JPH11508682A - 非分離特異的結合化学発光アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ここに記載されているアッセイは、アクリジニウムエステルで標識されたトレーサーが、それらに対応する、金属酸化物の固相上に固定化された結合共役体に結合された場合には、その固相に結合した標識されたトレーサーの測定可能な化学発光光の放出が、固相に取り付けられていないフリー画分のトレーサーと比較して抑制されるという観察を基礎としている。本発明に従って、分析対象の存在の検出または定量のための非分離特異的結合アッセイが提供されており、そこにおいて、全体の反応混合物（反応していないトレーサーを含む）がフラッシュされ（ｆｌａｓｈｅｄ）、変調されたシグナル（抑制効果のため）が参照と関連づけられ、そのように前記試料中の前記分析対象の量または存在を決定している。この非分離方法を用いることにより、複数の分離を用いる異種アッセイに固有の不利益が回避され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 非分離特異的結合化学発光アッセイ 発明の分野 本発明は、非分離化学発光特異的結合アッセイに関する。定義 本明細書において「分析対象（ａｎａｌｙｔｅ）」とは、１またはそれより多 くの特異的結合パートナーとの間で結合反応を生じ得る物質として定義される。 用語「分析対象」は、血清タンパク質、ホルモン、薬剤、抗原、抗体（モノクロ ーナル、ポリクローナルおよびそれらの断片を含む）、病原体、酵素、代謝産物 、補酵素およびそれらの結合パートナー、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチ ド、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッド、および金属お よびそれらのキレート化剤等を含むが、これらに限定されるわけではない。「特 異的結合パートナー」とは、標的とされた分析対象および分析対象アナログに対 して結合することが可能な物質として定義される。用語「特異的結合パートナー 」とは、抗体、抗原、アビジン、ビオチン、チロキシン、チロキシン結合グロブ リン、多糖、フォスフォリルコリン、アミノエチル二水素リン酸残基、エストロ ゲン、ビタミンＢ−１２固有因子、結合タンパク質、それらの混合物、およびオ リゴヌクレオチド等を含む多様な他のタンパク質およびヘプチド等を含むが、こ れに限定されるものではない。「分析対象アナログ」とは、特異的結合反応を通 して、標的とされた分析対象の選択された特異的結合パートナーと対合すること が可能な物質として定義される。「特異的結合複合体」とは、標的とされた分析 対象−特異的結合パートナーの複合体、分析対象アナログ一特異的結合パートナ ー、または第１の特異的結合パートナー−標的とされた分析対象−第２の特異的 結合パートナー「サンドイッチ」（ここにおいて第１および第２の結合パートナ ーは同じでも異なっていてもよい）の何れかを指す。「特異的結合複合体」は、 免疫的、化学的、および相補的結合を含む何れの数の特異的結合反応によって構 成されてもよい。「トレーサー」とは、標識された特異的結合パートナー、標識 された分 析対象または標識された分析対象アナログとして定義される。「結合共役体」と は、分析対象、分析対象アナログまたは分析対象の特異的結合パートナーから選 択されうる結合する部分として定義される。「フリー画分」とは、固相に取り付 けられていないアッセイの成分として定義される。発明の背景 この分野で良く知られているように、化学発光シグナルを提供する化合物が現 在、特異的結合アッセイにおいて標識として用いられている。分離（異種）およ び非分離（同種）アッセイの両方が、化学発光化合物を標識として用いて用意さ れている。 異種アッセイとは、一般に、固相上に形成された特異的結合複合体をフリー画 分から化学発光のフラッシュの活性化および測定に先立って分離することを要す るアッセイを指すものである。このように、典型的には、異種アッセイプロトコ ルには、固相反応産物をフリー画分から分離するいくつかの段階が要求されるが 、そこにおいて、水中でのデカントおよび再懸濁が典型的には必要である。異種 アッセイに関連したこれらの分離段階（群）は、かなりの時間量を占め、オペレ ーター誤差の機会を増加させる。 同種アッセイとは、一般に、化学発光フラッシュの活性化および測定に先立っ て、固相反応結合複合体およびフリー画分の物理的分離を典型的には要求しない アッセイを指すものである。例えば、米国特許出願第５０１７４７３号には、光 吸収物質（色素）を用いた分離無しの固相イムノアッセイが記述されているが、 そこにおいて物質は、結合トレーサーに関連したものを除いた全ての化学発光を 吸収し、それにより検出される発光は結合トレーサーによるもののみであるとし て記載されている。 固相結合複合体のフリー画分からの分離の必要を排除する別のアッセイシステ ムが必要とされている。発明の概要 ここに記載されたアッセイは、アクリジニウムエステルで標識されたトレーサ ーが、金属酸化物固相上に固定化されたそれらに対応する結合共役体に結合され た場合に、固相に結合された標識されたトレーサーの測定可能な化学発光光の放 出が、固相に結合されていないフリー画分中に残存しているトレーサーから発生 された化学発光シグナルと比較して減少される（ここでは「抑制される」と表現 される）という観察に基づいている。 本発明に従って、試料中の分析対象の存在を検出または定量するための非分離 特異的結合アッセイが提供されており、該アッセイは：前記試料を、自身に結合 共役体が取り付けられた金属酸化物を含む固相、および、アクリジニウムまたは ベンズアクリジニウムエステルで標識された結合共役体を含むトレーサーと接触 させ；前記固相、トレーサーおよび試料を反応させ、前記固相に結合した特異的 結合複合体、および前記固相に結合されていないフリー画分を含む反応混合物を 形成させ；前記アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステルトレーサー をフラッシュし、変調化学発光シグナルを提供するために、前記反応混合物を活 性化剤と接触させ；前記変調シグナルを測定し；そして前記変調シグナルを前記 試料中の前記分析対象の存在を検出または定量するために参照と関連づける、各 工程を含む。 この発明にまた提供されているのは、上記の方法を実行するための診断キット である。 複数の分離を用いている異種アッセイに固有の不利益は、この非分離方法を用 いることにより回避されうる。付加的には、本発明により成されたように、アッ セイの分離段階が排除されるかまたはより少なく関与するようにされた場合、ア ッセイの自動化はより容易である。図面の説明 ここに含まれている図面においては、図１は実施例２の表１のグラフでの表示 である。図２は実施例３の表２のグラフでの表示であり、αテオフィリンＰＭＰ およびα−ＬＨ ＰＭＰの両方を示している。図３は、実施例４において参照と して用いられたような、テオフィリンの測定のための標準曲線である。図４は実 施例５に記載されている。図５は、実施例６に記載されている競合ハイブリダイ ゼーションアッセイを示している。詳細な説明 本発明は、化学的または生物学的物質中に存在する標的とされた分析対象を検 出および／または定量するために用いられてもよい。一般に、化学発光活性化条 件下で安定である何れの分析対象の相互作用が、本アッセイシステムにおいて用 意されても良い。 アクリジニウム、ベンズアクリジニウムまたはアクリダン型の複素環式環シス テムを有する様々な型の化学発光化合物が好ましい標識であるが、相当する化学 発光化合物および標識を活性化させる手段は本発明の範囲から外れない。アクリ ジニウムおよびベンズアクリジニウムエステルは現在、複素環式環システムまた はアクリジニウム、ベンズ［ａ］アクリジニウム、ベンズ［ｂ］アクリジニウム 、ベンズ［ｃ］アクリジニウム、ベンズイミダゾールカチオン、キノリニウム、 イソキノリニウム、キノリジニウム、環置換キノリニウム、フェナントリジニウ ムおよびキノキサリニウム等の環システムを含む陽性酸化状態で異種原子を有す る環システムを有するような化合物を含む好ましいアクリジニウムエステルとと もに、当業者に良く知られているとおり、より好ましい化学発光化合物である。 トレーサーは、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステル上に存在す る反応性官能基に、選択された結合共役体を直接的または間接的に、当業者に良 く知られているように、例えばＷｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９（８），１４７４−１４７９，１９８３のように取り 付けることにより調製されてもよい。特に好ましい化合物は、アリール環リービ ング基（ｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）およびアリール環のパラまたはメタ位置 の何れかに存在する反応性官能器を有するベンズアクリジニウムエステルおよび アクリジニウムエステルである。特に安定なアクリジニウムおよびベンズアクリ ジニウムエステルは、アリール環の両方のオルト位置に電子供与種（好ましくは Ｃ₁−Ｃ₄アルキルまたはアルコキシ基、最も好ましくはメチル）を有し、反応性 官能基（好ましくは、結合パートナーの取り付けに先だってＮ−サクシニミジル オキシカルボニル基に変換されたＣＯＯＨ）をメタまたはパラ位置に有するアリ ール環を備えたアリール環リービング基を有するものであるが、これらは、ここ において両方とも参考文献として取り込まれている米国特許第４７４５１８１号 およびＷＯ９４／２１８２３に記載されているようなものである。 固相は好ましくは金属酸化剤物質、好ましくはクロム酸化物、鉄酸化物、ニッ ケル酸化物、またはそれらの何れかの混合物である。固相は、水には不溶性で水 または生物学的液体にさらされた場合に構造上の一体性を維持するものでなけれ ばならず、粒状（磁性鉄流動体（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）中 にあるもののような細かく分割された物質から粗い粒状物質までの範囲に亘る） 、または成形された物品（例えばビーズ、試験管トレー、マイクロタイタープレ ート、膜、フィルム、濾紙、ディスク等）であっても良い。より好ましくは、固 相粒子は、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５に対して付与された米 国特許第４５５４０８８号（ここに参考文献として取り込まれている）に記載さ れているような鉄酸化物の核を含んでいる。結合共役体の取り付けを補助するた めに、好ましくは金属酸化物固相は、その上に存在する生物吸着性物質を有する 。シランポリマー性コーティングは、特に好ましい生物吸着物質であり、一般的 には、有機機能性およびシリコン−機能性化合物であって、分子のシリコン部分 が無機物質に対する吸着性を有する一方、分子の有機部分は有機物と組み合わせ られるように適合されていることを特徴とするものであると定義されるであろう 。好ましくは、結合共役体を固相に取り付けるための化学反応には、ジアゾ化、 カルボジイミドおよびグルタールアルデヒドカップリングが含まれるが、これに 限定されるものではない。用いられてもよりカップリング技術は、Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎｚｙ．，７０，ｐ．１５９−１６５（１９８０），およびＧｒｏｍ ａｎ，Ｅ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｖｏｌ ．３，ｐｐ．１５６（１９８５），およびＪｏｓｅｐｈｓｏｎに１９８７年に付 与された米国特許第４６７２０４０号に記載されている（これらのそれぞれはこ こに参考文献として取り込まれている）。 本発明が遺伝子プローブとともに実施された場合、核酸のハイブリダイゼーシ ョンは金属酸化物固相を用いて達成されるであろうが、そこにおいてハイブリダ イゼーションは、核酸と結合された固相（最も好ましくはＤＮＡオリゴマー）を 、単離されるべき分子を含んだ反応混合物中に分散させ、核酸と結合された固相 が相補的な標的配列とハイブリダイズすることを可能とすることにより成される 。 アクリジニウムエステル化合物の化学発光光の放出は、公知の活性化試薬、典 型的には、水、エーテル、エステル、アルコールおよびケトンおよびそれらの組 合せを含む溶媒（群）中に存在する、塩基およびＨ₂Ｏ₂（Ｈ₂Ｏ₂生産物質を含む ）またはＯ₂により引き起こされる。本発明に従っては、活性化試薬（群）が、 結合反応が起こった後で全体の反応混合物と接触される（すなわち、固相に結合 された特異的結合複合体はフリー画分から分離されない）。好ましくは、活性化 剤は、以下に「第１の」試薬（最初に反応混合物に添加される）および「第２の 」試薬（第１の試薬が添加された直後に反応混合物に添加される）として記述さ れているように、実際には２つの別個の試薬である。第１の試薬は水性酸性過酸 化水素溶液で、第２の試薬は塩基性水性試薬であり、化学発光光は即時に（ここ において「即時に」とは、第２の試薬が反応混合物に添加されてから数分間を超 えない時間的期間として、より好ましくは１分未満、最も好ましくは約０．１秒 後またはその程度、と定義される）測定される。第１の試薬の酸は、硝酸、塩酸 、硫酸、およびそれらの混合物、およびそのようなものを含む何れの好適な酸で も良い。最も好ましくは、第１の試薬中の酸は、水性溶液の総容量に基づいた％ で約０．１％から約１０％（Ｖ／Ｖ）で存在している過酸化水素を有する水性溶 液中に、約０．０５Ｎから約０．５Ｎまで（最も好ましくは約０．１Ｎ）の濃度 で存在する硝酸である。第２の試薬中に存在する塩基は、水酸化ナトリウム、水 酸化カリウム、水酸化リチウム、およびそれらの混合物、およびそのようなもの を含む何れかの適当な塩基である。一般的には、水酸化ナトリウムが第２の試薬 中の塩基として適当であり、約０．２５Ｎから約１．２５Ｎ（最も好ましくは約 ０．２５Ｎ）の濃度レベルで用いられても良い。付加的には、当業者に公知の通 常の成分、バッファー物質（リン酸バッファー、クエン酸バッファー、ホウ酸バ ッファー等を含む）、多様な界面活性剤（米国特許第４９２７７６９号および係 属中の１９９４年１１月１４日に出願された米国出願番号第０８／３３９８７０ 号に記載されているもの等、両方は共通してＣｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．に譲渡されている）、およびタンパク質（牛血清 アルブミン、ゼラチン、カゼイン、およびそのようなものを含む）が活性化試薬 （群）中に含まれていても良い。最も好ましい活性化剤は：第１の試薬：約０． １％から約１０％（好ましくは０．５％から１％）の過酸化水素中の水性溶液中 に存在する硝酸の水性溶液（好ましくは０．１Ｎ）；および第２の試薬：約０． １から約１％（Ｖ／Ｖ）の界面活性剤（最も好ましくはＮ−アルキルトリメチル 塩化アンモニウム）を含む水中の約０．２５Ｎから約１．２５ＮのＮａＯＨ（好 ましくは０．２５Ｎ）の水性溶液で、前記％は水性試薬溶液の総量に基づいてい る。 ここで用いられるように、変調された化学発光シグナルは反応混合物によって 提供された総化学発光シグナルの一切を含んだものである。これには、固相に結 合されたトレーサーによって、および、一旦固相上での特異的結合反応が行き渡 っても（ｔｒａｎｓｐｉｒｅｄ）フリー画分中に残った何れかのトレーサーによ って提供された、抑制された発光が含まれている。化学発光シグナルのパーセン ト抑制は以下の等式で計算される： ％抑制＝［１−（変調シグナル計数／抑制されないシグナル計数）］ｘ１００％ 抑制されていないシグナル計数は、固相の不在下で採取された、結合していな い所定量のトレーサーの化学発光フラッシュから測定された計数である。所定量 とは、アッセイに添加されたのと同じトレーサーの量として定義される。％抑制 計算は、続いて参照（例えば、合成標的配列ＤＮＡ等を含む）と関連づけられ、 試料中の分析対象の量または存在を決定する。固相が関係のない結合パートナー でコートされている場合は、存在する固相の量に比例して化学発光が抑制される ことが観察された。ここで記載されているシグナル変調は、固相量による抑制に 加えての、およびそれより大きな規模のものであり、そしてアクリジニウムエス テルで標識された分析対象と固相に共有結合的に取り付けられた結合パートナー との特異的結合反応によるものである。 全ての実施例において、化学発光標識の活性化（例えばフラッシュすること） により発生された光放出の評価および測定は、当業者に公知の技術で実行されて もよい。例えば、化学発光シグナル測定において利用されても良いルミノメータ ー（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）装置が市販されており、例えば、Ｃｉｂａ Ｃｏ ｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓ ．によって製造されたＭＡＧＩＣ（登録商標）ＬＩＴＥアナライザー（ＭＬＡ Ｉ）装置がある。このアッセイはまた、ルミノメーターを、１またはそれより多 くの光電子倍増管チューブ（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ）とと もに、 共通して譲渡されていてここに参考文献として取り込まれている、優先日が１９ ９３年３月１９日であるＷＯ９４／２２００２に記載されている複数の光電子倍 増管チューブとともに含む自動化されたシステムにおいて用いるために用意され てもよい。 本発明の方法は、当業者に公知の技術により多様なアッセイシステムおよびフ ォーマットによって実施されても良い。競合的または非競合的（例えばサンドイ ッチ）アッセイフォーマットの両方が、免疫的結合、化学結合、相補的結合およ びそれらの組合せによって実行され得る。 以下は、本発明に従った、用いられ得る免疫的フォーマットの説明である。 標識された抗原−競合的：このフォーマットにおいては、測定されるべき標的 とされた抗原を含む試料は、（１）金属酸化物固相に結合された限定された量の 抗体、および（２）自身にアクリジニウムエステル標識が取り付けられている抗 原または抗原アナログを含むトレーサー、を含む溶液とともに保温される。反応 溶液の保温の間、試料中の抗原は標識された抗原（または抗原アナログ）と、固 相に取り付けられた抗体との結合に関して競合する。保温の期間の後、反応溶液 中に残された３つまでの成分が存在し得る：（１）固相に取り付けられた抗体と 結合した試料抗原を含む複合体（活性化によってシグナルが得られない）；（２ ）固相に取り付けられた抗体と結合したトレーサー抗原（または抗原アナログ） を含む複合体（活性化によって抑制されたシグナルが得られる）；および、可能 性としては、（３）反応しなかったトレーサー（抑制されないシグナルが得られ る）。固相に結合した標識された抗原（または抗原アナログ）の量は、試料中の 抗原の量に反比例する。 標識された抗体−競合的：このフォーマットにおいては、測定されるべき標的 とされた抗原を含む試料は、（１）金属酸化物固相と結合された限定された量の 抗原（または抗原アナログ）、および（２）自身にアクリジニウムエステル標識 が取り付けられている抗体を含むトレーサー、を含む溶液とともに保温される。 反応溶液の保温の間、試料中の抗原は固相抗原（または抗原アナログ）と、標識 された抗体との結合に関して競合する。保温の期間の後、反応溶液中に残された ３つまでの成分が存在し得る：（１）トレーサー抗体と結合した試料抗原を含む 複合体（活性化によって抑制されないシグナルが得られる）；（２）固相に取り 付けられた抗原（または抗原アナログ）と結合したトレーサー抗体を含む複合体 （活性化によって抑制されたシグナルが得られる）；および、可能性としては、 （３）反応しなかったトレーサー抗体（抑制されないシグナルが得られる）。試 料中の抗原と固相上の抗原（またはアナログ）は、標識された抗体に関して競合 する。固相に結合されるようになった標識された抗体の量は、試料中の抗原の量 に反比例する。 標識された抗体−サンドイッチ：このフォーマットは、２つの抗体（同じかま たは異なったもの）に同時に結合可能であるために十分大きい抗原に対して典型 的に成されるものであるが、これにおいては、試料は、固相に取り付けられた過 剰量の１つの抗体、および、アクリジニウムエステルで標識された過剰量の別の トレーサー抗体とともに保温される。抗原は、その１つの抗原決定基を介して固 相に取り付けられた状態となり、標識された抗体が異なった決定基を介して、順 に抗体に結合された状態になる。固相上に形成された複合体（すなわち固相抗体 −抗原−トレーサー抗体）からは、活性化において抑制された化学発光シグナル が得られ、反応しなかったトレーサーからは抑制されないシグナルが得られる。 固相に結合されるようになった標識抗体の量は、試料中の抗原の量に直接的に比 例している。 ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば遺伝子プローブアッセイ）に関して は、競合およびサンドイッチフォーマットが実施されても良い。ハイブリダイゼ ーションアッセイとともに用いられた場合、本発明のアッセイは、最初のハイブ リダイゼーション−捕捉段階から既にアッセイ中に存在する固相の利益を受け得 る。特定の核配列のアッセイのために用いられるハイブリダイゼーション抑制現 象に関しては、好ましくは、抑制効果は、標識されたオリゴマープローブを固定 化された配列と溶液相配列とに分配することにより変調される。競合的フォーマ ットにおいては、固定化されたオリゴマーおよび標的配列は、それ故、好ましく は、標識されたオリゴマープローブの少なくとも一部にハイブリダイズすること が可能である実質的に共通の配列を共有している。 遺伝子プローブアッセイにおいて実施される場合には、アクリジニウムエステ ルはオリゴマーの何れの所望の位置に置かれても良いが、最も好ましくは、標識 は分子の５’末端に位置される。遺伝子プローブアッセイには、好ましくは、試 料中の標的核酸配列のそれぞれのＤＮＡまたはＲＮＡコピーを生成させるために ＤＮＡまたはＲＮＡレプリカーゼを用いて、当業者に良く知られた方法、例えば ＥＰ−Ａ−０４８１７０４（共通して譲渡されここに参考文献として取り込まれ ている）に記載されたようなものにより増幅する段階が取り込まれている。この 増幅段階の間またはその後に、アクリジニウムエステルで標識されたオリゴマー が試料に添加される。ポリヌクレオチド配列は、標識された配列が、増幅された 配列の一部およびアッセイの手順のはじめに添加された金属酸化物固相上に固定 化された同じ配列と特異的にハイブリダイズすることを可能とする。固相上に捕 捉されるであろう標識されたオリゴマーの量は、溶液中に存在するかまたは固相 上に固定化された相補的な配列の相対的な量に依存する。レプリカーゼ反応から 生成された増幅された標的配列の量は、固相上に固定化された量より過剰である と考えられている。非分離化学発光検出方法を用いると、標的を含まないかまた は閾値以下で含む資料は標識されたオリゴマーの光放出の抑制という結果となる が、一方、標的を含む試料に関しては、標識されたオリゴマーの化学発光は抑制 されないまま残るであろう。固相に取り付けられたオリゴマーとのハイブリダイ ゼーションにより生じた、標識されたオリゴマーの化学発光の％抑制は以下の式 によって計算され得る。 ％Ｑ＝［（オリゴマー−固相を含む反応物のＲＬＵ）／（マイナス オリゴマー −固相対照のＲＬＵ）］ｘ１００ ここにおいてＱは抑制を示しＲＬＵは相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈ ｔ Ｕｎｉｔ）を表す。計算において示されているように、ハイブリダイゼーシ ョン反応および対照反応は、好ましくは、実質的に同じ条件下で保温されるが、 それは標識されたオリゴマーの化学発光が、一般に、時間、温度およびバッファ ー条件で変動し得るからである。 本発明に従って、固相に取り付けられたオリゴマーへの標識されたオリゴマー のハイブリダイゼーションは、固相の容量が、投入された標識されたオリゴマー に対して過剰である場合は、化学発光シグナルの最大限の減少という結果となる 。 付加的には、固相と比較しての標識されたオリゴマーの過剰は、より少ない抑制 という結果となる（すなわち、ハイブリダイズしなかった過剰の標識されたオリ ゴマーが、対照と比較してより多くの化学発光を発生させることにより、より高 い効率で検出されるであろう）。 本発明は、トレーサーおよび固相共役体に取り付けられた相補的な物質を用い て実施されても良い。好ましい相補的な物質にはビオチンおよびアビジンが含ま れる。典型的なビオチン化合物には、例えば、ビオシチン（すなわちビオチンε −Ｎ−リジン）、ビオシチンヒドラジド、２−イミノビオチンのメルカプト派生 体またはアミンおよびビオチニル−ε−アミノカプリオイックアシッド（ａｍｉ ｎｏｃａｐｒｉｏｉｃ ａｃｉｄ）ヒドラジド、および、例えばビオチン−Ｎ− ヒドロキシサクシニミドエステル、ビオチニル−ε−アミノカプリオイックアシ ッド−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル、スルホサクシニミジル６−（ビオ チンアミド）−ブロモアセチルヒドラジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオシチンお よび３−（Ｎ−マレイミドプロピオニル）ビオシチンを含むビオチン派生体が含 まれるが、当業者によく知られているとおり、これらは（好ましくは固相のポリ マーコーティングに取り付けられた）結合タンパク質に取り付けられることが可 能である。用いられてもよいアビジン化合物には、ストレプトアビジン、サクシ ニル化アビジン、モノマー性アビジン等が含まれる。アビジンおよびビオチン（ またはどちらかの派生体）の、特定のトレーサーまたは固相共役体への直接的ま たは間接的な取り付け方法は、例えば、アビジンまたはビオチンのアミノまたは メルカプト基を反応させることを通して等の、当業者に良く知られた技術を通し て成されても良い。 免疫的アッセイに関しては、本発明はテオフィリンおよびジニトロフェノール （ＤＮＰ）タンパク質およびそれらの派生体を検出または定量するために特に有 用である。ハイブリダイゼーションアッセイに関しては、本発明は、例えばサル モネラおよびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種等の腸内病原 体を検出または定量することにおいて特に効果的である。 ここでの開示に供与により、当業者には、本発明に対する様々な変更は明らか であり、また本発明の範囲および物質から離れることなく容易に成され得ること は理解されるであろう。ここにおいて以下の実施例は説明のために意図されてお り、本発明をそれらに限定するために意図されているのではないことに注意され たい。実施例 全ての実施例において、固相は、鉄酸化物コアの周りにシランポリマー性コー ティングを有する常時性粒子（ＰＭＰ）から成っていた（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍ ａｇｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから購入）。ＰＭＰは 、グルタールアルデヒドで活性化させ、多様な特異的結合パートナーと、Ｇｒｏ ｍａｎ，Ｅ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７０，ｐ ．１５９−１６５）に記載されたように２ステップ手順に従って共役させた。実 施例において用いられたアクリジニウムエステル（ＡＥ）は、以下の構造のもの であった： ここにおいて、ＸはＣＨ₃ＳＯ₄、Ｒ₁はメチル；Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₅およびＲ₇は水素 、Ｒ₄およびＲ₈はメチル、Ｒ₆＝は、特異的結合パートナーの取り付けにおいて 補助するためにＮ−サクシニミジルオキシカルボニル基に変換されたＣ ＯＯＨである。アクリジニウムエステルの結合共役体との取り付けにおいて用い られた技術の記述は、Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，２９（８），１４７４−１４７９（１９８３）およびＥＰ−Ａ−０ ５３７９９４において見られる（これらの各々がここにおいて参考文献として取 り込まれている）。アッセイは２つの試薬で以下のようにフラッシュされた：フ ラッシュ試薬１ ＝約０．３ｍｌ、の約０．５％Ｈ₂Ｏ₂水性溶液中の０．１Ｎ Ｈ ＮＯ₃。フラッシュ試薬２＝約０．３ｍｌの、約０．５％ＡＲＱＵＡＤ（登録商 標）１６−５０ Ｎ−アルキルトリメチル塩化アンモニウム（５０％活性、ＡＫ ＺＯ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬより購入）水性溶液 中の０．２５Ｎ ＮａＯＨ。フラッシュ試薬１が最初に反応混合物に添加され、 即時にフラッシュ試薬２が続いた。相対光単位（ＲＬＵ’ｓ）を、フラッシュ試 薬１および２の注入の後の２秒間の間隔にわたって、ルミノメーター（ＭＡＧＩ Ｃ（登録商標）Ｌｉｔｅアナライザー「ＭＬＡ Ｉ」、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎ ｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｄｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓ）を用 いて測定した。 ％抑制は以下の等式によって計算された： ％抑制＝［１−（変調シグナル計数／抑制されないシグナル計数）］ｘ１００％ 変調シグナル計数は、特異的結合パートナーの間の反応が生じた（ｔｒａｎｓ ｐｉｒｅｄ）後に反応混合物によって提供された全体のシグナルの測定値である 。抑制されないシグナル計数は、固相の不在下でフラッシュされたものとして、 アッセイに添加された量のトレーサーから放出された光の測定値である。実施例１ この実施例は、抗体依存抑制現象を示す。 ２，４ジニトロフェノール（ＤＮＰ）に対するモノクローナル抗体を、マウス をＤＮＰとチログロブリンとの共役体（ＤＮＰ−ＴＧ）で免疫化した後で定法に より調製した。この共役体は等しい重量のチログロブリンおよび２，４−ジニト ロベンゼンスルホン酸とを０．１５Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃溶液中で１８時間にわたって 反応させ、続いて０．００１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４に対し て完全に透析することにより調製された。 抗体（抗ＤＮＰ）は腹水液から所望ではないタンパク質をカプリル酸とともに 沈殿させ、続いて上清を０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４に対 して透析することによって精製した。 抗体の固定化のために、１０ｍｇのＰＭＰが０．１Ｍリン酸、ｐＨ７．４中の ６．２５％グルタールアルデヒドで２時間活性化された。過剰のグルタールアル デヒドを洗浄で除いた後、ＰＭＰを１ｍｌの抗体溶液（１．５ｍｌ／ｍｌまで希 釈）と混合し、一晩放置した。粒子を続いてリン酸バッファー中で数回洗浄し、 最後は１０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０． １５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）に再懸濁 させた。 ＤＮＰ−ＴＧ（上記のように調製）およびフルオレセインイソチオシアネート の牛血清アルブミンとの共役体（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより購入）をアクリジニウムエステル （ＡＥ）で以下のように標識した：１ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中の２ｍｇの共役体を、８０μｌのＡＥ（ジメチル ホルムアミド中で１ｍｇ／ｍｌ）と混合させ、１時間室温で保温した。混合物を 続いて、０．５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのＤＬリジン溶液に添加し、１５分間保温 した。標識された共役体は続いてセファデックスＧ２５の２０ｃｍのカラムでの ゲル濾過によって精製した。 ＤＮＰ−β−アラニンを以下のように調製した：１ｇのβアラニンを５０ｍｌ の１Ｍ ＮａＨＣＯ₃に溶解させた。７ｍｌの２，４−ジニトロフルオロベンゼ ン（ＤＮＦＢ）を１００ｍｌのエタノールに添加し、これをβアラニンを添加し て室温で２時間にわたって撹拌した。エタノールをロータリーエバポレーション により除去し、残存物を過剰のＤＮＦＢを除去するためにエーテル抽出した。通 常のＨＣｌを沈殿が生じるまで水性部分に添加した。後者は濾過により回収し、 エーテル洗浄し、風乾させた。この物質は２回再結晶された：第１回は水から１ Ｎ ＨＣｌの添加により、続いてＮａＨＣＯ₃／Ｎａ₂ＣＯ₃、ｐＨ＝９からで、 エーテル洗浄し、乾燥させた。 １００μｌの抗ＤＮＰ ＰＭＰ（１：３０にＰＢＳ／ＢＳＡにより希釈）を、 １００μｌのＡＥ−ＤＮＰ−ＴＧ（ＰＢＡ／ＢＳＡにより１：１５０００で希釈 ）または１００μｌのＡＥ−ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（ＰＢＡ／ＢＳＡで１：６０００ ０に希釈）の何れかと混合した。１時間後、各々の混合物の化学発光光放出を測 定し、抗ＤＮＰ ＰＭＰの不在下で同じ量の各々のＡＥ標識された共役体のそれ と比較した。ＡＥ−ＤＮＰ−ＴＧ共役体は、特異的抗ＤＮＰ抗体を有している粒 子によって光出力の５２％が抑制された。ＡＥ−ＦＩＴＣ−ＢＳＡ共役体はこの 抗体によって結合されないが、これに関しては光の２６％のみが粒子によって抑 制された。 これらのデータは、固相上での特異的結合反応複合体の形成において抑制が増 加されることを支持している。これらの発見は、標識されたトレーサーの与えら れた量からの、与えられた量の固相による光放出の抑制の量は同じであろうとい う期待に反するものである。実施例２ 以下の実施例は、実施例１に記載されたシステムへのＤＮＰ派生体（アクリジ ニウムエステルで標識されていない）の添加の効果を示している。 １００μｌの抗ＤＮＰ−ＰＭＰ（１：３０にＰＢＳ／ＢＳＡで希釈）を、５０ μｌのＡＥ−ＤＮＰ−ＴＧ（ＰＢＳ／ＢＳＡで１：７５００で希釈）および、５ ０から５００ｎｇ／ｍｌの濃度の５０μｌのＤＮＰ−β−アラニンとともに保温 した。１時間後、各々の混合物の化学発光を測定した。結果は下の表１に示され ており、図１にグラフで示されている。 データは、標識されていないＤＮＰ派生体の増加した濃度での添加は、光出力 の連続的な増加という結果となることを示している。この効果は、推定的には、 標識されていないＤＮＰが固定化された抗体の使用可能な結合サイトに関して競 合し、その結果、ＡＥ標識されたＤＮＰの粒子への結合の減少という結果となり 、かくして、化学発光光放出の抑制が減少したことによるものである。実施例３ テオフィリンおよび黄体形成ホルモン（ＬＨ）に対するモノクローナル抗体は 、マウスを８−カルボキシプロピルテオフィリン−チログロブリンおよびＬＨで それぞれ免疫化した後に標準的な技術により生産した。テオフィリンに対するポ リクローナル抗体は、ウサギを８−カルボキシプロピルテオフィリン−チログロ ブリンで免疫化して生産した。モノクローナルおよびポリクローナル抗体（抗Ｌ Ｈ）は、０．０１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中で活性化とカッ プリングが行われたことを除いては、上記の実施例１、２に記載されたように精 製した。粒子は最終的に２５ｍｇ／ｍｌに、ＰＢＳ／ＢＳＡバッファー中で再懸 濁した。テオフィリン標準は、テオフィリン（Ｓｉｇｍａ）のストック溶液を、 バッファーベースの標準にはＰＢＳ／ＢＳＡ中に、血清標準には薬を含まないヒ ト血清中に希釈することにより調製した。Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓから 得られたテオフィリンＲＩＡキット由来の標準もまた使用した。 テオフィリンモノクローナル抗体（ＴＨＥＯ）またはＬＨモノクローナル抗体 の何れかが固定化されたＰＭＰを、２．５ｍｇ／ｍｌから０．１５６ｍｇ／ｍｌ までＰＢＳ／ＢＳＡバッファーで順次希釈した。５００μｌのＰＭＰを試験管に 分散させ、粒子を磁気的に分離した後バッファーを除去し、１００μｌの水を添 加し、粒子を再懸濁した。ＰＢＳ／ＢＳＡ中に希釈したＡＥ−ＴＨＥＯ（０．４ ｍｉｌｌｉｏｎ ＲＬＵ／管）を各々の管に添加した。化学発光光放出を直ちに ＭＬＡ Ｉを用いて測定した。 抗テオフィリンＰＭＰおよび抗ＬＨＰＭＰとともにあるＡＥ−ＴＨＥＯの溶液 について観察されたＲＬＵ（変調シグナルの総計）を、ＰＭＰの不在下で測定さ れたＲＬＵ（抑制されない総計）と比較した。結果を以下のように、表２にまと める。 表２は図２中にグラフで示されているが、そこにおいて別々の線がαテオフィ リンＰＭＰおよびαＬＭＰＭＰを、標識されたものとして示している。表２およ び図２に示されたデータは、抗ＴＨＥＯ ＰＭＰが存在する場合に観察された抑 制％は、この範囲のＰＭＰ量では濃度とは比較的無関係と見られることを示して いる。これとは対照的に、粒子が「無関係な」抗体（抗ＬＨ）とカップリングさ れた場合には、粒子の量に関連した計数の抑制が観察された。実施例４ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍｅｔｐａｔｈ，Ｉｎｃ．）から 患者の試料が得られた。患者の試料のテオフィリンレベルを、市販のアッセイ、 ＴＤＸ テオフィリンアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａ ｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）を用いて測定した。 非分離テオフィリンアッセイを以下のように行った。標準、対照、または患者 の試料を、ＡＥ−テオフィリンおよびモノクローナル抗テオフィリンＰＭＰとと もに室温で１０分間保温した。化学発光をＭＬＡＩ中で、試験管をさらに操作す ることなく測定した。分析対象の濃度が低いと、ほとんどのトレーサーが固相に 結合し、フラッシュされず、そして計数は低くなる。分析対象の濃度が増加する につれて、より多くのトレーサーが結合せずに残り、より高いシグナルとなる。 試料標準曲線が図３に示されている。１２５の患者の試料のアッセイの結果が表 ４に示されれいる。市販のテオフィリンアッセイ（Ａｂｂｏｔｔから購入したＴ ＤＸアッセイ）を対照として用い、対照データは表４に示されている。 実施例５−７ ハイブリダイゼーションアッセイ 実施例５−７に記載されているハイブリダイゼーションアッセイに用いられた 核酸配列は、ここにおいて配列表中に提供されているが、そこにおいては以下の 略語がハイブリダイゼーションアッセイの表示において用いられている：アデニ ン（Ａ）；チミン（Ｔ）；ウラシル（Ｕ）；グアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ）。 ＰＭ９７９：配列番号１として示され、塩基１−１０はスペーサーアームを構 成し、塩基１１−４６はナノ変異体（＋）テンプレートの５’配列から成り、塩 基４７−７０はサルモネラ特異的標的配列に相補的である。 ＭＡＳＡ５：配列番号２として示され、塩基１−１０はスペーサーアームを構 成し、塩基１１−７１はミディ変異体（＋）テンプレートの５’配列から成り、 塩基７２−９５はサルモネラ特異的標的配列に相補的である。 ＰＭ１０７６：配列番号３として示され、ＰＭ９７９およびＭＡＳＡ５に相補 的なサルモネラ標的の半分が用いられた。 ＰＭ２０５８：配列番号４として示され、ＰＭ９７９およびＭＡＳＡ５に相補 的なサルモネラ標的が用いられた。この配列のいくつかのバージョンは、ここに 記載されているように、アクリジニウムエステルとの結合のための５’アミノ基 を有している。 ＳＡ７：抗サルモネラ標的、配列番号５として示されている。 ＭＤ２４：配列番号６として示され、ミディ変異体（＋）テンプレートの塩基 ３４−５７；すなわちＭＡＳＡ５の塩基４４−６７に相補的なプローブが用いら れている。この配列のいくつかのバージョンは、ここに記載されているように、 アクリジニウムエステルとの結合のための５’アミノ基を有している。 ＭＤＶ−ＳＡ２ ＲＮＡ転写：配列番号７として示され、塩基１−６１はミデ ィ変異体（＋）テンプレートの５’末端から成り、塩基６２−６９および１１８ −１２３はプラスミドリンカー配列であり、塩基７０−１１７はサルモネラ特異 的標的配列に相補的であり、塩基１２４−２８２はミディ変異体（＋）テンプレ ートの３’末端から成る。 固相は、それ自身に増幅オリゴマープローブの１つが共有結合的に取り付けら れたＰＭＰから成る（ＰＭ９７９については異種二重機能的カップリング試薬を 用いて５’末端アミノ基を介して、またはＭＡＳＡ５についてはＰＭＰのグルタ ールアルデヒド活性化による）。ＡＥ−ＰＭ１０７６および５’³²Ｐ−ＰＭ２０ ５８配列は、固定化されたプローブの抗標的部分に相補的である（それ故、ハイ ブリダイゼーションと捕捉が同時に起こる）。ＰＭＰ９７９−ＰＭＰを、ＰＭ９ ７９オリゴマー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手 ）およびチオ終結ＰＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒ ｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて調製した。ＡＥ標識されたＰＭ１０７６（ＡＥオリゴ マー）は、ジメチルアクリジニウムエステル標識、および、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ ｏｒｐ．より入手したＰＭ１０７６オリゴマーを用いて調製した。ＭＡＳＡ５− ＰＭＰは、ＭＡＳＡ５オリゴマー（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．より入手）およ びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓより購入したチオ終結ＰＭＰを用いて 調製した。ＰＭ２０５８オリゴマーもまた、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．より入 手した。クエン酸ナトリウムはＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌ ｏｕｉｓ，ＭＯより購入した。ＮａＣｌ、トリスＥＤＴＡおよびＴｗｅｅｎ２０ は全てＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより、 ＢＳＡ（画分Ｖ）はＭｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．より購入した。実施例５ この実施例は、オリゴマー−ＰＭＰとのハイブリダイゼーションによるＡＥ− オリゴマー化学発光の抑制を示す。 ＰＭＰ上に固定化されたＰＭＰ９７９（ＰＭ９７９−ＰＭＰ）、およびＡＥ− ＰＭ１０７６（ＡＥ−オリゴマー）を含むハイブリダイゼーション反応を、４０ μｌの６０ｍＭクエン酸ナトリウム、６００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリ ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ、１ｍＭエチレンジア ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡＮおよび０．０２％（Ｖ／ Ｖ）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０） 、ｐＨ７．５（これ以降バッファー）を、１０本の試験管に添加することにより 氷上で開始した。次に、５０μｇのＰＭ９７９−ＰＭＰを含む５μｌのバッファ ーを１０本の試験管のうちの５本に添加し、５μｌのバッファーのみを残ってい る ５本の試験管に対照反応のために添加した。最後に、１０、３２、１００、３２ ０、および１０００フェントモル（１ｆｍｏｌ＝１ｘ１０^-15モル）のＡＥ−Ｐ Ｍ１０７６を含む５μｌのバッファーを、１つのＰＭＰを含むグループと、ＰＭ Ｐのない１つの対照グループ（ハイブリダイゼーションの間のＡＥ分解に関して の対照）との試験管の組に添加した。全ての反応物は５６℃で保温され、０、７ ５、１２０および１８０分で５μｌの試料を除去し、１００μｌの水に添加し、 試薬１および２でルミノメーター中でフラッシュさせ、化学発光活性を決定した 。 ％抑制を、様々な試験管から測定されたシグナルから計算し、図４に示した。 図４に示されているように、オリゴマーＰＭＰを含む全ての反応物の化学発光は 、オリゴマーＰＭＰを含まない対応する対照と比較して、最大７４％まで、ハイ ブリダイゼーションに際して劇的に減少していた。また、データは、ＡＥ−オリ ゴマーの相対投入量とオリゴマーＰＭＰが顕著な抑制を生じさせた条件を示して いる。１００ｆｍｏｌのＡＥオリゴマーの投人量を有し、固相の容量が投入ＡＥ −オリゴマーの５倍である反応条件を、実施例６の競合アッセイの適性を試験す るために選択した。実施例６ ハイブリダイゼーション反応は、氷上で、１０μｌのバッファー（実施例５に 記載）のみ、または１００μｇのＰＭ９７９−ＰＭＰを含む１０μｌのバッファ ーを、５本の試験管のそれぞれに添加することにより開始した。続いて、０，１ ０^-14、１０^-13、１０^-12、および１０^-11モルの標準ＰＭ９７９（ＰＭＰ上に固 定化されたオリゴマー）を含む１０μｌのバッファーを、ＰＭ９７９−ＰＭＰを 含む試験管の１つに、および、添加された標準のそれぞれの量についての１つの ＰＭＰを含まない対照に添加した。最後に、２００ｆｍｏｌのＡＥ−ＰＭ１０７ ６を含む８０μｌのバッファーを、全ての反応物に添加した。全ての試験管は５ ６℃で保温した。二重の１０μｌの試料を、それぞれの反応物から保温時間（０ 、２０、４０、６０分）で除去し、１００μｌの水に添加し、ルミノメーター中 で処理し、化学発光活性を決定した。結果を表４（図５）および５に示す。表５ は表４からの２０分のデータから派生されたデータを示している。示されている 結果は理論上の期待、すなわち、溶液中のＰＭＰ９７９の投入量が固相容量 を超えている場合を除いて、全てのハイブリダイゼーションにおいて同じ最大量 の抑制が達成されたことと一致していた。 上記のデータによって示されているように、この実施例は、合成ＤＮＡオリゴ マーについてのハイブリダイゼーション競合アッセイを示している。ＰＭＰ上に 固定化されたものと同じオリゴマーの量を変化させて、固相上に固定化されたオ リゴマーと、ＡＥ−オリゴマーのハイブリダイゼーションに関して競合するため に溶液中に添加した。すなわち、添加されたオリゴマーが競合的標準として機能 した。これは、実施例７の提案されたアッセイにおいて、増幅されたプローブの 存在により行われるであろう競合を模倣している。実施例７ ０、１０^-16、１０^-18、１０^-19、および１０^-20モルのミディ変異体テンプレ ートとともに開始された増幅反応は、それぞれ、ＥＤＴＡの添加により終結され 、氷上に置かれた。 ハイブリダイゼーション反応は、氷上で、５、２０、７０、または７５μｌの バッファーを、１２本の試験管に、他の全ての成分を添加した後の最終容積が１ ００μｌとなるよう、上記のように添加することにより開始された。次に５μｇ のＰＭ９７９−ＰＭＰを含有する５０μｌのバッファーを６本の試験管に添加し た。続いて５μｌのバッファー、または５つの複製反応物の１つ、の何れかを、 １つはＰＭＰを含み、１つはＰＭＰを含まない試験管の組に添加した。最後に、 １０ｆｍｏｌのＡＥ−ＭＤ２４を含む２５μｌのバッファーを、全ての試験管に 添加した。全ての試験管を２０分間５６℃で保温し、続いてルミノメーター中で 試薬１および２でフラッシュし、化学発光活性を決定した。 表６に示されている結果は、十分量の複製されたミディ変異体ＲＮＡの存在（ 反応毎に５ｐｍｏｌのオーダーであると見積もられている）を反映してはいなか った。ミディ変異体配列の存在の検出するためのアッセイの失敗は、試薬の品質 によるものではない。なぜなら、試薬は、合成標的との模擬アッセイおよび滴定 によって実証されているのである。付加的な試みとしては、ＡＥ−オリゴマーの 増加された投入および添加に先だっての標的の熱変性を伴うと、同じく失敗した 。³²Ｐ−標識されたＭＤ２４を用いた引き続いての実験は、失敗はプローブの標 的への不十分なハイブリダイゼーションによるもの、推定的には、ミディ変異体 の複式の高度な安定性によるものであることを示唆している。この仮説は、転写 された１本鎖ミディ変異体標的に関する抑制アッセイの結果であって、標的およ びＡＥ−プローブのモル比についての理論上の期待と一致する抑制値を有する標 準曲線をもたらした結果により支持されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 キャロル，エディー サード アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02154 ウォルサム エディー ストリー ト 24 (72)発明者 コノリー，ジョセフ イー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02026 デッドハム ドゥワイト ストリ ート 51 (72)発明者 リー，マイケル ジェイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01770 シャーボーン ラセット ヒル ロード 56 (72)発明者 マーティネリ，リチャード エイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02135 ブライトン キルサイス ロード 71 アパートメント ６ (72)発明者 アンガー，ジョン ティー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02052 メッドフィールド ウィチタ ロ ード 29

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．分析対象の存在を検出または定量するための非分離特異的結合アッセイであ って、該アッセイが： (a) それ自身に結合共役体が結合された固相、およびアクリジニウムまたはベ ンズアクリジニウムエステルで標識された結合共役体を含むトレーサーと、試料 とを接触させ； (b) 前記固相、トレーサーおよび試料を反応させ、前記固相に取り付けられた 特異的結合複合体および固相に結合していないフリー画分を含む反応混合物を形 成し； (c) 前記反応混合物を、前記アクリジニウムエステルトレーサーをフラッシュ し変調された化学発光シグナルを提供するための活性化剤と接触させ、 (d) 前記変調シグナルを測定し；そして (e) 前記変調シグナルを、前記試料中の前記分析対象の量または存在を決定す るために参照と関連づける 各工程を含むことを特徴とするアッセイ。 ２．前記特異的結合複合体が免疫的反応により形成されることを特徴とする請求 の範囲第１項記載のアッセイ。 ３．前記金属酸化物固相が鉄酸化物を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記 載のアッセイ。 ４．前記活性化剤が、酸性過酸化水素の水性溶液を含む第１の試薬および塩基性 水溶液を含む第２の試薬を含み、前記第１の試薬が第２の試薬に先立って前記反 応混合物と接触されることを特徴とする請求の範囲第３項記載のアッセイ。 ５．前記第１の試薬が、硝酸、塩酸、硫酸およびそれらの混合物から成る群から 選択された酸性成分を有し、前記第２の試薬が、水酸化ナトリウム、水酸化カリ ウム、水酸化リチウム、およびそれらの混合物から成る群から選択された塩基を 有することを特徴とする請求の範囲第４項記載のアッセイ。 ６．前記第１の試薬中で、前記酸が約０．１Ｎから約０．５Ｎの範囲の量で、水 性の第１の溶液全体の量に基づいて約０．１％から約１０％（Ｖ／Ｖ）の範囲 の量で存在する過酸化水素の水性溶液中に存在し、前記第２の試薬中で、前記塩 基が水性溶液中で、約０．２５Ｎから約１．２５Ｎの範囲の濃度で存在すること を特徴とする請求の範囲第５項記載のアッセイ。 ７．前記第１の試薬が０．５％から１％の過酸化水素中に０．１Ｎの硝酸の水性 溶液を含み、前記第２の試薬が０．２５Ｎ水酸化ナトリウムの水性溶液および水 性の第２の試薬全体の量に基づいて約０．１％から約１％（Ｖ／Ｖ）の範囲の量 で存在する界面活性剤を含むことを特徴とする請求の範囲第６項記載のアッセイ 。 ８．前記分析対象が、テオフィリンまたはジニトロフェノールタンパク質から成 る群より選択されたことを特徴とする請求の範囲第７項記載のアッセイ。 ９．前記アッセイがハイブリダイゼーションアッセイであり前記特異的結合複合 体が相補的結合によって形成されることを特徴とする請求の範囲第１項記載のア ッセイ。 10．前記金属酸化物固相が、鉄酸化物を含むことを特徴とする請求の範囲第９項 記載のアッセイ。 11．前記活性化剤が、酸性過酸化水素の水性溶液を含む第１の試薬および塩基性 水溶液を含む第２の試薬を含み、前記第１の試薬が第２の試薬に先立って前記反 応混合物と接触されることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のアッセイ。 12．前記第１の試薬が、硝酸、塩酸、硫酸およびそれらの混合物から成る群から 選択された酸性成分を有し、前記第２の試薬が、水酸化ナトリウム、水酸化カリ ウム、水酸化リチウム、およびそれらの混合物から成る群から選択された塩基を 有することを特徴とする請求の範囲第１１項記載のアッセイ。 13．前記第１の試薬中で、前記酸が約０．１Ｎから約０．５Ｎの範囲の量で、水 性の第１の溶液全体の量に基づいて約０．１％から約１０％（Ｖ／Ｖ）の範囲の 量で存在する過酸化水素の水性溶液中に存在し、前記第２の試薬中で、前記塩基 が水性溶液中で、約０．２５Ｎから約１．２５Ｎの範囲の濃度で存在することを 特徴とする請求の範囲第１２項記載のアッセイ。 14．前記第１の試薬が０．５％から１％（Ｖ／Ｖ）の過酸化水素中に０．１Ｎの 硝酸を含み、前記第２の試薬が０．２５Ｎ水酸化ナトリウムの水性溶液および 水性の第２の試薬全体の量に基づいて約０．１％から約１％（Ｖ／Ｖ）の範囲の 量で存在する界面活性剤を含むことを特徴とする請求の範囲第１３項記載のアッ セイ。 15．前記結合反応が免疫的であり、前記分析対象がテオフィリンまたはジニトロ フェノールタンパク質から成る群より選択されたことを特徴とする請求の範囲第 １項記載のアッセイ。 16．前記結合反応が相補的結合であり、前記分析対象が腸内病原体であることを 特徴とする請求の範囲第１項記載のアッセイ。 17．試料中の分析対象を検出または定量するための請求の範囲第１項記載の非分 離特異的結合アッセイであって、前記アッセイが、言及された順序で、 (a) 試料；前記分析対象に特異的な結合パートナーに連結された金属酸化物を 含む固相；および、自身に取り付けられたアクリジニウムまたはベンズアクリジ ニウムエステルを有する前記分析対象または分析対象アナログを含むトレーサー ；を含む溶液を保温し； (b) 前記溶液を反応させ、前記固相に結合した前記トレーサーを含む特異的結 合複合体、および反応しなかったトレーサーを含むフリー画分を含む反応混合物 を形成させ； (c) 前記反応混合物を、酸性過酸化水素溶液を含む第１の活性化試薬と接触さ せ； (d) 前記段階（ｃ）の混合物を、変調化学発光シグナルを提供するために塩基 性水性溶液を含む第２の活性化試薬と接触させ； (e) 前記変調化学発光シグナルを測定し； (f) 前記試料中の前記分析対象の量または存在を決定するために前記変調シグ ナルと参照とを関連づける 各工程を含むことを特徴とするアッセイ。 18．前記段階（ａ）のトレーサーの量が、抑制されないシグナル計数測定という 結果となる、固相の不在下で測定される化学発光光放出を放出するために別途活 性化され、％抑制効果が前記段階（ｅ）の前記変調シグナルおよび前記抑制され ないシグナル計数を用いて、等式： ％抑制＝[１−(変調シグナル計数／抑制されないシグナル計数)]ｘ100％ により計算され、そして前記％抑制効果が前記段階（ｆ）の参照と関連づけら れ、前記分析対象の存在または量の決定が提供されることを特徴とする請求の範 囲第１７項記載のアッセイ。 19．前記第１の試薬が０．５％から１％の過酸化水素中に０．１Ｎの硝酸の水性 溶液を含み、前記第２の試薬が０．２５Ｎ水酸化ナトリウムの水性溶液および水 性の第２の試薬全体の量に基づいて約０．１％から約１％（Ｖ／Ｖ）の範囲の量 で存在する界面活性剤を含むことを特徴とする請求の範囲第１８項記載のアッセ イ。 20．試料中の分析対象を検出または定量するための請求の範囲第１項記載の非分 離特異的結合アッセイであって、前記アッセイが、言及された順序で： (a) 試料；前記分析対象または前記分析対象に特異的な分析対象アナログに連 結された金属酸化物を含む固相；および、自身に取り付けられたアクリジニウム またはベンズアクリジニウムエステルを有する前記分析対象または分析対象アナ ログの特異的結合パートナーを含むトレーサー；を含む溶液を保温し； (b) 前記溶液を反応させ、前記固相に結合した前記トレーサーを含む特異的結 合複合体、および反応しなかったトレーサーを含むフリー画分を含む反応混合物 を形成させ； (c) 前記反応混合物を、酸性過酸化水素溶液を含む第１の活性化試薬と接触さ せ； (d) 前記段階（ｃ）の混合物を、変調化学発光シグナルを提供するために塩基 性水性溶液を含む第２の活性化試薬と接触させ； (e) 前記変調化学発光シグナルを測定し； (f) 前記試料中の前記分析対象の量または存在を決定するために前記変調シグ ナルと参照とを関連づける 各工程を含むことを特徴とするアッセイ。 21．前記段階（ａ）のトレーサーの量が、抑制されないシグナル計数測定という 結果となる、固相の不在下で測定される化学発光光放出を放出するために別に 活性化され、％抑制効果が前記段階（ｅ）の前記変調シグナルを用いて計算され 、等式： ％抑制＝[１−(変調シグナル計数／抑制されないシグナル計数)]x100％ により計算され、そして前記％抑制効果が前記段階（ｆ）の参照と関連づけら れ、前記分析対象の存在が提供されることを特徴とする請求の範囲第２０項記載 のアッセイ。 22．前記第１の試薬が０．５％から１％の過酸化水素中に０．１Ｎの硝酸の水性 溶液を含み、前記第２の試薬が０．２５Ｎ水酸化ナトリウムの水性溶液および水 性の第２の試薬全体の量に基づいて約０．１％から約１％（Ｖ／Ｖ）の範囲の量 で存在する界面活性剤を含むことを特徴とする請求の範囲第２１項記載のアッセ イ。 23．試料中の分析対象を検出または定量するための請求の範囲第１項記載の非分 離特異的結合アッセイであって、前記アッセイが、言及された順序で、 (a) 試料；前記分析対象に特異的な第１の結合パートナーに連結された金属酸 化物を含む固相；および、自身に取り付けられたアクリジニウムまたはベンズア クリジニウムエステルを有する前記分析対象の第２の結合パートナーを含むトレ ーサー；ここにおいて前記第１および第２の結合パートナーは同じでも異なって いても良い、を含む溶液を保温し； (b) 前記溶液を反応させ、前記固相に結合した前記分析対象に結合した前記ト レーサーを含む特異的結合複合体、および反応しなかったトレーサーを含むフリ ー画分を含む反応混合物を形成させ； (c) 前記反応混合物を、酸性過酸化水素溶液を含む第１の活性化試薬と接触さ せ； (d) 前記段階（ｃ）の混合物を、変調化学発光シグナルを提供するために塩基 性水性溶液を含む第２の活性化試薬と接触させ； (e) 前記変調化学発光シグナルを測定し； (f) 前記試料中の前記分析対象の量または存在を決定するために前記変調シグ ナルと参照とを関連づける 各工程を含むことを特徴とするアッセイ。 24．前記段階（ａ）のトレーサーの量が、抑制されないシグナル計数測定という 結果となる、固相の不在下で測定される化学発光光放出を放出するために別に活 性化され、％抑制効果が前記段階（ｅ）の前記変調シグナルおよび前記抑制され ないシグナル計数を用いて、等式： ％抑制＝[１−(変調シグナル計数／抑制されないシグナル計数)]x100％ により計算され、そして前記％抑制効果が前記段階（ｆ）の参照と関連づけら れ、前記分析対象の量または存在の決定が提供されることを特徴とする請求の範 囲第２３項記載のアッセイ。 25．前記第１の試薬が０．５％から１％の過酸化水素中に０．１Ｎの硝酸の水性 溶液を含み、前記第２の試薬が０．２５Ｎ水酸化ナトリウムの水性溶液および水 性の第２の試薬全体の量に基づいて約０．１％から約１％（Ｖ／Ｖ）の範囲にあ る量で存在する界面活性剤を含むことを特徴とする請求の範囲第２４項記載のア ッセイ。 26．試料中の分析対象の検出または定量のための非分離アッセイに用いられる診 断キットであって、前記アッセイが分析対象の存在の検出または定量のための非 分離特異的結合アッセイであって、前記キットが： (a)結合共役体がそれ自身に取り付けられている金属酸化物を含む固相、およ び、アクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステルで標識された結合共役 体を含むトレーサー； (b) 前記アクリジニウムエステルトレーサーをフラッシュさせるための活性化 剤；および (c) 付加的には標準または参照または両方 を含んでいることを特徴とする診断キット。