JPS5863387A - 制限酵素の製造法 - Google Patents

制限酵素の製造法

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JPS5863387A
JPS5863387A JP56161071A JP16107181A JPS5863387A JP S5863387 A JPS5863387 A JP S5863387A JP 56161071 A JP56161071 A JP 56161071A JP 16107181 A JP16107181 A JP 16107181A JP S5863387 A JPS5863387 A JP S5863387A
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enzyme
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JP56161071A
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Toshiyuki Kamisaka
神阪 敏行
Toshizo Sakurai
桜井 稔三
Masahiko Mutai
務台 方彦
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Yakult Honsha Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はビライドバクテリウム・ビフィダムを利用して
制限酵素を製造する方法に関するものである。
制限酵素け2本鎖デオキシリポ核酸(DNA)の中の特
定の塩基配列を認識してこれを特定の部位で切断するエ
ンドヌクレアーゼfiDN人分解酵素である。この酵素
はその特異な酵素作用に基づき特定の生物種のDNAを
認識して特定の大きさのDNA断片に切断することがで
きるから、DNAの構造と機能の解析、塩基配列の決定
、遺伝子の単離などの試薬として有用なだけでなく、今
後きわめて重要な産業的意義を持つ遺伝子の人工的変換
のための試薬として不可欠のものである。
本発明者らはこのように実用性に富む重要な生化学試薬
としての制限酵素を、微生物を利用して製造する方法に
つ自研究を重ね、特に■非病原性であること、■培養が
容易で菌体を大量に取得できること、■制限酵素生産量
が多く精製が容易であること、などを指標として腸内細
菌を中心に制限酵素生産−の検索を行なってきた。その
結果、ビフィドバクテリウムに属する細菌がきわめて安
定で取扱いや保存が容易な種々の制限酵素を産生ずるこ
とを見いだし、その一部について、日本農英化学金昭和
55年度大会において発表したが、その後さらに研究を
進めた結果、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに属す
る菌株が、公知の制限酵素A c y lのアイソシゾ
マーすなわちAcylが4−するのと同一の塩基配列を
認識する制限酵素(以下仁の酵素をBbilという)を
産することを知った。
本発明は上記知見に基〈−のであって、ビフィドバクテ
リウム・ビフィダムに属する制御i1#嵩Bbil生産
劇を培養し、得られた上記−の菌体より制限酵素Bbi
lを採取することを特徴とする制限酵素Bbilの製造
法を提供するものである。
本発明の方法により製造することができる制限酵素Bb
ilは次のような理化学的性質を持つ酵素である。
(1)  作用及び基質特異性 種々のDNAKこの酵素を作用させたときの切断部位の
Wkは嬉1表のとおりである。
嬉  1fi また塩基配列 (但しRtjA又tJGで、YIfiB、@AのときT
1凡がqのと@Cである。) をlimして2本鎖DNAを特定の部位で切断する。(
これらにより、Bbil/fi公知の制限酵素A c 
y lのアイソシゾマーであると認められる。)(2)
至適9H:1.4付近(安定な範11:s、s〜8.2
) (3)至適温度:35〜38℃ (4)阻害、活性化及び安定化 1〜15mMのMg計で活性化されるが、ATP+8−
アデノシルメチオニンのような補助因子を必要としな≠
本発明の製法を実施するに当り、制限酵素Bbil生産
菌の培養法には特に制限はな−。基本的にはビフィドバ
クテリウム菌につき周知の培養法に従−1用いるmが増
殖可能な培地及び条件下に、通常線菌の増殖が定常期に
達する迄、培養を行えはよい。
培養終了後社常法により培養物を遠心分離して集菌する
。得られた菌体かも制限酵素を採取する方法も任意であ
るが、代表的な方法を示せば次のとお抄である。
菌体社まずリゾチーム処理した後、超音波破砕する。次
いで遠心分離して沈殿物を除き、無細胞抽出液を得る。
この無細胞抽出液をストレプトマイシン硫酸塩で処理し
、更に硫酸アンモニウムで分画シた後、パイロゲル、セ
ファデックスなどを用ψるゲル濾過法、ホスホセルロー
ス、ハイドロキシアパタイト、DgAE −セルロース
などを用いるイオン交換クロマト法、ヘパリン−セファ
レースなどを用いるアフィニティークロマト法、又はこ
れらの組合せにより精製して、目的物である制tm酵素
を得る。これらの精一工程も、従来の酵素精−の常法に
従って行えばよい。
本発明の方法に使用することができる制限酵素Bbil
生ramの例としては、ビフィドバクテリウム・ビフィ
ダムYIT−4ooi  (徽工研謔寄美緋第aa72
t)、同YIT−4007(微工研菌寄寵第5871号
)などがある。これらの菌の菌学的性質は次のとおりで
ある。
■ 分類学的性状 ダラム陽性無芽胞桿繭で、細胞内部にメチレンブルーに
親和性を有する顆粒が存在するOmamで観察すると、
細胞の先端が分肢して、Y字状、湾曲状の多形性を示す
。重層法で形成させたコロニーは、円筒状、凸状、レン
ズ状を示す。
カタラーゼ活性0、脚酸ガス産生(ハ)、ミルク凝固性
(ト)、ゼラチン液化性(へ)、硝酸塩還元性(へ)、
インドール産生(へ)、硫化水素産生0である。
糖発酵性は、グルコース、7ラクトース、ラクトース、
ガラクトースの冬着が陽性、アラビノース、キシロース
、サリシン、マンノース、マンニトール、メレジトース
、セロビオース、ソルビトール、イヌリン、トレへロー
ス、マルトース、リボース、ソルボースの冬着が陰性で
ある。
以上の性状から、本菌株はBargey’sManua
l(1974年)の分類基準を参照してビフソドバクテ
リウム・ビフィダムであると同定したが、後に詳述する
ような、公知のビフィズス菌にはない特性も備えている
ところから、ビフィダムの変異株であると判断した。
■ 増殖しうる温度及びpH (至適条件:36〜38℃、pHa〜7)(上記■及び
■の特性はYIT−4005及びYIT−4007ic
共通の1のである。) ■ 胆汁醗耐性 デオキシコールaeaoo−g/―を含有する培地でY
IT−4oos/fi増殖セス、YIT−4007は増
殖する。
上述のように本発明の製造法にょ)得られる制限酵素は
公知酵素Acyiのアイソシゾマーであるが、Acyl
の原料はラン藻の一種であるアナベナ・シリンカドリカ
であって、このランSが培養しに〈〈多鰍の藻体を得る
の社容易でな―(*01の培地力・らlGGgの藻体を
得るのに約3遍間を要する)から、Acylの商業生産
は極めて困難で1、、: あるのに対し、本発明の製、法、は、飲食品ある−は医
薬品の分野で大規模培養の技術が確立されて−て容易に
大量の菌体を入手することができる(10tの培地から
1昼夜で40〜50gの菌体を得ることができる)ビフ
ィドバクテリウム酸を使用するものであり、一体からの
酵素の抽出・精製も容易であって精製された酵素の安定
性も良好であるなど、きわめて有利な方法である。
以下実施例を示して本発明を説明する。
実施例 l ビフィドバクテリウムOビフィダムYIT−4007(
微工研菌寄第5871号)を炭酸ガス噴射法で嫌気性と
した下記の組成のVLG培地に!種し、37℃で約15
時間嫌気培養して前培養液を得たO ビーフェキストラクト      2gトリプテイケー
ス       10  gイーストエキス     
   5g K、HPO,水溶液(濃度s o g/z)   7.
5 at塩溶液※           7.5−〇、
1%レサズリン溶液     1 dイオン交換水  
     914  mo、07襲ヘミン溶液    
 10  ad3襲システィン塩酸塩溶液    10
 1lja % Na、CO)水溶液     so 
 m◆ 塩溶液組成 KH,PO430g (NH,)、80.      s o  gNaCl
        60 1 Mg80.・?H,03g CaCl、−2H,03g イオン交換水     1t これを同組成のVLG培地に、その1 / 250置接
種し、37℃で約15時間嫌気培養して定常期初期の培
養液を得た。この培養液から冷却遠心機を用いて集菌し
て得られた菌体約60gを4倍量の0.4M  NaC
1及びo、lrnM7x=h)tチルスルホニルフルオ
ライドを含む緩衝液A(iomMリン酸カリ緩衝液、I
)H7−0、ymM  β−メルカプト:L*/−k、
1mM  BDTA) K懸濁し、中で30分間処理し
て細胞壁を部分分解した後、超音波処理して菌体を破砕
し、超遠心分離して無細胞抽出液を得た。この後、下記
の処理をすべて0〜5℃で行なった。まず無細胞抽出液
に10%ストレプシマイシン硫酸塩を最終濃度が1.2
−になるように攪拌しなから徐々に加え、更に30分間
攪拌した俵、遠心分離して沈殿を除いた。この上清に硫
酸アンモニウムを70%飽和になるように徐々に加え、
1時間攪拌後、遠心分離して沈殿を集め、これを少量の
緩衝液B(lomMリン酸カリ緩衝液、pH7,4,7
mM  !−メルカプト:X−1/−k、1mM  k
DTA)に溶解し、同シ緩衝液に対して一夜透析した。
透析試料を、あらかじめ緩衝液Bで平衡化した本スホセ
ル四−スカラA(1)11.ワットマン、1.5X3G
傷)に添加し、洗浄後、O−0,8M  NJICIの
直線的濃度勾配を持つ緩衝液Bで分画す本と、制限酵素
Bbijは0613〜0.1gM  々acI濃度画分
に回収された0 上記Bbi厘含有画分を集め、これeo、2M  Na
C1を含む緩徴液人に対して一夜透析し、あらかじめ同
じ緩衝液で平衡化したへイド騨キシアパタイトカラム(
1,oxtom)に吸着さ姥、洗浄後0.01〜o、 
s M !Jン鹸カリの@itt+的濃度勾配を持ち且
つ0.2M  N4C1を含む緩衝液入で溶出させると
、Bbil活性が0.28〜0.31M  9ン酸力リ
m度の一分に回収された。
以上のようにして得られた制限酵素Bbil標品には他
の制限酵素活性社検出されなかった。
代坦人  弁理士  板  井  −場、11゛□

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 2本鎖デオキシリプ核酸中の塩基配丼 (但しRはA又はGであ抄、YtiRが人のときT、R
    がqのときCである。)を認識する制限酵素を生産する
    能力を有するビフィドバクテリウム・ビフィダムを培養
    り、Iられた菌体よ抄上記制限酵素を採取することを特
    徴とする制限酵素の製造法。
JP56161071A 1981-10-12 1981-10-12 制限酵素の製造法 Granted JPS5863387A (ja)

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JPS6243675B2 JPS6243675B2 (ja) 1987-09-16

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