JPS5933227A - 抗腫瘍活性物質ｒｄ−０１とその製法およびその製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロピオニバクテリウム属に嬉する微生物の函
体から得られる抗１ＩＩＩ！瘍活性を有する加熱変性デ
オキシリボ核酸ＲＤ−０１に関する。

プロピオニバクテリウム属に属する細菌が抗腫瘍作用、
アジ−パント作用等の生理活性をもつことは古くより知
られ、近年該、■菌の細胞壁骨格の分１１トとその生理
活Ａ研究が行なわれ、また一部では該細菌の菌体を臨床
的に応用する試みがなされている。

しかし、この１晟生物の菌体は種々の副作用を有してい
るのでこれらの副作用を軽減するため、主として細胞壁
から活性物質を分離しようとする試みがなされて来た。

細胞壁由来のｌ重性物質の例としては上述の泊旧１ｉＷ
壁骨格や細胞壁から調製した高分子ムコペプチド等が挙
げられるが、これらのものも抗腫瘍活性の商いものは副
作用も強く、副作用の弱いものは抗腫瘍活性が必ずしも
高くないという欠点を有する。

先に本発明者らは結核菌から得られる抗腫瘍活性物質に
ついて神々検討した結果、結核菌を破砕して得られる無
線ｊ胞抽出液から分離された加熱変性デオキシリボ核酸
が宿主介在性の強力な抗ｒＩＩ！ｓ活性を有し、かつ毒
性および抗原性が極めて低いことを初めて見い出し特許
（特・、Ｈ，・：ｉ昭５６−２　’、う（５１ｉ　９　
）を１旧顧した。

さらに、本発明にらはプロピオンバクテリウノ、属に属
する細菌の菌体抽出物についてもｔｔ［規”を抗腫′瘍
活性物質を見い出ずべく、結核１岩の経恢に基づいて抗
腫瘍活性物′１イ↓の検索を鋭意性な−〕だ結果、プロ
ピオンバクテリウノ・鴇の；１ｉｌｌｌ　閑から結核菌
の用台に用いたと同１求の方法で調製した加熱変性デオ
キシリボ核酸も尚い抗腫瘍活性を示し、かつ１１１件が
極めて低く、発熱性や抗原性がほとんど／′ｉ：いこと
を確認し、本発明物質を加熱変、、、−１デオキ／リホ
核酸ＲＤ−０１と命名し本発明を完成するに十つノ・二
。

以下、本発明物質を単に加熱変性デオキシリボ核酸、変
性デオキシリボ核酸、デオキシリボ核酸めるいは本物質
と称することか多い。本発明によって得られるデオキシ
リポ核ｒ’ｉ！２は結核１眉由来の該物質と同様に宿主
介在性の強い抗腫ノら活性をイ〕し、その作用はこれ−
までに知らｇている動物細１睦由来のデオキシリポ核敵
寺の腫瘍細１１ｉ！！への直接障害作用に基づく抗１厘
賜作用（５ｃｉｅｎｃｅ、　１４’４．９９７．１９６
５゜Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　？フ、　　
２３４２．　１９６７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏ
ｆｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　
５ｃｉｅｎｃｅ　ｆｉｌ、　　２０７．　１９６８）に
比べはるかに９３ｉ力である。

本発明物質とその製造法およびその宿主介在性の強力な
抗ｊ匝ノ（４粘性は本発明者らによって辺めて明らかに
されたものである。

すなわち本発明は、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せ
しめてなる加熱変性デオキシリボ核酸Ｒ１）−（月及び
そ（〕）塩に関し、更に詳細には、プロピオニバクテリ
ウム属ｊＭＩＩ　菌より得られる抗腫瘍活性を有する７
ＪＩ　Ｉ：！〜′Ｊ＆性デオキシ゛リポ核酸ＲＤ−０１
に関し、そして、その製法及び抗腫瘍剤に関するもので
ある。

さらに本発明はプロピオニバクテリウム属細菌破砕物を
遠心分周１トシて得られる核酸画分を加熱することを特
徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸
ＲＤ−０１の製造法に関するものである。

さらに本発明は核酸画分の分離法として無細胞抽出液に
核敵凝果剤を加え、得られる沈澱の可溶画ノ汁から分１
・１１トすることを特徴とする１゛む匣４Ｉ−Ｓ活性を
有する加熱変性デオキシリボ核酸ＲＤ−０１の４！（浩
法（Ｃ関するものである。

さらに＋：発明はＩ亥１賓１曲分（０分１４１を法と［
７て）、１（ね、１川１１１ツ抽出液に核酸凝來剤を加
え、ｍられる１七噌を水または塩類性を夜に対して透析
し／ヒ稜加熱し、そのＩ−清から分離４−ることを’ｌ
’４Ｊ゛漱とする抗）１１す１．．３活性を有する加熱
変性デオキシリボ核酸Ｒｒ）−０１の製造法に関するも
のである。

さらに本発明は、デオキシリボ核酸に惜有物ケ約８０〜
１２０Ｃに加熱して、　抗原Ｊ４性を有せしめることを
特徴と「るＰＡ’、　ＩＭｔ　＃Ｇ、！活性を南する力
１巨ノー変・（１１−デオキシリポ核ｊ設ＲＤ−Ｊｌｌ
Ｏオ°１造法である。

さらに本発明は、刈１熱変ｉｔｔによって抗腫瘍活性を
有せしめてなる加熱変性デオキシリボ核酸ＲＤ−（目を
有効成分とする抗腫瘍剤で、ねる。

本発明に用いられる微生？吻は、プロピオニ・・クテリ
ウム属に属する。１．Ｉ１１繭であるが、りｆ適なもの
古シテハ、バーシーズ、マニュアルｅオブーテイタミネ
イティブ・バクテリオロジー第８版、第６３４内〜６旧
白に、ｊｌ：載されている公知のグロピオニノくルＴＣ
０２ｔり７’Ｂ ａｖ　ｉ　痛ｍ１％−ど−ノノ様けられるが、やはり全
菌体と１〜て抗１１１ｊ！瘍活件が（ｃ４＋　＜、・か
つ病原性の弱い菌株が好ましい。

本発明に、Ｉっ・ける」−６白眉株の培養は通常（１）
嫌気性培’１１法を用Ｉ＾ることが出来るし、１．珂体
の破砕方法４ｒ通常の方法（′（二従ってよい。たとえ
ば、窒素源として肉エキス、ペプトン、フイトン、酵旬
エキス省・、炭素源としてはグルコース青、還元９１ｊ
と１．ては塩ハシスティン、チオグリコール酸ナトリウ
ム等、さらにリンＬ′１６？カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム等を添加した培地を用いるのが好ま
しい。

培養は３０〜４０℃で２〜１５日間位静置するのが好ま
しい。１４〕られた＋１１体は遠心分離等によシ果萌し
、生理食鳴水等により洗浄した後、そのま５次の１染作
（・こイ・？す；じ・、・（）シ＜は四す、ｔｌ、ば、
フェノールあるいは弱い加熱殺菌をした後、次のＪ・ｔ
ｈ作に付してもよい。

得られた国体は、水好゛ま［７くは適当な緩山液と九分
混合し、水冷ｉ〜ながらダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌ
ｌ）　　あるいはフレ７チ（Ｆｒｅｎｃｈ　）　　プレ
、＜ｆ（どによ１ｌｌｌ菌体を破砕して破１ｉ％閑体１
１ｔｈ蜀液を・（Ｈる。このｊ背濁液を遠心して無細胞
抽出液をイｉ）るが、このときの遠心分離の条件は、未
破砕菌体９部分的に破砕された菌体、細胞壁画分等を沈
渣として除去出来る通常の遠心力で良く、たとえば５，
０００　ｘｇ　。

１０分間以上遠心してその上清音取得する。

本発明におけるバエ１１ｊ代抽出液とは、岐砕菌１１・
１°１甲７扁液から遠心分離により、未破砕菌体、部分
的に破砕された１；１１体、細胞壁画分前を出来るｌビ
は除いた両分のことである。

無細胞抽出液から核酸画分をイ４ｊるにｒＪ：、；１．
ｆｉｌ浦１１１血抽出液を１ば接有機討剤処理して核酸
１＋、＋！ｉ分を得る方法（例えばマーマー（Ｍａｒｍ
ｕｒ　）　　法やフェノール法等、以下直接有機溶剤法
と称する）と無δ＋ＩＩＩ　、ｉｅ　４１１１出、夜に
核酸ｉ、Ｎｆ：宋削を加えて核酸画分を含む沈澱をイ）
Ｉる方法が適用「１丁能である。

面接有磯溶剤法ｉ、１小量規模（通常１７以下）の本発
明物質をイ！Ｉるのに適した方法であり、得られるｒ亥
酸画分（以ドＲ，Ｄ核酸画分と称する）は、通常抗原性
を有する多糖や蛋白等の不純物を含有するので密度勾配
Ｉ・（（心法等により不純物を出来るだけ除去しだ後（
ｉＩｌっれる精製デオキシリポ核ｒ−１！２画分を加熱
処理して本発明物質を得るか、あるいはＲＤ核酸画分を
−まず加熱処理した後遠心法や沈１殿法等によって不（
＋１物を除去して本発明物質を得る。

Ｒｒ）核酸画分や精製デオキシリボ核酸画分の加熱処理
条件は、後述の調製法と共通するので、後に詳しく述べ
る。

本発明に於ける加熱の目的は本発明物質の分子扉分布を
調節し、２本鎖構造を１本鎖構造にかえるとともに不純
物の除去効率音高め、製剤化を容易にし、片時の溶ノ弄
性を高め、抗腫瘍活性が高く、かつ、毒性、副作用の低
い本発明物質を得ることである。

うｊ（輸１１１胞抽出）夜（こ法線１疑果剤を加えて核
ｉ”ｉ７画分を沈Ｉ殿させる方法ｔよ、核酸］［１１げ
を誰縮出来るので大竹規模の本発明物質を得るの（′こ
適した方法である。

この方法において用いらＩ’Ｌる核酸、）、不東削は通
常の核ｆ’！！！ｉ疑東序］のいｉ′″れも１史月ｉｉ
＋丁Ｔ止であるが、ｆ父（リニ１−桟で用いた凝集ｉｌ
ｌを簡便に除去出来もという意味で、低分子凝集へ１１
が好ましい。その好適な１夕１１．、ｌ−しては、塩化
力ルンウム、１ｈ化マンガン、１化マグネシウム、硫酸
アルミニウノ・等の多価金属陽イオンあるいはストレフ
トマイシン 等の水溶性塩基性抗生物質−またはその地等が禁けられ
る。核；！攻ｒ’ｉｅ（：′県剤の１史月］昂はそυイ
沖力１により，１１割官選択出来るが、たとえば多価金
属陽イオンでは０、１〜１０％、好−止シ＜は０１〜３
％、抗生物ノｎｆＨＯ．ｏ］　〜１０″Ｘ）、　好−士
しく　（ｌ：ｌ：　０．　１〜ｒ％を抽出液に対して使
用するのが適当である。

操作としては無，ｐ＋＋＋　１１＝抽出液に核酸凝集剤
を加え、生成した沈澱を遠心あるいはｐ過等の方法に」
：り分目ｔして核酸画分を含Ｉ’Ｆ　；ｊ悸濁液を得る
。こり：ｉ？ｊ　ｒｉｉｉｉ液より核酸７ｊ＆果剤を除
くには透析が適当である。

その際に便用４−ろ水性溶媒は、核酸凝集剤の除去効率
を高めるために適当なイオン強度を有する、ｐＨが中性
附近の叉衝液が好ましい。たとえば好適なものとしてｉ
：　０．　１〜Ｉ　Ｍ　ＮａＣＱ含有リン酸緩衝液，０
．１〜ＩＭＫＣＱクエン酸緩衝液，０１〜１ＭＮａＣＱ
．含有炭酸ナトリウム緩衝液，０．１〜１ＭＮａＣρ含
有トリス塩酸ｔｉ衝ン（＋等が挙げられる。

核酸画分を含む懸濁液を含塩緩衝液に対して透析した後
便すればさらに水に対して透析して塩類を除く。透析済
みの核酸画分を含む懸濁液を以下ＲＮ−１画分と称する
。ＲＮ−１画分を得る操作は、全て冷却下で行ない、核
酸画分の不必要な分解、変性を防止する。冷却温度は０
ないし１０℃が好ましい。

ＲＮ−１画分から本発明物質を得るには２つの方法が可
能である。１つの方法はＲＮ−１画分から核酸画分を分
離した後、得られた核酸画分を加熱して本発明物質を得
る方法であり、もう一つの方法はＲＮ−１画分を加熱処
理した後本発明物質を分離する方法である。

前者の方法においては、外ず、Ｒ　ＩＪ−１　＋ｌｌ＋
ｉ　汗の誂肩物浸度と水性溶媒のｐＨや塩濃度前を調節
［７だ仮、遠心分１４１［または、ｐ過等の方法により
ＲＮ−１画分からデオキシリポ咳ｊ雲を含む可溶画分を
分Ｐｉｌｆする。

この可溶画分から沈澱法あるいはカラノ・クロマト法あ
るいは電気泳動法さらに、要すればリボヌクレアーゼ処
理法等の方法によりデオキシリボ核酸画分を分離して、
加熱処理すれば本発明物′ぼが−１けられる。ＲＮ−１
画分から可溶画分を分ｌ／ｉｆＦする際の好適なＲＮ−
１画分の濃度は１〜１５ｍｇ／ｍＱである。水性溶媒の
ｐＨは中性附近が好ましく、通常厳めるいは塩基である
いは緩衝液でｐＨ　５から８の範囲に調節する。水性溶
媒のイオン強度（は、遠心分離等の際の沈澱の除去効率
に影響を与え、通常０、１以上が好ましく、要すれば食
塩あるい（は塩化カリウム等を加えてイオン強度を調節
しても良い。

このように調節したＲＮ−１画分を通常２０，旧）Ｏｘ
ｆＺで５分間以上遠心分離すると、核酸画分を含む清澄
な可溶画分がその上清として得られる。この上清からス
トレプトマイシンあるいは塩化マンガンあるいはセチル
トリメチルアンモニウムプロミド等を用いる沈澱法ある
いはセファローズ等を用いるカラムクロマト法あるいは
塩化ビニル−酢「）タビニル共重汁体等盆用いる電気泳
動法等によりチオキシリボ核酸画分を分離することが出
来る。

以上の操作は全−ＣＯ〜１０℃で行うのが好ましい。

このようにしてイｉ＋られたデオキシリボ核酸画分をさ
らに、リボヌクレアーゼ処理後加熱処理するか、あるい
は加熱処理後リボヌクレアーゼ処理すれば精製された本
発明物質が得られるが、加熱条件は後者の方法と共通す
るので後に詳述する。

後者の方法では、捷ずＲＮ−１画分を加熱するが、この
加熱操作は核酸画分の適切な変性を行なうことおよび不
純物’（１１性させ以後の本発明物質の分離操作を容易
にすることを目的とする。加熱条件は後に示すように本
発明物質の抗ｊ厘痺活性にも密接に関連しており、適切
な条件範囲が存在する。

加熱の要因としては、加熱時の溶質の濃度、水性溶媒の
種類とｐＨ，イオン強度、加熱温度、加熱時間が挙げら
れ、適切な条件範囲は次のとおりで・りる。

溶質の濃度は１〜１５ｍｆ／ｍＱが刺切である。

水性溶媒が水あるいは食塩等の蕗塩水（イオン強度が０
．１〜０５）の場合は８０℃ないし１２０℃で５分間な
いし１２０分間、　水性溶媒が緩衝１筺の場合は緩衝液
のｐＨによって大きく影響され、中１９＝附近のｐＨで
は加熱温度は高く、加熱時間も長くし、酸性あるいはア
ルカリ性では、加熱温度は低く、加熱時間も短くするの
が好ましい。

ｌ１ｌｌＪえば水ｉ生浴媒が強順性、１するいは強アル
カリ四の場合は、加熱温度を８０〜１２（１’ｃに限定
するものではなく、室温伺近でも充分である。−まだ、
水性溶媒がアルカリ性の場合はｐｆ（、加熱温度および
時間を適宜選択すれば本発明物質からリボ核酸を除去し
うる点で有利な場合もある。

以上のごとく、適切な加熱−Ｉξ件を選ぶことにより後
に示すように本発明の目的とする抗腫“Ｉ９活性が旨く
、かつ抗原性の低い加熱変性デオキシリボ核酸を含む懸
濁液を得ることが出来る。

ここに示した加熱条件は本発明物質調！ｉ１２法の■１
沙な要因で、りり、本明細書で示したいずれの調製法に
も適用＋１−Ｊ能である。

このようにしてＲＮ−１画分を加熱した後冷却し、腎石
または濾過前の方法により沈府を除けば、本発明′物質
を含む清澄な溶液を得る。この溶液から本発明物質を分
子ｒｉ１１するのは容易であり、通常の方法によって可
能である。その適切な例としては、核収凝東剤による沈
１殿法、有機溶媒による分画法、カラムクロマト法ある
いは電気泳動法等とりボヌクレアーゼ処ユ１ｊ法と、の
組み合わせが挙げらｔ′Ｌる。

これらの方法に王って得られた本発明物質は、その゛ま
ま製剤のｊ駅体として使用するか、あるいは凍結乾燥し
て乾燥粉末にすることも可能である。

本発明物質中のデオキシリボ核酸の分子量は約３万から
１００万の間に分布し、グアニン、シトシン（ＧＣ，）
含量は約６６％である。本発明物質の転移温度Ｔｍは、
明確な値を示さずさらに、ヒドロキシアパタイトのカラ
ムクロマトグラフィーにより分析すると本発明！Ｉ’ａ
貿が変性さｎた１本鎖のデオキシリボ核酸であることを
意味する。

本明細１坪に示した方法によって得ら扛る物汀のなかに
は、加熱変性チオキシリボ核酸以外に、微重のリボ核酸
、蛋白２．糖等をぎむものもあ１が、いずれも混入物と
ｄえる程度であり、要すればこれら（ｄびらに梢吸して
除くことが出来る。

次に実施例１において砧刺して得られたＩｎ）−ＡＩに
ついて理化学的性質を調べ、その結果を示す。

なお、実施例２で得られたＲＤ−Ａ２の精製品について
も同様の理化学的性質を示している。

本物質、加熱変性デオキシリボ核酸ＲＤ−ＡＩの理化学
的性質（Ｎａ塩による） （１）元素分析（％）　：　Ｃ：　２６．１８〜：３１
３１　Ｈ：４．（１２〜４９８Ｎ：］２．１１〜１３．
８９　Ｐ：８．１３〜９．１８Ｎａ　：　３．０２〜４
．２８ （２）分子量：３万〜１００万 分子−一分布図は第１図に示す辿り。

（３）−点：明確な融点を示さない。

（４）紫外線吸収スペクトル：第２図（・（示す通り。

（５）赤外側吸収スペクトル：第３図に示す１１ｉ１す
。

（６）溶剤に対する溶解性：水に可溶、エタノール、メ
タ、ノール、５−１−チル、アセトンニ不溶。

（７）　　呈色反１心 Ａ）オルシノール反応Ｓ　ＳＴＳ法により分画したＲＮ
Ａ画分に対して１雲１生。

Ｂ）ジフェニルアミン反応：　ｓ　′ｒ　ｓ法により分
画したＤＮＡ画分に対してｉｉ、！　ｉ生。

Ｃ）ニンヒドリン反応：本物質１０　ｔｔｆｌ／ｍρの
濃゛度で陰性。

１））　　アンスロン反応：本物質１０１１ｆ／／ｍ、
Ｑ、の濃度で陰性。

（８）塩基性、１°１り付、中性の区別二本物質の水溶
液のｐＨは６．５〜７．５である。

（９）物質の色：白色粉末 ００）特　性：加熱処理によって可溶性を付与するとと
もに、高腫瘍活性を有せしめ、かつ変性および抗原性が
極めて低くなっている。

（１１）　　塩基組成図）ニゲアニン：３３．４　　　
アデニン：１７．２シトシン：３２．５　　チミ　／：
ｔ６．ｃ＋（方法は化学分析による） ＯＱ　　酵素処理二本物質をデオキクリボヌクレアーゼ
ｌ　　（’ＤＮａｓｅ　ｌ　）で処理すると抗＋１ｔｔ
ｔ　ＪＳｉ　四がなくなるが、リボノぞレアーゼＴ２（
ＲＮａｓｅ　′ｒ２　）の処理では抗腫瘍性は変化しな
い。

（旧　ヒドロキシアバタイ］・のカラムクロマトグラフ
ィーにより分析すると１本領構；告である。

（１・０　　転移幅１止（′ｒｍ）　　：　測星された
融１１」イ曲線からは明確な転移温度Ｔｍは求めらｒし
ない。

本発明物質が示す抗＋＋ＩＪｉ瘍活性の本体が、加熱変
性デオキシリボ核酸であることは、本発明物質をデオキ
シリポ俵取分Ｗ４酵素（ＤＮａｓｅ　ｌ　）で処理する
と抗腫瘍活性がなくなること、本発明物を勺をリボ核酸
分解酵素（ＲＮａｓｅＴ、　）で処理しても抗ｑ「ｌｊ
　４１；Ｉｌ活性が変化しないことから明らかである。

本発明物質を抗１ｍ　４易＋’ｉ’ｌとして用いる場合
は、注射剤の型で用いるので好ましい。本発明′吻′μ
ｆは、単独でめるいは通常用いら：／’Ｌる添加剤、賦
へ１１剤を加えて液剤、あるいは同時溶解型の凍結乾燥
製ｒｆすとして適用可能である。

また本発明物質は水中油滴η、すあるいは油中水滴型の
エマルジョンとしても適用可能である。

本発明物質の１史用針、投与経路は適宜選択さＬしるが
１更用叶は体！ｌｉ　ｋｇあたり０．０１ないし１００
ｍ１ｉ＋が好ましく、投与経路は皮肉、皮下、静脈内、
腹ＩＫ内投与やｎａ　＋＋（−！内股与が行なわれる。

本発明物質はモルモットやマウスの独々の腫瘍系に対し
て萬い抗腫瘍作用を示す。例えばマウスの同系腫瘍であ
るＩＭＣ力ルチノーマに対して本発明物質は生理食塩液
に溶解した型で）凍傷細胞と接触させた後、動物体内に
移植することによる腫瘍の生着抑制（ザブレノジョン活
性）あるいは動物体内に生着しノζ腫瘍組織内に投与す
ることによる抗腫瘍活性（リグレッション活性）におい
て原料である菌体と同等か、あるいはそれよりも高い抗
腫瘍活性をノドした。また、モルモットの同系腫瘍であ
るライン１０に対しては、油中水滴型の本発明物質の腫
瘍内投与により、本発明物質は、原発腫瘍の増殖抑制だ
Ｑブでなく、所属リンパ節への腫瘍の転移も抑制した。

さらに本発明物質は、生理爬塩液に溶解して１腫瘍組織
とは異る場所に投与することによってもＩＦ、ＩＣカル
テ７ノーマに対して抗ＩＩＩＥ　Ｊ弓作用を７］ズした
。

本発明物質の急性活性はマウスに対する静１派内投与に
よる体重ｋｇめたりの５０％致死社ＬＤ５ｏ値が５００
＋ｎ’／以−ヒでめることから、極めて低い。

・また本発明物質の；η二１京性についても、モルモッ
トを用いたアナフイラギシー試験、　　、ｉ１％　９１
Ｆ、　７１ｉ１１アレルギー試１検によって、本発明・
物質が極めて安全であうことが判明した。

その肋木発明物質の発熱性、疼痛性、起炎性。

肉芽形成性等も原料１１体に比較し、換めて低く、Ｑ常
の医薬としての適用には問題にならない程鹿であること
が、神々の試験により判明した。

む揮の腫瘍細胞に対する本発明′物質のｎｌｌ　Ｉｌ’
ｃ！噌’ｔＨ（Ｘ抑制作用を調べたところ、本発明物質
は、はとんど＋１ｌｉｌ　Ｊｌｆ！増殖抑制作用を示さ
なかった。このことから本発明物質（は宿主の免疫反応
を弁して抗腫ｊ易作用を示すと考えられるので本発明物
質の免疫学的活性を個々検討した。その結果、本発明物
質、はマウスのキラーＴ細胞噌強効果、およびマクロフ
ァージ宿性化作用の他にナチ＝ラルキラー細１１ｔｉ　
７１！：・１・−（。

増強作用を小（２・・几 以−１−の神々の知見から本発明物質は抗胛瘍へ１１と
して極めて有用なものと考えら江る。

以下に本発明物Ｉ！ｆＩ／）製造法を実情例により、丑
だ、本発明物′Ｃ′↓のＩＡ：腫瘍剤としての有用性を
試（検測により示［。

実施例１　ストレプトマイシンを用いて得ら罰る懸濁１
１ケの可溶両分から本発明′物質の製造・・−トインフ
ユジョン陪地（栄研化学製）　　２５７グルコース　　
　　　　　　　５７ チオグリコール＋！１ケナトリウム　　　０．５ｇ水を
加えてＩ　、Ｑにし、ｐＨ６，８〜７．２に調節する。

プロピオニバクテリウム・アビドラム （Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ　ａｖｉｄｕ
ｍ）　　ＡＴＣＣ２５５７７を上記組成の培地を含むゴ
ム栓付のルーピンに植菌し、ルーピン内の空気を窒素で
置換した佼３７゛Ｃで５日間静置培養した。培養終了後
フェノールを最終濃度で５％になるように培養物に冷加
し２日間室温に放置した。得られた培養物から：眉体を
１信心分１１１Ｆにより！、１すめ、生理ｔ”Ｅ　４１
暫水で；３回洗浄し湿田体を得；欠。この湿菌体１　ｆ
ｌ　（ｌ　ｆｌをＩｏｏｍ（！の１０ｍ〜・■リン酸緩
Ｍｆｉ　Ｉイ（（ｐｒ（７，ｏ）　　に！ｌＷｉ　＋１
ｉｊ　Ｌ　ｆｃ　Ｖ＆、水冷下ダイノミルで破砕し、２
　ｏ、ｏ旧）ｘｆで２０分間ｊ・１重心分離して上清の
ノ、１１．’、＋ｔ：ｌＩＩ　ＩＩｉ’２抽出詠をｒ４
Ｉた。この萌出液にストレプトマイシン硫酸１語を終４
度が０．３％′になるように冷加し、充分攪拌した後、
・Ｉ　’ＣＩ’−・晩装置し、生成した沈澱を１重心分
渾により集、Ｙ）、０、５　Ｍ　ＮａＣＱ含有１０　ｍ
Ｍリン酸Ｆｊ？　”ｌ’ｆｉｒ液（ｐｆｌ　７．　（１
）に懸濁した。このＷ５ｊ　７＠　ｉ夜をセロバンチ＝
−−ブｉ／（詰めて同じ緩：Ｉｔｉ　鹿に対して透析し
、続いて蒸留水に対してａ’１ｌｒＬで核ｉ＋１２ｕｎ
ｉ分を含む懸濁イＫ　１８　（１ｍＱ。

（以ドこの懸濁液をＲＮ−１と称する）をイまた。

この懸濁液の固形物濃度は３．５　ｍ　ｆ　／　、＋１
であり、湿菌体あたり０．６３％の収率であった。

次にＲＮ＝１全計１・てＮａＣＪ！　受路濃度が０．９
％になるように加えて攪拌し、加慈変任処理（＋　００
　’Ｃ。

６０分）した汝、２０．ｔ）　ＯＯｘｆ、２　ｔ＋分間
冷心分・１１１して上清を丙だ。この」−清にＮａＣＱ
を最終濃度か０．４Ｍになるように加えて溶解した弦、
セチルトリメチルアンモニウノ・プロミド（以下このも
のをＣ′ＦＡ１３と称−ｊ−０宋シｊ（化成会社製）を
最終濃度が０２％（Ｗ／Ｖ）になるように加えて充分攪
拌し、侶渦に、３０分間静的”した。生成した沈澱ル：
Ｉ・（（心分離にＪ二り果め、Ｉ　Ａｉ　ＮａＣＱ液４
０ｍＲに溶１９イした波、苛ｉｉｉ：　ノクロロホルム
ーイソアミルアルコール（２１１：１）の混液？、加え
て振盪、遠心分離して水層部分を得た。この操作をさら
に２回くり返した後、肖られた水層に；３倍量の９９．
５％エタノールを加えて攪拌し、４゛Ｃで一晩静置した
。生成した沈澱を遠心分１輔により果め、蒸留水３０＋
ｎｆｌに溶ｊ・ｊイした後、蒸留水に対して透析し、精
製核酸溶液を得た。この溶液をＩ　Ｎ　Ｎａ１ｌ（で中
ｆ［１ｆｉ、　凍結乾燥して乾燥標品１４５　＋ｎｆ／
　ｆ　、１４すだ。氷晶９０ｍ７を０．０５　Ｍ酢ｌ１
１２２１ｊＨｊ７（ｔ　（ｐＨ７１，５）　　１０　ｍ
ｆｌに溶解した後、同緩衝液２ｍρに溶１９イしたりボ
ヌクレアーゼＴ２　（三共会仕製）２００Ｕを冷加し、
３７℃で２２時間反応させた。反応Ｈ’ｌｙ、　ｊｒこ
等計のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：　
］）の混液を加えて振盪後、遠心分離して水層部分を得
た。この操作をさらにくり返した伎、水１曽の全・）；
゛を・、あらかじめ（、）、　５　ｈｌ炭、１ｇ水素ア
ンモニウム１夜で洗浄し／こｒη２．５　ｃｍ、　ｊ〈
さ９０ｃｍの七フ了デノクスＧ−１００（Ｐｈａｒｒｎ
ａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　′ｆｌ：　裂
）カジノ・に負萌し、回、夜で溶出した佼、最初に溶出
する画分としてデオキシリボ核酸を含む両分を得た。こ
の画分を水（で利して可、ｔ７Ｔ′シた後、Ｎａ０Ｈ−
Ｃ中和後、凍結１し４燥して本発明物’ｇｆ　６７　ｍ
ｆｌを得た。以］・”このものをｒ＜Ｄ−ＡＩと称す。

ＲＤ−ＡＩのデオキシリボ核酸の陰ｉｉｉ：　（純度）
は５％過塩素酸で加水分角イした・敞、ジフェニルアミ
ン法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　　６
２．３１５．　　［１５６）により定量し７だ時９８．
８：釜であ−っだ。

実姉例２　マーマー法による本発明物質の装造：プロビ
オニバクテリウム赤グラニコロサ１１（Ｐｒｏｐｉｏｎ
ｉｌ）ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｒａｎｕｌｏｓａｍ）ＡＴ
ＣＣ２５５ｆｉ７１を実施例１の培地で同様の培ｉＩト
条件によって刊また湿（看１本２５０７を７倍せの１　
（ｌ　ｒｒ１Ｍリン１゛投”：　ｆ！１”Ｉ　’＋夜に
懸濁した後氷冷下ダイノミルで破砕し、２０．■）ＯＸ
７で２０分間遠心して無細胞抽出液をイ好た。　こ・ノ
）抽出、夜から一７−マー（へＩａｒｍｕｒ、　　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ、□、Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ＋＋
ｌｏｇｙ　３．２０８．１９６］　）　　法によりト且
デオキンリボ核酸画分を得だ。この画分を０．９′Ｘ；
食塩液に対して透析した後、１００℃、００分加熱した
。冷却液蒸ＷＩ水に対して透析、中１１・凌凍結乾燥し
て（また標品５５ｍ７に対し、実施例１と同１’＞Ｑの
スケールでリボヌクレアーゼ゛ｒ２処理を行ない、梢製
し、本発明物’Ｉ’（３＋　ｍグを得だ。以下このもの
’４ＨＲＤ−Ａ２と称す。ＲＤ−Ａ２のチオキシリポ核
ｒ・ｐ含鼠、け実殉例Ｉと同様の方法で分析すると９８
．１％そあった。

実施例 ＲＤ−ＡＩ、１０　、ｎｆｌ　全１０　ｍ、ＱのＰＲＳ
マイ°ナス液（栄研化学社製）に浴博し、ニュクリボア
ーＮ。

２０　（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ社製）　を用いて無菌１／
”　過Ｌ　タ。

得られたＰ液を１．５１１１（！ずつバイアル瓶に無菌
的に分注して本発明物質の液剤を得た。

実ｈｍ例４　凍結乾燥製剤 ＲＤ−ＡＩ、１０ｍ７を１０ｒｒＪの注射用蒸留水に溶
解し、次に５００ｍ？のマニトールを加えて溶解し７ｃ
）ｂ、ニコークリボア−ＮＯ２０を月」いて５＃、Ｆ、
　１肉Ｆ’　Ａ　Ｉ。

ンこ。イ４Ｓら、劃た沢イ５　Ｈ’ｚ）　１．５　ｔｎ
Ｑ　ｉ″ツ；’！ｔ１．ｌ貞１′白（（（バイアル瓶に
分注した後、凍結乾燥して本発明物ｒ↓ｄ）凍結乾燥剤
を得だ。

実姉１夕ＩＪ　、５　　エマルジョンｉ’１ｌｌＲＤ−
ＡＩ、４　ｍＷを１１．５ｍ（ｊの牛ｊψｆ”ＪＥ　”
’５Ａ液（・（溶１１ｊｊｒし、次にドラケオール６−
ＶＲ（Ｄｒａｋｅｎｌ　６−ＶＲ。

Ｐｅｎ５ｉｌｖａｎｉａ　Ｒｅｔｉｈｉｎｑ　Ｃｏｎ〕
ｐａｎｙ製）とアラ７−ルＡ　（Ａｒｌａｃｅｌ　Ａ、
　Ａｔ１ａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ製）の８．５　：　１．５の／Ｍ液０．５１ηＱを加
二ξて連結注射針を用いて油中水型のエマルジョンを借
だ。

ｉｒ”（！、）９２　？！Ｉ　１　　マウスＬｌｖ＋ｃ
　：／７　ルｆノーマにン・」ず６　ｌ’Ａ’　ＩＩ中
瘍作用 本発明′物質のマウスＩ　ｉｖＩ　Ｃ力ルチノーマＫ　
対−Ｊ−る抗腫瘍性を調べた。

試験系は次のとおりである。

ＣＤＦ雌性マウス・ノ）皮肉に：５×１０５個ノ）ｒ１
シｒｃ力ルチノーマ＋＋；ＩＩＩ　１１国をイ多、（値
し、７トρ１もｑｌ：１目から１３薗Ｈに計６回、実施
例３の方法で１′−Ａ製した製剤を１回あたり０．１ｍ
ρずつ、ｊ腫瘍内に投与した。移１＠試、験クリ３　核
酸分解酵素処理物の抗腫瘍作用本発明物賀全核ｊ波分解
酵素で処理することにより本発明物質の抗＋７瘍活性の
本体を調べた。

試、験法は次のとおりである。

ＡＤ−ＡＩをテオキ／リボ核酸分解酵素ＤＮａｓｅ　［
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｂｅｍｉｃａｌｓ製）で処理した後得
られた分解物をクロロホルム処理してＤＮａｓｅ（を除
き、次にセファデックスＧ　１０　（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ製）カラムにまり脱塩
、凍結乾燥して、本発明物質の核酸分解酵素処理物を得
た。得られた処理物の抗肝瘍活性を試験例・１と同様に
試験し、第３表に示す結束を得だ。

第３表　マウスＩＭＣ力ルチノーマに対する核酸分解酵
素処理物の抗腫瘍作用 Ｔ／Ｃは対照群の平均腫瘍重量に対する投与群の平均腫
瘍重量のパーセント比である。

対照としては生理食塩液を用い、Ｂ　ＣＧはＢ　ＣＧワ
クチンを用いた。

試験例４　ナチュラルキラー（’ＮＫ）　　細胞の活性
増強作用 本発明物質のＮ　Ｋ細胞に対する活性増強作用を調べた
。

試験法は次のとおりである。

生理食塩液、ＲＤ−Ａｌ又ｉｄ：　ＲＤ　−Ａ　２の生
理耐塩、：ｔｍ解散（Ｉ　ｍゾ、／ｍｆｆ）を８週令の
Ｃ５７ＢＬ／［−ｉ系＋’ｌｌｆ注マウスに一匹あたり
０．３ｍｆｌ腹腔内腹腔上投与の・１８時間後に腹腔浸
出細胞を採取した。採取液中の；ｍｔ＋胞牧を１０％牛
脂児而清添加ＲＰＭＩ］６４０培地で２Ｘ１０″個／ｍ
ｆｆＫ調整した後プラスチックシャーレに移して３７℃
、５′Ｘ炭酸ガス大気下で９０分間インキ＝ベートし、
シャーレに付着性細ｔｌｆ：２　、非付着１牛の４１１
胞を得た。各々の細胞５×１０５個と５１　Ｃｒで標識
したマウス白血病細胞Ｙ　Ａ　Ｃ−１、ＩＸｌ、０’個
を１３７℃、　５％炭酸ガス大気下で１０％牛脂児廂清
冷加ＲＰＭＴ１６４．０培地を用いて４時間培養した。

その培養上清に遊離された５１Ｃｒの放射能をオートガ
ンマ−カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ製）で測定し、腹腔
浸出細胞のＹＡＣ−１細胞に対する細胞障害作用を調べ
た。

第４衣　ＮＫ、ｌ・１１１胞のｌ占曲増強作用試験例５
　　ｌ１ａｌ胞増殖面接阻害作用を調・＼た。

試、験系１ｄ次のとおりである。

８Ｊ　ｘ　１０’　ｉ面のＹ　Ａ　Ｃ−］細胞と＋　５
．４　Ｘ　１０’個のＦ　Ｍ３　Ａ　糸１１］胞をそれ
ぞれ１０％牛脂児而清ｆ６５加ＲＰＭＩｉ６４０培地に
浮遊せしめ、３７℃、５％炭酸ガス大気下で２４１守間
培幹後ＲＤ−ＡＩを１ｍグ／　ｍ　ｆｌの最終濃度に加
え、同じ条件下でさらに培養を継続した。＠養開始後２
４時間ｌ」毎にトリパンフゝルー染色（・こより生細胞
数を測定した。結果・、す第５表に示した。

試験例６　急性毒性 １群ｌＯ匹の５週令ｄｄＹ系雄性マウス（平均体４１Ｌ
２３１Ｆ）にＲ＋）　−Ａ　１を生理食塩液に溶解して
体重１　ｋｇあたり５００ｍｆｉ’を静脈内投与した。

本発明物質は投与後１週間の観察期間中、体重増加の抑
制を示さず、死亡例もなかった。この結果から本発明物
質の静脈内投与における５０％致死用栢゛ＬＤ、ｏは５
００　ｍゾ／ｋｇ以上と考えられる。

試験例７　抗原Ｉ／Ｉ：。

生理食塩液に溶解したＲＤ−ＡＩをＩｎ６匹のハートレ
ー系ｄｌｌｆ；　ｌ注モルモット　（平均体重３４８Ｓ
’）に１匹あたシ］ｍＳ’ずつ、週３回合計６回皮内投
与して感作した。最終感作日から２週間経過後ＲＤ−Ａ
Ｉを生理食ｊ語液に溶解して体重１ｃｇあたり　１０ｍ
ｆあるいは２ｎ１１を静脈内投与した。チャレンジ前後
のモルモットの行動観察により本発明物質のは原性を調
べたところ本発明物質は前記投与量では全くアナフィラ
キシ−ショックを誘発しなかった。

【図面の簡単な説明】 第１図は本発明物質のセファローズＣＬ　−ｆｉ　Ｒカ
ラムクロマトによる溶出図を、第２図は間物′ｔｊｉの
紫外線吸収スペクトルを、・イ３，３図は同物質の赤外
線吸収スペクトルを示′３−８ 躬・許出顕人　　三井東圧化学株式□；”ｌｌ図　　　
面 グ　１　圀 ０　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　２０　
　　、　　　　　　　ＪＯ言に験管鉛ｒ水） 薯　２　凹 ｚ２θ　ｚ４θ　　２６θ　ｚｇθ　　Ｊθθ　Ｊ〃波
　長　（ｙｌｍ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　加熱変性によって抗腫瘍活性を有せしめてな１ハ下
   呂ピの理化学的性質（Ｎａ塩による）を示す加熱性デオ
   キシリポ核％ＲＤ−０１及びその塩。 （１）元素分析（％）：　Ｃ：　２６．１８〜３１．３
   １　）１：４．０２〜４．９８Ｎ：１２．１１〜１３．
   ８９　　Ｐ　：　８．１３−９．１８Ｎａ　　：　　３
   ．０２〜４．２８ （２）分子量：：３万〜１００万 分子Ｙ（を分布図は第１図に示す通り。 （３）融　点：明確な融点を示さない。 （４）紫外線吸収スペクトル：第２図に示す通り。 （５）赤外線吸収スペクトル：第３図に示す通り。 （６）溶剤に対する溶解性：水に可溶、エタノール。 メタノ−乞　エーテル、アセトンに不溶。 （７）呈色反応 Ａ）オルシノール反応：　ＳＴＳ法によｐ分画したＲ　
   Ｎ　Ａ　１ｉｆｔｉ分に対して陰性。 Ｂ）ジフェニルアミン反応５ＳＴＳ法により分画したＤ
   ＮＡ画分に対して陽性。 Ｃ）ニンヒドリン反応：本物質］（ｌｔｔ？／ｍＱの　
   　　　−濃度で陰性。 Ｄ）アンスロン反応：本物質Ｉ　Ｏｆｉｆ／／ｍＱので
   ）゛照度で陰性。 （８）塩基性、ｊ設性、中性の区別二本物質の水溶液の
   ｐＨは６．５〜７５である。 （９）物質の邑：白色粉末 ００）特性：加熱処理によって可溶性を伺与するととも
   に高い抗腫瘍活性を有せしめ、かつ毒性および抗原性が
   極めて低くなっている。 （１１）　　塩基組成図）ニゲアニン：３３．４　　ア
   デニン：１７．２シｉ・シン：　３２．５　　チミン：
   　＋　６．９（方法は化学分析による） （＋２　　酵素処理二本物質をデオキシリボヌクレアー
   ゼｌ　　（ＤＮａｓｅ　ｌ）で処理すると抗ｌｌｌ１ｌ
   ！瘍性がなくなるが、リボヌクレアーゼＴ２（ＲＮａｓ
   ｅＴ２）の処土里では抗）厘瘍性は変化しない。 （１丁タ　　ヒドロギゾアパタイトのカラムクロマトグ
   ラフィーにより分析すると１本鎖構造である。 （ロ）転移温度（Ｔｍ）　　：　　測定された融１弄曲
   線からは明確な転移温度］゛ｍ（σ１．求められない。 ２　プロピオニバクテリウム属菌よりイ１ｔられたもＣ
   りである特許請求の範囲第１項記載の加熱変性デオギリ
   ボ核酸ＲＤ−０１゜ ；３　プロピオニバクテリウム属細菌破砕物を遠心外ｙ
   ７１１：してイ；すら；ルる無＋ｌ１ｌｌｌ胞抽出液か
   ら得られる核酸画分を加熱変性することを特徴とする抗
   畦瘍活性を有する加熱変性チオキシリボ核酸ＲＤ−０１
   のｌ造法。 ４、核酸画分の分離法として無祁１胞抽出液を有機溶剤
   処理して分１ね１ｔすることを特徴とする特許請求の範
   囲第３項記載の製造法。 ５、核酸画分の分離法として無細胞抽出液に核酸凝集剤
   を加え、得られる沈澱を水または塩類溶液に対して透析
   した後、その可溶画分から分離することを特徴とする特
   許請求の範囲第３項記載の製造法。 ６、　プロピ、Ｊ゛ニバクテリウム属細菌１妓砕物を１
   束石分離して得ら４１．る無線１血抽出液に核酸凝集剤
   を加え、得られる沈澱を水または塩１１′４訂八に対１
   −７でｉ分析［また後加熱変１・生じてその１清から分
   １加することを特徴とする抗腫４す活性をイ〕する加熱
   変性デオキシリボ核酸ＲＤ−（１１の製造法。 ７　デオキシリポ核１宜へ゛有物を約８０°〜１２０　
   Ｃに加熱して抗腫瘍性を有せしめることを特徴とする抗
   腫ｊＭ活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸ＲＤ−０
   １の製造法。 ８　加熱変性によって抗ｌｌＩ４を瘍活性を有せしめて
   なる加熱変性デオギシリボ核１”１９ＲＤ−０１を有効
   成分とする抗１厘瘍剤。 ９、加熱変性デオキシリボ核酸ＲＤ−０１かプロピオニ
   バクテリウム属菌より得られたものである（１！ｌπ「
   請求の範囲第８項記載の抗原瘍剤。