JPS581920B2 - 体液中のエステル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素の検出用診断剤 - Google Patents

体液中のエステル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素の検出用診断剤

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JPS581920B2
JPS581920B2 JP55016082A JP1608280A JPS581920B2 JP S581920 B2 JPS581920 B2 JP S581920B2 JP 55016082 A JP55016082 A JP 55016082A JP 1608280 A JP1608280 A JP 1608280A JP S581920 B2 JPS581920 B2 JP S581920B2
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デイーター・ベルガー
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Description

【発明の詳細な説明】 体液、特に尿中の白血球の検出は、腎臓及び泌尿生殖管
路の病気の診断に重要な位置を占めている。
従来、この検出は、遠心分離してない尿中又は尿固形沈
渣中の白血球を顕微鏡により計数することによって行な
っていた。
損傷のない白血球しか検出されないことは、両方法とも
もちろん共通である。
他方、白血球溶解の速度が尿環境に応じて著しく変動す
ることは公知である。
例えば、強アルカリ性尿中では白血球半減期は僅か６０
分である。
その結果あまり低すぎる白血球数が生ずるか又は尿の放
置時間が比較的長い場合には誤まった陰性の所見さえ生
ずる。
遠心分離してない、ホモジナイズした尿中の白血球を計
算板中で顕微鏡により定量的に測定すると、溶解誤差を
別とすれば、正しく確かな数値が生じる。
しかしこの方法は手数がかかり、煩雑で、時間がかかり
、習熟した人を必要とするので、実際には珍れにしか使
用されない。
尿中の白血球測定の大多数は、医学実務では尿固形沈渣
中のいわゆる視野法により実症される。
このためには、まず試験物（固形沈渣）を遠心分離によ
り得なければならない。
しかしこの場合には、尿の他の成分も富化し、他の成分
、例えば塩及び上皮細胞が白血球の顕微鏡による計数値
を著しく大きくすることがある。
変動する固形沈渣含有率、固形沈渣の異質性及び恐らく
種々の顕微鏡拡大率又は顕微鏡の種々の光学的装備によ
り、顕微鏡視野当りの白血球の数に関する通常の記載は
数百％の誤差を伴なうことになる。
従って最近では、体液中の白血球を簡単で、容易に取扱
いうる方法でかつ出来るだけ迅速にかつ完全に検出しう
る診断剤を調整する研究がなされてきた。
白血球は広い酵素スペクトルを有するので、このような
白血球試験の検出原理として酵素反応が提示された。
ドイツ連邦共和国特許出願Ｐ２８ ２６９６５．０号
、同Ｐ２８ ３６ ６４４．１号及び同Ｐ２８
５４ ９８７．３号明細書には、例えば適当な緩衝物
質、常用の助剤及び色原体で含浸された吸収性支持体か
ら成る診断剤が記載されている。
この場合色原体としては下記のものが使用されている： ドイツ連邦共和国特許出願Ｐ２８ ２６９６５．０号
による一般式（Ａ）： 〔式中Ｒ’， Ｇｔ場合によりハロゲン若しくは低級ア
ルコキシ基で置換されたカルボン酸残基、又はペブチド
化学に常用の窒素保護基を有するアミノ酸残基若しくは
ペプチド残基を表わし、Ｒ′２はハロゲン原子又は低級
アルキル基を表わし、Ｗ′３及びＲは同一又は異なり、
それぞれ水素原子又はハロゲン原子を表わす〕のスルホ
ンフタレインエステル、ドイツ連邦共和国特許出願Ｐ２
８ ３６６ ４ ４． １による一般式（Ｂ）； Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ’（ＯＲ）ｎ （Ｂ）〔式
中Ａ−／は、Ｎ，Ｓ及び０から成る１個乃至２個のへテ
ロ原子を有し、場合によりベンゼンと縮合した５員又は
６員の基を表わし、この基は場合によりハロゲン、低級
アルキル基及び／又は低級アルコキシ基で１個以上置換
されていてよく、或いはＡ−／は低級アルキル基、低級
アルコキシ基、ニトロ基、スルホネート基及び／又はア
シルアミノ基で１個以上置換されたフエニル基を表わし
、Ｂ′は場合によりスルホネート基、低級アルコキシ基
及び／又は低級アルコキシーポリアルキレンオキシ基で
１〜２個置換されたベンゼン基、場合によりスルホネー
ト基、低級アルコキシ基及び／又は低級アルコキシーポ
リアルキレンオキシ基で１〜２個置換されたナフタリン
基又は場合によりスルホネート基、低級アルコキシ基及
び／又は低級アルコキシーポリアルキレンオキシ基で１
〜２個置換されたキノリン基を表わし、Ｒはカルボン酸
残基又はペプチド化学に常用の窒素保護基を有するアミ
ノ酸残基若しくはペプチド残基を表わし、ｎは１又は２
の数を表わす〕のアゾ色素−エステル、及び ドイツ連邦共和国特許出願Ｐ２８ ５４９ ８ ７．
３号による一般式（Ｃ）：〔式中Ｒ１″、Ｒｑ′、Ｒ
ｚ′及びＲｒ′は同一又は異なっていてよく、それぞれ
水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、
アリール基、アラルキル基、アラルコキシ基、水酸基、
カルボキシ基、カルボキシ低級アルコキシ基、アラルコ
キシカルボニル基、アラルコキシカルボニル低級アルコ
キシ基、ニトロ基又は低級アシルアミノ基を表わすか、
又はそれぞれ２個の隣接した置換基は場合によりハロゲ
ンで置換された縮合ベンゼン項を形成する基を表わし、
Ｘは硫黄原子又は場合により低級アルキル基、アリール
基、アラルキル基若しくはアシル基で置換されたイミノ
基を表わし，Ａ″はアミノ酸残基又はペプチド残基を表
わし、Ｂ“はペプチド化学に常用の窒素保護基又はペプ
チド化学で誘導される窒素保護基を表わす〕のインドキ
シルーエステル。
この診断剤を用いれば、体液中、特に尿中のエステル分
解酵素又は蛋白質分解酵素、特に白血球中に存在するエ
ステラーゼ又はプロテアーゼを色の変化により簡単かつ
迅速に検出することができる。
ところで本発明の課題はこの酵素試験の基礎となる検出
反応を促進する可能性を見い出すことである。
この酵素による白血球試験の反応時間は、従来常用の助
剤及び色原体の他に１種以上の活性化剤を使用すれば、
著しく短縮されることが意外にも判った。
従って、本発明の対象は、付加的に１種以上の活性化剤
を含むことを特徴とする、常用の助剤の他に常用のエス
テラーゼ基質及び／又はプロテアーゼ基質を含む、エス
テル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素の検出用診断剤
である。
更に、本発明はこの診断剤に関し、該診断剤は有利に体
液、特に尿中の白血球を検出するために使用される。
本発明による診断剤は、吸収性支持体、フイルム層、粉
末混合物、凍結乾燥物、常用のエステラーゼ基質及び／
又はプロテアーゼ基質、その都度常用の添加剤及び１種
以上の活性化剤を含む溶液又は試薬錠剤から成るのが有
利である。
詳言すれば、本発明による診断剤は次のａ）〜ｄ）に記
載された化合物群から選択した１種以上の活性化剤を含
むことを特徴とする： ａ）一般式（Ｉ）： 〔式中Ｒ，、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ，は同一又は異な
っていてよく、それぞれ水素、ハロゲン、低級アルキル
基、低級アルコキシ基又はビニル基を表わし、このビニ
ル基は場合により低級アルコキシ基、アミノ基、アルキ
ルアミノ基若しくはジアルキル基を１個以上有するアリ
ール基又はへテロ環式基で置換されているか、又はそれ
ぞれ２個の隣接した置換基は場合によりハロゲン、水酸
基、低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基で１個以
上置換された、縮合インデン項或いはベンゼン環を形成
する基を表わし、この基は場合により低級アルキル基で
置換された、縮合ベンゼン環又はピリジン環を形成する
基を有していてもよく、Ｒ３は更にビニルーキヌクリジ
ルーカルビノール基を表わしていてもよい〕のピリジン
誘導体、 〔式中Ｒ′１は水素、低級アルキル基又は場合により水
酸基若しくはアシル基で置換されたアリール基を表わし
、Ｒ′２は水素、アミノアルキル基、Ｎ−アシルアミノ
アルキル基又は飽和若しくは不飽和の低級肪脂族カルボ
ン酸残基又は場合により窒素がアシル化された低級肪脂
族αーアミノ酸残基を表わす〕のイミダゾール誘導体、 Ｃ）一般式（ＩＩＩ） ： Ｘ−Ａ−ＯＨ （ＩＩＤ〔式中Ｘは水
素又は水酸基を表わし、Ａは炭化水素基を表わす〕のア
ルコール及び ｄ）一般式（閏： Ｄｍ（Ｂ（ＣＮ）ｎ（ＮＯ）ｐ） （ＩＶ
’）〔式中Ｄはアルカリ金属イオン、Ｂは重金属イオン
、ｍは２〜５の整数を表わし、ｎは４〜８の整数を表わ
し、ｐは０又は１を表わし、数値ｍは重金属イオンの電
荷及び数値ｎにより決まる〕の金属錯体。
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ，の定義において
ハロゲンとは、弗素、塩素、臭素及び沃素、特に塩素及
び臭素を表わす。
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ，の定義における
低級アルキル基及び低級アルコキシ基並びに置換基Ｒ′
１及びＲ′２の定義における低級アルキル基は、直鎖又
は分枝鎖であってよく、１〜５個、特に１〜３個の炭素
原子を含んでいてよい。
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基及びイソプロピル
基又はメトキシ基及びエトキシ基が特に有利である。
炭化水素基Ａは直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和、環式
又は非環式であってよく、非環式化合物では１〜３０個
、特に５〜２２個の炭素原子を有し、環式化合物では３
〜２０個、特に６〜１７個の炭素原子を有していてもよ
い。
置換基Ｒ′，及びＲ′２の定義におけるアシル基として
は、炭素原子数１〜５個、特に１〜３個の脂肪カルボン
酸残基が該当し、その際アセチル基が特に有利である。
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ，及びＲ′１の定義
におけるアリール基は、フエニル基又はナフチル基であ
るのが有利である。
置換基Ｒ′１としては、フエニル基が特に有利である。
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の定義における
ヘテロ環式基とは、１〜３個のヘテロ原子を有する５員
又は６員の基であり、その際へテロ原子としては窒素原
子、硫黄原子及び酸素原子が該当する。
ピリジル基、フリル基及びチェニル基が特に有利である
。
飽和又は不飽和の低級脂肪族カルボン酸残基及び場合に
より窒素原子がアシル化された低級脂肪族α−アミノ酸
残基Ｒ′２としては、炭素原子数１〜５個、特に１〜３
個のカルボン酸又はそのα−アミン誘導体が該当する。
酢酸、プロピオン酸及びアクリル酸又はＬ−アラニン及
びＮ−アセチルーＬ−アラニンが特に有利である。
一般式（ｒｖ）の活性化剤において、アルカリ金属イオ
ンＤとしてはナトリウムイオン及びカリウムイオンが有
利であり、重金属イオンＢとしては金属鉄、ニッケル、
クロム、マンガン、コバルト、モリブデン及びバナジウ
ムのイオンが有利である。
本発明に使用しうる活性化剤としては、例えば下記のも
のが挙げられる； ■．ピリジン ２．２−メチルーピリジン ３．３−エチルーピリジン ４．３−ブロムーピリジン ５．３．５−ジクロルーピリジン ６．４−メトキシーピリジン ７．２，６−ジメチル−４−エトキシーピリジン８．
キノリン ９，２−メチル−キノリン １０ ８−メチル−キノリン １１．７−イソプロピル−キノリン １２．２−クロル−キノリン １３．４−ブロム−キノリン １４ ３−メトキシ−キノリン １５．６−エトキシ−キノリン １６．２−メチル−６−ブロム−キノリン１７．２−メ
チル−４−メトキン−キノリン１８． ５ ． ７−ジ
ブロム−８−メトキシ−キノリン１９．イソキノリン ２０ １−メチル−イソキノリン ２１．３−プロピル−イソキノリン ２２．７−メチル−イソキノリン ふ．１−クロル−イソキノリン 冴．４−ブロム−イソキノリン ５．７−メトキシ−イソキノリン あ．１−メトキシ−３−クロル−イソキノリン２７．１
−クロル−４−メチル−５−メトキシ−イソキノリン 公．ベンゾ−〔ω−キノリン（ニアクリジン）？９．ベ
ンゾ−〔ｃ〕−キノリン（ニフェナントリジン３０ ２
−メチル−フエナントリジン ３１．２−エチル−フエナントリジン ３２．２−プロピル−フエナントリジン ３３ ２−メトキシ−フエナントリジン ３４．ベンゾ−（ｆ）一キノリン ３５．２−イソプロピル−ベンゾ−（ｆ：）−キノリン
３６．３−メチル−ベンゾ−〔０−キノリン３７．２，
４−ジメチル−ベンゾ−〔０−キノリン３８．ベンゾ−
一キノリン ３９．４−メチル−ベンゾ−■−キノリン４０． ２
， ４−シメチル−ベンゾ−一キノリン４１．ベンゾ−
〔ω−キノリン ４２． １ ． ７−フエナントロリン ４３ ２−メチル−１，７−フエナントロリン４４．
２ ． ８−ジメチル−１，７−フエナントロリン ４５． ４ ． ７−フエナントロリン ４６．３−メチル−４，７−フエナントロリン４７．
３ ． ８−ジメチル−４，７−フエナントロリン ４８． １ ， Ｉ Ｏ−フエナントロリン４９． ２
． ９−ジメチル−１，１０−フエナントロリン ５０ ４−アザ−フルオレン ５１．キニン ５２，キニジン ５３．シンコニン ５４ シンコニジン ５５，クプレイン ５６．２−（フエニル〕−ビニル−ピリシン−（２’）
５７．２−（４“−メトキシ−フエニル〕−ビニル−ピ
リジン−（２′） ５８．２−（４“一（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）一フエ
ニル〕〜ビニル−ピリジン−（２’） ５９．ビスー〔２−（フエニル）一ビニル〕−ピリジン
−（ ２／ ， ４／） ６０．２−（ナフチル−（１“）〕−ビニル−ピリジン
−（ ２’） ６１．２−（ピリジル−（２“）〕−ビニル−ピリジン
−（２′） ６２．２−（ピリジル−（３“）〕−ビニル−ピリジン
−（２′） ６３．２−（ピリジル−（４“）〕−ビニル−ピリジン
−（２′） ６４．２−（フリル−（２′′）〕−ビニル−ピリジン
−（ ２’） ６５．２−（ビリジル−（３“）〕〜ビニル−ピリジン
−（３′） ６６．２−（ピリジル−（３“）〕−ビニル−ピリジン
−（４′） ６７．２−（ピリジル−（４“）〕−ビニル−ピリジン
−（４′） ６８．２−（チェニル−（２“）〕−ビニル−ピリジン
−（４′） ６９．イミダゾ−ル ７０ １−エチル−イミダゾール ７１ １−フエニル−イミダヅール ７２．１−（４’−ヒドロキシ−フェニル）一イミダゾ
−ル ７３．１−（４’−アセチル−フェニル）一イミダゾー
ル ７４．ヒスタミン ７５，Ｎ一α−アセチル−ヒスタミン ７６（イミダゾリル−４）一酢酸 ７７ β−（イミダゾリル−４）一プロピオン酸７８
．β一（イミダゾリル−４）一アクリル酸７９．Ｌ−ヒ
スチジン ８０． Ｎ−α−アセチル−Ｌ−ヒスチジンＳｔ．
ヘキサノール−（１） ８２．ヘプタノール−（１） ８３， オクタノール−（１） 澗． ノナノール−（１） ８５， デカノール−（１） ８６． ドデカノール−（１） ８７． テトラデカノール−（１） 羽． ペンタデカノール−（１） ８９． ヘキサデカノール−（１） ９０ ヘプタデカノール−（１） ９１． オクタデカノール−（１） ９２． ノナデカノール−（１） ９３， エイコサノール−（１） ９４． ドコサノール−（１） ９５． シクロヘキサノール ９６， シクロヘキセン−（１）−オール−（１）９
７， シクロへプタノール ９８ シクロオクタノール ９９． シクロノナノール １００ シクロデカノール １０１． シクロドデカノール １０２． シクロヘプタデカノール １０３ シクロヘプタデセン−（９）−オール−（１
）１０４．シトロネロール １０５．ゲラニオール １０６．ネロール １０７ リナロール １０８． ファルネソール １０９８ ネロリドール 】１０． ンスーオクタデセン−（９）−オール−（
１）１１１． フイトール １１２．ペンタンジオール−（１．５） １１３．ヘキサンジオール−（１．６） １１４．ヘプタンジオール−（１．７） １１５．オクタンジオール−（１．８） １１６． ノナンジオール−（１．９）１１７．
デカンジオール−（１．１０）１１８． ドデカンジ
オール−（１，１２）１１９．ヘキサシアノ鉄醗（社）
トリカリウム１２０ ヘキサシアノ鉄酸（Ｉｆ）テト
ラカリウム１２１． テトラシアノニッケル酸（Ｉｔ
）ジカリウム１２２． オクタシアノモリブデン酸（
Ｖ） ｌ−リナトリウム１２３．ペンタシアノ−ニトロ
シル−鉄酸（ＩＩ）ジナトリウム １２４．ペンタシアノ−ニトロシルマンガン酸（Ｉ）ト
リカリウム １２５．ペンタシアノ−ニトロシルクロム酸（Ｉ）｝リ
カリウム １２６．ペンタシアノ−ニトロシルコバルトｅｃＩ）ト
リカリウム １２７． ペンタシアノ−ニトロシル−バナジン酸（
１）ペンタカリウム すべての活性化剤は公知化合物であるか、又は公知化合
物と同様にして製造することができる。
本発明により活性化剤として使用する一般ｇＩ）、（Ｉ
Ｉ）及び（Ｉｖ）の化合物は、含浸溶液１リットル当り
１０−４〜１モル、特に１０−３〜１０−１モルの濃度
で使用し、一般式（ＩＩＤの活性化剤は含浸溶液に０．
５ 〜１０％（ｗ／■）、特に１〜５％（Ｗ／ｖ）で添
加する。
本発明による診断剤は、活性化剤の他に、通常使用され
る成分、例えば常用のエステラーゼ基質又はプロテアー
ゼ基質、緩衝剤、湿潤剤、場合により錯体形成剤及び酸
化剤を含む。
これらの成分は、ドイツ連邦共和国特許出願Ｐ２８
２６９６５．０号、同第２８ ３６ ６４４．１号
及び同第２８ ５４ ９８７．３号明細書に記載さ
れているような方法及び濃度で使用される。
エステラーゼ基質又はプロテアーゼ基質として使用する
色原体は含浸溶液、被覆組成物又は被験液１リットル当
り１０−４〜１モル、特に１０−３〜１０−１モルの濃
度で使用する。
エステル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素、特に白血
球−プロテアーゼの検出用診断剤のもう１つの成分は、
適当な緩衝剤系である。
これには、例えば燐酸塩緩衝剤、硼酸塩緩衝剤、バルビ
ツール酸塩緩衝剤、トリスー（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタン緩衝剤（ニトリス緩衝剤）、２−アミノー２
−メチルプロパンジオール−１，３緩衝剤（ニアメジオ
ール緩衝剤）又はアミノ酸緩衝剤があり、その際ｐＨ値
及び容量は、測定溶液又は試験片においてｐＨ値が６〜
１０、特に７〜９に調節するように、選択しなければな
らない。
エステル分解酵素及び／又は蛋白分解酵素、特に白血球
エステラーゼ又はプロテアーゼの検出用診断剤は、更に
湿潤剤を１成分として含んでいてよい。
非イオン性並びに両性、陽イオン活性又は陰イオン活性
湿潤剤を０．０５〜２％、特に０１〜１％の濃度で使用
するのが有利である。
本発明による診断剤の付加的成分は、適当な錯体形成体
であってよい。
金属塩例えば、鉄、銅、クロム、コバルト、ニッケル、
マンガン及ヒ亜鉛の塩を使用するのが有利である。
これは１０−４〜１０−１モル／ｌ含浸液、特に１０−
３〜１０−２モル／ｌの濃度で使用する。
本発明による診断剤を製造する場合には、更に酸化剤、
例えばヘキサシアノ鉄酸（１）カリウム、臭素酸カリウ
ム、クロム酸カリウム、フエナジンーメトサルフエート
又はテトラゾリウム塩を使用することができる。
酸化剤は、含浸剤、被覆組成物又は被験液１ｌ当り１０
−４〜１モル、特に１０−３〜１０−１の濃度で使用す
る。
本発明による診断剤を製造するには、例えば吸収性支持
体、特に濾紙、セルロース又は合成繊維の不織布を、試
験片の製造に通常使用される必要な試薬（基質、緩衝剤
、活性化剤、場合により湿潤剤、錯体形成剤、酸化剤等
）を易揮発性溶剤、例えば水、メタノール、エタノール
又はアセトンに溶かした溶液で含浸する。
これは２段階で行なうのが有利である： まず、緩衝剤及び場合により水溶性活性化剤を含む水溶
液で含浸する。
次に、エステラーゼ基質又はプロテアーゼ基質、場合に
より非水溶性の活性化剤及び他の非水溶性の添加剤を含
む溶液で含没する。
特別の場合には、逆の含浸順序を適用することもできる
。
出来上った試験紙をそのまま使用してもよく、また公知
の方法で保持具に接着してもよく、またドイツ連邦共和
国特許第２１ １８ ４５５号によりプラスチック
と目の細かい網との間に封入するのが有利である。
フイルムで被覆した試験片を製造するには、フイルム形
成性物質、例えばポリビニルエステル又はポリアミドの
溶液又は分散液中にすべての試薬を装入し、均一に混合
する。
混合物をプラスチック支持体上に薄い層で被覆し、乾燥
する。
本発明によるフイルムで被覆した試験片を乾燥後に切断
し、そのまま使用してもよく、或いは公知方法で保持具
に接着するか、又は例えばドイツ連邦共和国特許第２１
１８ ４５５号によりプラスチツクと目の細い網
との間に封入してもよい。
粉末混合物又は試薬錠剤の形の、エスデル分解酵素及び
／又は蛋白質分解酵素の検出用の本発明による診断剤は
、前記の成分を常用のガレヌス式添加剤と混合し、造粒
することによって製造することができる。
この種の添加剤は、例えば炭水化物、例えば単糖類、オ
リゴ糖若しくは多糖類、又は糖アルコール、例えばマン
ニット、ソルビット若しくはキシリット又は他の可溶性
不活性化合物、例えばポリエチレングリコール又はポリ
ビニルビロリドンである。
粉末混合物又は試薬錠剤は、一般に約５０〜２００ｍｇ
特に５０〜８０■の最終重量を有する。
その都度約５〜２０ｍｇ、特に約１０■の総重量の凍結
乾燥物を製造するには、試験に必要なすべての試薬の他
に、常用の被膜形成剤、例えばポリビニルピロリドン及
び場合により更に充填剤、例えばマンニット、ソルビッ
ト又はキシリットを含む溶液を凍結乾燥する。
溶液の形の本発明による診断剤は試験に必要な試薬をす
べて含むのが有利である。
溶剤としては、水又は水と水溶性有機溶剤、例えばメタ
ノール、エタノール、アセトン又はジメチルホルムアミ
ドとの混合物が挙げられる。
保存性の理由から、試験に必要な試薬を２種以上の溶液
に分け、実際の試験の際に初めて一緒憾するのが有利で
ある。
こうして製造した診断剤は、被験体液中の白血球を着色
又は変色により迅速かつ簡単に検出することができる。
ドイツ連邦共和国特許出願Ｐ２８２６ ９６５．０号
、同Ｐ２８ ３６ ６４４．１号及び同２８ ５
４ ′９８７．３号の診断剤に比べて、本発明による
活性化剤を適用すると、明らかに短縮された反応時間が
観察される。
次に、実姉例に基づいて本発明を詳述する。
例１ 濾紙〔例えばシュライヒヤー・ウント・シュル（Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｅｈｉｉｌｌ）２３ＳＬ）を下
記の溶液で順次含浸し、次に６０℃又は室温で乾燥する
。
溶液１ 水中のトリスー（ヒドロキシメチル）一アミノーメタン
ーＨＣｌ緩衝剤、０．２モル／Ｖ，ｐＨ９．０溶液２ アセトン中の基質溶液」０−３モル／ｌ１本発明による
活性剤を溶解度に応じて溶液１又は溶液２に添加して、
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＶ）の活性化剤の場合
には１０−２モル／ｌ含浸溶液の最終濃度、一般式（Ｉ
ＩＮ）の活性化剤の場合には含浸溶液の２％（ｗ／ｖ）
の最終濃度にする。
第１表には、下記のエステラーゼ基質又はプロテアーゼ
基質を用いた試験結果をまとめる：Ａ−：ジーアセチル
−３′，３“−ジブロム−５′，５“−ジクロルーフェ
ノールスルホンフタレイン、Ｂ：ジーアセチル−４５６
７３’５’３“５″−オクタブロムーフェノールスルホ
ンフタレイン、 ｃ：ジ−（Ｎ−ベンジルカルボニルーＬ−アラニル）
−３’ ， ｓ’ ． ３“，５“−テトラブロム＝フ
エ，ノールスルホンフタレイン Ｄ：ジー（Ｎ−ペンジルオキシカルボニルーＬ−フエニ
ルアラニル） ｓ／ ， ｓ／ ， ３／／ ， ５
“−テトラブロムーフェノールスルホンフタレイン第１
表には、等張食塩溶液１μｌ当り白抑球５０００の標準
溶液中に試験片を浸してから初めて明らかな呈色反応が
起るまでに経過する反応時間を挙げる。
対照値きしては、活性化剤添加物を含まないそれぞれの
処方の反応時間を記載する。
試験した４種の化合物の場合に色は無色から深青色に変
化する。
基質Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤの代わりに他の、ドイツ連邦共和
国特許出願Ｐ２８ ２６ ９６５．０号のスルホン
フタレイン−エステル及び／又は白血球５０００／μｌ
等張食塩溶液の標準液の代わりに尿を使用しても、同様
の試験結果が得られる。
例２ 濾紙（例えばシュライヒヤ・ウント・シュル２３ＳＬ）
を下記の溶液で順次含浸し、次に６０℃又は室温で乾燥
する。
溶液１ 水中のトリス−（ヒドロキシメチル）一アミノメタン−
ＨＣｌ緩衝剤０２モル／ｌ， ｐＨ ７．０（基質Ｅ，
Ｆ及びＧ用）又は 水中のトリス−（ヒドロキシメチル）一アミノメタン−
ＨＣｌ緩衝剤０２モル／ｌ， ｐＨ ８．０（基質Ｈ用
） 溶液２ アセトン中の基質溶液１０−３モル／ｌ 活性化剤の添加及び試，験の実施は、例１と同様に行な
った。
第２表には、下記のプロテアーゼ基質の試験結果をまと
めて示す： Ｅ：チアゾール−２〜アゾー４’−（１′−（Ｎ−ペン
ジルオキシカルボニルーＬ−アラニルオキシ）−５７−
メトキシナフタリン〕 （試１験紙は淡紅色から赤色に変色する）Ｆ：６−メト
キシーベンゾチアゾールー２−アゾー２’−（１’（Ｎ
〜ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニルオキシ）一
ナフタリン〕 （試１験績は淡江色から赤色に変色する）Ｇ： ２ ，
４−ジニトローベンゼン−アゾ−４７一（１’−（Ｎ−
ベンジルオキシカルボニルーＬ−アラニルオキシ）−ベ
ンゼン〕。
（試験紙は黄色から赤紫色に変色する） Ｈ：２，５−ジメトキシーベンゼン−アゾ−４′−（１
’−（Ｎ−ペンジルオキシカルボニルーＬーアラニルオ
キシ）−ナフタリン〕 （試験紙は淡橙色から赤色に変化する）。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液に試験
片を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに経
過する反応時間を記載する。
対照値として、活性化剤を含まない処方の反応時間を記
載する。
基質Ｅ，Ｆ１Ｇ及びＨの代わりに、ドイツ連邦共和国特
許出願Ｐ２８ ３６ ６４４．１号によるアゾ色素
エステル及び／又は等張食塩溶液１μｅ当り白血球５０
００の食塩溶液の代わりに尿を使用しても、同様の結果
が得られる。
例３ 濾紙（例えばシュライヒヤー・ウント・シュル２３ＳＬ
）を下記の溶液で順次含浸し、次に６０℃又は室温で乾
燥する。
溶液１ 水中のテトラ硼酸ナトリウムーＨＣｌ緩衝剤、０２モル
／ｌ，ｐＨ ８．０ 溶液２ アセトン中の基質溶１１０−３モル／ｌ 活性化剤の添加及び試験の実柿は例１と同様に行なった
。
第３表には、下記のプロテアーゼ基質の試験結果をまと
めて示す： Ｉ：３−（Ｎ−（ジフエニルカルバモイル）−Ｌ−アラ
ニルオキシ〕−インドール、 Ｊ ： ３−（Ｎ−（ ５’， ５’−ジメチル−３し
オキソーシクロヘキセン−１−イル）一Ｌ−アラニルオ
キシ〕−インドール、 Ｋ： ３−（Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）一Ｌ−
アラニルオキシ〕−インドール、 等張食塩溶液１μｌ当り白怖球５０００の標準液中に試
験片を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過する反応時間を記載する。
対照値としては、活性化剤を添加してない処方の反応時
間を記載する。
３種の基質を用いて作った試、験片は、白血球を含む溶
液に浸した後、無色から深青色に変色する。
ドイツ連邦共和国特許出願第Ｐ２８ ５４９ ８ ７
． ３号明細書に記載されている他のインドキシルーエ
ステル及び／又は白血球を含む尿を等張食塩溶液１μｌ
当り白血球５０００の標準液の代わりに使用しても同様
の試験結果が達成される。
例４ 濾紙（例えばシュライヒヤー・ウント・シュル２３ＳＬ
）を下記の溶液で順次含浸し、次に６０℃又は室温で乾
燥する。
溶液１ 水中のトリスー（ヒドロキシメチル）一アミノーメタン
ＨＣｌ一緩衝剤、０，２モル／ｌ、ｐＨ９．０溶液２ アセトン中のジーアセチル−３’，５’，３“，５“一
テトラブロムーフエニルスルホンフタレイン、１０−３
モル／１ 本発明による活性化剤を溶液」及び／又は溶液２に溶解
性に応じて単独又は混合物として添加して、一般式（Ｉ
）、（ＩＩ）及び（Ｉｖ）の各活性化剤の場合には含浸
溶液１０−２モル／ｌの最終濃度、一般式（ＩＩＩ）の
活性化剤の場合には２％（ｗ／ｖ）の含浸溶液の最終濃
度が生じるようにした。
第４標には、等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の
標準液に試験片を浸してから初めて明らかな呈色反応が
起るまでに経過した反応時間を挙げる。
対照値として、活性化剤を添加しない処方の反応時間を
記載する。
試験片は、白血球を含む溶液中に浸すと、無色から深青
色へ変色する。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液の代わ
りに、白血球を含む尿を用いても同様の試験結果が達成
される。
例５ 例４に記載した方法で、下記の溶液を用いて試験紙を製
造する： 溶液１ 水中のトリスー（ヒドロキシメチル）−アミノーメタン
ーＨＣｌ緩衝剤、０．２モル／ｌ ， ｐＨ ８．０溶
液２ アセトン中の２−メトキシー４−ニトローベンゼンーア
ゾ−４’−（１’−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−
Ｌ−アラニルオキシ）−ナフタリン〕，１０−３モル／
ｌ， 白血球を含む溶液中に浸すと、試験紙は淡橙色から赤色
に変色する。
第５表には試験結果を示す。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液中に試
験紙を浸してから始めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過する反応時間を記載する。
対照値としては、活性化剤を添加しない処方の反応時間
を記載する。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液の代わ
りに、白血球を含む尿を用いても、同様の試験結果が得
られる。
例６ 下記の溶液を用いて例４に記載した方法で試験紙を製造
する： 溶液１ 水中の四硼酸ナトリウムーＨＣｌ緩衝剤、０．２モル／
ｌ１ ｐＨ ８．０ 溶液２ アセトン中の３−ｒ（Ｎ−（２’−ニトロベンゼンース
ルフエニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−インドール、１
０−３モル／ｌ１ 試験紙は、白血球を含む溶液中に浸すと、黄色から緑色
に変色する。
試験結果を第６表に挙げる。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液中に試
験紙を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過した反応時間を挙げる。
対照値としては、活性化剤を添加しない処方の反応時間
を挙げる。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液の代わ
りに、白血球を含む尿を用いても同様の試験結果が得ら
れる。
例７ 下記の溶液を用いて例４に記載した方法で試験紙を製造
する。
溶液１ 水中の四硼酸ナトリウムーＨＣＡ緩衝剤、０．２モル／
ｌ，ｐＨ８．０ 溶液２ アセトン中の３ − （ Ｎ − （ベンゾイル）−Ｄ
，Ｌ−アラニルオキシ〕−インドール、１０−３モル／
ｌ， 試験結果を第７表に示す。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液中に試
験紙を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過した反応時間を挙げる。
対照値としては、活性化剤を添加しない処方の反応時間
を挙げる。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液の代わ
りに、白血球を含む尿を用いても同様の試験結果が得ら
れる。
例７ａ 下記の溶液を用いて例４に記載した方法で製造する： 溶液１ 水中の四硼酸ナトリウムーＨＣｌ 緩衝剤、０２モル／
ｌ、 ｐＨ ８．０ 溶液２ アセトン中の３ − （ Ｎ −トルエンー４７−スル
ホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−インドール、１０−
３モル／ｌ、 試験紙は、白血球を含む溶液中に浸すと無色から青色に
変色する。
試験結果を第７ａ表に示す。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液中に試
験紙を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過する反応時間を挙げる。
対照値としては、添加剤を添加しない処方の反応時間を
挙げる。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液の代わ
りに、白血球を含む尿を用いても同様の試験結果が得ら
れる。
例８ 濾紙（例えばシュライヒヤー・ウント・シュル２３ＳＬ
）を下記の溶液で順次含浸し、次に６０℃又は室温で乾
燥する。
溶液１ 水中のトリスー（ヒドロキシメチル）−アミノーメタン
ーＨＣｌ緩衝剤（０．２モル／ｌｓｐＨ７．０）中の０
．２％ラウリルピリジニウムクロリド溶液 溶液２ アセトン中のチアゾール−２−アゾー４７ （１’−
（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルーし−アラニルオキシ
）−ナフタリン〕、１０−３モル／ｌ、活性化剤の添加
及び試験の実癩は例１と同様に行なった。
試験紙は、白血球を含む溶液中に浸すと深紅色から紫色
に変色する。
第８表には、試験結果を示す。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液中に試
験紙を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過する反応時間を挙げる。
対照値としては、活性化剤を添加しない処方の反応時間
を挙げる。
例１〜例７に記載した他の基質及び活性化剤及び／又は
他の常用の湿潤剤を用いても、同様の試験結果が得られ
る。
例９ 濾紙（例えばシユライヒヤー・ウント・シュル２３ＳＬ
）を下記の溶液で順次含浸し、次に６０℃又は室温で乾
燥する。
溶液１ 水中のトリスー（ヒドロキンメチル）−アミノーメタン
ーＩ−■Ｃｌ緩衝剤、０２モル／ｌ，ｐＨ ７．０溶液
２ アセトン中のチアゾール−２−アゾー１／ （２／−
（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルーし−アラニルオキシ
）−ナフタリン）、１０−’モル／ｌ及び酢酸亜鉛１０
−３モル／ｌ 活性化剤の添加及び試験の実癩は、例１と同様に行なっ
た。
試験祇は、白血球を含む溶液に浸すと淡紅色から青紫色
に変色する。
第９表には、試験結果を示す。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液中に試
験紙を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過する反応時間を挙げる。
対照値としては、活性化剤を添加しない処方の反応時間
を使用する。
ドイツ連邦共和国特ｄ１−出願第Ｐ２８ ３６６４４
．１号の前記以外のアゾ色素エステル、例１〜例７に挙
げた他の活性化剤及び／又は他の常用の錯体形成剤を用
いても、同様の試験結果が得られる。
例１０ 濾紙（例えばシュライヒヤー・ウント・シュル２３ＳＬ
）を下記の溶液を用いて順次含浸し、次に６０℃又は室
温で乾燥する。
溶液１ 水中の四硼酸ナトリウムーＨＣｌ緩衝剤０．２モル／ｌ
中の臭素酸カリウム１０−２モル／ｌ，溶液２ アセトン中の３−（Ｎ−ホルミルーＬ−アラニルオキシ
〕−インドール、１０−３モル／ｌ，活性化剤の添加及
び試験の実施は例１と同様に行なった。
試験紙は、白血球を含む溶液に授すと無色から青色に変
色する。
第１０表には、試験結果を示す。
等張食塩溶液１μｌ当り白血球５０００の標準液中に試
験紙を浸してから初めて明らかな呈色反応が起るまでに
経過した反応時間を挙げる。
対照値としては、活性化剤を添加しない処方の反応時間
を使用する。
ドイツ連邦共和国特許出願第Ｐ２８ ５４９ ８ ７
． ３号の前記以外のインドキシルエステル、例１一例
７に記載した他の活性化剤及び他の常用の酸化剤を用い
ても、同様の試，験結果が得られる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 常用のエステラーゼ基質及び／又はプロテアーゼ基
    質並びに常用の付加的助剤を含み、体液中のエステル分
    解酵素及び／又は蛋白質分解酵素を検出する診断剤にお
    いて、更に 〔式中Ｒｌ ｙ Ｒ２ ， Ｒ３ ， Ｒ４及びＲ５は
    同一又は異なっていてよく、それぞれ水素、ハロゲン、
    低級アルキル基、低級アルコキシ基又はビニル基を表わ
    し、このビニル基は場合により低級アルコキシ基、アミ
    ノ基、アルキルアミノ基若しくはジアルキルメチル基を
    １個以上有するアリール基又はへテロ項式基で置換され
    ているか、又はそれぞれ２個の隣接した置換基は場合に
    よりハロゲン、水酸基、低級アルキル基若しくは低級ア
    ルコキシ基で１個以上置換された、縮合インデン環成い
    はベンゼン環を形成する基を表わし、この基は場合によ
    り低級アルキル基で置換された、縮合ベンゼン項又はビ
    リジン環を形成する基を有していてもよく、Ｒ３は更に
    ビニルーキヌクリジルーカルビノール基を表わしてもよ
    い〕のピリジン誘導体、 ｂ）一般式（■）： 〔式中Ｒ／，は水素、低級アルキル基又は場合により水
    酸基若しくはアシル基で置換されたアリール基を表わし
    、Ｒ′２は水素、アミノアルキル基、Ｎ−アシルアミノ
    アルキル基又は飽和若しくは不飽和の低級脂肪族カルボ
    ン酸残基又は場合により窒素がアンル化された低級脂肪
    族αーアミノ酸残基を表わす〕のイミダゾール誘導体、 Ｃ）一般式（ＩＩＩ） ： Ｘ − Ａ − Ｏ Ｈ （Ｉ［Ｄ
    〔式中Ｘは水素又は水酸基を表わし、Ａは炭化水素基を
    表わす〕のアルコール及び ｄ）一般式（ＩＶ）： 貼ＣＢ（ＣＮ）ｎ（Ｎｏ），） （ｒＶ）〔式中Ｄ
    はアルカリ金属イオン、Ｂは重金属イオン、ｍは２〜５
    の整数を表わし、ｎは４〜８の整数を表わし、ｐはＯ又
    は１を表わし、数値ｍは重金属イオンの電荷及び数値ｎ
    により決まる〕の金属錯体の群から選択した１種以上の
    活性化剤を含むことを特徴とする体液中のエステル分解
    酵素及び／又は蛋白質分解酵素の検出用診断剤。 ２ 付加的助剤として緩衝剤、錯体形成剤、湿潤剤、酸
    化剤、フイルム形成剤、ガレヌス式添加剤及び／又は被
    膜形成剤を使用した特許請求の範囲第１項記載の診断剤
    。 ３ 体液、特に尿中の白血球を検出する特許請求の範囲
    第１項又は第２項に記載の診断剤。
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