JPS59130184A - 架橋剤を用いた固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 架橋剤を用いた固定化酵素は、固定化酵素の最も広く知
られた形態の一つである。この様な固定化酵素を製造す
る為、多くの方法が開発されてきている。この様な方法
の一つにおいてまず担体を架橋剤でまず活性化し、次い
で酵素で処理し、これによ〉酵素は担体に緊密に付着す
る。この様な活性化方法には、米国特許４，２９２，１
９９、又はバイオテクノロジーアンドバイオエンジニア
リング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　％２２巻、２７１〜２８７
頁（１９８０）に記載されている様に、担体をポリアミ
ンで含浸し引き続き過状のグルタルアルデヒドで処理す
る方法が含寸れる。この種の他の活性化には、米国特許
３．７０５，０８４に開示されている様に、担体を吸着
促進不溶性ポリマーでコーティングし、引き続きポリマ
ー上に酵素を吸着させ、更にその場で架橋によシ固定化
させる方法を含む。この種の別の活性化は米国特許４，
０６９，１０６に開示されている：ケラチンー含有担体
をケラチンで還元し次いでＳ−８基を介して酵素を架橋
嘔せることにより活性化させる。この種の別の活性化は
米国特許３．８０２，９０９に開示されているニガラス
をタンパクの存在下で破壊し、タンパクに結合すべき新
たに調製された活性部位を得る。この種の別の活性化は
米国特許３，５１９，５３８に開示されているニガラス
を一連の化学薬剤で処理し所望の活性部位を得る。固定
化酵素の他の製造方法がバイオケミカルアンドバイオフ
ィジカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａ
ｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）ｓ　３６巻、
２３５〜２４２頁（１９６９年）に開示されている：酵
素をあらかじめ活性化することなくコロイドシリ　　〜
力表面に吸着させ次いで更にグルタルアルデヒドを用い
て架橋することによシ固定化する。

上記のすべての方法は、担体上で活性部位に直接付着し
た酵素分子の薄い層によって特徴づけらねで分り従って
固定化される酵素の忙は活性部位の数によって決定され
る。

研究方法のちがいはすべて担体表面に利殖される層をよ
シ厚くすることであシ、これによシ酵素分子の小部分の
みが担体に直接接触する。この様な方法において固定化
さ力、る酵素の量を決定するのは担体の表面積ではなく
、そしてこの方法は最終の使用中においてプロセスのパ
ラメーターに依存しつつ、結合される酵素の量を最適化
することが可能である。しかしながら、この方法は実行
することがよシ困難である。なぜならは相当に多量の酵
素が固定化中にそれを適切に保持することを困難にして
いるからである。従ってその明らかな利点にも係わらず
この方法による文献は比較的に少ない。カナダ特許１，
０１１，６７１及び同１．０１１，６７２に開示された
、一つの提案は架橋媒体として水溶性有機溶剤の水溶液
を使用することであシ、この有機溶剤の濃度は酵素を不
溶性に保つのに十分に高く保持され、しかも架橋反応を
ひどく妨害しないのに十分な低さである。この方法に関
しての主な欠点は精巧な安全対策を必要とする爆発の危
険性をともなう、相当に多量の有機溶剤を必要とするこ
とである。更にこの方法によって得られる生成物が物理
的安定性及び回収活性度の見地から全く満足出来ない。

おそらくこれは固定化中に溶液から酵素を保持するのに
必要な有機溶剤の濃度が比較的高い為であろう。この問
題に関係する他の方法が米国特許４，１１６，７７１に
提案されている：限られた水の容積中酵素を、担体に速
やかに添加ず石前にグルタルアルデヒド及び不活性タン
パクで処理し、次込でグル化し、次いで粒状化し更に最
終的に乾燥する。この方法の主な欠点は、架橋剤の濃度
が高いことであシ、これは水の量が限られたことによる
。多くの酵素は、架橋剤の高濃度に非常に鋭敏である。

なぜなら該酵素は、後の使用中広範囲の架橋のため失活
するか、又は近づき難いものとなるかのいずれ、あるい
は又その双方の理由による。このことは多量の酵素を担
体に適用する場合の主な困難さを説明している二十分に
低濃度の架橋剤を得る為、比較的多量の媒体を必要とし
、これは架橋が有効々ものとなる前に、酵素が媒体中に
溶解することを妨げる事を不可能にし、一方酵素を溶解
した状態に保ち得る架橋剤の高濃度は先に説明した様に
望ましくない。

上記問題に対する全く異った研究方法は、水性媒体をす
っかシ排除する事であり、更にそのがわシ気体相を用い
る事である：これはジャーナルオブソサイエティオブケ
ミカルインダストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓ
ｔｒｙ）、１８巻、１６〜２０ページ（１８９９年）に
おいて不溶性ゼラチン繊維の製造に対し記載されておシ
、更に＃素の固定化に対し日本特許Ｊ５７００２６８３
において開示されている。しかしながら、この方法は非
常に精巧な通風システムを要求し、更に通風システムの
内側に不溶付付着物が形成するのを妨止する特別な手段
を必要とする。

かくして、本発明の目的は架橋剤を用いることによる固
定化酵素製剤の製造方法を提供することにあり、該方法
は実施するのに簡易であるべきであシ、たとえば精巧な
安全設備を必要とすることがなく、更にこの方法によシ
固定化酵素の高い酵素活性の回復性並びに良好な物理的
安定性をともなって製造され得る。

今や、本発明によれば以下の事実が見い出された：すな
わち、ある種の塩を特定した最少濃度で使用することに
よシ上記目的を達成することが可能である。仮に先に引
用した従来技術が担体のみを用いた固定化酵素製剤に関
連するとしても、本発明はその様な固定化酵素製剤に限
定されるものではなく、同様の担体を用いない固定化酵
素製剤をも包含するものである。

かくして本発明は架橋剤を用いる固定化酵素製剤の製造
方法において、以下の成分： ａ）固体又は溶解した状態の酵素製剤、ｂ）架橋剤、お
よび Ｃ）架橋反応が生起する間に、酵素の実質的部分が溶液
の塩に溶解するのを防げるか又該塩と混合するのを防げ
るのに十分な濃度で、架橋剤と反応し々いか又は酵素を
不活化しない水溶性塩、を水性媒体中に一緒に導入し、
しかる後固定化酵素を回収する、前記方法を提供するも
のである。

得られた最終の固定化酵素が過剰の架橋剤を含有する場
合、この架橋剤は洗浄することにより除去出来る。

酵素製剤は固体又は溶解した状態で存在出来ることが理
解式れるべきであシ：史に酵素製剤は高純度であるか、
又は不活性添加剤（たとえば充填剤、強化剤、結合剤も
しくは粒状化剤）を含有することが出来る。更に成分が
共に導入される順序は任意である。但し、塩の添加の前
に酵素製剤及び架橋剤をいっしょに導入する場合におい
てもしも塩の添加がゆえなく遅れる場合酵素の収率は減
少するであろう。

先に示したカテゴリーの塩は（これによシｌｈ定のカテ
ゴリーの塩が、特定の酵素及び特定の架橋剤の各々の組
み合わせに設定される）、通常安価な塩を含む。一種又
はそれ以上の酵素製剤、一種又はそれ以上の架橋剤及び
一種又はそれ以上の塩が、本発明方法において使用出来
ることが理解されるべきである。

本発明に係る方法の好ましい態様において、酵素製剤は
担体を含んで成る。本発明方法は担体なしでも実施する
ことが出来る（たとえば例１５参照）けれども、通常は
担体を用いるのが好ましい：これは主に充填層の操作に
対し有用であるすぐれた流動特性を有する粒子を製造す
ることに対する、担体によってもたらされる可能性の故
である。酵素が固体状態又は溶解した状態であろうとな
かろうと、この場合酵素は担体に密接に関係している：
固体状態において酵素は担体上で被覆層であり、更に溶
解状態において酵素溶液は（多孔性の）担体を含浸させ
る。

本発明方法の好ましい態様において、酵素製剤は固体酵
素の層で被覆された担体である。これにより酵素の層の
厚さを変えることによシ広い範囲内で希望の酵素を担持
した酵素製剤を製造することができる。

本発明方法の好ましい態様において、酵素製剤は酵素溶
液を含有した多孔性の担体である。これによυ本発明に
係る固定化酵素の製造に対する非常に簡単な方法が提供
される。

本発明方法の奸才しい態様において架橋剤はグルタルア
ルデヒドである。グルタルアルデヒドは比較的安価であ
り保険当局による異議は々い。又、多く　ノ（ｌｅ［に
関しグルクルアルデヒドは非常に有効でありしかもおだ
やかな架橋剤である。

本発明の好ましい態様において水性媒体中のグルクルア
ルデヒド濃度はＯ，ＯＯ１〜ｓ　％　（ｗ／ｖ）、好ま
しくは０００５〜１係（ｗ／ｖ　）、である。

依存し、更に最大ト素活性回復に対応するグルタルアル
デヒド濃度は通常光に示された範囲内で見い出される。

グルタルアルデヒドの％（Ｗ／ｖ）は次式： に従って計算される。

本発明の好ましい態様によれば、塩は第２、第３又は第
４アンモニウムもしくは一種のアルカリ金属のスルフェ
ート、ホスフェート、シトレート、ビガーｓｐネート、
カーボネート、フルオライド、アセテート、タートレー
ト、ポリスルフェート、ポリスルフート、フェロシアニ
ド、フェノールスルホネート、ツルベート、エチルスル
フェート、クロリド、ニトレート及びサク、シネートか
らなる群から選ばれ、特に硫酸ナトリウム、燐酸ナトリ
ウム、燐酸カリウム及びクエン酸カリウムである。

一般にこれらの塩は安価であシかつ回収可能であり、実
に高い酵素活性回復性を有する固体化酵素製剤の製法に
対する可能性を有している。

本発明方法の好ましい態様によれば、塩の濃度は、０．
１　Ｍ〜飽和の範囲であシ、特に約０．５　Ｍ〜約３Ｍ
の範囲である。後の実施例から明らかな様に、非常に高
い酵素活性回復性をもたらす、先に示した範囲内のグル
タルアルデヒド濃度及び塩のモル濃度を選択することが
可能である。

本発明方法の好丑しい態様によれば、酵素はグルコース
イソメラーゼ、アミラーゼ、特にアミログルコシダーゼ
、プルラナーゼ、ラクトース、被りチナーゼ、ナリンギ
ナーゼ、ペニシリンアシラーゼ、イヌリナーゼ、リパー
ゼ及びプロテアーゼから成、る君トから選ばれる。

かくして、もし酵素が固体状態である場合、先に示した
塩を、酵素の沈殿の為に必要とされるよりもよシ低い濃
度で用いる場合においてさえその使用によシ、すべての
実際的目的に対し酵素は架橋剤（塩溶液）中に溶解され
ず、この間Ｃ４：素は架橋剤に十分オリ用できる様に保
持されるか又は、もしも酵素が溶解している場合、酵素
は塩の溶液と混合されない。この様にして、最適磯度の
架橋剤が使用でき、これにより極めて最少の損害をｒ！
１ト索に与えるだけでメジ、しかも十分に良好な物理的
安定性を付与する。かくして以下の事実が見い出された
・すなわち、架橋剤濃度を減少するためには、最適レベ
ルで酵素活性回復性を保持する為の塩の濃度を増加しな
ければならない事である。本発明によれば、酵素又は架
橋剤たとえば銀もしくは水銀塩（これらは酵素を失活し
得る）のいずれかと反応する塩、又はアンモニウム塩も
しくは第一級アミン塩もしくはスルフイツト塩（これら
は多種の架橋剤と反応する傾向にあυ）の使用は避ける
べきである。本発明の目的の為に使用出来る塩は、それ
らの有効性に関し非常に広範囲であシ、更にそれらの有
効性は酵素に応じて変化する傾向にある。しかしながら
塩の選択に関しいくつかの幅広いガイドラインを次のご
とく説明することが出来る：二種の塩が性質に関しもし
同一でない場合よυ可溶性の塩を選ぶことが推奨される
。従ってＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４はよシ高い溶解性の故に
、Ｋ２ＳＯ４よｐも通常好ましい。又以下の事実も見い
出された。

すなわち一般に多価アニオンの塩、たとえばスルフェー
ト、ホスフェート、カーボネート、シトレート等は一価
のアニオンたとえばクロリド及びニトレードよシ有効で
ある。しかるにカチオンに対しては通常その逆が好まし
いニー価のカチオン、たとえばＮａ、Ｋ　　又はテトラ
メチルアンモニウムは多価アニオンたとえばＭｇ　　又
はカルシウム＋１よシ有効である。従って好捷しい塩は
スルフェート、ホスフェート及びシトレートのアルカリ
金Ｅ１塩であシ、特に硫酸ナトリウム、燐酸ナトリウム
、燐酸カリウム、クエン酸カリウム及びテトラメチルア
ンモニウムスルフェートでアル。

堰の濃度は通常最少に保たれる。この最少値は一方では
当面の酵素に依存する：なぜならば酵素が異なればしば
しば異った４″ぶ度を要求するからであシ、更に又一方
では架橋剤濃度に依存する。架橋剤濃度が高りれば高い
程、より少ない塩が必要とされ、そして逆もまた同じで
ある。架橋剤濃度は又、多くの酵素が架橋剤に鋭敏であ
るので最少に保持される。しかし該濃度は有効な固定を
確保するために十分高くなりれば々ら々い。しかしなが
ら特に有効々塩を用いる場合、非常に高い總の濃度での
架橋反応に対する最適条件をイζ１（立する場合、特に
留意が必要である。かくして以下の事実が見い出された
：たとえば高濃度のＮ　ａ　２　Ｓ　０４又は燐酸カリ
ウムにおいては活性率は適当な濃度でのそれらに比較し
て相当に減少している。これはおそらく酵素分子を部分
的に利用できない様にしている非常に強固外架橋の為で
あろう。

もしも酵素が固体状態で存在するならば、架橋媒体中で
これらの塩を使用する別の利点は粒子を含有する酵素が
固定化反応中凝集することを妨げることにある。この様
な凝集はそれが使用中に有効性及び流動特性を低下せし
めることとなるので好ましくない。又この点において塩
は大いに異っている。

本発明方法は多くの工程で行なうことが出来、その順序
は限定されない。たとえば本発明の好ましい態様にお込
て、まず担体が酵素溶液で処理され、乾燥され次いで架
橋剤及び塩を含有する溶液で処理され、洗浄され更に所
望にょシ乾燥される。

同じプロセスの変法において、塩の全量の１部が酵素溶
液中に含有される。別の変法において、まず酵素が架橋
剤で処理され、その後ただちに塩で処理される。ある種
の目的に対し、たとえば固定化酵素が少なくかつ繊維状
であることが望丑れる場合、担体の量は非常に少ないか
、又は担体は全く避けられ、かつ酵素は架橋剤及び塩を
有する凝固浴中で処理される。従って酵素は塩浴中で凝
固する溶液中に溶解され、架橋剤は凝固前又は凝固後の
いずれかで、酵素溶液又は該浴に添加される。

又、塩は、水の量を制限することが望才れる場合溶液の
変わりに乾燥粉末として添加される。従って異った成分
を導入する順序、又はそｈらの状態つまシ溶液であるか
又は乾燥しているかは本発明方法に対し限定され々い。

架橋反応のｐ）（温度及び持続時間は酵素及びもし存在
するとして不活性担体に依存しつつ、活性度の回復性に
対し深遠な効果を有する。一般に約４〜約９の５１１１
＋四のＰＩｌが適当であるととが見い出された。多くの
場合に適当な温度範囲は約り５℃〜約３０℃であるが、
ある種の場合、たとえば架橋反応時間を短くすることが
望まれる場合、より高温度が有利に用いられ、更に非常
々感温性酵素の場合にはより低い温度が有利に用いられ
る。架橋反応時間は架橋剤のタイプ及び濃度、塩のタイ
プ及び濃度、酵素、ｐＨ及び温度に依存して２〜３分か
ら数日の範囲で変化し、従って各々のケースに応じて決
定されるべきである。しかるにグルタルアルデヒド及び
大部分の酵素に対しては、室温で約１０分〜数時間の範
囲が適当と思われる。

以下の文章において、別々のノボ（ＮｏｖＯ）の文献が
参照される。これらのすべての参照文のコピーはノ？イ
ン〆ヌトリーＡ／／５（Ｎｏｖｏ　Ａ１１ｅ　Ｊ２８８
０、バグヌパードデンマーク）から入手出来る。

本発明方法を次の実施例によって説明する。

実施例を含む明細書の以下の論所において、カラム操作
中の圧力降下（物理的強度）の値が示される。この値は
ノボの実験手順を記載する、ＡＦ１６６／２　　に従っ
て決定される。この圧力降下の決定に関するいくつかの
理論的考察が５ｔａｒｃｈ７’５ｔａｒｔｅ　３１（１
９７９）ＡＩ　、１３〜１６貞に記載されている。公知
の商品と比較する為、固定化グルコースイソメラーゼ製
剤ＳＷ′Ｆ、ＥＴＺＹＭＥ　Ｋ　対する圧力降下の最も
良い値は約１　Ｏｆｉ／ａｍ２であることが言及される
。次の実験から本発明方法によって興造される固定化酵
素製剤に関する圧力降下は２ｇ／ＣｎＬ２の低さであ）
、更にすべての値は１０１／ｌＪよりも相当に低く、こ
れにより本発明の利点が明らかに証明される。

例１ ２８％Ｖ、７’Ｗの程度に部分的に狛ｌ製したグルコー
スイソメラーゼ製剤でコートされかつ係続するデンマー
ク出願第４４３０／８２における実施例８に記載された
方法によって製造される乾燥担体粒子２０ｇの部分を、
ｐＨ７，Ｑに調節した。０．０６Ｍ燐酸ナトリウム、１
．４Ｍ硫酸ナトリウム及び棹々の量のグルタルアルデヒ
ドを含有する溶液５００解中に懸濁させ次いで尾部でお
だやかに拐゛、拌した。

１時間後粒子を除去し次いでｐＨ７，Ｑに調節した０、
０６Ｍ燐酸ナトリウム溶液に１時間（旨濁させた。

この洗浄を三回くし返し、次いで粒子をホスフェート溶
液中で１昼夜放置し、しかる後その活性度をＮｏＶＯ分
析基準ＡＦ　１８９／１に従って決定したＯ結果を第１
図に示すがこの第１図はグルタルアルデヒドの係を酵素
単位／ｇで表わした酵素活性回復性に対しプロットした
物であり、これはグルタルアルデヒドに対する酵素の感
度を示す。

例２（比較） 粒子を例１に記載したと同様に調製したが、塩は添加せ
ず、最少量のホスフェートを緩衝剤（０，０６Ｍ燐酸ナ
トリウム、ＰＨ６，５）として役立たセタ。グルタルア
ルデヒドの矢を酵素単位／、９で表わされるｌ）ヤ素活
性回復性に対しプロットした（第２図参照）。この図は
架橋剤が二つの相反する作用を有することを示している
ニ一方では該架橋剤は酵素を溶解させない様にして収率
を増加さぜ：他方では酵素を失活させることによ多収率
を減少さぜる。この場合、最適値はグルタルアルデヒド
１％付近に設定される。第１図及び第２図の比較から、
グルタルアルデヒド濃度の最適値は硫酸ナトリウム１．
４Ｍの約４０倍である様に思われ、更にこの場合収率は
塩を用いた場合の収率のわずか約６０俤であろう。

例３ 粒子を例１におけると同様に調製したが、この場合燐酸
カリウムを塩として用い、更に該均１の濃度は、グルタ
ルアルデヒド濃度を三段階にかつＰ＋１を６．５に保持
しつつ変化させた。燐酸カリウムの係を６６累単位／ｇ
で表わされる１３１・素清件回復性に対しプロットした
（第３図参照）。この図から塩の６た度が増加すると明
らか如有効な作用が表われ、特に低濃度のグルタルアル
デヒドでＶＪ：有効である。

例４ ９（１３における実験をくシ返したが、この場合硫酸ナ
トリウムを燐酸カリウムの変わシに用いた０Ｎａ２Ｓ０
４のモル濃度を闇素車位／ｇで表わちれる酵素活性回復
性に対しプロットした（第４図参照表。

この図から塩の有用な効果が明らかに現われる。

又第４図から明らかな様に、塩の作用に対し最適値が存
在し、この最適値以上では活性回復性は減少し、これに
よシこの最適値はグルクルアルデヒド濃度に依存する。

例５ 例３に説明した実験をくり返したが、塩の濃度だけを増
加させた。燐酸カリウムのモル濃度を、酵素毘位／ｇで
表わされる酵素活性回復性に対しプロットしたく第５図
参照）。第４図及び第５図の比較からＮ　ａ　２　Ｓ　
Ｏ４及び燐酸カリウムは同様の埜動を示すことがわかる
。

例６ 例１で説明した実験をくり返しだが、架橋剤に溶解シた
ホスフェート及びスルフェートの変わりに、ｐＨ７，０
のクエン酸力２．リウムを用いた。第６図において、グ
ルクルアルデヒド濃度を酵素単位／Ｉで表わされる活性
度に対しプロットしたが、結果は例１の結果にあきらか
に似ている。

例７ 継続しているオランダ出願４４３　ｏ／ｓ　２における
実施例４と同様に製造した乾燥担体粒子２０ＩをＬａｂ
型流動床で流動化させた。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）　ｓｐ、　ＮＲＲＬＢ−１１、２２９から得られる高
温ラクターゼｓ　ｏ、　ｔ　ＴＪ／１１を含有する１１
．１係ｗ／ｗのホモジュナイズした細胞スラッジ（デン
マーク特許出８５１９０／７９の例１で示されると同様
に発酵させた、デンマーク噴許出願５１９０／７９の例
４で示されるとおＱに製造したスラッジ）４５．８Ｆを
、３０〜４０℃で担体粒子上にスプレーし、次いでコー
トした粒子を乾燥せしめた。

ラクターゼ活性単位を、次の反応条件下で毎分１μｍｏ
ｔのラクトースを放出させる、ラクターゼの量として定
義される二基質濃度は１０俤ラク）　−ス、温度ｌ−１
６０℃、ｐＨは６．５及び反応時間は３０分である。酵
素活性回復性は７９．８ｑ６であった。

次いでコートされた球体１０．９を、０．０６ＭＮａ２
ＨＰＯ４，１，４Ｍ　Ｎａ２ＳＯ４及び０．１　％　ｗ
／ｖグルタルアルデヒドを含有する溶液２５０　ｍｌ、
中ｐＨ７，５で処理した。室温で１時間後粒子を除去し
次いでＰＨ７，５で０．０６　Ｍ　　Ｋ２ＨＰＯ４を用
いて完全に洗浄した。架橋工程に関し活性回復性は１７
２チであった。

以下余白 例８ 継続するデンマーク出願４４３０／８２における実施例
４と同様に製造した乾燥担体粒子２４．？を、市販製品
ＡＭＣ２０ＯＬ　（ノボパンフレットにＮ０ＶＯＡＭＧ
　、　Ｂ　０２０　ｇ　−ＧＢと記載）を限外濾過法に
よシ製造されるＡ１ナイガー（Ｎｉｇｅｒ）から得られ
る３　９．６　’＄　ｗ／ｗの部分精製アミログルコシ
ダーゼ２０．２９溶液中で浸漬し、３９．６係ｗ／ｗの
乾物濃度（活性２６１０　ＩＡＧ／ｇ、活性単位はノボ
分析基準ＡＦ　１５９／２で定義される）に低分子成分
を除去する。真空条件を１時間付与した。この様にして
得られた放生物は７７．９係の酵素活性回復性を有する
乾物部分精製アミログルコシダーゼ２５重量係を含有し
た。

次いで乾物７１．８％を有する粒子２０ｇを、ＣＦ　０
６　Ｍ　Ｉ’ＪａＨＰＯ−１４Ｍ　Ｎａ、ＳＯ２及び０
゜２チグ４ ルタルアルデヒドの溶液１６００　ｍ６中ｐｆ−１４５
で処理した。１時間後粒子を濾過して除去し、００６Ｍ
Ｎ　ａＨ２ＰＯ４を用い、ＰＨ４，５で洗浄した。

架橋工程に関し酵素活性回復性は５５．１であった。

例９ 継続するデンマーク出願４４３０／８２尾おける実施例
４に示したと同様に製造されかつ乾燥物質濃度９８８係
を有する担体粒子４８ｇ並びに５係のグルコース及び８
％の硫酸ナトリウムを添加した（乾燥物質４１．．８％
）、真空蒸留で部分精製したバチルスコアギユランスグ
ルコースイソメラーゼコンセントレート２４ｇを混合し
、次いて液状物から、真空処理によシ粒子の孔内の空気
を放出せしめた。混合後の重量は６３．２２ｇであった
。

乾燥物質は７９．２％であった。

この製剤の１８ｇ部分（１４，９までの乾燥物質）を、
す、べての場合において、ｐｉ−１７，５にＭｌ！！１
節した、１．５Ｍの硫酸す）　ＩＪウム、５係のグルコ
ース及び０．０６Ｍの燐酸ナトリウムを含有する溶液３
７５ｍ１及び更に０１又は０．２又は０．３％のグルタ
ルアルデヒドを用いて室扉で１時間処理した。

この処理の後、該部分をｐＨ７，５の１係の燐酸ナトリ
ウム約１５１１＋、／ｌ！を用いて五目洗浄した。

酵素活性を、粒子から液体を除去した後ＡＦ１８９／１
に従って決定した。更に乾燥物質と液体を除去した粒子
について決定した。

ｐｈ素コンーヒン・トレード　　　　　４１．８　　１
４１５　３３８５　　−　　　　　　　　−酵素コンセ
ントレート　　　　７９．２　　　４６３　　５８５　
　８６　　　　　−＋担体 ０．１チＧＡで固定化　　３２．５　　１５８　４８６
　７２　　８３０２％ＧＡで固定化　　３８．９　　１
４１　３６２　５３　　６２０．３係ＧＡで固定化　　
　−１１７３３３４９５７乾燥物質５Ｉに等価の部分を
圧力降下に対し試験した。

０１％　　　　　　　３５ ０．２％　　　　　　　１３ ０．３％　　　　　　　　２　　　　３例１０ この例は、担体としてノリット（Ｎｏｒｉｔ）　　から
入手される活性化炭素をもとにした固定化酵素製品を製
造する方法を説明する。ノリットロックス（Ｎｏｒｉｔ
　Ｒｏｘ）　０．８の活性化炭素、タイプＡ−３３９７
の２０ｇを、バチルスコアギユランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）から得られる３９．２％ｗ／
ｗの部分精製グルコースイソメラーゼ（活性度３９５０
　Ｕ／乾物（，９＋、活性単位はノボ「分析基準」ＡＦ
　１８９／１で定義される）の溶液３３．９中で浸漬し
た。

４℃で２０時間真空条件を伺与した：ただし真空はこの
時間中４度開放した。この様にして得られた製品は９７
係の酵素活性回復率を有する部分精製グルコースイソメ
ラーゼ乾物３５Ｎ量係を含有した。

次いで９８チの先に示しだ凝集産物を４Ｎ　ＮａＯＨを
用いてｐＨ７，５に調節した０、０６ＭのＫＨ２ＰＯ４
，１，４ＭのＮａ２ＳＯ４及び０．１８％のグルタルア
ルデヒドの溶液８９０　ｍ、ｌ中で固定化した。室温で
２時間おだやかに攪拌した後、粒子を濾過して除き次い
でｐＨ３，０の０．０６　Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４で完全に洗
浄した。

架橋工程に関し活性の回復性は３１チであった。

例１１ この例は直径約２關を有するシリカ球体から成る担体を
用いた固定化酵素製剤の製造方法を説明する。

Ａ、シリカ球体２０Ｆを実験室用タイプの流動床内で流
動化させ、次いでバシラスコアギーランス源の１５　％
　ｗ／ｗ部分精製グルコースイソメラーゼ（活性度３３
０６　Ｕ／乾物＜ｇ）、活性度はノボ分析基準Ａｔ；”
１８９／１で定義される）の４０ｇ溶液を２５〜３０℃
で球体上に散布し、次いでコートした球体を乾燥させる
。得られた生成物は活性度の７８％回復率を有する部分
精製グルコースイソメラーゼ２３重量％を含有した。

次いでコートした球体の９５チを、４Ｎ　ＮａＯＨでＰ
Ｉ−］　７．５に調節した、０．０６Ｍのに２ＨＰＯ４
゜１．４ＭのＮａ２ＳＯ４及び０．１　％　ｗ／ｖグル
タルアルデヒドを含有する溶液５００ｍ１中で処理し：
室温で１時間後粒子を除去し次いでｐＨ８，０の０．０
６ＭのＫＨ２ＰＯ４で完全に洗浄した。しかる後活性度
を測定した。

架橋工程に関する活性回復率は５５係であった。

Ｂ、シリカ球体２０１／を、０５６ＭのＮａ２ＳＯ４を
添加したバシラスファギュランス源の４０ｑ６ＶＷ部分
精製グルコースイソメラーゼ（活性度３２７０Ｕ／乾物
（ｇ））の溶液１５Ｉに浸漬しブ辷。

２０分間真空状態を付与した。ただし真空は該期間中４
度開放した。この様にして得られた生成物は９０係の酵
素活性回復率を有する部分精製グルコースイソメラーゼ
２０　ｇ　量％を含有した。次いでコートされた球体の
９５φをこの例のパー）Ａで説明したごとく処理した。

架橋工程に関する活性回復率は４５係であった。

酵素が特に架橋するのに困難である様ないくつかの場合
において、もしも酵素が純粋々状態で固定化しなければ
ならない場合、地は有利であるのみならず不可欠でもあ
る。よい例はアミログルコシダーゼであり、これはノ＆
　（ＮＯＶＯ）社によって製造されかつたとえば商標名
人Ｍ０２００Ｌのもとで市販されておシ（小冊子ノボ酵
素ＡＭＧ　、　ＢＢ　０２０ｇ−ＧＢ２５００７月１９
８２年参照）、これは純粋な状態にある場合実際固定化
することは不可能である：このアミログルコシダーゼを
５０　％　ｗ／ｗのグルタルアルデヒドのごとき高濃度
においてサエモ不溶化することは困難であることがわか
った。しかしながら本発明で使用する塩（相当高い濃度
ではあるが）を用いることにより、次の例１２〜１７に
よって実証されている様に、０．０５４　ｗ／ｖのグル
タルアルデヒドのごとき低濃度においてさえ酵素を有効
に不溶化することが可能である。すぐれた濾過性並びに
容易に浮揚しうる、得られた製剤はたとえば低カロリー
ビールの製造において有利に用いられる。

例１２ 乾燥物シ濃度３０　％　ｗ／ｖに希釈した市販のＮ０Ｖ
ＯＡＭＧ　２０ＯＬを、ハイフロセライト（）Ｊｙｆｌ
。

Ｃｅ１ｉｔｅ）（珪藻土）と混合し次いで乾燥し、これ
によりＡＭＧＪｕ剤から帰因する乾物２１　％　ｗ／ｗ
を含有する製剤を得た。次いで製剤の１ｇ部分をＰ■１
６５の燐酸カリウム０．０６Ｍ、２．４ＭのＮａ２ＳＯ
４及び種々の濃度のグルタルアルデヒドを含有する溶液
に３２℃で添加し、次いで全混合物を２０時間該温度で
放置した。次いで粒子を濾過し更に脱イオン水で３回洗
浄し、更に活性収率を測定した。

結果は、０．０５％で最適を示すグルタルアルデヒドの
２個の相対する作用を示す類似のパターンを示す（第７
図参照）。

例１３ 例１２におけると同様の手順をくり返したが、この例で
は異った濃度のＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏｔ、を用いた。この
酵素に関する活性回復性は石、在する塩の量に非常に鋭
敏である（第８図１参照）。

例１４ 例１２の手順をくシ返したがこの例においてはＩ４不素
の半分のみを含有するＡＭＧ製剤を用いた。その結果最
適グルタルアルデヒドナシ度が低濃度にシフトしている
ことが明らかに観察された（第９図参照）。

例１５ ＮＯＶＯＡＭＧ２００Ｌをスプレー乾燥し次いで得られ
た粉末を出発原料として用い、更にいく分手順を変えた
：　ＡＭＧ粉末０．５．？を、２．５ＭのＮａ２ｓ０４
、ｐＨ６，５を有する０、　１　Ｍの燐酸カリウム並び
に１係Ｗ／ｖのグルタルアルデヒドを含有する溶液１０
０ｍ１に３２℃で添加し、次いで時々振とうさせながら
該温度で１時間放置した。この様にして形成した不溶性
粒子を濾過し次いでグルタルアルデヒドナシで、再び該
媒地中でインキュベートシ、更ニ２０時間同温度でイン
キュベートした。次いで濾過し脱イオン水で五目洗浄し
た。これらの易濾過性微小球は１０〜１００μｍの直径
を有し、更に最初の活性を１９ｑ６保持していた。

例１６ 例１５の手順と同様の手順を行なった。ただしグルタル
アルデヒドは酵素粉末を塩の溶液に添加した後、該塩溶
液に添加した。最初の活性の３４チを有する同様の生成
物を得た。

例１７ 例１５の手順を再びくシ返したが、ただ０．４係Ｗ／ｖ
グルタルアルデヒドを用い更に全体のインキュベーシヨ
ンを３時間に短縮した。虻初の活性の３７チを有する生
成物を得た。

例１８ この例はグルタルアルデヒド以外の他の架橋剤、すなわ
ち多価カチオンを用いた本発明方法の適応性を示す。こ
の例においてＳｎ　　　を架橋剤として用いた。すなわ
ち架橋前の状態において、例１２からのセライト−ＡＭ
Ｇ　（Ｃｅ　］　ｉ　ｔｅ−ＡＭＧ）製剤０．１を、２
ＭのＮａ２８０４．０．４　Ｍのｌ［、酸カリウム（Ｐ
Ｈ４，３５）及び０．００８６ＭのＳ　ｎｅ　ｔ４．５
倍の１１２０を含有する溶液１ｏｏｍｅに攪拌し々から
ゆっくり添加し、更に該混合物をときおシ振とうさせな
がら室温で５時間放置した。イ６゛製した粒子を濾過し
次いでＰＩ］４３５の０．２　Ｍ酢酸カリウム１００ｍ
１中に懸濁させ次いで懸濁液を５分間持拌した。この手
順をミロくシ返した。最終生成物は４３チの酵素活性回
復率を有していた。

例１９ この例において生成物は例１８に記載した方法に従って
製造したがただアセテート及び錫塩の濃度はそれぞれ２
倍の０．８Ｍ及び０．（１１７Ｍであった。同様の製品
を得、酵素活性回復率は６５チであった。

例２０ この例においても例１８と同様の手順をくシ返したがた
だアセテート濃度は半分すなわち０．２Ｍに減少せしめ
た。再び同様の生成物を、４８チの酵素活性回復率を持
って得た。

例２１ この例においては他の架橋剤すなわちペンゾキオンの使
用を説明している。すなわち例１２におけるごとき乾燥
セライト−ＡＭＣ製剤０．５ｇを、２、１　Ｍ　（７）
　Ｎａ　Ｓｏ　　及び０．０５Ｍ０酢酸ナトリウム４ を含有する溶液７５ｍ１に添加し、次いで純粋エタノー
ルに溶解した２　０　％　ｗ／ｖのベンゾキノン溶液５
ｍＡ’に添加し、次いで全混合物を室温で８０分間枚装
し、ときおシ攪拌した。精製した粒子を濾過し、ｐＨ４
．４の０．１Ｍ酢酸カリウム緩衝液７５ｍｌ中に懸濁さ
せ、５分間攪拌し次いで再び濾過した。

この手順を三回くり返し、活性度を測定した。酵素活性
回復率は１４％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図それぞれグルタルアルデヒド及び酵素
単位／ｇの関係を示すグラフであシ、第３図は燐酸カリ
ウム及び酵素単位／ｇの関係を示すグラフであり、 第４図は硫酸ナトリウムと酵素単位／ｇの関係を示すグ
ラフであシ、 第５図は燐酸カリウムと酵素単位／Ｉの関係を示すグラ
フであり、 第６図はグルタルアルデヒドと酵素単位／ｇの関係を示
すグラフであり、 第７図はグルクルアルデヒドと側斜率（ＯＡの関係−を
示すグラフであり、 第８図は硫酸ナトリウムの回復率（係）の関係を示すグ
ラフであシ、 第９図はグルタルアルデヒドと回復率（＠の関係を示す
グラフである。 １ｐ４−許出願人 ノボ　インダストリ　アクティーゼノｉカブ特許出願代
理人 弁理士　青　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士　内　１）幸　男 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也 図面の序口（内容に変更なし） 第１図 酵素単位／９ 第２回 グルクルアルデヒド（０／、） 第３図 第４図　　　゛７′酸：６１Ｊ　１１７″（Ｍ）酵素単
位／９ 第９図 回復率（’／、　） 木 グルタルアルテヒト（’／、　） 手続補正書　（方式） 昭和５９年２　月／り日 特許庁長官　若杉　和夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年　特許願　　第１８６０８２号２、発明の名
称 架橋剤を用いた固定化酵素の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　　ノボ　インタ”ストリ　アクテイーゼルスヵ
ブ４、代理人 （外　４　名） ６　補正の対象 図　　　面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、　添伺書類の目録 浄１図面　　　　　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、架橋剤を用いる固定化酵素製剤の製造方法において
   、以下の成分： ａ）同体又は溶解した状態の酵素製剤、ｂ）架橋剤、お
   よび ｃ）架橋反応が生起する間に、酵素の実質的部分が溶液
   の塩に溶解するのを防げるか又該塩と混合するのを防げ
   るのに十分な濃度で、架橋剤と反応しないか又は酵素を
   不活化しない水溶性塩、 を水性媒体中に一緒に導入し、しかる後固定化酵素を回
   収する、前記方法。 ２　前記酵素製剤が担体を含む、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３　前記酵素製剤が個体酵素の層でコートされた担体で
   ある、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４　前記酵素製剤が酵素溶液で含浸された多孔性担体で
   ある、特許請求の範囲第２項記載の方法。 方法。 ６　前記水性媒体中のグルタルアルデヒドの濃度が、０
   ００１及び５チ（ｗ／す、好ましくは０００５〜１％（
   ｗ／ｖ）の範囲にある、特許請求の範囲第５項記載の方
   法。 ７、前記塩が一種のアルカリ金属のスルフェート、ホス
   フェート、シトレート、ビカーボネート、カーボ＊　−
   ト、フルオライド、アセテート、タルトレート、ポリス
   ルフェート、ポリホスフェート、フェロシアニド、フェ
   ノールスルフォネ−）、ツルベート、エチルスルフェー
   ト、クロライド、ニトレート及びザクシネート、特に硫
   酸ナトリウム、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム及びクエ
   ン酸カリ８　前記塩の濃度が０．２Ｍ及び飽和濃度の範
   囲、特に約０．５　Ｍ〜約３Ｍの範囲にある、特許請求
   の範囲第１〜第６のいずれか１項に記載の方法。 ９、前記酵素がグルコースイソメラーゼ、アミラーゼ、
   特にアミログルコシダーゼ、プルラナーゼ、ラクターゼ
   、ペクチナーゼ、ナリンギナーゼ、ペニシリンアシラー
   ゼ、イヌリナーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼから成る
   群から選ばれる、特許請求の範囲第１〜第８項のいずれ
   かに１項に記載の方法。