JPS5934882A - バイオセンサ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■〕発明の背景 技術分野 本発明は、分析試料中のＬ−グルタミン酸を特異的に分
析するためのバイオセンサーに関するものである。また
、本発明は、Ｌ−グルタミン酸のレセプター部として新
規酵素Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを使用することを
特徴とするバイオセンサーに関するものである。

従来技術 従来、Ｌ−グルタミン酸を分析するためのバイオセンサ
ーとしては、（１）グルタミン酸デヒドロゲナーゼをＬ
−グルタミン酸のレセプター部として使用し、トランス
デユーサー部としてカチオン電極を使用する酵素電極（
アナリテイカ・キミカ・アクタ（Ａｎａｌ ＣｈｉｍＪ
Ａｃｔａ．）、５６、３３３（１９７１））および（
２）エシエリシア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）の凍結乾燥菌
体をＬ−グルタミン酸のレセプター部として使用し、ト
ランスデユーサー部として炭酸ガス電極を使用する微生
物電極（Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、１１６、６１
（１９８０））が知られている。

（Ｄの酵素電極は、酵素の安定性が極端に悪く（２日）
、カチオン電極を用いているため、ナトリウムイオン、
カリウムイオンなどの共存するカチオンの影響を受けや
すく実用的ではない。■の微生物電極は、固定化微生物
菌体を使用しているので安定性は優れている（３週間、
１５００回以上）が、好気的条件では菌体の呼吸作用に
よつて炭酸ガスが生成し、測定に影響を与える。このよ
うな影響を除くために窒素ガスの吹き込みなどによつて
菌体の呼吸作用を阻害するとともに試料中の炭酸ガスを
除去する必要がある。また、この微生物電極は基質特異
性が高くないことから、醗酵のプロセス制御などラフな
測定にしか利用できないと考えられる。

また、レセプター部としてＬ−アミノ酸オキシダーゼを
使用する酵素電極も知られている（アナリテイカル・ケ
ミストリー（Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、）、４７。

１３５９（１９７５）など）。しかしながら、このよう
な酵素電極に使用されている従来のＬ−アミノ酸オキシ
ダーゼはＬ−グルタミン酸に対しては作用しにくく、上
記の酵素電極を使用してもＬ−グルタミン酸の特異的な
分析はできなかつた。

最近、Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性の高いＬ−
アミノ酸オキシダーゼがストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ；以下、「Ｓ」と略すこともある。）
属に属する微生物、具体的にはストレプトマイセス・バ
イオレツセンスの培養によつて生産されることか見出さ
れた（特開昭５７−４３６８５号公報参照）。このグル
タミン酸オキシダーゼ（以下、「公知酵素」と略すこと
もある。）の蛋白質としての理化学的性質は明らかでは
ないが、酵素学的性質として記載されている性質を挙げ
ると次のとおりである。

（１）基質特異性 Ｌ−グルタミン酸に対する活性を１００とした場合、Ｌ
−グルタミンに対して８４、Ｌ−ヒスチジンに対して６
．８の相対活性を示し、他のアミノ酸に対しては実質的
な活性は示さない。

（２）至適ｐＨ ｐＨ５〜６ （３）ｐＨ安定性 ｐＨ３．５〜６５の範囲（３７℃．１時間保持）で安定
である。

（４）温度安定性 ５０℃まで（１０分間保持）安定である。

（５）阻害剤の影響 水銀イオン、銅イオンおよびジエチルジチオカルバメイ
トによつてほぼ完全に阻害される。

以上のような公知酵素をＬ−グルタミン酸を特異的に分
析するだめのバイオセンサーに利用できるか否について
前記公開特許公報には何ら開示されていないが、仮にバ
イオセンサーのレセプター部に公知酵素を利用したとし
ても種々の問題点が考えられる。すなわち、公知酵素は
従来知られていたＬ−アミノ酸オキシダーゼと比較すれ
はＬ−グルタミン酸に対する基質特異性は高いが、上記
のとおり依然として他のアミノ酸に明確な活性を示すの
であり、これらのアミノ酸の共存下におけるＬ−グルタ
ミン酸の特異的分析を行うためのバイオセンサーとして
は利用できない。また、公知酵素は安定性が高くはなく
、バイオセンサーのレセプター部に利用する場合にも保
存安定性および使用安定性が必ずしも良いとは考えられ
ない。さらに、分析試料中に銅イオンが存在する場合、
公知酵素は顕著に阻害され、分析が困難になると考えら
れる。

以上のとおり従来Ｌ−グルタミン酸を特異的に識別する
ためのレセプター部としてオキシダーゼを利用したＬ−
グルタミン酸分析用のバイオセンサーは存在せず、この
ような目的を十分に達成し得るＬ−アミノ酸オキシダー
ゼも存在しなかつたのである。。

〔■〕発明の概要 要旨 本発明は、被検知物質のレセプター部としての酵素と該
酵素の作用による分析試料中の化学的もしくは物理的変
化を検出し、電気信号に変換するトランスデユーサー部
とからなるバイオセンサーにおいて、酵素としてＬ−グ
ルタミン酸に対する基質特異性がきわめて高く、Ｌ−グ
ルタミン酸以外のアミノ酸には実質的に作用せず、安定
性の高いＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（以下、「本発
明酵素」と略称することもある。）を使用することを特
徴とするバイオセンサーを提供するものである。

効果 本発明のバイオセンサーは、公知のＬ−グルタミン酸分
析用のバイオセンサーと異なり、バイオセンサーのレセ
プター部として最も汎用されているオキシダーゼを使用
するので、その製作が容易である。また、酵素反応の検
出手段も、基質である酸素の減少を検出する手段または
反応生成物である過酸化水素もしくはアンモニアの増加
を検出する手段など公知の手段のなかから、目的に応じ
て選択することができ、多様性がある。さらに、本発明
のバイオセンサーは、公知のバイオセンサーと比べ、Ｌ
−グルタミン酸に対する特異性が格段に高く、多種類の
アミノ酸を含有する試料であつても他のアミノ酸に妨害
されることなくＬ−グルタミン酸だけを選択的に分析す
ることができる。

以上のような本発明のバイオセンサーを使用することに
よつて食品、発酵液などその本来の成分としてＬ−グル
タミン酸を含有する分析試料中のＬ−グルタミン酸を選
択的に分析できるばかりではなく、Ｌ−グルタミン酸が
関与する反応系、たとえばグルタミナーゼ、グルタミン
酸ラセマーゼ、グルタミン酸・オキザロ酢酸トランスア
ミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸・ピルビン酸トラン
スアミナーゼ（ＧＰＴ）などＬ−グルタミン酸が関与す
る酵素の反応系における酵素活性または反応に関与する
他の物質を分析することもできる。

〔■〕発明の具体的説明 １）バイオセンサー 本発明において［バイオセンサー」とは被検知物質を識
別するレセプター部としての酵素と該酵素の作用による
分析試料中の化学的もしくは物理的変化を検出し、電気
信号に変換する信号変換部位であるトランスデユーサー
部とから構成され、電気信号を電流の変化または電位の
変化として測定し、分析試料中における被検知物質の存
在量またはその存否を分析するための装置を意味する（
［化学の領域、増刊１３４号、バイオマテリアルサイエ
ンス第１集」ｐｐ、６９〜７９．１９８２年４月２０Ｉ
Ｈ、■南江堂発行および「化学工業」１９８２年６月号
、ｐｐ、４９１〜４９６参照）。

上記のようにレセプター部として酵素を使用するバイオ
センサーは「酵素センサー」とも称され、特にトランス
デユーサー部として電気化学デバイスを使用する酵素セ
ンサーは「酵素電極」とも称される（［イオン電極と酵
素電極」、鈴木周−編。

ｐｐ、６５〜１０６．１９８１年１１月１日、■講談社
発行および「化学の嶺域」第３６巻、第５号。

ｐｐ、３４３〜８４９、（１９８２年）参照）。また、
酵素センサーにはレセプター部とトランスデユーサー部
が密着もしくは近接して構成される電極装着型酵素電極
およびレセプター部とトランスデユーサー部が分離して
構成されるリアクター型酵素センサーがある。

本発明によるバイオセンサーは上記の公知のバイオセン
サーにおいてレセプター部として新規酵素である特定の
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを使用することによつて
新規なバイオセンサーを構成し、従来技術に比べ格段の
効果を達成して実成されたものである。したがつて本発
明においては本発明酵素を使用する他は公知の技術を採
用することができ、さらに今後開発されるべき技術も本
発明の目的にかなうものであれば採用することができる
。

２）本発明酵素 本発明酵素は、Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性が
きわめて高く、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸には実
質的に作用ぜす、安定性の高いＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼであればよく、その起源・由来を問わず、その調
製法も問わない。

以下に本発明酵素の一例としてストレプトマイセス属微
生物の培養物より得られた酵素を挙げ、この例示酵素に
ついて具体的性質および調製法を説明する。

（Ａ）本発明酵素の酵素学的および理化学的性質後に示
す参考例の方法で製造したＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼの精製酵素標品の酵素学的および理化学的性質は下記
のとおりである。

（１）作用 本発明酵素はＬ−グルタミン酸を基質とした場合、下記
反応式のごとくＬ−グルタミノ酸１ｍｏｌにつき、１ｍ
ｏｌの酸素と１ｍｏｌの水を要求し、１ｍｏｌのα−ケ
トグルタル酸、１ｍｏｌのアンモニアおよび１ｍｏｌの
過酸化水素を生成する。

（２）基質特異性 種々のアミノ酸に対して本発明酵素の精製標品を作用さ
せた結果が第１表である。各基質の濃度は１０ｍＭであ
り、反応はｐＨ７．４（０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液
）およびｐＨ６．０（０．１Ｍ酢酸緩衝液）で行つた。

酵素活性は後述する酸素電極法により測定し、Ｌ−グル
タミン酸に対する活性の相対値として表わした。

以上のとおり本発明酵素はＬ−グルタミン酸に対する基
質特異性が高く、他のアミノ酸に対しては、ｐＨ７．４
においてＬ−アスパラギン酸にわずかな活性（０．６％
）を示すだけで、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−ヒスチジ
ンを含む他のＬ−アミノ酸およびＤ−グルタミン酸には
実質的には全く活性を示さず、ｐＨ６．０においてはＬ
−アスパラギン酸に対しても実質的に活性を示さない。

以上の本発明酵素に対し、前記のとおり公知酵素はＬ−
アスパラギン酸に対しては活性を示さない（０１％以下
〕が、Ｌ−グルタミンに対して８．４％、Ｌ−ヒスチジ
ンに対して６８％の活性をそれぞれ示す酵素であり基質
特異性において両者は異る。

なお、本発明酵素のＬ−グルタミン酸に対するｋｍ値は
ｐＨ７．４において２．１×１０−４Ｍで、Ｌ−アスパ
ラギン酸に対するｋｍ値はｐＨ７．４において２．９×
１０−２Ｍである。

（８）力価の測定 本発明酵素の力価の測定は、酸素電極法で行つた。すな
わち、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸ナトリウムを含む０
．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌを酸
素電極セルに入れ、１０μｌの酵素液を添加して酸素消
費速度を測定した。３０℃で１分間１μｍｏｌの酸素を
消費する酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ本明細書において「
Ｕ」と略称する。）とした。

なお、反応液の溶存酸素濃度は温度の上昇とともに減少
するので高い反応温度での活性測定には上記方法は使用
できない。このような場合にはＭＢＴＨ法（アナリテイ
カル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）、２５．２２８（１９６８）参照）によつて行う。

すなわちＬ−グルタミン酸ナトリウム、カタラーゼおよ
び本発明酵素を含有する反応液を適当温度で２０分間イ
ンキユベートし、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて反
応を停止し、この反応停止液に酢酸緩衝液（ｐＨ５．０
）および３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾ
ンハイドロクロライド（ＭＢＴＨ）を加えて５０℃で８
０分間インキユベートした後、室温まで冷却して３１６
ｎｍの吸光度を測定し、検量線から生成したα−ケトグ
ルタル酸を定量する。

（４）至適ｐＨ 至適ｐＨは第１図に示すとおり、ｐＨ７〜８．５付近で
ある。各ｐＨにおける酵素活性の測定は、基質としてＬ
−グルタミン酸ナトリウムを使用し、緩衝液として０．
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ８．５〜６．０）、０．２Ｍりん
酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８５）および０．２Ｍ
グリシン−塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（
ｐＨ８．５〜１２．０）を使用し、３０℃で行つた。

なお、第１図には本発明酵素と公知酵素の至適ｐＨの比
較のため、本発明酵素（実線）と公知酵素（点線：特開
昭５７−４８６８５号公報の第１図より引用した。）の
ｐＨ活性曲線を併記した。

第１図から明らかなように本発明酵素は至適ｐＨにおい
ても公知酵素とは相異する。

また、アスパラギン酸を基質とした場合の作用ｐＨ範囲
は狭く、至適ｐＨは７〜８であるが、ｐＨ６、０以下お
よびｐＨ１０．０以上においてはＬ−アスパラギン酸に
対してほとんど作用しない（ｐＨ６．０においてグルタ
ミン酸に対する活性の０１％以下）。

（５）ｐＨ安定性 ｐＨ３．５〜１１．５の各ｐＨにおいて３７℃、６０分
間、４５℃、１５分間および６０℃、１５分間の各条件
で保持した後、ｐＨ７．４においてグルタミン酸に対す
る酵素活性を測定した。

その結果、３７℃、６０分間保持の条件ではｐＨ５５〜
１０．５の範囲において安定であり（第２図。

実線）、４５℃、１５分間保持の条件でもｐＨ５．５〜
９．５の範囲において安定であり（第３図）、６０℃、
１５分間保持の条件ではｐＨ５．５〜７５の範囲におい
て安定であつた（第４図）。

なお、第２図には本発明酵素と公知酵素のｐＨ安定性の
比較のため、公知酵素のｐＨ安定曲線（特開昭５７〜４
８６８５号公報の第２図より引用し、点線で示した。）
を本発明酵素のものと併記した。

以上の第２〜４図から明らかなように、本発明酵素と公
知酵素の安定ｐＨ範囲を比較すると、両所は明らかに異
り、前者の方か後者に比べて広いｐＨ範囲において安定
である。

（６）作用適温の範囲 ３０℃〜８０℃の各温度においてＬ−グルタミン酸ナト
リウムを基質として２０分間反応し、前記ＭＢＴＨ法で
酵素活性の測定を行つた。

その結果、本発明酵素の作用適温の範囲は３０〜６０℃
であり、作用至適温度は５０℃付近であつた（第５図）
。

（７）熱安定性 ４０℃〜９０℃の各温度においてｐＨ５．５、ｐＨ７．
５およびｐＨ９．５の各条件で１５分間保持した後、ｐ
Ｈ７．４においてグルタミン酸に対する酵素活性を測定
した。

その結果、ｐＨ５．５においては６５℃まで安定であり
、８５℃で約５０％の残存活性を示す（第６図、▲−▲
）。ｐＨ７．５においては５０℃まで安定であり、７５
℃で約６０％の残存活性を示す（第６図、●−●）。ｐ
Ｈ９．５においても４５℃まで安定であり、７０℃で約
５０％の残存活性を示す（第６図、■−■）。

なお、本発明酵素と公知酵素の執安定性の比較のため、
公知酵素の温度安定曲線（特開昭５７−４３６８５可公
報の第３図より引用し、点線で示した。）を本発明酵素
のものと併記した。

第６図より明らかなように、本発明酵素は公知酵素より
も温度安定性か高い。

（８）阻害、活性化および安定化 本発明酵素に対する種々の添加物質の影響を調べるため
に、第２表に示す各物質１ｍＭを含む反応液（ｐＨ７．
４）中で酵素反応を行つた。

その結果は第２表に示すとおりである。

１）ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸２）ＮＥＭ：Ｎ
−エチルマレイミド ３）ＰＣＭＢ：パラクロロマーキユリベンソエイト４）
ＤＤＴＣ；ジエチルジチオカルバメイト５）チロン：４
．５−デヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸二ナト
リウム 第２表より明らかなように本発明酵素は、パラクロロマ
ーキユリベンゾエイトによつて約４５％阻害されるが、
塩化第二銅およびジエチルジチオカルバメイトには全く
阻害されない。一方、公知酵素は塩化第二銅およびジエ
チルジチオカルバメイトによつて完全に阻害される。し
たかつて両酵素は阻害剤による影響という点においても
相異する。

なお、本発明酵素の活性化剤および安定化剤はまだ見出
されていない。

（９）紫外線吸収スペクトル（第７図参照）入ｍａＸ：
２７３ｎｍ、３８５ｎｍ、４６５ｎｍ肩：２９０ｎｍ付
近、４９０ｎｍ付近 （１０）補酵素 本発明酵素を熱処理またはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処
理し、遠沈して得られた上清は、その吸収がフラビンア
デニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と一致し、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼのアポ酵素を活性化したので、本発明酵
素の補酵素がＦＡＤであることが判明した。

また、薄層クロマトグラフイーにおけるＲｆ値からもＦ
ＡＤであると同定された。

ＦＡＤは本発明酵素１ｍｏｌにつき２ｍｏｌ存在するも
のと推定された。

（１１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製された本
発明酵素は 単一バンドを示した。

（１２）分子量 本発明酵素の分子量は、セフアデツクスＧ−２００（フ
アルマシア・フアインケミカルズ社製）によるゲル濾過
法では１３５．０００±１０．０００と測定された。

（１３）等重点 アンフオライン（ＬＫＢ社製）を用いた等電点電気泳動
により測定したところ、ｐｌは６．２でであつた。

（１４）結晶構造および元素分析 本発明酵素は結晶化されていないので測定していない。

（１５）精製方法 本発明酵素の精製は塩析法、等電点沈澱法、有機溶媒に
よる沈澱法、けいそう土、活性炭などによる吸着法、各
種クロマトグラフ法等を適宜に組合せて行うことができ
る。精製方法の具体例は参考例に示すとおりである。

（Ｂ）本発明酵素の調製 次に本発明酵素を微生物の培養によつて製造する方法を
具体的に示す。

使用微生物 本発明酵素の製造に使用される微生物は、ストレプトマ
イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、本発明
酵素を生産する能力を有する微生物である。

このような微生物の具体例としては、千葉県香取郡東庄
町の土壌より分離され、単一の菌株として単離されたＸ
−１１９−６株を挙げることができる。この菌株の菌学
的性質を以下に記載する。

Ａ．顕微鏡的観察 気菌糸は、直線状でその幅は０９〜１．０μであり、単
純分枝を示す。胞子柄は、多数の胞子の連鎖よりなつて
おり、２〜５回転の螺旋を形成する。

胞子はやや惰円形で、その大きさは０９〜１．０×１．
１×ｌ、２μであり、電子顕微鏡によつて表面はとげ状
構造であることが観察される。基菌糸の分断は認められ
ない。

Ｂ．肉眼的観察 各種培地における生育（３０℃、１６日間培養）の肉眼
的観察の結果は次のとおりである。

（１）シユークロース硝酸塩寒天培地 その生育は不良である。基菌糸は灰褐色で寒天中に侵入
せず、気菌糸は粉状で寒天上に放射状に薄く広がる。色
は灰褐色で、灰色の胞子を形成する。培地中への色素の
生成は認められない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地その生育は良
好である。基菌糸は白黄色で寒天中に浸入するとともに
わずかに盛り上る。気菌糸は白色で、貧弱であり、培地
中への色素の生成は認められない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地その生育は良
好である。基菌糸は白黄色で、寒天中に侵入するととも
に盛り上る。気菌糸は形成されず、培地への色素の生成
も認められない。

（４）澱粉・無機塩寒天培地 その生育は良好である。基菌糸は白黄色で、寒天中に侵
入するとともに盛り上る。気菌糸は白色で、豊富であり
、灰色の胞子を着生する。培地中への色素の生成は認め
られない。

（５）チロシン寒天培地 その生育は良好である。基菌糸は白黄色である。

気菌糸は白色で、豊富であり、灰色の胞子を着生する。

培地中への色素の生成は認められない。

（６）栄養寒天培地 その生育は極めて良好である。基菌糸は白黄色で寒天中
に侵入するとともに盛り上る。気菌糸は白色で、胞子の
着生は認められない。培地中への色素の生成も認められ
ない。

（７）イースト・麦芽寒天培地 その生育は極めて良好である。基菌糸は白黄色で、寒天
中に侵入するとともに盛り上る。気菌糸は白色で、豊富
であり、灰色の胞子を着生する。

培地中への色素の生成は認められない。

（８）オートミール寒天培地 その生育は極めて良好である。基菌糸は白色で、寒天中
に侵入するが、培地上には盛り上らない。

気菌糸は白色で、豊富であり、灰色の胞子を着生する。

培地中への色素の生成は認められない。

Ｃ．生理的性質 生育温度範囲は８〜４０℃であり、３５℃近辺か最適で
ある。

チロシン寒天培地およびペプトン・イースト・鉄寒天培
地では、共にメラニン様色素は生成せず、ゼラチンをわ
ずかに液化し、澱粉を加水分解する。

Ｄ．各種炭素源の同化性 プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上での各種炭素源の利
用性は第３表のとおりである。

以上の性状を要約すると次のとおりである。すなわち、
気菌糸は螺旋状で、胞子の表面はとげ状である。培地上
での発育では白黄色または灰褐色を呈し、気菌糸は白色
〜灰褐色で、溶解性の色素およびメラニン様色素の生成
は認められない。また、スターチ水解性は強い方である
。

これらの結果と第３表に示した炭素源の同化性を基準に
バージエーズ・マニユアル・オブ・デイタミネーテイブ
・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）第８版（１９７４年）における分類体系に従つ
て本菌株の同定を行つたところ、本菌株はストレプトマ
イセス属に属するが、本菌株の特徴に十分に合致する公
知の種は見出せず、本菌株を新菌株であると同定し、ス
トレプトマイセス・エスピーＸ−１１９−６（Ｓｔｒｅ
ｐｌｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｘ−１１９−６）と命名した。

本菌株について、昭和５６年通商産業省告示第１７８号
に従つて工業技術院微生物工業技術研究所に対して寄託
申請を行い、昭和５７年６月５日付けで受託され、受託
番号として微工研菌寄第６５６０号（ＦＥＲＭＰ−６５
６０）が付与されている。

上記菌株は本発明酵素の生産能の高い菌株の一例であり
、本発明の使用微生物はこれに限定されるものではない
。また、このような本発明酵素生産菌を通常の微生物突
然変異誘導法、たとえば紫外線、Ｘ線、γ線照射などの
物理的処理、ニトロノグアニジンなどの薬剤による化学
的処理などの処理法によつて変異させて得られた本発明
酵素の高生産性突然変異株のいずれをも好適に使用でき
る。さらに本発明酵素の製造方の目的は基本的には、前
記微生物の本発明酵素の生産に関する遺伝情報を担う遺
伝子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）による酵素蛋白の合成
機能を利用することにある。したがつて、このような遺
伝子ＤＮＡを適当なベクターに組み込み、前記以外の属
の微生物へ形質転換により移入させるか、または遺伝子
ＤＮＡをプロトプラスト法による細胞融合によつて他属
微生物に取り込ませるなど遺伝子操作的手法によつて得
た微生物による本発明酵素の製造方も 適用される。

培養方法および条件 前記使用微生物の培養方法および条件は、該微生物が良
好に生育し、本発明酵素が十分に生産される方法および
条件であれば特に限定されないが、固体培養法もしくは
それに準ずる方法が好適である。

固体培養に使用する固体培地は通常使用されるものと何
ら変らない。すなわち、固体培地とはフスマ、脱脂大豆
、米ヌカ、トウモロコシ、菜種粕小麦、米、もみがら等
の天然固体原料の単独あるいは二種以上の組合せたもの
を主体とし、さらに必要に応じて本発明の使用微生物が
資化可能な栄養源、たとえばグルコース、シユークロー
ス、アラビノース、フラクトース、マンニトール、イノ
シトール、可溶性澱粉．エタノール等の炭素源、各種ア
ミノ酸、ペプトン、大豆粉、蛋白質加水分解物、コーン
ステイープリカー、肉エキス、酵母エキス、各種アンモ
ニウム塩、各種硝酸塩、尿素等の窒素源、各種のナトリ
ウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、マグ
ネシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、りん酸塩、硫酸塩等の塩類
、サイアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン
酸、ビオチン、ｐ−アミノ安息香酸、ビタミンＢ１２等
の発育素を適宜添加した培地、またはこれらを適宜な配
合、大きさ、形状に造粒した培地などである。このよう
な固体培地は常法により滅菌あるいは変性処理し、種菌
を接種して固体培養を行う。

また、上記以外の培養法、たとえばスポンジ等の適宜の
担体に液体培地を吸収または被覆しく特開昭４９−１４
６７９号公報参照）、種菌を接種して培養する方法であ
つても使用微生物が繁殖し、本発明酵素を良好に生産す
る限り採用できる。

培養条件は使用微生物の種類に応じて酵素の生産に最適
の条件を選択すればよく、特に限定されない。通常、た
とえば２０〜３０℃．ｐＨ５−７で５〜１５日間培養す
ればよい。

本発明酵素の採取 使用微生物の培養により生産された本発明酵素は、適当
な抽出法により培養物、すなわち培地および／または培
養菌体から抽出分離され、そのまま粗酵素液として使用
するか、あるいは前記したとおり通常の酵素精製法に従
つて使用目的に応じた精製段階に精製される。

抽出法は、特に限定されず、常法により行われる。たと
えば、固体培養物からの抽出は、通常、水または緩衝液
により行われる。また、菌体内の本発明酵素は常法によ
り菌体を破砕し、可溶化して抽出する。

３）レセプター部 前記の本発明酵素をバイオセンサーのレセプター部とし
て使用するためには、本発明酵素と被検知物質であるＬ
−グルタミン酸の接触が容易に行われ、酵素反応が円滑
に進行するとともに、本発明酵素が分析試料溶液中に実
質的に溶出しない状態にレセプター部を構成しなければ
ならない。したがつて、本発明酵素は通常固定化され、
あるいは半透膜（たとえば、透析膜、限外濾過膜など）
によつて被覆されて使用される。

固定化は、レセプター部のバイオセンサーにおける使用
の目的に適合する態様でなされ、本発明酵素が実質的に
失活せず、酵素反応が阻害されない態様でなされればよ
く、特に限定されない（「固定化酵素」．千畑一部編、
昭和５０年３月２０日、儀講談社発行および「イオン電
極と酵素電極」（前出）、６５〜７７参照）。

すなわち、固定化方法は包括法（格子型、マイイロカプ
セル型など）、担体結合法（共有結合法、イオン結合法
、物理的吸着法など）、架橋法などの公知の方法よりレ
セプター部として使用する固定化酵素の調製法として好
適な方法を選択すればよい。具体的には、担体もしくは
支持体の素材としてはセルロース（セロフアン、濾紙な
ど）、アセチルセルロース誘導体、ニトロセルロース（
コロジオンなど）、各種イオン交換セルロース誘導体（
ＤＥＡＥ−セルロース、ＴＥＡＥ−セルロース、ＥＣＴ
ＥＯＬＡ−セルロース、ＣＭ−セルロース、Ｐ−セルロ
ースなど）などのセルロース系誘導体、でん粉、デキス
トラン誘導体（セフアデツクス（商品名〕など）、アガ
ロース、マンナン（コンニヤクマンナンなど）、キトサ
ン、カラギーナン、アルギン酸、キサンタンガム、寒天
などの多糖類、コラーゲン、ゼラチン、フイブロイン、
ケラチン、アルブミン、グルテンなどの蛋白質、ポリア
クリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアル
コールなどの高分子性ゲル、ポリ塩化ビニル、ポリメチ
ルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリスチレ
ン、ポリアミノスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド（ナ
イロン、ポリアミノ酸など）、フツ素樹脂（テフロン（
商品名）など）、ケイ素樹脂（シリコーン）、吸着樹脂
、イオン交換樹脂などの合成有機高分子物質、ガラス、
シリカ、セラミツク、アルミナ、カオリナイト、ベント
ナイト、りん酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、活
性炭などの無機物質などをそのままあるいはこれらに酵
素蛋白質と反応性の官能基を導入し、もしくは官能基を
活性化して使用される。包括法によつて固定化する際に
は例えは高分子性ゲル、セルロース誘導体、多糖類、蛋
白質などのゲルの格子の中に酵素を取り込ませるか、例
えは有機高分子物質、セルロース誘導体などの半透膜性
の皮膜によつて酵素を被覆してマイクロカプセル状に調
製することができる。担体結合法による場合、ジアゾ法
、ペブヂド法、アルキル化法、もしくは架橋試薬（グル
タルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナートなど
）によつて適宜の担体に共有結合さゼる方法、イオン交
換基を有する担体にイオン結合させる方法、または物理
的に吸着させる方法によつて固定化することができる。

また、架橋法による場合、２個もしくはそれ以上の官能
基を有する試薬、たとえはグルタルアルデヒド、イソシ
アナート誘導体（ヘキサメチレンジイソシアナート、ト
ルエンジイソシアナートなど）、イソチオシアナート誘
導体（ヘキサメチレンジイソチオシアナートなど）、Ｎ
、Ｎ’−エチレンビスマレインイミド、Ｎ、Ｎ’−（１
．２−フエニレン）ビスマレインイミド、Ｎ、Ｎ’−（
１．４−フエニレン）ビスマレインイミド、Ｎ、Ｎ−ポ
リメチレンビスヨードアセトアミドなどによつて酵素間
に架橋することにより固定化することができる。これら
の方法の二種以上を組合せて実施し、固定化酵素を調製
することもてきる。以上の方法によつて本発明酵素を固
定化し、膜状、ゲル状、粒状、チツプ状、粉末状、マイ
クロカプセル状、チユーブ状、繊維状、容器状など適宜
の形態に調製し得る。得られた固定化酵素をバイオセン
サーのレセプター部として使用する態様は次のとおりで
ある。すなわち、電極装着型酵素電極の場合、通常、膜
状、ゲル状、粉末状もしくはマイクロカプセル状の固定
化酵素を測定電極の作用面に密着もしくは近接して装着
し、さらに好ましくは基質透過性多孔質膜（たとえは、
透析膜、限外濾過膜、積層膜、不均質膜、非対称膜など
）を被覆して構成される。なお、電極膜、固定化酵素層
および試料液と接する被覆膜の三者は、全てが一体とな
つた積層膜もしくは不均質膜あるいは前二者もしくは後
二者が一体となつた積層膜もしくは不均質膜として構成
されていてもよい。また、リアクター型酵素センサーの
場合、通常、粒状、もしくは粉末状の固定化酵素をカラ
ムに充填し、またはチユーブ状もしくは繊維状（ホロフ
アイバー状）の固定化酵素をリアクターとして構成し、
レセプター部として使用し得る。

４）トランスデユサー部 前記のレセプター部において分析試料中の基質を本発明
酵素によつて酸化し、この反応による化学的もしくは物
理的変化を検出して電気信号に変換する部位がトランス
デユーサー部である。本発明においては化学的変化を検
出する場合を例示するか、物理的変化、たとえば熱の収
支をサーミスタなどによつて検出してもよい。

本発明酵素による反応に伴う化学的変化は、分析試料中
の酸素およびＬ−グルタミン酸の減少ならびに過酸化水
素、アンモニアおよびα−ケトグルタル酸の増加である
が、トランスデユーサー部によつて検出されるのは通常
酸素の吸収、過酸化水素の増加またはアンモニアの増加
である。

酸素の吸収を検出して電気信号に変換するトランスデユ
ーサーとしては酸素電極が使用される。

一般に使用される酸素電極は作用電極として白金、金、
イリジウムなどの貴金属電極を用い、対照電極として銀
、銀／塩化銀糸、飽和カロメル、鉛、亜鉛、アルミニウ
ムなどの電極を用い、これらの両極間に電解液が介在す
る基本構造を有するものである。具体的には前記両極お
よび電解液（水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどの
アルカリ溶液）が一体化され、作用電極が酸素透過性の
電極膜（融膜；テフロン膜、ポリプロピレン膜、ポリエ
チレン膜などからなる。）を介して試料溶液と接するよ
うに構成された複合型電極（クラーク型電極などの隔膜
酸素電極）あるいは作用電極側と対照電極側が塩橋で連
結された分離型電極などが使用される。その方式はポー
ラログラフ方式であつても、ガルバーニ電池方式であつ
てもよい。

過酸化水素を検出して電気信号に変換するトランスデユ
ーサーとしては過酸化水素検知型電極が使用される。具
体的には、前記の酸素電極と同様の構造の電極を使用す
ることかできる。たとえば、白金などの貴金属電極から
なる作用電極、銀電極からなる対照電極、電解液および
過酸化水素透過性隔膜から構成されるクラーク型過酸化
水素電極が好適である。また、レセプター部として本発
明酵素とともにパーオキシダーゼもしくはモリブデン酸
塩などの過酸化水素分解用触媒を使用し、過酸化水素と
ヨウ素イオンを反応させ、ヨウ素イオンの活量減少を検
出する方法によつて過酸化水素を検出することもてき、
この場合にはヨウ素イオン電極を使用することができる
。

アンモニアを検出して電気信号に変換するトランスデユ
ーサーとしては、アンモニアをアンモニウムイオンとし
て分析する場合はカチオン選択性電極を使用することが
でき、アンモニアガスとして分析する場合には疎水性の
ガス透過性膜を装着したガラス電極からなるアンモニア
ガス電極を使用することかできる。

本発明による電極装着型酵素電極は前記のレセプター部
としての本発明酵素が以上例示した各種電極の電極感応
物質透過性膜上もしくはこのような膜と一体化して装着
されて構成される。

また、本発明によるリアクター型酵素電極は、前記のレ
セプター部としての本発明酵素を固定化したりアクター
と、酵素反応部分と分離して設置される以上に例示した
各種電極から構成される。

なお、本発明はトランスデユーサー検知物質およびトラ
ンスデユーサー方式に限定されるものではない。

５）具体例 以下、本発明によるバイオセンサーの一例として電極装
着型酵素電極の製作例を実施例として示し、この電極の
利用例を示す。また、本発明酵素の製造法を参考例とし
て示す。たたし、本発明はこれらの例示に限定されるも
のではない。

実施例１ Ｌ−グルタミ／酸オキシターゼ（４４８Ｕ／ｍｌ）溶液
０．１ｍｌを３０ｍｍ×３０ｍｍ四方のセロフアン膜（
膜圧３０μｍ）に滴下・乾固し、これに２．５％グルタ
ルアルデヒド溶液０．１ｍｌを浸潤させ、４℃て一晩乾
燥し、２８０ｎｍに於ける吸収物質が溶出しなくなるま
で水で洗浄し、Ｌ−グルタミノ酸オキシダーゼ固定化セ
ロフアン膜を得た。

上記固定化酵素膜を円形の小片に裁断し、隔膜酸素電極
（（株）石川製作所製）の酸素透過性膜（テフロン膜、
膜圧１０ｕｍ）上に装着し、さらにこの固定化酵素成子
にセルロース透析膜（膜厚５０ｕｍ、ヴイスキング社製
）を装着してＬ−グルタミン酸センサーを製作した（第
８図）。

第８図において、隔膜酸素電極は、カソードは白金電極
（１）、アノ−ドは鉛電極（２）であり、水酸化カリウ
ム溶液を内部液（電解液（３）とし、白金カソード表面
に酸素透過性のテフロン膜（４）が装着されている。こ
のテフロン膜上に上記固定化酵素膜（５）が装着され、
さらにセルロース透析膜（６）で被覆され、Ｏ−リング
（７）で固定されている。

上記のＬ−グルタミン酸センサーを使用し、第９図に示
ずＬ−グルタミン酸分析装置を製作した。

第９図において、試料溶液注入口（１）より注入された
試料溶液（２）は溶存酸素飽和緩衝液（３）とともにペ
リスタテイツク・ポンプ（４）によつてフローセル（５
）に送入される。このときＬ−グルタミン酸センサー（
６）によつて測定された電流減少値は記録計（７）に記
録される。

上記の装置にＬ−グルタミン酸ナトリウム標準液を連続
的に注入し、電流減少値を測定し、Ｌ−グルタミン酸ナ
トリウム濃度との相関を求め、結果を第１０図に示した
。

同装置を使用し、各温度におりる応答性を測定し、結果
を第１１図に示した。たたし、測定は、０、８ｍＭＬ−
グルタミン酸ナトリウム溶液を使用し、２０℃、３０℃
および４０℃の各温度で行つた。

同様に、各ｐＨのＬ−グルタミン酸ナトリウム溶液（０
．８ｍＭ）に対する応答性（３０℃）を測定し、結果を
第１２図に示した。

また、同様に各種アミノ酸に対する応答性を測定し、結
果を第４表に示した。なお、各アミノ酸溶液の濃度は１
．０ｍＭであり、反応ｐＨ７．０（０．１Ｍりん酸カリ
ウム緩衝液）で行つた。

実施例２ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（１２．５Ｕ／ｍｌ）溶
液０．５ｍｌを多孔性ニトロセルロース膜（東洋科学産
業■製、ＴＭ−５；孔径０．１ｕｍ、直径２５ｍｍ、膜
厚１４０μｍ）上に滴下・吸引することにより吸着固定
し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ固定化膜を得た。

上記固定化酵素膜を円形に裁断（直径５．０ｍｍ）した
後、実施例１と同様に隔膜酸素電極に装着し、Ｌ−グル
タミン酸センサーを製作した。

利用例 市販醤油を０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０
倍に希釈して空気をバブリングし、溶存酸素を飽和状態
にした試料液を調製した。４９ｍｌの０．１Ｍりん酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に上記試料液１ｍｌを注入し、実施
例１で製作した装置によつて測定した。得られた電流減
少値から検量線によつて上記醤油中のＬ−グルタミン酸
濃度を算出したところ、この値はＬ−グルタミン酸デカ
ルボキソラーゼを利用して比色法−により測定する市販
のＬ−グルタミン酸オートアナライザー（テクニコン・
イノストウルメンツ社製）による定量値とよく一致して
いた。

参考例 ５００ｍｌ容三角フラスコにフスマ２０ｇおよび水１６
ｍｌを入れ、１２０℃１３０分間加圧滅菌して調製した
フスマ培地にストレプトマイセス・エスピーＸ−１１９
−６（微工研菌第６５６０号）を植菌し、２８℃．７日
間培養して種菌を調製した。

５ｌ容三角フラスコ２５本にそれぞれフスマ２００ｇお
よび水１６０ｍｌを入れ、１２０℃、３０分間加圧滅菌
した後、前記の種菌を無菌的に接種し、２８℃で２日間
培養後、温度を２０℃に下げてさらに２週間培養した。

得られた培養物を３７．５ｌの水に１時間浸漬した後、
濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵素液的３４
ｌを得た。この粗酵素液に硫酸アンモニウムを５０％飽
和まて加え、生成した沈澱を遠沈採取して０．０２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５．５）３．９ｌに溶解し、５７℃で３
０分間加熱した。この熱処理した酵素液を５℃以下に冷
却後、２倍量の予め冷却したエタノールを加え、生成し
た沈澱を遠沈採取して０．０２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７
．４）２ｌに溶解し、同一緩衝液で一夜透析した。透析
中に生成した沈澱を遠沈除去し、上清液を同一緩衝液で
平衝化したＤＥＡＥ（ジエチルアミンエチル）−セルロ
ースカラム（３．５×５０α）に通し、吸着した酵素を
食塩０８５Ｍを含む同一緩衝液を用いて溶出した。溶出
された活性区分を集め、００５Ｍの食塩を含む０．０５
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５５）で一夜透析した。この透析内
液を同一緩衝液で平衝化したＤＥＡＥ−セフアロースＣ
Ｌ−６−１３（フアルマンア・フアインケミカルズ社製
）カラム（２×１０ｃｍ）に通し、吸着した酵素を食塩
０．０５〜０７５Ｍのリニアクラジエント法で溶出した
。溶出された活性区分を集め、透析濃縮後、セフアデツ
クスＧ−２００（フアルマシア・フアインケミカルズ社
製）カラム（２．５×１２０ｃｍ）を用いてゲル濾過を
行い、活性区分を集めて濃縮後、０．０２Ｍりん酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した。この透析内液を
遠沈し、上清液を精密濾過した後、凍結乾燥してＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼの精製標品（比活性５５．１Ｕ
／ｍｇ蛋白。

収率１８４％）３０■を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線）の作用
ｐＨ範囲を示す。 第２図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線）の安定
ｐＨ範囲（３７℃、６０分間保持）を示す。 第３図は本発明酵素の安定ｐＨ範囲（４５℃、１５分間
保持）を示す。 第４図は本発明酵素の安定ｐＨ範囲（６０℃１５分間）
を示す。 第５図は本発明酵素の作用適温範囲を示す。 第６図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線、○−○
）の安定温度範囲を示す。第６図において▲−▲はｐＨ
５．５、●−●はｐＨ７．５、■−■はｐＨ９．５の各
条件における温度安定曲線を示す。 第７図は本発明酵素の紫外線吸収スペクトルを示す。 第８図は本発明によるＬ−グルタミン酸センサーを模式
的に示すものである。 １・・・・白金電極、２・・・・鉛電極、４・・・・テ
フロン膜５・・・・固定化酵素、６・・・・セルロース
透析膜第９図は第８図のＬ−グルタミン酸センサーを使
用したＬ−グルタミン酸分析装置を模式的に示すもので
ある。 ２・・・・試料溶液、３・・・・溶存酸素飽和緩衝液５
・・・・フローセル、６・・・・Ｌ−グルタミン酸セン
サー、７・・・・記録計 第１０図は第９図の装置を使用した際のＬ−グルタミン
酸ナトリウム濃度と電流減少値との相関を示すものであ
る。 第１１図は第９図の装置を使用した際の各温度における
応答性を示すものである。 第１２図は第９図の装置を使用した際の各ｐＨにおける
応答性を示すものである。 特許出願人（６・７７）ヤマサ醤浦株式会月第１図 第２図 第５図 第６図 温度 第７図 ノδＪ ｂ ９ｔＢ ち−ＬＦＬ（１戸１） 硅ルア（幻 ４、ｔ４７１！デｌθ〃 Ｐ〃 手続補正書（自発） 昭和５８年３月ノアＥｌ １、事イＩＩの表示 昭和５７年特許願第１４６７０７号 ２、発明の名称 バイオセンサー ３、補正をする者 事件との関係特許出願人 住所（郵便番号２８８） 千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話０４７９（
２２）００９５ ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面の簡ｉ４４な
説明の欄ならびに図面 ５、補正の内容 ■）明細書第２頁第１６行目に１■エソエリソア・フリ
ーとあるのを［■Ｉ７−グルタミン酸デカルボキノラ−
七活性を有するエノエリンア・コリー１とｄｌ」１する
。 ２）明細Ｐ）第３頁第３行目に１カリウムイオンな大 吉の一存する１とあるのを１−カリウムイオンなど測定
系に１１存する」と訂正する。 ３）明細１１１第１０頁第８行目に「実践」とあるのを
；完成１と訂正する。 ４）明細７Ｊ１第１１頁第１行目の［酵素」と１−を挙
シー、１との間に１−（以下、１本酵素」という。）」
を加入する。 ５）明細書の以下の個所（１）〜（８Ｂに「本発明酵素
Ｊとあるのを全て１本酵素１と訂正する。 （１）第１２頁第６行、（２）第１２頁末行、（３）第
１４１′↓下から第９行、（４）第１４頁末行、（５）
第１５頁第６行、（６）第１５頁第１１行、（７）第１
６頁第５行、（８）第１７頁第３行、（９）第１７頁第
４行、＋１０１第１７１′↓第７行、＋１１３第１８頁
第６行、（１′２第１８頁第９行、（１３）第１８頁第
１Ｉ行、＋１４）第１８頁第１９ｔｉ、０５）第１９頁
第１４行、＋１６１第１９頁第２１行、（１９）第２１
頁第１行、（２０）第２１頁第８行、３１）第２１頁第
１４行、（４第２１頁第１８行、（イ））第２２頁第２
行、（２４）第２２頁第６行、（支））第２２頁第９行
、（支））第２２頁第１８行、（潤第２３頁第１行、ρ
８８第２４第５行、シ１第２４頁第６〜７行、鈴０）第
２９頁第６行、町）第２９頁第１０行、および（８２第
２９頁第１３行。 ６）明細書第２９頁第５行目の１本発明の−１を削除す
る。 ７）明細書第２９頁第１２行目に］さらに本発明酵素基
本的には、」とあるのを「さらに前記微生物による本酵
素の製造は基本的には、」とｇ］’、ｉｌＦ、する。 ８）明細Ｆ「第２９頁第１５行目に「することＩζある
。１とあるのを１することである。−１とＲＪ正する。 ９）明細書第３０頁第１〜２行目に１だ微生物による本
発明酵素の製造法も適用される。」とあるのを（られた
微生物によつても本酵素は製造することかＣきる。」と
Ｍｌ’ＩＥする。 １０）明細Ｕ（第３０頁第１４行目の１本発明の−１を
削除する。 ＋１）明細Ｈ１１第３７頁第１２〜１３行目に１ヂユ−
膜状もしくは繊維状（ホロフアイバー状）１とあるのを
１（ユー膜状、膜状、繊維状もしくはポロフｒイハ状」
とｉＪ圧する。 １２）明細、１１第４３頁第７〜９行目に１なお、各ア
ミノ酸で行つた。」とあるのを１′なお、Ｌグルタミン
酸り外のアミノ酸は２．０１ｎＭ６１のｍｉｌ’ｉ、を
使用し、Ｌ−グルタミン酸は０．４ｍＭａ度の溶液をｊ
小川して測定し、測定値を換算して相対応答顧を算出し
た。反応はＩ）Ｈ５．５（０．］、］ｌｖｌ酢酸−百′
ｌ酸−ｊ−１リウム緩衝液）で行つた。 １３）明細；１：第４３頁の第４表を次のとおり訂１’
する。 Ｘ′− 一＼、 一−−−−−−−− 第４表 １４）明細書第４４頁第１０行目と第１Ｉ行目の間、実
施例２の記載の後に実施例３としてり下の文章を加入す
る。 １実施例３ 実施例１と同一の操作によつて得られたＬ−りルタミン
酸オキシダーゼ固定化セロフアン膜を円形の小片に裁断
し、過酸化水素電極（■石川製作新製）の電極上に装着
し、さらにこの固定化酵素膜をセルロース透析膜で覆い
、実施例１と同様の構造のＬ−グルタミン酸センザーを
製作した。このセンサーを使用し、実施例１と同様のＬ
−グルタミン酸分析装置を製作した。 上記の装置にＬ−グルタミン酸ナトリウム標準液４連続
的＋ｒｔ−１：入し、電流−一値を測定し、Ｌ−グルタ
ミン酸すトリウム濃度との相関を求め、結果を第１３図
に示した。」 １５）明細：１：第４５頁第３行目までの利用例の記載
の後に次の文章を加入する。 １−また、市販醤ｎ１１にＬ−グルタミン酸ナトリウム
の既知ＩＴＩ：（５−］００１ｔｍｏＩｅ／Ｈｌ）を添
加し、実施例１および実施例３て製作した装置を使用し
て測定し、各々の装置の検量線から醤油中の１７−グル
タミン酸濃度を算出したところほぼ添加用に比例した測
定値が得られた。測定値と添加量との関係を第１４図（
実施例１の装置を使用）および第１５図（実施例３の装
置を使用）に図示する。１１６）明細書第５０頁第１３
行目までの図面の簡単な説明の記載の後に第１３〜１５
図の説明として次の文章を加入する。 ［゛第１３図は実施例３に記載のＬ−グルタミン酸分析
装置を使用して測定した電流−−値とＬ−グルタミン酸
ナトリウム濃度との相関を示すものである。 第１４図は第９図の装置を使用して得られた測定値と醤
油中に添加したＬ−グルタミン酸すトリウムの爪との相
関を示すものである。 第１５図は実施例８に記載のＬ−グルタミン酸分析装置
を使用して得られた測定値と醤浦用月こ添加したＬ−グ
ルタミン酸すトリウムの量との相関を示すものである。 ］ １７）願１１Ｆに追加の図面として別紙図面ニ１葉（セ
Ｓ１３〜１５図）を添イ；ｊするう 箋ｔ３１￥１ 慴 イ。 （ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）被検知物質のレセプター部としての酵素と該酵素の
   作用による分析試料中の化学的もしくは物理的変化を検
   出し、電気信号に変換するトランスデユーサー部とから
   なるバイオセンサーにおいて、酵素としてＬ−グルタミ
   ン酸に対する基質特異性がきわめて高く、Ｌ−グルタミ
   ン酸以外のアミノ酸には実質的に作用せず、安定性の高
   いＬ−グルタミン酸オキシダーゼを使用することを特徴
   とするバイオセンサー。 ２）トランスデユーサー部が分析試料中の化学的変化を
   検出し、電気信号に変換する電極である特許請求の範囲
   第１項記載のバイオセンサー。 ３）レセプター部が固定化酵素からなる特許請求の範囲
   第１または２項記載のバイオセンサー。