JPS584560B2 - 鉄錯塩を用いた酵素活性測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は芳香族第一級アミンの誘導体を酵氷活性測定の
基質として使用し、新規に調製された安定な鉄錯塩試薬
にて呈色させる新規酵素活性測定法に関するものである
。

酵素活性を有する物質、例えば体液中の血清、唾液、髄
液、尿、胃液等は種々の診断試料として用いられている
。

血清を例にとって説明すると血清中に存在するペプチダ
ーゼ、トランスペプチターゼ等の活性は生体の生理的・
病的状態により著しく変動することが知られており、例
えばγ・グルタミルトランスペプテダーゼ（γ・ＧＴＰ
ａｓｅと略記）、ロイシンアミノペプチダーゼ （ＬＡＰａｓｅと略記）は肝疾患の診断、システインア
ミノペプチダーゼ（ＣＡＰａｓｅと略記）は妊娠時の胎
盤機能の診断に広く使用され重要な診断法となっている
。

通常生体成分を比色測定する場合、測定に使用する波長
が６ ０ ０ ｎｍ以上であれば化体に存在する色素類
の影響を受けずに比色定量できるといわれている。

一般にペプチダーゼ、トレンスペプチダーゼ等の酵素活
性測定は、ｐ−ニトロアニリンの誘導体を基質として使
用し、酵素反応により遊離してくる黄色に着色したｐ−
ニトロアニリンを比色する方法、又はβ−ナフチルアミ
ンの誘導体を基質とし、酵素反応により遊離するβ−ナ
フチルアミンをジアゾ反応で黄色又は赤色に呈色して測
定する方法が知られている。

しかし、血清中には黄色の色素が存在したり、一部溶血
している時は赤色を呈したりして公知の方法での測定の
場合は血清成分が測定値に影響を与えるため、６００ｎ
ｍ以上の長波長域で比色測定できる方法が強く望まれて
いる。

本発明者等は、これらの欠点を補なうべく鋭意研究を重
ね、芳香族アミンの誘導体を基質として用い、酵素反応
により遊離される芳香族アミンを鉄錯塩により青色又は
青緑色に呈色させ、血清中の他の成分に影響されること
なしに血清中の酵素活性を測定する方法を見出した。

この方法は血清中の酵素活性測定のみでなく、もちろん
他の酵素活性を有する物質にも応用できるものである。

芳香族アミン、特に第一級アミン類がペンタシアノアミ
ノフエロエートを臭素水処理した試薬により青色又は緑
色に呈色することは、ミクロチミカ・アクタ（ Ｍｉｋ
ｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ） ２巻３頁（１９３７
年）に記載されている。

しかし、この試薬は定量試薬としては使用されず、又、
不安定で保存中に沈澱を生じ実用的診断試薬として使用
することは不可能であった。

本発明者らはこれらの欠点を補なうべく研究を重ね、ペ
ンタシアノアミノフエロエートを過酸化物で処理するこ
とにより安定な、しかも是量性のある呈色能を示す芳香
族アミン呈色試薬を調製することができることを見出し
た。

過酸化物処理に用いる過酸化物としては過沃素酸のナト
リウム塩及びカリウム塩、過マンガン酸カリ、過酸化水
素等が良好であるが、過酸化水素が最適である。

又、鉄錯塩に重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウム、重炭
酸リチウム、重炭酸カリ等と低分子デキストランを配合
するとさらに安定な鉄錯塩試薬が得られる。

またこれらの配合薬剤を凍結乾燥した場合は鉄錯塩は非
常に安定なものとなるので、呈色反応試薬として製剤化
する場合は凍結乾燥製剤とすることが望ましい。

また、この呈色反応を血清酵素活性測定に使用するに際
し、前述の文献に示されたような公知のアルカリ性液中
で呈色させることは、混在する血清の影響を著しく受け
、定量されるアミン量と測定される吸光度との間に直線
関係を見出すことが困難であり、これは酵素活性測定に
当り著しく不利な欠点である。

この欠点を補なうためには、呈色時に弱酸性の緩衝液を
使用するとよい。

使用される緩衝液のｐＨは３．０〜７．０であり、最適
ｐＨは４，０〜５．５である。

又、緩衝液の種類は通常使用される弱酸性緩衝液は全て
使用できるが、乳酸、クエン酸、シュウ酸等よりなる緩
衝液が最適である。

緩衝液の濃度は、０．０１〜１モルが使用されるが、０
．０５〜０．４モルが最適である。

酵素活性の測定にはそれぞれの酵素に適合した芳香族ア
ミン誘導体を酵素基質として用いる。

例エハγ・ＧＴＰａｓｅの測定にはγ−Ｌ−グルタミン
誘導体を、ＣＡＰａｓｅ測定にはＳ−ベンジルーし−シ
ステイニル誘導体を、ＬＡＰａｓｅの測定にはＬアロイ
シル誘導体をそれぞれ基質として使用する。

それぞれの基質と血清を３０分間酵素反応させた後に遊
離した芳香族アミンを該試薬にて呈色させ測定する。

これらの反応により遊離される芳香族アミンとしては などがあげられる。

これらの芳香族アミンを過酸化物処理したペンタシアノ
アミノフエロエートを用いて発色させたときの測定波長
および吸光度を参考のために第１表に示す。

０．２ｍＭアミン液を呈色させた時の吸光度。

したがって本発明の方法を用いることにより、長波測で
他物質の防害を受けずに酵素活性を測定することができ
る。

酵素反応時の実際の呈色操作は次の様にして行なわれる
。

すなわち、前述の鉄錯塩を含む呈色試薬１容を塩化ナト
リウムまたは塩化カリウムを１．０％含む０．２モルｐ
Ｈ４．５の緩衝液５０容に溶解したものを反応停止呈色
液とし、酵素反応液の５倍容加え室温に２０分放置後に
比色定量する。

血清酵素活性を測定する場合、試薬ブランクとして、血
清の代りに水を使用し、同様に処理呈色させたものを測
定し、血清を使用したときの測定値との吸光度の差（△
ＣＤ）にて活性を表示できる。

呈色液は青又は青緑色を呈し、６００ｎｍ以上の長波長
領域で測定されるため血清中の色素類による影響は全く
認められず、又、血清自身の呈色も認められないので、
多数の血清を測定する場合でも対照試験は、水を使用し
た試薬ブランクのみで十分である。

第２表にこのようにして測定された酵素活性の結果の数
例について記載する。

次に実施例をあげて本発明の方法を具体的に説明するが
本発明はこれによって限定されるものではない。

実施例 １ ナトリウムペンタシアノアミノフエロエート２グを水２
０ｍｌに溶解し、０．３％過酸化水素液６０ｍｌを加え
、さらに１０％重炭酸ナトリウム液２０ｍｌを加える。

次に低分子デキストラン４ｇを加え、呈色原液を調製す
る。

反応停止・呈色液は呈色原液１ ｍｌに０．２ＭｐＨ４
．５の乳酸緩衝液（１％塩化ナトリウムを含む）５０ｍ
ｌを加えて調製する。

Ｌ−γ・グルタミルージメチル−ｐ−フエニレンジアミ
ド１５０ｍｇをメチルセロソルブ６ｍｌと０．１２５Ｎ
塩酸４ｍｌの混液に溶解し基質液を調製する。

グリシルグリシン０．８ｇ、塩化ナトリウム０．５グ、
ツイン８０ ０．５ｇを１００ｍｌの水に溶解し、６Ｎ
カセーソーダにてｐＨ８．３にして緩衝液を調製する。

基質液と緩衝液を混合し、基質緩衝液を調製する。

基質緩衝液１ ｍｌを試験管に入れ、３７℃に加温しヒ
ト血清０．０５ｍｌ加え、３０分間反応させ３０分後に
反応停止・呈色液５ｍｌを加え、室温に２０分間放置し
、呈色させた後、６６０ｎｍにて吸光度を測定する。

ブランクとして、ヒト血清の代りに水０．０５ｍｌを加
え同様に処理したものを測定し、ブランク値とし、測定
値とブランク値との差より、ヒト血清中のγ・ＧＴＰａ
ｓｅ活性が得られる。

実施例 ２ Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインーＰ−ハイドロキシアニ
リド１００ｍｇをジオキサン３ｍｌと０．１６Ｎ塩酸２
ｍｌの混液に溶解し、基質液を調製する。

ツイン８０を１．２５％含む０． １ Ｍ トリエタノ
ールアミンークエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍｌ
に基質液を混合し、基質緩衝液を調製する。

基質緩衝液１ ｍｌを試験管に入れ３７℃に加温後、ヒ
ト血清０．０５ｍｌ加えて３０分間反応させ、３０分後
に実施例１にて調製した反応停止・呈色液５ｍｌを加え
、室温に２０分間放置し、呈色させた後６６０ｎｍにて
吸光度を測定する。

ブランクとして、ヒト血清の代りに水０．０５ｍｌを加
えて同様に処理したものを測定し、ブランク値とし、測
定値とブランク値との差よりヒト血清中のＣＡＰａｓｅ
活性が得られる。

実施例 ３ Ｌ一ロイシンーＰ−ヒドロキシアニリド１００ｍｇをメ
チルセロソルブ３ｍｌと０．２５Ｎ塩酸２ｍｌの混液に
溶解し基質液を調製する。

ツイン８０を０．５％含む、０．１Ｍトリエタノールア
ミン・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌに基質液を
混合し、基質緩衝液を調製する。

基質緩衝液１ｍｌを試験管に入れ３７℃に加温後、ヒト
血清０．０５ｍｌ加えて３０分間反応させ、３０分後に
実施例１にて調製した反応停止・呈色液５ｍｌを加え室
温に２０分間放置し、呈色させた後６ ６ ０ｎｍにて
吸光度を測定する。

ブランクとして、ヒト血清の代りに水０．０５ｍｌを加
えて同様に処理したものを測定し、ブランク値とし、測
定値とブランク値との差より、ヒト血清中のＬＡＰａｓ
ｅ活性が得られる。

実施例 ４ Ｎ−ベンジルーＬ−チロシンージメチルーｐ−フエニレ
ンジアミド３０ｍｇをアセトン５ｍｌに溶解して基質液
を調製する。

０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．８）（５ｍＭ塩化カル
シウム、１％ツイン８０を含む）１００ｍｌと基質液を
混合して基質緩衝液を調製する。

基質緩衝液１ｍｌを試験管に入れ３７℃に加温後、キモ
トリプシンを含む溶液０．０５ｍｌを加え３０分間反応
させ、３０分後に実施例１にて調製した反応停止・呈色
液５ｍｌを加え室温に２０分間放置し呈色させた後、６
６ ０ ｎｍにて吸光度を測定する。

ブランクとして、キモトリプシン含有液の代りに水０．
０５ｍｌを加え、同様に処理したものを測定し、ブラン
ク値とし、測定値とブランク値との差よりキモトリプシ
ン活性が得られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 芳香族アミン誘導体を基質とし、これに酵素活性を
   有する物質および過酸化物で処理した鉄錯塩を加えて呈
   色させることを特徴とする酵素活性測定法。