JPS5851899A - 脂質関連成分の測定法および測定用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 存在する遊離脂肪酸、捷たけ脂肪酸エステルから遊離し
た脂肪酸、脂肪酸エステル捷たは脂肪酸エステルに作用
して脂肪酸を遊離せしめる酵素の活性のいずれか１つの
成分の測定法およびｉｌｌｌｌ定用組成物に関する。

従来より血清中の遊離脂肪酸の酵素的測定法とｌ〜では
、存在する遊離脂肪酸に、アノルーＣｏＡ・ンンセター
ゼ（　Ａｃｙｌ−ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，　）
活性の存在下にＣｏＡＳＩ（　（　ｍｌ　ｘ　７チ−ム
Ａ）およびＡ−ＴＰ（アデン／ン・トリホスフエ−ト）
を用いてアノルーＣｏＡ　。

ＡＭＰ（アデノシン・モノホスフェート）、ピロリン酸
を生成せしめ、次いで生成しだＡＭＰに、ミオキナーゼ
（　Ｍｙｏｋｉｎａｓｅ　）活性の存在下Ａ　’Ｊ’　
Ｐを用いて１モル比のＡＭＰより２モル比のＡＤＰ（ア
デノシン・ジホスフェート）を生成せしめる。さらにこ
の生成したＡ．　Ｄ　Ｐにピルベート・キナーゼ（Ｐｙ
ｒｕｖａｔｅ　Ｋｉｎａｓｅ　）活性の存在下にポスホ
エノーｊｌｚ　ピルベートを用いてＡ　’Ｉ”　Ｐおよ
びピルベートヲ生成せしめ、その後生成したピルベート
にラクテート・デヒドロゲナーゼ（　Ｌａｃｔａｔｅ　
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性の存在下に還元型Ｎ
ＡＤ　にコチン・アテニン・ジヌクレオチド）を用いて
ラクテートおよびＮＡＤを生成せしめ、その際反応にお
いて消費される還元型ＮＡＤの量を波長３４．０ｎｍに
て測定して吸光度の減少を求め、１モル比の脂肪酸によ
り２モル比の還元型ＮＡＤを消費する量として測定する
方法が知られている（　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ上，３４．１−３４．５（１９７
９）］。寸だ別法として、遊離脂肪酸にアンルーＣｏＡ
・シンセターゼノ存在下にＣｏＡ　Ｓ　Ｉ（およびＡＴ
Ｐを用いてアン／１／　−　ＣｏＡ　。

Ａ　Ｍ　Ｐおよびピｐ　ＩＪン酸を生成せしめ、次いで
生成したアノルーＣｏＡにアノルーＣｏＡ・オキシダー
ゼ（　Ａｃｙｌ−ＣｏＡ・ｏｘｉｄａｓｅ　）活性の存
在下に酸素を消費させて２．３−トランス−エノイル−
ＣＯＡオヨび過酸化水素を生成せしめ、その後生成した
過酸化水素に４−アミノアンチピリン、２．４．−ジブ
ロモフェノールおよびベルオギンダーゼ（ＰｅｒＯｘ　
ｉｄａｓｅ）活性により呈色色素となし、この呈色を測
定する方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　−１　０８、６−１０（１９８０）’）が知
られている。しかしながら特に、アシル−ＣｏＡ・オキ
シダーゼ活性を利用する方法では、生成する過酸化水素
が用いるＣｏＡ．　Ｓ　Ｈの還元性作用により悪影響を
受けるもので、従って第一反応の終了後に残存したＣｏ
Ａ　Ｓ　ＨをＮ−エチルマレイシドにて非還元性物質に
変化させた後に第二反応を行なわせしめねばならない欠
点があり、同時反応をなし得ないものであった。寸だ血
清中に存在するリパーゼ活性の測定においては、そのリ
パーゼ活性は弱く、従ってリパーゼ活性測定に用いる基
質である脂肪酸エステルからの遊離脂肪酸の量も少なく
、よって上記三方法では感度的に充分に測定し得ないも
のであった。

捷だ前者の測定方法では１モル比の脂肪酸から２モル比
の還元型ＮＡＤＯ量の減少を測定する定量法であるがそ
の測定感度は不充分であった。

本発明者らは、弱いリパーゼ活性の如くの少量の脂肪酸
１，か遊離し得ない場合であっても良好に定量し得る方
法について種々研究した結果、少なくとも被検液中に存
在する脂肪酸１＆は脂肪酸エステルから遊離された脂肪
酸を、１ずアシル−ＣｏＡとなし、次いでこのアシル−
ＣＯＡをデヒドロアシル−ＣｏＡとなし、さらにとのデ
ヒド「コア／ルーＣｏＡをヒドロキンアンルーＣｏＡと
なし、このヒドロキシアシル−ＣｏＡをケトアンルーＣ
ｏＡとなし、次いでこのケトアノルーＣｏＡをアシル−
ＣｏＡとなす工程を組合せることにより、同時反応にて
良好に測定し得ることを見い出した。

即ちこの反応の最終工程で生成されたアンルーＣｏＡは
被検液中の脂肪酸の鎖長に比べて炭素数２個少ないアン
ル基を有するもので、さらにこのアシル−ＣｏＡは順次
にデヒドロアシル−ＣｏＡ・ヒドロキンアシル−ＣｏＡ
　、ケトアンルーＣＯＡトナリ、次いで２個炭素数を減
じたアシル−ＣｏＡを生成するサイクルを形成する。こ
の形成されるサイクルは被検液中の脂肪酸の炭素数に応
じて高次サイクルをなす。この高次サイクルにて１モル
比の脂肪酸から生成または消費される高モル比の成分を
直接または種々の手段により著しく高感度にて検出　１
５− できる変化として測定する。この測定において被検液中
の脂肪酸は■ＡＴＰまだはＧ　Ｐ　Ｔ　、ｌ！：　Ｃｏ
ＡＳＨおよびアンルーＣｏＡ・シンセタービ活性に基く
反応工程によリーア／ルーＣｏＡとなし、■アシルＣｏ
Ａを酸素およびアンル−Ｃｏ　Ａ・オキシダービ活性に
基く反応工程によりデヒドロアンルーＣｏＡとなし、■
とのデヒドロアンルーＣｏＡを水およびエノイル−Ｃｏ
　Ａ　−ヒドラターゼ（Ｂｎｏｙｌ−ＣｏＡ　ｈｙｄｒ
ａｌａｓｅ　。

Ｅ、Ｃ，４，。２，１．１７）活性に基く反応工程によ
りヒドロキンアシル−ＣｏＡとなし、■このヒドロキン
アンルーＣｏＡをＮＡＤおよび３−ヒドロキンアシｆｉ
Ｖ−ＣＯＡ、−デヒドロゲナービ（３−Ｈｙｄｒｏｘｙ
ａｓｙｌ　−ＣｏＡ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＸＥ
、Ｃ，１，１゜１．８５　）活性に基く反応工程により
ケトアンル−ＣｏＡとなし、■このケトアノルーＣｏＡ
をＣｏ　Ａ　Ｓ　Ｉ−Ｉおよび３−ケトアンルーＣＯＡ
・チオラーゼ（３−Ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡｔｈｉｏ
ｌａｓｅＸＥ、　Ｃ，２，３゜１．１６）活性に基く反
応工程により■反応工程にて生ずるアンルーＣｏＡに比
べて炭素数２個の単位で減じたアンルーＣｏＡを生成す
るもので、この生成されたアシル−ＣｏＡは１６−− ■反応工程以後の反応に基いて炭素数２個の単位で分解
するβ酸化サイクルを形成し、その際反応系において検
出できる変化を測定するもので、このようにして１モル
比の脂肪酸からβ酸化サイクルのサイクル数に応じた高
モル比の変化として高感度にて脂肪酸、捷だけ脂肪酸を
遊離せしめる系からの脂肪酸を測定する方法、および測
定用組成物について完成した。

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、被検液
中の成分を定量するに当り、下記の反応工程■、■、■
、■、■ ■　脂肪酸をアシル−ＣｏＡにする反応工程、■　アン
ルーＣｏＡをデヒドロアシル−ＣｏＡにする反応工程、 Ｏデヒドロアシル−ＣｏＡヲヒドロキ／アンアシＣｏＡ
にする反応工程、 ■　ヒドロキンアンルーＣｏＡをケトアンルーＣｏＡに
する反応工程、 ■　ケトアノルーＣＯＡをアシル−ＣｏＡにする反応工
程、 および検出できる変化を測定する工程を有することを特
徴とする測定法、および、少なくとも、下記の組成 ・ＡＴＰまたはＯＴＰ。

−ＣｏＡＳＩ（ ・ＮＡＤ。

・アンルーＣｏＡ・ノンセターゼ活性の成分、・アンル
−ＣｏＡ・オキンダービ活性の成分、・エノイル−Ｃｏ
Ａ・ヒドラターセ゛活性の成分、・３−ヒドロキシアシ
ル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性の成分、 ・３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーヒ活性の成分、を
含有することを特徴とする測定用組成物である。

捷ず本発明の被検液としては、少なくとも脂肪酸を含有
するものであればよく、またその脂肪酸としては、例え
ば炭素数６のカプロン酸、炭素数８のカフリＩＶ酸、炭
素数１０のカプリン酸、炭素数１２のラウリン酸、炭素
数１４のミＩＪスチ／酸、炭素数１６のパルミチン酸や
、パルミトレイン酸、炭素数１８のステアリン酸、オレ
イン酸、リノ−ル酸やリル鼻ン酸、などの種々の脂肪酸
が挙られる。さらにこの脂肪酸としては、例えばバター
、マーガリン、チーズ、ハム、牛乳、マヨネーズなどの
飲食品中の遊離脂肪酸や脂肪酸エステルの成分、血清や
尿などの生体液中の遊離脂肪酸や脂肪酸エステル、捷た
はそれらに作用する酵素活性に基く反応生成物、医薬製
剤中の遊離脂肪酸捷たはその塩や脂肪酸エステルの成分
や、脂肪酸または脂肪酸エステルに作用する市販の酵素
試薬の酵素活性に基〈反応生成物などの種々の成分を測
定するための脂肪酸、または遊離される脂肪酸が挙られ
る。さらにまた脂肪酸エステルから脂肪酸を遊離せしめ
るに当っては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなど
を用いるアルカリケン化に基いて脂肪酸を遊離せしめて
もより、寸たこの脂肪酸エステルに作用して脂肪酸を遊
離せしめるｌ以」−の酵素活性に基いて脂肪酸を遊離せ
しめてもよい。

さらに脂肪酸エステルとこの脂肪酸エステルに作用して
脂肪酸を遊離せしめる酵素活性との組合せにおいて、脂
肪酸エステルの成分を測定しようとする場合には該当す
る酵素活性によって脂肪酸を遊離せしめればより、捷だ
酵素活性を測定しようとする場合には該当する脂肪酸エ
ステルの含有物および必要に応じて他の酵素活性を有す
る成分を用いて脂肪酸を遊離せしめればよいもので、脂
肪酸エステルの測定１だけ酵素活性の測定のいずれかの
１つの成分の測定のために用いられる。この脂肪酸エス
テルと該当する酵素活性の組み合せとしては脂肪酸を遊
離せしめ得る組み合せであれば何ら限定されるものでな
く、種々挙られる。例えば脂肪酸エステルがモノグリセ
ライド、ジグリセライドまたはトリクリセライトなどの
グリセライドであり、酵素活性がリパーゼ活性である組
み合せにおいては、グリセライドから遊離される脂肪酸
の測定によってグリセライド捷たはリパーゼ活性のいず
れか１つの成分の測定がなされる。好１しくはグリセラ
イドの測定の際には例えば血清中などのトリグリセライ
ド測定用とすればよく、リパーゼ活性を含有する試薬を
用いて血清に作用せしめ、そのトリグリセライドから脂
肪酸を遊離せしめればよい。寸だリパーゼ活性の測定の
際には例えば血清中の膵リパーゼ活性の測定用とすれば
よく、グリセライドを含有する試薬を用いて血清に作用
せしめ、そのグリセライドから脂肪酸を遊離せしめれば
よい。さらにこの膵リパーゼ活性測定におけるグリセラ
イドとしては、用いるグリセライドによる反応系の濁り
の防止のだめにモノグリセライド捷だはジグリセライド
を用いることが好捷しく、さらにアルブミン、例えば牛
血清アルブミンを用いることが好ましい。さらに脂肪酸
エステルとこの脂肪酸エステルに作用して脂肪酸を遊離
せしめる酵素活性とによる脂肪酸の遊離の系としては、
例えば脂肪酸エステルがレシチンであす、酵素活性がホ
スホリパーセ゛Ａ１活性、ホスホ活性−ゼＡ２活性捷た
はホスホリパービＢ活性である系、脂肪酸エステルがリ
ゾレシチンであり、酵素活性がリゾホスホリパーセ゛活
性である系、脂肪酸エステルがホスファチジン酸であり
、酵素活性がホスファチジン酸ホスファターゼ活性およ
びリパーゼ活性である系、脂肪酸エステルがレシチンで
あシ、酵素活性がホスホリパーゼＣ活性およびリパーゼ
活性である系、脂肪酸エステルがレシチンであり、酵素
活性がホスホリパービＤ活性、ホスファチジン酸ホスフ
ァターゼ活性およびリパーゼ活性である系、脂肪酸エス
テルがアシルコリンであり、酵素活性がコリンエステラ
ーゼ活性でアル系、脂肪酸エステルがコレステロールエ
ステルなどのステロールエステルであり、酵素活性がコ
レステロールエステラーゼ活性である系、し／チノとコ
レステロールとの含有物ト、レシチンコレステロ−ルア
フルトランスフェラーゼ活性、コレステロールエステラ
ーゼ活性またはりゾホスポリハーゼ活性との組合せの系
などが挙られる。これらの被検液において脂肪酸の測定
に基いて、脂肪酸自体の定量や例えばリパーゼ活性の測
定、ｌ−ジグリセライドの定量、ホスホリパーゼＡ、＋
活性の測定、ホスホリバー七゛Ａ２活性の測定、ホスホ
リバー　ヒＢ活性の測定、リゾホスホリパーヒ活性の測
定、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性の測定、ホス
ホリパーゼＣ活性の測定、ホスホリパービＤ活性の測定
、コリンエステラービ活性の測定、コレステロールエス
テラ−ビ活性の測定、レンチンの定Ｈ、コレステロール
エステルの定量、レンチンＪレステロールアンルｌ−ラ
ンスフエラーセ活性の測定、コレステロールの定量など
の種々の測定目的にて用いられる。まだこれらの脂肪酸
を遊離せしめる系において、用いられる各試薬の量は、
測定すべき目的や選択する反応条件によって適宜変更役
割すればよく、特に限定されるものではなく、反応によ
って遊離される脂肪酸の量が定量測定するに充分量遊離
される条件であればよい。また脂肪酸を遊離せしめるに
当っては、通常３７℃近辺の温度条件にて行なえばよく
、１だ反応時間は脂肪酸が充分量遊離されるに要する時
間以上であればよく、通常１分以」−行なわれる。

寸だ本発明の被検液中の脂肪酸を測定するだめの■、■
、■、■および■の各反応工程を例示すれば、次の如く
である。

■　反応工程；脂肪酸をアノルーＣｏＡにする反応工程
である。例えば脂肪酸をＡＴＰおよびＣｏＡＳＨの共存
下にてアシル−ＣｏＡ、ＡＭＰおよびピロリン酸（ｐｐ
ｉ）となす反応を触媒する酵素活性を有するアシル−Ｃ
ｏＡ・／ンセターピ活性、Ａ、ＴＰおよびＣｏ　Ａ　Ｓ
　Ｈに基く反応工程が挙られる。

シンセターゼ活性 ■　反応工程；アンルーＣｏＡをデヒドロアンルＣｏ　
Ａにする反応工程である。例えばアンルーＣｏＡを酸素
の存在下にデヒドロアンル−ＣｏＡおよび過酸化水素と
なす反応を触媒する酵素活性を有するアシル−ＣｏＡ・
オキンダービ活性および酸素に基く反応工程が挙られる
。

オギンダービ活性 ■　反応工程；デヒドロアンル−ＣｏＡをヒドロキンア
シル−ＣｏＡにする反応工程である。例えばデヒドロア
ンルーＣｏＡを水の存在下にヒドロキシアンルーＣＯＡ
となす反応を触媒する酵素活性を有するエノイル−Ｃｏ
Ａ・ヒドラタービ活性および水に基く反応工程が挙られ
る。

■　反応工程；ヒトロキ／ア／ルーＣｏＡをケトアンル
ーＣｏＡにする反応工程である。例えばヒドロギンアノ
ルーＣｏＡをＮＡＤの存在下にケトアンルーＣｏＡおよ
び還元型ＮＡＤとなす反応を触媒する酵素活性を有する
３−ヒドロギンアノルーＣｏＡ・デヒドロゲナーヒ活性
およびＮＡＤに基く反応工程が挙られる。

〔ヒト狛キンア／ルーＣｏＡ） ■　反応工程；ケトアンルーＣｏＡをアノルーＣｏＡに
する反応工程である。例えばケトアンルーＣｏＡをＣｏ
　Ａ　Ｓ　Ｉ−１の存在下にアノルーＣｏＡおよびアセ
チル−ＣｏＡとなす反応を触媒する３−ケトアンルーＣ
ＯＡ・ブオラービ活性およびＣｏＡＳＨに基〈反応工程
が挙られる。

これらの各反応工程を遂行せしめるために、各反応に要
する試薬および酵素活性を奏する各酵素を用いればよく
、寸だ用いられる酵素としては、動物由来のものでも、
微生物由来のものでも使用でき、捷だこれらは市販の酵
素を用いてもよく、捷だ酵素含有組織から単離したもの
でもよい。アシル−ＣｏＡ・ノンセターゼ活性を奏する
酵素としては、例えばモルモット肝臓由来のもの〔Ｊｌ
ｌｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、ｌＢ、３２９　（１９５３）　〕、ラット
、マウス、ウシ、ブタなどの肝臓由来のもの（特開昭５
５−７４、７９１号公報）、工・／エリヒア・コリー（
Ｅｓｃｈｅ　ｒ　ｉ　ｃｈ　ｉ　ａｃｏｌｉ）由来のも
の（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１２゜５
７６（１９７０）Ｌバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｍｅｇａＩｅｒｉｕｍ）由来のもの（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ上（１）、８５　（１９６５））、そ
の他、アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒ）属に属
する生産菌（Ａ。

ａｅｒｏｇｅｎｃｓ　　ＪＦＯ３３］、８Ｌセラチア（
Ｓｅｒａｔｉａ）属に属する生産菌（Ｓｅｒａｔ　ｉａ
　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　Ｉ　Ｆｏ　３０５４、　）、
プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属に属する生産菌（Ｐｒ
ｏｔｅｕｓｍｉ　ｒａｂ口ｉｓ　ＩＦ　Ｆ　０８８４９
）、スタフィロコッカス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ　）属に属する生産菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ａｕｒｅｕｓ　　ＴＦＯ３０６０）、シュー　トモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する生産菌（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＩＦＯ３
９］９）、フザリウム（Ｆｕｓａｒ　ｉｕｍ）属に属す
る生産菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　　
Ｉ　Ｆ　０５９４・２）、キベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
　ｌａ）属に属する生産菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕ
ｊｉｋｕｒｏｉ　　ＩＦＯ６６０４）、キャンシタ（Ｃ
ａｎｄｉｄａ）属に属する生産菌（Ｃａｎｄｉｄａｌｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ”ｉ　Ｆ　Ｏ０７１７）などの微生物
由来のもの［Ｊ、　Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、、　１０５　
（３）１２１６（１９７１）、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、］　１４　（１）２４９　（１９７８）、特開昭５
５−７４．７９０号公報、特開昭５５−９９１８７号公
報〕などが挙られる。さらに脂肪酸をアンルーＣｏＡと
する反応を触媒する酵素としてはＧ　Ｔ　ＰＸＣｏＡＳ
Ｈの存在下に脂肪酸をアシル−ＣｏＡとなし、Ｇ□ＤＴ
およびオルトリン酸を生成するアシル−ＣｏＡ・ンンセ
タービが挙られ、このアンルーＣｏＡ・ゾノセターセを
用いてもよい。（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣＣ１１ｅ、　、２３
９゜（６）１６９４．（１９６４，）ウソ肝臓由来）。

寸たアンルーＣｏ　Ａ・オキ／ダーゼ活性を奏する酵素
としては、例えばラット肝臓由来のもの（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍＢｉｏｐｈｙ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　８
３　（２）　４７９　（１９７８）〕、キャノジダ属に
属する生産菌（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ。

Ｃａｎｄ　ｉｄａ　　Ｉ　１ｐｏｌｙ　（ｉｃａ　　Ｉ
　Ｆ　Ｏ１５４８、Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉ
ｓ　Ｔ　ＦＯ０５８９）、サッカ０マイセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する生産菌（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　Ｉ　Ｆ　Ｏ０
２１３，５ａｃｃｈａ　ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　Ｙ　００８６　（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−ＰＡ　５１
７４）、オイペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ）属に属する生産菌（Ｅｕｐｅｎｉｃｉ　Ｉｆ　ｉｕ
ｍ　ｊａｖａｎｉｃｕｍ　ＩＦＯ７９９２）、モナスカ
ス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ　）属に属する生産菌（Ｍｏｎａ
ｓｃｕｓ　　ｓｐ、Ｍ−４８００（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−Ｐ
Ａ５２２５）：Ｌアスペルギ＃　ス（Ａｓｐｅｒｇｉ　
ｌ　１ｕｓ）属に属する生産菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｃａｎｄｉｄｕｓＭ−４８１５（ＦＥＲＭ−、Ｐ扁
５２２６））、アースロバフタ−（Ａｒ１ｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　）属に属する生産菌（Ａｒ１ｈｒｏｂａｃｉｅ
ｒ　　ｓｐ、Ｂ−０７２０（ＦＥＲＭ　−Ｐ　Ａ　５２
２４　）　）、マクロフオミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍ　
ｉ　ｎａ）属に属する生産菌（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎ
ａ　ｐｈａｓｅｏｌ　ｉ　ＡＴＣＣ１４，３８３）、ク
ラドスポリウム（Ｃ１ａｄｏｓｐｏｒ　ｉｕｍ　　）属
に属する生産菌（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｒｅｓｉ
ｎａｅ　ＩＦＯ６３６７）などの微生物由来のもの（Ａ
ｒｃｈ、　Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　１７６．５９１　（１９７６）、
特開昭５５−１１８３９１号公報、特開昭５６−８６８
３号公報、特開昭５６−６１９９１号公報〕などが挙ら
れる。

捷だこのアシル−ＣｏＡ・オキ／ダーゼ活性の代すにア
シル−Ｃｏ　Ａ・デヒドロゲナーゼ（Ａｃｙｌ−ＣｏＡ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、　Ｅ＋Ｃ，１，８，９９
，３、Ａｃｙｌ−ＣｏＡ：　（ａｃｃｅｐｔｏｒ）ｏｘ
ｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）活性を奏する酵素、例えば
ブタ、ウソやヒツジの肝臓由来のもの（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、２１８．７１７（１９５６）、Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、　２１８．７０１　（１９５６）、Ｊ
、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。、７５　２７８７（１９５
８）、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、
、　２２．４７５　（１９５６））を用いて、アンルー
ＣｏＡをデヒドロアノルーＣｏＡとなしてもよい。この
際、電子受容体、例えば鷲２．６−シクロロフエノール
インドフエノール、２−（Ｐ−ヨードフェニル）−３−
（Ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウム・クロライド（ＩＮＴ）　、３−　（４，，５
−ジメチル）−２−チアゾリル−２，５−ジフェニル−
２Ｈ−テトラゾリウム・プロマイ）’（ＭＴＴ）、３．
３ｉ（４゜４．′−ビフエニリレン）−ビス（２，５−
ジフエニル−２Ｔ−（−テトラゾリウム・クロライＭ　
）　（Ｎｅ。

−ＴＢ　　ｉ　　、　　３．３　−　　（３，３−ン　
メ　ト　キ　／−４゜４−ビフエニリレン）−ビス〔２
−（Ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２）１−テ
トラゾリウム・クロライド１　（ＮＴＢ）、３．３”　
　（３゜３′−ジメトキン＝４゜４−ヒス〔２゜５−ビ
ス（Ｐ−二ｌ・ロフェニル）　−２１−１−テトラシリ
ラム・クロライド）（ＴＮ　Ｔ　ｒ’ｉ　）、３．３′
−（３３′−／メトキシー４．４７−ビフェニレン）−
ビス（２，５−ジフェニル−２１−１−テトラシリラム
・クロライド）（ＴＢ）などを、好ましくはフェナジン
メトザルフェトとともに用いて反応を行なわせればよい
。さらにエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性を奏する
酵素、３−ヒドロキンアシル−Ｃ（ｌ　Ａ・デヒドロゲ
ナーゼ活性を奏する酵素や３−りトアンルーＣｏＡ・チ
オラーゼ活性を奏する酵素としては適宜それらの酵素活
性含有組織から単離してもよイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　、　２１８．９７１　（１９５６）、Ａｎｇｅｕ
、＋、　Ｃｈｅｍ。、址、６８７（１９５２）、Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。、２０７　６３１．（１９５４
）、Ｂｉｏｃｈ　ｉｎ、ＢｉｎｐｈｙｓｏＡｃ　ｌａ１
圧４．４８　（１９５７１、Ｊ、　Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、　２０８．３４．５　（１９５４，）　）］ｏｔだ
これらのエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒ
トロキシアシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性および
３−ケＩ・アシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性において、
各酵素活性を同一蛋白上に有してなる複合活性酵素の酵
素活性を用いることが好捷しい。

この複合活性酵素生産菌としては、例えばエンエリヒア
属に属する生産菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
；Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃｏｄ、　Ｓｃ　ｉ
、　、　Ｌ４（２）　４９２　（１９７７））、／ニー
トモナス属に属する生産菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＦ
ｒａｇｉ　Ｂ−０７７１（Ｆ　Ｅ　ＲＭ−Ｐ＆　５７０
１）　；特願昭５６−９９３１．４．号明細書〕が挙ら
れる。特にこのシュードモナス属に属する生産菌Ｂ−０
７７１およびこの生産菌から得られた複合活性酵素につ
いて述べれば、次の通りである。捷ず本菌Ｂ−０７７１
は山梨県北巨摩郡須玉町の架剤の土壌より分離したもの
で、その肉眼的および顕微鏡的観察などに基く各種培地
上における培養の所見はり下に述べる通りである。

（Ｎ肉眼的特徴 （１）普通寒天平板培地 丘状、円形で、周囲はなめらかな集落を形成し、半光沢
で、灰白色〜淡黄色を呈する。可溶性色素は産生じない
。

（２）普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。半光沢で、灰白色〜淡黄色を呈
する。可溶性色素は産生じないっ（３）液体培地 一様に混濁し、沈澱も生ずる。菌膜は形成しない。

（ト）顕微鏡的特徴 １つすぐ、１だはやや曲った桿菌で、単独または二連で
、た１に長連鎖になる。大きさはＯ０４〜０、６　ｘ　
Ｏ，５〜３゜Ｑ／１ｍで、極手で運動する。芽胞は形成
しない。

（Ｑ生理的・生化学的特徴 ダラム染色　　　　　　　　　　　　　　　−〇・Ｆテ
スト　　　　　　　　　　　　　　　Ｏカタラ−セ　　
　　　　　　　　　　　　　　＋オキンダーゼ　　　　
　　　　　　　　　　士しンチナーゼ　　　　　　　　
　　　　　　−ウレアーヒ ＳＳＲ培地　　　　　　　　　　　　−クリステンゼン
培地　　　　　　　　０−）ゲラチンの加水分解　　　
　　　　　　　　−テンプンの加水分解　　　　　　　
　　　　−力セインの加水分解　　　　　　　　　　　
−エスクリンの加水分解　　　　　　　　　　　−アル
ギニンの加水分解　　　　　　　　　　十ポリーβ−ハ
イドロキ／ブチレイ１−（ＰＨＢ）の糸種　　−インド
ールの産生　　　　　　　　　　　　−硫化水素の産生
　　　　　　　　　　　　　−アセトインの産生　　　
　　　　　　　　　−Ｍ　Ｒテスト　　　　　　　　　
　　　　　　　−硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　
　　　−クエン酸の利用　　　　　　　　　　　　　十
糖より酸の産生性 酸産生、ガス非産生：Ｌ（ト）アラビノース、セロビオ
ース、フラクト−ス、フコース、ガラクト−ス、グルコ
ース、クリセリン、ラクト−ス、マルトース、マンノー
ス、ノリヒオース、ラムノース、／ユクロース、トレハ
ロース、キンロース、酸非産生、ガス非産生：アドニト
一ル、ヅルンｉ・−ル、メノーエリスリト−ル、イノ／
トールイヌリン、マンニトール、メレジトース、ラフイ
ノ−、ｚ、、ｆｌ）’ｙン、ノルボース、ソルビトール
、スターチ、 上記の通り、本菌Ｂ−０７７１は、ダラム陰性で、鞭毛
で運動し、カタラービ、オキシダーセ陽性であり、さら
にグリコースを酸化的に分解する好菌件の細菌である特
徴を有していることから、／ニードモナス属に属する菌
株と認められた。

さらに、ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバ
イオロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｌ）ｉｏｌｏｇｙ　）ム臥３７９〜４
．０８　（１９６１）に記載のシュードモナス−７ラキ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ）と対比した結果
、よく一致した。

−ｑへ　− さらに本菌Ｂ−０７７１を、標準法である／ニードモナ
ス・フライ・ＡＴＣＣ４９７３と比較実験を行なった。

その結果、第１表に示す通りであった。

第　　１　　表 　３６− 以上の通り、本菌Ｂ−０７７１は、標準株であるシュー
ドモナス・フライ・ＡＴＣＣ４，９７３とよく一致した
。よって本菌をシュードモナス・フライ・Ｂ−０７７１
と命名した（微生物受託番号通知書、微生物受託番号［
微工研菌寄第５７０１号、Ｐ　Ｅ　ＲＭ−Ｐ　Ａ　５７
０１　ｉ）。さらに、本菌を培養しで単離、精製された
複合活性酵素の活性測定法、その理化学的性質について
述べる。

（１）活性測定法 （ａ）エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性測定法０−
２Ｍ−）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９−０）　　　０−４
．　ｍ１１　Ｍ　−ＫＣｌ０．１　ｍ１ ４０ｍＭ−ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
１ｍ１１５ｍＭ・パルミトエノイル−ＣｏＡ　　　　　
　　　　Ｑ−ｌ　ｍ１１％牛血清アルブミン　　　　　
　　　　　　　　　０．０５ｍ１０２５％ニトロテトラ
ゾリウムブルー　　　　　　０．１　ｍｅ３０Ｕ／ｍｅ
−ジアホラーセ（東洋醸造社製）　　　　０．１　ｍｅ
ｌ、　２５　Ｕ／ｍｌ　・３−ヒ）’ｏキノアアシーＣ
ｏＡ・テヒトロゲナーゼ（ベーリンガー社製）　　　　
　　　　０．０１＋＋＋ｌ計１．００ｍ１ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素液５０μｌを加えて３７℃、１０分間反
応せしめる。反応後これに、０．５％トチ／ル硫酸すト
リウム２．Ｏｍｅを加えて反応を停止せしめ、次いで波
長５５０ｎｍにて吸光度（△Ａ１５ｏ）を測定する。測
定において、１分間に１μｍｏｌｅの還元型ＮＡＤを生
成する酵素量を１単位（Ｉ　Ｕ　）とする。−１だ酵素
活性は、次式に従う。

（１））　３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・テヒドロゲ
ナーゼ活性測定法 ０．２Ｍ−トリス−塩酸緩衝液（ｐＩ（８，５）　　　
　０．５　　ｍｔ！］、　Ｍ　−ＫＣＩ　　　　　　　
　　　　　　０．０５ｍｅ４０ｍ〜！・ＮＡＤ　　　　
　　　　　　　０．１ｍ１１５ｍＭ・３−ヒドロキシバ
ルミトイル−ＣｏＡ　　　Ｏ，１ｍ１１％律血清アルブ
ミン　　　　　　　　０．０５ｍｅ０．２５％ニトロテ
トラゾリウムブルー　　　　　　０．１．　　ｍｅ３０
ＴＪ／ｍｌ−ジアホラーセ０．１　ｍｌ計　　１，００
ｍｆｆ 上記の組成を有する反応液を３７℃、２分間予備加温し
、これに、酵素１５０μｅを加えて３７°Ｃ５，１０分
間反応せしめる。反応後これに、０．５％ドデシル硫酸
すトリウム２．Ｏｍｌを加えて反応を停止せしめ、次い
で波長５５０ｎｍにて吸光度（△Ａ５ｙｏ）を測定する
。測定において、１分間に１μｍｏ　ｌ　ｅの還元型Ｎ
ＡＤを生成する酵素量を１単位（Ｉ　Ｕ　）とする。ま
た酵素活性は、次式に従う。

（ｃ）８−ケトアフルーＣｏＡ・チオラーセ活性測定法
０．２Ｍ−１−ｌＪス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　　
　　０．２　　ｍｅｌ　０　ｍＭＣｏＡ　Ｓ　Ｈ０，０
５ｍ１０．２ｍＭ・３−ケトバルミトイル−ＣｏＡ　　
　　　　０．　１　　ｍ１１００ｍＭ−ＭｇＣ１２ｏ、
１．ｍ１ １ｍＭ・ジチオスライド−ｆｉｖ　　　　　　　　　　
　　０．１　　ｍｌ計　　１．ｏｏｍｌ 上記の組成を有する反応液を１．Ｏｍｅ容石英セルに加
えて３７℃とし、これに酵素液２０μｌを加えて３７℃
にて反応せしめ、反応によって消費される３−ゲトハル
ミトイルーＣｏＡの減少を波長３０３ｎｍにて経時的に
吸光度（ＯＤ３ｏ３）測定する。測定において、１分間
に１μｍｏｌｅの３−’ｙｒバルミトイルーＣｏＡを消
費する酵素量を１単位（１［Ｊ）とする。また酵素活性
は、次式に従う。

（２）酵素作用 １モルのデヒドロアンルーＣｏＡおよび１モルの水から
１モルのヒドロキシアンルーＣｏＡを生成する反応を触
媒するエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、１モルの
ヒドロキシアンルーＣｏＡおよび１モルのＮＡＤから１
モルのケトアシル−ＣｏＡおよび１モルの還元型Ｎ　Ａ
、　Ｄを生成する反応を触媒する３−ヒドロキシアンル
ーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、１モルのケトアンル
ーＣｏＡおよび１モルのＣｏ　Ａ　Ｓ　Ｈから１モルの
ア／ルＣｏＡおよび１モルのアセチル−ＣｏＡを生成す
る反応を触媒する３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ
活性の各酵素活性を示す。。

（３）三種の酵素活性が同−蛋白上にあることの証明、
／ニードモナス・フライ・Ｂ−０７７１の培養物からの
菌体より得られだ粗酵素から、数段の精製工程にて精製
酵素を得るもので（後述の複合活性酵素の製造側参照）
、この工程において三種類の酵素活性を前記の活性測定
衣に基いて測定した。

その結果第２表に示す通りであった。

第　　２　　表 （なお、酵素活性測定値は、その酵素含有液中の蛋白量
を求めて換算した値である） その結果、各酵素活性は、その粗酵素からの各精製工程
での活性の比率にてよく一致しているもので、かつ精製
された酵素もその三種の酵素活性　４３− を有していることから、この三種の酵素活性は同−蛋白
上にあるものと認められる。

さらに後述の製造例のトヨパールＩ−ＩＷ−６０カラム
クロマトグラフィーにて得られた精製酵素２．０ｍ夕を
、キャリア・アンホライトを用いる等電点電気泳動にか
けた後三種の酵素活性を、その活性測定法に基いて測定
した結果、ｐｌ（４，，９のフラク／ヨンに三種の酵素
活性とも単一ピーク上に検出された。

（４）基質特異性 下記の種々の炭素数を有する３−ヒドロキンアンルーＣ
ｏＡヲ基質として用い、３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ
・デヒドロゲナーゼ活性測定法に従ってその活性を測定
した。

基　質　　　　　　　　　　相対活性％）３−ヒドロキ
ンオレイル−ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　５６．５
３−ヒドロキンラウリルーＣｏＡ　　　　　　　　　　
　　８１１１３−ヒドロキン力グリル−ＣｏＡ　　　　
　　　　　　　　　９Ｌ　０３−ヒドロキ／ラウリル−
ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　　１００．０３−ヒド
ロキシリルニルーＣｏＡ　　　　　　　　　　　９８．
０Ｉｉ　− ３−ヒドロキンバルミトイル−ＣｏＡ　　　　　　　　
　　７５．５３−ヒドロキンステアリル−ＣｏＡ、　　
　　　　　　　　　　３０．５３−ヒドロキンラウリル
ーＣｏＡ、　　　　　　　　　　　９．５３−ヒドロキ
ンオレイル−ＣｏＡ　　　　　　　　　　　　５７．５
３−ヒドロキシリルニル−ＣｏＡ　　　　　　　　　　
　　９９．０さらに本複合活性酵素は、少なくともパル
ミトエノイル−ＣｏＡ、８−ケトバルミトイル−ＣｏＡ
に基質特異性を有する。

（５）至適ｐ　Ｈ 基質として３−ヒドロキンバルミトイル−Ｃ１ＯＡを用
い、３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ
活性測定法におけるｐ　Ｈをトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７
，５〜９．５にて変化せしめて活性を求めた。その結果
、第１図に示す通り、その至適ｐ　Ｈはｐ　Ｈ９付近で
あった。

（６）　ｐ　Ｈ安定性 １０ｍＭの各種緩衝液（ｐ　Ｈ４〜７　ジメチルグルタ
ル酸−水酸すトリウム緩衝液、ｐ１４７．５〜９゛トリ
ス塩酸緩衝液）に溶解した酵素液（１５Ｕ　／　ｍｌ　
）を３７°Ｃ１６０分間放置した後その残存活性を、３
−ヒドロキノアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性測
定法に基いて測定した。

その結果、第２図に示す通りで、ｐ■■５〜８の範囲で
安定であった。

（７）熱安定性 １０ｍＭジメチルグルタル酸−水酸化す）　ＩＪウム緩
衝液（ｐＩ（７，０）に溶解した酵素液（１５Ｕ　／　
ｍ７りを各温度で１０分間処理した後その残存活性を３
−ヒドロキノアンル〜ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性測
定法に基いて測定した。

その結果、第３図に示す通りで、はぼ５０°Ｃまでの温
度に対して安定であった。

（８）等　電　点 キャリア・アンホライトを用いた焦点電気泳動法により
測定した結果、等電点けｐＨ４，９にあった。

（９）金属イオンの影響 ３−ヒドロキンアノルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
についてその影響を測定した。

００界面活性剤の影響 ３−ヒドロキ／アシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
についてその影響を測定した。

以上の通り、この複合活性酵素はエノイル−ＣｏＡ・ヒ
ドラターゼ活性、３−ヒドロキノアンル−Ｃｏ　Ａ・デ
ヒドロゲナーゼ活性および３−ケトアノルーＣｏＡ・チ
オラーゼ活性を同一蛋白上に有するものである。

さらにこれらの各酵素活性において、用いられる酵素の
活性測定法については、以下の通りである。

・アノルーＣｏＡ・ンンセターゼ活性測定法０．２Ｍ　
リン酸緩衝１ｌ（ｐＨ７５）　　　　　　　　０．２　
　ｍｅｌ　０ｍＭ　　Ａ、ＴＰ　　　　　　　　　　　
　　Ｏ，１ｍ１１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　　　　　　　
　　　　　０．１　ｍ１１０　ｍ　Ｍ　　ＣｏＡＳＨＯ
，０５ｍＪ５％トリトンＸ−１００含有１ｍＭパルミチ
ン酸溶液０．２　　ｍｌ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　０．８５ｍ１計
　　１．００ｍ１ 上記の組成を有する第１反応液を調整する。

また第２反応液として、下記組成の反応液を調整する。

０．２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　　　　　　
　０．５　ｍ１２０ｍＭ　　Ｎ−エチル・マレイミド　
　　　　　　　　０．１　　ｍ１１５ｍＭ４−７ミノア
ンチピリ７　　　　　　　　　０．３ｍ１Ｏ１３％　３
−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキンエチル）
アニリ７　　　　　　　　　　　　　　　　０．２５ｍ
ｅベルオキ／ダーゼ（１００ＰＰＵ／Ｍ）　　　　　　
　　　０．１　　ｍ１０．５％　ナトリウムアジド　　
　　　　　　　　　　０．１＋＋＋Ａ！アンルーＣＯＡ
・オキ７ダーゼ（１，２０Ｕ／ｍｌ）　　　　　０．１
　　ｍｌ計　　２．００ｍ１ 上記組成を有する第１反応液に酵素液５０μｌを加えて
３７℃、１０分間反応せしめる３１反応後これを第２反
応液に加えて３７℃、５分間反応せしめ、次いで波長５
５０ｍｍにて吸光度（△Ａ３５ｏ）を測定する。壕だ酵
素活性は、次式に従う。

（たたし、Ｃは酵素液中のアシル−ＣｏＡ・シンセター
ゼの濃度（ｍ９／ｍｌ）を示す。）・アノルーＣｏＡ・
オキ／ダーゼ活性測定法０．２Ｍ＋−リス塩酸緩衝１（
ｐＨ８，０）　　　　　　Ｏ，１ｍ１５ｍＭ４−アミノ
アンチピリン　　　　　　　　　　０．０５ｍ６３ｍＭ
　　ジエチルメタトルイジン　　　　　　　　　　０．
０５ｍ１Ｏ，５ｍｑ／ｍｅベルオキ７ダーゼ　　　　　
　　　　　　０．０５ｍｇ２５ｍＭ　　バルミトイル−
Ｃｏ　Ａ　　　　　　　　　　　０．０２ｍｌ計　　０
．５０ｍ１ 上記組成を有する反応液に、酵素液１０μｌを加えて、
３７°Ｃ１１０分間反応させた後Ｑ　、　５　ｍｌの４
Ｍ尿素を加えて反応を停止せしめ、次いでこれに１％ｉ
・すｌ、ンＸ−１００の２　ｍｌを加え、波長５４５ｍ
ｍにて比色し、生成した過酸化水素の量を求める。酵素
活性は、１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生成する
酵素量を１単位（ＩＵ）とする。

寸だエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性測定法３−ヒ
ドロキシアシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性測定法
、３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性測定法は、
前記複合活性酵素における各活性測定法にて述べた方法
と同一方法によるものである。

さらに各反応工程を遂行せしめるに当って、使用される
各酵素活性の量としては反応せしめるに充分な酵素活性
を有していればよく、被検液中の脂肪酸の量および炭素
数や反応条件などに応じて適宜変更すればよく、特に限
定されるものではない。例えば０．００５〜０．０５Ａ
ｍｏｌｅの炭素数１８のオレイン酸を含有する被検液に
ついて３７℃、５〜１０分間反応せしめる場合には、ア
ノルーＣｏＡ・ノンセターセ活性は通常０．ｌＴＪ以上
、好１しくは０．５〜ＩＵ程度の酵素活性を奏する酵素
の量を用いればよく、１だアシル−ＣｏＡ・オキ／ダー
ゼ活性は通常１０以上、好捷しくは５〜１５（Ｊ程度の
酵素活性を奏する酵素の量を用いればよい。さらに、エ
ノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシア
シル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、３−ケトアシル
−ＣｏＡ・チオラーゼ活性、またはそれらの各酵素活性
を同一蛋白上に有する複合活性酵素の酵素活性は通常０
−１０以上、好ましくは１〜２５程度の酵素活性を奏す
る酵素の量を用いればよい。さらに反応に要する試薬、
例えば＠反応工程に要せるＡＴＰまたはＧＴＰおよびＣ
ｏＡＳＨ１■反応工程に要するＮＡＤ、■反応工程に要
するＣ　ｏ　Ａ　Ｓ　Ｈの各試薬の量としては、被検液
中に存在する脂肪酸の量とその脂肪酸の炭素数に基いて
行なわれるβ酸化サイクル数との積に値する量以上の充
分々量にて用いればよく、例えばオレイン酸０，０１μ
ｍｏｌｅの場合にはＡＴＰまたはＧＴＰは通常０．１μ
ｍｏｌｅ程度以上、好ましくは０．５１ｉｍｏｌｅ程度
以上、Ｃｏ　Ａ　Ｓ　Ｉ−１’ｄ、０６１１ｉｍｏｌｅ
程度以上、好捷しくは０　５μｍｏｌｅ程度以上、ＮＡ
Ｄは０．１μｍｏｌｅ程度以ト、好捷しくけ０５μｍｏ
ｌｅ以上を用いればよい。さらに■反応工程において、
アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ活性に基つく反応を行な
わせしめるに当っては、反応系に存在する酸素、即ち溶
存酸素を利用すればよく、捷だ■反応工程に要する水と
しても反応系に存在する水を利用すればよい。さらにア
シル−ＣｏＡ・シンセターゼ活性を良好にせしめるため
に、マグネ／ラムイオンを放出できる水溶性マグネシウ
ム塩、好１しくは塩化マグネシウムを用いればよい。ま
た■反応工程において、アシル−ＣｏＡ・オキソダーゼ
活性に基いて生成される過酸化水素を消去することが好
ましく、通常カタラーゼを用いて過酸化水素を分解、消
去せしめればよい。このようにして、少なくとも、ＡＴ
ＰまたはＧＴＰ−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性
の各活性を含有する測定用組成物を調整すればよい。捷
たこの測定用組成物において前記複合活性酵素を、エノ
イル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキンアシ
ル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性、および３−ケトア
シル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性の代りに用いることが好
捷しく、さらに水溶性マグネ／ラム塩を含有せしめるこ
とが好ましい。さらにこの測定用組成物にカタラーゼを
含有せしめることが好ましく、その他、非イオン系界面
活性剤、例えばトリトンＸ−１００（商品名）を含有せ
しめて測定用組成物となしてもよく、また一般に中性な
いし弱アルカリ性の水または緩衝液を用いて溶液となし
てもよい。さらにこの測定用組成物を脂肪酸エステルか
ら酵素活性に基いて遊離される脂肪酸の測定のために用
いる場合には、脂肪酸エステル捷たは脂肪酸エステルに
作用して脂肪酸を遊離せしめる酵素活性を有する成分を
脂肪酸遊離のだめの試薬として、あらかじめこの測定用
組成物に加えておいてもよい。例えばリパーゼ活性測定
用組成物においては、前記の測定用組成物にグリセライ
ド、好ましくはモノグリセライド捷だはジグリセライド
、さらに好甘しくにアルブミンをも添加したものとして
調整すればよい。１だトリグリセライド測定用組成物と
しては、例えばリパーゼ活性を含有する成分を前記の測
定用組成物に添加して調整すればよい。さらに例示すれ
ば、レノチ／である脂肪酸エステルの含有物を前記測定
用組成物に添加してなるホスホリパーゼＡ　＋　活性、
＊スホＩＪ　ハーゼＡ２活性またはホスホリパーゼＤ活
性測定用組成物、リゾレノチンである脂肪酸エステルの
含有物を前記測定用組成物に添加してｈるリゾホスホリ
パーゼ活性測定用組成物、ホスファチジン酸である脂肪
酸エステル含有物およびリパーゼ活性を有する酵素の含
有物を前記測定用組成物に添加してなるホスファターゼ
活性測定用組成物、レシチンである脂肪酸エステルおよ
ヒリパーゼ活性を有する酵素の含有物を前記測定用組成
物に添加してなるホスホリパーゼＣ活性測定用組成物、
し／チンである脂肪酸エステルおよびホスファチジン酸
ホスファターゼ活性とリパーゼ活性を有する酵素の含有
物を前記測定用組成物に添加してなるホスホリパーゼＤ
活性測定用組成物、アシルコリンである脂肪酸エステル
の含有物を前記測定用組成物に添加してなるコリンエス
テラーゼ活性測定用組成物、ステロールエステルである
脂肪酸エステルの含有物を前記測定用組成物に添加しテ
ナルコレステロールエステラーゼ活性測定用組成物、ホ
スホリパーゼＡ１活性、ホスホリパーゼＡ２活性、ホス
ホリパーゼＢ活性、ホスホリパーゼＣ活性とリパーゼ活
性、または、ホスホリパーゼＢ活性とホスファチジン酸
、ホスファターゼ活性とリパーゼ活性を有する酵素の含
有物を前記測定用組成物に添加してなるレシチン測定用
組成物、リゾホスホリパーゼ活性を有する酵素の含有物
を前記測定用組成物に添加してなるリゾレンチ／測定用
組成物、コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素
の含有物を添加してなるコレステロールエステル測定用
組成物、コレステロールおよびレシチンを含有する脂肪
酸エステルとコレステロールエステラーゼ活性捷だはり
ゾホスホリパーゼ活性を有する酵素の含有物とを前記測
定用組成物ニ添加してなるし／チンコレステロールアツ
ルトランスフェラーゼ活性測定用組成物、レシチンであ
る脂肪酸エステルとレシチンコレステロ−ルアノルトラ
ンスフェラーゼ活性トコレスチロールエステラーゼ活性
捷だはりゾホスホリパーゼ活性を有する酵素の含有物と
を前記測定用組成物に添加してなるコレステロール測定
用組成物などが挙られる。

次いでこのようにして得られた測定用組成物を用いて、
種々の被検液中の脂肪酸を測定するのであるが、捷ず用
いられる被検液の計としては通常５μ１以上を用いて、
測定用組成物の通常１　ｍ１以上の溶液に加えればより
、捷だその際の反応条件としては、例えば反応温度は通
常３７℃近辺にて行なえばよい。寸だ反応時間としては
特に限定されるものでなく、反応時間は長時間とする方
がより高感度に変化を生ずるもので、通常１分以上であ
ればよく、好捷しくけ５〜１０分間程度である。

さらに反応媒体としては用いる各酵素活性の安定ｐ　Ｈ
域の媒体であればよく、通常弱酸性ないし弱アルカリ性
、例えば水分やｐＴ（ｉ５〜８のリン酸緩衝液、トリス
−Ｈ（４！緩衝液、イミ・ダシ−ルーＨＣｌ緩衝液、ジ
メチルゲルタール酸−ＮａＯＩ７緩衝液、ピペス（Ｐ　
Ｔ　ＰＥＳ　１−Ｎａ０）Ｉ緩衝液が用いられる。

このようにして反応せしめた後反応において検出できる
変化を測定するのであるが、この検出できる変化とは、
１回のβ酸化サイクルにで少なくとも１分子の成分を消
費するか、捷たけ生成する成分の変化である。簡便には
反応に用いられるＮＡＤから反応工程によって生成され
る還゛元型ＮＡＤの量の変化を検出し、定量測定する。

この還元型ＮＡＤの測定手段としては、例えば用いるＮ
ＡＤに特異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤに特異的吸
収波長である吸収波長域の波長に基いて吸光度測定すれ
ばよい。ＮＡＤは２６０ｎｍ近辺に特異的極太吸収波長
を有し、還元型ＮＡＤは２６０ｎｍ近辺および８４０ｎ
ｍ近辺に特異的極大吸収波長を有するもので、それ故還
元型ＮＡＤの測定のだめの特異的吸収波長である吸収波
長域としては３２０ｎｍ〜３６０ｎｍ近辺であり、好１
しくは３４０ｎｍ近辺の波長である。この波長により、
生成される還元型ＮＡＤの量を検出できる変化として測
定する。さらに還元型ＮＡＤの測定手段としては、還元
型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色
原体の発色による方法も挙られる。この還元型ＮＡＤの
水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体として
はＴＮＴ、ＭＴＴ、Ｎｅｏ　−１ザルフエ−１・を用い
てその電子伝達を良好にせしめたものを用いればよい。

この水素伝達系色原体をあらかじめ前記の測定用組成物
に添加して用いてもより、捷たは反応後に添加してもよ
く、反応後に生成する還元型Ｎ　Ａ　Ｄはこの水素原子
伝達系色原体と反応して色の変化を生せしめ、この色調
の変化をその吸光波長により吸光度を測定すればよい。

さらに寸だこの還元型ＮＡＤの測定手段として、この還
元型ＮＡＤを基質とする酵素、例えば還元型Ｎ　Ａ　Ｄ
・オキ／ター上を用いてこの酵素反応に基いて変化する
成分を測定すればよく、好ましくは公知の固定化手段に
より固定化酵素として加工せしめ、この固定化酵素を酸
素電極などに具備せしめた還元型Ｎ　Ａ、　Ｄ・オキン
ターゼ酵素電極を用いることにより、反応系に生成した
還元型ＮＡＤに作用して消費される酸素の量を電気的に
測定することによる還元型ＮＡＤの測定方法も利用でき
る。さらにこの測定された還元型ＮＡＤの量に基いて、
脂肪酸含量が算出され、さらにこの脂肪酸含量から被検
液中の脂肪酸エステルの含量捷たは酵素活性の値が算出
される。さらに検出できる変化の測定としては、測定用
組成物に用いられる試薬における反応において消費され
るＣ０ＡＳＨの成分の量、捷たけ反応において生成され
るアセチル−ＣｏＡなとの成分の量を測定してもよい。

このようにして、本発明の測定法および測定用組成物は
、簡便かつ極めて高感度にて測定し得るもので、さらに
脂肪酸を遊離せしめる種々の被検液中の成分の測定のだ
めに利用できる良好なものであり、例えば膵臓機能の検
査の１つとしての血清リパーゼ活性の測定において、簡
便に、寸だ高感度にて正確に測定し得るものである。

次いで本発明の実施例および酵素の製造例を挙げて具体
的に述べるが、本発明はこれらによって何んら限定され
るものでは々い。

実施例　１ 〔各種脂肪酸の定量〕 ・　１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．２　　ｍｌ・　１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２　　　　　　　　　　　　　　０．３　　ｍｌ−１０
ｍＭ　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．３　　ｍｌ・　３％トリトンＸ−１０００，１ｍ
ｌ・　１０ｍＭ　　ＣｏＡＳＨ０，２ｍｌ・アノルーＣ
ＯＡ・／ンセターゼ活性含有液（４０Ｕ／ｍｌ　；東洋
醸造社製Ｌｏ　ｔＮａ６５６　）　　　　　　　　　０
．０２．ｍｌ・アノルーＣｏＡ・オキシターゼ活性含有
液（４００Ｕ／ｍｇ；東洋醸造社製Ｌｏ　ｔＮ［１６５
４；後述のアノルーＣｏＡ・オキシターゼの製造例参照
）０．０２ｍ１・カタラーゼ（１５０Ｕ／ｍｌ：　シグ
マ社製）　　　　０．０５ｍ１・複合活性酵素活性含有
物（エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性４００　Ｕ／
ｍｌ、　　３−ヒドロキンア受ルーＣｏＡ・デヒドロゲ
ナーゼ活性２００　Ｕ　／ｍｌ、　　８−’ｙドアシル
ーＣＱＡチオラーゼ活性１６８Ｕ／ｍｌ；東洋醸造社製
；後述の複合活性酵素の製造例参照）　　　　　　　　
　　　０．０５ｍ１計３．０ｈ＋／’ 上記の組成を有する測定用組成物を調整した。

この測定用組成物３−３−０Ｏに、２　ｍ　Ｍの各種脂
肪酸を含有する被検液２５μｌ（脂肪酸含量０．０５μ
ｍｏｌｅ）　を加えて、３７℃で５分間反応せしめた後
、生成された還元型ＮＡＤの量を波長３４０ｎｍにて吸
光度（ＯＤ　３４０１ｍ　）を測定した。

その結果、第３表に示す通りであった。

極めて良好な吸光度増加の比例関係にて測定し得たもの
であった。

実施例　２ 〔脂肪酸（オレイン酸）の定量〕 実施例１と同一組成を有する測定用組成物３．００ｍ１
を用い、これにオレイン酸０．０１μｍｏｌｅ。

０．０２μｍｏ　ｌ　ｅ、　０．０３μｍｏ　ｌ　ｅ、
　０．０４μｍｏ　ｌ　ｅ。

および０．０５μｍｏｌｅを含有する被検液２０μｌを
加えて、３７℃で５分間反応せしめ、次いで生成された
還元型ＮＡＤの量を波長３４０．ｎｍにて吸光度測定し
た。その結果、第４図中番−１で示される定量曲線を得
た。

壕だ対照として、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｙｙ。

９８．３４１　（１９７９）に記載の従来法に基いて、
オレイン酸を含有する被検液を用いて測定（たたし、吸
光度の減少値である）した結果、第４図中Ｇ−０にて示
される定量曲線を得だ。

その結果、本発明の定量曲線は、従来法のそれに比べ高
感度にて測定され得たことが明らかである。

実施例　３ 〔脂肪酸（オレイン酸）の定量〕 ・　０．２Ｍ　　ピペスーＮａＯＨ緩衝液（ｐＩ（７，
３）０．５ｍ１ −１０ｍＭ　ＮＡ、Ｄ　　　　　　　　　　　０．２　
ｍｅ・］−００ｍＭＭｇＣ１２ｏ、　２　ｍｌ−１０ｍ
Ｍ　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　０．２　ｍｌ・　１
％トリト、：／Ｘ−１００　　　　　　　　　　　　　
０．２ｍｌ・１０ｍＭ　ＣｏＡ−８Ｈ０，２ｍｌ ・アンルーＣｏＡ・シン士ターゼ活性含有物（４０Ｕ／
ｍｌ。

Ｌ　ｏ　ｕ＋ｎ６５６　）　　　　　　　　　　　　　
　　　０．０２ｍ１・アノルーＣｏＡ・オギ／タービ活
性含有物（４００Ｕ／ｍｌ。

Ｌｏ　ｔＮｎ６５４）　　　　　　　　　　　　　　　
　ｏ、０２ｍ１、　　・複合活性酵素活性含有物（エノ
イル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性４００　Ｕ／ｍｌ、　
　３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
性２００Ｕ／ｍｌ、　　３−ケトアノルーＣｏＡ・チオ
ラーゼ活性１６３　Ｕ／ｍｌ）　　　　　０．　Ｏ１ｍ
ｌ・　カタラーゼ（１５０Ｕ／ｍｌ）　　　　　　　　
　　　０．０５ｍ１・　ジアホラーゼ（８０Ｕ／ｍｌ：
東洋醸造社製）０，１ｍ１−　０．２５％ＮＴＢ　　　
　　　　　　　　　　　　０．２ｍｌ・蒸留水　　　　
　　　　　　　　　　ｌ。１０ｍｌ計　　８．００ｍ１ 上記組成を有する測定用組成物を調整した。この測定用
組成物３．００＋＋＋ｇを用い、これにオレイン酸０．
００５μｍｏｌ＋、０．０１μｍｏｌｅ、０．０１５μ
ｍｏ　ｌ　ｅ、　０．０２μｍｏ　ｌ　ｅ、　０．０２
５μｍｏ　ｌ　ｅを含有する被検液２０μｌを加えて、
３７℃で１０分間反応せしめ、反応によって生成した還
元型ＮＡＤＯ量に応じて生成した青紫色の発色を波長５
５０ｎｍにて吸光度（ＯＤ５６００ｍ　）を測定した。

その結果、第５図中番−１で示される定量曲線を得だ。

捷だ対照として、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓＬｙ。

１０８．６（１９８０）に゛記載の従来法に基いて、オ
レイン酸を含有する被検液を用いて測定〔たたし、波長
５０５ｎｍによる吸光度（ＯＤ５Ｑ５ｎｍ　）測定であ
る〕しだ。その結果、第５図中○−○にて示される定量
曲線を得た。

その結果、本発明の定量曲線は、従来法のそれに比べ極
めて高感度に測定され得だことが明らかである。

実施例　４ 〔リパーゼ活性（血清リパーゼ活性）測定〕−０，２Ｍ
　　ピペスーＮａ０Ｉ−Ｉ緩衝１（ｐＨ７，３）０．２
ｍ１ −１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　０．１
５ｍ１・１０ｍＭ　ＭｇＣ７２０，１，５ｍＪ・ｌｏｍ
Ｍ　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　０．１５ｍＪ・　
２％１・１月−ンＸ−１００含有１０ｍＭ１−２−ジオ
レイルグリセライド　　　　　　　　　　　　　　０．
１０ｍ１・　　１．　０ｍＭ　　　　ＣｏＡＳＩ−Ｔ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｏ，１５ｍ１−　２Ｍ　　ＫＣｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　０．１　　ｍｌ・　５％十血清アル
ブミ７　　　　　　　　　　　　　Ｑ、　ｉ　　ｍｌ・
アシル−ＣｏＡ・／ンセターゼ活性含有物（４０Ｕ／ｍ
ｌ；Ｌｏ　ｔＮ［１６５６）　　　　　　　　　　　　
　　　　０．２　　ｍｌ・アンルーＣｏＡ・オキ／ター
上活性含有物（４ｏＯＴＪ、４’；Ｌ　ｏ　ｔＮ［１６
５４）　　　　　　　　　　　　　　　　０．０２ｍ１
・複合活性酵素活性含有物（エノイル−ＣＯＡ・ヒドラ
ターゼ活性４００　Ｕ　７ｍｌ、３−ヒｌ’ｏ　キシ７
　／ｆｉＶ−ＣＯＡ　−デヒドロゲナーゼ活性２００　
Ｕ　／ｍｉ！、　　３−ケ（・アンル−ＣｏＡ・チオラ
ーゼ活性１６８１Ｊ／ｍ６）　　　　　０．０５ｍ１・
カタラーゼ（１５０ＴＪ／ｍｌ）　　　　　　　０．０
５ｍｅ・蒸留水　　　　　　　　　　　　　　０．０８
ｍ、ｇ計　　１．５ｍｊ 上記組成を有する測定用組成物を調整した。この測定用
組成物１．．５ｍｌに、人血清５０μｌを加え３７°Ｃ
にて反応せしめ、反応後逐次反応液中に生成される還元
型ＮＡＴ）の量を波長３４０　ｎ　ｍにて吸光度（ＯＤ
３４０１ｍ）の測定をしだ。

その結果、第４表に示す通りであった。

第　　４　　表 この測定の結果、用いたジグリセライドと血清リパーゼ
活性とに基くジグリセライドから遊離された脂肪酸が反
応する前に、血清中に存在する遊離の脂肪酸が反応した
ことが明らかであり、またとの血清中に存在する遊離の
脂肪酸は反応時間７分間の反応で終了したものと認めら
れる。この時点次後の吸光度の増加が用いたジグリセラ
イドと血清リパーゼ活性とに基くジグリセライドから遊
離された脂肪酸の反応による還元型ＮＡＤの量であり、
従って反応開始後８分から１３分の５分間の吸光度の増
加により、リパーゼ活性を求めた結果、８．４．４ＴＪ
／ｌであった。

なおリパーゼ活性の算出式は次式に基いたものである。

１．５　　５０　　５ 寸だ血清リパーゼ活性の測定において、上記の測定用組
成物の組成中リパーゼ活性の基質であるグリセライド無
添加の組成物を調整し、これを用いて血清リパーゼ活性
測定用被検液を加えて血清中に存在する遊離の脂肪酸を
消去せしめた後、本発明の上記測定用組成物を用いるこ
とにより血清中の遊離脂肪酸による影響なく、す・ぐ−
ゼ活性の測定ができる。

実施例　５ 〔トリグリセライド測定用組成物〕 ・０．２Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＩ−Ｉ７．５）　　　
　　０．５　　ｍｌ・１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　　　　　
　　　　　　　　　Ｏ，３ｍｌ−１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２　　　　　　　　　　　０．４　ｍｌ・］、　ＯｍＭ
　　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８ｍｌ
・　３％トリト、／Ｘ−１０００，Ｌ　　ｍｌ・　１０
ｍＭ　Ｃ０ＡＳＨ０４ｍｌ ・アシル−ＣｏＡ・ンンセターゼ活性含有物（４，ＯＵ
／ｍｌＶ。

Ｔ−、ｏ　ＩＮ［１６５６）　　　　　　　　　　　　
　　　　０．　Ｏ：３ｍｌ・アンルーＣｏＡ・オキシタ
ーゼ活性含有物（４，ＯＯＵ　７ｍｌ。

Ｌ　ｏ　　ｔＮＩ１６５４　）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．　０８ｍｅ・複合活性
酵素活性含有物（エノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性
４００　Ｕ　７ｍｌ、　　３−ヒドロギンア／ルー〇ｏ
Ａ°テヒトロゲナーセ活性２００Ｕ／ｍＪ、３−ケトア
ンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性１６　ａ　Ｕ／ｍｌ）　
　　　　　　　　０、Ｏ’１ｍｌ・　カタラーセ（１５
０Ｕ／ｍｅ）　　　　　　　　　　　０．０７ｍ１・　
リパーゼ活性（１０，０ＯＯＵ／ｍｅ；東洋醸造社製）
０、０８ｍ１ 泪　　３．ＯＯｍＪ 」−記組成を有する測定用組成物をトリグリセライＦ用
測定用組成物としだ。

このトリグリセライド測定用組成物は、血清３０μｌを
前記実施例１記載の測定用組成物と同一の組成を有する
血清中の遊離脂肪酸の消去のだめの組成物に加えて３７
°ＣＸ　１０分間反応せしめた後、その１−　ｍｌ（血
清相当量１０μｌ）を分増し、これを被検液として加え
て波長８４．　Ｏｎ　ｍにて吸光度の増加を測定するか
、捷たは血清１０　ＩＩ　ｌを直接加えて反応開始１０
分以後の波長８４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定す
るに用いられる。

実施例　６ 〔ホスホリパーゼＡ１活性、ホスポリバー上Ａ２活性１
だはオスホリパーセＢ活性測定用組成物〕実施例］記載
の測定用組成物において、蒸留水１２６ｍ１の代りに、
１０ｍＭし７チン溶液０，２ｍｌおよび蒸留水１．０６
ｍ７を用いて測定用組成物となす。

実施励　７ 〔リゾホスホリパーゼ活性測定用組成物〕実施例１記載
の測定用組成物において、蒸留水１．２６ｍ１の代りに
、１０ｍＭリゾレ／チン溶液０．２ｍｌおよび蒸留水１
−０６ｍ１を用いて測定用組成物となす。

実施例　８ 〔ホスファターゼ活性測定用組成物〕 実施例１記載の測定用組成物における蒸留水］、、２６
ｍ１の代りに、１０ｍＭホスファチジン酸溶液０．２ｍ
ｌ、リパーゼ（１０，０ＯＯＴＪ　７ｍｌ　）０．０５
ｍ１および蒸留水１．．０１ｍ１を用いて測定用組成物
となす。

実施例　９ 〔ホスホリパービＣ活性測定用組成物〕実施例５記載の
トリグリセライド測定用組成物における蒸留水０．７７
ｍ１の代りに、１０ｍＭレシチン溶液０．２ｍｌおよび
蒸留水０．５７ｍ１を用いて測定用組成物となす。

本測定用組成物は、グリセライドにも作用するために、
グリセライドをも含有する被検液を用いる揚台にはグリ
セライドからの脂肪酸の量との差を求める。

実施例　１０ 〔ホスホリパーゼＣ活性測定用組成物〕１０ｍＭ１／ジ
チア溶液０．　２ｍ１．、　　リパーゼ活性（５，００
００７ｍｌ　）　０．０８ｍ１．０．２　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）　０．５０ｍｅ、蒸留水１．２２ｍ１
を含有する脂肪酸遊離用反応組成物２．０ｍｌを調整す
る。

この脂肪酸遊離用反応組成物と、前記実施例１記載の測
定用組成物とを用いてホスホリパーゼＣ活性測定用組成
物となす。

１ず脂肪酸遊離用反応組成物２．０ｍｌに、ホスホリパ
ーゼＣ活性測定用被検０．２０μｌを加えて３７℃、１
０分間反応せしめ、次いで反応を停止せしめた後、これ
を実施例１記載の測定用組成物８．００ｍ１に加えて３
７°Ｃで５分間反応せしめ、波長３４．　Ｏｎ　ｍにて
吸光度測定をする。

実施例１１ 〔ホスホリパーゼＤ活性測定用組成物〕１０ｍＭし／チ
ノ溶液０．２ｍｌ、ホスファチジノ酸ホスファターゼ活
性（５０Ｕ／ｍｅ　；東洋醸造社製）０−０５ｍｌ、　
　リパーゼ活性（１０、０００ＴＪ／ｍｅ）０、０５ｍ
１．　０．２１ＶＩ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
０．６ｍｌ、蒸留水１．１ｍ、ｌを含有する脂肪酸遊離
用反応組成物２．．０ｒｎｌを調整する。

この脂肪酸遊離用組成物と、前記実施例１記載の測定用
組成物とを用いてホスホリパーゼＤ活性測定用組成物と
なす。

実施例　１２ 〔コリノエステラーゼ活性測定用組成物〕実施例１記載
の測定用組成物における蒸留水１．２６＋＋＋／！の代
りに、２ｍＭパルミトイルーコリノエステル溶″ｏ、Ｏ
６２ｍｅおよび蒸留水１．０６ｍ１を用いて測定用組成
物となす。

実施例　１３ 〔コレステロールエステラーゼ活性測定用組成物〕実施
例１記載の測定用組成物における蒸留水１．２６ｍ１の
代りに、５　ｍ　Ｍ　３−オレオイル−コレステロール
エステル溶に！ｉ、０．２ｍｌおよび蒸留水１−０６ｍ
／！を用いて測定用組成物となす。

実施例　１４ 〔し／チンコレステロールアノルトランスフエ７−セ活
性測定用組成物〕 ５　ｍ　Ｍ　コＬ／　ステロール溶液０．２ｍｌ、５ｍ
Ｍ１／ンチンｇｉ　０　、２　ｍｌ、　　リゾホスホリ
パーゼ活性（８０Ｕ　／　ｍｌ！　）含有物０．０５ｍ
１および０．３％］・リドンＸ−１００含有の０．１Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　１　、５５ｍｌを含有
する脂肪酸遊離用反応組成物２．Ｑｍｅを調整する。

この脂肪酸遊離用組成物と、前記実施例１記載の測定用
組成物とを用いてレンチンコレステロールアノルトラン
スフエラーゼ活性測定用組成物をなす。

実施例１５ 〔コレステロールエステル測定用組成分〕実施例１記載
の測定用組成物における蒸留水１　、　２６　ｍ１（Ｄ
代リニ、コレステロールエステラーゼ活性（３５０１Ｊ
　／　ｍ、ｌ　；東洋醸造社製）含有物０．２ｍ、ｌお
よび蒸留水１．．０６ｍ１を用いてコレステロールエス
テル測定用組成物となす。

〔複合活性酵素の製造例〕

５００ｍ１容三角フラスコに１００ｍ１の培地（培地組
成、ペプトン１．５％、粉末酵母エキス０．５％、ＫＣ
ｌ０．２％、ＮａＣ１０，１％、Ｋ２ＨＰＯ４０゜１％
、ＭｇＳＯ４０，０５％、オレイン酸０．７５％、ｐＩ
（７，０；１５本分）を入れ、１２０°Ｃで加圧滅菌し
だ後３０°Ｃにて、７．：ｌ−−トモナス・フライ−Ｂ
−ＯＴ’ｌｌ　（ＦＥＲ，Ｍ−ＰＮｎ５７０１）を接種
し、ロータリー７エーカーにて２０時間培養した。次い
でこの培養物を併合し、５０００ｒｐｍ、２０分間遠心
分離して培養菌体を得た。さらに得られだ菌体を１．５
０ｍ２リゾチーム含有１０　ｍ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（
ｐ　Ｉ−１７、０）　３６０　ｍｌに加えて可溶性の和
製の複合活性酵素含有液（３−ヒドロキンアンルー　Ｃ
ｏ　Ａ・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性は３．
０（Ｊ／ｍ？であった。）　３４０　ｍｌ！を得た。

得られた粗製の複合活性酵素２９０ｍ１を水槽中で冷却
後、予め一２０°Ｃに冷却したアセト７２９０ｍ１を添
加し、生じた沈澱物を回収し、これをＩＭ　Ｋ　Ｃｌ含
有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐｉ−、Ｔ７．５）に
溶解し、さらに１２００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心分離し
て不溶物を除去した。得られた上清液の４５ｍ１を分取
し、これに２２．５ｍｌの飽和硫安溶液（ｐＨ７，０）
を添加し、生じた沈澱物を１２００Ｏｒｐｍ、１０分間
遠心分離にて除去した。次いで得られだ上清液５７ｍ１
に、さらに飽和硫安溶液２８ｍ１を加えて沈澱せしめた
。この沈澱物を回収した後、ＩＭＫＣｌ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）の１０ｍ１に溶解し、
１０　ｍ　Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）２
．Ｏｌに対して４°Ｃで２０時間セルロースチューブに
て透析脱塩し、次いでこれを凍結乾燥して、複合活性酵
素粉末（３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナ
ーゼ活性にて、その比活性は１Ｂ、２Ｕ／ｍｙであった
）７　’１ｒｒｉを得た。

さらに得られた複合活性酵素粉末（３−ヒドロキンアン
ルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性は
１８．２Ｕ／ｍ２であった。）７７ｍ９を２０ｍ１の水
に溶解し、これを、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で平衝化しだＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６
Ｂ（ファルマノア社ｆｆ）のカラム（３Ｘ１１ｃｍ）に
チャージして吸着せしめ、同一ト緩衝液にてカラムを洗
浄した。次いで５００ｍ１の同上緩衝液と０−４４４Ｋ
Ｃｌを含んだ同上緩衝液５００ｍ１にて作製した直線濃
度勾配法による溶出を行なった。５２ｍＡ／時間の流速
で、９ｍ１つつ分取し、各分画の酵素活性を測定し、そ
の活性画分（Ｎ［１７１〜８０　）　９０ｍｌを得だ（
３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
にて、その比活性は３０　、　Ｏ０７ｍ９であった）。

さらにこの活性画分を、１０　ｍ　Ｍ　リン酸緩衝液（
ｐＨｊ５）２１に対して透析した後、ハイドロキンアパ
タイトゲルを充填しだカラム（２ＸＩＯｃｍ）にチャー
ジして吸着せしめた。３００ｍ１の１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）と３００ｍＪの０５Ｍ　ＩＪン酸緩衝
液（ｐｌ（７，５）とにて作製した直線濃度勾配法によ
り溶出を行なった。３３ｍ１／時間の流速で５　ｍｌつ
つ分取し、各分画の酵素活性を測定し、活性画分（Ｎα
４６〜６２）８５ｍｌを得だ（エノイルアンルーＣｏＡ
ｌ１ヒドラターゼ活性の比活性は２１０　、８Ｕ／ｍ９
．３−ヒ）口＃　’／　７　シ／ｌ／　−ＣｏＡ・デヒ
ドロゲナーゼ活性の比活性は１０５０２杓す、３−ケト
アシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性の比活性ハ８５．６Ｕ
／ｍ２であった）。次いでこの活性画分を、限外濾過膜
（アミコン社製ＸＭ−５０）を用いて濃縮後、これを、
トヨパールＨＷ−６０（乗洋曹達社製）を充填しだカラ
ム（１−ＩＸ９０ｃｍ）にチャージしてゲル濾過しだ（
溶媒：１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐ［（７，５，０，
５ＭＫＣｌ）。

３．５ｍ１つつ分取し、活性画分（Ｎ［１２３〜２７）
１７．５ｍｅを得、これを凍結乾燥して精製された複合
活性酵素を得た（３−ヒドロキ／アシル−リＯＡ・デヒ
ドロゲナーゼ活性にて、その比活性は１１０Ｕ／％’で
あった。収量２０　ｍｇ　）。

〔アシル−ＣｏＡ・オキンターゼの製造例〕オレイン酸
１％、酵母エキス０．２５％、ペプト　ン　１　％、　
　ＫＣｌ０．２　％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，１免、　Ｍｇ
５Ｏ４・７Ｈ２００，０５％、消泡剤（ディスフオーム
ＢＣ−５１Ｙ）０．２％よりなる組成の培地１０ｍ１を
滅菌後試験管に入れ、これにアースロバフタ−・ニス・
ピー・Ｂ−０７２０菌株を接種し、３０°Ｃにて一晩振
盪培養して種菌を得だ。次いでこれを、上記と同一組成
の培地５１を有する８１容ジャーファーメンタ−に移植
し、３０°Ｃ１２０時間６００ｒｐｍ、５１／分の条件
下通気攪拌培養した。培養終了後、培養物を遠心分離し
てその菌体を得、これを、ｌｌの１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）、２　ｍＭＥＤＴＡ、　０．５ｍ９７ｍ
１リゾチームに懸濁し、３７℃にて６０分間攪拌し、処
理後オキシリボヌクレアーゼ５　ｍ９を添加してさらに
１０分間攪拌した後、１１００００ｒｐにて２０分間遠
心した。得られた上清液に、２００ｍ１のアセトンを加
えて遠心した後、さらに上清に、１．８１のアセトンを
加えた。次いでこれを遠心してその沈澱物を得、これを
２．００ｍ１の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１７．０）
に溶解し、不溶物を遠心除去し、さらに、飽和硫安を用
いて３０〜７５％の硫安分画を行ない、得られた沈澱物
を４０ｍ１の１０　ｍ　Ｍ’　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解し、これをアクリルマイトゲル（バイオゲ
ルＰ〜２；バイオラド社製）のカラムにチャージして脱
塩した。次いでこれを、リン酸カルンウムゲルのカラム
にチャージして吸着せしめ、洗浄後０．０５〜０．５Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の濃度勾配をつけたグラ
ディエンド法で溶出し、その活性画分（０，４５Ｍ付近
）を回収した。さらに、この画分を限外ｐ過膜（ダイア
フローメンブレンＰＭ−１０；アミコン？［）を用いて
脱塩濃縮し、次いで凍結乾燥して、アンルー　Ｃｏ　Ａ
・オキ７ダーゼ（比活性５．５Ｕ／ｍ９、全活性８５０
　Ｕ、収率８．５％）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は／ニードモナス・フライ・Ｂ−０’／７１（Ｆ
ＥＲＭ−ＰＮｎ５７０１　）から得られた複合活性酵素
の３−ヒドロキシアンル−ＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
性の仝ｐ　ｐ　Ｈを示す曲線、第２図は該複合活性酵素
の３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活
性のｐＨ安定性を示す曲線、第３図は該複合活性酵素の
３−ヒドロキシアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性
の熱安定性を示す曲線、第４図は脂肪酸（オレイン酸）
の定量曲線、第５図は脂肪酸（オレイン酸）の定量曲線
を示す。 特許出願人　東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第１図 ７，５　　　　８８，５　　　　９　　　　　　９．５
第　　２　　図 ５６７８９ 第　　３　図 佑４図 ０　　　　　０．０１　　　０．０２　　　０．０３　
　　０．０４　　０．０５オ′イ′酸（ｐｍｏｌｅ７３
ｍ１．） 第５図 ０　　　　０．００５　　　０．０１．　　　　Ｏ，Ｏ
］、５　　０，０２　　０．０２５オレイン酸（１＋ｍ
ｏｌ−ｅ／３ｍ１）特許庁長官　島　１）春　樹　殿 ／１事件の表示 昭和、！ｉ′６年特許願第１１１ｇ３／３号Ω＼発明の
名称 脂質関連成分の測定法および測定用組成物３Ｘ補正をす
る者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福乙３．２の／自　　発 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　　ＩＦ’０　３０５１７−）　
Ｊを削除する。 手続補正書 昭和５７年／θ月２ｚ日 昭和Ｓ乙年特許願第１／１−ｇ３／３号、２１発明の名
称 脂質関連成分の測定１法および？ｌａ＋定用組成用組成
物３１袖正者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福乙３λの／自　　発 加入する。「上記のリノール酸およびリルン酸を基質と
しだ場合１用いた接合活性酵素活性含有物中にエピメラ
ーゼが混入していないトヨパールＨＷ−４Ｑのゲルゾ過
後の精製された複合活性酵素の凍結乾燥物を用いた結果
＼　リノール酸の場合ＯＤ３４０ｎｍ＝’１．１０＼　
リルン酸の場合ＯＤ　　　　−：０．’１０３４０　ｎ
ｍ であった。」 −ノー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）被検液中の成分を定量するに当り、下記の反応工
   程■、■、■、■、■ ■　脂肪酸をアゾルーＣｏＡにする反応工程、■　アゾ
   ルーＣｏＡをデヒドロアシル−ＣｏＡ　Ｋ　スる反応工
   程、 ■　テヒドロアシルーＣｏＡをヒドロキンアンルー〇Ｏ
   Ａにする反応工程、 ■　ヒドロキンアンルーＣｏＡ　ヲケトアノル−ＣｏＡ
   にする反応工程 ■　ケトアンルーＣｏＡをアンルーＣｏＡにする反応工
   程、 および検出できる変化を測定する工程を有することを特
   徴とする測定法。 （２）　　反応工程において、 ■　反応工程が、脂肪酸とＣｏＡ　Ｓ　ＨとＡＴＰ−ｉ
   たはＯＴＰおよびアンルーＣｏＡ・ゾンセターセ活性に
   基く反応工程、 ■　反応工程が、アシル−ＣｏＡ　、酸素およびアンル
   ーＣｏＡ・オキシダーセ活性に基く反応工程、■　反応
   工程が、デヒドロアシル　ＣｏＡ、水およびエノイル−
   ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性に基く反応工程、 ■　反応工程が、ヒドロキンアンルーＣｏＡ　ＸＮＡ　
   Ｄおよび３−ヒドロキンアンルーＣｏＡ・デヒドロゲナ
   ーゼ活性に基〈反応工程、 ■　反応工程が、ケトアンルーＣｏＡ、ＣｏＡ　Ｓ　Ｈ
   および３−ケトアンルーＣｏＡ・チオラーゼ活性に基く
   反応工程である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 （３）■、■および■反応工程が、エノイル−ＣｏＡ・
   ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキンアシル−ＣｏＡ・デ
   ヒドロゲナービ活性および３−ケトアンルーＣｏＡ・チ
   オラーゼ活性の各酵素活性を同一蛋白上に有してなる複
   合活性酵素の酵素活性に基く反応工程である特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の測定法。 （４）　　複合活性酵素が、シュードモナス・フライに
   属する複合活性酵素生産菌から得られた酵素である特許
   請求の範囲第３項記載の測定法。 （５）／ニードモナス・フライに属する複合活性酵素生
   産菌が、ツユ−トモナス・フライ・Ｂ−０７７１菌であ
   る特許請求の範囲第４項記載の測定法。 （６）　　検出できる変化を測定する工程が、反応工程
   によって生成する還元型Ｎ　Ａ、　Ｄの量を定量する工
   程である特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記
   載の測定法。 （７）生成する還元型Ｎ　Ａ、　Ｄの量の定量が、ＮＡ
   Ｄに特異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤに特異的吸収
   波長である吸収波長域の波長による定量である特許請求
   の範囲第６項記載の測定法。 （８）吸収波長域の波長が、３２０　ｎｍ〜３６０ｎｍ
   近辺である特許請求の範囲第７項記載の測定法。 （９）吸収波長域の波長が、３４０　ｎ　ｍ近辺である
   特許請求の範囲第８項記載の測定法。 Ｇｏ）　　生成する還元型ＮＡＤＯ量の定量が、還元型
   ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原
   体の発色による定量である特許請求の範囲第７項記載の
   測定法。 θの　還元型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素原
   子伝達系が、ジアホラーゼおよび水溶性テトラゾリウム
   塩を含有する水素原子伝達系である特許請求の範囲第１
   ０項記載の測定法。 （功　被検液中の成分が脂肪酸である特許請求の範囲第
   １項ないし第１１項のいずれかの項に記載の測定法。 ｄａ　　被検液中の脂肪酸が、脂肪酸エステルの含有物
   と、その脂肪酸エステルに作用して脂肪酸を遊離せしめ
   る酵素活性とにより遊離される脂肪酸である特許請求の
   範囲第１２項記載の測定法。 σゆ　脂肪酸エステルの測定まだは酵素活性の測定のい
   ずれかの１つの成分の測定である特許請求の範囲第１３
   項記載の測定法。 Ｑｏ　　脂肪酸エステルがモノグリセライド、ジグリセ
   ライド捷たけトリグリセライドであり、酵素活性がリパ
   ーゼ活性である特許請求の範囲第１３項寸だは第１４゛
   項記載の測定法。 ＯＯアルジミンを添加してなるリパーゼ活性測定法であ
   る特許請求の範囲第１５項記載の測定法。 α力　脂肪酸エステルがレシチンであり、酵素活性がホ
   スホリパーゼＡ２活性、ホスホリパーゼＡ２活性まだは
   ホスホリパーゼＢ活性である特許請求の範囲第１３項寸
   たは第１４．項記載の測定法。 （ト）脂肪酸エステルがりゾレンチンであり、酵素活性
   がリゾホスホリパーゼ活性である特許請求の範囲第１３
   項寸だけ第１４項記載の測定法。 叫　脂肪酸エステルがホスファチジン酸であり、酵素活
   性がホスファチジン酸ボスファターゼ活性およびリパー
   ゼ活性である特許請求の範囲第１３項寸たけ第１４．項
   記載の測定法。 （イ）脂肪酸エステルがし／チンであり、酵素活性がホ
   スホリパーゼＣ活性およびリパーゼ活性である特許請求
   の範囲第１３項１だは第１４項記載の測定法。 ■）脂肪酸エステルがレシチンであり、酵素活性がホス
   ホリパーゼＤ活性、ホスファチジン酸ホスファターセ廷
   性およびリパーゼ活性である特許請求の範囲第１３項ま
   たは第１４項記載の測定法。 （イ）脂肪酸エステルがアシルコリンであり、酵素活性
   がコリンニステラ〜ゼ活性である特許請求の範囲第１３
   項または第１４項記載の測定法。 （イ）脂肪酸エステルがステロールエステルであり、酵
   素活性がコレステロールエステラーゼ活性である特許請
   求の範囲第１３項寸たけ第１４項記載の測定法。 ■　被検液中の脂肪酸が、レシチンとコレステロールノ
   含有物ト、酵素活性がレシチンコレステロ−ルア／ルト
   ランスフエラーゼ活性およびコレステロールエステラー
   ゼ活性まだはりゾホスホリパーゼ活性とにより遊離され
   る脂肪酸である特許請求の範囲第１項ないし第１１項の
   いずれかの項に記載の測定法。 （イ）　レシチン、コレステロール、酵素活性のいずれ
   かの１、つの成分の測定である特許請求の範囲第２４項
   記載の測定法。 （ホ）少なくとも、下記の組成 ・ＡＴＰまたはＧＴＰ ・　ＣｏＡＳＨ −ＮＡＤ。 ｅアシル−ＣｏＡ・シンセターゼ活性ｔ　Ｉ　物、・ア
   シル−ＣｏＡ・オキンダーセ活性−ｉ有物、・エノイル
   −ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性含有物、・３−巳ドロキシ
   アンル−ＣｏＡ・テヒトロゲナーゼ活性１有物、 ・３−ケトアフル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性＠３物を含
   有することを特徴とする測定用組成物。 （イ）測定用組成物において、マグネシウムイオンを放
   出する水溶性マグネシウム塩を含有し７てなる測定用組
   成物である特許請求の範囲第２６項記載の測定用組成物
   。 （ハ）脂肪酸測定用組成物である特許請求の範囲第２６
   項１たは第２７項記載の測定用組成物。 （ト）少なくとも、脂肪酸エステル、まだはその脂肪酸
   エステルに作用して脂肪酸を遊離せしめる酵素活性を含
   有してなる１つの成分の測定用組成物である特許請求の
   範囲第２６項または第２７項記載の測定用組成物。 （イ）脂肪酸エステルがモノグリセライド、ジグリセラ
   イドまだはトリグリセライドであるリノ（−ビ活性測定
   用組成物である特許請求の範囲第２９項記載の測定用組
   成物。 ■）　リパーゼ活性測定用組成物がアルブミンを含有し
   てなる特許請求の範囲第３０項記載の測定用組成物。 （ハ）酵素活性がリパーゼ活性である脂肪酸エステル測
   定用組成物である特許請求の範囲第２９項記載の測定用
   組成物。 （イ）　トリグリセライド測定用組成物である特許請求
   の範囲第３２項記載の測定用組成物、。 例　脂肪酸エステルがレシチンであるホスホリノシービ
   Ａ、Ｉ活性、ホスホリパービＡ２活性捷たはホスホリバ
   ービーＢ活性測定用組成物である特許請求の範囲第２９
   項記載の測定用組成物。 （１）脂肪酸エステルかりゾレシチンであるリゾホスホ
   リパーセ活性測定用組成物である特許請求の範囲第２９
   項記載の測定用組成物。 ■　脂肪酸エステルがホスファチジン酸であるホスファ
   チジン酸ホスファタービ活性測定用組成物である特許請
   求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 （ハ）脂肪酸エステルがレシチンおよび酵素活性がリパ
   ーゼ活性であるホスホリパーゼＣ活性測定用組成物であ
   る特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 （ト）脂肪酸エステルがレシチン、および酵素活性がホ
   スファチジン酸ホスファターゼ活性およびリパーゼ活性
   であるホスホリパーゼＤ活性測定用組成物である特許請
   求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 ■）脂肪酸エステルがアシルコリンであるコリンエステ
   ラ−セ活性測定用糾成物である特許請求の範囲第２９項
   記載の測定用組成物。 ｆｉｌｌ　　脂肪酸エステルがステロ−ｌレエステルで
   あるコレステ（ＩＩ−ルエステラーセ活性測定用組成物
   である特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 ＋１．１）　　酵素活性がホスホリパーセＡＩ活１’ｌ
   Ｅ、ホスホリバー　セＡ　２　？＆　性、ホスホリハー
   セ゛Ｂ活性、ホスホリパーゼＣ活性とリパーゼ活性、ま
   たは、ホスホリパーゼＤ活性とホスファチジン酸ホスフ
   ァターゼ活性とリパーゼ活性であるレシチン測定用組成
   物である特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 磐酵素活性がコレステロールエステラーセ活性であるス
   テロールエステル測定用組成物である特許請求の範囲第
   ２９項記載の測定用組成物。 （！３）　　脂肪ｅエステルがコレステロールとレシチ
   ンおよび酵素活性が＝ルステロ−ルエステラーゼ活性捷
   だはりゾホスポリパーセ活性であるレシチンコレステロ
   ールテンルトランスフエラ−ゼ活性測定用組成物である
   特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 に）脂肪酸エステルがレシチン、および酵素活性がレゾ
   チンコレステロー／１アシルトランスフエラーセ活性お
   よびコし・ステロールエステラーゼ活性捷だはりゾホス
   ホリパーセ活性であるコＩ／ステロール測定用組成物で
   ある特許請求の範囲第２９項記載の測定用組成物。 ｅ５）　　エノイル−ＣｏＡ・ヒトラターセ活性、８−
   ヒドロキシアシルーＣｏＡ・デヒドロゲナーゼ活性およ
   び３−ケトアノルーＣｏＡ・チオラーゼ活性が、各酵素
   活性を同一蛋白上に有してなる複合活性酵素の活性であ
   る特許請求の範囲第２６項ないし第４４項のいずれかの
   項に記載の測定用組成物。 ←６）複合活性酵素がシュードモナス・フライに属する
   複合活性酵素生産菌から得られた酵素である特許請求の
   範囲第４．５項記載の測定用組成物。 （４，７）　　ンユードモナス・フライに属する複合活
   性酵素生産菌が、シュードモナス・フライ・Ｂ−０７７
   １菌である特許請求の範囲第４６項記載の測定用組成物
   。 （４８）還元型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素
   原子伝達系色原体を含有せしめてなる特許請求の範囲第
   ２６項ないし第４７項のいずれかの項に記載の測定用組
   成物。 （４９）還元型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素
   原子伝達系色原体が、ジアホラーセおよび水溶性テトラ
   ゾリウム塩の含有物である特許請求の範囲第４８項記載
   の測定用組成物。