JPS5928398B2 - Ｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents
Ｌ−イソロイシンの製造法Info
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- JPS5928398B2 JPS5928398B2 JP14871976A JP14871976A JPS5928398B2 JP S5928398 B2 JPS5928398 B2 JP S5928398B2 JP 14871976 A JP14871976 A JP 14871976A JP 14871976 A JP14871976 A JP 14871976A JP S5928398 B2 JPS5928398 B2 JP S5928398B2
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- aminobutyric acid
- ethanol
- culture
- inleucine
- isoleucine
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は醗酵法によるし一インロイシンの製造法に関す
る。
る。
更に詳しくは、ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付
与された、エタノール資化性微生物を、ＤＬ−α−アミ
ノ酪酸を含むエタノールを主炭素源とする培地に好気的
に培養し、この培養液よりＬ−インロイシンを採取する
方法に関し、その目的は安価な原料を用いて、工業的に
有利に、Ｌ−イソロイシンを製造することにある。
与された、エタノール資化性微生物を、ＤＬ−α−アミ
ノ酪酸を含むエタノールを主炭素源とする培地に好気的
に培養し、この培養液よりＬ−インロイシンを採取する
方法に関し、その目的は安価な原料を用いて、工業的に
有利に、Ｌ−イソロイシンを製造することにある。
Ｌ−インロイシンは必須アミノ酸として、人間及び動物
の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医薬、食品
、飼料強化剤としての需要は近年急激に増加しつつある
。
の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医薬、食品
、飼料強化剤としての需要は近年急激に増加しつつある
。
Ｌ−インロイシンの工業的製造法としては、他のアミノ
酸の場合と同様に立体異性体が存在する為に化学合成法
では、Ｌ一体のみの製造は困難であるため、主として醗
酵法による生産が行なわれている。
酸の場合と同様に立体異性体が存在する為に化学合成法
では、Ｌ一体のみの製造は困難であるため、主として醗
酵法による生産が行なわれている。
醗酵法としてはＤＬ−α−アミノ酪酸、スレオニン等の
Ｌ−インロイシンの前駆物質を使用する方法（特公昭４
３−８７０９、特公昭４０−２８８０等）と前駆物質を
特に加えない所謂直接醗酵法（特公昭３８−７０９１、
巷開昭４９−９３５８６等）がある。
Ｌ−インロイシンの前駆物質を使用する方法（特公昭４
３−８７０９、特公昭４０−２８８０等）と前駆物質を
特に加えない所謂直接醗酵法（特公昭３８−７０９１、
巷開昭４９−９３５８６等）がある。
これ等の醗酵法において使用される炭素源については、
一般に１−グルコース、フラクトース マンノース カ
ラクトース シュークロース、マルトース、クリセロー
ル、マンニトール、澱粉加水分解液、糖蜜等の炭水化物
が使用でき、また有機酸も使用できる。
一般に１−グルコース、フラクトース マンノース カ
ラクトース シュークロース、マルトース、クリセロー
ル、マンニトール、澱粉加水分解液、糖蜜等の炭水化物
が使用でき、また有機酸も使用できる。
」（特公昭３８−７０９１公報２頁左欄９〜１３行目）
とか、 又［グルコース、フラクトース、シュークロース、マル
トースの単独使用または併のほか澱粉、澱粉糖化糖、糖
蜜類、有機酸、アルコール類が用いられる。
とか、 又［グルコース、フラクトース、シュークロース、マル
トースの単独使用または併のほか澱粉、澱粉糖化糖、糖
蜜類、有機酸、アルコール類が用いられる。
」（特公昭４０−２８８０ 公報３頁左欄９〜１２行
目）とか、 或ハ１−クルコース、マルトース、シュークロース、澱
粉分解物、廃糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸、エタノー
ル、グリセリン等のアルコール類等使用菌が資化しうる
ものであれば何でもよい」（特開昭４９−９３５８４
公報４頁左欄８〜１２行目）と広く記載されている。
目）とか、 或ハ１−クルコース、マルトース、シュークロース、澱
粉分解物、廃糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸、エタノー
ル、グリセリン等のアルコール類等使用菌が資化しうる
ものであれば何でもよい」（特開昭４９−９３５８４
公報４頁左欄８〜１２行目）と広く記載されている。
然しなから実際具体的に開示されているものはグルコー
スまたは澱粉糖化液に限定されている。
スまたは澱粉糖化液に限定されている。
もつとも例外的には糖質以外の炭素源として脂肪原炭化
水素（特公昭４８−２３５５）及び芳香族化合物（特開
昭４９−４８８９０）を使用する方法が提案されている
。
水素（特公昭４８−２３５５）及び芳香族化合物（特開
昭４９−４８８９０）を使用する方法が提案されている
。
本発明者は、糖質より安価で今後共安定した供給が可能
と考えられ、さらに脂肪族炭化水素又は芳香族化合物と
比較して水溶性である点等より醗酵工学上有利である、
エタノールを主炭素源とするＬ−イソロイシンの工業的
製造法の開発を目標として鋭意研究を進め、既にブレビ
バクテリウム属に属するエタノール資化性微生物（ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３微生物受託番号
微工研菌寄第３０６８号ＦＥＲＭ−Ｐ屋３０６８が代表
菌株）を、ＤＬ−α−アミノ酪酸を含みエタノールを主
炭素源とする培地に培養し、工業的に有利にＬ−イスロ
イシンを製造する方法を発明し、特開昭５１−１３０５
９２に記載の通り出願している。
と考えられ、さらに脂肪族炭化水素又は芳香族化合物と
比較して水溶性である点等より醗酵工学上有利である、
エタノールを主炭素源とするＬ−イソロイシンの工業的
製造法の開発を目標として鋭意研究を進め、既にブレビ
バクテリウム属に属するエタノール資化性微生物（ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３微生物受託番号
微工研菌寄第３０６８号ＦＥＲＭ−Ｐ屋３０６８が代表
菌株）を、ＤＬ−α−アミノ酪酸を含みエタノールを主
炭素源とする培地に培養し、工業的に有利にＬ−イスロ
イシンを製造する方法を発明し、特開昭５１−１３０５
９２に記載の通り出願している。
この特開昭５１−１３０５９２の方法において、Ｌ−イ
ンロイシンを生成蓄積する菌株は当然ながら、ＤＬ−α
−アミノ酪酸に或程度の耐性（微耐性）を有しているこ
とが考えられるが、本願発明者は更ｌこ鋭意研究を重ね
た結果、使用する微生物に積極的にＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性を付与すること−こより、Ｌ−インロイシンの生
成蓄積量の大幅な向上を可能とすることを見出した。
ンロイシンを生成蓄積する菌株は当然ながら、ＤＬ−α
−アミノ酪酸に或程度の耐性（微耐性）を有しているこ
とが考えられるが、本願発明者は更ｌこ鋭意研究を重ね
た結果、使用する微生物に積極的にＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性を付与すること−こより、Ｌ−インロイシンの生
成蓄積量の大幅な向上を可能とすることを見出した。
其の結果ブレビバクテリウム属に属し、α−アミノ酪酸
耐性を有する、エタノール資化性微生物により、α−ア
ミノ酪酸を含有し、エタノールを主炭素源とする培地に
、著量のＬ−イソロイシンを生成蓄積させることに成功
し、工業的に特に有利なＬ−インロイシンの製造方法を
完成した。
耐性を有する、エタノール資化性微生物により、α−ア
ミノ酪酸を含有し、エタノールを主炭素源とする培地に
、著量のＬ−イソロイシンを生成蓄積させることに成功
し、工業的に特に有利なＬ−インロイシンの製造方法を
完成した。
本発明において使用するＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積
極的に付与されたエタノール資化性微生物であるＤＬ−
α−アミノ酪酸耐性変異株は、次の操作によって得られ
る。
極的に付与されたエタノール資化性微生物であるＤＬ−
α−アミノ酪酸耐性変異株は、次の操作によって得られ
る。
紫外線照射、あるいは化学的薬剤（例えばＮ−メチル−
Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン等）処理により
上記Ｌ−インロイシン生産菌株（ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３）に変異を誘起せしめた後、この
菌懸濁液をα−アミノ酪酸１０ｍ７／ｍ／含有する平板
培地（尿素０．２％、硫安０．７係、ＫＨ２ＰＯ４０，
０５係、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５係、ＭｇＳＯ４・ ７Ｈ
２００，０５％、ＮａＣ１２ｍｆ／１１ＣａＣ１２・２
Ｈ２０２ｍり／１１ ＦｅＳＯ４・７Ｈ７Ｈ２Ｏ２／ｌ
、 Ｍｎ５Ｏ，・４〜６ Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２
０２ｍｙ／ ｌ、 ビオチン ２００μｇ／ｌ、チア
ミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ＤＬ−α−アミノ酪酸１．
０係、寒天２．０％、エタノール３容量％〔滅菌後添加
〕）に、３０℃にて数日間培養し生じた大コロニーを分
離することにより、耐性変異株を得る。
Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン等）処理により
上記Ｌ−インロイシン生産菌株（ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３）に変異を誘起せしめた後、この
菌懸濁液をα−アミノ酪酸１０ｍ７／ｍ／含有する平板
培地（尿素０．２％、硫安０．７係、ＫＨ２ＰＯ４０，
０５係、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５係、ＭｇＳＯ４・ ７Ｈ
２００，０５％、ＮａＣ１２ｍｆ／１１ＣａＣ１２・２
Ｈ２０２ｍり／１１ ＦｅＳＯ４・７Ｈ７Ｈ２Ｏ２／ｌ
、 Ｍｎ５Ｏ，・４〜６ Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２
０２ｍｙ／ ｌ、 ビオチン ２００μｇ／ｌ、チア
ミン塩酸塩１００μｇ／ｌ、ＤＬ−α−アミノ酪酸１．
０係、寒天２．０％、エタノール３容量％〔滅菌後添加
〕）に、３０℃にて数日間培養し生じた大コロニーを分
離することにより、耐性変異株を得る。
代表的な耐性変異株としてはブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（以下ＭＪ −２３３−
ＡＢ−４１と記す）があり、この菌株は工業技術院微生
物工業研究所に微生物受託番号微工研菌寄第３８１２号
Ｆ”ＥＲＭ−Ｐ屋３８１２（昭和５２年１２月１６日）
として受託されている。
バムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（以下ＭＪ −２３３−
ＡＢ−４１と記す）があり、この菌株は工業技術院微生
物工業研究所に微生物受託番号微工研菌寄第３８１２号
Ｆ”ＥＲＭ−Ｐ屋３８１２（昭和５２年１２月１６日）
として受託されている。
この耐性変異株はブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（微生物受託番号 微工研菌寄第３０６８号Ｆ
Ｅ ＲＭ −Ｐ Ａ ３０６８以下ＭＪ −２３３と記
す。
２３３（微生物受託番号 微工研菌寄第３０６８号Ｆ
Ｅ ＲＭ −Ｐ Ａ ３０６８以下ＭＪ −２３３と記
す。
）よりα−アミノ酪酸耐性株として誘導されたものであ
る。
る。
なおブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の菌学
的性質と其の分類学的同定理由は次の通りである。
的性質と其の分類学的同定理由は次の通りである。
菌学的性質
■ 顕微鏡的性質
０６〜０．８ Ｘ １．ＯＸ ２．４μの短桿菌、通常
Ｖ字形の対をなし、柵状も認められる。
Ｖ字形の対をなし、柵状も認められる。
ダラム陽性、無胞子、非運動性、夾膜認められず、非抗
酸性。
酸性。
■ 培養的性質
１、肉汁寒天コロニー
円形、表面は平滑、コロニーの隆起は扁平もしくはや＼
隆起、コロニーの周縁は堂＼波状、黄色、不透明、や＼
光沢あり。
隆起、コロニーの周縁は堂＼波状、黄色、不透明、や＼
光沢あり。
２、肉汁寒天傾面
生育中程度、糸状、黄色。
３、肉汁
生育中程度、沈渣あり、濁度なし。
４ 肉汁寒天穿刺
表面によく生育、内部生育は僅かで糸状。
■ 生育条件
■、生育湛度：適渦３０〜３７℃、範囲１５〜４０°Ｃ
２、生育ｐＨ：最適ｐＨ７〜８、範囲５〜１０３、酸素
要求性：好気性 ４、アンモニウム塩の利用性：あり ５、尿素の利用性：あり ６、硝酸塩の利用性：あり ■ 生理学的性質その他 １、ゼラチンを液化しない。
要求性：好気性 ４、アンモニウム塩の利用性：あり ５、尿素の利用性：あり ６、硝酸塩の利用性：あり ■ 生理学的性質その他 １、ゼラチンを液化しない。
２、 リドマスミルク変化しない。
３、硝酸塩の還元性：陽性
４、インドールの生成：陰性
５、硫化水素の生成：陰性
６、澱粉の加水分解：陰性
７、ペプトンからアンモニアの生成：陽性８、フォーゲ
スグロスカラエル反応：陰性９、メチルレッド試験：陽
性（弱） １０、カタラーゼ：陽性 １１、ウレアーゼ：陽性 １２、炭水化物から酸の生産 グルコース、サッカロース、トレハロース、マルトース
、サリシンから酸を生成、ガスは生成しない。
スグロスカラエル反応：陰性９、メチルレッド試験：陽
性（弱） １０、カタラーゼ：陽性 １１、ウレアーゼ：陽性 １２、炭水化物から酸の生産 グルコース、サッカロース、トレハロース、マルトース
、サリシンから酸を生成、ガスは生成しない。
アラビノース、キシロース、ラクトース、ラムノース、
ラフィノース、マンニット、ズルシット、イノジット、
アトニットから酸およびガスを生成しない。
ラフィノース、マンニット、ズルシット、イノジット、
アトニットから酸およびガスを生成しない。
１３、 ビタミンの要求性：ビオチンの要求性あり。
上述の菌学的性質をもとにして、バージ−のマニュアル
・オブ・デターミナテイブ・バタテリオロジー（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａ−ｔ
ｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第７版の分類基
準および第８版に記載されている参考文献に従い公知の
菌群との異同を検討した。
・オブ・デターミナテイブ・バタテリオロジー（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａ−ｔ
ｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第７版の分類基
準および第８版に記載されている参考文献に従い公知の
菌群との異同を検討した。
本菌株はダラム陽性、無胞子、非運動性、好気性であり
、かつ検鏡観察した範囲で、すべて楕円ないし短稈形で
Ｖ字状分裂が認められる。
、かつ検鏡観察した範囲で、すべて楕円ないし短稈形で
Ｖ字状分裂が認められる。
捷だ増殖経過に伴なうダラム染色の変化、形態的変化お
よび分岐状細胞が認められない。
よび分岐状細胞が認められない。
これ等の性質を前記バージ−のマニュアル・オブ・デタ
ーミナテイプ・バクテリオロジー第７版に対比するに本
菌はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ）属に属することは明確であるが、これと同一の種
の記載はない。
ーミナテイプ・バクテリオロジー第７版に対比するに本
菌はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ）属に属することは明確であるが、これと同一の種
の記載はない。
次に本菌がアミノ酸を生産することにより、既知菌株と
の比較をグルタミン酸生産株に関する総説（層化第３６
巻第２号１４１〜１５９頁１９６２年）と対比するとブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ） と一致した。
の比較をグルタミン酸生産株に関する総説（層化第３６
巻第２号１４１〜１５９頁１９６２年）と対比するとブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ） と一致した。
従って本菌はブレビバクテリウム・フラバムト同定した
。
。
前記のＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（アミノ酪酸性株）と
其の親株であるＭＪ−２３３のα−アミノ酪酸に対する
相対生育度は次の表−１の如くである。
其の親株であるＭＪ−２３３のα−アミノ酪酸に対する
相対生育度は次の表−１の如くである。
なお係は重置部を示す。（注−１）
表中の数値は、ＤＬ−α−アミノ酪酸無添加時の生育度
０− Ｄ６１ｏ （吸光度測定：参考文献東京大学農学
部農芸化学教室実験農芸化学上巻Ｐ２１２朝倉書店（１
９７５））を１００とし、以下相対生育度を示す。
０− Ｄ６１ｏ （吸光度測定：参考文献東京大学農学
部農芸化学教室実験農芸化学上巻Ｐ２１２朝倉書店（１
９７５））を１００とし、以下相対生育度を示す。
（注−２）
使用培地組成及び培養方法
尿素０．２係、硫安０．７係、ＫＨ２ＰＯ４０，０５係
、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５チ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，
０５係、酵母エキス ０．０１％、カザミノ酸０．０１
％、Ｆｅ ＳＯ４・７ Ｈ２０２ｍｇ／ｌ、 Ｍｎ Ｓ
Ｏ４・４〜６ Ｈ２Ｏ２ｍｇ／／ｌ、ＮａＣ１２ｍｇ／
／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｈ２Ｏ２／ｌ、ＺｎＳＯ４・
７Ｈ２０２ｍＶ／ｌ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミ
ン塩酸塩１００μｇ／ｌからなる培地（ＤＬ−α−アミ
ノ酪酸は、表−１に示す量を加える）ｉｏｍ／を２４φ
犬型試験管に分注、１２０°０１０分間滅菌後、ＭＪ−
２３３−ＡＢ−４１株を各々接種し、エタノールを無菌
条件下にて０．３ｍ１（３容量係）添加し、３０°Ｃ３
日間振盪培養を行なった。
、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５チ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，
０５係、酵母エキス ０．０１％、カザミノ酸０．０１
％、Ｆｅ ＳＯ４・７ Ｈ２０２ｍｇ／ｌ、 Ｍｎ Ｓ
Ｏ４・４〜６ Ｈ２Ｏ２ｍｇ／／ｌ、ＮａＣ１２ｍｇ／
／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｈ２Ｏ２／ｌ、ＺｎＳＯ４・
７Ｈ２０２ｍＶ／ｌ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミ
ン塩酸塩１００μｇ／ｌからなる培地（ＤＬ−α−アミ
ノ酪酸は、表−１に示す量を加える）ｉｏｍ／を２４φ
犬型試験管に分注、１２０°０１０分間滅菌後、ＭＪ−
２３３−ＡＢ−４１株を各々接種し、エタノールを無菌
条件下にて０．３ｍ１（３容量係）添加し、３０°Ｃ３
日間振盪培養を行なった。
なお、本願発明において、ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を
積極的に付与されたエタノール資化性微生物であるＤＬ
−α−アミノ酪酸耐性変異株とは、ＤＬ−α−アミノ酪
酸２係を（注−２）の培地に加え、３０℃３日間振盪培
養した時の 相対 −α−ＡＢ２％添加時の生育度０．Ｄ６□。
積極的に付与されたエタノール資化性微生物であるＤＬ
−α−アミノ酪酸耐性変異株とは、ＤＬ−α−アミノ酪
酸２係を（注−２）の培地に加え、３０℃３日間振盪培
養した時の 相対 −α−ＡＢ２％添加時の生育度０．Ｄ６□。
１００
生育度−α−ＡＢ無添加時の生育度０．Ｄ６１゜が３０
以上のものと定義する。
以上のものと定義する。
（上式中のα−ＡＢはＤＬ−α−アミノ酸の略号である
。
。
）本発明の培養に使用する培地組成は、エタノールを主
炭素源とし、且ＤＬ−α−アミノ酪酸を含有するもので
あれば、窒素源無機塩は特に限定されない。
炭素源とし、且ＤＬ−α−アミノ酪酸を含有するもので
あれば、窒素源無機塩は特に限定されない。
窒素源としてはアンモニヤ、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独もしくは
混合し用いることが出来る。
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独もしくは
混合し用いることが出来る。
無機塩としては、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。
との他に菌の生育及びＬ−インロイシン生成に必要であ
れば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイ
ープリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培
地に添加し用いる。
れば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイ
ープリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培
地に添加し用いる。
培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行ない、培養
温度は２０〜４０℃好ましくは２５〜３５℃で行なう。
温度は２０〜４０℃好ましくは２５〜３５℃で行なう。
培養途中のｐＨは５〜１０好ましくは７〜８付近にて行
ない、培養液中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加し
て行なう。
ない、培養液中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加し
て行なう。
ＤＬ−α−アミノ酪酸の添加濃度は、０．１〜５重量係
置部しくは、１〜３重量係置部る。
置部しくは、１〜３重量係置部る。
培養開始時のエタノール濃度は１〜５容量係、好ましく
は２〜３容量％が適する。
は２〜３容量％が適する。
培養期間は２〜８日間、最適期間は４〜５日間を要する
。
。
培養液からのＬ−インロイシンの回収は、培養液を遠心
分離等ζこより、菌体等の除却後、公知の手法、すなわ
ちイオン交樹脂処理法あるいは、沈殿法等により容易に
行なうことが出来る。
分離等ζこより、菌体等の除却後、公知の手法、すなわ
ちイオン交樹脂処理法あるいは、沈殿法等により容易に
行なうことが出来る。
以下に実施例を示す。
なおＬ−インロイシンの定性は、ペーパークロマトグラ
ムのＲｆ値、電気泳動法の易動度、微生物定量法による
生物活性値により確認した。
ムのＲｆ値、電気泳動法の易動度、微生物定量法による
生物活性値により確認した。
定量ハ、ロイコノストック・メセンテロイデスＡＴＣＣ
８０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法により行な
った。
８０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法により行な
った。
また係と表したのは重置部を意味する。
実施例 １
前培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％
、ＫＨ２ＰＯ４０，０５係、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５係、
Ｍｇ５０４−７ Ｈ２Ｏ０，０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ
２０２ｐｐｍ、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、
Ｍｎ５０４Ｈ４〜６Ｈ２０２ｐｐｒ１１、Ｚｎ５Ｏ・７
Ｈ７Ｈ２Ｏ２ｐｐＮａＣ１２ｐｐｍ１ビオチン ２００
μｆｌ／１１．チアミン−ＨＣｌ１００μｇ／ｌ、カザ
ミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０ｍ／を２４
φ犬型試験管に分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した後
、ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性株ＭＪ−２３３−ＡＢ−４
１（相対生育度４０）を植菌し、無菌的にエタノールを
０．３ ｍｌ加え、３０℃にて２日間振盪培養を行なっ
た。
、ＫＨ２ＰＯ４０，０５係、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５係、
Ｍｇ５０４−７ Ｈ２Ｏ０，０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ
２０２ｐｐｍ、 ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、
Ｍｎ５０４Ｈ４〜６Ｈ２０２ｐｐｒ１１、Ｚｎ５Ｏ・７
Ｈ７Ｈ２Ｏ２ｐｐＮａＣ１２ｐｐｍ１ビオチン ２００
μｆｌ／１１．チアミン−ＨＣｌ１００μｇ／ｌ、カザ
ミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０ｍ／を２４
φ犬型試験管に分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した後
、ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性株ＭＪ−２３３−ＡＢ−４
１（相対生育度４０）を植菌し、無菌的にエタノールを
０．３ ｍｌ加え、３０℃にて２日間振盪培養を行なっ
た。
次に本培養培地（尿素０．４係、硫酸アンモニウム１．
４％、ＫＨ２Ｐ０．０．０５ ％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０
５％、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２Ｏ０，０５％、ＣａＣｌ２・
２Ｈ２０２ｐｐｍ、 ＦｅＳＯ４＋ ７Ｈ２０２ｐｐｍ
、 Ｍｎ５０４４４〜６ Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ、 ＺｎＳＯ
４＋ ７ Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ。
４％、ＫＨ２Ｐ０．０．０５ ％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０
５％、Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２Ｏ０，０５％、ＣａＣｌ２・
２Ｈ２０２ｐｐｍ、 ＦｅＳＯ４＋ ７Ｈ２０２ｐｐｍ
、 Ｍｎ５０４４４〜６ Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ、 ＺｎＳＯ
４＋ ７ Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ。
ＮａＣ１２ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／１１チアミン
・ＨＣｌ１００μｇ／１１ 、コーンステイープリカー
１０ｍｌ／ｌ、 ＤＬ−ａ−アミノ酪酸２％）１０
ｍｌを、２４φ大型試験管に分注、滅菌後（滅菌後ｐＨ
７，０）、前培養液を０．１ ｍｌ植菌し、無菌的にエ
タノールを０．３ ｍｌ加え、３０°Ｃにて６日間振盪
培養を行なう。
・ＨＣｌ１００μｇ／１１ 、コーンステイープリカー
１０ｍｌ／ｌ、 ＤＬ−ａ−アミノ酪酸２％）１０
ｍｌを、２４φ大型試験管に分注、滅菌後（滅菌後ｐＨ
７，０）、前培養液を０．１ ｍｌ植菌し、無菌的にエ
タノールを０．３ ｍｌ加え、３０°Ｃにて６日間振盪
培養を行なう。
エタノールは消費にともない添加する。
（この時エタノールは３容量係を越えないようにする。
また全エタノール消費量は６容量係であった。
）培養５日月にＬ−イソロイシンが培養液１４当り５．
０ｇ蓄積された。
０ｇ蓄積された。
培養液から菌体その他の不純物を除いた濾液を、強酸性
陽イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラムに通して、Ｌ−イ
ソロイシンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水
で溶出したのち、Ｌ−イソロイシン画分を濃縮し、冷エ
タノールでＬ−インロイシンの結晶を析出させ、培養液
１１当り２．８ｇの粗結晶を得た。
陽イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラムに通して、Ｌ−イ
ソロイシンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水
で溶出したのち、Ｌ−イソロイシン画分を濃縮し、冷エ
タノールでＬ−インロイシンの結晶を析出させ、培養液
１１当り２．８ｇの粗結晶を得た。
なお同条件で親株（ＭＪ−２３３）を使用した場合、培
地中のＬ−インロイシンの蓄積は培養液１１当り３．０
ｇであった。
地中のＬ−インロイシンの蓄積は培養液１１当り３．０
ｇであった。
実施例 ２
前前培養用培地（尿素０，４係、硫酸アンモニウムｉ、
４％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５
係、ＭｇＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ０，０５％、Ｎａ Ｃｌ
２ ｐｐｍ、、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０２ｐｐｍ、ＺｎＳ
Ｏ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、 Ｆｅ ＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ
２ｐｐｍ、 ＭｎＳＯ４・４〜６６Ｈ２Ｏ２ｐｐ、ビオ
チン２００ ｔｔｇ／ｌ、 チアミンＨＣｌ１００μｇ
／ｌ、カザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０
ｍ／を、２４φ大型試験管に分注、滅菌後ＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１を植菌し、無菌的にエタノールを０．３
ｍｌ添加し、３０°Ｃにて２日間振盪培養を行なう。
４％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＫＨ２ＰＯ４０，０５
係、ＭｇＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ０，０５％、Ｎａ Ｃｌ
２ ｐｐｍ、、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０２ｐｐｍ、ＺｎＳ
Ｏ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、 Ｆｅ ＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ
２ｐｐｍ、 ＭｎＳＯ４・４〜６６Ｈ２Ｏ２ｐｐ、ビオ
チン２００ ｔｔｇ／ｌ、 チアミンＨＣｌ１００μｇ
／ｌ、カザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０
ｍ／を、２４φ大型試験管に分注、滅菌後ＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１を植菌し、無菌的にエタノールを０．３
ｍｌ添加し、３０°Ｃにて２日間振盪培養を行なう。
前培養用培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４
係、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ，０，０５チ
、Ｍｇ５０４−７Ｈ２００，０５％、ＮａＣ１２ｐｐｍ
。
係、ＫＨ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯ，０，０５チ
、Ｍｇ５０４−７Ｈ２００，０５％、ＮａＣ１２ｐｐｍ
。
ＣａＣｌ２−２Ｈ２０２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ４＃ ７Ｈ２
０２ｐｐｍ１ＦｅＳ０４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、 Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６６Ｈ２Ｏ２ｐｐ、ビオチア ２００ ｔ
４／ｌ、 チアミンＨＣｌ１００μｇ／ｌ、コーンス
テープリカ１０ｍｌ／ ｌ、ＤＬ−ａ−アミノ酪酸１．
０％）５０ｍ／を、５００ｍ／容三角フラスコに分注、
滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）後、前前培養液１０ｍ／を植
菌し、無菌的にエタノールを１．５ｍ／加え、３０℃に
て１日振盪培養を行なう。
０２ｐｐｍ１ＦｅＳ０４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、 Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６６Ｈ２Ｏ２ｐｐ、ビオチア ２００ ｔ
４／ｌ、 チアミンＨＣｌ１００μｇ／ｌ、コーンス
テープリカ１０ｍｌ／ ｌ、ＤＬ−ａ−アミノ酪酸１．
０％）５０ｍ／を、５００ｍ／容三角フラスコに分注、
滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）後、前前培養液１０ｍ／を植
菌し、無菌的にエタノールを１．５ｍ／加え、３０℃に
て１日振盪培養を行なう。
本培養培地（尿素０．４係、硫酸アンモニウム１．４係
、ＫＨ２Ｐ０．０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、
Ｍｇ５０４−７ Ｈ２Ｏ０，０５％、ＮａＣ１２ｐｐｍ
、ＣａＣｌ２＋ ２Ｈ２０２ｐｐｍ、 ＺｎＳＯ４・７
Ｈ２０２ｐｐｍ。
、ＫＨ２Ｐ０．０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、
Ｍｇ５０４−７ Ｈ２Ｏ０，０５％、ＮａＣ１２ｐｐｍ
、ＣａＣｌ２＋ ２Ｈ２０２ｐｐｍ、 ＺｎＳＯ４・７
Ｈ２０２ｐｐｍ。
Ｆｅ ＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ、 Ｍｎ５０４Ｈ４
〜６Ｈ６Ｈ２Ｏ２ｐｐ ビオチン２００ ｔｔｊｊ／Ｌ
チアミン・ＨＣｌ１００ μａｌ／１１ 、コーンステ
ープリカ−１０ｍｅ／ｆＤＬ−α−アミノ酪酸２％）■
ｌを２１容ジャーファーメンタ−に入れ、滅菌（滅菌後
ｐＨ７，０）後、前培養液５０７７１／を植菌し、無菌
的にエタノールを３０ｍ１加え、通気Ｉ ＶＶＭ、攪１
８００ ｒｐｒｎ、温度３０℃ｐＨ６，５（アンモニア
水にて調整）にて培養を行なう。
〜６Ｈ６Ｈ２Ｏ２ｐｐ ビオチン２００ ｔｔｊｊ／Ｌ
チアミン・ＨＣｌ１００ μａｌ／１１ 、コーンステ
ープリカ−１０ｍｅ／ｆＤＬ−α−アミノ酪酸２％）■
ｌを２１容ジャーファーメンタ−に入れ、滅菌（滅菌後
ｐＨ７，０）後、前培養液５０７７１／を植菌し、無菌
的にエタノールを３０ｍ１加え、通気Ｉ ＶＶＭ、攪１
８００ ｒｐｒｎ、温度３０℃ｐＨ６，５（アンモニア
水にて調整）にて培養を行なう。
エタノールは消費にともない添加し培養を続ける。
培養５白目（消費全エタノール１００ｍ１）にＬ−イソ
ロイシンが培養液１１当り１１．０ｇ生成蓄積された。
ロイシンが培養液１１当り１１．０ｇ生成蓄積された。
なお同条件にて親株（ＭＪ−２３３）を培養したところ
培養液１１当り７．０ｇのＬ−インロイシンが生成蓄積
された。
培養液１１当り７．０ｇのＬ−インロイシンが生成蓄積
された。
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属に属し、ＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物で
あるＤＬ−α−アミノ酪酸耐性変異株を、ＤＬ−α−ア
ミノ酪酸を含む、エタノールを主炭素源とする培地に、
好気的ｌこ培養して、培養液中に、Ｌ−イソロイシンを
生成蓄積せしめ、この培養液よりし一インロイシンを採
取することを特徴とする、醗酵法によるＬ−イソロイシ
ンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14871976A JPS5928398B2 (ja) | 1976-12-13 | 1976-12-13 | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14871976A JPS5928398B2 (ja) | 1976-12-13 | 1976-12-13 | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5375386A JPS5375386A (en) | 1978-07-04 |
| JPS5928398B2 true JPS5928398B2 (ja) | 1984-07-12 |
Family
ID=15459059
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14871976A Expired JPS5928398B2 (ja) | 1976-12-13 | 1976-12-13 | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5928398B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09140959A (ja) * | 1995-11-22 | 1997-06-03 | Ito Hifuku Kogyo Kk | ダウン充填機およびダウンの充填方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1675327A1 (ru) * | 1986-12-24 | 1991-09-07 | Научно-Исследовательский Технологический Институт Аминокислот | Способ получени L-валина |
-
1976
- 1976-12-13 JP JP14871976A patent/JPS5928398B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09140959A (ja) * | 1995-11-22 | 1997-06-03 | Ito Hifuku Kogyo Kk | ダウン充填機およびダウンの充填方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5375386A (en) | 1978-07-04 |
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