロックする。pEZC726の他のセグメ
ントは、構成性プロモーターにより発現されるtetリプレッサー遺伝子を有する
。従って、pEZC726により形質転換される細胞は、tetRと同じセグメント上のク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニ
コールに耐性であるが、カナマイシンに感受性である。リコンビナーゼ媒介性反
応は、tetR遺伝子の、調節されたカナマイシン耐性遺伝子からの分離を生じる。
この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナマイシン耐性を生
じる。第１の組換え反応はインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの添加によ
り駆動される。第２の組換え反応はリコンビナーゼCreをコインテグレート（こ
こでは、pEZC7 Cointegrate）へ添加することにより駆動される。
図２Ｂは、pEZC705の制限地図を示す。
図２Ｃは、pEZC726の制限地図を示す。
図２Ｄは、pEZC7 Cointegrateの制限地図を示す。
図２Ｅは、Intprodの制限地図を示す。
図２Ｆは、Intbyproの制限地図を示す。
図３Ａは、インサートドナープラスミド（ここでは、pEZC602）をベクタード
ナープラスミド（ここでは、pEZC629）と組換え、そして産物（ここでは、EZC6p
rod）および副産物（ここでは、EZC6Bypr）娘分子を得るインビトロにおける方
法を示す。２つの組換え部位は、loxPおよびloxP 511である。これらの部位によ
り規定されるpEZC629の１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポ
ゾンTn10由来のtetOPオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマ
イシン耐性遺伝子が存在する。tetリプレッサータンパク質の非存在下において
、E．coli RNAポリメラーゼは、tetOPからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。
tetリプレッサーが存在する場合、それはtetOPに結合し、そしてカナマイシン耐
性遺伝子の転写をブロックする。pEZC629の他のセグメントは、構成性プロモー
ターにより発現されるtetリプレッサー遺伝子を有する。従って、pEZC629により
形質転換される細胞は、tetRと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カ
ナマイシンに感受性である。反応は、tetR遺伝子の、調節されたカナマイシン耐
性遺伝子からの分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞
においてカナマイシン耐性を生じる。第１および第２の組換え事象は、同じリコ
ンビナーゼCreの添加により駆動される。
図３Ｂは、EZC6Byprの制限地図を示す。
図３Ｃは、EZC6prodの制限地図を示す。
図３Ｄは、pEZC602の制限地図を示す。
図３Ｅは、pEZC629の制限地図を示す。
図３Ｆは、EZC6cointの制限地図を示す。
図４Ａは、組換えクローニングのインビトロ方法の、真核生物細胞における発
現のために、ベクター中へクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子をサブクローン化するための適用を示す。インサートドナープラスミドpE
ZC843は、loxP部位が遺伝子の5'末端に位置するようにloxP部位とattB部位との
間にクローン化されたE．coliのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を含む。ベクタードナープラスミドpEZC1003は、loxP部位に並置され
たサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む。超らせんプラスミドをλ
インテグラーゼおよびCreリコンビナーゼとインビトロで組み合わせた。インキ
ュベーション後、コンピテントなE．coli細胞を組換え反応溶液を用いて形質転
換した。形質転換のアリコートをカナマイシンを含有する寒天プレート上に広げ
て、産物分子（ここでは、CMVProd）を選択した。
図４Ｂは、pEZC843の制限地図を示す。
図４Ｃは、pEZC1003の制限地図を示す。
図４Ｄは、CMVByproの制限地図を示す。
図４Ｅは、CMVProdの制限地図を示す。
図４Ｆは、CMVcointの制限地図を示す。
図５Ａは、pEZC1301の制限地図を示す。
図５Ｂは、pEZC1305の制限地図を示す。
図５Ｃは、pEZC1309の制限地図を示す。
図５Ｄは、pEZC1313の制限地図を示す。
図５Ｅは、pEZC1317の制限地図を示す。
図５Ｆは、pEZC1321の制限地図を示す。
図５Ｇは、pEZC1405の制限地図を示す。
図５Ｈは、pEZC1502の制限地図を示す。
図６Ａは、pEZC1603の制限地図を示す。
図６Ｂは、pEZC1706の制限地図を示す。
図７Ａは、pEZC2901の制限地図を示す。
図７Ｂは、pEZC2913の制限地図を示す。
図７Ｃは、pEZC3101の制限地図を示す。
図７Ｄは、pEZC1802の制限地図を示す。
図８Ａは、pGEX-2TKの制限地図を示す。
図８Ｂは、pEZC3501の制限地図を示す。
図８Ｃは、pEZC3601の制限地図を示す。
図８Ｄは、pEZC3609の制限地図を示す。
図８Ｅは、pEZC3617の制限地図を示す。
図８Ｆは、pEZC3606の制限地図を示す。
図８Ｇは、pEZC3613の制限地図を示す。
図８Ｈは、pEZC3621の制限地図を示す。
図８Ｉは、GST-CATの制限地図を示す。
図８Ｊは、GST-phoAの制限地図を示す。
図８Ｋは、pEZC3201の制限地図を示す。
好ましい実施態様の詳細な説明
サブクローニング反応が組換えクローニングを用いて提供され得るこいうこと
が、本発明において予想外に見出された。本発明による組換えクローニングは、
操作された組換え部位および組換えタンパク質を用いて、DNA分子のセグメント
の移動または交換のために、インビトロおよびインビボにおいて、DNA、ベクタ
ーおよび方法を使用する。これらの方法は、所望の特性（単数または複数）およ
び／あるいはDNAセグメント（単数または複数）を有するキメラDNA分子を提供す
る。
従って、本発明は、インビトロまたはインビボにおいて、組換えタンパク質お
よび操作された組換え部位を使用して、キメラ核酸を得るための、核酸、ベクタ
ーおよび方法を提供する。これらの方法は、関連背景技術において開示または示
唆された方法より、高度に特異的であり、迅速であり、そして労働集約的でない
。本発明の改善された特異性、スピードおよび収率は、任意の関連する目的に有
用である、DNAまたはRNAのサブクローニング、調節または交換を容易にする。こ
のような目的としては、DNAセグメントのインビトロ組換え、および転写される
、複製される、単離されるまたはゲノムのDNAまたはRNAのインビトロまたはイン
ビボにおける挿入または改変が挙げられる。
定義
以下の記載において、組換えDNA技術において使用される多数の用語が多く利
用される。明細書および請求の範囲（こような用語に与えられるべき範囲を含む
）の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
副産物：これは、サブクローン化されることが所望されるDNAを欠く、娘分子
（組換えクローニングプロセスの間に第２の組換え事象の後に産生される新たな
クローン）である。
コインテグレート：これは、親（出発）DNA分子の両方を含む、本発明の少な
くとも１つの組換え中間体DNA分子である。これは通常環状である。いくつかの
実施態様においては、これは直鎖状であり得る。
宿主：これは、組換えクローニング産物のレシピエントであり得る、任意の原
核生物または真核生物であり得る。本明細書において用いられる用語「宿主」は
、遺伝子操作され得る原核生物または真核生物を包含する。このような宿主の例
については、Maniatisら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spr
ing Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982)を参照のこと。
インサート：これは、本発明の方法により操作しようとする、所望のDNAセグ
メント（図１のセグメントＡ）である。インサートは、１つ以上の遺伝子を有し
得る。
インサートドナー：これは、インサートを有する、本発明の２つの親DNA分子
のうちの１つである。インサートドナーDNA分子は、両方の末端において組換え
シグナルに隣接されるインサートを含む。インサートドナーは直鎖状または環状
であり得る。本発明の１つの実施態様において、インサートドナーは環状DNA分
子であり、そして組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさらに含
む（図１を参照のこと）。
産物：これは、組換えクローニングプロセスの間に第２の組換え事象の後に産
生される、ＡおよびＤまたはＢおよびＣ配列を含む所望の娘分子の一方または両
方である（図１を参照のこと）。産物は、クローン化またはサブクローン化され
るべきであったDNAを含む。
プロモーター：これは、開始コドンの近位に位置する、遺伝子の5'領域である
と一般に記載されるDNA配列である。隣接するDNAセグメントの転写はプロモータ
ー領域から開始される。抑制性プロモーターの転写速度は、抑制物質に応答して
減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導物質に応答して増加する。構
成性プロモーターの転写速度は、一般的な代謝条件の影響下で変化し得るが、特
異的に調節されていない。
認識配列：認識配列は、タンパク質、DNAまたはRNA分子（例えば、制限エンド
ヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が認識し、そして結合
する、特定のDNA配列である。例えば、Creリコンビナーゼのための認識配列は、
８塩基対のコア配列に隣接する２つの13塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結
合部位として作用する）を含む34塩基対の配列である、loxPである。Sauer，B.
，Current Opinion in Biotechnology 5:521-527(1994)の図１を参照のこと。認
識配列の他の例としては、リコンビナーゼ酵素であるλインテグラーゼにより認
識される、attB、attP、attL、およびattR配列である。attBは、２つの９塩基対
のコア型Int結合部位および７塩基対の重複領域を含む約25塩基対の配列である
。attPは、コア型Int結合部位およびアーム型Int結合部位、ならびに補助タンパ
ク質IHF、FIS、およびXisのための部位を含む約240塩基対の配列である。Landy
，Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)を参照のこと。このよう
な部位はまた、方法および産物を増強するように、本発明に従って操作される。
リコンビナーゼ：これは、特異的な組換え部位におけるDNAセグメントの交換
を触媒する酵素である。
組換えクローニング：これは、本明細書において記載される方法であって、こ
れによりDNA分子のセグメントが、インビトロまたはインビボにおいて、交換、
挿入、置換（replace）、置換（substitute）または改変される。
組換えタンパク質：これは、１つ以上の組換え部位が関与する組換え反応に関
与する、切り出しタンパク質または組み込みタンパク質、酵素、補因子または会
合タンパク質を包含する。Landy（1994）（下記）を参照のこと。
抑制カセット：これは、サブクローニングベクター中に存在する選択マーカー
のリプレッサーを含むDNAセグメントである。
選択マーカー：これは、しばしば特定の条件下で、それを含有する分子または
細胞について、あるいはそれを含有する分子または細胞に対して選択することを
可能にする、DNAセグメントである。これらのマーカーは、RNA、ペプチド、また
はタンパク質の産生のような（これらに限定されない）活性をコードし得るか、
あるいは、RNA、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物または組成物な
どのための結合部位を提供し得る。選択マーカーの例としては以下が挙げられる
がそれらに限定されない：（1）そうでなければ毒性の化合物（例えば、抗生物
質）に対する耐性を提供する産物をコードするDNAセグメント；（2）そうでなけ
ればレシピエント細胞において欠如している産物をコードするDNAセグメント（
例えば、tRNA遺伝子、栄養要求マーカー）；（3）遺伝子産物の活性を抑制する
産物をコードするDNAセグメント；（4）容易に同定され得る産物をコードするDN
Aセグメント（例えば、βガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質（GFP）、
および細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）；（5）そうでなければ細
胞の生存および／または機能に有害である産物に結合するDNAセグメント；（6）
そうでなければ上記番号（1）〜（5）に記載のDNAセグメントのいずれかの活性
を阻害するDNAセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（7）
基質を修飾する産物に結合するDNAセグメント（例えば、制限エンドヌクレアー
ゼ）；（8）所望の分子（例えば、特異的タンパク質結合部位）を単離するため
に使用され得るDNAセグメント；（9）そうでなければ非機能性であり得る特異的
ヌクレオチド配列をコードするDNAセグメント（例えば、分子の亜集団のPCR増幅
のための）；および／または（10）存在しない場合、直接的または間接的に、特
定の化合物に対する感受性を与えるDNAセグメント。
選択スキーム：これは、インサートドナー、ベクタードナー、および／または
任意の中間体、（例えば、コインテグレート）副産物を含む混合物からの、所望
の産物（単数または複数）の、選択、富化、または同定を可能にする任意の方法
である。１つの好ましい実施態様の選択スキームは、組換えクローニングの間に
連結されているまたは連結されていないのいずれかである、少なくとも２つの成
分を有する。一方の成分は選択マーカーである。他方の成分は、選択マーカーの
インビトロまたはインビボにおける発現、あるいは選択マーカーを有するプラス
ミドを有する細胞の生存を制御する。一般的に、この制御エレメントは、選択マ
ーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現を制
御するための他の手段が使用され得る。リプレッサーが使用されるかアクチベー
ターが使用されるかは、当業者に容易に明らかなように、マーカーがポジティブ
選択用であるかネガティブ選択用であるか、および種々のDNAセグメントの正確
な配列に依存する。好ましい必要性は、選択スキームが１つ以上の所望の産物の
みの選択または富化を生じることである。本明細書において定義されるように、
DNA分子について選択することは、（a）所望のDNA分子の存在について選択また
は富化すること、および（b）所望のDNA分子でないDNA分子の存在に対して選択
または富化することを包含する。
１つの実施態様において、選択スキーム（これは、逆に実施され得る）は、３
つの形態のうちの１つをとり、これは図１に関して議論される。第１（選択マー
カーおよびそのリプレッサーについて本明細書において例証される）は、セグメ
ントＤを有し、そしてセグメントＣを欠く分子について選択する。第２は、セグ
メントＣを有する分子に対しておよびセグメントＤを有する分子について選択す
る。第２の形態の可能な実施態様は、その中にインビトロ反応産物が導入される
べき細胞に対して毒性の遺伝子を有するDNAセグメントを有する。毒性遺伝子は
、毒性遺伝子産物（毒性タンパク質またはRNA）として発現されるDNAであり得る
か、またはそれ自体もしくはそれだけで毒性であり得る。（後者の場合において
、毒性遺伝子はその古典的な定義の「遺伝性の特性（heritable trait）」を有
すると理解される。）
このような毒性遺伝子産物の例は当該分野において周知であり、そして、制限
エンドヌクレアーゼ（例えば、DpnI）および抑制機能の非存在下で宿主を傷害す
る遺伝子（例えば、kicB）を包含するがそれらに限定されない。あるいは、毒性
遺伝子はインビトロにおいて選択され得る（例えば、制限部位）。
第２の形態において、セグメントＤは選択マーカーを有する。毒性遺伝子は、
ベクタードナー、コインテグレート、および副産物分子を有する形質転換体を除
去するが、選択マーカーは、産物を含有する細胞について、およびインサートド
ナーのみを有する細胞に対して選択するために使用され得る。
第３の形態は、同一の分子上にシスでセグメントＡおよびセグメントＤの両方
を有する細胞については選択するが、異なる分子上にトランスに両方のセグメン
トを有する細胞については選択しない。これは、２つの不活性なフラグメント（
各々１つがセグメントＡおよびＤ上にある）に分割される選択マーカーにより具
体化され得る。
フラグメントは、セグメントが組換え事象により一緒にされるときに、それら
が機能性の選択マーカーを再構成するように、組換え部位に関して配列される。
例えば、組換え事象はプロモーターを構造遺伝子と連結し得る、構造遺伝子の２
つのフラグメントを連結し得る、または生存のために必要なヘテロダイマー遺伝
子産物をコードする遺伝子を連結し得る、またはレプリコンの部分を連結し得る
。
部位特異的リコンビナーゼ：これは、代表的には少なくとも以下の４つの活性
を有するリコンビナーゼの型である：（1）１つまたは２つの特異的DNA配列の認
識；（2）前記DNA配列（単数または複数）の切断；（3）鎖交換に関与するDNAト
ポイソメラーゼ活性；および（4）DNAの切断された鎖の再封鎖をするDNAリガー
ゼ活性。Sauer，B.，Current Oponions in Biotechnology 5:521-527(1994)を参
照のこと。保存的部位特異的組換えは、両方のパートナーについての高度の特異
性により、相同組換えおよび転位から区別される。鎖交換機構は、DNA合成の非
存在下における特異的DNA配列の切断および再結合を含む(Landy，A．(1989)Ann
．Rev．Biochem．58:913-949)。
サブクローニングベクター：これは、適切なレプリコンを含む環状または直鎖
状DNA分子を含むクローニングベクターである。本発明において、サブクローニ
ングベクター（図１におけるセグメントＤ）はまた、最終産物中に組み込まれて
、クローン化されたDNAインサート（図１におけるセグメントＡ）に対してまた
はそれともに作用することが所望される、機能性および／または調節エレメント
を含み得る。サブクローニングベクターはまた、選択マーカー（図１におけるセ
グメントＣに含まれる）を含み得る。
ベクター：これは、インサートに、有用な生物学的または生化学的性質を提供
するDNAである。例としては、インビトロまたは宿主細胞において複製し得るか
または複製され得る、あるいは所望のDNAセグメントを宿主細胞内の所望の位置
に運搬し得る、プラスミド、ファージ、および他のDNA配列が挙げられる。ベク
ターは、そこにおいてDNA配列が、ベクターの本質的な生物学的機能の損失なし
に決定可能な様式で切断され得、そしてその中にDNAフラグメントが、その複製
およびクローニングを生じさせるためにスプライスされ得る、１つ以上の制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を有し得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、
PCRのための）、転写および／または翻訳開始および／または調節部位、組換え
シグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、相同
組換えまたは制限酵素の使用を必要としない所望のDNAフラグメントの挿入方法
（例えば（これらに限定されない）、PCRフラグメントのUDGクローニング（米国
特許第5,334,575号、その全体が本明細書中に参考として援用される）、T:Aクロ
ーニングなど）はまた、本発明に従って使用されるべきクローニングベクター中
へDNAのフラグメントをクローン化するために適用され得る。クローニングベク
ターは、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用のため
に適切な選択マーカーをさらに含み得る。
ベクタードナー：これは、所望の産物の部分になるべきDNAベクターをコード
するDNAセグメントを有する、本発明の２つの親DNA分子の１つである。ベクター
ドナーは、組換え部位により隣接される、サブクローニングベクターＤ（または
、インサートドナーが既にクローニングベクターを含まない場合、これはクロー
ニングベクターと呼ばれ得る）およびセグメントＣを含む（図１を参照のこと）
。セグメントＣおよび／またはＤは、選択スキームについて上記したように、所
望の産物娘分子についての選択に貢献するエレメントを含み得る。組換えシグナ
ルは、同一であるかまたは異なり得、そして同一のまたは異なるリコンビナーゼ
により作用され得る。さらに、ベクタードナーは直鎖状または環状であり得る。
説明
本発明のインビトロまたはインビボ方法についての１つの一般的なスキームを
図１に示す。ここでインサートドナーおよびベクタードナーは、環状または直鎖
状DNAのいずれかであり得るが、環状として示す。ベクターＤは、もとのクロー
ニングベクターＡを交換する。エレメントＡおよびＤを含む娘ベクターについて
、および１つ以上のコインテグレート（単数または複数）を含む他の分子に対し
て
選択することが所望される。四角および丸は、組換え部位の異なる組である（例
えば、lox部位またはatt部位）。セグメントＡまたはＤは、Ｄがこの例において
使用される場合、少なくとも１つの選択マーカー、発現シグナル、複製起点、あ
るいは欠失、選択、発現、マッピングまたはDNA配列決定のための特殊化された
機能を含み得る。
エレメントＡまたはＤの部分であり得る所望のDNAセグメントの例は、PCR産物
、大きなDNAセグメント、ゲノムクローンまたはフラグメント、cDNAクローン、
機能性エレメントなど、および有用な核酸またはタンパク質をコードする遺伝子
または部分的遺伝子を包含するが、それらに限定されない。さらに、本発明の組
換えクローニングは、タンパク質発現および／または遺伝子治療のための、エク
スビボおよびインビボ遺伝子移入ビヒクルを作製するために使用され得る。
図１において、スキームは以下のようにベクターＤおよびＡを含む所望の産物
を提供する。インサートドナー（ＡおよびＢを含む）は、組換えタンパク質によ
り、ベクタードナー（ＣおよびＤを含む）と四角の組換え部位においてまず組換
えて、Ａ-Ｄ-Ｃ-Ｂの各々を有するコインテグレートを形成する。次に、丸の組
換え部位において組換えが生じて、産物DNA（ＡおよびＤ）ならびに副産物DNA（
ＣおよびＢ）を形成する。しかし、所望であれば、２つ以上の異なるコインテグ
レートが形成されて、２つ以上の産物を生成し得る。
本発明のインビトロまたはインビボ組換えクローニング方法の１つの実施態様
において、少なくとも１つの所望の産物DNAを選択するための方法が提供される
。これは、図２に示されるプラスミドpEZC726のマップの考慮により理解され得
る。２つの例示的な組換え部位は、attPおよびloxPである。これらの部位により
規定される１つのセグメント上に、そのプロモーターがトランスポゾンTn10由来
のtetOPオペレーター／プロモーターにより置換されているカナマイシン耐性遺
伝子が存在する。tetリプレッサータンパク質の非存在下において、E．coli RNA
ポリメラーゼは、tetOPからカナマイシン耐性遺伝子を転写する。tetリプレッサ
ーが存在する場合、それはtetOPに結合し、そしてカナマイシン耐性遺伝子の転
写をブロックする。pEZC726の他のセグメントは、構成性プロモーターにより発
現されるtetリプレッサー遺伝子を有する。従って、pEZC726により形質転換され
る細
胞は、tetRと同じセグメント上のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子のためにクロラムフェニコールに耐性であるが、カナマイシンに感受
性である。組換え反応は、tetR遺伝子の調節されたカナマイシン耐性遺伝子から
の分離を生じる。この分離は、所望の組換え産物のみを受ける細胞においてカナ
マイシン耐性を生じる。
２つの異なる組のプラスミドを、インビトロ方法を実証するために構築した。
Creリコンビナーゼのみのでの使用のための１つの組（クローニングベクター602
およびサブクローニングベクター629（図３））は、loxPおよびloxP 511部位を
含んだ。Creおよびインテグラーゼでの使用のための第２の組（クローニングベ
クター705およびサブクローニングベクター726（図２））は、loxPおよびatt部
位を含んだ。所望の娘プラスミドの産生の効率は、Cre単独を使用してよりも、
両方の酵素を使用して、約60倍高かった。Cre単独反応由来の24コロニー中19が
、所望の産物を含んだが、インテグラーゼ＋Cre反応由来の38コロニー中38が、
所望の産物プラスミドを有した。
他の選択スキーム それらがそのために組換えクローニングが実施される特定
の目的に適合し得るとして当該分野において公知である種々の選択スキームが、
使用され得る。個々の嗜好および要求に依存して、多数の異なる型の選択スキー
ムが本発明の組換えクローニング方法において使用され得る。当業者は、多数の
DNAセグメントまたはそれらを作製するための方法、および当該分野において慣
例的に使用される異なる選択方法の利用可能性を利用し得る。このようなDNAセ
グメントは、活性（RNA、ペプチド、もしくはタンパク質の産生を包含するが、
これらに限定されない）をコードするDNAセグメント、またはこのようなRNA、ペ
プチド、またはタンパク質のための結合部位を供給するDNAセグメントを包含す
るが、これらに限定されない。選択スキームの案出において使用されるDNA分子
の例は、「選択スキーム」の定義のもとに、上記に与えられる。
さらなる例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（i）PCRのための新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置されてい
なかった２つのDNA配列の並置）；
（ii）制限エンドヌクレアーゼまたは他のDNA修飾酵素、化学物質、リボザイ
ム
などにより作用されるDNA配列の含有；
（iii）DNA結合タンパク質、RNA、DNA、化学物質などにより認識されるDNA配
列の含有（例えば、集団についての選択または集団からの排除のためのアフィニ
ティータグとしての使用のための）(Davis，Nucl．Acids Res．24:702-706(1996
)；J．Virol．69：8027-8034(1995))；
（iv）ランダマイズされ、そしてcDNA由来のRNAライブラリーを用いることに
よる、エプスタインバールウイルスに発現されるRNAに会合するリボソームL22タ
ンパク質についてのRNAリガンドのインビトロ選択；
（vi）その活性が特異的方向および並置を必要とする機能性エレメント（例え
ば、（a）トランスでは弱く反応するが、シスに配置されると、適切なタンパク
質の存在下において、分子の特定の集団を破壊する組換え（例えば、インビトロ
RNA合成を可能にするプロモーター配列の再構成）を生じる組換え部位）の配置
。RNAは直接使用され得るか、または逆転写されて所望のDNA構築物を得ることが
出来る;
（vii）分子（単数または複数）のサイズ（例えば、分画）または他の物理的
性質による所望の産物の選択；および
（viii）その同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）のために必要
とされるDNA配列の含有。
本発明の方法における産物および副産物の形成後、特定の組換えクローニング
手順において任意に案出された特定の選択スキームに依存して、選択工程はイン
ビトロまたはインビボのいずれかにおいて実施され得る。
例えば、選択のインビトロ方法は、インサートドナーおよびベクタードナーDN
A分子について案出され得る。このようなスキームは、組換え事象の後に、希な
切断部位が副産物中に至るように、出発環状ベクターにおいて希な制限部位を操
作することを含む。従って、希な制限部位を結合し、そしてそれを切断する制限
酵素がインビトロにおいて反応混合物に添加されると、希な切断部位を有するDN
A分子（すなわち、出発DNA分子、コインテグレート、および副産物）の全ては、
切断され、そして意図される宿主細胞において複製不能にされる。例えば、セグ
メントＢおよびＣにおける切断部位（図１を参照のこと）は、産物以外のすべて
の分子に対して選択するために使用され得る。あるいは、セグメントＤについて
（例えば、Ｂ上に見出されない薬剤耐性遺伝子により）選択し得る場合、Ｃにお
ける切断部位のみが必要とされる。
同様に、直鎖状DNA分子を扱う場合、インビトロ選択方法が案出され得る。PCR
プライマーに相補的なDNA配列が、産物分子にのみ、組換えクローニング方法を
介して、移入されるように操作され得る。反応が完了した後、適切なプライマー
が反応溶液に添加され、そしてサンプルがPCRに供される。従って、産物分子の
全てまたは一部が増幅される。
他のインビボ選択スキームが、種々のE．coli細胞株を用いて使用され得る。
１つのスキームは、サブクローニングプラスミドの一方のセグメント上にリプレ
ッサー遺伝子を、そして同じプラスミドの他方のセグメント上にそのリプレッサ
ーにより制御される薬剤マーカーを置くことである。別のスキームは、サブクロ
ーニングプラスミドのセグメントＣ上にキラー（killer）遺伝子を置くことであ
る（図１）。もちろん、このようなプラスミドを増殖させるための方法が存在し
なくてはならない。すなわち、それにおいてキラー遺伝子が死滅させない状況が
存在しなければならない。E．coliの特定の株を必要とする公知の多数の遺伝子
が存在する。１つのこのようなスキームは、制限酵素DpnI（これは、その認識配
列GATCがメチル化されない限り切断しない）を使用することである。多数の普及
した一般的なE．coli株はGATC配列をメチル化するが、その中でクローン化され
たDpnIが害なしに発現され得る変異体が存在する。
もちろん、類似の選択スキームが他の宿主生物のために案出され得る。例えば
、Tn10のtetリプレッサー／オペレーターが真核生物において遺伝子発現を制御
するように適合させられた(Gossen，M.,およびBujard，H.，Proc．Natl．Acad．
Sci．USA 89:5547-5551(1992))。従って、本明細書において例証されるtetリプ
レッサーによる薬剤耐性の同じ制御が、真核生物細胞において産物を選択するた
めに適用され得る。
組換えタンパク質
本発明において、DNAセグメントの交換は、組換えタンパク質(リコンビナーゼ
ならびに会合する補因子およびタンパク質を含む)の使用によって達成される。
種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このようなリコン
ビナーゼの例には以下が含まれる：
Cre：バクテリオファージP1由来のタンパク質(AbremskiおよびHoess、J.Biol.
Chem．259(3):1509-1514(1984))は、loxP(交叉の遺伝子座)部位と呼ばれる34bp
DNA配列間の交換を触媒する（すなわち、組換えを引き起こす）(Hoessら、Nucl.
Acids Res．14(5):2287(1986)を参照のこと)。Creは市販されている(Novagen、
カタログNo.69247-1)。Creによって媒介される組換えは、自由に可逆的である。
熱力学的考察からは、Cre媒介性組み込み（１つの分子を形成する２つの分子間
の組換え）が、Cre媒介性切り出し（２つの娘分子を形成する同一分子中の２つ
のloxP部位間の組換え）より、はるかに効率的でないことは驚くべきことではな
い。Creは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウムまたは
スペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。DNA基質は、直鎖状また
は超らせん状のいずれかであり得る。多くの変異体loxP部位が記載されている(H
oessら、前掲)。これらの１つloxP 511は、別のloxP 511部位と組換えるが、lox
P部位とは組み換えない。
インテグラーゼ：λゲノムのE.coli染色体への組み込みを媒介する、バクテリ
オファージλ由来のタンパク質。バクテリオファージλInt組換えタンパク質は
、溶原状態の形成または誘導の一部として、その基質att部位間の不可逆的な組
換えを促進する。組換え反応の可逆性は、組み込み組換えおよび切り出し組換え
のための２つの独立した経路から生じる。各経路は特有であるが重複する、att
部位DNAを含む15のタンパク質結合部位のセットを使用する。４つのタンパク質(
Int、Xis、IHFおよびFIS)が関与する協同的および競合的相互作用が組換えの方
向を決定する。
組み込み組換えには、IntおよびIHFタンパク質、ならびに部位attP(240 bp)お
よびattB(25 bp)が関与する。組換えは、２つの新たな部位：attLおよびattRの
形成を生じる。切り出し組換えは、attPおよびattBを生成するために、Int、IHF
、およびXis、ならびに部位attLおよびattRを必要とする。特定の条件下で、FIS
は、切り出し組換えを刺激する。これらの正常な反応に加えて、attPおよびattB
は、
同一分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２つの切り出し産物(a
ttLを有するものおよびattRを有するもの)を生成し得ることを理解すべきである
。同様に、attLを含む分子とattRを含む分子との間での分子間組換えは、Int、I
HFおよびXisの存在下で、組み込み組換えならびにattPおよびattBの生成を生じ
得る。従って、DNAセグメントを、操作したatt部位の適切な組合せと隣接させる
ことによって、適切な組換えタンパク質の存在下で、切り出し組換えまたは組み
込み組換えを、互いの逆反応として導き得る。
att部位のそれぞれは、15bpのコア配列を含む。機能的重要性の個々の配列エ
レメントは、この共通コアの境界の範囲内に、外側に、およびその境界を横切っ
て存在する(Landy,A.，Ann.Rev.Biochem．58:913(1989))。種々のatt部位間の効
率的な組換えは、中心共通領域の配列が組換えパートナー間で同一であることを
必要とする。しかし、現在は、正確な配列は改変可能であることが見出されてい
る。その結果、コア内に変化を有する、att部位の誘導体が、少なくとも天然の
コア配列と同程度に効率的に組換えることが、現在は見出されている。
インテグラーゼはバクテリオファージλ上のattP部位(約240 bp)をE.coliゲノ
ム上のattB部位(約25 bp)と組換えて(Weisberg,R.A.およびLandy,A．Lambda II
、p.211 (1983)、Cold Spring Harbor Laboratory)、attL(約100 bp)およびattR
(約160 bp)部位によって隣接された、組み込まれたλゲノムを生成するように作
用する。Xisの非存在下（下記参照のこと）で、この反応は本質的に不可逆的で
ある。インテグラーゼおよびIHFによって媒介される組み込み反応は、インビト
ロで、スペルミジンを含む単純な緩衝液を用いて働く。インテグラーゼは、Nash
,H.A.、Methods of Enzymology 100:210-216(1983)によって記載されるように入
手され得る。IHFは、Filutowicz,M.ら、Gene 147:149-150(1994)によって記載さ
れるように入手され得る。
λタンパク質Xis（切り出し）の存在下で、インテグラーゼは、attRとattLと
の反応を触媒してattPおよびattBを形成する。すなわち、インテグラーゼは、上
記の反応の逆転を促進する。この反応もまた、本発明において適用され得る。
他の組換え系。種々の生物由来の多くの組換え系もまた、本明細書中に提供さ
れる教示およびガイダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Hoessら、Nuc
leic Acids Research 14(6):2287(1986)；Abremskiら、J.Biol.Chem．261(1):39
1(1986)；Campbell、J.Bacteriol．174(23):7495(1992)；Qianら、J.Biol.Chem
．267(11):7794(1992)；Arakiら、J.Mol.Biol．225(1):25(1992)を参照のこと。
これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する(Argosら
、EMBO J．5:433-440(1986))。おそらく、これらのうち、バクテリオファージλ
由来のインテグラーゼ/att系(Landy,A．(1993)Current Opinions in Genetics a
nd Devel．3:699-707)、バクテリオファージP1由来のCre/loxP系(HoessおよびAb
remski(1990)Nucleic Acids and Molecular Biology、第４巻、EcksteinおよびL
illey編、Berlin-Heidelberg:Springer-Verlag；90-109頁)、およびSaccharomyc
es cerevisiae２μ環状プラスミド由来のFLP/FRT系(Broachら、Cell29:227-234(
1982))が、最も良く研究されている。
部位特異的リコンビナーゼの第２のファミリーのメンバーであるリゾルベース
ファミリー(例えば、γδ、Tn3リゾルベース、Hin、Gin、およびCin)もまた公知
である。リコンビナーゼのこの高度に関連するファミリーのメンバーは、代表的
には、分子内反応(例えば、反転および切り出し)に制約され、そして宿主がコー
ドする因子を必要とし得る。宿主因子の要求性のいくつか(MaeserおよびKahnman
n(1991)Mol.Gen.Genet．230:170-176)および分子内組換えの制約のいくつかを軽
減する変異体が単離されている。
λIntに類似の他の部位特異的リコンビナーゼおよびP1 Creに類似の他の部位
特異的リコンビナーゼは、IntおよびCreを置換し得る。このようなリコンビナー
ゼは公知である。多くの場合、このような他のリコンビナーゼの精製は、当該分
野において記載されている。それらが公知でない場合、細胞抽出物が使用され得
るか、またはCreおよびIntについて記載された手順を使用して、酵素が部分的に
精製され得る。
CreおよびIntが例として詳細に記載されているが、多くの関連するリコンビナ
ーゼ系が存在し、そして記載された発明に対するそれらの適用もまた、本発明に
従って提供される。部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、
バクテリオファージλ、φ80、P22、P2、186、P4およびP1によりコードされる部
位特異的組換えタンパク質のような、本発明のための別の組換えタンパク質およ
び組換え部位を提供するために使用され得る。この群のタンパク質は、配列の予
想し得ないほど大きな多様性を示す。この多様性にも関わらす、すべてのリコン
ビナーゼは、そのＣ末端側の半分においてアラインされ得る。
Ｃ末端付近の40残基領域は、すべてのタンパク質において、特によく保存され
ており、そして酵母２μプラスミドFlpタンパク質のＣ末端付近の領域と相同で
ある。３つの位置がこのファミリー内で完全に保存されている：ヒスチジン、ア
ルギニンおよびチロシンが、よく保存されたＣ末端領域内のそれぞれのアライン
メント位置396、399および433に見出される。これらの残基は、このファミリー
のリコンビナーゼの活性部位に寄与し、そしてチロシン-433が鎖切断および再結
合の間にDNAと一時的に共有結合を形成することを示唆する。例えば、Argos,P.
ら、EMBO J．5:433-40(1986)を参照のこと。
あるいは、IS231および他のBacillus thuringiensisの転移因子が、組換えタ
ンパク質および組換え部位として使用され得る。Bacillus thuringiensisは、そ
の毒性が、農業的な有害生物ならびにヒトおよび動物の疾患のベクターに対して
活性である、胞子嚢中のデルタエンドトキシン結晶の存在に起因する、昆虫病原
性(entomopathogenic)細菌である。これらの毒素タンパク質をコードする遺伝子
のほとんどは、プラスミドに保有され、そして一般に、挿入配列(IS231、IS232
、IS240、ISBT1およびISBT2)ならびにトランスポゾン(Tn4430およびTn5401)と構
造的に関連している。これらの可動要素のいくつかは活性であり、そして結晶遺
伝子の可動性に関与し、そのことによって細菌毒性の変動に寄与することが示さ
れている。
イソIS231エレメントの構造分析により、それらがClostridium perfringens由
来のIS1151に関連し、そしてEscherichia coli由来のIS4およびIS186に遠縁に関
連する。他のIS4ファミリーのメンバーと同様に、それらは、他のISファミリー
およびレトロウイルスに見出される、保存されたトランスポゼース−インテグラ
ーゼモチーフを含む。
さらに、Escherichia coliのIS231Aから収集した機能的データは、特異的な標
的に対して優先性を有する、非複製様式の転位を示す。同様な結果はまた、Baci
llus subtilisおよびB.thuringiensisにおいても得られた。例えば、Mahillon,J
.
ら、Genetica 93:13-26(1994)；Campbell、J.Bacteriol．7495-7499(1992)を参
照のこと。
組換え反応を駆動するために添加されるリコンビナーゼの量は、公知のアッセ
イを用いることによって決定され得る。詳細には、力価アッセイを使用して、精
製されたリコンビナーゼ酵素の適切な量または抽出物の適切な量を決定する。
操作された組換え部位。上記リコンビナーゼおよび対応するリコンビナーゼ部
位は、本発明に従う組換えクローニングにおける使用に適切である。しかし、野
生型組換え部位は、本発明の方法において適用されるような、組換え反応の効率
または特異性を低下させる配列を含む。例えば、attB、attR、attP、attLおよび
loxP組換え部位における複数の終止コドンが、両方の鎖上の複数のリーディング
フレーム中に生じる。従って、組換えの効率は、例えば、コード配列が組換え部
位を横切らなければならない(１つのリーディングフレームのみがloxPおよびatt
B部位の各鎖上で利用可能である)場合、低下するか、または(attP、attRもしく
はattLにおいて)不可能である。
従って、本発明はまた、これらの問題を克服する操作された組換え部位を提供
する。例えば、att部位は、組換え反応の特異性または効率および産物DNAの性質
を増強するために(例えば、att1、att2、およびatt3部位)、逆反応を減少させる
ために(例えば、attBからのP1およびH1の除去)、１または複数の変異を有するよ
うに操作され得る。これらの変異体の試験は、どの変異体が、本発明に従う組換
えサブクローニングに適切であるに十分な組換え活性を生じるかを決定する。
従って、変異は、部位特異的組換えを増強するために組換え部位に導入され得
る。このような変異には、翻訳終止コドンを有さない組換え部位（これは、融合
タンパク質がコードされることを可能にする）；同一のタンパク質によって認識
されるが塩基配列が異なる組換え部位(その結果、これらは、それらの相同なパ
ートナーと大きくまたは排他的に反応して、複数の意図されるべき反応を可能に
する)が含まれれが、これらに限定されない。どの特定の反応が生じるかは、ど
の特定のパートナーが反応混合物中に存在するかによって特定され得る。例えば
、三部分タンパク質融合体は、組換え部位attR1およびattR2；attL1およびattL3
；ならびに/またはattR3およびattL2を含む親プラスミドを用いて達成され得る
。
特定の変異を核酸配列に導入するための周知の手順が存在する。これらの多く
はAusubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscie
nce，New York(1989-1996))に記載されている。変異は、オリゴヌクレオチド中
に設計され得、これは、既存のクローニングされた配列を改変するために、また
は増幅反応において使用され得る。所望の変異体DNAまたはRNAを単離するために
適切な選択方法が利用可能である場合、ランダム変異誘発もまた用いられ得る。
所望の変異の存在は、核酸を周知の方法によって配列決定することにより確認さ
れ得る。
以下の限定されない方法が、所定の組換え部位のコア領域を操作して、本発明
における使用に適切な変異した部位を提供するために、使用され得る：
１．部位特異的(例えば、attBを得るためのattLおよびattR)組換え機構ま
たは他の（例えば、相同）組換え機構による２つの親DNA配列の組換えによる。D
NA親DNAセグメントは、最終的なコア配列を生じる１またはそれ以上の塩基変化
を含む；
２．所望のコア配列の直接的な変異または変異誘発(部位特異的、PCR、ラ
ンダム、自発的など)による；
３．組み換えられて所望のコア配列を生じる親DNA配列の変異誘発(部位特
異的、PCR、ランダム、自発的など)による；および
４．所望のコア配列をコードするRNAの逆転写による。
変異体組換え部位の機能性は、所望の特定の特性に依存する方法で示され得る
。例えば、組換え部位における翻訳終止コドンの欠如は、適切な融合タンパク質
を発現させることによって示され得る。相同なパートナー間の組換えの特異性は
、適切な分子をインビトロ反応に導入し、そして組換え産物について、本明細書
中に記載したように、または当該分野において公知のように、アッセイすること
によって、示され得る。組換え部位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳
または転写開始シグナル、タンパク質結合部位、および核酸塩基配列の他の公知
の機能が存在することまたは存在しないことを包含し得る。組換え部位における
特定の機能的特性に関する遺伝子選択スキームは、公知の方法の工程に従って使
用され得る。例えば、(相互作用しない一対の部位から)相互作用するパートナー
を
提供するための部位の改変は、毒性物質をコードするDNA配列のこれら部位間の
組換えを介しての欠失を要求することよって達成され得る。同様に、翻訳終止配
列を除去する部位についての選択、タンパク質結合部位の存在または非存在など
は、当業者によって容易に案出され得る。
従って、本発明は、選択マーカーおよび/または所望のDNAセグメントに隣接す
る少なくとも２つの操作された組換え部位を有する少なくとも１つのDNAセグメ
ントを含む核酸分子を提供する。ここで、上記組換え部位のうち少なくとも１つ
は、コインテグレートDNAまたは産物DNAの形成においてインビトロで組換えを増
強する、少なくとも１つの操作された変異を有するコア領域を含む。
核酸分子は、上記組換えの少なくとも１つの増強を付与する、少なくとも１つ
の変異を有し得る。この増強は、(i)切り出し組み込みを優先すること；(ii)切
り出し組換えを優先すること；(ii)宿主因子の要求性を軽減すること；(iii)上
記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の効率を増加させること；および(iv)
上記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の特異性を増加させることから実質
的になる群より選択される。
核酸分子は、好ましくは、attB、attP、attLまたはattRに由来する少なくとも
１つの組換え部位を含む。より好ましくは、att部位は、本明細書に記載のよう
に、att1、att2、またはatt3から選択される。
好ましい実施態様において、コア領域は、以下からなる群より選択されるDNA
配列：
あるいは対応するまたは相補的なDNAもしくはRNA配列を含む。ここで、米国特許
法施行規則§1.822(本明細書中に参考としてその全体を援用する)に示されてい
るように、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ/Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ/Ｕ；Ｗ＝Ａま
たはＴ/Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ/Ｕ；Ｓ＝ＣまたはＧ；そしてＢ＝
ＣまたはＧまたはＴ/Ｕであり、コア領域は、１またはそれ以上のリーディング
フレームにおいて終止コドンを含まない。
コア領域はまた、好ましくは、以下からなる群より選択されるDNA配列：
あるいは対応するまたは相補的なDNAもしくはRNA配列を含む。
従って、本発明はまた、核酸分子を作製するための方法を提供する。この方法
は、配列番号１〜16のうちの少なくとも１つに対して少なくとも80〜99％の相同
性(あるいはその中の任意の範囲または値)を有する少なくとも１つのDNA配列を
含む少なくとも１つの操作された組換え部位、または任意の適切な組換え部位を
有する核酸分子、あるいは、当該分野において公知のように、ストリンジェント
な条件下で、その核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する工程を包含
する。
明らかなことではあるが、このような周知のインビトロおよびインビボ選択方
法の種々のタイプおよび変更が存在する。これらの各々については、簡略にする
ために、本明細書に記載されない。しかし、このような変形および変更は、本発
明の異なる実施態様であると意図されており、そしてそのようにみなされる。
インビトロ組換え反応である好ましい実施態様の結果として、非生物学的分子
(例えば、PCR産物)が、本発明の組換えクローニング方法により操作され得るこ
とに注目することが重要である。１つの例において、直鎖状分子を環状ベクター
にクローニングすることが可能である。
本発明には多くの適用がある。これらの使用には、ベクターを変化させること
、プロモーターを遺伝子の隣に並べること(apposing)、融合タンパク質に対する
遺伝子を構築すること、コピー数を変化させること、レプリコンを変化させるこ
と、ファージにクローニングすること、ならびに例えば、PCR産物(一方の端にat
tB部位、そして他方の端にloxP部位を有する)、ゲノムDNAおよびcDNAをクローニ
ングすることが含まれるが、これらに限定されない。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施態様をさらに例示することを意
図され、限定することを全く意図されない。
実施例
本発明の組換えクローニング法は、クローニングベクターの変化のような、あ
るものを使用者にとって有用にさせるための核酸セグメントの交換を達成する。
これらのセグメントは、お互いに関して適切な方向にある組換えシグナルによっ
て両側で隣接されなければならない。以下の実施例において、２つの親の核酸分
子（例えば、プラスミド）を、インサートドナーおよびベクタードナーと呼ぶ。
インサートドナーは、ベクタードナーによって寄与された新しいベクターに結合
されるようになるセグメントを含む。両方の開始分子を含む組換え中間体（単数
または複数）は、コインテグレート（単数または複数）と呼ばれる。第２の組換
え事象は、２つの娘分子を産生し、これらは産物（所望の新しいクローン）およ
び副産物と呼ばれる。
緩衝液
本発明の反応において、種々の公知の緩衝液を使用し得る。制限酵素について
は、製造者によって推奨される緩衝液の使用が望ましい。代替緩衝液が、文献か
ら容易に見出され得るか、または当業者によって案出され得る。
実施例１〜３。λインテグラーゼのための１つの例示的な緩衝液には、50 mMT
ris-HCl（pH 7.5〜7.8）、70 mM KCl、５mMスペルミジン、0.5 mM EDTA、および
0.25 mg/ml ウシ血清アルブミン、ならびに必要に応じて10％グリセロールが含
まれる。
P1 Creリコンビナーゼのための１つの好ましい緩衝液には、50 mM Tris-HCl(p
H 7.5)、33 mM NaCl、５mM スペルミジン、および0.5 mg/ml ウシ血清アルブミ
ンが含まれる。
λ IntおよびP1 Creに類似する他の部位特異的リコンビナーゼのための緩衝液
は、当該分野で公知であるか、または特に上記の緩衝液に照らして、当業者によ
って経験的に決定され得るかのいずれかである。
実施例１：CreならびにCreおよびIntを用いる組換えクローニング
２対のプラスミドを、２つの異なる方法においてインビトロ組換えクローニン
グ法を行うために構築した。一方の対であるpEZC705およびpEZC726（図2A）を、
Creおよびλインテグラーゼとともに用いられる、loxPおよびatt部位を有して構
築した。他方の対であるpEZC602およびpEZC629（図3A）は、CreのためのloxP（
野生型）部位および１塩基（全34中）においてloxPと異なる第２の変異体lox部
位（loxP 511）を含んだ。本発明の組換えクローニングに対する最小の要求は、
各プラスミドにおける２つの組換え部位（一般に、XおよびY、ならびにX'および
Y'）である。いずれかまたは両方の型の部位が組換えて、コインテグレート（例
えば、XおよびX'）を形成し得る場合、およびいずれかまたは両方の（しかし、
コインテグレートを形成する型と異なる部位である必要がある）が、組換えて、
コインテグレート（例えば、YおよびY'）から産物または副産物プラスミドを切
り出し得る場合、組換えクローニングが起こる。同一のプラスミド上の組換え部
位は、組換えないことが重要である。本発明の組換えクローニングは、Creのみ
を用いて行われ得ることが見出された。
Creのみ
２つのプラスミドを、この概念を示すために構築した（図3Aを参照のこと）。
pEZC629が、ベクタードナープラスミドであった。これは、構成性薬剤マーカー
（クロラムフェニコール耐性）、複製起点、loxPおよびloxP 511部位、条件的薬
剤マーカー（トランスポゾンTn10のテトラサイクリン耐性オペロンのオペレータ
ー／プロモーターによってその発現が制御されるカナマイシン耐性）、およびte
tリプレッサータンパク質に対する構成性に発現される遺伝子tetRを含んでいた
。pEZC629を含むE.coli細胞は、30μg/mlのクロラムフェニコールに対して耐性
であるが、100μg/mlのカナマイシンに対して感受性であった。pEZC602が、イン
サートドナープラスミドであり、これは、異なる薬剤マーカー（アンピシリン耐
性）、複製起点、ならびにマルチクローニング部位に隣接しているloxPおよびlo
xP511部位を含んだ。
本実験は、以下の２つのパートからなった：
パートＩ：各々約75μgのpEZC602およびpEZC629を全容積30μlのCre緩衝液（5
0mM Tris-HCl（pH7.5）、33mM NaCl、５mM スペルミジン-HCl、500μg/ml ウシ
血清アルブミン）中で混合した。２つの10μlアリコートを、新しいチューブに
移した。１つのチューブに、0.5μlのCreタンパク質(約４単位/μl；Abremskiお
よびHoess、J．Biol．Chem．259: 1509(1984)に従って、部分精製した)を入れた
。両方のチューブを、37℃で30分間インキュベートし、次いで、70℃で10分間イ
ンキュベートした。各反応物のアリコートを希釈し、そしてDH5αに形質転換し
た。発現後、アリコートを、30μg/ml クロラムフェニコール；100μg/mlアンピ
シリン＋200μg/mlメチシリン；または100μg/ml カナマイシン上にプレートし
た。結果：表１を参照のこと。Creを含まない反応物は、1.11×106個のアンピシ
リン耐性コロニー（インサートドナープラスミドpEZC602由来）；7.8×10
5
個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベクタードナープラスミド由来）；
および140個のカナマイシン耐性コロニー（バックグラウンド）を生じた。Creを
添加した反応物は、7.5×105個のアンピリン耐性コロニー（インサートドナープ
ラスミドpEZC602由来）；6.1×105個のクロラムフェニコール耐性コロニー（ベ
クタードナープラスミドpEZC629由来）；および760個のカナマイシン耐性コロニ
ー（バックグラウンドコロニーおよび組換えクローニング産物プラスミド由来の
コロニーの混合物）を生じた。分析：Creの存在において、カナマイシンプレー
ト上のコロニーの数がずっと多かったので、それらの多数またはほとんどが所望
の産物プラスミドを含むと予想された。
パートII：「＋Cre」カナマイシンプレート由来の24コロニーをひろい、そし
て100μg/mlカナマイシンを含む培地中に接種した。ミニプレップを行い、そし
てミニプレップDNA（非切断あるいはSmaIまたはHindIIIで切断を電気泳動した。
結果：24個のミニプレップ中19個は、産物プラスミドについて予想されるサイズ
の超らせん状のプラスミドを示した。19個の全ては、予想されるSmaIおよびHind
III制限フラグメントを示した。分析：Creのみのスキームを示した。詳細には、
約70％（24個中19個）の産物コロニーを生じることが示された。効率は、約0.1
％（6.1×105個のクロラムフェニコール耐性コロニーから760個のカナマイシン
耐性クローンが得られた）であった。
Cre＋インテグラーゼ
本方法を示すために使用されるプラスミドは、ベクタードナープラスミドであ
るpEZC726がloxP 511の代わりにattP部位を含んだこと、およびインサートドナ
ープラスミドであるpEZC705がloxP 511の代わりにattB部位を含んだことを除き
上記で使用されたプラスミドに正確に類似する（図2A）。
この実験は、以下の３つのパートからなった：
パートI：約500ngのpEZC705（インサートドナープラスミド）を、アンピシリ
ン耐性遺伝子内でプラスミドを直鎖化するScaIを用いて切断した。（λインテグ
ラーゼ反応は、歴史的に直鎖状態のattBプラスミドを用いて行われている（H.Na
sh,私信）ので、これを行った）。しかし、インテグラーゼ反応は、超らせん状
の両方のプラスミドを用いて良好に進行することが後に見出された。次いで、直
鎖状プラスミドをエタノール沈殿し、そして20μlのλインテグラーゼ緩衝液（5
0mM Tris-HCl（約pH7.8）、70mM KCl、５mMスペルミジン-HCl、0.5mM EDTA、250
μg/mlウシ血清アルブミン）中で溶解した。また、約500ngのベクタードナープ
ラスミドpEZC726をエタノール沈殿し、そして20μlのλインテグラーゼ緩衝液中
で溶解した。使用の直前に、λインテグラーゼ（２μl、393μg/ml）を融解し、
そして18μlの冷λインテグラーゼ緩衝液を添加することにより希釈した。１μl
のIHF（組み込み宿主因子、2.4mg/ml、アクセサリータンパク質）を、150μlの
冷λインテグラーゼ緩衝液中で希釈した。アリコート（2μl）の各DNAを、全量1
0μlで、λインテグラーゼ緩衝液（各々１μlのλインテグラーゼおよびIHFを含
むまたは含まない）と混合した。混合物を、25℃で45分間インキュベートし、次
いで、70℃で10分間インキュベートした。各反応物の半分をアガロースゲルに供
した。結果：インテグラーゼおよびIHFの存在下で、全DNAの約５％が、直鎖状の
コインテグレート形態に転換された。分析：インテグラーゼおよびIHFの活性を
確認した。
パートII：３μlの各反応物（すなわち、インテグラーゼおよびIHFを含むまた
は含まない）を、27μlのCre緩衝液（上記）中で希釈し、次いで、各反応物を２
つの10μlアリコートに分割した（全部で４つ）。これらの反応物の２つに、0.5
μlのCreタンパク質（上記）を添加し、そして全ての反応物を37℃で30分間イン
キュベートし、次いで70℃で10分間インキュベートした。各反応物に、TE緩衝液
（90μl；TE:10mM Tris-HCl（pH 7.5）、１mM EDTA）を添加し、そして各１μl
を、E．coli DH5αに形質転換した。形質転換混合物を、100μg/ml アンピシ
リン＋200μg/ml メチシリン；30μg/ml クロラムフェニコール；または100μg/
ml カナマイシン上にプレートした。結果：表２を参照のこと。
分析：Creタンパク質は、形質転換を減少させた。この効果について調節した
場合、カナマイシン耐性コロニー数は、Creおよびインテグラーゼの両方を用い
た場合、コントロール反応物と比較して、100倍より多く増加した。これは、99
％より高い特異性を示唆した。
パートIII：38個のコロニーを、インテグラーゼ＋Creプレートからひろい、ミ
ニプレップDNAを作製し、そしてHindIIIで切断して診断マッピング情報を得た。
結果：38個全てが正確に予想されたフラグメントザイズを有した。分析：Cre+λ
インテグラーゼ法は、Creのみよりずっと高い特異性を有することが観察された
。結論：Cre+λインテグラーゼ法を示した。効率および特異性は、Creのみより
もずっと高かった。
実施例２：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の真核生物
細胞における発現のためのベクターへのサブクローン化のためのインビトロ組換
えクローニングの使用（図4A）
loxP部位とattB部位の間でクローン化され、その結果loxP部位が遺伝子の５’
末端に位置する、E．coliのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子を含む、インサートドナープラスミドであるpEZC843を構築した（図4B）
。loxP部位に隣接するサイトメガロウイルス真核生物プロモーターを含む、ベク
タードナープラスミドであるpEZC1003を構築した（図4C）。１μlアリコートの
各超らせん状のプラスミド（約50ngの粗製ミニプレップDNA）を、等量のλイン
テグラーゼ緩衝液（50mM Tris-HCl（pH7.8）、70mM KCl、５mM スペルミジン、0
.5mM EDTA、0.25mg/ml ウシ血清アルブミン）およびCreリコンビナーゼ緩衝液（
50mM Tris-HCl（pH7.5）、33mM NaCl、５mM スペルミジン、0.5mg/ml ウシ血清
アルブミン）、２単位のCreリコンビナーゼ、16ngの組み込み宿主因子、および3
2nｇλインテグラーゼを含む10μlの反応物中で合わせた。30℃で30分間インキ
ュベートした後、75℃で10分間インキュベートし、１μlをコンピテントE．coli
DH5α株（Life Technologies,Inc.）に形質転換した。形質転換体のアリコート
を、200μg/ml カナマイシンを含む寒天プレート上に広げ、そして37℃で一晩イ
ンキュベートした。それ以外の同一のコントロール反応は、ベクタードナープラ
スミドのみを含んだ。コントロール反応形質転換の10％を受けたプレートから、
１つのコロニーを得た；組換えクローニング反応の10％を受けたプレートからは
144のコロニーを得た。これらの数は、99％より多い組換えクローニングコロニ
ーが、所望の産物プラスミドを含んだことを示唆した。６個の組換えクローニン
グコロニーから作製したミニプレップDNAから、予想されたサイズのプラスミド
（5026塩基対）であるCMVProdを得た。NcoIを用いた制限消化から、６個全ての
プラスミドについてCMVプロモーターの下流にクローン化したクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼと予想されるフラグメントを得た。
実施例３：終止コドンを有さないattB部位によって隣接されるサブクローン化さ
れたDNAセグメント
パートＩ：背景
上記の実施例は、転写が組換え部位を横切る転写融合に適する。しかし、attR
部位およびloxP部位の両方は、両方の鎖に複数の終止コドンを含み、従って、コ
ード配列が組換え部位を横断しなければならない（１つのリーディングフレーム
のみがloxP部位の各鎖上で利用可能である）場合、転写融合は困難であり得るか
、または不可能であり得る（attRまたはattLにおいて）。
サブクローニングのための主要な理由は、タンパク質ドメインを融合すること
である。例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）ドメインの目的の
タンパク質への融合は、融合タンパク質がグルタチオンアガロース（Pharmacia,
Inc.、1995カタログ）のアフィニティークロマトグラフィーによって精製される
ことを可能にする。目的のタンパク質が連続的なヒスチジンの連続（例えば、Hi
s6）に融合される場合、融合タンパク質は、金属イオンを含むキレート樹脂（Qi
agen,Inc.）のアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。活性
、溶解性、安定性などについてアミノ末端融合体とカルボキシ末端融合体とを比
較することがしばしば望まれる。
バクテリオファージλ組み込み系のattB部位を、loxPに対する代替物として試
験した。なぜなら、それらは小さく（25 bp）、そしていくらかの配列可撓性を
有するからである（Nash,H.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4049-4053(1987)
）。全ての終止コードを取り除く複数の変異により、組換えサブクローニングの
ための有用な組換え部位を得るであろうことは以前には示唆されていなかった。
λバクテリオファージにおける部位特異的組換えのための標準的な表記（Weis
ber，Lambda III,Hendrixら編、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring H
arbor NY(1989)）を用いて、E．coli宿主細胞における組換え反応に関与する核
酸領域を以下に示す：
ここで：0は、ファージおよびE．coliゲノムの両方に見出される15 bpコアDNA配
列を示す；BおよびB'は、E．coliゲノム中のコアに隣接する約５塩基を示す；お
よびP1、H1、P2、X、H2、C、C'、H'、P'1、P'2、およびP'3は、バクテリオファ
ージλゲノム中のタンパク質結合ドメインをコードする公知のDNA配列を示す。
反応は、タンパク質Xis（エキシジョナーゼ）の存在下で可逆的であり；attL
とattRとの間の組換えは、その組み込まれた状態からλゲノムを正確に切り出し
、attP、およびattBを含む直鎖状E．coliゲノムを含む環状λゲノムを再生する
。
パートII：変異体att部位を含むプラスミドの構築および試験
変異体attL部位および変異体attR部位を構築した。重要なことに、Landyら（A
nn．Rev．Biochem．58:913(1989)）は、attPのP1およびH1ドメインの欠失が、切
り出し反応を促進し、そして組み込み反応を除去し、その結果切り出し反応を不
可逆的にさせることを観察した。従って、変異がattRに導入されて、P1およびH1
ドメインもまた欠失されたので、本実施例におけるattR部位は、P1領域およびH1
領域を欠き、そして取り除かれたNdeI部位を有し（塩基27630をCからGに改変し
た）、そしてバクテリオファージ座標27619〜27738（GenBank release 92.O,bp:
LAMCG、「バクテリオファージλの完全な配列」）に対応する配列を含む。
野生型attLおよびattR部位の組換えによって産生されるattBの配列は以下のと
おりである：
終止コドンを斜体にし、そして下線を引いた。attL、attR、およびattPの配列は
attB配列に由来し得、そしてバクテリオファージλの境界は、attLおよびattR内
（座標27619〜27818）に含まれたことに留意のこと。
変異体attR1部位およびattL1部位を組み換えた場合、配列attB1が産生された
（変異を太字の、大きな文字で表す）：
４つの終止コドンが消失していることに留意のこと。
attR1列およびattL1配列（太字）にさらなる変異を導入した場合、attR2部位
およびattL2部位を得た。attR2およびattL2の組換えは、attB2部位を産生した：
上記のattL部位およびattR部位の組換え活性を以下のようにアッセイした。プ
ラスミドpEZC705のattB部位（図2B）を、attLwt、attL1、またはattL2と置換し
た。プラスミドpEZC726のattP部位（図2C）を、attRwt（P1およびH1領域を欠く
）、attR1、またはattR2と置換した。従って、得られたプラスミドは、Creによ
って媒介されて、それらのloxP部位を介して組換え得、そしてInt、Xis、およ
びIHFによって媒介されて、それらのattR部位およびattL部位を介して組換え得
る。プラスミドの対を、Cre、Int、Xis、およびIHFと混合しそして反応させ、E.
coliコンピテント細胞に形質転換し、そしてカナマイシンを含有する寒天上に
プレートした。結果を表３に示す：
上記のデータは、野生型att部位およびatt1部位は低い程度に組換えたが、att
1部位およびatt2部位は互いに検出可能には組換えないことをを示す。
パートIII：目的のDNAセグメントに隣接する両方のattB部位のコア領域が終止
コドンを含まない場合の、組換えが示された。関与するプラスミドの物理的な状
態が、組換え効率に影響することが見出された。
適切なatt部位を、pEZC705およびpEZC726中に移動し、プラスミドpEZC1405（
図5G）（attR1およびattR2）ならびにpEZC1502（図5H）（attL1およびattL2）を
作製した。本実験における所望のDNAセグメントは、pEZC1502の２つのattL部
位の間にクローン化されたクロラムフェニコール耐性遺伝子のコピーであった。
プラスミドの対を、Int、Xis、およびIHF（loxP部位が存在しなかったのでCreは
なし）を用いてインビトロで組換えた。表４に示すように、親プラスミドの両方
が環状である場合、または一方のプラスミドが環状でありかつ他方が直鎖状の場
合に、所望のカナマイシン耐性コロニーの収率を決定した：
1DNAを、Qiagenカラムを用いて精製し、濃度をA260で測定し、そしてXbaI（pEZC
1405）またはAlwNI（pEZC1502）を用いて直鎖化した。各反応物は、100ngの示さ
れたDNAを含んだ。全ての反応物（全量で10μl）は、３μlの酵素混合物（Xis、
Int、およびIHF）を含んだ。インキュベーション（25℃で45分間、65℃で10分間
）後、１μlを用いてE．coli DH5α細胞を形質転換した。2
全形質転換反応物（1ml）をプレートした場合、予想されるコロニー数。100μl
または１μlのいずれかの形質転換体を実際にプレートした。
分析：変異体attR部位および変異体attL部位を用いる組換えクローニングを確認
した。所望のDNAセグメントは、いずれの鎖においても終止コドンを全く含まな
いattB部位の間にサブクローン化される。両方の関与する分子が超らせん状であ
り、そしてタンパク質が制限されている場合、切り出し反応がより効率的であっ
た初期の観察のために、（一方の親が直鎖状の場合の）産物DNAの増大した収率
は、予想外であった（Nunes-Dubyら、Cell 50:779-788(1987)）。
実施例４：逆方向反復を有さない組換えクローニングの実証
パートＩ：原理
上記実施例３は、適切な組換え部位の逆方向反復を含むプラスミド（例えば、
プラスミドpEZC1502中のattL1およびattL2）（図5H）が、組換えて、これも逆方
向で終止コドンを有さないattB部位によって隣接される所望のDNAセグメントが
得られ得ることを示した。逆方向反復のインビボおよびインビトロでの影響が危
惧された。例えば、逆方向でattB部位によって隣接される所望のDNAセグメント
の転写は、ヘアピン構造を形成し得る一本鎖RNA分子を生じ、その結果、翻訳を
阻害し得る。
類似の組換え部位の逆方向を、部位を直列反復配置のatt部位に配置すること
により回避し得る。親プラスミドの各々が野生型attL部位および野生型attR部位
を直列反復で有する場合、Int、Xis、およびIHFタンパク質は、分子内反応にお
いてそれらの部位によって隣接されるDNAセグメントを単に取り除く。しかし、
上記の実施例３に記載の変異体部位は、分子内組換えを所望のように進行させな
がら、分子内反応を阻害することが可能であり得ることを示唆した。
パートII：組換えクローニングのための逆方向反復を有さないプラスミドの構造
プラスミドpEZC1405（図5G）中のattR2配列を、反対方向でのattL2と置換し、
pEZC1603（図6A）を作製した。pEZC1502（図5H）のattL2配列を、反対方向でのa
ttR2と置換し、pEZC1706（図6B）を作製した。これらのプラスミドの各々は、at
t1コアとatt2コアの間の分子内反応を非常に非効率的にするコア領域中の変異を
含んだ（実施例３、上記を参照のこと）。
プラスミドpEZC1405、pEZC1502、pEZC1603およびpEZC1706を、Qiagenカラム（
Qiagen,Inc.）で精製した。プラスミドpEZC1405およびpEZC1603のアリコートを
、XbaIを用いて直鎖化した。プラスミドpEZC1502およびpEZC1706のアリコートを
、AlwNIを用いて直鎖化した。100ngのプラスミドを、Int（43.5ng）、Xis（4.3n
g）、およびIHF（8.1ng）を含む最終容量10μlの緩衝液(等容量の50mM Tris HCl
（pH7.5）、25mMTris HCl（pH8.0）、70mM KCl、５mMスペルミジン、0.5mM EDTA
、250μg/ml BSA、10％グリセロール)中で混合した。反応物を25℃で45分間、
65℃で10分間インキュベートし、そして１μlをE．coli DH5αに形質転換した。
発現後、アリコートを、200μg/mlのカナマイシンを含有する寒天プレート上に
広げ、そして37℃でインキュベートした。
コロニー数/１μlの組換え反応物として表現した結果を表５に示す：
分析：全ての配置において（すなわち、環状または直鎖状）、pEZC1405×pEZC
1502対（逆方向反復配置でのatt部位を有する）は、pEZC1603×pEZC1706対（ヘ
アピン形成を回避するために変異されたatt部位を有する）よりもより効率的で
あった。pEZC1603×pEZC1706対は、pEZC1405×pEZC1502対より高いバックグラウ
ンドおよびより低い効率を与えた。より低い効果であるが、pEZC1603×pEZC1706
反応由来の80％以上のコロニーが、所望のプラスミド産物を含むと予想された。
１つのパートナーを直鎖状にすることが、全ての場合において反応を刺激した。
パートIII：産物プラスミドの構造の確認
直鎖状pEZC1405（図5G）×環状pEZC1502（図5H）、環状pEZC1405×直鎖状pEZC
1502、直鎖状pEZC1603（図6A）×環状pEZC1706（図6B）、および環状pEZC1603×
直鎖状pEZC1706反応由来の各々６個のコロニーを、富化培地にひろい、そしてミ
ニプレップDNAを調製した。Ssp Iを用いる診断的切断により、24個のコロニーに
ついて予想される制限フラグメントを得た。
分析：同一の分子上の変異体attL部位および変異体attR部位を有するプラスミ
ド間の組換え反応により、高い程度の特異性を有して、所望のプラスミド産物を
得た。
実施例５：毒性遺伝子を用いる組換えクローニング
パートＩ：背景
制限酵素Dpn Iは、配列GATCを認識し、そしてAがdamメチラーゼによってメチ
ル化された場合のみ、この配列を切断する。大部分の一般的に使用されるE．col
i株は、dam+である。細胞の染色体が多数の断片に切断されるので、E．coliのda
m+株におけるDpn Iの発現は致死性である。しかし、dam-細胞において、Dpn Iの
発現は無害である。なぜなら染色体は、Dpn I切断に対して免疫性であるからで
ある。
ベクタードナーが、組換え部位によって分離される２つのセグメントCおよびD
を含む一般的な組換えクローニングスキームにおいて、所望の産物の選択は、セ
グメントDの存在およびセグメントCの非存在についての選択に依存する。元の実
施例において、セグメントDは、セグメントC上に見出されるリプレッサー遺伝子
によってネガティブに制御される薬剤耐性遺伝子（Km）を含んだ。Cが存在する
場合、Dを含む細胞は、耐性遺伝子がオフになっていたのでカナマイシンに対し
て耐性ではなかった。
Dpn I遺伝子は、上記実施態様のリプレッサー遺伝子を置換し得る毒性遺伝子
の例である。セグメントCがDpn I遺伝子産物を発現するする場合、dam+宿主への
プラスミドCDの形質転換は細胞を死滅させる。セグメントDを、例えば組換えク
ローニングによって新しいプラスミド移入する場合、毒性遺伝子がもはや存在し
ないので、薬剤マーカーについての選択は成功する。
パートII：毒性遺伝子としてDpn Iを用いるベクタードナーの構築
Dpn Iエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、プライマー５’CCA CCA CAA
ACG CGT CCA TGG AAT TAC ACT TTA ATT TAG３’（配列番号17）および５’CCA
CCA CAA GTC GAC GCA TGC CGA CAG CCT TCC AAA TGT３’（配列番号18）ならび
に鋳型としてDpn I遺伝子を含むプラスミド（Sanford A.Lacks，Brookhaven Nat
ional Laboratory,Upton,New Yorkから入手したプラスミド由来であり；またATC
C 67494としてアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能である）
を用いるPCRによって増幅した。
さらなる変異を、所望の塩基変化を含むプライマーを用いる既存のattLドメイ
ンおよびattRドメインを増幅することによって、それぞれ、attLおよびattRのB
領域およびB'領域に導入した。変異体attL3（オリゴXis115を用いて作製された
）およびattR3（オリゴXis112を用いて作製された）の組換えにより、以下の配
列（太字がattB1と異なる）を有するattB3を得た：
既存の遺伝子ドナープラスミドのattL2の代わりにattL3配列をクローン化し、プ
ラスミドpEZC2901を得た（図7A）。既存のベクタードナープラスミドのattR2の
代わりにattR3配列をクローン化し、プラスミドpEZC2913を得た（図7B）。DpnI
遺伝子をプラスミドpEZC2913にクローン化して、tetリプレッサー遺伝子を置換
した。得られたベクタードナープラスミドをpEZC3101と名付けた（図7C）。pEZC
3101をdam-SCS110株（Stratagene）に形質転換した場合、数百のコロニーを得た
。同じプラスミドをdam+DH5α株に形質導入した場合、たとえDH5α細胞がSCS110
細胞より約20倍コンピテントであっても、ほんの１コロニーを生じただけであっ
た。Dpn I遺伝子を含まない関連するプラスミドを同じの２つの細胞株に形質転
換した場合、DH5α細胞から448のコロニーが得られたが、SCS110細胞からは28個
のコロニーが生じた。これは、Dpn I遺伝子がプラスミドpEZC3101（図7C）上で
発現
され、そしてdam+DH5α細胞を死滅させるが、dam-SCS110細胞を死滅させないと
いう証拠である。
パートIII：Dpn I選択を用いる組換えクローニングの実証
プラスミド対を使用し、毒性遺伝子Dpn Iに依存する産物についての選択を用
いる組換えクローニングを示した。プラスミドpEZC3101（図7C）を、Mlu Iを用
いて直鎖状にし、そして環状プラスミドpEZC2901（図7A）と反応させた。リプレ
ッサー遺伝子による薬剤耐性の制御に基づく選択を用いるプラスミドの第２の対
を、コントロールとして使用した：プラスミドpEZC1802（図7D）を、Xba Iを用
いて直鎖状にし、そして環状プラスミドpEZC1502（図5H）と反応させた。以前の
実施例におけると同一の緩衝液ならびにタンパク質Xis、Int、およびIHFを含む
８マイクロリットルの反応物を、25℃で45分間、次いで75℃で10分間インキュベ
ートし、そして１μlアリコートを、表６に示すようにDH5α（すなわち、dam+）
コンピテント細胞に形質転換した。
ミニプレップDNAを、反応＃２由来の４つのコロニーから調製し、そして制限
酵素Ssp Iを用いて切断した。全てから予想されるフラグメントを得た。
分析：毒性遺伝子を用いる選択を用いるサブクローニングを示した。予想され
る構造のプラスミドを産生した。
実施例６：融合タンパク質作製のための、ウラシルDNAグリコシラーゼを用いる
遺伝子のクローニングおよび組換えクローニングを用いる遺伝子のサブクロ
ーニング
パートＩ：既存の発現ベクターの組換えクローニングのためのベクタードナーへ
の変換
既存のベクターの機能的ベクタードナーへの変換に有用なカセットを、以下の
ように作製した。プラスミドpEZC3101（図7C）を、Apa IおよびKpn Iを用いて消
化し、末端を平滑にするためにT4 DNAポリメラーゼおよびdNTPで処理し、所望で
ないDNAフラグメントを小さくするためにSma I、HpaI、およびAlwN Iを用いてさ
らに消化し、そしてattRI-CmR-Dpn I-attR-3ドメインを含む2.6kbカセットをゲ
ル精製した。精製されたカセットの濃度を、約75ngDNA/μlであると評価した。
プラスミドpGEX-2TK（図8A）（Pharmacia）は、タンパク質グルタチオンSトラ
ンスフェラーゼと、そのマルチクローニング部位に挿入され得る任意の第２のコ
ード配列との間の融合を可能にする。pGEX-2TK DNAを、Sma Iを用いて消化し、
そしてアルカリホスファターゼで処理した。約75ngの上記の精製DNAカセットを
、約100ngのpGEX-2TKベクターと５μl連結物中で2.5時間連結し、次いで、１μl
をコンピテントBRL3056細胞（DH10Bのdam-誘導体；市販のdam-株は、Life Techn
ologies,Inc.,由来のDM1およびStratagene由来のSCS110を含む）に形質転換した
。形質転換混合物のアリコートを、100μl/mlアンピシリン（耐性遺伝子は、pGE
X-2TK上に存在する）および30μl/mlクロラムフェニコール（耐性遺伝子は、DNA
カセット上に存在する）を含有するLB寒天上にプレートした。コロニーをひろい
、そしてミニプレップDNAを作製した。pGEX-2TK中のカセットの方向を、EcoR I
を用いる診断的切断によって決定した。所望の方向を有するプラスミドを、pEZC
3501（図8B）と名付けた。
パートII：３つのリーディングフレームでのレポーター遺伝子の組換えクローニ
ング遺伝子ドナープラスミドへのクローニング
ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）クローニングは、クローニングベクターへ
PCR増幅産物をクローニングするための方法である（米国特許第5,334,515号、本
明細書中でその全体が参考として援用される）。簡単に述べれば、所望のDNAセ
グメントのPCR増幅を、それらの５’末端にチミジン塩基の代わりにウラシル塩
基を含むプライマーを用いて実施する。このようなPCR産物を酵素UDGと共にイン
キュベートする場合、ウラシル塩基は特異的に取り除かれる。これらの塩基の欠
損は、PCR産物DNAの末端における塩基対合を弱め、そして適切な温度（例えば、
37℃）でインキュベートした場合、このような産物の末端は、主として一本鎖化
される。PCR産物の３’末端に相補的である突出した３’テールを含む直鎖状ク
ローニングベクターの存在下でこのようなインキュベーションを行った場合、塩
基対合は、効率的にクローニングベクターにPCR産物をアニーリングする。アニ
ーリングされた産物を、形質転換によってE．coli細胞に導入した場合、インビ
ボプロセスは、効率的にそれを組換えプラスミドに変換する。
３つ全てのリーディングフレームでの任意のPCR産物のクローニングを可能に
するUDGクローニングベクターをpEZC3201（図8K）から以下のように調製した。
８つのオリゴヌクレオチドが、Life Technologies,Inc.から得られた（全て５’
→３’で記載される：rf1 上部（GGCC GAT TAC GAT ATC CCA ACG ACC GAA AAC C
TG TAT TTT CAG GGT）（配列番号19）、rf1 下部（CAG GTT TTC GGT CGT TGG GA
T ATC GTA ATC）（配列番号20）、rf2 上部（GGCCA GAT TAC GAT ATC CCA ACG A
CC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT）（配列番号21、rf2 下部（CAG GTT TTC GGT
CGT TGG GAT ATC GTA ATCT）（配列番号23）、rf3 上部（GGCCAA GAT TAC GAT A
TC CCA ACG ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT）（配列番号23）、rf3 下部（CA
G GTT TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTA ATC TT）（配列番号24）、カルボキシ上部
（ACC GTT TAC GTG GAT）（配列番号25）、およびカルボキシ下部（TCGA GTC CA
C GTA AAC GGT TCC CAC TTA TTA）（配列番号26））。rf1、２および３上部鎖な
らびにカルボキシ下部鎖を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末端
上でリン酸化し、次いで各対の相補的な鎖をハイブリダイズした。プラスミドpE
ZC3201（図8K）をNot IおよびSal Iを用いて切断し、そして切断プラスミドのア
リコートをカルボキシ-オリゴ二重鎖（Sal I末端）およびrf1、rf2、またはrf3
二重鎖のいずれか（Not I末端）と混合した（250pmolカルボキシオリゴ二重鎖と
10μl（約５pmol）切断プラスミドとを混合し、３つの20μl容積に分割し、rf1
、rf2、またはrf3二重鎖の５μl（250pmol）および２μl=２単位T4 DNAリガーゼ
を各反応物に添加した）。室温での90分の連結後、各反応物を調製用アガロース
ゲルに供し、そして2.1kbのベクターバンドを溶出し、そして50μlの
TEに溶解した。
パートIII：CATおよびphoA遺伝子のPCR
プラスミドpACYC184由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（CAT）遺伝子およびE．coli由来のアルカリホスファターゼ遺伝子であるphoAを
増幅するために、プライマーをLife Technologies，Inc.,から得た。プライマー
は、ウラシル塩基を含む12塩基５’伸長を有し、その結果ウラシルDNAグリコシ
ラーゼ（UDG）でのPCR産物の処理は、DNAの各末端での塩基対合を弱め、そして
３’鎖が上記のrf1、rf2、およびrf3ベクターの突出す３’末端とのアニーリン
グを可能にする。プライマーの配列（全て５’→３’で記載）は以下のとおりで
あった：CAT左、UAU UUU CAG GGU ATG GAG AAA AAA ATC ACT GGA TAT ACC（配列
番号27）；CAT右、UCC CAC UUA UUA CGC CCC GCC CTG CCA CTC ATC（配列番号28
）；phoA左、UAU UUU CAG GGU ATG CCT GTT CTG GAA AAC CGG（配列番号29）；
およびphoA右、UCC CAC UUA UUA TTT CAG CCC CAG GGC GGC TTT C（配列番号30
）。次いで、プライマーを公知の方法工程（例えば、米国特許第5,334,515号（
これは本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）を用いる
PCR反応のために使用し、そしてこれらのプライマーを用いて得られたポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅産物は、開始ATGを有するがいかなる転写シグナルも有さないC
ATまたはphoA遺伝子を含んだ。さらに、アミノ末端上のウラシル含有配列は、TE
Vプロテアーゼ（Life Technologies,Inc.）の切断部位をコードし、そしてカル
ボキシ末端上のウラシル含有配列は、連続的なTAAナンセンスコドンをコードし
た。
非精製PCR産物（約30ng）を、１×REact4緩衝液(LTI)および１単位のUDG（LTI
）を含む10μｌの反応物中で、ゲル精製された、直鎖状rf1、rf2、またはrf3ク
ローニングベター（約50ng）と混合した。37℃での30分後、各反応の１μlアリ
コートを、コンピテントE．coli DH5α細胞(LTI)に形質転換し、そして50μg/ml
のカナマイシンを含有する寒天上にプレートした。コロニーをひろい、そしてミ
ニプレップDNAの分析は、CAT遺伝子が、リーディングフレーム１（pEZC3601）（
図8C）、リーディングフレーム２（pEZC3609）（図8D）、およびリーディングフ
レーム３（pEZC3617）（図8E）でクローン化され、そしてphoA遺伝子が、リー
ディングフレーム１（pEZC3606）（図8F）、リーディングフレーム２（pEZC3613
）（図8G）、およびリーディングフレーム３（pEZC3621）（図8H）でクローン化
されたことを示した。
パートIV：CATまたはphoAのUDGクローニングベクターからGST融合ベクターへの
サブクローニング
３つ全てのリーディングフレームでのGSTとCATまたはphoAのいずれかとの間の
融合物をコードするプラスミドを、以下の組換えクローニングによって構築した
。GSTベクタードナーpEZC3501（図8B）（上記のPharmaciaプラスミドpGEX-2TK由
来）のミニプレップDNAを、Cla Iを用いて直鎖状にした。約５ngのベクタードナ
ーを、緩衝液および組換えタンパク質Int、Xis、およびIHF（上記）を含む８μl
の反応物中、CATまたはphoAを含む各約10ngの適切な環状遺伝子ドナーベクター
と混合した。インキュベーション後、１μlの各反応物を、E．coliDH5α株に形
質転換し、そして表７に示すようにアンピシリン上にプレートした。
パートV：融合タンパク質の発現
各形質転換由来の２つのコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含有する17
×100mmのプラスチックチューブ（Falcon 2059,Becton Dickinson）中の２mlの
リッチ培地（CircleGrow，Bio101 Inc.）中にひろい、そして37℃で約４時間強
く振盪し、その時培養物は視覚的に濁っていた。１mlの各培養物を、GSTの発現
を誘導するために10μlの10％（w/v）IPTGを含む新しいチューブに移した。さら
なる２時間のインキュベーション後、全ての培養物は、ほぼ同じ濁度を有した；
１つの培養物のA600は、1.5であった。0.35mlの各培養物由来の細胞を回収し、
そしてサンプル緩衝液（SDSおよびβ-メルカプトエタノールを含む）で処理し、
そして細胞の約0.15 A600単位に等価なアリコートを、Novex ４〜20％勾配ポリ
アクリルアミドゲルに供した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブルーを用いて染
色した。
結果：単一のタンパク質のバンドの増大した発現は、12の培養物の全てで見出
された。これらのタンパク質の観察されたサイズは、３つのリーディングフレー
ムでCATまたはphoAに（終止コドンを含まないattB組換え部位を介して）融合さ
れたGSTの予想したサイズと良く一致した：CAT rf1=269アミノ酸；CAT rf2=303
アミノ酸；CAT rf3=478アミノ酸；phoA rf1=282アミノ酸；phoA rf2=280アミノ
酸；およびphoA rf3=705アミノ酸。
分析：CATおよびphoA遺伝子の両方を、３つ全てのリーディングフレームでGST
融合ベクターにサブクローン化し、そして６つの融合タンパク質の発現を示した
。
上記発明は、明瞭化および理解の目的で幾らか詳細に記載されているが、形式
および詳細における種々の変化が、本発明および添付の請求の範囲の真の範囲か
ら逸脱することなくなされ得ることが、本開示の解釈から当業者によって認識さ
れる。本明細書中で引用された全ての特許および刊行物は、本明細書中にその全
てが参考として援用される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ
Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ブラッシュ，マイケル エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
ガイザースバーグ，サニーエイカーズ ロ
ード 20931
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．第１のDNAセグメントおよび第２のDNAセグメントを含むベクタードナーDNA 分子であって、該第１のDNAセグメントまたは該第２のDNAセグメントは少なくと も１つの選択マーカーを含み、ここで該第１のセグメントおよび該第２のセグメ ントは、（i）環状ベクタードナーにおいては、第１の組換え部位および第２の 組換え部位により、または（ii）直鎖状ベクタードナーにおいては、少なくとも 第１の組換え部位により、のいずれかで分離され、ここで隣接する組換え部位の 各々の対が操作され、そして互いに組換えない、ベクタードナーDNA分子。 ２．前記選択マーカーが以下： （i）そうでなければ毒性の化合物に対する耐性を提供する産物をコードするD NAセグメント； （ii）そうでなければレシピエント細胞において欠如している産物をコードす るDNAセグメント； （iii）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするDNAセグメント； （iv）容易に同定され得る産物をコードするDNAセグメント； （v）細胞の生存および／または機能に有害である産物をコードするDNAセグメ ント； （vi）該（i）〜（v）のDNAセグメントのいずれかの活性を阻害するDNAセグメ ント； （vii）基質を修飾する産物に結合するDNAセグメント； （viii）所望の分子の単離を提供するDNAセグメント； （ix）そうでなければ非機能性であり得る特異的ヌクレオチド配列をコードす るDNAセグメント；および （x）存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する感受性 を与えるDNAセグメント、 からなる群より選択される少なくとも１つのDNAセグメントである、請求項１に 記載のベクタードナーDNA分子。 ３．前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、tRNA遺伝子、栄養要求マーカー 、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド；制限エンド ヌクレアーゼ；制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切断部位、タンパク質結 合部位；およびPCRプライマーに相補的な配列、からなる群より選択される少な くとも１つである、請求項２に記載のベクタードナーDNA分子。 ４．前記選択マーカーが少なくとも１つの選択マーカーの不活性フラグメントを 含み、ここで該不活性フラグメントが前記第１の組換え部位または前記第２の組 換え部位と、別の選択マーカーの不活性フラグメントを含むさらなるDNAセグメ ントとにわたって組換えられる場合に、機能性の選択マーカーを再構成し得る、 請求項１に記載のベクタードナーDNA分子。 ５．第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNAセグ メントを含むインサートドナーDNA分子であって、該第１の組換え部位および該 第２の組換え部位は操作され、そして互いに組換えない、インサートドナーDNA 分子。 ６．前記所望のDNAセグメントが、クローニング部位、制限部位、プロモーター 、オペロン、複製起点、機能性DNA、アンチセンスRNA、PCRフラグメント、タン パク質またはタンパク質フラグメント、からなる群より選択される少なくとも１ つをコードする、請求項５に記載のインサートドナーDNA分子。 ７．１つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容器を 含むキットであって、ここで第１の区画は第１のDNAセグメントおよび第２のDNA セグメントを含むベクタードナーDNA分子を含み、該第１のDNAセグメントまたは 該第２のDNAセグメントは少なくとも１つの選択マーカーを含み、ここで該第１ のセグメントおよび該第２のセグメントは、（i）環状ベクタードナードナーに おいては、第１の組換え部位および第２の組換え部位、または（ii）直鎖状ベク タ ードナーにおいては、第１の組換え部位、のいずれかにより隣接され、ここで隣 接する組換え部位の各々の対が操作され、そして互いに組換えない、キット。 ８．第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNAセグ メントを含むインサートドナーDNA分子を含む第２の区画をさらに含み、ここで 該第１の組換え部位および該第２の組換え部位が操作され、そして互いに組換え ない、請求項７に記載のキット。 ９．少なくとも１つの前記組換え部位を含むDNAセグメントを組換え得る少なく とも１つの組換えタンパク質を含むさらなる区画をさらに含む、請求項７に記載 のキット。 １０．選択マーカーまたは所望のDNAセグメントに隣接する少なくとも２つの組 換え部位を有する少なくとも１つのDNAセグメントを含む核酸分子であって、こ こで少なくとも１つの該組換え部位がコインテグレートDNAまたは産物DNAの形成 においてインビトロで組換えを増強する少なくとも１つの操作された変異を有す るコア領域を含む、核酸分子。 １１．前記変異が少なくとも１つの前記組換えの増強を与え、該増強が実質的に 、（i）切り出し組換えの優先；（ii）組み込み組換えの優先；（iii）宿主因子 の要求の軽減；（iv）前記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の効率の増加 ；（v）前記コインテグレートDNAまたは産物DNA形成の特異性の増加からなる群 より選択され；そして該産物DNAに対する所望の特性に貢献する、請求項１０に 記載の核酸分子。 １２．前記組換え部位が、attB、attP、attLおよびattRからなる群より選択され る少なくとも１つの組換え部位に由来する、請求項１０に記載の核酸分子。 １３．前記att部位が、att1、att2およびatt3からなる群より選択される、請求 項１２に記載の核酸分子。 １４．前記コア領域が以下： からなる群より選択されるDNA配列、および対応するまたは相補的なDNAまたはRN A配列、を含み、ここでＲ＝ＡまたはＧ；Ｋ＝ＧまたはＴ／Ｕ；Ｙ＝ＣまたはＴ ／Ｕ；Ｗ＝ＡまたはＴ／Ｕ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｓ＝Ｃまた はＧ；およびＢ＝ＣまたはＧまたはＴ／Ｕである、請求項１０に記載の核酸分子 。 １５．前記コア領域が以下： からなる群より選択されるDNA配列、および対応するまたは相補的なDNAまたはRN A配列、を含む、請求項１４に記載の核酸分子。 １６．核酸分子を作製するための方法であって、配列番号１〜１６の少なくとも １つに少なくとも90％の相同性を有する少なくとも１つのDNA配列を含む少なく とも１つの操作された組換え部位を有する核酸分子を提供する工程を包含する、 方法。 １７．請求項１６に記載の方法により提供される核酸分子。 １８．請求項１０に記載の核酸分子を含む組成物。 １９．少なくとも１つの区画でその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化 された容器を含むキットであって、ここで第１の区画が請求項１８に記載の組成 物を含む、キット。 ２０．前記組換え部位を認識する少なくとも１つの組換えタンパク質を有する第 ２の区画をさらに含む、請求項１９に記載のキット。 ２１．請求項２２に記載の方法に有用である、単離された形態の少なくとも１つ の組換えタンパク質をその中に厳重な封じ込めで収容するように区画化された容 器を含むキット。 ２２．コインテグレートDNA分子を作製する方法であって、以下の工程： インビトロにおいて （i）第１の組換え部位および第２の組換え部位により隣接される所望のDNAセ グメントを含むインサートドナーDNA分子、ここで該第１の組換え部位および該 第２の組換え部位は互いに組換えない； （ii）第３の組換え部位および第４の組換え部位を含むベクタードナーDNA分 子、ここで、該第３の組換え部位および該第４の組換え部位は互いに組換えない ；および （iii）該第１の組換え部位および該第３の組換え部位または該第２の組換え 部位および該第４の組換え部位を組換え得る少なくとも１つの部位特異的組換え タンパク質； を組み合わせ、それにより、組換えを生じさせ、その結果該第１の組換え部位お よび該第３の組換え部位または該第２の組換え部位および該第４の組換え部位を 含むコインテグレートDNA分子を産生する工程、 を包含する、方法。 ２３．産物DNA分子が前記コインテグレートDNAから、（i）前記第１の組換え部 位および前記第３の組換え部位、または（ii）前記第２の組換え部位および前記 第４の組換え部位の少なくとも１つを組換えることにより産生され、該産物DNA が前記所望のDNAセグメントを含む、請求項２２に記載の方法。 ２４．前記方法がまた副産物DNA分子も産生する、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記産物DNA分子について選択する工程をさらに含む、請求項２３に記載 の方法。 ２６．前記ベクタードナーDNA分子が前記第３の組換え部位および前記第４の組 換え部位により隣接されるベクターセグメントを含む、請求項２２に記載の方法 。 ２７．前記ベクタードナーDNA分子がさらに（a）毒性遺伝子および（b）選択マ ーカーを含み、ここで該毒性遺伝子および該選択マーカーが異なるDNAセグメン ト上に存在し、該DNAセグメントが（i）環状DNA分子においては、２つの組換え 部位、または（ii）直鎖状DNA分子においては、１つの組換え部位、のいずれか により分離されている、請求項２２に記載の方法。 ２８．前記ベクタードナーDNA分子がさらに（a）抑制カセット、および（b）該 抑制カセットのリプレッサーにより抑制される選択マーカーを含み、ここで該選 択マーカーおよび該抑制カセットが異なるDNAセグメント上に存在し、該DNAセグ メントが（i）環状DNA分子においては、２つの組換え部位、または（ii）直鎖状 DNA分子においては、１つの組換え部位、のいずれかにより分離されている、請 求項２２に記載の方法。 ２９．前記インサートドナーDNA分子および前記ベクタードナーDNA分子の少なく とも１つが環状DNA分子である、請求項２２に記載の方法。 ３０．前記インサートドナーDNA分子および前記ベクタードナーDNA分子の少なく とも１つが直鎖状DNA分子である、請求項２２に記載の方法。 ３１．前記選択する工程がインビトロまたはインビボにおいて実施される、請求 項２２に記載の方法。 ３２．前記組換えタンパク質が少なくとも第１の組換えタンパク質および第２の 組換えタンパク質を含み、該第２の組換えタンパク質が該第１の組換えタンパク 質と異なる、請求項２２に記載の方法。 ３３．前記組換えタンパク質がIntである、請求項２２に記載の方法。 ３４．前記少なくとも１つの組換えタンパク質が（i）IntおよびIHF、ならびに （ii）Int、Xis、およびIHFから選択される、請求項２２に記載の方法。
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