JPS5839698A - 新規アントラサイクリン抗生物質とその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗腫瘍性物質である新規アントラサイクリン
抗生物質及びそれらの製造法に関する。

従来、アントラサイクリン系抗生＠質の中２例えは、ア
ドリアマイシン（米国特許第３５９００２８号明細書参
照）やアクラシノマイシンＡ（特公昭５１−３４９１５
号公報参照）が実験腫瘍に対して強い活性を示すだけで
なく、臨床試験においても強い抗Ｍ３ＩＡ性を示すこと
が知られ、有用な制癌剤として使用されている。

本発明者らは、さらに有用なアントラサイクリン抗生物
質を開発すべく研究を行い９式式中、Ｒ１が水酸基を表
わすときは、Ｗは式の糖残基で几３は水素原子を表わし
； ｇｌ及びＢＰが水素原子を表わすときは、Ｗは上記の糖
残基を表わす。

で示される文献未賊の化合物の生産に成功し、該化合物
もまた実験動物種湯に対して９強い活性を示すことを見
い出し本発明を児成した。

本発明者らは２式ｆｌ）で示される化合物のうち。

次式 で示される化合物なβ−イソロドマイシノンＲＪ）Ｃと
命名し１次式 で示される化合物なら一ロドマイシノｙ　ＲＤＣと命名
し提案する。

本発明の上記β−イソロドマイシノ７Ｒ１）Ｃ及びα２
−ロドマイシノンＲＤＣは、後述する如くマウス白血病
（Ｌ１２１０）に対し強い治療効果を有するカー。

又その他の種々の動物実験腫瘍に対しても優れた制癌作
用を有することが期待され、且つ毒性カー軽微な点によ
り、制癌剤として有利に使用し得るものである。

本発明の化合物の製造は１式 式中、）ｔｌは水素原子または水酸基を表わす。

で示されるアントラサイクリノ／（以下、Ｒ１が水素原
子を表わす化合物なα２−ロドマイ７ノン及びＲ１が水
酸基を表わす化合物をβ−インロドマイシノンと呼ぶ）
を式ｔｌ）で示される化合物のＲ１がそれぞれ対応する
式（１−ｂ）で示されるα２−ロドマイ７ノンＲＪ）Ｃ
及び式（Ｉ−ａ）で示されるβ−インロドマイシノンＲ
ＤＣに変換する能力を有する変異菌体を栄養培地中で培
養し、該培地または、該培養中にα２−ロドマイ７ノン
またはβ−インロドマイノノンを添加培養し、生成する
α２−ロドマイシノンＲＤｃまたはβ−インロドマイシ
ノンｋＬＤ（）ｒ：採収することにより行うことができ
る。

本発明によれば、上記変換能を有する変異菌体は、前述
のアクラシノマイシ／Ａ（特公昭５１−３４９１５号公
報参照）の生産菌として知られているストレプトミセス
ガリラエウス＋ＶＡ　１４４−Ｍ　１（ＡＴＣＣ３１１
３３またはＦＥＲＭ　Ｐ−２４５５）から単離した抗生
物質非生産性で且つ、上記変換能を有する変異菌体スト
レプトミセスガリラエウスＩ’Ｍ　１４４−ＭＩ　ＫＥ
３０３株（ＦＥＢＭ　Ｐ−４８０８）が好適に用いられ
るが、上記変換能を有する菌株であればいかなる属に属
する菌株でも用いることができる（該ＫＥ３０３株の単
離法及び菌学的記載に関しては。

特開昭５６−１５２９９号公報参照）。

該菌株の培養または本発明の化合物の製造は。

まず寒天斜面培地（酵母エキス０．３％、可溶性澱粉１
．０％、寒天１．５％、ｐＨ７，２）で培養し、６〜７
℃で保存された上記の変換能を有する菌株（例えばＫＥ
３０３株）を、ストレプトミセス属に属する微生物の培
養に常用される栄養培地２例えば澱粉、グルコース、有
機窒素源及び無機塩類から成る通常の液体培地へ接種し
、２５〜３２℃にて１〜３日間振盪培養して種母を調整
する。

次に通常の液体培地１例えば蔗糖、グルコース。

大豆粉、無機塩類より成る培地へ、上記の種母を１〜３
％接柚し、２５〜３２℃にて１５〜４８時間振盪培養を
行い、対数増殖期に達した培養菌液へ、α２−ロドマイ
ンノンあるいはβ−インロドマインノンのメタノール溶
液を、最Ｐ−濃度１０〜２００μ♂、’ｍｌｊとなる様
に添加し、更に１５〜７２時間培養を続けて微生物変換
を完結させる。なお発酵中の発泡を抑制するため、消泡
剤としてアデカノール（旭電化工業社商標）、ンリコー
ン（信越化学工業社商標９等を適宜添加することができ
る。本発明の化合物を採取するには、培養液を菌体とｆ
液に分離し、菌体及びｅ液から該化合物を含有する粗色
素を抽出、精製を行う。抽出にはアセトン。

メタノール、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、薄
い鉱酸、酸性緩衝液等が用いられる。精製には／す力ゲ
ル、交叉結合デキストランゲル（例えは、セファデック
スＬ［ｌ−２０ｉファルマシア社商標ン２弱酸曲イオン
交換樹脂などを用いたカラム及び薄層クロマトグラフィ
ー、適当な溶媒を用いた液体クロマトグラフィー、及び
向流分配法等の常法を組合せることにより有利に行うこ
とかできる。例えば粗抽出物を交叉結合デキストランケ
ル（セファデックスＬＨ−２０）カラムでゲル１遇する
ことにより、該生成物を未変換のアグリコンと分離させ
２次いでプレパラティブシリカゲル薄層（ＰＦ２５４９
　メルク社製）で溶媒を変えギクロマトを繰り返すこと
により容易に精製された本発明の化合物を得ることがで
きる。

本発明の化合物は、塩基性の基、ジメチルアミノ基を有
する糖残基り一ロドサミニル基を有することから、遊離
の塩基又は無機もしくは有機酸との酸付加塩としても得
られる。遊離の塩基は公知の造塩の方法によって無毒性
の酸、硫酸、塩酸。

臭酸、硝酸、りん酸、酢酸、プロピオ／酸、マレイン酸
、クエン酸、コノ１り酸、酒石酸、フマール酸、グルタ
ミン酸、パントテン酸、ラウリルスルホン酸、メタンス
ルホン酸、ナフタレインスルホン酸等と付加塩として回
収される。

即ち、付加塩の形成は遊離塩基を適当な溶媒中で上記の
無毒性の酸と反応させて凍結乾燥させるか、または該酸
付加塩が僅かしか溶けない溶媒を用いて沈澱させる方法
で得ることが出来る。

以上によって得られる不発明の化合物は、以下の試験法
によって、その有用性が検せられた。

■）マウス白血病培養細胞（Ｌ１２１０）の増殖阻害及
び核酸合成阻害 ２０％仔牛血清を含むルＰＭＩ　　１６４０培地　（ロ
ースウェルパーク研究所　１６４０）へＬ１２１０細胞
を５Ｘ１０’り／ｍｌ　接種し、同時に本発明の化合物
をＯｌ及び０．５μｆ／ｒｎｌの濃度で添加し、３７℃
にて炭酸ガス培養語中で２４時間培養し対照区に対する
５０％増殖阻害濃度を求めた。更に上記のＬ１２１０培
養細ｒｅを１０％仔牛血清を含むＲＰＭ１１６４０培地
へ５　Ｘ　１０’ケ／ｄ　となるように懸濁し。

３７℃にて炭酸ガス培養器中で１〜２時間培養を行った
後１本発明の化合物を種々の′Ｉｌｋ反で添加し。

１５分後に〆に＋４ｃｍウリジｙ　（０，０５μＣｉ／
ｍｌ）及び１４Ｃ＋ミン”　（０，０５１１ｃｉ／ｍｌ
　）を添加し。

３７℃にて６０分間培養した。反応液へ１０％トリクロ
ル酢酸溶液を添加し２反応を停止すると同Ｗに、酸不溶
物を沈澱させ、１０〜５％トリクロル酢酸にて更に３回
洗浄した後ギ酸に溶解し、酸不溶物中の放射活性を測定
し対照区に対する放射能の取込み率から５０％収込み阻
害濃度を求めた。

２）マウスに対する急性毒性 本発明の化合物を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の
０．２５　ｍｌに溶解し、該溶液をＣＤＦ系マウスに腹
腔内投与することにより、ＬＤ５ｏ値を求めた。

以上の結果を下記第１表に示す。

（第１表）　本発明の化合物の白血病Ｌ１２１０細胞に
対する増殖及び核酸合成阻害作用並びにマウス急性毒性
表記の結果から９本発明の化合物β−インロドマイシノ
ンｋＬＤｃ及びα２−ロドマイシン／ＲＤｃはマウス白
血病１，１２１０細胞の増殖を低１１！１度で死滅させ
る。作用を有し、且つマウスに対する毒性は既知アント
ラサイクリン抗生ｖ４質に比し、低いことが判明した。

なお、アントラサイクリン抗生物質の直接の作用点と考
えられている核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）合成に対しては
２本物質は共にＲＮＡ合成をより特異的に阻害する特徴
を有しており、その阻害作用はアクラシノマイシン及び
ロドマイシン群抗生物質に類似している。

次に後記実施例に於て用いるアグリコン類の調製を参考
例として掲る。

〔参考例〕　基質に使用するアグリコン類の調製本発明
に用いた基質アグリコンは以下の如くにして調製するこ
とができる。ロゼオルビシンＡ及びＢの生産菌である公
知凶アタテノミセス・ロゼオビオラセンス（ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ　　ｒｏｓｅｏｖｉｏｌａｃｅｎｓ　）ｘ
Ｈ１３０８１ｍを０．３％酵母エキス及び１％可溶性デ
ンプン、ｐＨ７，０からなる種母培地（１００ｍＶ５０
０　ｍｌ三角フラスコ）で３日間振盪培養し、これを４
％蔗糖、２．５％大豆粉、０，１％酵母エキス。

０．２５％食塩、０．３２％炭酸カルシウム、　　０．
０００５％　Ｃｕ５Ｏ，・７Ｈ，０，０，０００５％Ｍ
ｎＣ７１２・４　Ｈ２Ｏ及び０．０００５％Ｚｎ５Ｏ，
・７鴇０．　　ｐＨ７，４から成る発酵培地５９ｍ１を
分注殺菌した５０（１＋Ａ！三角フラスコ−の２５０本
に１　ｍｌずつ接種し、ロータリーシェーカー（２１０
ｒｐｍ）上、２８℃で５日間振盪培養する。得られた発
酵プロスは遠心操作により菌体と上清に分け、菌体は２
１のアセトンで抽出し、濃縮、Ｉｌのクロロホルムで再
抽出する。上清は。

２１のクロロホルムで抽出し、菌体からの抽出物と混合
し濃縮乾固し組物質を得る。これを７９ｍＡのメタノー
ルに溶解し、遠心操作に・より不溶物を除去し、その上
清をセファデックスＬＨ−２０カラム（前出、φ４．Ｏ
ｘ　４０ｃｒｎ）にかけメタノールで浴出、最初に流出
するグリコシド画分を濃縮乾固する。これに２００ｍ１
の０．３Ｎ塩酸を加え、８５℃で７−間加熱し加水分解
する。総量５００ｍＪのクロロホルムで抽出、濃縮乾固
しγ−ロドマイシノン、β−ロトマイジノン、β−イソ
ロドマイシノン及びα２−ロドマイシノンを含む粗アグ
リコン物質を得る。これを調製用薄層（６０ＰＦ２５４
．メルク社製）ｖｃスポット、クロロホルム：メタノー
ル（２０：１）の溶媒系で展開し、　　Ｒｆ値０．２４
を示すβ−インロドマインノン、及びＲｆ値０．２１を
示すα２−ロドマイシノン部分をそれぞれかきとり、ク
ロロホルム：メタノール（５：１）混液でｌ、　ＩＩＩ
縮乾固し、メタノール溶出によるセファデックスＬＨ−
２０カラム（＄２５ｃＩｎｘ５０ｃｍ）で最終精製を行
い、３０■のβ−インロドマイシノン、６８〜のα２−
口ドマイ７ノンを収得した。

次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ 可溶性澱粉１．５％、グルコース１％、大豆粉１％、酵
母エキス０．１％２食塩０，３％、りん酸二カリウム０
．１％、硫酸マグネシウム（Ｍｇ８０．・ｎ１２０）０
．１％、硫酸銅（Ｃｕ５Ｏ，−５Ｈ，０）　０．０００
７％、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０）　０．０００１
％、塩化マンガン（ＭｎＣ／２−４Ｈ２０）０．０００
８％、硫酸亜鉛（ＺｎＳ０４−７　Ｈ２Ｏ）０．０００
２％、ｐＨ７，４から成る培地、ｌＱＱｍｌを分注殺菌
した５　００　Ｉｌｌ　三角フラスコへ、ストレフトミ
セスガリラエウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　、　ｇ
ａｌ　１ｌａｅｕｓ　）ＫＢ３０３株の斜面寒天培養か
ら１白金耳ずつ接種し、２８℃にて４８時間、ロータリ
ーシェーカ゛−上で振盪培養を行い種母を作成した。次
いで上記培地組成中、大豆粉を２％に、酵母エキスを０
．２％に増量した発酵生産培地５０ａｔを分注殺菌した
５　００　Ｉｌｌ溶の三角フラスコ１０００本へ、上記
種母培養を１　ｍｌずつ接種し、２８℃にてロータリー
シェーカー（２ｔｏｒｐｍ）上で１７時間振盪培養を行
った。

これに、β−インロドマイシノ／あるいはＣ２−ロドマ
イシノンのメタノール溶液＜　２Ｑ／ｍｅ）　ヲ７ラス
コ当りＱ、　５　Ｋｌ　（最終濃度：　２０　ｐｆ／ｍ
ｌ；各総量二３６０■）添加し、更に２４時間培養を縦
続した。

発酵終ｒ時のそれぞれの変換物！−インロドマイシンあ
るいはＣ２−ロドマイシンの変換生成率をみるため、５
ｍ７！の培養液を採収し、これにクロロホルム−メタノ
ール（３二２）混液な５ｍＪ添加し。

サーモミキサーで振盪攪拌し、生成物をクロロホルム層
へ抽出した。これを凝縮乾固した後、再びクロロホルム
０．２　ｍｌに溶解し、その２０μｌをシリカゲル薄層
Ｆ２５４　（メルク社製）にスポットし、クロロホルム
：メタノール（１０：１）の展開溶媒で展開して風乾し
、　　）ｔｆ値０．４３を示す！−インロドマイシノン
Ｋｌ）Ｃ及び）ｔｆ値０．３０を示すＣ２−ロドマイシ
ノンＲＬ）Ｃのスポットを島津薄層りロマトスキャンナ
−（Ｃ８−９１０型）で波長４９０　ｎｍにて定量した
結果、添り口した両アントラサイクリノンの８０％以上
が変換されており、β−インロドマイ７ノ／１（ＩＪｃ
及びＣ２−ロドマイシノン１ｔａｃ生成讐は総量でそれ
ぞれ２３０及び１８５■であった。

本培養液（１８Ａ’）を集め、遠心分離によって菌体な
収得し、生成物を２１のアセトンで抽出した。

アセト／抽出液を凶に減圧濃縮した後、およそ１．５１
のクロロホルムで生成物を転溶し、濃縮乾固して粗抽出
物を得た。

実施レリ２ この粗変換抽出物をそれぞれ５０ｍ１のメタノールに溶
解し、不溶物を遠心分離によって除去した後、上清をそ
れぞれ別のセファデックスＬＨ−２０カラム（４０ｘ５
．０α）に加え、メタノールで溶出した。最初の赤紫色
色素区分をそれぞれ分取し、濃縮乾固した後、それぞれ
少量のクロロホルムに溶解し２分収用シリカゲル薄層（
６０ＰＦ２５４．メルク社製）（５０枚）の下端１．５
α上に線状にスポットし、クロロホルム：メタノール（
１００：１０）にて展開した。

β−インロドマイシノ７ＲＤＣあるいはＣ２−ロドマイ
シノンＲＤＣから成る色素バンドをかき収り。

およ（−１５Ｑａ＋／のクロロホルム：メタノール（５
：１）混液にて抽出し、凝縮乾固した。

次いで、各濃縮物をメタノール２０ｔｎｌに溶解し。

それぞれセファデックスＩｆ（−２０カラム（４０Ｘ４
α）を通過せしめ、該当画分をプール、濃縮乾固した。

各内容物を０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，５）の３０
ｍ１に溶解し、僅かに残る不溶物を遠心操作にて除去し
たのち、その上清にトルエンｌ０ｍ１を加見振姐攪拌し
た。靜置后分離するトルエン層を除去、この操作をさら
に１回繰り返えしたのち。

水層を分収し、低温ド（１０°Ｃ）で４Ｎ苛性ソーダー
にてｐＨ６〜７に中和し１次いでクロロホルムにて袖、
出した。クロロホルム抽出液は１／３量の０．０１Ｍ　
−Ｅｌ）ＴＡ　（ｐＨ６，０）で洗浄１次いで水洗し。

芒硝で乾燥させたのち減圧濃縮した。濃縮液へｎ−へキ
サンを過剰に加え、暗赤色沈澱を生成せしめ、１過操作
で集積せしめたのち、真空乾燥してＩ−インロドマイシ
ノンＲ１ＪＣ及びＣ２−ロドマイシノンＲＤＣ純品をそ
れぞれ１０８Ｔｎ９及び８６〜収得した。

以下に本発明によって得られるβ−インロドマイ７ノン
ＲＤＣ及びＣ２−ロドマイシンノ）ＬＤＣの理化学性状
を示す。

−イソシドマ　ジノンＲＤＣ 形　　状　赤紫色粉末 融　　　点　　　１２３〜１２７℃ 分子量　８０２ 元素分析’　　Ｃ４０Ｈ５１Ｎ　０１６　？！：　Ｌ　
テＣＨＮ　　　Ｏ 計算値（％）　　５９．８５　６．３６　１．７４　３
１．９２実験値　　　５９．５５　６．１８　１．７６
　　−紫外可視吸収スペクトル ４９５（９２）　　ｓ２ｓ（ｔｏｇ　　５４ｇ（６３）
ＩＲ（ＫＢｒ’＞ａ＋　１； ３４００、２９２０．　１７２０．　１６６０．　１５
９０．　１４００．　１３７０１３００、　１２４０ ＰＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣＩＶｓ　）　　δｐｐｍ
　：ヱ〔二り旦ヱイヱシニ乙旦旦９− 形　状　赤色粉末 融　　　点　　　１２８〜１３５’Ｑ 分子量　７８６ 元素分析：　　Ｃ，搗ＩＮ　０１１１としてＣＨＮ　　
　　Ｏ 計算値（％）　　６１．０７　６．４９　１．７８　３
０．５３実験値　　　６０．５３　６．６２　１．８０
　　−比旋光度　　〔α）曾＋９６．０°（（’　０．
０４．　ＭｅＯＨ）紫外可視吸収スペクトル ｎ２（１ａｓ＋）　５１２（ｔｏ２）　５２６（８４）
９０％ＭｅＯ１（−０°”　Ｈ０’　　：　２３４（５
０４）　２５６（２６５）　２９０（１０６）λ ”ａｘ”ｍ（”Ｌ） ４９２（１４３）　５１４（１１５）　５２６（９３）
９０％ＭｅＯＨ−０，ｌＮ　ＮａＯＨ、□３５（４３３
，、２９６（５８）λ ｒｎ　ａ　ｘ　　　　ｎｍ　（Ｂ　ｉり５６０（１４１
）　５９７（１２７） ＩＲ（ＫＢｒ）１１１１　　＋　　； ３４００、　２９３０．　１７３０，１６００．　１４
６０１１４００．　１２８０ＰＭＲスペクトラム（１０
０Ｈｚ　、ＣＤＣｌ５　）二δ　ｐｐｍ　　：特許出願
人　三楽オーシャン株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 り式 式中、几１が水酸基を表わすとき、Ｒ２は式の糖残基で
   Ｗは水素原子を表わし； Ｈｌ及びＷが水素原子を表わすとき、Ｒ３は上記の糖残
   基を表わす。 で示されるアントラサイクリ／抗生物質及びその酸付加
   塩。 ２、　ストレグトミセス属に属し２式 式中、Ｒ１は水素原子または水酸基を表わす。 で示されるアントラサイクリノンをＲがそれぞれ対応す
   る式（Ｉｌで示される化合物に変換する能力を有する微
   生物を栄養培地中で培養し、該培地または該培養中に式
   ｔｌｌ）で示されるアントラサイクリノンを添加培養し
   、生成する式（＋＋で示される化合物を採取することを
   特徴とする式（１）で示されるアントラサイクリン抗生
   物質の製造法。