JPS5852226A - 牛トロンビンの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明に、牛のトロンビンから発熱物１ＪＩＩを除去す
る方法ｎ：ｐＡｔゐ。 発熱？″質゛・、熱、泉゛−１背中及び足の苦痛及び不
快ケ含めて、人間に対し、沁１しからぬ反応管引き起こ
す。動物でに、発熱物質か存在することＫよって上述の
’ｒ）Ｌ＋き望１［−力、らぬ生物学的試験が誘発ζ７
するから、製薬学的ｖ！４ｖ剤は発熱物質を比較的含ん
でいてにカら彦い。 人聞の病気の非経口的予防、診断又に処置のたｔ）のす
べての生物学的生成物は、発熱物質の存在に対する試験
を含めて、特別な試りに適合しかけわけならない。米国
薬局方に記述さＶている如き発熱物質試験に、ウサギの
熱応答全基準として用いる生物学的試験である。発熱ｍ
個を含むトロンビンの局所的施用にエリ局在化した血餅
が生成する場合にね、発熱物Ｊｊｒを体液系へ又は血液
循環系へ導入することにηるから、そのようカドロンビ
ン−製剤も非経口的製薬学的調製畑と−１−の、発熱物
質を含む基準に−Ａ合しな汀ｔ’ｌｉがらがい。 Ｒｅｍｊｎｇｔｏｎｓ　　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ　　８ｃｉｅｎｃｅ。 餓１４版、１５２４〜１５２５真１１Ｑ７０年）に、＃
桑学トー製剤から発熱物負ケ除去マゐことｃｒ、＊ｔζ
會芳−（７ている。この文献Ｖコ、好適な方法が発熱物
質を除去する試みエリもむしろ発ｙＩＰ物質の非経口的
ｐ！！＃剤への導入を防止することにあること？ｙｔ−
ているが、こｒｌＬＤ・・・・・　［東質的に不ｉ］能
で夛る」と述ベマいる。 Ｊ　、　Ｐｈａｒｍ、　　Ｐｈａｒｍａｃ、　、　　３
０　、　１９８１’１９７８１Ｈ１発熱勉１質を製薬学
的投薬形態から除去する六ぬｒ（従来から提案さＶてい
る方法が再結晶；希アル刀り、酸欠０酸イヒ剤の存在下
における汗繁深い処坤；活性炭、アスベスト又に他の物
情への吸着；了ニオン交捗りロｉトダラフイー或いａ珪
ｒ１１１１層クロマトグラフィー、を含むことを示して
い小。’Ｊた驚者ね、土述σ］方法が実験室で小規楔に
川・・なために１南片であるか、数リンドルの規模で不
値足彦桑剤から発熱物質試験適に除去すく、ことができ
ないことを示唆してい心。著者ね、費用の〃かゐ工程で
あゐ分子濾過ドエつて発熱＠’ｊＭ汚染物會除物上た。 従来の技術に、ファクタＩＬプロトロンビン）、ファク
４１１ａｌ）ロンビン）及びフ了りタＸＶｒ含む白液因
子σご精製法からかつている。２つの主たる方法にイオ
ンクロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィーで
ある。 例えげ、Ｊ　、Ｂｔｏｌ、　（：ｈｅｍ、　＊　　２４
３　＊　　１１２〜１１７（１９６８Ｎ’：ｌ、ジエチ
ル了ミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース音片い／）ｔＰ
ｉ的／ロマトグラフイー払でグラ２ミノケン及びブラズ
ミン會除去するというトロンビンｆ）鞘製法會記述して
いる。ＦＥ）３８　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　５１１１）、
１９１〜１９４＋１９７５１ｔｆｆ、親和性クロマトグ
ラフィーによる牛トリプシン及びトロンビンの精＃法に
ついて１述し１いる。 抑液因子のｎＩ製に関する敵本関連し、た従米伝ａ。 Ｈｉｏｃｈｅｍｉ＋〕ｎ、　　ｅｔ　　　Ｂｌｏｐｈｙ
ｓｉｒ、ａ、　　Ａｅｔａ、。 ムス−２，６９１〜ｆｉ９Ｆｔ　＋　１９７０）及び４
３４゜１９９〜２（１８１１９７６１Ｋｒｙ？４光シゎ
てぃゐ。 １９７０任の文献り、人…ｊの抑餅ファクタＸを精製す
＾方法を１述し２でいる。プロトロンビン（ファクタｌ
）にファクタ）（ａの触媒作用１工ってトロンビン（〕
了クりＩａ）Ｋ転住できるから、著者ねトロンとンを含
めて、他の血餅因子ケ含１ないファクタＸを得ることに
関心１示したにの方法ね、青色染料−多糖類錯体及び血
餅因子を錯化させ、クロマトグラフィーで処欝すること
を含゛　　　　　　　またこの力ａ　ｒ、ｒ　、血餅因
子と錯場合、ファクタｎ及びｈａ空ト容雪中１（ｆｉｆ
出する。こ′ｎＯそｒｌらが青色染料−多糖−と錯化す
ることケア＋＜シてい／）。ファクタ■及びＸに色含容
首（ｉｎｒ、１ｕｄｅｄ　　ｖｏｌｕｍｅ　　）中に流
出する。こｔｉｔｘそｎらが實色染狙−多糖ａ鈴体と錯
化しかい仁と會示す。用いる青色染料の構造に、４−フ
ェニルアミノ−１−アミノ−アンスラキノン構造を有す
るものとしてＪ　、　Ｃｈｒｏｎｎａｔｏｇｒａｐｈｙ
　、　−６９。 ２（１１〜２１４　＋１９７２１に−１足さｎている。 １９７６年の文献ｒ１多糖類の重合体に１合した同一の
アンスラキノン青色染利會用いることによるファクタｍ
、■、ＩＸ及びＸの人間のｉｎ＃からの精製法を配達し
ている。酢敞塩酸価剤での流出ｆ（ＬＦ）、ファクタ＞
１７アクタｕ１■及びＩＸから分離している。著者に、
カラムに結合し介物質の１りＱ）ＦＡ１分が７アクタ１
ａ（）ロンビン）活性を示すこと、シロちファクタログ
ニトロンビンへの活性化への可能性を示唆

【た。 １９７０犀ルひ】９７６舘σノ双力の分離６、他σ曲Ｉ
Ｍ因子、？１１オけｎ　　ｖｎ及びＩＸをイ・細物とし
て除去するファクタＸの精製法？ｌｒ’述（ている。 いすわの分離も、発熱物質のトロンビンか［の除去ケ開
示［７ていｆｒｉ／−１１−、提案もし−でいかい。 数リットル知模Ｖ゛工８ＶＣも容易に適用［、うる、抑
液蛋白生成物から＠熱物質ケ除去する葡単１゛効果的η
方法ゾ・必要ときｖでいる。 本発明ｈ、牛トロンビンから発熱物＊’を除去する方法
に関する、本ｙＪ法に、構造式 〔式−申、■、及びり、つ水索又６Ｓす、１１であり、
及びＲａ　ｆｃＩ　（、’　ｌ　Ｘ　ｔｒ：ｌ　ｉ、、
）でめる〕を肩するアンスラキノン青色染料とエピクロ
ルヒドリンでの架−にエリ多傭ａ會住危せしめたデキス
トランとσ）錯合体を形成はせ　この錯合体を低イオン
強度の錫溶液と平衡化てゼる、工移管含んでいる。次い
で発熱物質含有の牛トロンビンｖｌ−錯合体と接触ハぜ
、トロンビン會低イオンＩｉ！ＩＦ＃の塩浴液で洗浄し
、て発熱物ＩＸケ除去する。発熱物質を含１ないトロン
とンに、例えけ尚イオン％！１ｑ・塩浴液での脱ｆＫ工
９回収ζわる。 本発明で９！用される不純な発熱物質含有のトロンビン
物質１■、７了クタ出σ〕トロンビンへの転化亭 ＫＬＯ、ファクタ１Ｃプロトｐビン）會含有する牛の佃
漿から製造することが１゛きゐ。トロンビンＶ和／）た
ｔＩ＆糧々の方法ｒ１文献（計述寧１ているー？１見げ
、プロトロンビンにファクタＩＸｉＭＩＸ物から製造す
めことができる。〔８肺、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 （’ｈｅｍ、、２４８，７７２９〜７７４１１１９７３
１］。プロトロンビン１、クエン醪バリウムに＠ｙｋζ
ゼ、エチレンジアミン四酢拳１流出１せ、１酸アンモニ
ウムで分別プせ、艷に１）　Ｂ　Ａ　Ｅ−セルロースの
クロマトグラフィーｒ（工ってｆｉｌｌすることができ
る。θ′いて）″ロトロンビンを、　Ｊ　　、　　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　ｔ：ｈｒｍｉｓｔｒｙ　　、　
　’ｌ　　５０　　。 ８８９７〜８９（１６１１９７５）Ｋ’計述されるよう
に牛のファクタｘａで活性什感ゼる。 トロンビン會含有する出発物ＪＪｌｌ？−製造するため
に用いる力ｇ：ｎ”）１３通りてオ）る。 殺菌して々い１０トンビン錯合体をイオン父俟江によっ
て牛の血Ｗから分別した。フィピリノーゲン及び他の汚
染物を沈廊′：ｖｃ工って除去【２、フ“ロトンビンを
牛σノドロンボンラスチン及び、ａ４４イオン１活性化
さゼた、 Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｒｍ、、５．２ｆｉｆｉ　１１！
’１４４）ニトロンボブラスチン及び刀ルシウム、スト
ロンチウム、マグネシウム又にバリウムｔＩＡの使用を
記述している。　Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　（：ｈｅｍ、　
＋　２４６　。 ｆｉ１０６〜６１１４（１９７１）ｔ’ｆｆプロトンビ
ンσｔクエン酸ナトリウムでの活性化、絖〈透析につい
て記述しでいる。 次いでトロンビン物質を高速遠心分＃ＩＫ伊り、て錯合
体を清Ｕさせ、続いて巨大有性及び１１石性膜でのｐ過
に伊する。先に示したように、種々のトロンビンの製造
法が技術的に数示さねてい６゜こｆ’！ｋ（ｒ）方法に
、本発明に用いる出発駿Ｊ質會得ゐためＫｌ’片−ｆ／
ｂことができる。本発明の方法で用いるものｒｆｆｃσ
゛発熱物質含弔σ、トロンビンである。 暢造式 〔式中、Ｈ６及びＢ、ｔａ水票又ｕ８Ｕ、Ｈであり及び
ｋＬ、に（１又に０である〕 を肩するアンスラギノン實仔染料に、エピクロルヒドリ
ン１゛架檎（て多糖類σ・３次元網状構造管形成させた
テキストランに結付セＥ５めＣ−わる。托−がじ１−ｉ
（ある過剰か青電染料−多糖類マトリックスｇ、Ｂｌｕ
ｅ　　ＩＭｅｐｈａｒｏｓｅ　　ｔ゛Ｌ　ｆｉ　Ｈの商
品名１゜ＰｈａｒｍａＣｉａ　　ｌ　ｒｌｐｐｓａｌａ
、　　８ｗｅｄｅｎ　　）から市販ζｎていｆ、）。Ｈ
１８が（１１゛訊ゐ適栴彦青色染料に、（：１ｂｒａｔ
＝ｏｎ　　Ｂｌｕｅ　ｌ＋’３Ｇ−Ａの曲品名でＬ：ｉ
ｂａＡ　Ｇ　Ｉ　Ｂａ５ｅ１．５ｗ１ｔｚｒｒ−Ｌａｎ
ｄ　ｌから市鈑ζｊている。遣当彦多糖＠に、５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ型の商品名でＰｈａｒｍａｒ、ｉｍ　−１
）１ｃｍ市販１１ている。 染料は技術的に十分公知の方法で多糖１ｉＫ結合せ１め
うる〔８即、Ｊ　、　（’ｈｒｏｍａｔｏｇｒｏｈｙ、
　−ＬＬ２０９〜２１４１１９７２１］。染料及び多糖
類を水浴液で一緒に混合（、ナ）　ＩＪウム塩を添加す
ることができる。次いで上述の如く得た低純度の牛のト
ロンビンを低イオン強参の墳溶液、例え、げ０．１　（
１〜０．２０　ＭＮａｔ′Ｊ　Ｔ平伽什−Ａ？た實包染
料−多ｅｅ錯合体からなりカラムに適用ｆ、ｂ。トロン
ビン會、錯合体に結合づ一＋Ｆるのに十分力時間、錯合
体と接ＰｆＪＩジせる。結合に接触嚇に起こり、接触向
後に平■イにｎ１液での洗浄１行なう。即ち、トロンと
ン會平絢（１７浴ｇで洗かし、発熱物質を洗浄＃敵で除
去すな。次いで高イオン強簾の塩酌液、例ｆｉ：Ｈ’ｌ
）、４〜２．ＯＮ　　Ｎａｔ二ｌ’ｔ”２Ｊラム？脱Ｉ
Ｉｉ着＃せることにより、ｎＩ製ばｆ＋たトロンビン會
カラムから除去する。 実施例Ｉ Ｒ８が（ＪＴ”よる前述σ）構造式を肩丁ゐアンスラキ
ノン青色染料２ｔの水６（）が中溶液會、８ｅｐｈａｄ
ｅｘ　　Ｇ−７５１０９の水３　Ｆｉ　（１−甲ａｍ液
に、ａ　＜＋　’（：６ＴＪ、４３１＃ｔ、　（攪拌ｔ
、７Ｔｈ　カＣ：４ｍｋ　ＩＩ（添７１ｏｔ、；ｑｎ分
間攪拌した。Ｎａ（°１　４　Ｆｊ　ｆ　Ｍ分を添加し
２、攪拌を１岨パ間継紗した。次いで密合物上８０℃１
で加熱１、へａｔ、’ｏ＝　４　ｆで処理［７、この１
１度で爽に１時間攪拌し、た。搦混１て冷却Ｅ左後、ゲ
ルをンフナーｐ斗で吸り・ｐ別［７、水洗し次。 このケＡｉ、ｉｌ、２　Ｍ　Ｎａ（：ｊ　％液で約６〜
８の範囲のｐＨＫ＋伽什さゼたカラム１１０ｃ＋ｙ＋ｌ
中ｙｃ充填し１（。 前述の如く１製［六、弁勢物實Ｖ含む、約３嗟トロンヒ
ンの′ｖＪ期純阪ン南１ゐトロンビン−製物管、先のゲ
ルカラムに適用した。次いでとのトロンビン會低イオン
強度の塩平衡化溶液で洗浄して発熱物質を除去した。カ
ラムを通過する洗浄′＃４１［中の発熱物質の存在に、
Ｂ　１ｏｃｈｅｒｎｉｃａ、　ｅｔＨｉｎｐｈｙｓｉｒ
、ａ、　　Ａｃｔａ、＋　　２　　ｆｉ　　１　　、　
　２　８　４〜２　８　９（１９７２１に記述ζ−る試
−に基づく１Ｌ１ｍｕｌｕｓ　　Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ　
　Ｌｙｓａｔｅ″として表示ざｆ＋心方法ｆζ従りて麩
験し、た。 発熱物５Ｍσ２存在に対し、て浴液σ、ト１結果か負と
なった後、ゲルカラムを筒イオン俵屋の塩浴液、即ち２
Ｍ　Ｎａｔ’ｌ溶液と接触プゼることにより、トロンビ
ン會ゲルカラムから説塾→せた。トロンビンね約７（Ｉ
ｇｋの純度會もした０次いでゲルカラム力ｌ−ｌ５ｓ　
ｔ、ｆｆ　）　ロンビン５（’１．１　ｆｉＭ　　Ｎｉ
１（’ｊに対し２て透析し無ｌＩ！濾過し、保結乾珠し
た。 得らｔまたトロンビンを、前述の発熱物質−ウサｄｆ賦
験で１−し１、発熱物質を含９ない及び局所的に投与で
き葵泄餅剤とＥて用いるσ′に適当ｒあることがわかっ
ｔｏ トロンビンに、酵素及びプロ酵素、例えばプラスミン及
びプラスミノゲンと唾、関連する。この物質ｕ、＊ｖｔ
トロンビンσン崩壊における面餅購程に含１ｔＩ心。−
上述の如く製造したトロンビンの予備ｆＣ＃ｔ２　、上
述σ・力Ｂが牛σ７トロンビンか【プラスミン及びブラ
スミノゲンを除去す心ことを示す。 特許出願人　　マイルス・ラボラドリース・インコーホ
レーテンド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構造式 〔式中、）Ｌ、及びｉ（瀧に水嵩又は８ｔ）、　Ｈであ
   り、托、は（：１又にＵである〕 【有する肇刺と、エピクロルヒドリンでの架橋により多
   糖−の３次元網状構造を生成ゼしめたデキストランとの
   釦＠体ケ形敗させ；この錯合体ｔ−倶イオン強１の塩浴
   液で平鞠化孕せ：該錯合体ケ発熱物質含有の牛トロンビ
   ンと接触させ；該トロンビンを低イオン強腹の塩浴液で
   洗浄して１発熱物質を除去し；そして発熱物９ｉｖ苫１
   ｉい牛トロンビン會回収することをや書とする、発熱物
   質會含む牛トロンビンから発熱←ノ質會除去する方法。 ２．９合体を平絢化さゼるために用いる低イオン＠腹の
   錫＃液か０．２０Ｌ９％、大きくないイオン強要を南す
   る特許−求の節−謝１項記載の方び。 ３、トロンビンを洗浄するために用いる低イオンＷｓ倉
   の塩浴液が梁刺−多糖類錯合体を平向化させるために用
   いるものとｔｒ！Ｉｌ−のものである特許ト＊の静囲第
   ２項記載Ｃ；方法。 ４、Ａ１１＊餉會含弔【、ないトロンビンσノ仲１収が
   、錯＠体力・らトロンビンを除去するのに十分なイオン
   強度の塩浴液でトロンビン會処珈し、発熱物質を含まな
   い牛欧トロンビン會回収することを含んでなる勢許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５、錯Ｏ体からトロンビンを除去するために用いる塩溶
   液が０．４よりも小さくないイオン強度１有する特許請
   求の範囲第４璃記載の方法。 ６、低イオン強度の塩溶液と、トロンビン會除去すゐた
   めに用いる塩浴液が双方と％＋Ｎａ（’１會含壱するｑ
   ＃計話求の範曲第５項に載σご方法。 ７、＄造式 〔式中、Ｈｌ及びＨ９ね水木又にｓｕ、ｔ−ｔであり、
   ）ｔｌにじ１又Ｆ’ＳＯでめる〕を有すと染狛と、エピ
   クロルヒドリン↑の架橋により多糖類の３次元網状＃ｌ
   Ｉ造會牛敢せしめたテキストランとの鉢＠体會形Ｉｆｔ
   ？ゼ；この錯会体ｉ低イオン強腹の＃Ａ浴溶液平働（ヒ
   ζゼ；該錯合体を発熱物質室７ｆ４（１）牛トロンビン
   と接触ζせ：＃トロンビンを低イオン伽ｆＭ（７塩＃・
   液で洗浄して１発熱物質金除去（、；発熱物ｌＪＮ會含
   １ない牛トロンビンを回収すゐという工１ｉ！によって
   製造Ｌ＝ｆｃ発熱物債を物情ない牛トロンビン。