JPH051276B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なアントラサイクリン抗生物質
に関し、さらに詳しくは式 式中Ｙは、基

【式】又は

【式】を表わす、 で示される新規アントラサイクリン抗生物質に関
する。 アントラサイクリン系抗生物質としては、従来
から放線菌の培養液から得られるダウノマイシン
（米国特許第3616242号明細書参照）及びアドリア
マイシン（米国特許第3590028号明細書参照）が
知られており、これらの化合物は実験腫瘍に対し
て広い抗癌スペクトルを有し、癌化学療法剤とし
て臨床的にも広く利用されている。しかし、ダウ
ノマイシン及びアドリアマイシンはかなり強力な
抗癌作用を示すが決して満足できるものではな
く、発酵法、半合成法、微生物変換法等各種の手
段により種々の類縁化合物を創製する試みが行わ
れており、既にいくつか提案されている〔例え
ば、特公昭51−34915号公報（アクラシノマイシ
ンＡ及びＢ）、F.Arcamone、Topics in
Antibiotic Chemistry、Vol.2、第102〜279頁、
ELLIS HORWOOD LIMITED発行、特開昭57
−56494号公報（４−デメトキシ−11−デオキシ
ダウノマイシン等）、特開昭56−15299号（ロドマ
イシン群抗生物質）等参照〕。 本発明もまた、有用なアントラサイクリン系抗
生物質を提供すべく、広く土壌分離菌株又は、そ
れらの変異処理株の生産物について検索した結果
完成されたものである。即ち、本発明者等は一貫
して微生物生産による新規アントラサイクリン化
合物の検索及びその生合成の研究を継続してきた
が、先に、ダウノマイシン又はカルミノマイシン
生産菌の変異菌株がダウノマイシン及びカルミノ
マイシン生合成の前駆体で、アントラサイクリノ
ン骨核の10位にカルボキシル基を有し、本発明者
等によつてカルボルビシンと命名された新規なア
ントラサイクリン抗生物質を生成蓄積する事実を
発見し提案した（特願昭58−117215号出願明細書
参照）。 本発明はカルボルビシンの11位の炭素への水酸
基導入を欠損した生合成ブロツク変異株を取得す
ることにより11−デオキシカルボルビシン、即ち
前記式(1)のＹが基

【式】で表わさ れる物質の取得が可能てあるとの観点より、新し
く土壌より単離したダウノマイシン及びバウマイ
シン生産菌株ストレプトミセスD788
（Streptomyces D788）株を変異処理し、検索を
重ねた結果その一変異菌株が前記11−デオキシカ
ルボルビシン及び前記(1)のＹが基

【式】 で表わされる物質を同時に生産蓄積することを見
い出し、本発明を完成したものである。 本発明により提供される前記式(1)の化合物のう
ち、Ｙが基

【式】を表わす場合の 化合物、式 で示される化合物は、アントラサイクリン骨核の
10位にカルボキシル基を有している点に構造的特
徴を有し、またＹが基

【式】を表 わす場合の化合物、式 で示される化合物は、アントラサイクリン骨核の
Ａ環に二重結合を有している点に構造的特徴を有
するものであり、いずれも従来の文献に未載の新
規な抗生物質である。以下、本明細書において、
式（１−ａ）の抗生物質をＤ−788−３と称し、
式（１−ｂ）の抗生物質をＤ−788−４と称する。 D788−３及びD788−４物質は、後述する如く
培養白血細胞L1210に対して増殖阻止作用を有
し、制癌剤として利用可能な化合物である。特
に、D788−３は上述の如くアントラサイクリノ
ン骨核に遊離のカルボキシル基を有することから
類縁のダウノマイシン、アドリアマイシン等に比
し、高い水溶性を示す。従つて、本化合物はそれ
自体およびその加水分解処理によつて得られるア
グリコンは、新しいタイプのアントラサイクリン
系抗生物質誘導体の合成中間体として有用性をも
併せもつ化合物である。 本発明に従えば、D788−３及びD788−４の製
造は、アクチノミセイテス属に属し、ダウノマイ
シン又はカルミノマイシン及びそれらの類縁化合
物を生産する能力を有する土壌分離菌株又は公知
菌株を、変異原として、例えば、UV又はＮ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）を用いる通常の変異処理により単離され
るD788−３生産菌株を、適当な栄養培地に培養
することにより行うことが出来る。これらの生産
菌株の好適なものとしては、土壌分離菌株で本発
明者等がストレプトミセスD788と命名した菌株
をNTGで変異処理して得られる変異菌株のうち、
ストレプトミセスD788ap.KL−330を挙げること
ができる 該菌株は、昭和59年２月20日付で工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第7458号
（FERM Ｐ−7458）として寄託されている。 以下に、KL−330株の菌学的性状を示す。 (i) 形 態 分枝した基中菌子より、直線状、或はやや波
状をした気中菌糸を形成する。（Section
Retinacu−liapertiに分類されるものと考え
る）。輪生枝はみとめられない。成熟した胞子
鎖は10ケ以上の胞子が数えられ、胞子の大きさ
は0.6〜0.8×0.8〜2.6ミクロン位で、胞子の表
面は平滑である。子のう及び鞭毛胞子などはみ
とめられない。 (ii) 各種培地における生育状態 色の記載について（ ）内に示す標準はH.
D.Tresner＆．E.J.Backua著System of color
wheels for Streptomycete taxonomy（J.
Appl.Microbiol.11巻335〜338頁、1963年）を
用い、補足的に日本色彩研究所出版の「色の標
準」も用いた。 (iii) 次の各培地における生育状態。（特にことわ
らないかぎり28℃培養）

【表】 (iv) 生理的性質 (1) 生育温度範囲：（イースト・麦芽・寒天培
地を使用、PH6.0で、20℃、28℃、30℃、37
℃、42℃の各温度で実験） 20℃から37℃までは生育がみとめられた。 42℃では生育しない。 (2) ゼラチンの液化：陽性（グルコース・ペプ
トン・ゲラチン培地を使用し、20℃で培養） (3) スターチの加水分解：陽性（スターチ・無
機塩寒天培地） (4) スキム・ミルクの凝固・ペプトン化：どち
らも陰性。 (5) メラニン様色素の生成：（トリプトン・イ
ースト・ブロス、ペプトン・イースト・鉄・
寒天・及びチロシン寒天培地使用） いずれの培地でも陽性。 (v) 各種炭素源の利用性：（フリドハム・ゴドリ
ーブ寒天培地上） １ Ｌ−アラビノース 陽性 ２ Ｄ−キシロース 〃 ３ Ｄ−グルコース 陽性 ４ Ｄ−フラクトース 〃 ５ シユクロース 〃 ６ イノシトール 〃 ７ Ｌ−ラムノース 陰性 ８ ラフイノース 〃 ９ Ｄ−マンニツト 陽性 本発明によるD788−３生産菌株の培養は、放
線菌の栄養源として通常使用されるそれ自体公知
の培地組成物中で行うことができる。例えば、炭
素源としては、グルコース、グリセリン、蔗糖、
澱粉、マルトーズ、動植物油などが使用でき、窒
素源としては、例えば大豆粉、肉エキス、酵母エ
キス、ペプトン、コーンステープリカー、綿実
粕、魚粉などの有機物並びに硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アン
モニウムなどの無機体窒素が使用できる。又必要
に応じて食塩、塩化カリウム、リン酸塩その他
Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Zn⁺⁺、Fe⁺⁺、Cu⁺⁺、Mn⁺⁺あるい
はNi⁺⁺などの２価金属塩類及びアミノ酸やビタ
ミン類を添加する他発酵中の発泡を抑制するた
め、例えばシリコーン（信越化学KK製、−
KM75：商標）などの消泡剤を適宜添加すること
もできる。 温度、PH、通気撹拌および発酵時間等の発酵条
件は、用いられる菌株が最大量の該化合物を蓄積
する様に選択する。例えば温度は20〜40℃、好ま
しくは28℃、PHは５〜９、好ましくは６〜７にお
いて、発酵時間は１〜10日間、好ましくは６日間
で発酵を行うのが有利である。 該培養物からD788−３を単離、採取するには、
発酵終了後の培養物を遠心分離によるか、ケイ藻
土の如き適当な濾過助剤の存在下で濾過すること
により、菌体と上澄または濾液に分離する。 菌体からは必要により、アセトン、メタノー
ル、エタノールもしくはブタノール等の水と混和
する有機溶媒を用いて抽出し、この濃縮液を濾液
と混合する。この混合液を吸着担体、例えば、合
成吸着樹脂、シリカゲルを用いたクロマトグラフ
イーにより処理するか、陰イオン交換樹脂、陽イ
オン交換樹脂を用いる処理等を単独にあるいは適
宜組合せて使用することにより、D788−３は純
粋な形で採取できる。一方、D788−４は、上記
D788−３の単離、精製処理に際して、少量成分
として単離できるが、D788−３の脱炭酸及び脱
水生産物に該当するので、D788−３の粕調製も
しくは精製物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ア
セトン、メタノールなどの溶媒又は10〜80％の水
を混和した溶液中に溶解し、PHを２〜９に調整、
20〜60℃で0.5〜４時間撹拌することによりD788
−４に変換せしめ、反応液からクロロホルム等の
有機溶媒を用いて抽出し、さらに必要により、シ
リカゲルクロマトグラフイー等の処理により精製
し、純品として得ることができる。 次に本発明によるD788−３及びD788−４の具
体的有用性について述べる。本物質はマウス白血
病培養細胞L1210の増殖及び核酸合成を抑制する
作用を有する。例えば20％仔牛血清を含む
RPM11640培地（ローズウエルバーグ研究所）へ
L1210細胞を５×10⁴ケ／ml接種し、同様に本物
質を0.002〜0.25μｇ／mlの濃度で添加し、37℃に
て炭酸ガス培養器中で培養し対照区に対する50％
増殖阻害濃度を求めた。更に上記のL1210培養細
胞を10％仔牛血清を含むRPM11640培地へ５×
10⁵ケ／mlとなる様に懸濁し、37℃にて炭酸ガス
培養器中で１〜２時間培養を行つたのち、本物質
を種々濃度で添加し、15分後にさらに¹⁴C−ウリ
ジン（0.05μCi／ml）または¹⁴C−チミジン
（0.05μCi／ml）を添加し、37℃にて60分間培養し
た。反応液へ冷10％トリクロル酢酸を添加し、反
応を中止とすると同時に、酸不溶物を沈澱させ、
冷５％トリクロル酢酸にてさらに２回洗滌したの
ち、ギ酸に溶解し、放射活性を測定し、無添加対
照区に対する放射能の取込み率から50％取込み阻
害濃度を求めた。次表に結果を示す。

【表】 以上の結果に示される如く、D788−３及び
D788−４はマウス白血病細胞L1210に対し、極め
て低濃度で増殖を阻止し、同時にRNAおよび
DNA合成を阻害する作用を有しているが、代表
的アントラサイクリン抗生物質ダウノマイシンと
比較して、ともにマウス白血病細胞L1210の増殖
阻止作用が弱い割には、核酸合成阻害作用が強く
特にD788−３はDNA合成阻害作用がRNA合成
阻害作用より強い特徴を有する化合物であり、制
癌剤としての用途が期待される。 以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明
する。 実施例 １ ストレプトミセスD788（Streptomyces D788）、
sp.KL−330菌株（微工研条第7458号）のYS（0.3
％酵母エキス、１％可溶性デンプン、1.5％寒天、
PH7.2）斜面培養より一白金耳を採り、下記する
種母培地100mlを分注殺菌した500ml容三角フラス
コに接種し、28℃、ロータリー、シエカー
（220rpm）にて２日間振盪培養して種母を作成し
た。 種母培地 可溶性デンプン 0.5％ グルコース 0.5％ エスサンミート（大豆粉、味の素社製） 1.0％ 酵母エキス 0.1％ NaCl 0.1％ K₂HPO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ 水道水 PH7.4（殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地15を入れ、殺菌
した30容ジヤーフアーメンター２基に上記の種
母培養液を、１基当り750ml（５％に相当）ずつ
添加接種した。 生産培地 台湾酵母 ５％ 可溶性デンプン 7.5％ 酵母エキス 0.3％ NaCl 0.2％ CaCO₃ 0.3％ ミネラル混液※ 0.06％ 水道水 PH8.2（加熱殺菌前） ※ CuSO₄・5H₂O 2.8ｇ、FeFO₄・7H₂O 0.4
ｇ、MnCl₂・4H₂O 3.2ｇ、ZnSO₄・7H₂O 0.8
ｇを蒸留水500mlに溶解したもの。 通気量５／分、撹拌450回転／分で、28℃、
100時間培養すると培養液は濃黄色を呈し、培養
液１ml中およそ180μｇのD788−３を蓄積した。 なお、培養液中の本物質は培養液１mlに1Mク
エン酸緩衝液（PH3.5）１mlを加え、さらにアセ
トン２mlを加えて撹拌、室温で１時間放置、遠心
操作により上清を分取、その10〜30μを薄層シ
リカゲルプレート（F254、メルク社製）の下端
より２cm位置にスポツトし、クロロホルム／メタ
ノール／水／酢酸（120／40／３／0.4）で展開
し、D788−３の黄色スポツト（Rf値；0.2）を薄
層用、クロマトスキヤンナー（島津製作所製CS
−910型）を用いて波長430nｍで測定し、標準曲
線より算定して定量した。 培養140時間後、発酵を中止し、ジヤーフアー
メンター２基より培養液を集め（総量27）濃硫
酸でPH1.8に調整してのち遠心操作により菌体と
濾液に分離する。菌体区分は総量８のアセトン
で抽出し、その抽出上清をおよそ1/3量まで減圧
濃縮する。これを先の濾液と混合し、4N苛性ソ
ーダを用いてPH2.3に調整したのち、ダイヤイオ
ンHP−20（合成吸着樹脂、三菱化成社製）１
のカラムに通す。PH２酸性水で洗滌し、次いでお
よそ2.5の50％アセトン水（PH2.5）で黄色着色
区分を溶出する。溶出液をおよそ１／２容まで濃
縮し、PHを4N苛性ソーダで8.5に調整し、１の
クロロホルムで２回洗滌抽出した。 D788−３を含む水層のPH6N塩酸で2.5となし、
同容量のｎ−ブタノールで抽出し、抽出液を減圧
下で濃縮乾固して、D788−３の粗粉末6.23ｇを
得た。 実施例 ２ 実施例１で得た粗粉末2.5ｇを20mlのクロロホ
ルム−メタノール−水（100：10：0.5）混液に溶
解し、これを同溶媒に懸濁、充填したシリカゲル
カラム（φ40mm；80ｇワコーゲルＣ−200（和光純
薬(株)製使用））にかけおよそ300mlの同溶媒系で展
開し、次いで上記展開溶媒中クロロホルムの組成
比を90、80、70、60に順次減じた溶媒系をそれぞ
れおよそ300mlに展開した。D788−３は組成比
60：10：0.5の溶媒系で溶出され、薄層クロマト
グラフイー（前出）で追跡しD788−３のみを含
む溶出分画を集め、減圧下濃縮乾固して2.1ｇの
粉末を得た。これを希重炭酸ソーダ水溶液に溶解
せしめ、クロロホルムで抽出洗滌したのち、6N
塩酸でPHを2.5となし、ｎ−ブタノールで抽出す
る。減圧下濃縮乾固し、デシケーターにて真空乾
燥して純粋なD788−３、1.56ｇを取得した。 実施例 ３ 実施例１のD788−４含有のクロロホルム洗浄
抽出液を水洗し、減圧濃縮乾固すると黄色粉末
1.3ｇが得られた。これをクロロホルム／メタノ
ール／水（100／10／0.5）混液10mlに溶解した。
これを同溶媒に懸濁・充填したシリカゲルカラム
（20ｇワコーゲルＣ−200（前出）））にかて、同溶
媒系で展開、次いでクロロホルム／メタノール／
水（90／10／0.5）及び（80／10／0.5）を順次展
開させD788−４を単離溶出した。溶出区を水洗
後、芒硝で乾燥し、減圧濃縮乾固すると27mgの
D788−４純品が得られた。 実施例 ４ 実施例２で得たD788−３、300mgを50％アセト
ン水250mlに溶解し、4N水酸化ナトリウムでPH
7.0に調整し、50℃で３時間撹拌加温しD788−４
に変換せしめた。反応液を減圧下で濃縮しアセト
ンを留去したのち、4N水酸化ナトリウムでPH8.0
に調整し、100mlクロロホルムで３回抽出した。
抽出液を集め、水洗し、芒硝で乾燥後、減圧下で
濃縮乾固し、200mgのD788−４の黄色粗粉末を得
た。 上記粗粉末200mgを、実施例３に記載したと同
じ方法でシリカゲル（7.5ｇ、ワコーゲルＣ−
200）カラムクロマトグラフイーを行い、展開溶
媒クロロホルム／メタノール／水（80／10／0.5）
で溶出されるD788−４区分を分取し、水洗、芒
硝で乾燥後濃縮乾固して55mgのD788−４純品を
得た。 実施例 ５ 実施例２で得たD777−３ 60mgを0.1N塩酸50
ml中に溶解、85℃で15分間加熱分解させ、50mlク
ロロホルムで２回抽出し、濃縮乾固して粗アグリ
コン粉末を得た。小量のクロロホルムに溶解し、
シリカゲルカラム（ワコーゲル（前出）に吸着せ
しめ、クロロホルム／メタノール（100／１）、次
いで同（70／１）で展開して、アグリコンを精製
単離した。アグリコン含有溶出区分を水洗、芒硝
で乾燥させた後、減圧下で乾固し、18mgのアグリ
コンを得た。 上記実施例によつて得られたD788−３、D788
−４及びD788−４のアグリコンは下記の物理化
学的性状を示す。 D788−３ (A) 融点 186−187℃（分解） (B) 〔α〕²⁵ _D＝＋120°（C0.018、メタノール） (C) 紫外・可視吸収スペクトル（メタノール中） λmax ｎｍ（Ｅ１％ １cm）：206（399）、228
（594）、260（406）、432（205） (D) 赤外線吸収スペクトル（KBr）（cm^-1） 1700、1670、1620、1380、1290、1010、980、
760。 (E) プロトン核磁気共鳴スペクトル （ピリジン−D₅） （δ、ppm） 1.29 （3H、ｔ、Ｊ＝7.5 Ｈ−14） 1.48 （3H、ｄ、Ｊ＝6.5 Ｈ−6′） 1.75−2.2 （2H、ｍ、 Ｈ−13） 2.25−2.7 （4H、ｍ、 Ｈ−2′、Ｈ−８） 3.98−4.2 （1H、ｍ、 Ｈ−5′） 4.27 （1H、bs、 Ｈ−4′） 4.38 （1H、ｓ、 Ｈ−10） 5.17 （1H、ｍ、 Ｈ−1′） 5.38 （1H、ｍ、 Ｈ−７） 7.3 （1H、ｄ、Ｊ＝８ Ｈ−３） 7.63 （1H、ｓ、 Ｈ−11） 7.63 （1H、ｔ、Ｊ＝８ Ｈ−２） 7.77 （1H、ｄ、Ｊ＝８ Ｈ−１） D788−４ (A) 融点 113−115℃（分解） (B) 〔α〕²⁵ _D＝＋299°（C0.019、メタノール） (C) 紫外・可視吸収スペクトル（メタノール中） λmax ｎｍ（Ｅ１％ １cm）：225（537）、260（466）、
293（479）、447（298） (D)赤外線吸収スペクトル（KBr）（cm^-1） 1670、1640、1615、1590、1380、1280、
1010、980、750。 (E) プロトン核磁気共鳴スペクトル （CDCl₃） （δ、ppm） 1.20 （3H、ｔ、Ｊ＝7.5 Ｈ−14） 1.32 （3H、ｄ、Ｊ＝6.5 Ｈ−6′） 1.4−1.7 （2H、ｍ、 Ｈ−2′） 2.33 （2H、ｑ、Ｊ＝7.5′ Ｈ−13） 2.5−2.7 （2H、ｍ、 Ｈ−８） 3.4 （1H、bs、 Ｈ−4′） 3.98 （1H、ｑ、Ｊ＝6.5 Ｈ−5′） 4.22 （1H、ｍ、 Ｈ−3′） 5.3 （2H、bs、 Ｈ−７、Ｈ−1′） 6.44 （1H、bs、 Ｈ−10） 7.28 （1H、dd、Ｊ＝８、２ Ｈ−３） 7.6 （1H、ｓ、 Ｈ−11） 7.66 （1H、ｔ、Ｊ＝８ Ｈ−２） 7.82 （1H、dd、Ｊ＝８、２ Ｈ−１） D788−３アグリコン (A) 融点 160−162℃（分解） (B) 〔α〕²⁵ _D＝＋230°（C0.014、メタノール） (C) 紫外・可視吸収スペクトル（メタノール中） λmax ｎｍ（Ｅ１％ １cm）：205（531）、229（935）、
260（658）、290（291）、433（340） (D) 赤外線吸収スペクトル（KBr）（cm^-1） 1700、1670、1615、1280、1210、1020、750。 (E) プロトン核磁気共鳴スペクトル （CDCl₃−CD₃OD） （δ、ppm） 1.12 （3H、ｔ、Ｊ＝7.5 Ｈ−14） 1.5−2.0 （2H、ｍ、 Ｈ−13） 2.2 （1H、dd、Ｊ＝16、1.5 Ｈ−８） 2.55 （1H、dd、Ｊ＝16、５ Ｈ−８） 4.03（1H、ｓ、 Ｈ−10） 5.29 （1H、dd、Ｊ＝５、1.5 Ｈ−７） 7.28 （1H、dd、Ｊ＝８、２ Ｈ−３） 7.65 （1H、ｔ、Ｊ＝８ Ｈ−２） 7.71 （1H、ｓ、 Ｈ−11） 7.79 （1H、dd、Ｊ＝8.2 Ｈ−１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 式中Ｙは、基【式】又は 【式】を表わす、 で示される新規アントラサイクリン抗生物質。 ２ 式 で示される特許請求の範囲第１項記載の新規アン
   トラサイクリン抗生物質。 ３ 式 で示される特許請求の範囲第１項記載の新規アン
   トラサイクリン抗生物質。