JPH01207244A - 血小板減少症治療剤 - Google Patents
血小板減少症治療剤Info
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- JPH01207244A JPH01207244A JP63029819A JP2981988A JPH01207244A JP H01207244 A JPH01207244 A JP H01207244A JP 63029819 A JP63029819 A JP 63029819A JP 2981988 A JP2981988 A JP 2981988A JP H01207244 A JPH01207244 A JP H01207244A
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- Japan
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- amino acid
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- thrombocytopenia
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ω産業上の利用分野
本発明は、種々の原因によって起こる造血障害に伴う血
小板減少症の治療剤に関し、史に訂しくは、ヒト造血因
子の一種であるヒト単球−マクロファージコロニー刺激
因子を有効成分とする血小板減少症治療剤に関するもの
である。
小板減少症の治療剤に関し、史に訂しくは、ヒト造血因
子の一種であるヒト単球−マクロファージコロニー刺激
因子を有効成分とする血小板減少症治療剤に関するもの
である。
（罎従来技術
種々の迄面障害によって、顕署な血小板の減少または機
能低下に基づき、現に重篤な出血を見ているか、または
その恐れの強い病態に対して、血小板輸血が有力な手段
となっている。しかし、各医療の現場について見ると、
十分ｍの血小＆製剤が迅速に供給されている状況ではな
く、かつ、血小板輸血に伴いＡ Ｔ Ｌ （ａｄｌＪｌ
ｔ Ｔ Ｃｏ１ｔ ｌｃｕｋｅｍｉａ 。
能低下に基づき、現に重篤な出血を見ているか、または
その恐れの強い病態に対して、血小板輸血が有力な手段
となっている。しかし、各医療の現場について見ると、
十分ｍの血小＆製剤が迅速に供給されている状況ではな
く、かつ、血小板輸血に伴いＡ Ｔ Ｌ （ａｄｌＪｌ
ｔ Ｔ Ｃｏ１ｔ ｌｃｕｋｅｍｉａ 。
成人下細胞白血病）やＡＩ Ｄ Ｓ （ａｃｑｕｉｒｅ
ｄｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒ
ｏｍｅ 、 後天性免疫不全症候群）等の病原体である
ウィルスに感染する危陰性が著しく増大している。
ｄｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒ
ｏｍｅ 、 後天性免疫不全症候群）等の病原体である
ウィルスに感染する危陰性が著しく増大している。
ぐ９本発明が解決しようとする問題点
白血病や悪性腫瘍の薬剤ないし放射線による治療中や、
再生不良に貧血の経過中において、小篤な出血を現に見
ているか、またはその恐れの強い病態に対して、血小板
の産生を促進することを目的とし又検討を行った結果、
本発明に係るヒトＦｉ１球−マクロファージコロニー刺
激因子を有効成分としてなる製剤を悪性腫瘍の化学療法
において投与することによって血中の血小板レベルの１
富１ｔｌ’ｉへの復帰が甲急におこることを見いだして
本発明を完成した。
再生不良に貧血の経過中において、小篤な出血を現に見
ているか、またはその恐れの強い病態に対して、血小板
の産生を促進することを目的とし又検討を行った結果、
本発明に係るヒトＦｉ１球−マクロファージコロニー刺
激因子を有効成分としてなる製剤を悪性腫瘍の化学療法
において投与することによって血中の血小板レベルの１
富１ｔｌ’ｉへの復帰が甲急におこることを見いだして
本発明を完成した。
〈→問題点を解決するための手段
本発明の冶捺剤の有効成分であるコロニー刺激糖蛋白質
（以下、Ｃ８Ｆという）は、本出願人の１人が出願した
特願昭６２−１７８６９７号に記載されており、哺乳動
物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成刺激作
用をｈし、次の方法によって製造される。
（以下、Ｃ８Ｆという）は、本出願人の１人が出願した
特願昭６２−１７８６９７号に記載されており、哺乳動
物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成刺激作
用をｈし、次の方法によって製造される。
叶法人の尿をｐＨ８，０〜９．０に調整し、尿中の粘性
物質を沈澱・除去し、その上澄を分子帛１ｏ、ｏｏｏ〜
５０，０００ダルトンを通過さける限外濾過膜を用いて
濃縮と脱塩を行う。
物質を沈澱・除去し、その上澄を分子帛１ｏ、ｏｏｏ〜
５０，０００ダルトンを通過さける限外濾過膜を用いて
濃縮と脱塩を行う。
少なくとも２００倍以上に８″：Ｊ縮（蛋白質す５度と
して１％（Ｗ／Ｖ）以上）しだ後ｐｌ＋を６．５〜７．
５に調整し、６０℃で１０時間加熱処理（ウィルス等の
不活化）する。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオ
ン交換体、例えばＤ Ｅ Ａ Ｅ −ｔルロース等、に
有効成分を吸着させる。
して１％（Ｗ／Ｖ）以上）しだ後ｐｌ＋を６．５〜７．
５に調整し、６０℃で１０時間加熱処理（ウィルス等の
不活化）する。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオ
ン交換体、例えばＤ Ｅ Ａ Ｅ −ｔルロース等、に
有効成分を吸着させる。
次に０．０５〜０．１Ｍの籾）Ｈ液（ｆ）＋１６．５〜
７．５）で該イオン交換体を洗浄した後０．２・−０，
４Ｍの緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５）で有効成分を溶出
する。該溶出液を必要ならば限外濾過膜Ｔ：澹縮し、１
Ｍ〜４Ｍの塩類、例えば硫安、食塩等を含有するｇ街液
（ｐＨ６，５〜７．５）で平衡化させたゲル濾過剤、例
えば５ｃｐｈａｃｒｙｌ■５−３００ （Ｐｈａｒａ＋
ａｃｉａ Ｊｌ ’ＩＪ ）でグル濾過し、分子ｆｌｌ
ｌＫ囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの両分
を回収り゛る。次に該両分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝
液で平衡化させた疎水性親和体、例えばＰｔ＋ｃｎｙｌ
−３ｅｐｈａｒｏｓｅ■（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社製）
に吸着させ、０．５〜１．０Ｍ（１）Ｆ含ｎ緩衝液（ｐ
Ｈ６，５〜７．５）で溶出する。該溶出液を限外濾過膜
で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例えばＴ Ｓ Ｋ
Ｇ −３０００８Ｗ （東洋ｇＩｉ達製）でグル濾過
し、分子ζｄ範囲が７０，０００〜１５０．０００ダル
トンの両分を回収する。該両分を再痘、濃縮し、０．１
％トリフルオロ酢１！ｌ （−ｒ Ｆ△）溶液（ｐｉｆ
１〜２）で平衡化した高速液体逆相カラム、例えば、１
ｌｉ−ＰｏｒｅｏＲＰ −３０／Ｉ （パイオラドネ１
胃）に吸着させ、０．１％丁ＦＡを含む溶剤、例えばア
セトニトリル又はイソプロパツールの直線濃度勾配溶出
法により溶出する。このようにして１１？られたＣ８Ｆ
は、比活性ｌＸ１０８単位／ｍ’ｊ−蛋白質以上を有す
る純粋な物質である。
７．５）で該イオン交換体を洗浄した後０．２・−０，
４Ｍの緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５）で有効成分を溶出
する。該溶出液を必要ならば限外濾過膜Ｔ：澹縮し、１
Ｍ〜４Ｍの塩類、例えば硫安、食塩等を含有するｇ街液
（ｐＨ６，５〜７．５）で平衡化させたゲル濾過剤、例
えば５ｃｐｈａｃｒｙｌ■５−３００ （Ｐｈａｒａ＋
ａｃｉａ Ｊｌ ’ＩＪ ）でグル濾過し、分子ｆｌｌ
ｌＫ囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの両分
を回収り゛る。次に該両分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝
液で平衡化させた疎水性親和体、例えばＰｔ＋ｃｎｙｌ
−３ｅｐｈａｒｏｓｅ■（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社製）
に吸着させ、０．５〜１．０Ｍ（１）Ｆ含ｎ緩衝液（ｐ
Ｈ６，５〜７．５）で溶出する。該溶出液を限外濾過膜
で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例えばＴ Ｓ Ｋ
Ｇ −３０００８Ｗ （東洋ｇＩｉ達製）でグル濾過
し、分子ζｄ範囲が７０，０００〜１５０．０００ダル
トンの両分を回収する。該両分を再痘、濃縮し、０．１
％トリフルオロ酢１！ｌ （−ｒ Ｆ△）溶液（ｐｉｆ
１〜２）で平衡化した高速液体逆相カラム、例えば、１
ｌｉ−ＰｏｒｅｏＲＰ −３０／Ｉ （パイオラドネ１
胃）に吸着させ、０．１％丁ＦＡを含む溶剤、例えばア
セトニトリル又はイソプロパツールの直線濃度勾配溶出
法により溶出する。このようにして１１？られたＣ８Ｆ
は、比活性ｌＸ１０８単位／ｍ’ｊ−蛋白質以上を有す
る純粋な物質である。
本発明のＣ８Ｆは史に木Ｃ３Ｆに対する特１．１４抗体
との反応を利用して製造することができる。
との反応を利用して製造することができる。
この￥Ａ造法は、次の３つの［程からなる。以ド順次説
明する。
明する。
■ コロニー刺激糖蛋白質に対する特異抗体（以下、抗
Ｃ８Ｆ抗体という）のＷＡ製 前記第１の製造法又は、別個に行なったこの製造法によ
って１りられた本発明のＣ８Ｆを用いて、哺乳動物例え
ばウサＡ！、ヤギ、ヒツジ及びウマ等を免疫する。即ち
、本発明のＣＳ Ｆを０．１〜１．０ＩｒＫＩ／−の濃
度になるように生理食塩液に溶解して、フロイントの完
全アジニＬパン１−と等１ｄ混合し、哺乳動物の皮下へ
、週１〜２回、４〜８週間投与して免疫する。免疫初物
の血中抗体価がト貸したら、静注又は皮下性による追加
免疫を行い、追加免疫後３〜７日目に採血を行い、Ｃ８
Ｆ抗而清を採取する。採取した抗血清のＣ８Ｆに対する
抗体価は、後述するＣ８Ｆ生物力価中和試験によって測
定されるが、抗血清中のＣ８Ｆ抗体価は、１−当り５×
１０６単位以上のＣ３Ｆ生物力価を中和する抗血ト１１
を選択することが望ましい。採取した抗血清は、２回の
硫安塩析及びＤＥＡＥ−セルローズクロマトグラフィー
等によって、免疫グロブリンＧ又はＭ画分の抗Ｃ３Ｆ抗
体として精製する。また必要であれば、Ｃ８Ｆ又は抗Ｃ
５Ｆ抗体と交錯反応を示す夾雑タンパク質をリガンドと
する抗原カラムへ抗Ｃ３Ｆ抗体を通液し、抗Ｃ８Ｆ抗体
のみを吸着するか又は夾雑タンパク質を吸着させて、更
に抗Ｃ８Ｆ抗体を粘［Ｊる。
Ｃ８Ｆ抗体という）のＷＡ製 前記第１の製造法又は、別個に行なったこの製造法によ
って１りられた本発明のＣ８Ｆを用いて、哺乳動物例え
ばウサＡ！、ヤギ、ヒツジ及びウマ等を免疫する。即ち
、本発明のＣＳ Ｆを０．１〜１．０ＩｒＫＩ／−の濃
度になるように生理食塩液に溶解して、フロイントの完
全アジニＬパン１−と等１ｄ混合し、哺乳動物の皮下へ
、週１〜２回、４〜８週間投与して免疫する。免疫初物
の血中抗体価がト貸したら、静注又は皮下性による追加
免疫を行い、追加免疫後３〜７日目に採血を行い、Ｃ８
Ｆ抗而清を採取する。採取した抗血清のＣ８Ｆに対する
抗体価は、後述するＣ８Ｆ生物力価中和試験によって測
定されるが、抗血清中のＣ８Ｆ抗体価は、１−当り５×
１０６単位以上のＣ３Ｆ生物力価を中和する抗血ト１１
を選択することが望ましい。採取した抗血清は、２回の
硫安塩析及びＤＥＡＥ−セルローズクロマトグラフィー
等によって、免疫グロブリンＧ又はＭ画分の抗Ｃ３Ｆ抗
体として精製する。また必要であれば、Ｃ８Ｆ又は抗Ｃ
５Ｆ抗体と交錯反応を示す夾雑タンパク質をリガンドと
する抗原カラムへ抗Ｃ３Ｆ抗体を通液し、抗Ｃ８Ｆ抗体
のみを吸着するか又は夾雑タンパク質を吸着させて、更
に抗Ｃ８Ｆ抗体を粘［Ｊる。
■ 抗体結合支持体の調製工程
Ｃ８Ｆ抗体を結合し得る不溶性支持体は、抗体蛋白質の
ＮＨ２−基又はＣＯＯＩ−１−堪と化学結合できる不溶
性支持体であれば、公知のいずれのもので６使用できる
。例えば、臭化シアン活性化又はエポキシ化多糖体ゲル
、フォルミル化多糖体ゲル、アミノエチル化又はヒドラ
ジド化ポリマー等である。不溶性支持体と抗Ｃ８Ｆ抗体
との結合反応は、選択される不溶性支持体の結合基によ
って条件が異なるので、結合反応の至適条件となるよう
抗体を調整する。例えば、臭化シアン活性化支持体の場
合は、ｐ１１８〜１０の炭Ｍ！ｌ！液へ、エポキシ化支
持体の場合は、９１１１０以上の溶液へ、またフォルミ
ル化支持体の場合は、中性の溶液へ、それぞれ抗体を溶
解し、調整する。またその結合反応の温度条件も不溶性
支持体によって異なるが、本発明の結合反応の場合は、
２５℃以下の低温で行なうのが望ましい。特に臭化シア
ン活性化支持体の場合は、４℃以下で行う。結合させる
抗体量は、不溶性支持体１ｇ（湿重聞）当り、１０〜５
０ＩＩｔＦＪ、好ましくは２０〜３０■であり、結合反
応時の抗体濃度を１〜４％（Ｗ／Ｖ ）に調整する５、
結合反応終了後、支持体に残″つた抗体結合支持体を適
当な処理法で不活性化し、抗体結合支持体を得る。
ＮＨ２−基又はＣＯＯＩ−１−堪と化学結合できる不溶
性支持体であれば、公知のいずれのもので６使用できる
。例えば、臭化シアン活性化又はエポキシ化多糖体ゲル
、フォルミル化多糖体ゲル、アミノエチル化又はヒドラ
ジド化ポリマー等である。不溶性支持体と抗Ｃ８Ｆ抗体
との結合反応は、選択される不溶性支持体の結合基によ
って条件が異なるので、結合反応の至適条件となるよう
抗体を調整する。例えば、臭化シアン活性化支持体の場
合は、ｐ１１８〜１０の炭Ｍ！ｌ！液へ、エポキシ化支
持体の場合は、９１１１０以上の溶液へ、またフォルミ
ル化支持体の場合は、中性の溶液へ、それぞれ抗体を溶
解し、調整する。またその結合反応の温度条件も不溶性
支持体によって異なるが、本発明の結合反応の場合は、
２５℃以下の低温で行なうのが望ましい。特に臭化シア
ン活性化支持体の場合は、４℃以下で行う。結合させる
抗体量は、不溶性支持体１ｇ（湿重聞）当り、１０〜５
０ＩＩｔＦＪ、好ましくは２０〜３０■であり、結合反
応時の抗体濃度を１〜４％（Ｗ／Ｖ ）に調整する５、
結合反応終了後、支持体に残″つた抗体結合支持体を適
当な処理法で不活性化し、抗体結合支持体を得る。
■ 抗体結合支持体によるＣ８Ｆの精製工程抗体結合支
持体を０．５〜１．０Ｍの塩、例えば塩化ナトリウムを
含むｐ１１６〜８の緩衝液で洗浄する。洗浄した抗体結
合支持体は、カラムへ充填するか又は１ｉ 雨液に懸濁
させる。前者はカラム式、クロマトグラフィー、後者は
、バッチ式クロマトグラフィーとして使用する。本発明
のＣ８Ｆを含有する溶液は、例えば人尿濃縮液、Ｃ３Ｆ
産生細胞培養上澄液或いはＣ５Ｆ遭伝了ＩＩ換え細胞培
基上澄液などが用いられ、これを１）８６〜８に調整し
、次いで抗体結合支持体の洗浄に使用した前記ｆｆ１Ｖ
ＩＪ液と同一の緩衝液と平衡化させるか又は０．５〜１
．０Ｍ１７１度になるＪ、うに塩化ナトリウムを加え、
この処理液と抗体結合支持体とを接触させる。接触はカ
ラム式又はバッチ式のクロマトグラフィーで行なわれ、
カラム式クロマトグラフィーの場合は、゛デ渇以下、好
ましくは１０℃以下で、流速５〜２０ｄ／α２・時間で
通液させ、Ｃ５Ｆを抗体結合支持体のカラムへ吸着させ
る。吸？ｊＣ８Ｆ吊は、抗体結合支持体１ｇ（ｉｆｉｉ
１重吊）当り、５００〜２．０００万単位が望ましい。
持体を０．５〜１．０Ｍの塩、例えば塩化ナトリウムを
含むｐ１１６〜８の緩衝液で洗浄する。洗浄した抗体結
合支持体は、カラムへ充填するか又は１ｉ 雨液に懸濁
させる。前者はカラム式、クロマトグラフィー、後者は
、バッチ式クロマトグラフィーとして使用する。本発明
のＣ８Ｆを含有する溶液は、例えば人尿濃縮液、Ｃ３Ｆ
産生細胞培養上澄液或いはＣ５Ｆ遭伝了ＩＩ換え細胞培
基上澄液などが用いられ、これを１）８６〜８に調整し
、次いで抗体結合支持体の洗浄に使用した前記ｆｆ１Ｖ
ＩＪ液と同一の緩衝液と平衡化させるか又は０．５〜１
．０Ｍ１７１度になるＪ、うに塩化ナトリウムを加え、
この処理液と抗体結合支持体とを接触させる。接触はカ
ラム式又はバッチ式のクロマトグラフィーで行なわれ、
カラム式クロマトグラフィーの場合は、゛デ渇以下、好
ましくは１０℃以下で、流速５〜２０ｄ／α２・時間で
通液させ、Ｃ５Ｆを抗体結合支持体のカラムへ吸着させ
る。吸？ｊＣ８Ｆ吊は、抗体結合支持体１ｇ（ｉｆｉｉ
１重吊）当り、５００〜２．０００万単位が望ましい。
吸着さＵだ後、上記緩衝液を通液として夾雑物質を洗浄
・除去する。バッチ式クロマトグラフィーの場合は室温
又は１０℃以下で上記処理液と抗体結合支持体を混合し
、１〜１０時間［覚痒する６攪痒侵、ガラスミ１！紙等
で濾過し、抗体結合支持体を回収する。該抗体結合支持
体を上記の緩衝液で洗浄して、夾雑物質を完全に除去す
る。抗体結合支持体と特異的に吸着したＣ８Ｆは、抗源
抗体複合体の解離液、例えば０１１２〜３の酢酸緩衝液
、３〜４Ｍのチオシアン酸塩又は０．１〜０．２Ｍの２
．４−ジニトロフェノール等の溶液で抗体結合支持体か
ら溶出させる。カラム式クロマトグラフィーの場合は、
溶離液をカラムへ通液でることによって、またバッチ式
クロマトグラフィーの場合は抗体結合支持体を溶ｆｆ１
ａへ懸濁し、攪拌することによって、Ｃ８Ｆを溶出させ
る。ここに得られるＣ３Ｆ４よ不純物が除去された純粋
なＣ３Ｆである。
・除去する。バッチ式クロマトグラフィーの場合は室温
又は１０℃以下で上記処理液と抗体結合支持体を混合し
、１〜１０時間［覚痒する６攪痒侵、ガラスミ１！紙等
で濾過し、抗体結合支持体を回収する。該抗体結合支持
体を上記の緩衝液で洗浄して、夾雑物質を完全に除去す
る。抗体結合支持体と特異的に吸着したＣ８Ｆは、抗源
抗体複合体の解離液、例えば０１１２〜３の酢酸緩衝液
、３〜４Ｍのチオシアン酸塩又は０．１〜０．２Ｍの２
．４−ジニトロフェノール等の溶液で抗体結合支持体か
ら溶出させる。カラム式クロマトグラフィーの場合は、
溶離液をカラムへ通液でることによって、またバッチ式
クロマトグラフィーの場合は抗体結合支持体を溶ｆｆ１
ａへ懸濁し、攪拌することによって、Ｃ８Ｆを溶出させ
る。ここに得られるＣ３Ｆ４よ不純物が除去された純粋
なＣ３Ｆである。
以上のようにして製造された本発明のＣ３Ｆは次のよう
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、参考例１の方法により純化したＣ８Ｆを用い
た。
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、参考例１の方法により純化したＣ８Ｆを用い
た。
ａ）分子量
還元剤の非存在下に、Ｌａｅｍｎ＋ｌｉ （Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ２２７巻、６８０−６８５頁、１９７０年）の
方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分子／ｉｄを測定すると、７０．００
０〜９０．０００ダルトンであった。
ｒｅ、 ２２７巻、６８０−６８５頁、１９７０年）の
方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分子／ｉｄを測定すると、７０．００
０〜９０．０００ダルトンであった。
次に、０．２Ｍメルカプトエタノールで還元し、同様の
方法で測定すると、分子１ｆｉ３５．０００〜４５．０
００ダルトンのりブコニットに解離した（第１図）。
方法で測定すると、分子１ｆｉ３５．０００〜４５．０
００ダルトンのりブコニットに解離した（第１図）。
第１図は、本発明のＣ３Ｆのドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の泳動図テアリ、Ａ−
Ｅは非還元（２ｆｌ１体）、Ｆ、Ｇは分Ｆｍマーカー蛋
白質、Ｈ−Ｌは還元（サブユニット）を示し、！ＩＩ軸
の数字は分子ｆｉ（ＸＩＯ３ダルトン）を示す。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の泳動図テアリ、Ａ−
Ｅは非還元（２ｆｌ１体）、Ｆ、Ｇは分Ｆｍマーカー蛋
白質、Ｈ−Ｌは還元（サブユニット）を示し、！ＩＩ軸
の数字は分子ｆｉ（ＸＩＯ３ダルトン）を示す。
ｂ）サブユニット蛋白質のアミノ酸配列ＮＨ２−末端ア
ミノ酸配列は、純化Ｃ８Ｆを気相アミノ酸シーケンサ−
で常法ににり分析した。
ミノ酸配列は、純化Ｃ８Ｆを気相アミノ酸シーケンサ−
で常法ににり分析した。
次に純化Ｃ８Ｆを６Ｍグアニジンで変性させ、モノヨー
ド酢酸でアルキル化した後、脱ルし、トリプシン消化及
びＱ化シアン分解を行った。トリプシン消化及び臭化シ
アン分解ペプチドをｖｙｄａｃ Ｃ−１８逆相高速液体
クロマトグラフィーで分画し、分解されたペプチド画分
を胃、各両分をそれぞれ気相アミノ酸シーケンザーで分
析し、ペプチド断片のアミノ酸配列を分析した。トリプ
シン消化及び臭化シアン分解ペプチド断片のアミノ酸配
列と本発明者らがクローニングしたｍＲＮへの塩基配列
から、サブユニット蛋白質のアミノ耐−次構造を決定し
た。その結果は第１表に示すとおりである。
ド酢酸でアルキル化した後、脱ルし、トリプシン消化及
びＱ化シアン分解を行った。トリプシン消化及び臭化シ
アン分解ペプチドをｖｙｄａｃ Ｃ−１８逆相高速液体
クロマトグラフィーで分画し、分解されたペプチド画分
を胃、各両分をそれぞれ気相アミノ酸シーケンザーで分
析し、ペプチド断片のアミノ酸配列を分析した。トリプ
シン消化及び臭化シアン分解ペプチド断片のアミノ酸配
列と本発明者らがクローニングしたｍＲＮへの塩基配列
から、サブユニット蛋白質のアミノ耐−次構造を決定し
た。その結果は第１表に示すとおりである。
ＮＨ２−末端のアミノ酸であるグルタミン酸から１４９
番目のグルタミンまでは、公知のＣ３Ｆ−１と同一であ
るが、１５０番目から２１４番目乃至２３８番目までの
６５個乃至８９ｆ４のアミノ酸は、公知のそれと全く異
なっていた。
番目のグルタミンまでは、公知のＣ３Ｆ−１と同一であ
るが、１５０番目から２１４番目乃至２３８番目までの
６５個乃至８９ｆ４のアミノ酸は、公知のそれと全く異
なっていた。
また、ＣＯＯ−末端のアミノ酸としては、リブユニット
蛋白質の分Ｆ准に応じ２１４１目にプロリンが、そして
２３８番目にリジンが検出された。
蛋白質の分Ｆ准に応じ２１４１目にプロリンが、そして
２３８番目にリジンが検出された。
１２２番目と１４０番１」のアスパラギンは、Ａｓｎ−
Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒの典型的なＮ−グリコシド結合構造
を有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定され
た。ここにＸは任意のアミノ酸を示す。
Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒの典型的なＮ−グリコシド結合構造
を有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定され
た。ここにＸは任意のアミノ酸を示す。
Ｃ）等電点
ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、ｐＩは３．１〜３．７であった。
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、ｐＩは３．１〜３．７であった。
ｄ）糖鎖の構成単糖
ポリベブヂドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフィーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウＭｌｉ衝液濃
度勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニ
ンによるポストカラム標識した後、ケイ先払により同定
した。木Ｃ８Ｆ分子に含有される糖鎖は不均一であり、
定Ｂ＋することは困難であったが、構成単糖としてマン
ノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ
−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン
酸が同定された。
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフィーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウＭｌｉ衝液濃
度勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニ
ンによるポストカラム標識した後、ケイ先払により同定
した。木Ｃ８Ｆ分子に含有される糖鎖は不均一であり、
定Ｂ＋することは困難であったが、構成単糖としてマン
ノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ
−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン
酸が同定された。
ｅ）円二色性スペクトル
円二色性分散計ＬＪＡＳＣＯ社製Ｊ−６００）で遠紫外
部に於けるＣＤスペクトルを測定した（第２図）。
部に於けるＣＤスペクトルを測定した（第２図）。
第２図は本発明のＣ８ＦのＣＤスペクトルを示し、横軸
は波長（ｎｍ）、縦軸は楕円率（ｍｄｃｇ ）を示す。
は波長（ｎｍ）、縦軸は楕円率（ｍｄｃｇ ）を示す。
波長２０８ ｎｍ及び２２２ ｒｌｍにおいて極小ピー
クがみとめられ、本Ｃ８Ｆの二次構造にα−へリツクス
格造が含まれているものと推定された。
クがみとめられ、本Ｃ８Ｆの二次構造にα−へリツクス
格造が含まれているものと推定された。
ｒ）熱安定性
本Ｃ８Ｆを１μｇ／ＩＩｄｌのＩ！麿で、希釈緩衝液（
１）Ｈ７，Ｏ）に溶解し、６０±０．５℃で６０分間加
熱し、そのコロニー刺激活性（１１述）を測定したが、
活性の低下はほとんど認められなかった。
１）Ｈ７，Ｏ）に溶解し、６０±０．５℃で６０分間加
熱し、そのコロニー刺激活性（１１述）を測定したが、
活性の低下はほとんど認められなかった。
ｇ）赤外線吸収スペクトル
本Ｃ８Ｆの凍結乾燥粉末について透過測定法（ＫＢｒ窓
）にＪ：リフーリエ変換赤外分光装置（Ｎｉｃｏｌｅｔ
社ｌ１４５ＤＸＣ）を用いて測定した赤外線吸収スペク
トルは第３図に示すとおりであった。
）にＪ：リフーリエ変換赤外分光装置（Ｎｉｃｏｌｅｔ
社ｌ１４５ＤＸＣ）を用いて測定した赤外線吸収スペク
トルは第３図に示すとおりであった。
第３図の横軸は波数（♂１）を縦軸は透過率を示す。
本Ｃ８Ｆは１６５０Ｉｆｆ−’、１２０１ｚ−’及び１
１３３α に強い吸収、１５３７υ−１，１４３２ｃｒ
ａ 及び１０６８ＣＩＲ−１に中程度の吸収を示した
。
１３３α に強い吸収、１５３７υ−１，１４３２ｃｒ
ａ 及び１０６８ＣＩＲ−１に中程度の吸収を示した
。
上記の理化学的性質を有し、且つ哺乳動物の単球−マク
ロファージ系細胞のコロニー形成刺激作用を有する糖蛋
白質は、前記の製造法により人尿から！１造され、バイ
アル瓶中で無菌的に凍結乾燥され、粉末状で密封される
。凍結乾燥に先だちＧＳＦの安定剤としての人面清アル
ブミン及び溶解補助剤としてのアミノ酸又は糖類を含有
する水溶液を加え、無菌濾過し、のち無菌的に凍結乾燥
してもよい。
ロファージ系細胞のコロニー形成刺激作用を有する糖蛋
白質は、前記の製造法により人尿から！１造され、バイ
アル瓶中で無菌的に凍結乾燥され、粉末状で密封される
。凍結乾燥に先だちＧＳＦの安定剤としての人面清アル
ブミン及び溶解補助剤としてのアミノ酸又は糖類を含有
する水溶液を加え、無菌濾過し、のち無菌的に凍結乾燥
してもよい。
なお、本発明のＣ８Ｆのコロニー刺激活性は、マウス骨
髄細胞による［Ｉ軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で
測定した。Ｃ８Ｆ試料を０．３％、寒天、２０％牛脂児
血清（Ｆｅ２）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含む
ＨｃＣｏｙ’Ｓ ５△培地１−と６１合し、７．５％Ｃ
０２通気下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個
以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニ
ー数を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１
甲位は１コロニーを形成させるに必要なＣ３Ｆ［！Ｉと
規定した。また非活性は、Ｃ８Ｆ蛋白ｒ１１ｒｙＪ当り
形成されるコロニー数（単位）で表した。その結果、本
発明のＣ８Ｆは、１．４×１０８単位／η・蛋白質の比
活性をイｉしていた。また形成されたコロニーをヘマト
キシリン−エオシン染色して形態学的に分類したところ
、９５％以上のコロニーが中球−マクロファージから形
成されていた。
髄細胞による［Ｉ軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で
測定した。Ｃ８Ｆ試料を０．３％、寒天、２０％牛脂児
血清（Ｆｅ２）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含む
ＨｃＣｏｙ’Ｓ ５△培地１−と６１合し、７．５％Ｃ
０２通気下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個
以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニ
ー数を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１
甲位は１コロニーを形成させるに必要なＣ３Ｆ［！Ｉと
規定した。また非活性は、Ｃ８Ｆ蛋白ｒ１１ｒｙＪ当り
形成されるコロニー数（単位）で表した。その結果、本
発明のＣ８Ｆは、１．４×１０８単位／η・蛋白質の比
活性をイｉしていた。また形成されたコロニーをヘマト
キシリン−エオシン染色して形態学的に分類したところ
、９５％以上のコロニーが中球−マクロファージから形
成されていた。
本発明の製剤は、例えば注射用生理食塩水、注射用蒸留
水等に１０〜１００■／ｌｌ１１に溶解して、点滴、直
接静注、筋肉内、又は皮下に投与される。
水等に１０〜１００■／ｌｌ１１に溶解して、点滴、直
接静注、筋肉内、又は皮下に投与される。
投与量は、１回１．０００１１位／に９体用〜１５万単
位／に！１体重を使用するが症状によっては適宜増・減
Ｆ１１可能である。
位／に！１体重を使用するが症状によっては適宜増・減
Ｆ１１可能である。
投与時期は、化学療法及び放射線療法後、造血障害が始
まったと思われる時点がよい。投与は、面小板レベルが
一定状態になるまでその変動に応じて数回、数日間（２
〜１４日間）行ってもよい。
まったと思われる時点がよい。投与は、面小板レベルが
一定状態になるまでその変動に応じて数回、数日間（２
〜１４日間）行ってもよい。
投与対象は、造血障害によって誘起せしめられる血小板
減少症の患δであれば特に限定されない。
減少症の患δであれば特に限定されない。
（ホ）発明の効果
前記対象店名に、実施例に示すように、本発明の製剤を
投与したところ、血中内面小板レベルは、著明な改善が
認められた。またその投与結果として有害な副作用は観
察されなかった。かくして本発明の製剤は血小板減少症
治療剤として有用であることが示唆される。
投与したところ、血中内面小板レベルは、著明な改善が
認められた。またその投与結果として有害な副作用は観
察されなかった。かくして本発明の製剤は血小板減少症
治療剤として有用であることが示唆される。
（へ）実施例・参考例
以下に本発明の製剤の桑理効果についての実験例、毒性
についての実験例、臨床実施例、参考例を示すが、本発
明はなんらこれらの例に限定されるものではない。
についての実験例、臨床実施例、参考例を示すが、本発
明はなんらこれらの例に限定されるものではない。
実験例 １（毒性）
参考例１により調製された糖蛋白質を用いて忌性毒性を
リチャードらの方法（ジャーナル・オブ・ファルマコロ
ジー・アンド・エクスペリメンタル・セラごユテイクス
、９０巻、９９頁、１９４９年）により０５７ＢＬ系雄
性マウスで試験した。
リチャードらの方法（ジャーナル・オブ・ファルマコロ
ジー・アンド・エクスペリメンタル・セラごユテイクス
、９０巻、９９頁、１９４９年）により０５７ＢＬ系雄
性マウスで試験した。
その結果を第２表に示す。
第２表
臨床実施例 １
悪性腫瘍の患者に第１回目の化学療法後、観察のみ行い
（コントロール相）、２回目の化学療法後にｈＭ−Ｃ８
Ｆを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を連続７
日間点滴静注したく製剤投与相）。経時的に血中の顆粒
球、血小板数を計測し、その変動を第３表に示す。また
、コントロール相と製剤投与相の血小板数の最低値およ
び血小板レベルが１０万／ｍ ３以上に同役するのに要
する日数を比較し第４表に示す。
（コントロール相）、２回目の化学療法後にｈＭ−Ｃ８
Ｆを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を連続７
日間点滴静注したく製剤投与相）。経時的に血中の顆粒
球、血小板数を計測し、その変動を第３表に示す。また
、コントロール相と製剤投与相の血小板数の最低値およ
び血小板レベルが１０万／ｍ ３以上に同役するのに要
する日数を比較し第４表に示す。
第３表
治療法： １／１９ ＣＰＡ （Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐ
ｈａｍｉｄｃ） ６００Ｉ１１ｇＡＣＲ（Ａｃｌａｒ
ｕｂｉｃｉｎ） ６０ｍｇＣＤＤＰ（Ｃ
ｉｓ−ｐｌａｔ ｉｎｕｍ） ７５４２
／２３ ＣＰＡ（ＣＶＣＩＯＤｈＯ３（ｌｈａｆｆｉ
ｉ（ＩＱ） ＧＯＯｒＲｇＡＣＲ（八ｃｌａｒｕｂｉ
ｃｉｎ） ｅｏｑＣＯＯＰ（Ｃｉｓ
−ｐｌａｔｉｎｕｎ＋） ７５！Ｉｔｇ２／
２４から７日間ｈ）４−Ｃ３Ｆ製剤投与（８００万単位
／ｄａＶ ） 第４表 臨床実施例 ２ 悪性腫瘍の患者１０名に第１回目の化学療法後、観察の
み行い（コントロール相）、２回Ｉｌｌの化学療法後に
ｈＭ−Ｃ８Ｆを有効成分としてなる糖蛋白質８００万ｌ
ｐ位を連続７日間点滴静注した（製剤投与相）。経時的
に血中の血小板数を計測し、コントロール相と製剤投与
相の血小板数の最低（１「１および血小板レベルが１０
万／ ｔｎｍ ３以上に回復するのに要する日数を比較
し第５表に示す。
ｈａｍｉｄｃ） ６００Ｉ１１ｇＡＣＲ（Ａｃｌａｒ
ｕｂｉｃｉｎ） ６０ｍｇＣＤＤＰ（Ｃ
ｉｓ−ｐｌａｔ ｉｎｕｍ） ７５４２
／２３ ＣＰＡ（ＣＶＣＩＯＤｈＯ３（ｌｈａｆｆｉ
ｉ（ＩＱ） ＧＯＯｒＲｇＡＣＲ（八ｃｌａｒｕｂｉ
ｃｉｎ） ｅｏｑＣＯＯＰ（Ｃｉｓ
−ｐｌａｔｉｎｕｎ＋） ７５！Ｉｔｇ２／
２４から７日間ｈ）４−Ｃ３Ｆ製剤投与（８００万単位
／ｄａＶ ） 第４表 臨床実施例 ２ 悪性腫瘍の患者１０名に第１回目の化学療法後、観察の
み行い（コントロール相）、２回Ｉｌｌの化学療法後に
ｈＭ−Ｃ８Ｆを有効成分としてなる糖蛋白質８００万ｌ
ｐ位を連続７日間点滴静注した（製剤投与相）。経時的
に血中の血小板数を計測し、コントロール相と製剤投与
相の血小板数の最低（１「１および血小板レベルが１０
万／ ｔｎｍ ３以上に回復するのに要する日数を比較
し第５表に示す。
第５表
参考例 １
健常人の尿２００１をｐＨ１８，５に調整し、沈澱物を
濾過除去し、分両分Ｆ吊５０．０００グルトンの限外濾
過ＩＮ（アミコン社、ｌ−１１０Ｘ ５０ ）で濃縮と
脱塩を行った。次に、濃縮液をｐｌ＋７．０に調整し、
密封容器内で６０℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、
遠心分離（５，０００ｘｐ ３０分間）して沈澱物を
除去した後、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１７，２＞
で平衡化したＤＥＡＦ−セルロースと混合し、吸着させ
た。ＤＥＡＩＥ−セルｏ−スを０．０２Ｍ！ＪンＭ緩９
７Ｍ１０．０５Ｍ食塩添加０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）で溶出さＵた。溶出液を限外−過膜（アミ］
ンネ１１］１Ｐｌｏｄ−１ｍ縮して、５ｃｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ −３００（ファルマシア社、φ４ Ｘ ８０
ｃｐｓ ）を用い、１Ｍ硫安添加緩ｒｊＪ液（ｐＨ７，
２）でゲル濾過した。ゲル濾過での分子ｆｆｉ範囲７０
，０００〜１５０．０００ダルトンの両分を上記１ＭＩ
ＩＪ安添加緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４ Ｂカラム（ファルマシ７社製、φ２
Ｘ ２０ ｃｔｓ ）に吸着さけ、次いで０．５Ｍ硫
安添加Ｍ衝′ＩＩＩ（ｐＨ７，２）で溶出させた。溶出
液を限外濾過膜（間化成製、ＮＭ−３＞で濃縮して、Ｔ
ＳＫＧ ３，０ＯＯ３Ｗカラム（東）１費達製、φ４
Ｘ６００＃ｌｌＸ２）で＾速波体クロマトグラフィーに
かけ、分子ｌｉ４範囲７０．０００〜１５０．０００ダ
ルトンの両分を得た。この両分を再α濃縮し、１ｌｉ−
Ｐｏｒｅ ＲＰ −３０４（バイオラド社製、φ４Ｘ１
５０ｍ）の逆相カラムで０．１Ｍ＋−リフルオロＭＷを
含む、アセトニトリル０−１００％（ｐＨ１２，ｏ）の
ｉ線淵鴎勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ
、Ｃ８Ｆを溶出し、精製された比活性１．４Ｘ１０８１
１位／■・蛋白質のＣ８Ｆを冑た。１記製７４ Ｉ稈の
各ステップにおけるＣ８Ｆの精製痩は第６人に示すとお
りであった。
濾過除去し、分両分Ｆ吊５０．０００グルトンの限外濾
過ＩＮ（アミコン社、ｌ−１１０Ｘ ５０ ）で濃縮と
脱塩を行った。次に、濃縮液をｐｌ＋７．０に調整し、
密封容器内で６０℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、
遠心分離（５，０００ｘｐ ３０分間）して沈澱物を
除去した後、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１７，２＞
で平衡化したＤＥＡＦ−セルロースと混合し、吸着させ
た。ＤＥＡＩＥ−セルｏ−スを０．０２Ｍ！ＪンＭ緩９
７Ｍ１０．０５Ｍ食塩添加０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）で溶出さＵた。溶出液を限外−過膜（アミ］
ンネ１１］１Ｐｌｏｄ−１ｍ縮して、５ｃｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ −３００（ファルマシア社、φ４ Ｘ ８０
ｃｐｓ ）を用い、１Ｍ硫安添加緩ｒｊＪ液（ｐＨ７，
２）でゲル濾過した。ゲル濾過での分子ｆｆｉ範囲７０
，０００〜１５０．０００ダルトンの両分を上記１ＭＩ
ＩＪ安添加緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４ Ｂカラム（ファルマシ７社製、φ２
Ｘ ２０ ｃｔｓ ）に吸着さけ、次いで０．５Ｍ硫
安添加Ｍ衝′ＩＩＩ（ｐＨ７，２）で溶出させた。溶出
液を限外濾過膜（間化成製、ＮＭ−３＞で濃縮して、Ｔ
ＳＫＧ ３，０ＯＯ３Ｗカラム（東）１費達製、φ４
Ｘ６００＃ｌｌＸ２）で＾速波体クロマトグラフィーに
かけ、分子ｌｉ４範囲７０．０００〜１５０．０００ダ
ルトンの両分を得た。この両分を再α濃縮し、１ｌｉ−
Ｐｏｒｅ ＲＰ −３０４（バイオラド社製、φ４Ｘ１
５０ｍ）の逆相カラムで０．１Ｍ＋−リフルオロＭＷを
含む、アセトニトリル０−１００％（ｐＨ１２，ｏ）の
ｉ線淵鴎勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ
、Ｃ８Ｆを溶出し、精製された比活性１．４Ｘ１０８１
１位／■・蛋白質のＣ８Ｆを冑た。１記製７４ Ｉ稈の
各ステップにおけるＣ８Ｆの精製痩は第６人に示すとお
りであった。
参考例 ２
参考例１で得られたＣ３Ｆで免疫され、抗体価が十分に
上Ｒしたウサギ１０羽より抗Ｃ８Ｆ抗血清を採取し、前
記■の方法により精製された抗Ｃ８Ｆ抗体を約４３得た
。抗Ｃ８Ｆ抗体を０． １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、ｏ
）中で透析し、２０１１ｇ／ｄ’ｆ１１度に調整した。
上Ｒしたウサギ１０羽より抗Ｃ８Ｆ抗血清を採取し、前
記■の方法により精製された抗Ｃ８Ｆ抗体を約４３得た
。抗Ｃ８Ｆ抗体を０． １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、ｏ
）中で透析し、２０１１ｇ／ｄ’ｆ１１度に調整した。
該抗体溝１１１２００ｄを、あらかじめ蒸留水及び０．
１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した１００ｇのフオルミルーセ
ルロファインへ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化
シアノホウ素ナトリウム７００■を加えて、更に１６時
間攪拌し、フォルミルーセル［１フアインと抗Ｃ３Ｆ抗
体を結合させ抗体結合支持体を調製した。結合後、０．
２Ｍトリス−ｊＩＩ衝液で洗浄し、更に水素化シアノホ
ウ素ナトリウム５００■を含むトリス緩衝液２００Ｉｄ
を加え、室温で４時間攪拌して、未反応８基を不活化し
た。次いで抗体結合支持体を０．５Ｍ ＮａＣ１を含
有する０、０２Ｍリン酸緩衝液で十分洗浄した。抗体結
合支持体は、支持体１ｇ当り、２９．５〜の抗Ｃ８Ｆ抗
体を結合していた。次に、鍵常人尿ｉ、ｏｏｏ１を限外
鉱過濃縮機で濃縮し、脱塩した後、ＤＥＡＥ−セル［］
−ズに吸着させ、非吸着の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ
ＮａＣ１溶液で溶出し、該溶出液に０．５Ｍ１度に
なるよう塩化ナトリウムを加えてＣ８Ｆを含有する溶液
を調製した。このＣ８Ｆの比活性は２Ｘ１０５単位／Ｉ
ｌｌ！ｌであった。上記抗体結合支持体１００ｇに対し
、このＣ８Ｆを含有する溶液（全ｒ１１５００ｍ） を
加え、１０℃以下で一夜攪拌しバッチ式クロマトグラフ
ィー処理を行なった。攪拌後、ガラスフィルターで濾過
して、抗体結合支持体を集め、０．５Ｍ ＮａＣ１を
含有する０、０２ＭリンＡＩ［ｉ液で該抗体結合支持体
を十分に洗浄した。洗浄袋、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
２，５）５００−を加え、１０℃、１時間攪°拌して、
Ｃ８Ｆを溶出した。溶出液のｐＨを７．０にした後、限
外！１！Ａ躾で濃縮・脱塩して、精製Ｃ３Ｆ約１０１１
ｇを得た。精製Ｃ３Ｆの比活性は５．２Ｘ１０’単位／
η、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は９０％以上であっ
た。
１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した１００ｇのフオルミルーセ
ルロファインへ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化
シアノホウ素ナトリウム７００■を加えて、更に１６時
間攪拌し、フォルミルーセル［１フアインと抗Ｃ３Ｆ抗
体を結合させ抗体結合支持体を調製した。結合後、０．
２Ｍトリス−ｊＩＩ衝液で洗浄し、更に水素化シアノホ
ウ素ナトリウム５００■を含むトリス緩衝液２００Ｉｄ
を加え、室温で４時間攪拌して、未反応８基を不活化し
た。次いで抗体結合支持体を０．５Ｍ ＮａＣ１を含
有する０、０２Ｍリン酸緩衝液で十分洗浄した。抗体結
合支持体は、支持体１ｇ当り、２９．５〜の抗Ｃ８Ｆ抗
体を結合していた。次に、鍵常人尿ｉ、ｏｏｏ１を限外
鉱過濃縮機で濃縮し、脱塩した後、ＤＥＡＥ−セル［］
−ズに吸着させ、非吸着の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ
ＮａＣ１溶液で溶出し、該溶出液に０．５Ｍ１度に
なるよう塩化ナトリウムを加えてＣ８Ｆを含有する溶液
を調製した。このＣ８Ｆの比活性は２Ｘ１０５単位／Ｉ
ｌｌ！ｌであった。上記抗体結合支持体１００ｇに対し
、このＣ８Ｆを含有する溶液（全ｒ１１５００ｍ） を
加え、１０℃以下で一夜攪拌しバッチ式クロマトグラフ
ィー処理を行なった。攪拌後、ガラスフィルターで濾過
して、抗体結合支持体を集め、０．５Ｍ ＮａＣ１を
含有する０、０２ＭリンＡＩ［ｉ液で該抗体結合支持体
を十分に洗浄した。洗浄袋、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
２，５）５００−を加え、１０℃、１時間攪°拌して、
Ｃ８Ｆを溶出した。溶出液のｐＨを７．０にした後、限
外！１！Ａ躾で濃縮・脱塩して、精製Ｃ３Ｆ約１０１１
ｇを得た。精製Ｃ３Ｆの比活性は５．２Ｘ１０’単位／
η、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は９０％以上であっ
た。
第１図は本発明のＣ８Ｆのドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の泳動
図であり、第２図及び第３図はそれぞれ本発明ＣＳ＋＝
の遠紫外部ＣＤスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを
示す。 第１図において、
リアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の泳動
図であり、第２図及び第３図はそれぞれ本発明ＣＳ＋＝
の遠紫外部ＣＤスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを
示す。 第１図において、
Claims (1)
- （１）造血障害によつて誘起せしめられる血小板減少症
の治療及びその予防を目的として投与される次の物理化
学的性質を有するヒトマクロファージコロニー刺激因子
を有効成分として成る血小板減少治療剤。 ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であつて、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した分子量が７０，０００〜９０，０００ダ
ルトンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させ
たサブユニットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量は、３５
，０００〜４５，０００ダルトンである。 ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、第１表に
示す２１４個乃至２３８個のアミノ酸配列を有し、１２
２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）はそれぞれアスパラギ
ン（Ａｓｎ）−Ｘ−スレオニン（Ｔｈｒ）／セリン（Ｓ
ｅｒ）で表される典型的なＮ−グリコシド結合部位を有
する。ここでＸは任意のアミノ酸を示す。 【遺伝子配列があります。】 ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐ
I ）は、３．１〜３．７である。 ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
トース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸である。 ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８ｎｍ及び２２２ｎｍにそれぞれ極小ピークがあり、
α−ヘリックス構造を含んでいる。 ｆ）熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失われ
ない。 ａ）赤外線吸収スペクトル 凍結乾燥粉末について透過測定法（ＫＢｒ窓）によりフ
ーリエ変換赤外分光装置（Ｎｉｃｏｌｅｔ社製５ＤＸＣ
）を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは第３図に示
すとおりである。
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