JPS58150862A - 精製抗体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ケトステロイドの精製抗体の製造法およびこ
れに使用するステロイド固定架橋ポリアクリルヒドラジ
ド樹脂に関するものである。

免疫学的測定法を実施する際に特定物質に対する特異的
な抗体作製は極めて重要であるが。

力価が高く交差反応の低い優れた抗血清（抗体）を得る
ことは必ずしも容易ではない。特にステロイドホルモン
の免疫学的測定法では化学構造が近似している類縁化合
物が種々存在するためその影響が間−となる。

従来は特異的な抗体を得る手段として、免疫抗原を改良
する方法または多数の実験動物を免疫化し、その中より
特異性の高い抗体を産生するものを選ぶ方法などが採用
されて来た。一方。

免疫動物より得られた抗血清を純化精製する方法として
は抗原吸収法または市販のアクリルアミドゲルやアガロ
ース系のビーズを支持体として用いる生物学的親和性ク
リマドグラフ法などが採用されているが、多くの場合、
リガンドと支持体との結合に極めて毒性の強いＣＭＢｒ
の使用が必要であり、しかも抗体の力価の低下が著しい
欠点もある。このような観点から簡単な操作により力価
の低下を来すことなく特異性の高い抗体を得る方法の開
発が望まれている。

そこで１本発明者は種々研究の結果、架橋ポリアクリル
ヒドラジド樹脂に抗原のケトステロイドを固定し、この
もので抗体を処理すると力価の低下を最小限にとどめ極
めて特異性の高い抗体が得られることを見出し１本発明
を完成した。

本発明で用いる架橋ポリアクリルヒドラジド樹脂として
は、ヒドラジド基を含む樹脂であればよいが１例えばジ
ビニルベンゼンまたはエチレングリコールジメタアクリ
レートＩｉ（すなりちエチレングリコールジメタアクリ
レート、ジエチレングリコールジメタアクリレート、ト
リエチレングリコールジメタアクリレート、またはテト
ラエチレングリコールジメタアクリレート）で架橋した
ポリ了クリレート樹脂が容易に製造される（　Ｃｈｅｗ
、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　２６　’１４）６（１
９）７）参照）。

型態としてはゲル型および巨大網状蓋のいずれも使用で
きるが、物理的安定性の面からは巨大網状型の樹脂が好
ましい。

この架橋ポリアクリルヒドラジドＩｔＩｉ１にナトステ
ロイドを固定するには、アルコール額と水の混液に樹脂
を懸濁させ、これにケトステロイドを加えて数十度乃至
百数十度に加温して反応させる。ケトステロイドとして
は８−ケトステロイド、−６−ケトステロイド、１１−
ケトステロイド等があるが、特に８−ケトステロイドに
ついてよい効果が得られ３例えば、フルチゾール、コル
チゾン、１１−デオキシコルチコステロン、：１ルチコ
ステロン、１１−ｆ’ｔａ？シコルチゾール、１１−デ
ヒドロスルチコステロン。

プロゲステロン、１７α−ヒドロキシプ四ゲステロン、
１１−ケトプロゲステロン、１１α−ヒトルキシプロゲ
ステロン、１１／−ヒトルキシプロゲステロン、ｚＯα
または！０β−ヒドロキシーΔ番−プレグネン−８−オ
ン、ｚｏα−ジヒドロプｐゲステロン、アルドステｐン
。

６α−プレグナンジオン、テストステロン。

５αジヒドロテストステロン、プレドニゾン。

プレドニゾン等を挙げることができる。

ステロイド固定架橋ポリアクリルヒドラジド樹脂は極め
て安定であり通常の保存状態で全く変化せず長期間かつ
繰返し使用可能である。

しかし、アガｐ−ス系やアクリルアζドゲル等を用いる
場合　＊＊させた状態で保存する必要があり、これに際
しては薗の発生の防止や低温保存等、力価を保持させる
ことはしばしば困銀である。

本発明のステロイド固定樹脂で抗体溶液を処理すれば、
１１脂に固定されたステロイドにそれに対応する抗体が
抗原抗体反応により結合するので、この反応を利用して
抗体を精製することができるが９次の二種類の操作方法
が可能である。すなわち、狭雑する不要なステロイドの
抗体をステロイド固定樹脂に結合させて除く方法と、必
要な抗体をステロイド固定樹脂に結合させ、狭雑する他
の抗体は流出させた後、樹脂を適当な濃度の塩溶液で処
理して求める抗体を溶離取得する方法がある。抗体溶液
は適当な緩−液で希釈してステロイド固定樹脂に接蝕処
厘させればよく、バッチ式またはカラ五式を適宜採用す
る・溶離液としては、緩衝液に塩−を加え塩濃度を調節
したものを使用すればよく１例えば塩化カリウム、塩化
ナシリウムを１％ル濃度に含有したクエン酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液等を挙げることができる。

次に参考例および実施例を挙げて説明する。

参考例：架橋ポリアクリルヒドラジドｌｌ１１の合成 （Ｉ）　　架橋ポリアクリレート樹脂 アクリル酸エチル１ｆｉＯ−にｂＯ襲ジビニルベンゼン
溶液ｓ〇−又はエチレングリコールジメタアクリレ−）
１１１１６ｍンｙイル会會ｆｋ＠解ざ曾、さらにイソオ
クタン１６０−を加えて調製した液を単量体溶液とする
。

精製水１８０−に１％ハイドロオキシエチル大ルロース
水溶液１１Ｏｓｈｔおよび塩化ナシリウム４５炉を加え
た分散媒に上記単量体溶液全量な加え液をかきまぜて水
層に分散させた後、約８０分間で液温を７０〜７６℃に
上昇させ、この温度で一走の回転を保ちながら８時間攪
拌を行う。反応終了後多量の熱水（７０〜８０℃）で十
分洗浄する。風乾すると約１８（ｌの白色球状樹脂が得
られる。必要に応じて篩別により８６〜６０メ、シ、の
フラクシ、ンを集める。

ＩＲν　　ｃｍ　　：ｘ７ａｓ（ｃ−ｏ）ｘ （１）　　架橋ポリアクリルヒドラジド樹脂上記の架橋
ポリアクリレ−）樹脂５０９に無水ヒドラジン２００−
を加え８０〜ｌ！！０℃で６〜ｌＯ時間加熱する。反応
物を氷水中に注加し、−脂を濾取し、多量の精製水およ
びメタノールで洗浄後風乾する。

収量４５〜４７Ｆ。

なお架橋剤の種類によって反応条件を適宜選択する。例
えばジビニルベンゼン架橋樹脂の場合は１１０℃でＮｏ
時間、エチレングリコールジメタアタリレート額架橋樹
脂の場合は８０℃で６時間反応させる。

ＫＢｔ　　　−１ １Ｒνｅｌｌ　　：８畠ｏ　ｏ　（−ａｍ、　）。

暑１ｘ １＠９０（Ｏ嘩Ｏ） 実施例１ニステロイド固定架橋ポリアクリルヒドラジド
５ｔｉｉｔの製造 架橋ポリアクリルヒドラジド樹１ｉ１６Ｆをエタノール
−水路容量混液４０−に懸濁させ、ケトステロイド（た
とえば、１１−デオキシコルチゾール、フルチゾール、
デオキシコルチコステロ＞　）　６０５１９を加え、フ
０−８０℃の水浴中で２時間攪拌する・冷後樹脂を濾過
し、約６０ｍの熱エタノールで１０回洗浄をくりかえし
、樹脂に物理的に吸着したステロイドを除き、得られた
樹脂を減圧下に乾燥する。

着させる。ＯＪＭクエン酸緩衡液１００−でカラム、を
洗浄後、０．１Ｍの塩化カリウムを含む０．１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ８，５）　　で目的とす吸収を示す部分
を捕集する。この抗体溶液は直ちにそのままイムノアッ
セイに使用可能である。

上記方法で件部した抗１１−デオキシコルチゾール抗体
の置県性をラジオイムノア、セイ法（デキストラン−炭
末法）により調べた結果は次表に示す通りである。

手続補正書 唱和５１年４月２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和Ｓ７年特許出願第８１４１１号 １、発明の名称 精製抗体の製法 ＆　補正をする者 事件との間係　　　　　特許出願人 飯代場人 東京都中央区日本橋三丁目１４書ｌＯ号第−製薬株式金
社内 「明細書の発明の詳細な説明の橢」　／≦；Ｊン６、補
正の内容 明細書第１０頁下から９行目「精製１１−デオキシコル
チゾール」とあるを「精製１１−デオキシコルチゾール
抗血清」に訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　架橋ポリアクリルヒドラジド樹脂にケトステ
   ロイドを反応させることを特徴とするステロイド固定樹
   脂の製法 （２）　　ケトステロイドが８−ケトステロイドである
   特許請求の範囲第１項記載の製法 （８）　　架橋ぎりアクリルヒドラジド樹脂にケトステ
   ロイドを反応させてステロイド固定樹脂を製し、この樹
   脂で該ケトステロイドの抗体を処置することを特徴とす
   る精製抗体の製法（４）抗体の処理が、所望のケトステ
   ロイドの抗体を吸着させ次いで脱離させて取得する処置
   である特許請求の範囲第８項の製法 （５）抗体の処理が、不要のケトステロイドの抗体を吸
   着させて除去し、Ｖ＆着しなかった抗体を取得する処理
   である特許請求の範囲第８項の製法