JPS59183696A - 架橋フイブリン誘導体特異性モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、架橋フイプリングに導体から誘導されるモ
ノクローナル抗体、おｅｌ、びに記架４４誘棉イ４１の
アッセイに関するものであり、このアッセイはフィブリ
ン溶解におけるフィブリン分解産物一般Ｊ５よび前血栓
症状態および播種性脈管向凝固（［）ＩＣ）を含む血栓
症状態の診断テストとして用いられる。

フィブリノーゲンは、通常血柴中に溶解状態で循環する
巨大蛋白分子である。醇累トロンビンの作用を受けると
、フィブリノーゲン分子は連結し、自発的に整列して、
フィブリンと呼ばれ血ｆｉｌ＋の一１成分である長い糸
状ポリマーまた（ユ網状態になる。

プラスミンと呼ばれる（血液中でフィブリン網状態を破
壊し血搬の流動性を回復り−る作用を有づる）酵素で消
化されると、フィブリノーゲンは八−（三と称されるフ
ラグメントに分解されることがわかった。フラグメント
ＤおよびＥは回収部の大半を占め、Ｅに対して約２倍の
Ｄが存在した。

またフィブリノーゲンは、Ｅを中心成分としＤを末端成
分とする３節形状を有することがわかった。

フィブリンおよびフィブリノーゲンのプラスミン分解物
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＦ）を用
いて／−７いに区別りることができる。第Ｘｎ１ａ因子
とｎｇ’ばれるｎＹ　”ｒｌ　ｋ二よるフィブリンの架
（畠により、フラグメント１）タイン−かイト成し、こ
れはＤ−ダイマーとｉｌ’ｌ’　ＩＪれろ。第Ｘ　ＩＩ
Ｉ　ａ因子は、フ、イブリンのに〜接しノン−間にへ右
結合を導入し、フィンリンの１１“＋１造を”ｉｒ、　
＞ｉ。°にす′る酵素（′ある。フィブリン網状態−］
１１ｊの架４１？ｉの性質の１．■細な説明については
、ブシンス−１″：５．７ラツド５　／１１．Ｚ’！　
Ｓ’ｒ　（１９７９ｔｒ　１０月）を・引用（Ｊる。第
ＸｌＴｌζ１囚ｒ’　ｈａ、血柴中および血小板中の１
ｊ１１駆体からペーｌノドをＩ〜ロンピンのｊ）ｊ　’
５作用で、・１余くことにより）６性化される。１）−
タイマー（５ｊ１、分−１″−ｆ、約１８９０００ダル
１〜ンの分子であり、フィブリノーゲンのガンマ鎖残片
間の架橋てＪ（自ム１□合したｈ′くなるフィブリンか
ら由来り−る２種のノラクメンｌ−Ｄから基本的に成り
ｖｌつている。フィンリ／−クンそれ自イ水は、アルフ
ァ、ヘータおＪ、ひカンマ鎖の２゛つのコピーからなる
６ル１１の鎮から成りｖＬっでいる。

別の複合体（ＤＤ）Ｅは、架（１うひとフィシリンのプ
ラスミン分解で生成し、２個の７シクメン（〜Ｄおよび
フラグメントＥの組合わせで溝成されている。

さらに別の架橋誘導体は、「セミナース・イン・トロン
ボシス・］？ンド・ヘモスタシス」８巻１号＜１９８２
年）中の論文、グレフおよびフアルファ［ディチクジオ
ン・アンド・レレハンス・オブ・クロスリンクド・フィ
ブリン・デリハディノス・イン・ブラッドｊ記載の方法
で製造り−ることがでさ゛る。これらの中には、高分子
量架橋誘導体が含まれ、上記文献中Ｃ・は誘導体ＤＹ、
）／）／、ＸＤ、ＸＹ、ＤＸＤおＪ：ぴＹＸＤと命名さ
れている。

正常止血または血′ａ凝固では、液相まｌこは懸濁物中
の脈管的成分が保持されるが、同時（こ１へｌ０作り領
域における固相血液成分の局所的沈積をおこさせる。健
康状態では低度のフィブリンの脈管内沈積とフィブリン
溶解または細胞食作用にＪ、る沈積の除去との間にバラ
ンスが存在すると想像されてぎたが、今まで実験的に証
明されたことがなかった。

初期の臨床観察によると、あ◇抄の重症思考は出血と火
打■倶の徴候を示し、凝血ＩＲ４間が長く血小板減少症
をもつことｈくわｌ〕しつた７、ある場合には死後に微
小脈包゛内でフィシリン血栓ノン１認められた。

このようイア血栓の分散ｔｅｌからｉ−１ｆｆｉ秤性脈
↑９；内時Ｒ・（」＜ＤＩＣ）の飴！）＼」−よ４′１
だ、　＞ノくい（凝［ＩＷ　ｌ入にｆが）減少づること
が示された。口れらの’ＪＧ　’ｉ’１．から「）１ｊ
粍刊凝血ｐ常＃＋ｉ１のｔ＋１念かう：１．４１このｉ
、ｉ！　Ｌ；Ｌ　１１．’ｌとしくＬ）ＩＣと同義に用
いられる５゜ 現在認められＣいる１〕ＩＣのｊイ過には、血小板の消
耗をもＩ、：らり１疑固系の１１１１曹１１□、）へ１
−１ンビンの１１゜Ｊ戊、フィフリ゛ンの分′ｌＩ（お
にυ・り）ｉノ（フィシリン〈８解が含まれる。この過
程のｎ′仙／、Ｃ４ｉ物・ソ・的結末（、（。

ノイブリン沈＋１−と一ノイｆリンｉ’？ｉ：人どの間
のバランスを反映しＣいろ。ｖｌ宋としく勺じる１ｌｉ
ｌｉｌ床的介）ＩＪは、凝固因子の減少が☆配向ぐ（１
する場合に（Ｊ出血（ありさちなくぼ脈管Ｉ！ｌＩ］に
効宋に」、る＋、！ｒ、而竹相織面（４傷である。

ＤｒＣは、広範囲の損害狛に一シ」ツク、アシドシスお
にび酸素減少症の組合Ｕを伴う障害にＪ＞　Ｉ−Ｊる二
次的減少として報告されてきた。衆知の臨床向合（ｊｆ
症は敗血症、大外傷、悪性腫瘍および低醒索血症である
。これらの臨床状！ポにおいて凝固連鎖の賦活は凝固蛋
白と血小板の消費をもたらし、微小循環系におけるフィ
ブリン沈積を到来ざＵる。

ＤＩＣを開始させる詳細な因子は不明であるが、可能な
メカニズムか動物実験で多数示されでいる。

１［ｊ想的には、ＤｆＧの確実なｉ；シ在性）−（−ゾ
リン沈積の直接呈示が必要である。局所性および散在性
フィブリン生成を区別ザるための多数の直接ハイＡブシ
ー的証拠を１８ることが実際上困り・１（であるため、
診…ｉ上の目的におきかわるべき間接的試験が開発され
た。しかしこれらの試験は、脈鴛内フィブリン沈積症候
群に対して特Ａシ的’：４Ｋ　／ｌ＼っだ。

その特異性は、さらにフィブリノーゲンをフィブリンに
変換づることかできないが、血栓症に関係する他の凝固
因子を１〜ロンビンに変えることかできる他の酵素の作
用によって減らされる。間接的試験はすべて、ひとフィ
ブリノーゲンをフィブリンに変換し得る酵素がトロンビ
ンのみ（軸出を除く）だという原Ｌ！Ｉｆ　（こもどづ
い（いる５□可溶性フィブリン七ノン−１１ノソ合（本
の楯芹の存白−を　示　法　パ　ラ　１７　］′　Ｉ　
　ノ　１ノ　−　シ　１　ン　、８八　ｉ）鼻以　タト
　＃ご　１、ｊ２、　ｌｌ？１７を床的Ｄ　Ｉ　Ｃの譲
μｌｉに、両ｊ置Ｊ適月１（さ容易に実施でさる４：ｊ
　！＋’シ・１１の人さ゛プｊｉ〜にＩン（ニンＩＩＪ
、　、１，１．１・１７日、代え與は存在しない。これ
らのノスＩ−（、二（、！２、ＩＰＡを１ｌｆｔ　＋’
ｌ’４十１ＲＩ　Ａ法で測γりる１１）△（）ぞノリノ
ベプ１１−八）基１験、フィブリンしノン−１ノソはイ
、フイブリノーゲン・ゲルＪ−クスクル−シ：１ンクＬ
１７１〜クラフィＪ＞　Ｊ：ひＦＰＢ（’）ｒブリノベ
プチドｌ（＞　、１゜た１ま１〜１−１ンビン増加１）
１．　Ｆ−１）　ＩＩのＩＩＩ（！Ｖｌｉがｆ）まれる
１゜（・ロシビン作用の／、１−化♂イ・的−月、ｌＩ
、、　ｉ、ｖ的；ｉｔ熱に（ま、１ロ１〜ＬＪンビンタ
イｌｘ　（［）　ｌ　）　ｉ、八！！う）、１へ１−１
ン小／ラスチンタイム（△　ｌ）　Ｔ　Ｔ　＞基１験お
上０１へ１−１ン！ごンクロツディングタイｌ＼（１（
’：　ｌ−）試験が含、１、れる。実際上はしばしば１
史わｉｌぺ）りれとも、これらの試験では得られる１１
°Ｊ報（よ；１．・ｋ　、Ｉ１９吉巽的なものであり、
病因に関係なく凝面囚］ｔの欠乏劇の測定結果を表ねり
１ｃ（）Ｉとという点に２−Ｕ　ｊ：Ｆ、　Ｌ／　＜Ｅ
　Ｉプればならない。

凝・固因子アッセイもまた比較的非特異性であり、第Ｖ
因子、第×■因子およびフィブリノーゲンレベルの試験
を含んでいることが判明した。

フィブリン−フィブリノーゲン分解産物の試験は、フィ
ブリンに対Ｊるプラスミンの作用に対し゛Ｃ特異的であ
るとはこれまでのところ証明されＣおらづ“、フィブリ
ノーゲン分子に対してトロンビンがあらかじめ作用しな
くてもフィブリノーゲン溶解が起つ／ｊ場合にも陽性の
結果を勺える可能ｆ１がある。これらの試験はフラグメ
ントＩＩ）　Ｊ３よ０・トの試験を含んでいる。

、１〜ロンピン仲介面小板相互作用または放出１ｉＩＬ
験は、元来非特異的であることがわかった。これらには
、血小板計数、血小板生０′率おまひ面心（反放出試験
か会よれる。

凝血因子の同定に放射性ラベルノイブリ′ノーグンを用
いることも試みられたが、日間かかかり達成困難である
ことがわかった。

先？１技術を要約すると、診断試験の有効性は疾病の存
在または不存在を示Ｊ゛能力にかかつている。

４つの指（イｊ１りなわら感１α、ｑ、７．　ｌ、！；
：・：〕１１１り定１１＼さ正の予き１直およびＩ’４
０予菖ｊｌ”ｌべＩｔ！ＩＪ　７族しうる１姦ト（１１
試験の有効性を定パノ）ろためｔ＝　、　Ｉ、ｔ　／ｌ
＼的／、ｆう゛クーイン１１．１１１戸か存在づること
か広く知られ（いろ。第　の心髄事項は適当な診断用櫻
：　’４’−のＪ２：　ＩＩＩ　Ｃあるｎ　Ｊ！Ｉ’想
的に（ユ、この１５ｉ準は＋＋、；、Ｓ床的是（３＋よ
＆）　ト”ｌ：かに入さくＪ欠病の木石にス・ｊしでで
さるノこり１！１纜ｊ的（４Ｋ　（〕れは４ｉらない。

Ｌ）ＩＣに関りる固イｊの国φｆｌ　ｉ、ｌＥ　Ｃよ、
このト・５１トＪについ（の包４１も的１、乏、ｉｌ（
、、ｉ、イ’、＝（ＩＬイ）いこと−３ある。

（）；１０木像（よ村ｌめて非１Ｓ異的である。迭教の
常°用される芙験宅試験りよｌＪ診ｉ！７ｉ　Ｌの１１
１５“１ｊ１・Ｉ・λ欠如しくいる。白面ＴＪｉ　ｉｉ
［敞か低いこと（ｊ、１）ＩＣの可能・１（１を指示り
るが、感染１こつい（の−）ン（的’、’ｒ　ｌ／ｌ！
地の場合でもあり１苛る。ｆｊｌ仔な保留か多’にの凝
固アッセイに対してｊ内用される。プラスミン、Ｌムコ
（，１上うスターピのｆＶ用のためソイツリノー／フン
、１．・ｋ少症は一次的フイー７リン溶解と１〜ｍｌン
じン沖ｆトノｒノリノーゲンーフィブリ”７　弯１１／
！につ二５　（、’、”　ｉ人的フイツリン溶解の識別
基ＱＬとならｉｊ−、（ｔ　ｓ。他ｌ）、１〜ロンビン
作用の感ｊ宴の良い試験しｉｌＪ能（あるか、ぞの１１
７１７＋　ＩＡ的利用には明らかな欠点がある。その−
例はＦＰＡアッヒイであり、これはトロンビン作用に対
しては特異的ではあるが、きわめて鋭敏で局所的脈管向
凝固を検出して非Ｆ１Ｎ性静脈血栓にλ・ｊしてｍ性の
結果を与える。ＦＰＡレベル上昇の臨床的Ｒｍは、バラ
コアキュレーション試験が山付であっても、特に血小椴
計数、前凝血試験およびフィブリノーゲンレベルが正常
の場合には論争の種になる。

このような理由から感度特異性おＪ：び予言値は標準方
法では決定できない。障害の臨床的発現は複刹で予言不
可能である。従って、金員なわれている診断試験の適用
は種々の臨床的胆管内凝固症候群と関係づけて考えるの
が一番良い。

また、ＤＩＣの診断試験として、Ｄ−ダイマーのアッセ
イが提案されている。しかし、前述のようにこれはＰＡ
ＧＥの使用を必要とし、従ってこの技術は臨床的に常用
するには繁雑りき゛る。フィブリン誘導Ｄ−Ｄ−Ｅフラ
グメントに対して抗体は生じるが、常用される形態では
これらはフィブリノーゲンフラグメントＤ誘導体と交差
反応し、従って臨床的使用には４１゛お不適当である。

ＤＩＣとｔＥ１用詮断試験の実用的な要約は、「レミナ
ーズ・イン・１〜ｃ１ンボシス・ノノンド・ヘムスタシ
ス」８巻３号（１９Ｅう２イ１−）（１５Ｊ、びＤＩＣ
ニジ・）２ブリクーシ」ン・ｊ′ン１−・１．−　ｒイ
リノイ・Ａブ・ディアグノスナック）−スツ（Ａソウル
１１＼−ドおよびカーター）とｉ７ｎ　（する１、冑ン
に１１【１載され（いる。

上記プシンスキの文献に（３Ｌ、２千重の抗血清／ａ１
４１いたボリク［ｌ−ナルｌｉ’ｊ　Ｄ−タイ、ノー抗
１本の仙究が記載されＣいる。この試験ｅは、１］−ダ
イマー分子上の特異的マーカーに対シ、（抗ｊ）ｋがｒ
［られている。試験に際して、Ｄ２ト？し合体と［）−
ゲイン−の（１：　１　）　混合物に対しで、ｃＩＬＪ
、びｐｉ−１５、５で３Ｍ領域にさらしたＤ−タイ、ノ
ーに対しく、にわとりＪｊよ′びうささＣ１７′Ｌｌｌ
ｌＩ清が１１−７．　（うれた。この文献には、著省は
この試験結末がｉｉｉ　（ｆ　１！］脈管内凝固と１次
的フィブリン溶解の識別の」、うな臨床的１ｉ’＋＋面
で応用されることを望むが、その理由は循環フラグメン
）−Ｄ−ダイマーが前者の状態には存在し接当の状態に
は存在しない筈だからと記載されている。しかし、この
状態も他の関連づる臨床状態も架橋フィブリンフラグメ
ン１−に加えて高濃度の循環フィブリノーゲン誘導体を
有りるため、上記の′応用を行なうにはフラグメンｌ−
Ｄ−タイン−どフラグメントＤとの間に大きな反応性の
差が存在することを必要とする。ま″ｌこ、このアッセ
イは異常な高濃度のフィブリノーゲンの存在下でも実施
できることが示されてはいるが、このような臨床的局面
で信頼゛して用いるためにはざらに抗体の特異性を進め
ることが必要である。

上記グレッツおよびハワターの文献も、Ｄ−クイマーの
ような血液中の架橋フィブリン誘導体がＤＩＣのマーカ
ーになると考えられることを指摘している。しかし、こ
の文献には、信頼できるＤＩＣ診断試験が架橋フィブリ
ン誘導体に基づいて創出できることを示す記載は何もな
い。

この発明の目的は、・臨床的根拠によって使用できる架
橋フィブリン誘導体のアッセイ方法を提供するにある。

この発明は、架橋ノイブリン誘導体から誘導される七ツ
クローナル抗体のＭ法に、Ｉ−３いＣ１下記工程： （ｉ）架橋フィブリン読唇イホ、１、／＝はイれを含む
抽出物を１与る工程、Ｊ３よひ （ｉｉ）、１記誘導体または抽出物を役向しＩＣ動物か
ら得た抗体Ｈ−生１１胞をりＬＪ−ン化（ｊることに」
；す、上記誘導体または抽出物にス・１りる抗ｆホを牛
成さｌる工程 を含むことを特徴とＪる／ｊ’　２１．を提供（ｒるも
のである。。

′工程（（）において、適当４に抗体抽出物（ま、フィ
ブリン凝琥の７′プラスミンＭ’（、又（，１，１−［
」ンビン、ｉｘｍａ囚子Ｊ因子びプラスミンのノイノリ
ノーグンに対する同時作用により、−過刊凝易（形成と
それに続く凝塊溶解を伴つＣ得らｔｒる。後右の７″１
法の場合、フィブリノーゲンか１・１１ンビンと第×■
ａ因子の作用によりフィブリンに弯模され、次いでプラ
スミンにより分解される。勿論、フィシリン誘導体また
はそれを含む抽出物はひとまたは他他の適当な動物資源
から得ることかでき゛る。

上記の′粗黙抗原フラクションを得る方法はインビトロ
法である。適当なインビボ法が、血）６および他の架橋
フィブリン誘導体含有体液をひどを含む動物から得るた
め、ａ３よび実質的に純粋な架橋フィブリン誘導体を分
離できるＰＡＧＩＥ法に体液を付Ｊために用いられる。

別の方法として、架橋フィブリン誘導体は、重症血栓性
障害の患者血清から、ライルナ−等、バイオケミストリ
ー２１巻２６８７−２６９２與（１９８２年）記載のＪ
こうに、イオン交換クロマトグラフィーと組合わせたゲ
ル濾過を用いる技法により精製りることができ、上記文
献では、ひとフィブリノーゲン、精製フラグメントＤ、
ＥおよびＤ−ダイマーが得られている。

Ｄ−ダイマーのような純粋な架橋ノイブリン誘導体を用
いる場合、これはかなり容易に変性されるから、その製
造に際してはその分子の変性を１Ｇかないように注意し
なければならない・。

通常粗製物である抗原抽出物を製造するための上記方法
のさらに完全な記載については、前述したグレッツおＪ
、ひバッターの文献を引用する１、この発明で用いるに
適当イ１架橋ノｒフリン誘導体は、従来報告されたイ［
が、のしの（、（、いか、誘導体かＤ２ＥまたはＤ−タ
イマーでル）イ：）　’ｆ７）が好−ｅｂ＜、この発明
Ｃ用いる誘導ぐ全４４−が（）−タイン−ひあるのが最
も好適である。

［稈（１１）におい（、ＦＩＡ　導４ホまたはその抽出
物を投与りるに適当な動物は、ノウス、１、ｌ゛ζ（：
１ラットＣある。ぞのうち、マウスが９１′ま［７い。

また、最初粗製抽出物を１回または（れ以ｌ−投与し、
−ぞの１り純粋またはほぼ純粋な架（・へフィノ゛リン
話ン＃体を投与づるのか好ましい。こ・の方法が好まし
いため、誘導体に特異的なＬツクローノル抗（Ａを得る
ｌ’を盲−が単純化される。

誘導体または抽出物を後句した１ノウス／：投！フ後に
適宜Ｊと殺し、牌臓を摘出し、さらに処理して羽１；胞
懸濁液を作る。■１胞懸濁汲（，１１、さらにｆｌ′Ｉ
製（例えば遠心分離）して、マウスミエローマ細胞との
融合に用いるＰ臓白血球またはリンパ球をｆ）ｓ＋＋σ
ることかできる。

クローニング技術は、ガルフル等、ネイチュア２６６巻
５５０−２頁（１９７７年）記載の技術等に広範に基づ
くことができるが、そこでは細胞融合剤としてポリエチ
レングリコールを用いてハイブリドーマ細胞が作られ、
次いでこれが、適当な細胞供給層を用いる限界希釈に基
づいてクローン化または所望により適宜再クローン化さ
れる。

ハイブリドーマ細胞の培養にはつ］−ルプレートを用い
るのが好ましく、各ウェルには適当イＪ′■（胞培薔培
地と共に細胞懸濁液を置く。

スクリーニングアラレイ用に■胞試利を除いておくのが
好ましく、これは以下に記載りるように実施する。スク
リーニングアッセイにＷづいて、一定数の最もよく生育
したウェルを保存用に選ぶ。

スクリーニングアッセイ後、限界希釈により一定数の特
異性抗体産生クロノタイプを選択してモノクローナル抗
体分泌くヒルラインを得ることができる。

限界希釈クロノタイプを含むウェルプレートから採取し
７Ｃ試お１についＣさらＬ；−、、’、ｊ、、施したス
クリーニングアラレイに基づい−Ｃ１一定数の特異性抗
体産生クローンを大吊培谷用に増タメｊσゼるため選択
づ−る。

。」−記の方法で用いるにｊＱ当イ１スクリーニングア
ッセイは、上記工程： （Ａ）架橋フィブリン誘４ｉ体、１１．ピ；；介導体含
イｊ抽出物、フィブリノーゲン分解ｆｉ物から）バばれ
ｌご抗ｌｚミで状面を被覆りる１稈、 （［つ）上記抗原を前記のにうに製造し／ｊ架橋フィシ
リン誘尋体から誘導される一ＬツクＩＪ−Ｊ−ル抗体に
１瓜触させる工程、おＪ、ひ （Ｃ’）工程（Ｂ）ｃ’４成しノだ複台イホをシフナル
１１４フ幅丁程に付１１゛る工程 からなるものである。

好適には、］°稈（Ａ＞におい（ウェルプレートを用い
、その各つＩルには、１）−ダイン−のＪ、うな架橋フ
ィブリン誘導Ｉ／１１（１′３よび７・′よたはフィブ
リノーゲン分解産物（好ましくは、ノイブリノーゲンを
トロンビンでｉＶ４当に分解してノラグメン１〜１つ、
フラグメントＥおよび所望によりフラグメントＸおよび
Ｙ＠得る方法で製造したもの）を適用する。

次いで、架橋フィブリン誘導体から誘導したモノクロー
ナル抗体を各ウェルに加える。使用（゛する適当なシグ
ナル増幅工程はＥＩＡＩ程であり、そこでは適当な酵素
結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）が複合体に結合され、
次いで基質が加えられる。別の方法どして、ＲＩＡ、Ｆ
ＩΔ、凝集、枯看、または化学発光も適当なシグナル増
幅工程として用いることができる。

上記スクリーニングアッセイ方法の目的は、ｏＩ（躾１
１１胞が架橋フィブリン誘導体に持５′シ哲を右づる抗
体を産生じて１いることを確かめるにある。ノイブリノ
ーゲンまたはフィブリノーゲン分解虻物との間には何ら
反応がなく、誘導体との間には陽１１反応がある。

この発明はまた、架橋フィブリン誘導イホ検出用アッゼ
イ方法において、下記工程： （１）架橋フィブリン誘導体から製造したモノクローナ
ル抗体を、架橋フィブリン誘導体からＭ　８される抗原
を含むか、また（、１、栗４ｒノイプリン白ｔｌｉ＼か
らなるＶｉＥの６つル’ｔ６　（Ａ　ｍｔい”Ｉ　ト’
Ｉｅ、　Ｐｊ！ｌｊ　ｃ’　Ｌ’−ル、１稈、ｄ、ｉよ
び （１１）工程（ｉ）（４１−成した複合体ろ−シブノル
増幅工程に付づる［稈 を含むことを！ｉ６　ｉ１夕とりる１１１人を会Ｊ＋　
：１　（ｊる６のである。

」二記の万ｄ、にＪ５い（、；１．！１当イ１架（４ノ
イノリン誘ノリ棒とじ（は、１）−タイスノー、ｌ〕２
１’−Ｊ、た（、１前述のこと８１ζ）、づｊ子ｉｉｊ
とｔ：＋　′１′″１をイ゛ｊｉノ〈テ〉ｌ、（）ｊ、
の誂う９体かこｆ５上れる。モノクＬ」−リル抗体【、
ｊ、前ｊホのように製ｊ；’＋　サｉｔ、７’　ツｔ　
（”ｃｓ　ｔする！１．′１）、Ｌ、′のｑｌ　４．、
（ｊ）、ｒゾリン誘導体に関係したしの（ある３ シグナル増幅工程は、スクリーニングノノ・′／【！イ
ノ′）法に関連しで記述した任ｊ五のちのてＪ、いが、
１：ＩＡが好適である。

架橋フィブリン誂穫体の（ｆ−１は、１）す血栓Ｊｉｊ
　、　１１１１栓症およσぞの他のノｆ１リンの勺成Ａ
３　Ｊ：ひｉ８解が関連づる状態の適当イＩ′診曳１補
助）、５°（利として用いられる。

この発明のアッセイもまた、ストレアトギナーゼｍ法お
よび組織プラスミ゛ノーゲンアクティベータ療法（ｆＰ
Ａ）のような溶解療法の監視に用いることができる。前
血栓状態の一例はストレス状態である。血栓状態の例に
は、ＤＩＣ１肺竹塞栓血栓症、侵入性腫瘍Ｊ３よび後述
する他の血栓状態が含まれる。

液体試料は、リンパ液、血清、血漿または海出液のよう
な適当な体液から得られる。

上記アラレイ方法は、前述のＪ、うにチューブ、つ〕、
ルプレートまたはマイクロブ°レートを用いて達成でき
、また慣用方法を含む他の適当な方法で実施できる。１
本の長尺部材を用いる「スディック」法も用いることが
ひき、その場合抗ＩＪλまたは抗体でまずその上をコー
トし、その後工程（Ｂ）１１５よび（’Ｃ）を行なう。

この発明の他の実施態様では、モノクローナル抗体を小
ビーズに共有結合させる。このようなビーズは、血清、
血漿または他の体液中の架橋フィブリン誘導体の一試験
を迅速（例えば２−３分）に実施することを可ｆｉｔ：
　ｌこ（する、　ｌで一ズは、ポリスチレン、ナイロン
、ガラス上に１．Ｌ　１１！！の）Ｐｉ当な拐料（作る
ことがＣきる。、ポリλノルンについ（述べると、しツ
クローノル抗１ホ（，１，１しルフーイ’、ｓ　、　Ｊ
　、　Ｃｅｔ！、３　ｉ０６４巻７５５真（１５〕７（
）；ｉ−〉１記・戊のカル小ジイミド法庖用い（こ、ｉ
′しに）１１□合させることが（ｔ９る。ナイロンビー
ズ（：（：Ｌ　、　ｉ１４当！、）′評、１′）方法は
ｌ＼ンリーＪ７よひｌ＼ルンン１．Ｊ　、　　ｌ　＋ｕ
＋ｔ、＋＋＋、　Ｍｅｌ、ｈｏ（１３５谷２ε３ｊ５貝
り１９８ｏ　ｓｈ　）記・ｆ・ｋσ）グルクールＪツノ
１１シ゛ヒト育人（Ｌ！ｙ）る。ｈノスじ一人（＝　Ｌ
、ｌ：、〕φ当＜Ｋ　ｌｉ’、’＋台ｌｉ法としで米１
ノＩＩ　！Ｉ：ｓム’ｔ　／ｌ　２　ｉ　０７　’／こ
５）ｊ記載ｑ）ジノン止剤法を用いることが（・きる６
、これらのヒ′−ズノ′ツヒ−／またはシノックスノノ
ッしイにおい（、七ツクｌ−１−ノル１１’Ｌ体と結合
しｌ：じ−スを試ｔＯ）面イ１“１または面梨または他
のイホ油とりＩ（助ｊするとさ、ｊ釣当な検ｅ　４’ｊ
＋準を用いて凝Ｕ、の測；ｔ　Ａ１１なう。この態様で
は、ラテックス粒子３したｔ、＋　＋：　−／、　’ｄ
−’既知の１に剣係数を有する均一な球状に作り、検ｈ
′″ｉ、標準どじ（光散乱拡大、シャドウノ′ングル、
シトドウイΔ２゛ｊ１のＪシみ、走査および透過電子顕
微鏡まＩζはレーザ−光散乱等に用い漬。

勿論、第１のモノクローナル抗体が抗原で柚犯され、さ
れが次いでラベルした第２のモノクローナル抗体（ラベ
ルとしてＥＩ　Ａ　；またはＲＩＡ試験が適当）により
タッグ（ｔａｐ）される、捕獲−タッグ法に基つくアッ
セイ法も、この発明て用いることかできる。

しかし、」８合（こよつＣは１．上記ピースま／こ（ま
ラテックスアラレイのような単一のモノクローナル抗体
も用いることかできる。

個々の架橋フィブリン誘導体のアッセイに関連して、試
験した七ツク［１−ナル抗体全体の中で、一定数のもの
は汎特異性（ｐａｎｓｐｅｃ：ｒ：ｃ　）　　（−’ｄ
’ｆ：；わら、フィブリン分解産物およびフィブリノー
ゲン分解産物のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ　）または
反応部位に結合りる）であり、残りのものは単特異１１
（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）　　（ｉなわら、Ｄ−ダ
イマーおよび他の架橋フィブリン誘導体の反応部位にの
み結合づる）であることが判明した。

以下の記載において、１つのアッセイ法で捕獲−タック
法をグｌ施づイ）場合、’、Ｉ　ｔ、’＋異性セック［
〕−ナル抗体が支持体表面（こ結合され、架橋フィブリ
ン誘導１（＋Ｖｆ含む疑の（１つる而）ｉ′１よノごは
１１！！の体ｒｌ夕ｔ”　：Ａ験づる。ジグプル１曽幅
丁程（用いる適当４ｇラベルに結合した８＝ｔ　！＋１
　’Ｉ″・：・１１［（−ツク（〕−ノル抗体（ある第
２抗体でタックされた場合、ｂ　シｉｔ・！、狛５ｊ＋
：性モノクローＪル抗仏か試料中の一■−じ１・−）に
結合りるとこれは架（、岳！イブリンを汽）（７１イ＼
のｉｔ“１１埜；な）ノ・ンレインノ；を提供り−る７
、 この技法の変法どし−（，１１・Ｌ’！、’Ｓ□’１：
　ｉｉｌヒノク［１−ナル抗体を支持体表面に結合さμ
、り、ｌｊ僑ノイ、プリン誘導体を含む疑のあるイホ：
ｊムｉて１．１°Ｃ’４’）’ｊ’Ｊることか−（きる
。次いで１１１特異１１１七ツク１−１１−−−Ｊ゛ル
抗体、適当なラベルを結合したイ４＼液抗涼にタッグさ
μる。。

以下の実験において、０・ど）（／リノーゲンｄ３Ｊ：
ひフラグメント１つ、に、１３よＯ’　Ｄ　　ダイマー
は、前記ライルナ−の文献にしたか−）（製造した。フ
ィブリノーゲン分解産物は、ハｌ＼ルカー１〜ｄ３よＯ
・タイマン、Ｔ　ｌ）ｒｏｍｂ　Ｒｅｓｉ　Ｏ巻Ｆう０
３−８１２　ｒｌ（１９７７年）記載の方ｄ１ぐ製造し
た。Ｄ−タイマーの製造に必要な架橋フィブリンは、オ
レキザおよＯ・プシンスキー、バイスケミス１〜リー１
８巻９９１頁（１９７９年）にしたがって製造しプラス
ミン分解した。

実施例 ４１１１胞融合およびハイブリットの３ｙＣ択Ｄダイマ
ーを注射して３＋＋後、二ｆｆ！’ｌ　ｊ’ｊ：’ｒを
転座させて殺した２匹の免疫：こしたマウスから肺肝＆
を無菌状態で摘出した。二のマウスは、以１）１ｊ：こ
、クラエフ（にｌ’ａｅ［ｒ）お上ぴハフター（１１ａ
ｉ’ｔ、ｃｒｊの文献；こ報告されているよう：こ蛋自
分ｉ１ｊ・ｒ酵素Ｉロンヒンおよびプラスミンで７’ｌ
’ｉ化したフィブリンｉｐ、：　ｌ’ｌ’酉本をン：；
ｊｎ　”　：正射して免４５−　Ｃｊ　Ｊ’Ｌだ、　　
；２つ）ｌｌ’１ｉＮＪ！土、５１１１（の完全媒」也
・、’＋：Ｚ９ｂ’のｌ欠１−°、＼、ｊＩｊｂ、＋（
〕Ｊ３よび１５％の牛胎児血清、ＩＣ１ｉｉＪ、じ７口
１１のペニシリン、１ｉｉｆｌμＨ／’ｔｒ、　ｌのス
トレフ゛ｉ・マイン／、２×Ｈ＋）−＝（＼１のグルタ
ミン。ギ７コ、クランド、アイランド（Ｇｌ！＞ｃｏ、
（、ｒａｎｃｆ、−Ｆｉ、Ｊｌｌｄｊ、ニューヨークツ
を含有する６　０　ｎｏ□のべ１・り距ファルコン（Ｆ
　ａｌｃｏｎ）　、３　ｏ　ｏ　１　、オソクスナード
ｊ　（、）　＼ｎａ　ｒｄ　）、カリ７オニア）内１こ
置か２ｔた５角）ｉ６＋Ｖ　でチップの端１ｃ＋ｎを曲
けた、３Ｉｌｌ　（゛の便い捨での注射器に取りｆ旧す
た２×１８デージ釧にょ°）、上記肺臓の皮膜を除去し
て細胞懸濁疎か製造された。

次いで、この細胞懸濁液は２２デージ針を付けた１（１
ｍりの注射器に吸引され、そして、適当な圧力で噴出せ
しめられた。この操作は、大きな細胞塊りおよび破片を
除去するために徽細なメツシュのステンレススチールス
クリーンを介して、これ等の細胞をファルコン（Ｆａｌ
ｃｏｎ）２　（１（’ｌ　１チユーブ内にシ濾過せしめ
る前に、２回行われた。

上記細胞懸濁液を新しいファルコン２０　（１１チユー
ブに移送する前に、該細胞懸濁液は室温にて５分間静置
させて小さな塊りおよび皮膜破片か沈降させられた。こ
れ等の細胞は室温にて５分間；３５０Ｃ；で遠心分離さ
せられ、その」二澄み液を第１４１Ｕ胞ペレツトから新
しいチューブにデカントするとともに、５分１’Ｊ］７
０＋ＩＧで回転させて第２細胞ベレツトを得、２つのベ
レットをプールするとともに５　ｍ　ｐの完全媒地中に
再懸濁した。次いで、それぞれタークスおよびトリパン
フルー色素によって肺臓の白血球（ＳＷＢＣと記す）を
数えるとともにその生存能力を推定し、１００ＸＩ０６
の生存Ｓ　’ｖＶ　Ｂ　Ｃを総容量５１ｎ１の完全媒地
内で個別のファルコン２０　ｆＪ　］ナユーフに放置し
た７、融合に用いるＮ　Ｓ−１ミエローマ、１ｍ＋胞は
、−ｊｊ、ｈ！。温にて１５分間、：（ｓ　ｏ　Ｇで遠
心分３１￥によって洗浄し、完全媒地内で５ＸＩＯ”生
存細胞数７”　ＩＩＩ　ｌＮ二、１羽とせしめた。

２５　Ｘ　１　（１”のＭＳ−１と］０ｏｘ１ｔ、＋５
の免役５ＷＢＣとを混合し、室温（こて５分間、：≧５
０　にで遠心分離を行った。−に澄み液をデカントし、
その残留緑地を注意深くパ又ツールピペット！こより除
゛去し、５　ｍ　、（：の使い捨てのガラスピベツ）・
（コーニングガラス、Ｃｏｒｎｉｎε、ニューヨーク）
を用いて、１５％（Ｖ／ν）のツメチルスルホキシド（
１）八４　Ｓ　ｏ　）を含むＲ１−）へ’Ｉ　Ｉ　］　
Ｇ　／Ｉ　！’）中の、１２％（田／Ｖ＞のポリエチレ
ングリコール（Ｌ’　１：、Ｇ　、　Ｍ　Ｗ１５４０）
溶液（ベーカーケミカル社（Ｂａｋｅｒｃｌ＋（コｍ１
ｃａｌ）　ｃｏ、　ニューシ、１−−ン゛イ）を：１７
℃１こで添加し、電気ピペッタ−（ピベノｉ・−エイド
ードルモントーサイエンティフィックＣｏ、フルーマン
（Ｂ　ｒｏｏｍａ　ｌ　ｌ　）、Ｐａ）の助けにより、
その５　＋ｎ　（ｌのピペットにより３０秒間再懸濁し
た。このＴ−”ｌΣに一細胞懸濁液はさらに室温で３０
秒間放置した後、粘性のあるＰＥＧ溶液との完全混合を
十分に確実とするために、当該チューブを一定に振りな
がら９０秒間に亘って５　ｍ　ｆＶ、の完全培地をバス
ツールビペンＦにより滴下した。さらに、５＋ｎでの完
全緑地な即座に添加するとともに転倒１こより混合し、
そして、室温にて５分間３５０Ｇで遠心分離を行う前に
、当該細胞懸濁液をさらに１５０秒間静置した。その上
澄み液をデカントし、電気ピペッタ−付の５ｍ、ｉｐル
ビペット用いて、該細胞ベレットを５１１　ｐの完全媒
地中にゆっくりと再ｊ４濁した。

特に、全ての細胞塊集を破壊しないように注：Ｃ，：を
した。トリダックステッパー（ベルコブラスＩｎｃ。

ヴイネランド、ニュージャーシイ）を用いて、１０−４
Ｍのヒポキサンチン（１−１ｙｐｏｘａｎＬｌ＋１ｎｅ
）　（シグマ）、４Ｘ１０−’Ｍのアミ７プリテン（Ａ
＋ｏｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）　（シグマ）、１．６ｘ１ｏ
−ｓＭのチミドリン（Ｔｈｙｍｉｄｒｉｎｅ）　（シグ
マ）および４×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール
（ＭｅｒｃａｐｔｏｅＬｈａｎｏｌ）　（ＨＡＴメディ
アム）を含むｂｏ（の完全媒地内フィーダ細胞として、
１×１０６の止常Ｂ　Ａ　ｌ−、ｉ−う／ＣマウスＳ〜
’ｔ’　Ｉ；　Ｃを含有する、以降、１°融合プレート
と称するコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）　２４ウエルプレー
ト　ｊｃｏｓｌ、ａｒ　３５２・１、ケン７゛りンジ、
マサナユーセン゛ソ）・１個の各ウェルに、０．（Ｊ５
τａ（の細胞１゛ご、山数を添加した１゜次いで・、−
１−記１°１嫁でｊ・プレートを、：旨゛Ｃの湿ったＣ
０．５％、空気９５％中に放置した。最初、細胞を５日
又は７日ｔ−１に供給し、その後、必要に応じて、０　
、５　＋ｎ　、Ｇ　、７）Ｓしい１−■ＡＴ媒地緑地（
給した。

通常１０口ｌ１こハイフリド゛−マの成長を示す各ウェ
ルからスクリーニングアッセイのため：こ（）、５Ｉ１
１　（：の緑地を除去するとともに、（１、５１１１／
′の新しい１１　Ａ　Ｔ媒地で置換した。スクリーニン
グアッセイに基づｂ、保存のために最も強力：二成長し
た多数のウェルを選択した。選択したウェルを原・シェ
ル（１°　ウェル）と合流して成長せしめるようにし、
次いで、各ウェルなも分に割り、２４ウエルコス９−７
”レー）＜２°プレー１−、ｌの新しし）′ンエル（２
°　ウェル）に移送した。毎ト１、各ウェルを検査し、
必要な時に当該２°の２４ウェルコスタ−プレートの２
倍、３倍、あるいは４倍等に拡張した。

１１［〜２８日目から各細胞にＨＴ媒緑地供給した。

上記２°のプレートにおいて少なくとも２つのウェルが
強力に成長したと軽、再スクリーニングのために各ウェ
ルの上澄み液からクローン型のウェルの上澄み液を選択
し、２次スクリーニングアッセイの結果から多数の特異
性抗体生産クローン型のものを選択して、限界希釈する
ことにより、モノクローナル抗体分泌性セルラインを生
成せしめた。

バイブリドモナスのクローニング 各２°のウェルから選択したクローン型の細胞を再び懸
濁し、トリパンブルー排除法によりウェル当りの生存細
胞数を推計した。各クローン型のものをプレートする直
前に、頻度を０．５細胞１０．０５Ｊとするため、ＨＴ
媒地中で（もし各細胞が融合後２８日以上も古いもので
あれば完全媒地中で）連室に連続して希釈を行った。次
いで、０．１＋ｎｊ２のＨＴ媒緑地るいは完全媒地中に
１×１０−５の正常なマウス肺臓供給細胞を含む、平底
の９６ウエルを有する組織培ムブレ＝１・（７０−、ラ
ボラトリイズ、ミッシソウカ゛、オンタリオ、カナダ）
（ＬＤプレート）の各ウェルに、−１−記容量なトリダ
ックステッパーと一緒に添加した。その後、該ＬＤプレ
ートを：）７℃の湿っｈ！３％の（二〇７、′：Ｊ５％
の空気中（こ放置し７・−１０日後、クローナル増殖の
スクリーニングを行った。正１こ増館１した各ウェルか
らスクリーニングのため：こ０゜］　ＩＴＩ　！　　の
−Ｌｉｉ４．み欣を除去し、これ（ｔのウェルに最初ｉ
コｉ、ｌ　、　１　□−（’、１．１５　ｍ　（’、　
（７）　Ｉ−（Ｔ緑地又ｊヨ完全緑地を供給した。１．
、［ｙスクリーニングア・／でイ１こ基つき、大量培養
へ拡張するために゛へター（１ｊ（・ＩＬｅυ′特異性
抗体生産クローンの最小２カ・選択された。

一方、多量のＭ　Ａ　ｌ］を１）１ようとするｉ、ｌ、
５合；こは、複数の雌のＢ　Ａ　ＪＬ　Ｂ　／’　０マ
ウスに生（ｆ数２×１０６のハイブリドーマ細胞の注射
１こ先ｆって］４日間、２．Ｓ、ｉｔフ、１４−テトラ
メチルベンタテ゛カン（）゛リンストン、アルドリンチ
　ケミカルコーポレーション、ミルつオーキー、“ンイ
スコンシン）の腹腔内注射を行い、該細胞を注射１２〜
１４日後に、マウスから腹水を集めた。この腹水を遠心
分離により清浄し、４５％の硫酸アンモニアで沈降を行
うことによりＭ　Ａ　＋）を回収ぜしぬ、４℃あるいは
一７０℃のいずれかにて（１，０１％のナトリウムアジ
ドを含む燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に貯蔵した。

モノクローナル抗体のスクリーニングアッセイＰＢＳに
Ｄダイマー（Ｓμ８／Ｊ）あるいはフイフリノーゲン分
解産物（５μｇ／ｍで）のいずｉｔがの５０μでを室温
（２５℃）にて１時間添力１けることにより、Ｕ字形底
部を有する９６ウエルマイクロ試験プレート（ディスボ
ーザブルプロダクトプティ、リミテッド（Ｄｉｓｐｏａ
ｂｌｅ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｐｔｙ。

Ｌｔｄ）アプライド、南オーストラリア）の各ウェルに
、コーティングした。該プレートを倒置しかったたいて
過剰の抗原を除去し、次いで、′０゜０５％のトウィー
ン（Ｔｕ＋ｅｅｎ）　２０　（シグマケミカルコーポレ
ーション、セントルイス、ミズーリー）を含ＱＰＢＳに
よ１）該プレートを３回洗浄した。次いで、各ウェルに
５０μ（′の組織培養」、−澄み液を添加するとともに
室温に１時間インキュベートすることにより、１）−グ
イマーあるいはフィブリノーゲン誘辱体シこ対する：＼
’］　Ａｂを分泌するクローンを検出した。倒置および
たたくことにより遊離ＭＡｂを除去し、当該ブレー１を
Ｙ・ＢＳ／ｌ・ウィーンで３回洗浄した。ベルオギシタ
ーゼを結合した抗７１ンスうさぎ／グロブリン（り゛コ
バン゛ン、コペンハーゲン、テンマークツのＩ　／′］
　ｆ’、ｌ　ｔ）　（ｉに希釈したちのＪ　ｉｌ　Ｏμ
ｒを添加するととム：、二、さら：こ室温で１時ＩＩイ
ンキュベー１・した。とにより遊離ＭＡｂを除去し、当
該プレートをＰ　Ｂ　Ｓ　／　ｌ・ウィーンで３回洗浄
した。ベルオキシターゼを結合した抗マウスうさぎ／グ
ロブリン（ダコパノッ、コペンハーゲン、テンマークツ
の１　／　］　Ｔｉｔ　１．１　ｆｉ＋に希釈したちの
１００μｒ゛を添ＪＪＩけるとともに、さらに室温で１
時間インキュベートした。プレートを再び倒置しかっＩ
’ＢＳ／）ウィーンで：）面洗浄し、活性化シタ基質１
１’）　（ｌ　ｉｔ　（、’　（使Ｊｌ　ｉｊｉ　＋ｉ
ｉｊ　＋、＝、クエン酸５１）　＋ａ　Ｍ、０−トリジ
ンジヒドロクロライド（シグマケミカルコーポレーショ
ンのＯ−）リジンで、希ＨＣＩから再結晶したもの）２
．５ｍ、Ｍ、ｐｌ−１４，５のＥＤＴＡｏ、０２５ｍＭ
を含む基質溶液１０＋ｎｌに過酸化水素の３％溶液１０
μρを加えたもの）を各ウェルに加えた。１０分後に、
３Ｍｆ１．Ｈｃ夕５０μ夕を加えることにより呈色反応
を停止させると色が青から黄に変化し、タイターテンク
スマルチスキャン（Ｔ　１ｔｅｒｔｅｃｋ　　Ｍｕｌｔ
ｉｓｋａｎ）て４５０η【０の吸収を記録した。

ペルオキシダーゼ結合 過酸化ヨウ素酸塩で酸化されたペルオキシダーゼを用い
て、Ｊ　、Ｈ１ｓｔｃｌ＋ｅ＋＋＋、Ｃｙｔｏｃｌ＋ｅ
ｎ＋、２２巻１０８４−１０９１頁、１９７４年のナヵ
ネおＪびカイオイの変法により、Ｄ−ダイマーモノクロ
ーナル抗体の結合を行った。蒸留水中の５＋Ｉ）Ｈ／Ｉ
ｎｌのペルオキシダーゼを室温で２０分間０，１八１の
過ヨウ素酸ナトリウム１１５容と混合するとともに、未
反応過ヨウ素酸塩を、ｐＨ４，５のクエン酸ｏ、ｏｏ１
ｈｊで平衡させたセファデックス（Ｓ　ｅｌ＋ｌ＋ａｄ
ｅｘ）Ｇ　２　Ｓのカラムを用いるデル濾過によす除去
した。モノクローナル抗体（］’　Ｂ　Ｓ’中）を、ペ
ルオキシダーゼ１叫；ちり抗体２＋Ｂの割合で添加し、
直ちに、そのｐ　Ｉ−１をｐＨ：ノ、５の１へ・ｌ炭酸
すｌ・リウムを加えること°によりす、ｆ）−！ｊ、　
　Ｓに調整した。室温で時々攪４つ１〕を行って２〜：
（ＩＬ＞間反応を行わせ、バ′−バー１．Ｊ、Ｉ＋＋ｕ
ｎｕ＋＋ｏｌ　　’、＼’ｌｒ１．ｂ、　　］　ｉ巻、
］　５’　　２３　Ｊ　１５）　７６年）に記載のよう
に１）Ｈ９，５，２，〇へ１のエタノールアミンの１／
」Ｏ容を添加してその反応を停止させた。４℃で一夜放
置した後、エンノールアミンを、ｌ’Ｂｓで゛平衡させ
たセフ７デツクス（ｑ２５カラムを用いるゲル濾過で除
去するとともに、その１すＹ素結合体を０゜（）１％の
メナオレートの存在下４°Ｃで貯蔵した。

１斤白質の定量 Ｒｙ　ｌ　ａ　ｉ、　ｔおよびＰａｒｉｓｌ＋　　Ａｎ
ａｌｙＬｉｃａｌＢ　ｉ　ｏｃｈｃｍ、１２１巻、２１
３−２Ｊｒ１１頁（１９／３２年）の方法により蛋白質
の定量を行った。

捕獲／タッグ実験およびＤ−グイマーアッセイＰＢＳ中
のＭＡ　ｌ）のそれぞれ５０μ（（１（，１μ８／、、
ｆ）を含む９６ウエルマイクロタータープレートの各ウ
ェルを室温で１時間インキュベートすることにより抗原
捕獲／タッグ実験を行った。非結合ＭＡ　１１は、裏返
してプレートをただｂ、次いでスクリーニングアッセイ
で述べたようにＰＢＳ／トウイーンで洗浄することによ
り除いた。次に、抗ｉ抽獲を、λ４Ａｂ被覆ウェルにＰ
ＢＳ／）ライフ中ノ抗Ｊｊｍ（０−ｂｒ、／１１１．ｃ
）各５０１．１．（ｊを室温で１時間加えることにより
達成した。ウェルを前記のようにして洗浄した。次いで
、各ウェルにＰ、ＢＳ／）ウィーン中の種々のペルオキ
シダーゼ結合ＭＡｂ５０μ／ｇ（１μｇ／Ｊ）を室温で
１１ｔ；’、１ｉ）ｌ加えることにより、捕獲抗原をペ
ルオキシダーゼ結合ＭＡｂでタッグした。洗浄後、結合
フンシュゲート（結合物）の存在を、スクリーニングア
ッセイで記載したように基質１００μＣを加えて卿定し
た。血漿または血清中の架橋誘導体の存在の測定には、
ＰＢＳ／）ウィーン中の１７５希釈血漿または血清５０
μ矛を第２工程の抗原の代りにインキュベートした。

［結果１ 特異性 ひとＤ〜ダイマーに対するＭｔ＼１）を分泌するハイブ
リドーマクローン数ｊＯ（）種をまず１）Ｙ素イム７ア
ツセイて゛同定し、２種の異なるクラスの；＼・］　Ａ
ｂを得た（第１表）。第１群は大多数の陽性クローンを
含みＩその例はｓ、ｉ４．　　“７．／ｌ　１）２／１
　：３ン（１）Ｄ４Ｄ２／］ｆＢ）、Ｂ４・１．７，２
．Ｃン／１−ノ（ＤＤ−２ＣＩ／１　　り）　、　丁３
４　ｉ　、　　７　、　２１）　５／３８（ＤＩ）−２
１）５／３ｚ）ｌ、完全なフィブリノーゲン、フイフリ
ノーケ゛ン分解産物含有抽出物、フラグメン）Ｄおよび
Ｄ−グイマー上］二存在するエピトープ（抗原決定茫）
に結合ｒ　７＋１１１１Ａ　ｂを生産した。しかし、」
−記載１群は７ラグメントＥには結合しなかった。第２
の小さな群１その例はＢ、・１２．７．３］３６／２２
（１’）Ｌ’）−３１’、畳）／２２＞、Ｂ４１、７．
’　ＩＣ３／　１１）　ｒ３（ＤＤ　　］　０３／”ｌ
　１．’１８）１は、Ｄ−グイマー上に存在［るが７ラ
グメントＤ上に存在しない決定基と反応した。

精製した完全フィブリノーゲンまたはフイフリノーゲン
分解産物との間には交差反応は認められなかった。

捕獲抗体としてのＤ−グイマーモノクロナール種々のＭ
　Ａ　ｌ］がＤ−ダイマー上の同一または別の位置で反
応したことを認定するために、捕獲／タッグ実験を行う
。９６ウエルマイクロプレートの１ンエルを各Ｍ　Ａ　
＋）で・コーティングするととも（こ、フィブリノーゲ
ン分解産物またはＤ−ダイマーと培養する。非結合蛋白
質な洗去後にペルーオキシダーゼ結合ＭＡｂを加え、洗
浄後に活性基質を加えて結合コンシュデート（結合体）
の存在を決定する（表２参照）。

ＤＤ−２Ｃ１／１９ このＭ　Ａ　ｌ）は、抗原としてＤ−ダイマーを使用す
るときにのみ単一特異性ＭＡｂＤＤ　　ＩＣ３／１０８
またはＤＤ−３Ｂ６／２２結合で外、Ｄ−グイマー抗原
または分解産物としてフィブリノーゲンを使用するとき
汎特異性ム４ＡｂＤＤ−２Ｄ５／３８と結合できる。い
ずれかの抗原と池の汎特異性ＭＡｂＤＤ　　４Ｄ２／１
８２とを結合することはできない。これぬの結果は、Ｄ
　Ｄ　　２　Ｃ１／１９は、ＤＤ−４，Ｄ２／１８２ｉ
こＲって認識される位置に接近して結合するか、］））
）−２１）５／’３Ｂ、　］）ＤＤ−Ｉ　Ｃ３７１０ｇ
また１土ｆ）　ｉ）−：（Ｂ　６　／２２によって認識
されるものと全く別個の抗原決定基に結合することを示
唆している、 １）ｆ）−４Ｄ２／］　’、８２ 汎特異性ｂＩＡ　ｌノｌ）ｌ：’）−４１）２／Ｉ　ｉ
；　２は、ＤＤ−２Ｃ１／］　（月こ類１以した持）′
シ・１・゛１バクーンをイ＋Ｌティア＋。ソノ’ｌ’ｉ
ｉ　Ｊ　Ｌ、Ｉ−）　Ｉ）　−４１）　２　／　ｌ　８
２　ｔ；　Ｊ：びＤ　ｌ）　−２ＣＩ　／　］すは、結
合位ｉｉ”ｉがきわめて接近しているかまたは屯なって
いることを示”ｌしている。

Ｌ）Ｄ−２１）５／３：： 汎特異性Ｍ　、Ａ　ｂ　Ｄ　ｌ’）　−２１）　５　／
　３　：；もまた、））−ダイマーか使用されるときに
のみ１）Ｄ−ＩＣ３／１０８およびＤＤ　’　３　Ｉ３
Ｇ／′ン２とよ古今で・きるが、他の汎特異性ＭＡＩコ
Ｉ）　Ｉ’）　−ｚｌ　Ｉ）２　／　］　８２および［
）Ｄ−２Ｃ１／’１９の両者と、抗原としてＤ−ダイマ
ーまたはフィブリノーゲンか１ケイ産物を用いて結合で
とる。このモノクローナルは、それ自体で組み合ぜるこ
とがでｂるこのシリーズの唯一のものであり、Ｄ−グイ
マー分子当たり少なくとも２つの結合位置の存在を示唆
している。しカルなが呟これらの結合位置は、他の４つ
のモノクローナルによって認識される位置から区別され
ねばならないのは明らかである。

ＤＤ−３Ｂ６／２２およびＤＤ−ＩＣ３／１０８Ｄ−グ
イマー特異性ＭＡｂ　ＤＤ−３Ｂ６／２２は、Ｄ−ダイ
マーが捕獲抗原であるとと、汎特異性モノクローナルＤ
Ｄ　　４Ｄ２／１Ｂ２．ＤＩ’）−２Ｃ１／１９または
ＤＤ−２Ｄ５／３８のいずれかと結合することができる
。ＭＡｂ　ＤＤ　　Ｉ　Ｃ３／１０８は類１以した特異
性パターンを有するか、捕獲Ｍ　Ａ　ｂとしては比較的
貧弱なものである。その結果全体として、このモノクロ
ーナルのセットは、Ｄ−ダイマー分子に３つの異なる領
域、すなりちＤＤ−２Ｄ５／３８ｔこよって認識される
ユニークな位置、ＤＤ−４Ｄ２／１８２およびＤＤ−２
Ｃ１／１９によって共有される池の位置、お上びＤ　Ｉ
）　−Ｉ　Ｃ３／　１０　：′）とＤ　Ｉ）　−３Ｂ　
６　／　２２とによって共有される１−）−ダイマー９
、′ｉ−５”も位置に結合することを示唆している。

Ｄダイマー用特異的アッセイ 上記の結果は、これらのＭ　Ａ　１１をいくつか組み合
わぜると、Ｄグイマー用の特異的アッセイを発展するの
に有用であることが証明され、フィブリ７リシス用一般
アッセイになりうろことを示唆している。組み合わせの
第１の型として、単一特異性ＭＡｂ　ＤＤ　　３８６／
　２２は捕獲ＭＡ　Ｉ）として使用され、抗原は汎特異
性ＭＡｂ　ＤＤ−４，Ｄ２／１０８またはＤＤ　　２Ｄ
’５／３８ｉこタングされる。

タッグへ１１＼１〕としてペルオキシダーゼ結合ＤＤ−
−４Ｄ　２　／　１　（：）　８を使用するアッセイは
、Ｄ−ダイマーの１０−２０　７２／＋訂の感度を有し
ている（第１図参照）。フィブリン低分解産物とは強い
反応性を有するが、フィブリ７一ゲン低分解産物または
フラグメン）Ｄとは反応性が見られない。基本的に同等
の結、果は、タッグＭ　Ａ　１１としてペルオキシダー
ゼ結合ＤＤ−２Ｄ５／３８を用いて得られる（図示せず
）。池の組み合わせタイプでは、捕獲ＭＡｔ、とじて汎
特異性モアクーロナルＤ　Ｄ　−ＩＤ２／１８２を使用
し、抗原はペルオキシダーゼ結合ＤＤ−ＩＣ３／Ｉｔ３
８で・タンク゛される（第２図参照）。

この場合、Ｄ−ダイマーとフィブリンか１１’ｆ産物は
明確なシグナルを生したか、完全てＣフイフリノーゲン
、フイフリノーゲン分１；；１産物まｔ冒土フラグノン
トＤでは検出可（化な交差反応か認ｔ）ら才′シなかっ
た５定性的に同様な結果が、しＤ−２Ｃ］／１：３また
はＤＤ−ンＤ　５　／　３３で抽ち災すること；こよっ
て得られた（図示せす几 これらモノクローンの両に１ｊ合）つせ：、二部：つく
アッセイか、Ｄ−ダイマーおよび池の血液中の架橋誘導
体を検出する能力を有するか否か；こついて調べた。正
常健康志願者（対照は１９．２０．２３）または臨床診
断ＤＩＣ患暑から符て１・ｒ；　Ｓ　／　トウイーン中
１１５に希釈した血清またｉＪ：　ｌ！１１　’東を、
＋）　ｌ）　−３８６／２２またはＤ　ＣＤ−・１１）
ン／″ンｊ２てパ被添したマイクロブレートで゛・（ン
キュベートし、１旦ン扁で１時間インキュベー１・後、
結合［）−ダイマーまたは架橋誘導体の存否を結合ｊ＼
４　Ａ　＋１の添加により確認した（第３表）。ＤＤ−
３８６／ンン１こ基つくアッセイは血清および血漿の両
者で陽性の結果も示したか、ＤＤ−ＩＣ３／１０８に基
づくものは血清のみ陽性の結果を示した。

［ラテックスビーに試験］ ラテックス粒子としては、直径約１ミクロンのポリスチ
レンビーズを用い、これにモノクローナル抗体ＤＤ−３
８６／２２を共有結合ぎせた。

試験方法 １、ビーズ（’、）、０２Ｊをスライド上（使用前振盪
）で血清または被検希釈試料０．ＯＩＪと混合した。

２、スライドを２分間ゆっくり捲り動がし、凝集の有無
に注意した。

架橋フィブリン誘導本レベルの評価 架橋誘導体＞　２００　＋＋＋Ｂ／ｍ　灸を含む試料で
゛陽性の凝集が認められた。個々の試料における高レベ
ル架橋誘導体のさらに正確な評価は、第４図に示すよう
に、試料をＰＢＳ緩衝液で系列希釈して得られた。

補充臨床実験 対象 研究１’Ｘは、（ａ　）　ｋ＋Ｉ’　ｊ！ａとして健康
な（１１ｊ　９２　室ｒｕｙ　Ｉｊｊｒｊ名、１５名、
（ｉ））静脈造影）夫で゛証明され７ｚ浣部ｌ’ｆ１’
脈血栓症および／または動脈血栓症思考１０名、”Ｃ’
ｊ肺性本性塞栓患者名、および（ｄ）消・り・円、）ｙ
え面異常症の研究的証拠および播種性脈管内放固を１４
徴的に随伴する診断のある患者３０名で゛ある。１、ｄ
　＞　Ｊｉ）：の患部しワウンおよびオスキ、（’、１
．ｌｌｉ、　　＼、１（・・」、！＼・２・。

ｃ、　　　、Ｊ、　　　ｉ　　り’７　巻’：３６３−
！ＪＣ’＋Ｇ　　！′ｉ１．１　（Ｊ　ン　２３）；ノ
記４・梨の播種性脈管内）疑固の基Ｃ１，（を針べて充
足した。

１ｆｉＬ　ｊ色２［１＋ｌを、だいずトリブシ／インヒ
ヒター（ベット／正；よしエデ゛イそンソン、”、’＋
　、　　６　、’７．　：ｉ、　ｌ’、単位）の存イ゛
１：；；こトロンビン（２（ｌｉｔ＋）で；夕よ而させ
、血清を６１ｊ述した捕獲／幻、グ法により可、１；ｐ
性架橋フィブリン誘導体のアッセ侶こ用いに、ｉ）−比
（試料と空試験の比）としての結果を、（ａ’）Ｉ’ｌ
−：こ−７・９）では第１表、（ｄ）ＪＦｆ’ｌこ−）
いて（土弟５表、（１’　＞　４ｊＴ　に−ノイて（上
第６表、（ｃ）群１こついては第“７表１こ示す１また
結果を第３図に図示ｒる。

架橋フイフリン誘導体を区別するｆこめの１、テ異性抗
体プローベを得ようとする従来の試みは、免疫に用いる
抗原に応答するポリクロナール抗体の性質のために邪ｍ
された。架橋誘導体に対して顕著な選択性を有する数種
の抗体製品が既に報告されている。例えば、Ｄに較べて
Ｄ−ダイマーに５０倍大きな反応性を有するもの（前記
ブシ゛ン久キ文献）、非架橋のものおよびペプチドに較
べて架橋γ−γ僅に１０（）倍大ぎなもの（パーベ又等
、バイオケミストリー、１９巻、４０５１　４　Ｑ　５
８頁、（１９８（１年）またはフィブリノーゲンもしく
はフィブリノーゲン分解産物に較べてＤ−ダイマーにδ
倍大外なもの（うしす等、ＴＩ＋ｒｏ＋ｎｂＲｃｓ２３
８．３０３−１１２＠、１９８１年）である。非架橋フ
ラグメントの架橋反応率は、診断試薬としての価値を除
く１こ充分であった。

診断試薬上の問題点は、架橋フィブリン誘導体とのみ反
応するＭＢｂが製造されて始めて解決した（Ｉ）Ｄ−３
Ｂ６／２２およびＤＤ−ＩＣ３／１０８）。これ等のＭ
Ａｂは、捕獲／タッグ型システムを好適とする診断方法
の実施に用いられている。

しかし、ラベルした単特異性ＤＤ−３８６／２２−１う
Ｄ＝　ＩＣ３／１　ｏ　＜：ホｔこはその皿のラベルし
た架橋フィブリン誘導（本ヲ用イル従来）結合阻止アッ
セイをも用いることかでくる。

捕獲／タッグアッセイでは、問題（二なっている抗原を
、同一分子内の異なる領域に１、）異性を有する２種の
抗体と反応さぜる。通常、！ｔｉｔ長抗体長円体上に結
合され、抗原を添加して結合させた後、結合抗原の（ｆ
在を第２ラベル抗体の添加洗浄後１こ検出する。

、＼４ＡｂＤｌ）　　Ｉ　Ｃ３／　ｌ　ｌ’）　’ｔ、
：は１）−ダイマーに完全に特異性を持ち、捕獲人’Ｉ
Ｉ＼ｌ〕とし′この役目は１７５９行なわれていないか
、それで゛らヘルオキシターゼ結合ＭＢｂは良好な多）
グであっ１こ、、　＋１！ｕブハ別の特異的モアクロナ
ール））！’）　−：→Ｌ；　ｔｉ　／ン２は良好な捕
獲ＭＡｂではあるかタッグとしては比較的よくにかった
。

タッグとしてのＤＦミー］Ｃ３／ｌｏンｊ１．ニノ吉づ
くアッセイでは、Ｄ−ダイマーとフイフリン分ｉ１イ産
物かほぼ同様に結合したが、捕獲ｊ＼４Ａｂとしてｌ’
）　Ｉ）　−３８６／２２を用いるアッセイでは、［）
−ダイマーが約１００倍よ（結合した。同様に、ＤＤ−
３Ｂ６／２２アツセイでは高濃度のフィブリ／−ゲンに
おけるシグナルが発生したが、ＴｈＤ−ｓ　Ｃ３／１０
８ではそうではなかった。これらモノクローナルはそれ
ぞれ標準的酵素イムノアッセイで両抗原と同程度の交差
反応を示した（第１表）。

これ等両アッセイとも、Ｉ）ＩＣ患者の血清中に存在す
るＤ−ダイマー主たは池の架橋誘導体を低レベルで検出
で゛きるが、血漿中に存在する高濃度のフィブリ７−デ
ン（約３０００μｇ／　ｍ　Ｉ　）かタッグ抗体トン）
ＭＡｌ）ＤＤ　　ＩＣ３／１０８に基づくアッセイで血
漿に陽性結果を与えるのを妨害するのは驚くにあたらな
い。この場合の捕獲抗体ＤＤ−４Ｄ２／１８２はフィブ
リノーゲンとＤ−ダイマーの両者に強い反応性を有し、
血漿中高濃度のフィブリｙ−’ｒ’ンは固相上の捕獲モ
ノクローナルを覆ってしまうと思われるからである。他
方、単特異性ＤＤ−３８６／２２に基づく血漿アッセイ
は、数オーダーの大ぎさくｍａｇｕｎｉｔｕｄｅ）の高
濃度フィブリ／−ゲンの存在下でも架橋誘導体を選択的
に捕獲しく第２図）、したがって、架橋フィブリン誘導
体のアッセイシ二関してはさら：二効果的である。

第４図に示すよう（こ、ラテンクスヒーズ゛アッセイは
、前述したト：ＩＡで４％）られる匣の−ｊ’ｊ　！（
ｌｊ：結果とよく相関する。したがって、ラテ／クスビ
ーズアッセイは迅速診断試験能力を有する１ 上記アツセイ方法は、・′［・−４（１”０．ちら：二
好適ｔこは室温で実施でｂる。検体と孟＼ｉ　Ａ　ｂと
の接触は１）１４５・〜９で実施でき、適当なイオン力
の１−眼はＩＸ４である。

グ）１図は、Ｄ−ダイマーの特異性アッセイを示す。Ｄ
−ダイマー特異性モノクローナルｉ）　ｌ）−３１３６
／′２２　（］　（ｌμｇ、／、ｎｌ　）ヲマイクロプ
レートのウェル中へ被覆し、ます、Ｄ−ダイマー（＝−
Ｌ−１□八フィブリ／′−ゲン分解産物（△−△）、フ
ィブリ／−デン（ムーム）、フィブリン分）；イ産物（
（２）−＠）またはＬ）−モノマー（〇−〇）と反応さ
せ、次いでベルオキシターゼ結合ＤＤ４Ｄ２／１８２で
タングした。対照実験は、捕獲モノクローナル（１）Ｄ
−３Ｂ６／２２）ガ存在しなければ結合が起らないこと
を示した。

第２図では、汎特異性ＭＡｂＤＤ−４Ｄ２／１８２（１
０μｇ　／　ｍ　ｌ　）をマイクロプレートのウェル上
に被覆し、まずＤ−ダイマー（ローロ）、フィブリン分
解産物（△−△）、フィブリノーゲン（ムーム）、フイ
ブリノーデン分解産物（０−・）およびフラグメン）Ｄ
（〇−〇）と反応さぜ、次いでベルオキシターゼ結合Ｄ
Ｄ−ＩＣ３／１０８でタッグした。対照実験は、捕獲モ
ノクローナルが存在しなければ結合が起らないことを示
した。

（１）各モノクローナルのＤ−ダイマーに対する反応の
光学密度は１００゛％とされた。そのと外の指示値は、
他の抗原を介して得られた相対光学密度により定めたも
のである。

（２）力価は、Ａ　４５０ｒｎｏ＞　０．１の抗原とし
てＤ−ダイマーを用いたとき読みを与える最低の希釈度
である。

表−３ 酵素イム／アッセイによる血液中架橋 フィブリン誘導体の存在の決定 （１）ｌ）ＩＣスコア 当該患者は、Ｃａｎ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５６ｃ、　　Ｊ
、１０７．９６３−６６（１９７２）　（ウォン（Ｗｈ
ａｕｎ）およびオスキー（Ｏｓｋｉ））のスコアリング
システムにより、播種性血管向凝固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）と診
断された。

（２）値は、抗原に代えてＰＢ　Ｓ　／　）ウィーンを
捕ｉＭＡｂと共にインキュへ−１・した月照実験との比
較におけるＡ、ｓ　（ｌ　ｎ　ロｌの変化として２（す
。

（３）ポリアクリルアミドゲル電気泳動：こよる［）−
グイマーの介在はレーン等、ＴｆｌｒｏｍＬ、　　ｌ’
ｂ・：７．′：ノ巻」９ｌ−２（月）頁Ｈ：ｒ−“７６
年）／方法にしたかって確認した。

表−４ ｎ　　＝　　４５ ７−０．９ ８Ｄ＝（，１，３ 書＋十＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋　
−’−＋　＋紫ｃｑｃｏｔ−Ｌ−ｃｖｔ−１：’）ＣＯ
（”）ＣｏＬ−ＣＩ。ｗｍ−＋−（＋　＋’−’＋−ω
（イ）〜−−ｗ　　−＋−−＋−０−〜（ホ）寸りＯＬ
−ωの０−“ＣＱ　＝ｒ　Ｒ’）■２　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　
＝−’　　−−−−−′″５　　　　　　　　ざヤ １ 、＼　　　　　　　　　　　Δ ←　　　　　　　　Ｃ 会　　　　　　　　　へ ｑ′Ｊ。

＋−し− ＋十＋　＋　＋　＋　＋　十＋　十＋　＋　＋　十”’
　　　　”ｕ）（η　寸　の　〜　り　ＯｃＯ９１ｃ　
硝　０　ｏ　寸　”−・−一−シーくＳ −−−［−Ｏｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　（＋　　　　　刀　　　　　　　　　　　。

ヘ　ヤ　−　　　−８ ＝“皐＝８＝た藁２８翼に謬毘８二←二　麓Ｕ５３

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、Ｄ−ダイマーの特異性アッセイ
（それぞ゛れ捕獲ＤＤ−３８６／２２／タッグＤＤ−４
Ｄ２／１８２、および捕獲ＤＤ−４Ｄ２／１８２／ター
４Ｄ２　　ＩＣ３／１０８）を示す図である。第３図は
、ＥＩＡの光学密度比を示す図であり、図中、ＮＯＲＭ
は正常（ＩｌＯｒ＋＋ｌａ　ｌ　）、ＰＥｉ、ｔｌｌｉ
性塞栓、ＯＴＨは池の血栓本性障害（ｔｌ＋ｒｏ＋＋＋
ｂｏｅ＋ｎｂｏｌ　ｉｃｋ　　ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を示
す。第４図は、Ｄ−ダイマーのＥＩＡ値（［ｎｇ／ｍ１
ｌ）対Ｄ−グイマーのラテックス凝固（ｌｏｇ［ｎｇ／
ｍ１ｌ）の相関を示す図である。 ｑｔ許出ｍ人　フイールダー・ジルレスピー・ディビス
・リミテッド 代理人弁理士青山　葆　はか１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）架橋フィブリン誘導体から誘導されるモノクロー
   ナル抗体の製法において、下記工程：（１）架橋フィブ
   リン誘導体またはそれを含む抽出物を得る工程、および （１１）上記誘導体または抽出物を投与した動物から得
   た抗体産生細胞をクローン化ザることにより、上記誘導
   １本または抽出物に対する抗体を生成させる工程 を含むことを特徴とする方法。 （２）抽出物が、フィブリン凝塊のプラスミン分解、ま
   たはトロンビン、第Ｘ■因子およびプラスミンまたはフ
   ィブリノーゲンの同時作用により、一過性凝塊形成とそ
   れに続く凝塊溶解を以て得られたものである、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 （３）抽出物が、架橋フィブリン誘導体含有動物体液を
   電気７泳動、り［１７１〜グラノイーまｌζは他の分画
   手法に付づ口とによりｒ　’、’ｔされたものである待
   　６午　ｊ１４　　求　の　範　囲　第　１　耳４　記
   　４戊　の　ジノ　イ人　−（４）工程〈爾）か、架橋
   ノ了ｆリン誘導体を含む抗原１作抽出物をマウスに模’
   −（ｉ　Ｌ＋、次いＣ・これを居殺し、次いて゛牌臓を
   摘出しｄらに精製してリンパ球性また１′３．狩ｊ藏白
   血球性♀１１１胞を分離、次い（・これらを−７ウスの
   ミエローマ細胞と融合してハイプリドーマ細胞を形成し
   、これをクローン化また（よ、　　６殼に応じで山り［
   ｌ−ン化づる１）の〔ある、特許請求の範１川第１ない
   し３」「１の何れか゛１拍１．ピノ銭の万ン去１゜ （５）ハイプリト−マや１１．１１包が・ン１ルブレ−
   １〜」二Ｃ′培養され、そこぐは各つ１刀し内に細胞培
   養培地と共にハイブリトーン細胞懸濁液が置かれ−（い
   る、特許請求の範囲第５項記載の力試１゜ （６）ド１１８］−稈：− （Ａ）　　（ｉ　＞架（・ムフイブリン１ｌ１１．’ｉ
   Ｔｆホ、（ｉｉ＞−ｌ記誘導体含有抽出物、に；ｉ）ノ
   イ／リノーグン分解産物から選ばれた抗原で表面を旧す
   る工程、＜Ｂ）上記抗原を架橋フィブリン誘導体から誘
   導されるモノクローナル抗体に接触させる工程、および （Ｃ）ｉ程＜Ａ）で生成した複合体をシグナル増幅工程
   に付する工程 を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１１１１゛記
   載の方法に使用するためのスクリーニング・アッセイ。 （７）工程（Ａ）がモノクローナル抗体を加える前に抗
   原を各ウェルに加えたウェルプレートを用いるものであ
   る、特許請求の範囲第６１．Ｑ記載の方法。 （８）動物体液中の架橋フィブリン誘導体検出用アッセ
   イ方法において、下記工程： （１）架橋フィブリン誘導体から製造したモノクローナ
   ル抗体を、架橋フィブリン誘導体から誘導される抗原を
   含むか、または架橋フ′イブリン自体からなる疑のある
   液体試料と接触させる工程、および （１１）工程（１）で生成した複合体をシグナル増幅工
   程にイ」する１稈 を含むことを１寺徴と・ノるノ“ｊン入、。 （９）架橋フイｆリン誘石・１本か１）−フィン−Ｃあ
   る　、　　１４　区′（−；晶　求　の　イ厄　１川　
   稔’ｒ　　８　　ｊｌｉ　　ｉＩ己　・１戊　σ）　ツ
   ノ　ン人　９゜（１０）Ｉ−稈（ｉ）にＪ−３１ノる第
   １しツク１」−ノル抗体が捧液中の抗１３：口こ結合：
   ｋ　／ニーＩＬＬ柚犯され、次いて゛これか工程（１１
   ）Ｃ′ラベルしたり）２七ツクロ一ナル抗体にＪ、リタ
   ッグされる、ｉｌｌ　ｕ’ｌ　ｉ＋！’Ｉ求の「セ１Ｉ
   ＩＩ第８項又は第９項に記載の方法、。 （１１）第１モノクローニｊ°ル（ｌ′ｔ（／ｌＶが中
   ｆｊ異１４１であり、第２ヒノクロープール抗体がｉＮ
   、１ゼＩ’　ｒ＋ｊ性−（′ある、狛ム′［請求の範囲
   第１０］Ｎｉに記載の方法、。 （１２）第１七ツク（」−プル抗１ホかＩｌｉ持ｌ；性
   であり、第２モノクローナル抗（Ａ　ｉ）・単特５“？
   性であａ、１）許請求の範囲第１　Ｑ　Ｑ”、ロ、二記
   載の万７）、、。 （１３）第１モノクローナル抗イホか汎特異付（ｄうり
   、第２モノクローナル抗体が中狛安性である、特許請求
   の範囲第′１０項に記載の）“ｉ　ＰＩ、。 く１４）第２モノクロ−ノル抗１ホが酵素でラヘルされ
   、それを次いで−」−記酵素の品１゛′ｊと１ジ応さμ
   る、特許請求の範囲第１０項乃至第１３項のいずれかの
   １つに記載の方法。 （１５）第２モノクローナル抗体が放射性物質Ｃ゛ラベ
   ルれている、特許請求の範囲第１０ないし１３項の何れ
   か１項に記載の方法。 （１６）工Ｐｌ（ｉ）におけるモノクローナル抗体が液
   体試料と接触（る前にまずラテックスビーズと結杏され
   、次いで工程（１１）で凝集の検査に（＝Ｊされる、特
   許請求の範囲第８または９項記載の方法。 （１７）下記工程： （１）架橋フィブリン誘導体またはそれを含む抽出物で
   動物を免疫する工程、 （１１）動物から牌臓を摘出する工程、（ｉｉｉ　）牌
   臓゛を処理して細胞懸濁液を作る工程、（ｉｖ）細胞懸
   濁液を精製して牌臓白血球またはリンパ球を分離する工
   程、 （Ｖ）−成分として上記牌臓白血球またはリンパ球を含
   むハイブリドーマ細胞を形成する工程、（ｖｉ）適当な
   細胞フィーダ一層を用いて上記ハイブリドーマ細胞をク
   ローン化Ｊ、た（、ｊ、再クローン化りる工程、 （ｖｉｉ　）架橋フィーゾリン講榎ＩＡビしたはイれを
   含む抽出物またはフイアリノーノノン分ＩＩ％′ｐｒ物
   からｉ５ｆは−れた抗原を用いＣスクリーニング・ツノ
   ・ソレイを実／Ｉｉ！！シ架橋フイｌリン８、λ）１７
   １本１ゼｉ　、！ｉ！＋：　ｔ！！　Ｌツクｌ」−ノー
   ル抗体を産住りるハイーノリト−ン沼１１胞を・づγ副
   りろ工程、 （ｖｉｉｉ）架（１！５フイシリン１ｌｉｔン９１ホま
   ／＝　ＩＪ、イれから誘導される抗原を含む疑のある。 ・１々（４〜試料を、７１Ｊｊ、１（ｖｉｉ　）後（こ
   会同１され）こハｒノリトーン茅用ｎ説から製造したヒ
   ノク［１−ナル抗体ど接１ｌＩｌｌ！さける］−程、Ａ
   ５よひ ＜　　ｉｘ）　　土　稈　（ｖｉｉｉ）’ｒ　　ノＩ　
   ノ戊　し　た　ｉＩ、Ｉ　　台　１本　を　シ　ツノ　
   フ　ル増幅工程に付づる１稈 を含む、イホ液中の架（１１Ｆノイノ゛リン誘う１木の
   検出１７転。