JPS5813517A - カブトガニのアメボサイト・ライゼ−ト中に存在する凝固系阻害因子 - Google Patents
カブトガニのアメボサイト・ライゼ−ト中に存在する凝固系阻害因子Info
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- JPS5813517A JPS5813517A JP56113317A JP11331781A JPS5813517A JP S5813517 A JPS5813517 A JP S5813517A JP 56113317 A JP56113317 A JP 56113317A JP 11331781 A JP11331781 A JP 11331781A JP S5813517 A JPS5813517 A JP S5813517A
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発ｖ４＃ｉ、カブトガニの嵐りシバ液よシ取得される
アメボナイトの抽出液（アメボサイトーライゼート）の
エントドキシｙＫよる血りンパＩ［＃Ｉ！■畢を鳳書す
る因子（＃１ｉｌｌ書因子）及びそれを採取する方法Ｋ
ＩＩＬ、、さらに絆しくは、アメボナイト・ライゼート
中に存在する、ニジトド中シンのアメボサイトｅライゼ
ートを凝固せしめる能力及び／又鉱アメボすイト・ライ
ゼートに作用してライゼート中の凝固系酵素を活性化す
る能力を阻害する因子（ａ園阻害因子）韮びにその凝固
阻害因子を採取して除去することによりエントド苧シン
に対するアメボナイト・ライゼー）０感受性及び反応性
ｔｌｌ＆める方法Ｋｌｌするものである。
アメボナイトの抽出液（アメボサイトーライゼート）の
エントドキシｙＫよる血りンパＩ［＃Ｉ！■畢を鳳書す
る因子（＃１ｉｌｌ書因子）及びそれを採取する方法Ｋ
ＩＩＬ、、さらに絆しくは、アメボナイト・ライゼート
中に存在する、ニジトド中シンのアメボサイトｅライゼ
ートを凝固せしめる能力及び／又鉱アメボすイト・ライ
ゼートに作用してライゼート中の凝固系酵素を活性化す
る能力を阻害する因子（ａ園阻害因子）韮びにその凝固
阻害因子を採取して除去することによりエントド苧シン
に対するアメボナイト・ライゼー）０感受性及び反応性
ｔｌｌ＆める方法Ｋｌｌするものである。
カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ”ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ
。
。
Ｔａｃｈｙｐｌ＠ｕｓ ｔｒｉｄｅｎｔコ’ｊｕｓ 、
、ＴｌｇｉＲａｓ 勢）ｏｈリンパＩＮＫ存在するア
メボサイ）Ｋ対するダラム陰性曹の表層物質憐エントド
キシ７（１３ポポリすツカライド）ｌの作用にょ夛起ゐ
血すシバ液の凝固現象を応用したアメボサイト・ライゼ
ート管用いるいわゆるーリムルステストーはニジトド會
シンの特異的検出法として開管た動物を用いるパイロジ
エンテストの代用として医学類学の領域に広く利用され
ている。しかしアメぽナイト・ライゼートのエントド中
シンによるゲル化現象を基にした「リムルステスト」は
１それが商業的規模で実用化される九めは多くの問題点
管含んでいる。そ０ｖｌＪｉ１点の中でも’ＩＫＩＩＩ
ものは、安定し九毅固現象を起こす喪めにライゼート中
のゲル化蛋白量を−ｔ’にすること、及び、ゲル化を阻
害する因子を除去することであ′）た。ライゼート中の
ゲル化蛋白量中ゲル化阻害因子の量は、カブトガニの生
息皐境や季節的因子によｐ変動するものであ）、これら
をコントロールできないかぎり、アメボｔ、：１ イ）−ライゼート、の商品としての定量性に関して、信
執性が低いと−う問題点を有している。
、ＴｌｇｉＲａｓ 勢）ｏｈリンパＩＮＫ存在するア
メボサイ）Ｋ対するダラム陰性曹の表層物質憐エントド
キシ７（１３ポポリすツカライド）ｌの作用にょ夛起ゐ
血すシバ液の凝固現象を応用したアメボサイト・ライゼ
ート管用いるいわゆるーリムルステストーはニジトド會
シンの特異的検出法として開管た動物を用いるパイロジ
エンテストの代用として医学類学の領域に広く利用され
ている。しかしアメぽナイト・ライゼートのエントド中
シンによるゲル化現象を基にした「リムルステスト」は
１それが商業的規模で実用化される九めは多くの問題点
管含んでいる。そ０ｖｌＪｉ１点の中でも’ＩＫＩＩＩ
ものは、安定し九毅固現象を起こす喪めにライゼート中
のゲル化蛋白量を−ｔ’にすること、及び、ゲル化を阻
害する因子を除去することであ′）た。ライゼート中の
ゲル化蛋白量中ゲル化阻害因子の量は、カブトガニの生
息皐境や季節的因子によｐ変動するものであ）、これら
をコントロールできないかぎり、アメボｔ、：１ イ）−ライゼート、の商品としての定量性に関して、信
執性が低いと−う問題点を有している。
本発Ｗｊ４１ｉらは、先にこれらライ（−トのａｎｉ機
榊の解−を行い合成基質を用いるエンド）苧ｖｙｔｖａ
ｓ度定量法を開示Ｌ（咎１１１８５４−１５７９７号）
％さらＫは、＃固機転に関与する因子について報告して
来良 （Ｐ會ｂ ｓ ＊ しｓｔｔ＠ｒｓ。
榊の解−を行い合成基質を用いるエンド）苧ｖｙｔｖａ
ｓ度定量法を開示Ｌ（咎１１１８５４−１５７９７号）
％さらＫは、＃固機転に関与する因子について報告して
来良 （Ｐ會ｂ ｓ ＊ しｓｔｔ＠ｒｓ。
１１！Ｏ，１に？（口１１１０ ）、８． Ｉｗａｎａ
ｇａ ＠ｔ ａｔ ）。
ｇａ ＠ｔ ａｔ ）。
これらＯ検討からゲル化現象によらず、ライセード中に
存在するエントドキシνに依存スる酵素活性をその特異
的合成基質を用いて調定することにより高感度且つ定量
性Ｏ高い工ｙトド會シンＯ検ａＳ橢定法を提供して来良
。しかしながら、この方法は、通常の二ｙトド中シ／量
の關定域でＦｉ組書因子の存′４ＥＫよる影響はそれほ
ど受けな−ものの極微量のエントド中シｙ量の測定時に
％阻害因子がエントドキシｙの作用を１覆することから
、基本的にライゼート中Ｋｌｉ書因子が存在し′＆一方
が好ましいことは明白である。＠害因子の概ｔＫついて
は、その存在は□支持されてはおシ、その事態及びその
作用機転につｗて、＃ ｊｌｌ ｅｌｌ ［Ｎａｃｈｕ
ｍ ｌ ｅ ｔ ａｌ ＊ Ｊ、１ｎ’ｌ。
存在するエントドキシνに依存スる酵素活性をその特異
的合成基質を用いて調定することにより高感度且つ定量
性Ｏ高い工ｙトド會シンＯ検ａＳ橢定法を提供して来良
。しかしながら、この方法は、通常の二ｙトド中シ／量
の關定域でＦｉ組書因子の存′４ＥＫよる影響はそれほ
ど受けな−ものの極微量のエントド中シｙ量の測定時に
％阻害因子がエントドキシｙの作用を１覆することから
、基本的にライゼート中Ｋｌｉ書因子が存在し′＆一方
が好ましいことは明白である。＠害因子の概ｔＫついて
は、その存在は□支持されてはおシ、その事態及びその
作用機転につｗて、＃ ｊｌｌ ｅｌｌ ［Ｎａｃｈｕ
ｍ ｌ ｅ ｔ ａｌ ＊ Ｊ、１ｎ’ｌ。
Ｐ ａ ｔ ｂｏ 、 ｅ 見ＬＳ ｌ （１９７８）
）中、エントド中シン結合性リポタンパク説（８ｕｌ
ｌｉｖａｎ ｅｔ ａｔ、。
）中、エントド中シン結合性リポタンパク説（８ｕｌ
ｌｉｖａｎ ｅｔ ａｔ、。
Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏ″ｂｉｏｌ、、 ｚｓ、ｌｏｇ
ｓ （１Ｇ？４） ）等が提出されてきたがゲル化現象
に対するｗ＆―のみで充分明確にされているとは考えら
れない。
ｓ （１Ｇ？４） ）等が提出されてきたがゲル化現象
に対するｗ＆―のみで充分明確にされているとは考えら
れない。
一方、アメボナイト・ライゼート中から阻害因子を除去
する方法が検討されてき喪（米−費許第４，１０７．０
７７号、８ｕｌｌｉｖａａ、ｅｔａｌ及び特開昭５６−
４２５９０−１、？−ル１１／９−１６１ラウνら）、
前者はライゼートを有機溶媒を用いて振−し蛋白変性せ
しめることにより阻害現象を除去する方法であシ、後者
はライ（−量中のｓｗｕｍ素に影響を与えない程度のア
ルカリ領域のｐＨＫて阻害因子を失活せしめた彼に、凝
固酵素Ｏ作用域Ｏ’ｐＨに戻すことを特徴としている。
する方法が検討されてき喪（米−費許第４，１０７．０
７７号、８ｕｌｌｉｖａａ、ｅｔａｌ及び特開昭５６−
４２５９０−１、？−ル１１／９−１６１ラウνら）、
前者はライゼートを有機溶媒を用いて振−し蛋白変性せ
しめることにより阻害現象を除去する方法であシ、後者
はライ（−量中のｓｗｕｍ素に影響を与えない程度のア
ルカリ領域のｐＨＫて阻害因子を失活せしめた彼に、凝
固酵素Ｏ作用域Ｏ’ｐＨに戻すことを特徴としている。
これらの方法はいずれもライ（−Ｆ中Ｏエンド°ト呼シ
ン感受性因子勢に影響を与えるという欠点を有する。
ン感受性因子勢に影響を与えるという欠点を有する。
本発−者らはライゼート中の凝固系因子の作用機作の研
究の過柵でエントドキシνによる凝固系因子の存在並び
Ｋその阻害因子の分ｌＩを細めて行い今回本発明に到達
した。すなわちヘパリｙ・アガー−スを用いる％異的吸
着担体を用いてライイード中０凝固系因子と、阻害因子
を黴着せしめ、１，０Ｍ以下のイオン強度を有する塩―
淑、針管しくは、Ｎ＊Ｃ１溶液を用いて、主として、凝
ｍ系因子を脱着せしめ、次いで１．。
究の過柵でエントドキシνによる凝固系因子の存在並び
Ｋその阻害因子の分ｌＩを細めて行い今回本発明に到達
した。すなわちヘパリｙ・アガー−スを用いる％異的吸
着担体を用いてライイード中０凝固系因子と、阻害因子
を黴着せしめ、１，０Ｍ以下のイオン強度を有する塩―
淑、針管しくは、Ｎ＊Ｃ１溶液を用いて、主として、凝
ｍ系因子を脱着せしめ、次いで１．。
Ｍ以上のイオン侭度を有する塩溶液、好ましくは、Ｎ＊
Ｃｌ＠液を用−て溶出せしめ阻害因子を主成分とする一
分を得る。この画分をセファロー−架橋層ファト罎セフ
ァチック罎セ ファクリＪり（以上ファルマシア社製）等の商標名で知
られるアガロース、架橋アガロース、条横デ牟ストラン
ゲル、架橋アクリルアずドゲルのような分子−剤を用い
て再りａマドグラフィーを行うとき又は前記分子篩剤を
用いてライゼートを７１１ｍ１７ｇマドグラフィーに付
すときシフｓｆ＃Ｊ）ｌＪｙ（分子量： １１００−９
００ ）乃至ＮａＣ／ （分子量＝５８）の溶出位置に
溶出される一分は、アメボナイト・ライ（−ト並びＫｌ
ライ（−ト中に存在するエントド中シン感受性因子中エ
ントド中シン感受性因子及び＃！■ｌｌｐ素前累系を強
力Ｋｌｉ害し、アルカリ処理、プａナー（類、α−命篭
トリ１シン勢の＃素処理で完全に失活する。このことか
らこの阻害因子は工ｙトド中シンによるアメボナイト・
ライゼート基びに該ライゼート中のａｗＡ系因子の活性
化を強力に阻害すること、及びこの阻害因子をライイー
ドから本発明の緩やかな手法によシ除去することによシ
よｐ４感度且つ安定なアメボサイト・ライゼートを得る
ことが出来る。
Ｃｌ＠液を用−て溶出せしめ阻害因子を主成分とする一
分を得る。この画分をセファロー−架橋層ファト罎セフ
ァチック罎セ ファクリＪり（以上ファルマシア社製）等の商標名で知
られるアガロース、架橋アガロース、条横デ牟ストラン
ゲル、架橋アクリルアずドゲルのような分子−剤を用い
て再りａマドグラフィーを行うとき又は前記分子篩剤を
用いてライゼートを７１１ｍ１７ｇマドグラフィーに付
すときシフｓｆ＃Ｊ）ｌＪｙ（分子量： １１００−９
００ ）乃至ＮａＣ／ （分子量＝５８）の溶出位置に
溶出される一分は、アメボナイト・ライ（−ト並びＫｌ
ライ（−ト中に存在するエントド中シン感受性因子中エ
ントド中シン感受性因子及び＃！■ｌｌｐ素前累系を強
力Ｋｌｉ害し、アルカリ処理、プａナー（類、α−命篭
トリ１シン勢の＃素処理で完全に失活する。このことか
らこの阻害因子は工ｙトド中シンによるアメボナイト・
ライゼート基びに該ライゼート中のａｗＡ系因子の活性
化を強力に阻害すること、及びこの阻害因子をライイー
ドから本発明の緩やかな手法によシ除去することによシ
よｐ４感度且つ安定なアメボサイト・ライゼートを得る
ことが出来る。
以下、本発明を、関刺例及び実施例によってさらに詳し
く説明する。
く説明する。
ＩＩＩ製例
１）基質と担体 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ
Ｎム・ＨＣＪは、生化学工業（株）よｐ購入した。ヘバ
リン−アガａ ７’Ｊスはセファ１−ス（８＠ｐｈａ−
ｒｏｓｅ ） ｅ ＣＬ−＠Ｂ’（ファルマシア社）を
用鱒、マルタ（ｍａｒｃｋ）らの方法で調製し、２０分
関オートタレーグして用い九〇 Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｔｒムｄｅｎｔａｔｕｓ ）
より既決に従い採血し、得られた血球Ｉ ０００５Ｍ
）リス−塩＠ （Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ ） １ｌｌｉ液（
ｐＨ７，ｚ ）を用いて、ｔＸオド關りでホ峰ゲナイズ
し、８０００ ｒｐｍ 、 ３０分間遠心俵、その上清
を用いた・ ３）活性一定法 クロマト後の会画分の酵素活性および
台因子の活性は、３７℃の秦件下で下記の方法に従って
一定し良、なお、酵素活性はすべて見分間Ｋｌｊｍｏｌ
・のパラニトーアエリ７（ｐ−＋ａｉｔｒｏａｎ目ゑｎ
ｅ）を遊離する酵素量を１単位とした。
Ｎム・ＨＣＪは、生化学工業（株）よｐ購入した。ヘバ
リン−アガａ ７’Ｊスはセファ１−ス（８＠ｐｈａ−
ｒｏｓｅ ） ｅ ＣＬ−＠Ｂ’（ファルマシア社）を
用鱒、マルタ（ｍａｒｃｋ）らの方法で調製し、２０分
関オートタレーグして用い九〇 Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｔｒムｄｅｎｔａｔｕｓ ）
より既決に従い採血し、得られた血球Ｉ ０００５Ｍ
）リス−塩＠ （Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ ） １ｌｌｉ液（
ｐＨ７，ｚ ）を用いて、ｔＸオド關りでホ峰ゲナイズ
し、８０００ ｒｐｍ 、 ３０分間遠心俵、その上清
を用いた・ ３）活性一定法 クロマト後の会画分の酵素活性および
台因子の活性は、３７℃の秦件下で下記の方法に従って
一定し良、なお、酵素活性はすべて見分間Ｋｌｊｍｏｌ
・のパラニトーアエリ７（ｐ−＋ａｉｔｒｏａｎ目ゑｎ
ｅ）を遊離する酵素量を１単位とした。
中シｙ（リボボリナツカライド、ＬＰ８）（・ｏｏａｇ
／ｍｚ ＞ ５ｏｓｚ並ひにＯＪＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ−
１ＢｍＭＭｇｃｊ、緩１１１１ （ｐＨｓ、ｏ ） Ｚ
ｏｏ ｐｇを晶合し、１５分放置後、５ｍＭ Ｂｏｃ−
Ｌ＠ｕ−Ｇｌｙ−ムｒ＊−ｐＮｈ ２０ｆｉｌと画分ム
（図１）ｓｏｊｌのｓｔｅｍえ、一定時間＠ｏ、６Ｍ酢
酸０，８ｒＭ を加えて反応を停止し、遊離し九ノ（ラ
エトーアエリン量（＃＝五〇、Ｂｏｏ ）を４０５１１
ｍで一定した。
／ｍｚ ＞ ５ｏｓｚ並ひにＯＪＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ−
１ＢｍＭＭｇｃｊ、緩１１１１ （ｐＨｓ、ｏ ） Ｚ
ｏｏ ｐｇを晶合し、１５分放置後、５ｍＭ Ｂｏｃ−
Ｌ＠ｕ−Ｇｌｙ−ムｒ＊−ｐＮｈ ２０ｆｉｌと画分ム
（図１）ｓｏｊｌのｓｔｅｍえ、一定時間＠ｏ、６Ｍ酢
酸０，８ｒＭ を加えて反応を停止し、遊離し九ノ（ラ
エトーアエリン量（＃＝五〇、Ｂｏｏ ）を４０５１１
ｍで一定した。
００＃員−素前駆体（Ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ ｅ＠−
震ｙｍ・）：４に画分ｓｏ ｓｚと活性曹ファタタ−Ｂ
！＄０Ｊ１１．）リス緩衝ＩＩ （Ｑ）で使用し良もｅ
）１００ｊ１１１１６し、３０分放置後、ｚｍＭ会威基
質（（ｉ）で使用したもの） ｓｏ ｓｌを加え、ａＳ
ｌｌＮシ良アー電ダーゼ活性を一定した・崗％洒性■フ
ァクターＢは画分Ｂ、 （図ｈ ） ４００μＩト０，
４ Ｍ Ｔｒ ｌ ｓ −ＨＣｌ−！４１ｍＭＭｇＣＪ
、緩衝ＩＩ［（ｐ）ｌ ｓ、ｏ ） ２００ ＩＡｌ、
ＬＰ８ （４００ｎｇ／ｍｊ ）雪ｏ。
震ｙｍ・）：４に画分ｓｏ ｓｚと活性曹ファタタ−Ｂ
！＄０Ｊ１１．）リス緩衝ＩＩ （Ｑ）で使用し良もｅ
）１００ｊ１１１１６し、３０分放置後、ｚｍＭ会威基
質（（ｉ）で使用したもの） ｓｏ ｓｌを加え、ａＳ
ｌｌＮシ良アー電ダーゼ活性を一定した・崗％洒性■フ
ァクターＢは画分Ｂ、 （図ｈ ） ４００μＩト０，
４ Ｍ Ｔｒ ｌ ｓ −ＨＣｌ−！４１ｍＭＭｇＣＪ
、緩衝ＩＩ［（ｐ）ｌ ｓ、ｏ ） ２００ ＩＡｌ、
ＬＰ８ （４００ｎｇ／ｍｊ ）雪ｏ。
＃ｊＯａｌｌｔｌｓ４ＪＩｋ置してＩＩＩＩＬｌもｏｔ
ｍ％／％た・ 画分６０１１１とＴｒｉｍ緩衝液（（工）で使用したも
の） １０Ｏｊｌ １３ｍＭ４ｒｊｉｌｌ！基質（（Ｊ
＞で使用しえもの）８０ｊ１４１！履食塩水５ｏｊｚｔ
ｌｌ會し１一定時間後、Ｏ，ｓＭ＃ａｌｏ、８ｍｊを加
えて反応ヲ停止し、バラエトーアニリｙｏ遊離量を―定
し良・ （ｉｖ）畿ｔｉｉｉｉ書因子（Ａｎｔｉ−Ｌ１２ ｆａ
ｃｔｏｒ） ：試料と両分ム、画分Ｂ ％０．４ Ｍ
’ｒ ｒゑｓ −ＨＣｌ −３１１ｍＭＭｇＣｊ、緩価
淑（ｐＨ８，０）を４）！ｉＯμ１１さらＫ ！！ ｍ
Ｍ会虞基質（０）で使用の％ｅ）２０ａｔとＬ１２ （
４００ｎＫ／ｍｌ ） ３０ ｓｌを混合し、２１分放
置後、００６Ｍｇ１＠０．ａｍＺを加えて反応を停止し
、パラエトＯ７μすνの遊離量を一定し良、この条件下
、アアタターＢＯｍ性化（Ｌ１２１−厘使用）をＳｏφ
阻害する活性を１単位とし九〇 頗■釣に間開したヘパリｙ−アガーース・ＣＬ −５Ｂ
−ｓうＡ （ｉ Ｘ 、１７ｃｍ）ＩＣ％ ０．０５Ｍ
Ｔｗｉｓｔふ（むカブトガ鼻血球抽ｔＢ９８４０ｍｌを
添加し、０．１５ＭＴｈよびｉＭ塩化ナトリウムＳ＊を
用いて＃ｌ出を行なった（−五）ついでＩＭ塩化ナトリ
９ム溶出区分（１８Ｇ−３６０管）をあツＪ６−に７丁
ｃｍ−ス＠ ＣＬ−６Ｂカラム（３，！１ｘ １ｚｓ４
ｓ ＠１１１ ）を用いて、−曹的にゲルろ過をイン慕
ビター区分それぞれの検出法（前述）ｋ従りて検出した
ところ、塩漕出区分の■１〜２０４管に酵素系を一切含
ｔ１に％ｆｈイνにビター区分がＩＩＦ出され、これと
杜別Ｅｌ！Ｂ〜ｌ５ＯｆＫプ胃クーツテインダエンダイ
ム区分と脇区分が溶出された（図２）。
ｍ％／％た・ 画分６０１１１とＴｒｉｍ緩衝液（（工）で使用したも
の） １０Ｏｊｌ １３ｍＭ４ｒｊｉｌｌ！基質（（Ｊ
＞で使用しえもの）８０ｊ１４１！履食塩水５ｏｊｚｔ
ｌｌ會し１一定時間後、Ｏ，ｓＭ＃ａｌｏ、８ｍｊを加
えて反応ヲ停止し、バラエトーアニリｙｏ遊離量を―定
し良・ （ｉｖ）畿ｔｉｉｉｉ書因子（Ａｎｔｉ−Ｌ１２ ｆａ
ｃｔｏｒ） ：試料と両分ム、画分Ｂ ％０．４ Ｍ
’ｒ ｒゑｓ −ＨＣｌ −３１１ｍＭＭｇＣｊ、緩価
淑（ｐＨ８，０）を４）！ｉＯμ１１さらＫ ！！ ｍ
Ｍ会虞基質（０）で使用の％ｅ）２０ａｔとＬ１２ （
４００ｎＫ／ｍｌ ） ３０ ｓｌを混合し、２１分放
置後、００６Ｍｇ１＠０．ａｍＺを加えて反応を停止し
、パラエトＯ７μすνの遊離量を一定し良、この条件下
、アアタターＢＯｍ性化（Ｌ１２１−厘使用）をＳｏφ
阻害する活性を１単位とし九〇 頗■釣に間開したヘパリｙ−アガーース・ＣＬ −５Ｂ
−ｓうＡ （ｉ Ｘ 、１７ｃｍ）ＩＣ％ ０．０５Ｍ
Ｔｗｉｓｔふ（むカブトガ鼻血球抽ｔＢ９８４０ｍｌを
添加し、０．１５ＭＴｈよびｉＭ塩化ナトリウムＳ＊を
用いて＃ｌ出を行なった（−五）ついでＩＭ塩化ナトリ
９ム溶出区分（１８Ｇ−３６０管）をあツＪ６−に７丁
ｃｍ−ス＠ ＣＬ−６Ｂカラム（３，！１ｘ １ｚｓ４
ｓ ＠１１１ ）を用いて、−曹的にゲルろ過をイン慕
ビター区分それぞれの検出法（前述）ｋ従りて検出した
ところ、塩漕出区分の■１〜２０４管に酵素系を一切含
ｔ１に％ｆｈイνにビター区分がＩＩＦ出され、これと
杜別Ｅｌ！Ｂ〜ｌ５ＯｆＫプ胃クーツテインダエンダイ
ム区分と脇区分が溶出された（図２）。
実施例２ イνヒビタ一を除去しえライゼートの効果
実施例五において得られた各区分を混合して、アミダー
ゼ活性を測定するとき、表に示されるように、インにビ
ター区分を會ん＊ｉａ、 金物ではいずれ１着しい活性
阻害がみられえが、インとビター区分を含まない混舎物
ではいずれ％きわめて高いアミダーゼ活性が保持され大
、′ｉ。
ゼ活性を測定するとき、表に示されるように、インにビ
ター区分を會ん＊ｉａ、 金物ではいずれ１着しい活性
阻害がみられえが、インとビター区分を含まない混舎物
ではいずれ％きわめて高いアミダーゼ活性が保持され大
、′ｉ。
■表
エンド）キシンによって誘起される
りムルス凝園系の活性化に及ぼす凝
固阻害因子の効果
アメポｔイト・
う４−ａｔ−） Ｌ１２ ・Ｉ！
Ａｌｌ ５１８．１―分ム＋Ｂ ＬＰ畠
ａｓｓ ｓｏ ｏｘ、。
Ａｌｌ ５１８．１―分ム＋Ｂ ＬＰ畠
ａｓｓ ｓｏ ｏｘ、。
カプト１ｔ−ｏライ（−トＳＯｍｊを８＊ｐｋａ−ｄ＠
ｘ Ｇ−１＠倉うＡ（４，３Ｘ１１４Ｃｍ）Ｋ添加ムｏ
、ｏｓＭ ）リス緩衝＄１（ｐＨ８，０）十塩化ナトリ
ｔム（＠、ＩｓＭ）１１１１をもちいてゲルろ遥をｊＰ
ｅｅい、前違の検出法によ勤検出を行なったとζろ、塩
０Ｉｌｌ出区分と同一区分に％他のａｌｌ−嵩一子を食
（會鵞１に％Ａ純粋なイｙｗビター区分を検出した（Ｉ
ｌｍ ）＠
ｘ Ｇ−１＠倉うＡ（４，３Ｘ１１４Ｃｍ）Ｋ添加ムｏ
、ｏｓＭ ）リス緩衝＄１（ｐＨ８，０）十塩化ナトリ
ｔム（＠、ＩｓＭ）１１１１をもちいてゲルろ遥をｊＰ
ｅｅい、前違の検出法によ勤検出を行なったとζろ、塩
０Ｉｌｌ出区分と同一区分に％他のａｌｌ−嵩一子を食
（會鵞１に％Ａ純粋なイｙｗビター区分を検出した（Ｉ
ｌｍ ）＠
■１は、ヘバシｙ−７ガロース・ＣＬ−６Ｂカラムをｍ
％ｔｈｉｓ カブトガニ血球曽輿液のカラムタロ！トダ
ラムを示す。 Ａｌｌ雪は、セファ一−ス・ＣＬ−６Ｂカラムを用−九
、ゲルろ過によるｓ ｅｔ！ｉｌＫおけるＡＭ塩化ナシ
リクム＃Ｉ出区分（１８０〜意６０管）のカラムクロマ
トダラムを示す。 ａａｓａ、セファデックｘ （８ｓｐｈａｄｅｘ ）Ｇ
−５Ｏカラムを用いた、ゲルろ過ｖ＆による、カプト
ｔＩＪＩ＆・ライ層−トのカラムククマトダラムを示す
・ 計１ 凝ｌＩ＃素前駆体 ←→ ファクターＢ −一一一 シクロデキストリン −４阻害因子 −ＮａＣｊ 手続補正書 昭和８１年＄月易日 特許庁畏官 １！ 参 和 夫 殿１、事件の表示 昭和ｓ６年特許 願第 １１ｊＨ１７ｊｊ、−２，１Ａ
Ｉ！０名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 生化学工桑株式会社 （氏 名） ８、補正の内容 ！、＃４細書の発明の詳細な説明の欄を以下のとおシ補
正する。 （１）明細書第７頁下から１行目〜第８頁２行ｌの「・
・・中エンドトキシン感受性因子・・・・・・活性化酵
素系」を・ト・のエンドトキシンによる活性化の段階］
と補正する。 ａ） 明細書第７頁３行目の「−一キモトリプシン」を
「スプチリシン」と補正する。 ―） 明細書館１３貴下から６行目の「（図３）」を削
除する。 （４） Ｑｌｌ細書鎮１３頁の実施例３の記載Ｏ後に
、下記の実施例４を追加する。 カブトガニのアメポサイト１０ｔを０．０り１ＭＮａＣ
１を含む０．０２ Ｍ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ
８，０）で抽出して得たアメボサイト・ライゼート９０
−を、上記緩衝液で平衡化したヘパリン・セファロース
ＣＬ−６Ｂカラム（２，２Ｘ１８．０１）にかけ、 ０
．５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（１１８，０）５００−で溶出して、凝固酵素前駆
体、ファクターＧ及び７アクターＢの混合物を得た０次
いで、２ＭＮａＣｌを含む０．０２ Ｍ Ｔｒｌｓ−Ｍ
ＣＩ緩衝１１１（ｐｉ（１１，０）５００−で溶出して
、目的とする凝固阻害因子を得た。」 １、明細書０図１１ｉの簡単な説明Ｏ欄において、明細
書第１４頁４〜１２行目を削除する。 ■０図面において、図３を削除する。
％ｔｈｉｓ カブトガニ血球曽輿液のカラムタロ！トダ
ラムを示す。 Ａｌｌ雪は、セファ一−ス・ＣＬ−６Ｂカラムを用−九
、ゲルろ過によるｓ ｅｔ！ｉｌＫおけるＡＭ塩化ナシ
リクム＃Ｉ出区分（１８０〜意６０管）のカラムクロマ
トダラムを示す。 ａａｓａ、セファデックｘ （８ｓｐｈａｄｅｘ ）Ｇ
−５Ｏカラムを用いた、ゲルろ過ｖ＆による、カプト
ｔＩＪＩ＆・ライ層−トのカラムククマトダラムを示す
・ 計１ 凝ｌＩ＃素前駆体 ←→ ファクターＢ −一一一 シクロデキストリン −４阻害因子 −ＮａＣｊ 手続補正書 昭和８１年＄月易日 特許庁畏官 １！ 参 和 夫 殿１、事件の表示 昭和ｓ６年特許 願第 １１ｊＨ１７ｊｊ、−２，１Ａ
Ｉ！０名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 生化学工桑株式会社 （氏 名） ８、補正の内容 ！、＃４細書の発明の詳細な説明の欄を以下のとおシ補
正する。 （１）明細書第７頁下から１行目〜第８頁２行ｌの「・
・・中エンドトキシン感受性因子・・・・・・活性化酵
素系」を・ト・のエンドトキシンによる活性化の段階］
と補正する。 ａ） 明細書第７頁３行目の「−一キモトリプシン」を
「スプチリシン」と補正する。 ―） 明細書館１３貴下から６行目の「（図３）」を削
除する。 （４） Ｑｌｌ細書鎮１３頁の実施例３の記載Ｏ後に
、下記の実施例４を追加する。 カブトガニのアメポサイト１０ｔを０．０り１ＭＮａＣ
１を含む０．０２ Ｍ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ
８，０）で抽出して得たアメボサイト・ライゼート９０
−を、上記緩衝液で平衡化したヘパリン・セファロース
ＣＬ−６Ｂカラム（２，２Ｘ１８．０１）にかけ、 ０
．５ＭＮａＣ１を含む０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（１１８，０）５００−で溶出して、凝固酵素前駆
体、ファクターＧ及び７アクターＢの混合物を得た０次
いで、２ＭＮａＣｌを含む０．０２ Ｍ Ｔｒｌｓ−Ｍ
ＣＩ緩衝１１１（ｐｉ（１１，０）５００−で溶出して
、目的とする凝固阻害因子を得た。」 １、明細書０図１１ｉの簡単な説明Ｏ欄において、明細
書第１４頁４〜１２行目を削除する。 ■０図面において、図３を削除する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （２） カグトガｚＯアメボナイト・ライゼート中に存
在する、工ｙトド牟シｙｏ誼アメボナイト・ライゼート
を＃回せしめる能力又は蒙アメボナイト・ライ（−トに
作用してライゼート中Ｏ凝１１Ｊ％−嵩を活性化する能
力を阻害する因子。 （至）該因子が、カブトガニのアメボサイト・ライセー
ドをヘパリン・アガー−スを吸着担体とする吸着タロマ
トダラフイ−に付するとき、１、ＯＭｊ！Ｌ上Ｏイオシ
強度０ＮａＣ１潜液によって、蟲ｗＩ款着一体から脱着
される画分に會まれ、鋏−分を１らに分子篩りａｖ）タ
ラフィー担体を用いてりａマドグラフィーを行うと自シ
タロデ費ストリン乃至塩化ナトリウムがＳ出する位置Ｅ
ｌｌ出する一分に會鵞れる強塩基性べ１テド性因子であ
る特許請求の範囲第１項記載Ｏ因子。 （２） カブトガニ０アメボｔイト・ライゼートを、分
子篩ターマドグラフィー用一体を用いるカラムりａマド
タラフィーに付すか、あるーは、ヘバリν・ア１ｊａ−
スを吸着担体とする吸着タロマドタラフィーに付し、１
．０Ｍ以上のイオノ強度を有する塩溶ＩＥによって溶出
する一分を集めた後、該両分を分子−タロマド担体フィ
ー用鶴体を用いるカラムターマドグラフィーに封するこ
とを特徴とするアメボテイト・ライゼート中の工ｙトド
命シｙｌｃよるａｌｌ系阻害因子の採１に法。 （２）分子篩りａマドグラフィー用担体が、アガロース
、条横アガロース、架構デ中ストラｙゲル及び架橋アク
リルア建ドゲルから遥ばれたものである特許請求の範囲
第３項記載Ｏ採ＩＩＬｖ＆・ 厨 塩舒液が塩化ナトリクム溶液である特許請求の範囲
第３項記載の採取法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56113317A JPS5813517A (ja) | 1981-07-20 | 1981-07-20 | カブトガニのアメボサイト・ライゼ−ト中に存在する凝固系阻害因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56113317A JPS5813517A (ja) | 1981-07-20 | 1981-07-20 | カブトガニのアメボサイト・ライゼ−ト中に存在する凝固系阻害因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5813517A true JPS5813517A (ja) | 1983-01-26 |
| JPH0332748B2 JPH0332748B2 (ja) | 1991-05-14 |
Family
ID=14609159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56113317A Granted JPS5813517A (ja) | 1981-07-20 | 1981-07-20 | カブトガニのアメボサイト・ライゼ−ト中に存在する凝固系阻害因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5813517A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5155032A (en) * | 1988-09-01 | 1992-10-13 | Seikagaku Kogyo Co., Ltd. | Horseshoe crab amebocyte lysate factor g activation inhibitor |
| US5474984A (en) * | 1988-09-01 | 1995-12-12 | Seikagaku Kogyo Co., Ltd. | Horseshoe crab amebocyte lysate factor G activation inhibitor |
-
1981
- 1981-07-20 JP JP56113317A patent/JPS5813517A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5155032A (en) * | 1988-09-01 | 1992-10-13 | Seikagaku Kogyo Co., Ltd. | Horseshoe crab amebocyte lysate factor g activation inhibitor |
| US5474984A (en) * | 1988-09-01 | 1995-12-12 | Seikagaku Kogyo Co., Ltd. | Horseshoe crab amebocyte lysate factor G activation inhibitor |
| US5641643A (en) * | 1988-09-01 | 1997-06-24 | Seikagaku Kogyo Co., Ltd. | Horseshoe crab amebocyte lysate factor G activation inhibitor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0332748B2 (ja) | 1991-05-14 |
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