JPS5920352B2 - 親規抗生物質アクレアシンDr - Google Patents

親規抗生物質アクレアシンDr

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JPS5920352B2
JPS5920352B2 JP52046080A JP4608077A JPS5920352B2 JP S5920352 B2 JPS5920352 B2 JP S5920352B2 JP 52046080 A JP52046080 A JP 52046080A JP 4608077 A JP4608077 A JP 4608077A JP S5920352 B2 JPS5920352 B2 JP S5920352B2
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acreasin
methanol
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neutral
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勝 小谷
秀三 里井
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Toyo Jozo KK
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗性物質アクレアシンDγに関する。
本発明者らは、沖縄県石垣市於茂登の山林土壌より分離
したアスペルギルス(Aspergillus)属に属
する糸状菌M4845菌が、その培養液およびその菌体
内にキヤンジダ、アルビカンス(Candidaalb
icanc)なξの酵母類に極めて低濃度で増殖を阻止
し、また′皮膚糸状菌や植物病原糸状菌などの糸状菌類
に対して極めて低濃度にて良好に増殖抑制を示す新規抗
性物質を生産することを見出し、該抗生物質を抗生物質
アクレアシンDγと命名した上記の糸状菌M4845菌
の肉眼的および顕微鏡的観察に基く各種培地上における
培養の特徴は次に記載する通りである。
A肉眼的観察 1ツアペツク寒天培地 生育は速く、26℃、10日間で直径55〜6511に
達する。
集落表面は平担で薄く、培養初期には白色であるが、分
生胞子が形成され成熟するにつれて次第にフオーン(F
anlnhue4lg)となる。分生胞子は非常に多く
形成される。集落周辺部はややくもの巣状(アラクノイ
ド ArachnOid)o裏面の色は無色〜ペールイ
エロ一(PaleYelIOwlhue/Ca)。
拡散性色素および浸出液は出さない。無臭。37℃での
生育は遅く、10日間で14〜2麦芽汁寒天培地 生育は速く、26℃、10日間で直径60〜700に達
する。
集落表面は平担で薄く、培養初期には白色であるが、分
生胞子が形成され成熟するにつれてビーバ一(Beay
erlhue4ll)となる。分生胞子は非常に多く形
成される。集落周辺部は滑らかないしほぼ滑らか。裏面
の色はライトイエロ一(LightYellOw,.h
ue/%Ca)。拡散性色素および浸出液は出さない。
無臭。37℃での生育は遅く、10日間で10〜3バレ
イシヨ、ブドウ糖寒天培地 集落周辺部が明瞭なくもの巣状である以外は、生育状態
はほとんど麦芽汁寒天培地の場合と同じである。
注)色の表示記載は1958年、コンテイナーコーポレ
ーシヨン.オブ.アメリカ (COntainerCOrpOratiOnOfAx
erica)発行[カラー.ハーモニ一.マニユアル(
COlOrHarmOnyManuaI)の表示法に従
つた。
B顕微鏡的観察 分生胞子頭は最初球形、後に放射状に割れ込みを生じ数
本の円筒状となる。
分生胞子柄は長さ400〜1500μ、幅8〜13μ、
無色ないし淡黄色、壁は平滑で、やや厚く、厚さ1.5
〜2.0μ。頂のうは淡褐色で球形ないし亜球形で直形
30〜75μ、多くは40〜60μo梗子は単列で6〜
8×3〜4μのものが密に並んでいる。分生胞子は球形
ないし楕円形と形に幅がある。3.5〜5.0X3.0
〜3.5μ、淡黄褐色、壁は粗面。
C生育条件 生育温度は13〜40℃、生育のPHは2〜9、最適生
育温度は29〜31℃、最適生育PHは3〜5である。
上記の詳しい観察の結果、本菌はアスペルギルス属の菌
学的性状(農芸化学会誌、?、806〜809(195
3)、TheGenus八Spergi−11uss3
28〜331(1965))における黒褐色系統の分生
胞子を持つアスペルギルス.ニガ一、グループ(Asp
ergillusnigerGrOup)に属する菌と
認められ、さらにこのグループは梗子が単列か2列かに
よつて2つのグループに分られ、本菌は単列のグループ
に属する。
また梗子が単列である菌としては、アスペルギルス.ジ
ヤポニクス(AspergillusiapOnicu
s)とアスペルギルス.アクレアタス(Aspergi
llusaculeatus)が知られており、アスペ
ルギルス.ジヤポニクスは分生胞子が球形ないし亜球形
、大きさが3〜3.5μ、頂のうが15〜45μ、多く
は20〜35μであり、アスペルギルス、アクレアタス
は分生胞子が亜球形ないし楕円形、大きさが4.5〜5
X3〜3.5μ、頂のうが35〜100μ、多くは60
〜80μであつて、本菌はアスペルギルス.アクレアタ
スの菌学的性状に極めて似ており、さらにアメリカンタ
イプ.カルチヤーコレクシヨン(AmericanTy
peCultureCOllectiOn)よりアスペ
ルギルス.アクレアタスATCClO34と比較した結
果、極めてよく−致し、本菌はアスペルギルス.アクレ
アタスM4845と命名し、さらに本菌は工業技術院微
生物工業技術研究所に微生物受託番号「微工研菌寄第4
023号FERM−P,l64O23.]として申請さ
れている。本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
であつて、下記の物理、化学的性質を有する抗生物質ア
クレアシンDγ:パウリ一反応、フオーリン反応、過沃
素酸−ベンチジン反応、過マンガン酸カリウム脱色反応
に陽性、モーリツシユ反応、ビウレツト反応、キサント
プロテイン反応、トレンス反応に凝陽性、ニンヒドリン
反応、ベネデイクト反応、坂口反応、エールリツヒ反応
、塩化第2鉄反応、ドラーゲンドルフ反応、2.4−ジ
ニトロフエニルヒドラジン反応に陰性、溶剤に対する溶
解性 低級サルコールに可溶、酢酸エチルに僅かに溶解、アセ
トン、クロロホルム、n−ヘキサン、石油エーテル、水
に難溶性塩基性、酸性、中性の区別 n−ブタノール溶液からPH2〜9の水層に移動しない
ことより中性物質と推定される。
物質の色 白色 安定性 37℃、20時間、酸性および中性で安定であり、アル
タリ性で不安定。
紫外線吸収スペクトル メタノール中で測定したアクレアシンDγ(濃度40γ
/ml)の紫外??収スペクトルは、λMax278n
mlEl;=17.0に極大吸収、1%およびλMax
226nmlE=137、λMaxlCfL284nm
lEZ?=14.2にシヨルダ一を有する。
液体クロマトグラフイ一のリテンシヨンタイムRt=1
4.1分(カラム径5×500m1t1担体ポリスチレ
ン樹脂、展開溶媒0.01%トリエチルアミン含有85
%メタノール水溶液、カラム温度55ンC)であり、製
造法を挙げれば、アスペルギルス属に属する抗生物質ア
クレアシンDγ生産菌を培地に培養し、その培養物から
抗生物質アクレアシンDγを採取して新規抗生物質アク
レアシンDγを得る。
本発明における使用菌としては、上記のアスペルギルス
.アクレアタスM4845菌はその一例であつて、本菌
だけでなく、上記の物理、化学的性質を有するアクレア
シンDγ(以下単にアクレアシンDγと称す)を得るも
のであればよく、またアクレアシンDγを生産もしくは
合成し得る菌はすべて本発明において使用することがで
き、また本発明のアクレアシンDγは化学的手段を使用
して得られたものであつてもよい。
本発明を実施するに当つて、一例として挙げれば、まず
アスペルギルス属に属するアクレアシンDγ生産菌を通
常の抗生物質を生差する方法で培養する。
この際の培養の形態は液体培養でもよく、固体培養でも
よく、工業的にはアクレアシンDγ生産菌の胞子懸濁液
または1〜2日間培養した培養液を生産用培地に接種し
、深部通気攪拌培養を行なうのが有利である。培地の培
養源としては、微生物の培養に通常使用されるものが広
く使用され得る。炭素源としては同化可能な炭素化合物
であればよく、例えばブドウ糖、シヨ糖、乳糖、麦芽糖
、デンプン、デキストリン、糖蜜、グリセリンなどが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばコーン.スチープ.りカー、大豆紛、綿
実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉工キズ、酵母工キズ
、酵母、カゼイン分解物、アンモニウム塩、硝酸塩など
が利用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カル
シウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガンな
どの塩類が必要に応じて使用される。培養温度は菌が発
育しアクレアシンDγを生産する範囲内で適宜変更し得
るが、好ましくは25〜28℃である。
培養時間は条件によつて多少異なるが、通常70〜90
時間程度であつて、アクレアシンDγが最高力価に達す
る時期を見計らつて適当な時期に培養を終了すればよい
。このようにして得られたアクレアシンDγ生産菌の培
養物中において、アクレアシンDγは菌体内に大部分蓄
積され、また一部菌体外にも産出する。
またアクレアシンDγを採取するに際してはキヤンジダ
.アルビカンスまたはトリコフアイトン.アステロイデ
ス(TrichOphytOnaster一01des
)を被検菌とするカツプ法またはペーパーデイスク法に
よる生物検定により定量される。次いでこの培養物から
アクレアシンDγを採取するのであるが、菌体内に蓄積
されたアクレアシンDγを採取するのが好ましい。次に
アクレアシンDγの分離精製手段の一例を示す。すなわ
ち、アクレアシンDγ生産菌を前述の如く培養して得ら
れる培養物からアクレアシンDγを多量に含有する菌体
をドラムフイルタ一、フイルタープレスまたは遠心分離
機などで採取し、得られた湿菌体にアルコールやアセト
ンなどの親水性溶剤を加えて抽出し、得られた抽出液の
溶剤を留去し、これを水で希釈し、さらにこの希釈液に
n−プタノールや酢酸エチルなどの溶剤を加えて再抽出
し、抽出液を水洗後減圧濃縮して油状物を得る。この油
状物は活性アルミナ、シリカゲルなどを使用する吸着ま
たは分配クロマトグラフイ一に付し、その活性分画を得
、これを減圧濃縮して各種溶媒系における薄層クロマト
グラフイ一で単一スポツトを与える粉末を尋る。このよ
うにして得られるアクレアシンDγの物理、化学的性質
について、次に述べる。
2.分子量 ラスト法:1265 アミノ酸分析:(555)n (アクレアシンDγ2.6〜の加水分解物より4.8μ
MOlのスレオニンを検出した)ゲルろ過法:850±
100 (セフアデツクスLH−20(フアルマシア.フアイン
.ケミカル社製)を使用し、エタノールで展開し、分子
量既知の抗生物質を同時に展開し、その溶出位置から推
定)3.融点 159〜162位C (明瞭な融点は示さない) 4.比施光度 D 5.呈色反応 ベンチジン反応、過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性
、モーリツシユ反応、ビウレツト反応、キサントプロテ
イン反応、トレンス反応に凝陽性、ニンヒドリン反応、
ベネデイクト反応、坂口反応、エールリツヒ反応、塩化
第2鉄反応、ドラーゲンドルフ反応、2.4−ジニトロ
フエニルヒドラジン反応に陰性を示す。
6.溶剤に対する溶解性 低級アルコールに可溶、酢酸エチルに僅かに溶解、アセ
トン、クロロホルム、n−ヘキサン、石油エーテル、水
に難溶性である。
7.塩基性、酸性、中性の区別 アルカリ性で分解を起すため滴定は不可能であり、また
難溶性のため電気泳動で移動せず、その区別は定かでな
いが、そのブタノール溶液からPH2〜9の水層に移動
しないことより中性物質と推定される。
8.物質の色 白色結晶粉末 9.安定性 37゜C120時間、酸性および中性で安定である。
アルカリ性で不安定。10.紫外部吸収スペクトル メタノール中で測定したアクレアシンDγ(濃度40γ
/MOの紫外部吸収スペクトルは第1図に示す通りであ
つて、λMax278nrnlE{?:17.0に極大
吸収およびλMax226nハ14.2にシヨルダ一を
有する。
11.赤外線吸収スペタトル KBr法によるアクレアシンDrの赤外部吸収スペクト
ルは第2図に示す通りである。
12.Rf値 シリカゲル薄層クロマトグラフイ一(イーストマンコダ
ツク社製、イーストマンクロマトグラシート6060)
:クロロホルムーメタノール(10:3)でRf値0.
67、酢酸エチル−メタノール:水(20:4:1)で
Rf値0.35s酢酸エチル−n−ブタノール(3:1
)水飽和でRf値0.420(ただし、検出はキヤンジ
ダ、アルビカスを使用したバイオオートグラフイ一およ
び沃素蒸気による。
)13.液体クロマトグラフイ一によるUテンシヨンタ
イム(Rt)アクレアシンDγ5η/mlメタノール溶
液8μlを、液体クロマトグラム(カラム径5X500
71Lm1担体ポリスチレン樹脂、展開溶媒0.01%
トリエチルアミン含有85%メタノール水溶液、カラム
温度55ンC:日立643型日立製作所製使用)にチヤ
ージして、そのリテンシヨンタイム(RetentiO
ntime)は14.1分であつた。
14.加水分解物 アクレアシンDγを6N塩酸、110iCにて加水分解
せしめ、これにエーテルを加えて抽出し、その抽出液を
ガスクロマトグラムにチヤージせしめて、遊離脂肪酸の
定性検出した結果、パルミチン酸を検出した。
15.アミノ酸組成 6N塩酸、11『Cl2O時間加水分解し、ニンヒドリ
ン陽性成分を自動アミノ酸分析計(日本電子社製JLC
−5AH型分析計)にて調べた結果、第3図に示す通り
であり、スレオニンとニンヒドリン陽性成分数種を検出
した。
本発明で得られるアクレアシンDγは、その物理、化学
的性質より水難溶性ペプタイド様物質と認められ、既知
抗生物質においてメタノール中の紫外部極大吸収が27
8mμ付近を有するアタレアシンDγと類似の抗生物質
を検索すれば、ミロノジン(MyrOridinl特公
昭45−12276号)アスレスタチン(Athles
tatiO、特公昭41−1268号)、モニリン(M
Onilinl武田研究年報14,8〜10,1955
)、オリザマイシン(0ryZarr1yCin1特公
昭38−2800号)、サラマイセチン(Saramy
cetinsAnti−MicrObialagent
sandchemOtherapyll96l,436
〜444)、ウナマイシン(Unamycin,The
JOurnalOfArltibiOti一Cs,Se
rAl3,ll4〜120、1960)、ペンジサイド
(Engicidel英国特許第764198号)、ア
クレアシンD(米国特許第3978210号)が挙られ
るが、工キノギア〕ノデインB(EchinOcand
iuB.スイス国特許第568366号:A322O4
ミロリジンは水溶性塩基性物質であることから区別され
、アスレスタチンはその物理、化学的性質および生物学
的性質から近縁のものと推定されるが、アスレスタチン
の比施光度は〔α〕青−一64、(C=0.5、メタノ
ール)であり、またその紫外部陰大吸収は278nmの
他に明瞭な225nmの極大吸収を示し、さらにその元
素分析値におけるC:55.25%、H:7.50%、
N:9.41%であることより区別され、さらにモニリ
ンは塩基性核酸系物質であり、またその元素分析値にお
ける窒素執量も多いことより区別され、オリザマイシン
は酸性油状物であり、サラマイセチンは加水分解により
アスパラギン酸、シスチン、グリシンスレオニンなどを
与えるものであり、ウナマイシンは酸性ポリエン系物質
であり、ベンジサイドはモニリンと類似する核酸系物質
であることから区別され、さらにアクレアシンD1エキ
ノキヤンデインBとはその物理、化学的性質および生物
学的性質において極めて類似した構造を有する物質と推
定されるが、本発明のアクレアシンDγは液体クロマト
グラフイ一のリテンシヨンタイム14.1分値を有し、
かつその加水分解において明瞭にパルミチン酸を遊離す
る点において区別され、またテトラヘドロン・レターズ
(TetrahedrOnLetters)第46号第
4147〜4150頁(1976)にて報告されたエキ
ノキヤンデインBの構造はジヒドロキシホモチロシンを
含む環状ペプタイドの形成がみられるに対し、アタレア
シンDγのアミノ酸分析においては、その環状構造の中
にα−ヒドロキシホモチロシンが確認されることより、
アクレアシンDαとエキノキヤンデインBとは区別され
る。従つて、本発明のアタレアシンDγは従来知られて
いる物質とは異なる新規な抗生物質と認められる。次に
アクレアシンDγの生物学的性質について述べる。▲▲
Vl番1b辱v晶轟Vvrv畢尋【聯−V●J−▼▼v
測定は、各種濃度のアクレアシンDγを含有すツ −[
1′− Ai−=丁山一瞳→七φ岬〜て手l 八
戸0八l+]鹸糸状菌類については14日間、植物病
原糸状菌類については7日間培養)で培養し、増殖した
巨大集落の直径から菌苔面積を算出し、同時に併行して
行なつたアクレアシンDγ無添加の対照群の菌苔面積に
対して80%増殖抑制した濃度である。
マウスに対する急性毒性試験デオキシコール酸ナトリウ
ムを溶解補助剤として調整したアクレアシンDγ水溶液
を使用して、そのLD5Oを求めた。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に述べるが、本発明
はこれにより何んら限定されるものではないO実施例
1 グリコース2%、ポリペプトン1%、コーン.スチープ
.りカー1%、KH2PO4O.2%MgSO4O.l
%を含有する培地(PH6.5)100m1を500m
1容三角フラスコに分注し、120mC15分間加熱殺
菌し、これにアスペルギルス.アクレアタスM4845
株の斜面培養液よりの一白金耳の胞子を接種し、26℃
で48時間振盪培養を行ない、これを、120℃、15
分間加熱殺菌して得られるサツカロース1.5%、デキ
ストリン1.4%、ポリペプトン2%、コーン.スチー
ブ.りカー0.45%、KH2PO4O.2%、MgS
O4O.l%、BC−51Y(消泡剤:日本油脂社製)
よりなる培地(PH6.5)151を含有する301容
ジヤーフアーメンタ一に移植し、これを26℃、90時
間、250rp11毎分301の通気における通気攪拌
培養を行ない、培養物約151を得た。
この培養物の培養淵液および培養菌体中にアクレアシン
Dγの活性が有り、後述実施例2および実施例3の如く
してアクレアシンDγを得る。実施例 2 実施例1で得られた培養物約101を吸引淵過して湿菌
体約1kgを得た。
この湿菌体にメタノール51を加え、攪拌下2時間浸漬
抽出し、減圧ろ過してメタノール溶液を回収し、さらに
その菌体にメタノール51を加えて同様にして抽出し、
両抽出液を併合し、減圧下メタノールを留去して22の
濃縮液を得、これに水21を加え、さらにn−ブタノー
ル21を2回加えて抽出し、そのn−ブタノール層を回
収し、さらにこのn−ブタノール溶液を51の水で洗浄
後、減圧下少量の水を加えながら濃縮して暗褐色の粘稠
な濃縮液を得、これにn−ヘキサン500m1を加え、
生じた沈澱物を回収し、これを酢酸エチルで洗浄して、
アクレアシンDγ含有粗物質12.59を得た。美施例
3 上記の実施例2で得られたアクレアシンDγ含有粗物質
12.59を少量のメタノールに溶解し、これに259
シリカゲル(タルク社製)を加えて吸着させた後メタノ
ールを減圧下除去して得られるシリカゲルを、別に調整
した6009のシリカゲルを充填したカラム(内径50
11)の上に乗せ、酢酸エチルリイソプロパノール:水
(10:1.5:0.7)の展開溶媒を用いて展開せし
め、1フラクシヨン45dとして溶串して、そのフラク
シヨン廓32〜42を回収して、これを併合した後減圧
乾固して白色粉末900〜を得、これを少量のメタノー
ルに溶解し、これに29のシリカゲルを加えて吸着せし
めた後減圧乾燥し、これを、別に調整した45f!シリ
カゲル(東京化成社製)を充填したカラム(内径25m
0の上に乗せ、次いでクロロホルムリメタノール(10
:15)の展開溶媒にて展開し、1フラクシヨン59づ
つ分画してフラクシヨン/1676〜141を回収し、
これを併合し、濃縮乾固して3707Vのアクレアシン
Dγ含有物を得、次いでこれをメタノールに溶解し、こ
の101t1を高速液体クロマトグラム(日立634型
日立製作所製:カラム径5×500111担体ポリスチ
レン樹脂、展開溶媒0.01トリエチルアミン含有85
%メタノール水溶液、カラム温度55℃)にチヤージせ
しめ、そのリテンシヨンタイム14.4〜16.4分値
に分画される活性画分を得、これを繰返し行ない、その
画分を併合し、次いで減圧乾固し、これを少量のメタノ
ールに溶解し、これに酢酸エチル−n−ヘキサン(1:
1)の混合溶媒を加えて、析出する沈澱物を淵取して、
約15ηの精製アクレアシンDγを得た。
【図面の簡単な説明】
第1図はアクレアシンDγの紫外部吸収スペクトルを示
し、第2図はアクレアシンDγの赤外部吸収スペクトル
を示し、第3図はアクレアシンDγのアミノ酸分析を示
す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 下記の物理、化学的性質を有する抗性物質アクレア
    シンDγ:元素分析 C:57.55% H: 8.32% N: 8.94
    %分子量ラスト法:1265 アミノ酸分析:(555)n (アクレアシンDγ2.6mgの加水分解物より4.8
    μMolのスレオニンを検出した)融点 159〜162℃ 比施光度 〔α〕D^2^3=−46.5°(C=0.25、メタ
    ノール)呈色反応 パウリー反応、フォーリン反応、過沃素酸−ベンチジン
    反応、過マンガン酸カリウム脱色反応に陽性、モーリツ
    シユ反応、ビウレツト反応、キサントプロティン反応、
    トレンス反応に凝陽性、ニンヒドリン反応、ベネデイク
    ト反応、坂口反応、エールリツヒ反応、塩化第2鉄反応
    、ドラーゲンドルフ反応、2.4−ジニトロフェニルヒ
    ドラジン反応に陰性、溶剤に対する溶解性 低級アルコールに可溶、酢酸エチルに僅かに溶解、アセ
    トン、クロロホルム、n−ヘキサン、石油エーテル、水
    に難溶性、塩基性、酸性、中性の区別 n−ブタノール溶液からPH2〜9の水層に移動しない
    ことより中性物質と推定される。 物質の色 白色、 安定性、 37℃、20時間、酸性および中性で安定であり、アル
    カリ性で不安定、紫外線吸収スペクトル メタノール中で測定したアクレアシンDγ(濃度40γ
    /ml)の紫外線吸収スペクトルは、λmax278n
    m、E^1^%_1_c_m=17.0に極大吸収およ
    びλmax226nm、E^1^%_1_c_m=13
    7、λmax284nm、E^1^%_1_c_m=1
    4.2にショルダーを有する、液体クロマトグラフィー
    のりテンションタイムRt=14.1分(カラム径5×
    500mm、担体ポリスチレン樹脂、展開溶媒0.01
    %トリエチルアミン含有85%メタノール水溶液、カラ
    ム温度55℃)
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