JPS5820197A - グルタチオンの製造法 - Google Patents
グルタチオンの製造法Info
- Publication number
- JPS5820197A JPS5820197A JP12054581A JP12054581A JPS5820197A JP S5820197 A JPS5820197 A JP S5820197A JP 12054581 A JP12054581 A JP 12054581A JP 12054581 A JP12054581 A JP 12054581A JP S5820197 A JPS5820197 A JP S5820197A
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- Japan
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- glutathione
- microbial cell
- microorganism
- cysteine
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグルタチオンの製造法に関し、更に詳しくはグ
ルタチオンの合成酵素系の制御機構が解除されたエシェ
リヒア属に属する微生物を用いてグルタチオンを製造す
る方法に関する。
ルタチオンの合成酵素系の制御機構が解除されたエシェ
リヒア属に属する微生物を用いてグルタチオンを製造す
る方法に関する。
グルタチオ−ンはＬ−グルタミン酸、Ｌ−システィン及
びグリシンより成るトリペプチドであり。
びグリシンより成るトリペプチドであり。
肝疾患治療剤、解毒剤などして有用な物曹であり、また
生化学的試薬としても有用な物質である。
生化学的試薬としても有用な物質である。
従来、微生物を用いてグルタチオンを製造する方法とし
ては、酵母１体よりグルタチオンを抽出する方法、膜透
過性のよい乾燥酵母にＬ−グルタミン酸、Ｌ−システＱ
及びグリシンを含有する基質溶液を接触させてグルタチ
オンを生成させる方法、酵母や大腸菌の菌体に基質溶液
を接触させてグルタチオンを生成させるに際しＡ？？再
生系を共役ざぜる方法などが知られている。しかしなが
−３− ら、工業的製法としてみた場合、これらの方法はグルタ
チオンの生産量が必ずしも満足しつるものでなかった。
ては、酵母１体よりグルタチオンを抽出する方法、膜透
過性のよい乾燥酵母にＬ−グルタミン酸、Ｌ−システＱ
及びグリシンを含有する基質溶液を接触させてグルタチ
オンを生成させる方法、酵母や大腸菌の菌体に基質溶液
を接触させてグルタチオンを生成させるに際しＡ？？再
生系を共役ざぜる方法などが知られている。しかしなが
−３− ら、工業的製法としてみた場合、これらの方法はグルタ
チオンの生産量が必ずしも満足しつるものでなかった。
本発明者らは、かかる状況に鑑み、微生物を用いて工業
的有利にグルタチオンを製造する方法を見い出すべく種
々研究を重ねた結果、エシェリヒア属に属し、ｒ−グル
タミルシスティン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵
素活性を有しかつグルタチオンによるｒ−グルタミルシ
スティン合成酵素への阻害が解除された故生物が、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−システィン及びグリシンよりグルタ
チオンを製造する際の優れた酵素源となりつることを見
い出し１本発明を完成するに至った。
的有利にグルタチオンを製造する方法を見い出すべく種
々研究を重ねた結果、エシェリヒア属に属し、ｒ−グル
タミルシスティン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵
素活性を有しかつグルタチオンによるｒ−グルタミルシ
スティン合成酵素への阻害が解除された故生物が、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−システィン及びグリシンよりグルタ
チオンを製造する際の優れた酵素源となりつることを見
い出し１本発明を完成するに至った。
すなわち２本発明は上記微生物を培養し、かくして得ら
れた菌体もしくは該菌体の処理物をＬ−グルタミン酸、
Ｌ−システィン及びグリシンを含有する基質溶液と接触
させ、生成したグルタチオンを採取することからなるグ
ルタチオンの製造法である。
れた菌体もしくは該菌体の処理物をＬ−グルタミン酸、
Ｌ−システィン及びグリシンを含有する基質溶液と接触
させ、生成したグルタチオンを採取することからなるグ
ルタチオンの製造法である。
本発明で使用する微生物は、エシェリヒア属に特開昭５
８−２０１９７（２） 属し、ｒ−グルタτデシスティン合成酵＄ （Ｅ、 Ｃ
。
８−２０１９７（２） 属し、ｒ−グルタτデシスティン合成酵＄ （Ｅ、 Ｃ
。
６、３．２．２． 、以Ｆ本酵素をＱＳＨ−■と称する
）活性及びグルタチオン合成酵ｇ （ｘ、ｃ、 ６．２
．３．２．７以下本酵素をＧＳＨ−Ｉｔと称する）活性
を有し、かつグルタチオンによるＧＳＨ−Ｉへの阻害が
解除された微生物であればいずれも使用することができ
、かかる微生物の代表的な例としてはＧＳＨ−ｌ活性及
びＧＳＨ−ＩＩｌ活性有し、かつグルタチオンによるＧ
ＳＨ−工への阻害が解除されたエシェリヒア・コリが好
適に挙げられる。
）活性及びグルタチオン合成酵ｇ （ｘ、ｃ、 ６．２
．３．２．７以下本酵素をＧＳＨ−Ｉｔと称する）活性
を有し、かつグルタチオンによるＧＳＨ−Ｉへの阻害が
解除された微生物であればいずれも使用することができ
、かかる微生物の代表的な例としてはＧＳＨ−ｌ活性及
びＧＳＨ−ＩＩｌ活性有し、かつグルタチオンによるＧ
ＳＨ−工への阻害が解除されたエシェリヒア・コリが好
適に挙げられる。
上記菌株は例えば次の如くして取得することができる。
まず、ＧＳＨ−Ｉ活性及びＧ５１ｉ−１１活性ヲ有する
エシェリヒア・コリの野性味（例えば、エシェリヒア・
コリ１３５５）に変異を誘起せしめてシスティン要求株
及びメチルグリオキサール耐性株を取得する。変異の誘
起は通常の変異誘起処理により行なうことができ９例え
ばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
ノ如キ変異誘起剤て処理することにより実施することが
できる。システィン要求株の取得は変異誘起処理 ５− して得られる菌株をシスティン２ Ｘ ｔｃｒ’ｍを含
む最少培地（例えば９口ＨＰＯ４０，７チ、ＫＨ＊ＰＯ
４Ｑ。
エシェリヒア・コリの野性味（例えば、エシェリヒア・
コリ１３５５）に変異を誘起せしめてシスティン要求株
及びメチルグリオキサール耐性株を取得する。変異の誘
起は通常の変異誘起処理により行なうことができ９例え
ばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
ノ如キ変異誘起剤て処理することにより実施することが
できる。システィン要求株の取得は変異誘起処理 ５− して得られる菌株をシスティン２ Ｘ ｔｃｒ’ｍを含
む最少培地（例えば９口ＨＰＯ４０，７チ、ＫＨ＊ＰＯ
４Ｑ。
３チ、 （ＮＢＡ）！ＳＯ４０，１％、グルコース０．
５％の組成の培地、以下ＤＭ培地と称する）で培養し。
５％の組成の培地、以下ＤＭ培地と称する）で培養し。
生じた小コロニーを釣菌分離することにより取得するこ
とができる。一方、メチルグリオキサール耐性株は前記
の変異誘起処理して得られる菌株をメチルグリオキサー
ルを含むＤＭ培地に培養し。
とができる。一方、メチルグリオキサール耐性株は前記
の変異誘起処理して得られる菌株をメチルグリオキサー
ルを含むＤＭ培地に培養し。
生じた大きなコロニーを釣菌分離することにより取得す
ることができる。次いで、上記で取得したシスティン要
求株を含む最小培地に上記メチルグリオキサール耐性株
を培養し、コロニーの周辺にハローを作らないコロニー
を釣菌分離してＧＳＨ−Ｉ欠損株（例えば昇シェリヒア
・コリＣ９１２）をｌｌｉ［する。次いで、このＧ ５
Ｒ−Ｉ欠損株に前記ト同様の処理手段で変異を誘起せし
めたのち、８−ハイドロキシキノリンを含むＤＩ培地で
培養し、生ずるコロニーを釣菌分離することにより、Ｇ
ＳＨ−ｌ活性及びＧＳＨ１−ＩＦ活性を有し、かつグル
タチオンによるＧ Ｓ Ｈ−１への阻害が解除 ６− された菌株を取得することができる。かくして碍上記の
如くして取得した本発明の微生物を培養するに際して用
いられる培地としては、炭素源。
ることができる。次いで、上記で取得したシスティン要
求株を含む最小培地に上記メチルグリオキサール耐性株
を培養し、コロニーの周辺にハローを作らないコロニー
を釣菌分離してＧＳＨ−Ｉ欠損株（例えば昇シェリヒア
・コリＣ９１２）をｌｌｉ［する。次いで、このＧ ５
Ｒ−Ｉ欠損株に前記ト同様の処理手段で変異を誘起せし
めたのち、８−ハイドロキシキノリンを含むＤＩ培地で
培養し、生ずるコロニーを釣菌分離することにより、Ｇ
ＳＨ−ｌ活性及びＧＳＨ１−ＩＦ活性を有し、かつグル
タチオンによるＧ Ｓ Ｈ−１への阻害が解除 ６− された菌株を取得することができる。かくして碍上記の
如くして取得した本発明の微生物を培養するに際して用
いられる培地としては、炭素源。
窒素源、無機物などを程よく含有するものであれば９合
成培地または天然培地のいずれも使用できる。炭素源と
しては９例えばグルコース、シェークロース、フラクト
ース、でん粉、でん粉加水分解物、糖蜜などの種々の炭
化水素が使用でき、その使用量は０．５〜５．０％程度
が好ましい。また窒素源としては９例えば硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム、戻酸アンモニウム、酢酸ア
イモニウＡなどの各種の無機および有機アンモニウム類
。
成培地または天然培地のいずれも使用できる。炭素源と
しては９例えばグルコース、シェークロース、フラクト
ース、でん粉、でん粉加水分解物、糖蜜などの種々の炭
化水素が使用でき、その使用量は０．５〜５．０％程度
が好ましい。また窒素源としては９例えば硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム、戻酸アンモニウム、酢酸ア
イモニウＡなどの各種の無機および有機アンモニウム類
。
あるいはペプトン、酵母エキス、コーンメチ−ブリカー
。カゼイン加水分解物などの窒素性有機物などが使用で
き、その使用量は０．５〜２．０多程度が好ましい。更
に無機物としては０例えばリン酸＊ｉ水素カリウム、リ
ン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガ
ンなどが使用でき。
。カゼイン加水分解物などの窒素性有機物などが使用で
き、その使用量は０．５〜２．０多程度が好ましい。更
に無機物としては０例えばリン酸＊ｉ水素カリウム、リ
ン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガ
ンなどが使用でき。
−７−
その使用量はｏ、ｏｏｓ〜０．５チ程度が好ましい。
培養は振とう培養あるいは通気かく拌培養などの好気的
条件下に行なうのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃
が好適であり、培養期間は１６〜４０時間程度で充分で
ある。
条件下に行なうのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃
が好適であり、培養期間は１６〜４０時間程度で充分で
ある。
培養終了後、増殖した菌体を集め、該菌体もしくは該菌
体の処理物を酵素源とする。ここに菌体の処理物として
は９例えば乾燥菌体、超音波処理などにより得られる無
細胞抽出液、該抽出液よりによって固定化して優られる
固定化菌体、固定化酵素なども好適に挙げられる。
体の処理物を酵素源とする。ここに菌体の処理物として
は９例えば乾燥菌体、超音波処理などにより得られる無
細胞抽出液、該抽出液よりによって固定化して優られる
固定化菌体、固定化酵素なども好適に挙げられる。
上記の如き酵素源をＬ−グルタミン酸、Ｌ−システィン
及びグリシンを含む基質溶液と接触させて酵素反応させ
ることによりグルタチオンを生成させることができる。
及びグリシンを含む基質溶液と接触させて酵素反応させ
ることによりグルタチオンを生成させることができる。
基質溶液中のＬ−グルタミはｐ）＋ ７〜８．５で行な
うのが好ましく１反応温度は特開昭５８−２０１９７（
３） ２０〜５０℃、とりわけ３０〜３７℃が好適である。尚
１本酵素反応を効率よ〈実施するたｔに。
うのが好ましく１反応温度は特開昭５８−２０１９７（
３） ２０〜５０℃、とりわけ３０〜３７℃が好適である。尚
１本酵素反応を効率よ〈実施するたｔに。
本酵素反応をアデノシン−５′−リン酸（Ａ ？ Ｐ
）再生系と共役させるのが好ましい。ムチＰ再生系とし
ては９本発明の微生物が有するアセトキナーゼ、解糖系
酵素、カルバミルリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ
などによる反応を利用することかでき１例えばアセトキ
ナーゼ番ζよる反発を利用する場合には、基質溶液中に
マグネシウムイオンをマグネシウム塩（例えは硫酸マグ
ネシウム、塩化マグネシウム）として５〜２０ｔ１ｔＭ
、アデノシン−５′−三リン酸（Ａ〒Ｐ）を２〜５ｍ
Ｍ、及びアセチルリン酸を５〜ｌ Ｑ ｍ Ｍ程度存在
させてお（のが好ましい。
）再生系と共役させるのが好ましい。ムチＰ再生系とし
ては９本発明の微生物が有するアセトキナーゼ、解糖系
酵素、カルバミルリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ
などによる反応を利用することかでき１例えばアセトキ
ナーゼ番ζよる反発を利用する場合には、基質溶液中に
マグネシウムイオンをマグネシウム塩（例えは硫酸マグ
ネシウム、塩化マグネシウム）として５〜２０ｔ１ｔＭ
、アデノシン−５′−三リン酸（Ａ〒Ｐ）を２〜５ｍ
Ｍ、及びアセチルリン酸を５〜ｌ Ｑ ｍ Ｍ程度存在
させてお（のが好ましい。
かくして反応終了液中にグルタチオンが生成蓄積するが
、生成したグルタチオンはイオン交換樹脂処理の如き公
知の方法で単離精製することができる。例えば１反応終
了液を硫酸でｐＨ３とした後、カチオン交換樹脂（例え
はＤｉａｌｏｎ Ｐ Ｋ−２２８Ｈ＋）、に導通ずる。
、生成したグルタチオンはイオン交換樹脂処理の如き公
知の方法で単離精製することができる。例えば１反応終
了液を硫酸でｐＨ３とした後、カチオン交換樹脂（例え
はＤｉａｌｏｎ Ｐ Ｋ−２２８Ｈ＋）、に導通ずる。
吸着したグルタチオンを０．５Ｍ ９−
水酸化アンモニラ＾で溶出し、溶出汐を硫酸で−４．５
とした後、アニオン交換樹脂（例えばＤｕｏｌｉｔｅ轟
２ＣＨ８ＣＱＣ１−型）に導通する。ｒ＆看したグルタ
チオンを０．５Ｍ硫酸で溶出し、溶出液に５０−エタノ
ールを加え、析出した結晶を単離することにより、グル
タチオンを取得することができる。
とした後、アニオン交換樹脂（例えばＤｕｏｌｉｔｅ轟
２ＣＨ８ＣＱＣ１−型）に導通する。ｒ＆看したグルタ
チオンを０．５Ｍ硫酸で溶出し、溶出液に５０−エタノ
ールを加え、析出した結晶を単離することにより、グル
タチオンを取得することができる。
以下９本発明の実施側番示す。
実施例 １
下記第１表に示す菌株をグルコース０．５％、リン酸第
−水素カリウ＾Ｄ、３チ、リン陵第二水素カリウム０．
７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％、硫酸ア
ンモニウム０．１％の組成の培地（ｐＨ７，０）に接種
し、３７℃で１６時時間上う培養した。培養終了後、遠
心分離により菌体を集め、超音波処理により無細胞抽出
液を調製した。この無細胞抽出液０．０５ｄを、Ｌ−グ
ルタミン酸ｇ５ｍＭ、Ｌ−システィ’／２５ｍＭ、グ１
１シン５ＱｍＭ。
−水素カリウ＾Ｄ、３チ、リン陵第二水素カリウム０．
７％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０１％、硫酸ア
ンモニウム０．１％の組成の培地（ｐＨ７，０）に接種
し、３７℃で１６時時間上う培養した。培養終了後、遠
心分離により菌体を集め、超音波処理により無細胞抽出
液を調製した。この無細胞抽出液０．０５ｄを、Ｌ−グ
ルタミン酸ｇ５ｍＭ、Ｌ−システィ’／２５ｍＭ、グ１
１シン５ＱｍＭ。
塩化マグネ２ク４１９
ｍＭ及びＡＴＰ５ｍＭを含む５０ｍＭ）リス緩衝液９，
９５４に加え，３７℃で１時間酵素反応させ１０− た。反応終了後９反応液中のグルタチオン量を定量し．
菌体蛋白１”ｇ当りのグルタチオン生成量を算出した。
９５４に加え，３７℃で１時間酵素反応させ１０− た。反応終了後９反応液中のグルタチオン量を定量し．
菌体蛋白１”ｇ当りのグルタチオン生成量を算出した。
その結果は下記第１表の通りであった。
第 １ 表
Claims (3)
- （１） エシェリヒア属に属し、ｒ−グルタミルシス
ティン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵素活性を有
しかつグルタチオンによるｒ−グルタミルシスティン谷
成酵素への阻害が解除された微生物を培養し、かくして
得られた菌体もしくは該菌体の処理物をＬ−グルタミン
酸、＄−システィン及びグリシンを含む基質溶液と接触
させ、生成したグルタチオンを採取することを特徴とす
るグルタチオンの製造法。 - （２） 微生物がｒ−グルタミルシスティン合成酵素
活性及びグルタチオン合成酵素活性を有しかつグルタチ
オンによるｒ−グルタミルシスティン合成酵素への阻害
が解除されたエシェリヒア・コリである特許請求の範囲
第１項記載の製造法。 - （３） マグネシウムイオン、アデノシン−５′−三
２− リン酸及びアセチルリン酸の存在下に、１１体もしくは
該菌体の処理物を基質溶液と接触させる特許請求の範囲
第１項又は第２項記載の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12054581A JPS5820197A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | グルタチオンの製造法 |
| DE8282304039T DE3279950D1 (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Novel microorganisms derived from microorganisms of the genus escherichia by mutation and their use in the preparation of glutathione |
| ES514571A ES8400771A1 (es) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | "un procedimiento para la preparacion de glutation". |
| CA000408484A CA1187432A (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Microorganism and its use for the preparation of glutathione |
| EP82304039A EP0071485B1 (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Novel microorganisms derived from microorganisms of the genus escherichia by mutation and their use in the preparation of glutathione |
| ES522801A ES8500328A1 (es) | 1981-07-30 | 1983-05-30 | "un procedimiento para la preparacion de glutation" (como divisional de la solicitud de patente de invencion numero 514.571, presentada el 30 de julio de 1982) |
| US06/670,675 US4596775A (en) | 1981-07-30 | 1984-11-13 | Microorganism and its use for the preparation of glutathione |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12054581A JPS5820197A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | グルタチオンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5820197A true JPS5820197A (ja) | 1983-02-05 |
| JPH0147155B2 JPH0147155B2 (ja) | 1989-10-12 |
Family
ID=14788947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12054581A Granted JPS5820197A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | グルタチオンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5820197A (ja) |
-
1981
- 1981-07-30 JP JP12054581A patent/JPS5820197A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0147155B2 (ja) | 1989-10-12 |
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