JPS5842758B2 - ベ−タ− ガラクトシダ−ゼノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はβ−ガラクトシダーゼの製造法、特に微生物に
よるβ−ガラクトシダーゼの製造法に関するものである
。

乳糖は哨乳動物の乳汁中に含有される糖で、通常小腸に
存在するβ−ガラクトシダーゼの１種であるラクターゼ
により加水分解され吸収代謝される。

しかしながら、摂取した乳糖の量にくらべて小腸のラク
ターゼ活性が低い場合は、乳糖の消化不良が生ずる。

そして日本人の場合、平均して４人に１人は牛乳の消化
が十分に出来ない人がいると言われている。

この乳糖の消化不良は乳製品の利用拡大に伴って問題化
しており、又乳糖の晶析は乳製品の加工上、利用上での
問題点となっている。

これらの問題点を解消し、乳製品の利用及び用途拡大の
ためにβ−ガラクトシダーゼの普及化が望まれている。

ところでβ−ガラクトシダーゼを生産する微生物として
は、ある種の酵母（サツカロマイセス・フラジリス、ト
ルラ・タレモリス）、細菌（大腸菌、乳酸菌）、糸状菌
（アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニゲル）
等が現在までに知られているが、これらの微生物の生産
するβ−ガラクトシダーゼは菌体内酵素であったり、作
用ｐＨが低かったり、また微生物の酵素生産力が低かっ
たりしてその採取、利用が限定されている。

そこで本発明者等は、微生物によるβ−ガラクトシダー
ゼの生産について種々研究した結果、ペニシリウム属の
菌株が極めて有効に上記した問題点を解決する強力なる
β−ガラクトシダーゼを分泌性で生産するとの新知見を
得、本発明を完成するに到った。

即ち、本発明はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃ ｉ ｌ ｊ
ｉ ｕｍ）属に属するβ−ガラクトシダーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物よりβ−ガラクトシダーゼを採取す
ることを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造法であ
って、乳製品の利用及び用途拡大上有用なβ−ガラクト
シダーゼを容易に製造する方法を提供することを目的と
するものである。

本発明において使用するペニシリウム属のβガラクトシ
ダーゼ生産菌の具体例としては、例えば■ペニシリウム
・フレクエンタンス・ウェストリング（Ｐｅｎ、ｆｒｅ
ｑｕｅｎｔａｎｓ ｗｅｓｔｌｉｎｇ）（微工研菌寄第
３０８５号（ＦＥＲＭ−Ｐ／Ｉ６３０８５ ） ）■ペ
ニシリウム・ルテウム・ソオプ（Ｐｅｎ、Ｌｕｔｅｕｍ
ＳｏｐｐＸ微工研菌寄第３０９１号（ＦＥＲＭ−ＰＡ３
０９１））、■ペニシリウム・シトリナムＡＴＣＣ９８
４９（Ｐｅｎ、ｃｉｔｒｉｎｕｍＡＴＣＣ９８４９）〔
微工研菌寄第３０８６号（ＦＥＲＭ−Ｐ４３０８６））
、■ペニシリウム・グラカム・リンク（Ｐｅｎ。

ｇｌａｕｃｕｍ Ｌｉｎｋ）（微工研菌寄第３０９０号
（ＦＥＲＭ−Ｐ／％３０９０））、ペニシリウム・クリ
ソゲナム・トムＩ Ｆ Ｄ ４６２６ （Ｐｅｎ 、
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＴｈｏｍＩＦＤ４６２６）（微
工研菌寄第３０８８号（ＦＥＲＭ−Ｐ／１６３０８８
） ） 、■ペニシリウム・ロクエフォルテイ（Ｐｅｎ
、ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）（微工研菌寄第３０８９号（
ＦＥＲＭ−ＰＡ３０８９ ） ）、■ペニシリウム・ツ
タタム・ウェストリング（Ｐｅｎ、ｎｏｔａｔｕｍＷｅ
ｓｔｌｉ ｎｇ）（微工研菌寄第３０８７号（ＦＥＲＭ
−ＰＡ３０８７ ） ）−上記菌はいずれも工業技術院
微生物工業技術研究所に上記番号のもとに寄託されてい
る−等を挙げることが出来る。

上記菌株のβ−ガラクトシダーゼ生産性、得られたβ−
ガラクトシダーゼの至適ｐＨ１安定ｐＨを示すと、第１
表の通りである。

第１表中、菌株の欄の■〜■の番号は上記した番号に該
当する菌株を表わす。

またβ−ガラクトシダーゼ生産能の欄の記号は次の意味
を表わす。

＋＋＋＋ ：麹１ｇ当り１００単位以上 ＋＋＋：麹１ｇ当り１００〜６０単位 ＋＋：麹１ｇ当り６０〜４０単位 ＋：麹１ｇ当り４０〜２０単位 以上の他にもペニシリウム・オランチオービオラセム（
Ｐｅｎ、ａｕｒａｎｔｉｏ−ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、ペ
ニシリウム０モシタネンス（Ｐｅｎ ｍｏｎｔａｎｅｎ
ｓｅ ）等に属する菌株もβ−ガラクトシダーゼ生産能
のあることが認められる。

本発明の実施に当っては、ペニシリウム属に属するβ−
ガラクトシダーゼ生産菌を固体又は液体培地に好気的に
培養する。

本発明において、培地としては、麩、米ヌカ等の天然物
、もしくはその抽出液、さらにこれらに各種糖類等の炭
素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸類、
蛋白質、アンモニウム塩、硝酸塩等の窒素源、カリウム
、リン、マグネシウム、鉄等のミネラル物質、ビタミン
類などを適当に選択して添加したものが利用できる。

また上記した炭素源、窒素源、ミネラル物質、ビタミン
類を適当に含有する培地も用いることができる。

さらに必要に応じてこれら培地にβ−ガラクトシダーゼ
生産に効果的な各種の誘導、分泌性物質を添加すること
も可能である。

培養は通常、温度１５〜４５℃、ｐＨ３，５〜８．０の
範囲内で好気条件下で行われ、培養時間は通常１６〜１
２０時間である。

培養物よりβ−ガラクトシダーゼの採取は、酵素の採取
の常法にしたがって行うことができ、例えば固体培養物
の抽出液又は液体培養ブロスから、硫安等による塩析、
アルコール、アセトン等の有機爵媒による沈澱法、タン
ニン酸等の蛋白沈澱剤による方法などにより、β−ガラ
クトシダーゼを分離採取することができる。

更に例えばイオン交換樹脂処理、ゲル濾過、限外が過等
の一般的酵素精製法を使用することにより、このβ−ガ
ラクトシダーゼを精製することができる。

ここで、β−カラクトシダーゼ精製の具体例を挙げると
、本発明にしたがいペニシリウム属のβ−ガラクトシダ
ーゼ生産菌、例えばペニシリウム・シトリナムＡＴＣＣ
９８４９ＦＥＲＭ−ＰＡ３０８６を培養して得た麹の水
抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、０、６−０．９飽
和区分を集め、溶解後ｐＨを３．８に酢酸緩衝液で調整
する。

次いでこれをＤＥＡＥ−セファデックスカラムを通過さ
せ、未吸着区分をとり、更にこれをＳＰ−セファデック
スカラムを通過させ、吸着区分を食塩（ＮａＣ１）で濃
度０．１モルから１．０モルまで直線的に増加させる濃
度勾配法で溶出するβ−ガラクトシダーゼ区分を集める
。

更に、セファデックスＧ−２００カラムでゲル濾過を２
回繰返し、活性区分を集めることにより、精製β−ガラ
クトシダーゼを得る。

この精製により、β−ガラクトシダーゼを単一蛋白質に
まで精製でき、純度を抽出液の１ｏｏｏ倍まであげるこ
とができる。

酵素収率は約１０俤である。なお上述した抽出液、分離
酵素、精製酵素のいずれも、凍結真空乾燥等の乾燥によ
り粉末化が可能である。

本発明で製造されるβ−ガラクトシダーゼの物理化学的
性質を挙げると次の如くである。

（１）基質特異性 種々のグリコシドに作用させた結果は第２表に示す通り
である。

第２表 グリコシド 活性（俤）乳糖
１００ ０−ニトロフェニル−β／Ｄガラクト ピラノシド ３９８ｐ
−ニトロフエーレーβ−Ｄガラクト ピラノシド ２８８フ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ２４３フェニル
−β−Ｄ−グルコヒラノシトＯ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄガラクトピラノシド
Ｏフェニル−α−
Ｄ−グルコピラノシド ０フェニル−α−Ｄ−マ
ンノピラノシド Ｏフェニル−β−Ｄ−アラビノ
シト ０フェニル−β−Ｄ−キシロピラノシ
ド ０（２）至適ｐＨ１作用ｐＨ 至適ｐＨは４〜５であり、ｐＨ３，５〜８の間で作用す
る。

（３）至適温度、作用温度 至適温度は５０℃であり、６０℃未満で作用する。

（４） ｐＨ安定性 ｐＨ３，５〜８の間で安定である（但し４℃、２４時間
）。

（５）温度安定性 ５５℃まで安定（但しｐＨ６，１５分）、６５°Ｃ以上
では殆んど失活する。

（６）ＮａＣ１，ＫＣｌの影響 ＮａＣ１，ＫＣＩとも１モル濃度まで影響なし。

（７）金属イオンの影響 １０−３モル濃度で銅イオンにより失活が著しく、マグ
ネシウム、マンガン、鉄、カルシウム、バリウム等のイ
オンでは殆んど影響を受けない。

（８）分子量 約１０万（但しセファデックスゲル沢過法）。

次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより制限
されるものでない。

実施例 １ 麩２０．！９に水１６扉ｌを加え、１２０℃、２０分オ
ートクレーブで殺菌した三角フラスコに、あらかじめ同
一培地で４日間２７℃にて培養したペニシリウム・シト
リナムＡＴＣＯ９８４９（ＦＥＲＭ−ＰＡ３０８６ ）
の種菌を接種し、４日間、２７℃にて固体培養を行う。

この麩麹を５倍量の水で抽出し、遠心分離後、アルコー
ル６０％になるように冷却低温下で除々にアルコールを
滴下し、沈澱物を分離乾燥し、β−ガラクトシダーゼ粉
末８００■（１，２μ／■）を得た。

実施例 ２ 麩２，５ｇ、米ヌカ１．０ｇ、ＮａＮＯ３０，２ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，Ｉ Ｎ、 ＫＣｌ Ｏ，０５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ４７Ｈ２Ｑ０．０５ｇを含有する１００ｒｒＬｌの液
体培地（ｐＨ５，５）を入れた坂ロフラスコ（５００ｍ
ｌ）を１０本用意し、オートクレーブで殺菌後、これに
あらかじめ同一培地で４８時間２７℃にて培養したペニ
シリウム・クリソゲナム・トムＩＦＤ４６２６（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ／１６３０８８）の種菌液を接種し、２７℃にて
７２時間往復振盪培養を行う。

培養後、菌体等の固型物を分離し、限外濾過にて２００
１ｒＬｌに濃縮し、これに硫安を添加し０．６−０．９
飽和区分を分画する。

この分画区分を水に溶解し、セファデックスＧ−２５カ
ラムに通し、脱塩後、凍結真空乾燥してβ−ガラクトシ
ダーゼ粉末７０■（５，３μ／■）を得た。

実施例 ３ 麩ｉｏｏ部、米ヌカ２０部、水１００部を均一に混合殺
菌後、その５００ｇをアルミ製バットに広げ、これに実
施例２に記載したと同様組成培地であらかじめ培養した
ペニシリウム・シトリナムＡＴＣＣ９８４９（ＦＥＲＭ
−Ｐ屑３０８６）液体種菌５０ｒＩＬｌを接種し、２７
℃にて４日間培養を行う。

このようにして得た麩麹５０ｋｙを５倍量の水で抽出し
、限外濾過にて５０１に濃縮後、低温下（５°Ｃ）でア
セトンを加え、アセトン４５〜７０φ沈澱区分を分離す
る。

次いでこの沈澱を低アセトンで洗浄し、回転式真空乾燥
にて乾燥してβ−ガラクトシダーゼ粉末３５０ｇ（２，
５μ／ｍ９）を得た。

実施例 ４ 実施例３で得たβ−ガラクトシダーゼ粉末１００ｇを２
７１！の水に廖解し、これに硫酸アンモニウムを添加し
硫酸アンモニウム０．６−０．９飽和分画を集め、これ
をｐＨ３，８の酢酸緩衝液１１に晦解し、ＤＥＡＥ−セ
ファデックスカラムを通過後、これをＳＰ−セファデッ
クスカラムに吸着させ、食塩水にて０．１モルより直線
的に１．０モルまで増加させて、晦出する活性区分を集
め、セファデックスＧ−２００カラムでゲル済過を２回
繰返すと、精製β−ガラクトシダーゼ２３０■（１３０
μ／■）が得られた。

このようにして得た精製β−ガラクトシダーゼを市販牛
乳１００ｍ１に１０００単位及び５０００単位加えて５
０°Ｃにて反応させた。

５０００単位添加牛乳では、反応開始後３０分で９０％
以上の乳糖が、１時間ではほぼ１００％の乳糖が分解さ
れた。

また１０００単位添加牛乳では、３時間後で約８０％の
乳糖が分解された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ）属に属
   するβ−ガラクトシダーゼ生産菌を培地に培養し、培養
   物よりβ−ガラクトシダーゼを採取することを特徴とす
   るβ−ガラクトシダーゼの製造法。