JPS5935143A - 活性蛋白固定化用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 定などに広く利用しうる新規な人工担体に関する。

抗原、抗体反応を利用する臨床検査等の分野において、
抗原または抗体をある適当な大きさの粒子を担体として
それに吸着もしくは結合させ、それぞれに対応する抗体
または抗原の存在によってこの感作された担体の凝集を
起させる方法は間接受身凝集反応と呼ばれている。そし
て、この間接受身凝集反応は被検液中の抗体や抗原を高
感度に検出できるので、いろいろの疾患の廂清学的診断
に広く用いられている。

この反応に用いられる担体としては、ポリスチレンラテ
ックス、カオリン、炭末などの非生物学的粒子と、動物
赤血球、細菌菌体のような生物学的粒子とがある。一般
に非生物学的粒子の担体は、化学的に安定で、それ自身
抗原活性を有しないなどの利点はあるが、抗原あるいは
抗体が密に吸着されにくいという欠点がある。たとえば
、保存のために凍結乾燥すると抗原や抗体が担体から遊
離してし捷うのである。そのために、やむ々く液体中で
冷暗所に保存するという手段がとられているが、その結
果長期間保存することができない。また、非生物学的担
体のうち、炭末とカオリンは一定の大きさの粒子を選出
することが困難であり、ポリスチレンラテックスは反応
の媒質として望ましい中性域では非特異凝集である自然
凝集をおこす危険がある。

一方、生物学的担体である動物赤血球や細菌菌体はそれ
ぞれの大きさが一定であるという利点はあるものの、生
物の種類によって粒子の大きさは定まっており、目的に
応じた任意の大きさの粒子を得ることはできない。たと
えば、動物赤血球は大きさの一定した最も入手しやすい
担体であるが、血球表面に固有の抗原を有しており、抗
体との間で非特異凝集反応である交差反応を起こして目
的とする凝集反応に誤まりを与える可能性がある。

さらに、赤血球の生物学的、化学的および物理的特性値
が動物の個体間でばらついてしまって常に一定品質の血
球を入手することが難しいという欠点がある。

本発明者らはこれらの欠点のないすぐれた担体を開発す
べく種々検討の結果、ゼラチン、水溶性多糖類、および
メタリン酸塩を原料として新規な活性蛋白固定化用担体
の製造に成功し、この担体は従来の欠点を尽く解消した
すぐれたものであることを見出して、これに基いて本発
明を完成した。

すなわち本発明は、ゼラチン、水溶性多糖類およびメタ
リン酸イオンを含み、ゼラチンのアミン基間がアルデヒ
ドによって架橋され、２５℃で測定したＰＨ７，２の０
．１５Ｍ’Ｊン酸塩緩衝生理食塩水中の電気泳動度が−
１，１〜−０，８μｍ／ＳｅＣ／Ｖ／Ｃｍにあり、粒径
が１〜１００μの球形であって親水性かつ不溶性の粒子
であることによって特徴づけられた活性蛋白固定化用担
体に関するものである。

まず、本発明の担体はゼラチン、水溶性多糖類およびメ
タリン酸イオンを構成成分として含むものである。

ゼラチンは蛋白質の一種であってコラーケ゛ンより得ら
れたものである。ゼラチンのなかでは酸性ゼラチンが特
に好ましい。

水溶性多糖類は増粘剤まだは糊料として使用しうるもの
であり、多糖類の誘導体および塩も含まれる。例として
は、アラビアゴム、カルボキンメチルセルロース、アル
ギン酸すトリウム、寒天、カラケ゛−ナンなどを挙げる
ことができるが、特にアラビアゴムが好適である。

メタリン酸イオンはメタリン酸塩の一部の陽イオンが離
脱して形成される陰イオンであり、その荷電数は担体粒
子が形成されるＰＨ１原料に用いたメタリン酸塩の種類
などに応じて定まる。メタリン酸塩は化学式。

（ＭＰＯ３）　　　　　Ｍ　：陽イオンｎ二３〜６ で表わされる物質であり、たとえば三メタリン酸ナトリ
ウム、ヘキザメタリン酸すトリウムの如きものである。

担体粒子においては、ゼラチンのアミン基間がアルデヒ
ドによって架橋されており、水溶性多糖類とメタリン酸
イオンはゼラチンと静電的に結合している。そして、メ
タリン酸イオンは粒子の内部にも含壕れているが、特に
表面を取り巻いて電気二重層を形成しているものと思わ
れる。

このような担体粒子の大部分は水であシ、組成としては
ゼラチンが１〜１５チ程度、水溶性多糖類が帆５〜８チ
程度、メタリン酸イオンが０．０５〜３％程度、そして
水分が７０〜９０％程度である。担体粒子は着色されて
いる場合には色素を含（５） み、また、製法に応じて界面活性剤、親水性有機溶媒な
どが混入・している場合もある。

本発明の担体粒子の物性を次に示す。

（］）電気泳動度 ２５℃におけるＰＨ７，２の０．１５　Ｍリン酸塩緩衝
生理食塩水（以下、ＰＢＳと略記する。）中での本発明
の担体粒子の電気泳動度は−１，ｊ〜−０，８μｍ／Ｓ
　ｅ　Ｃ／　Ｖ　／（Ｗｎにある。

（２）外形 直径１〜１００μの球形である。

（３）色 特に着色しなければ無色不透明である。

（４）水に対する態度 親水性 （５）活性蛋白の固定化 本発明の担体粒子は抗原あるいは抗体をヒラ・ゾ赤血球
に感作する公知の方法によってこれらを感作することが
でき、酵素、リンホカイン等の他の活性蛋白を固定化す
ることができる。このような感作方法の例としてはタン
ニン酸、ホルマリン、（６） グルクルアルデヒド、ビルビックアルデヒド、ビスーノ
アソ化ヘンノシン、トルエン−２Ａ−）インシアナート
などを用いる方法を挙げることができる。また、本発明
の担体粒子はアミン基、カルボキシル基、水酸基々とを
活用して酵素を固定化する公知の方法によって酵素、あ
るいは抗原、抗体など各種の活性蛋白を固定化すること
もできる。

このような固定化法の例として、ジアゾカップリング法
、酸アジド化法などを挙げることができる。

このような本発明の担体粒子は、前述のゼラチン、水溶
性多糖類およびメタリン酸塩を含む水溶液を攪拌しつつ
そこに酸を加えてＰＨ２゜５〜６．０に調整し、その後
アルデヒド系架橋剤を作用せしめて不溶化することによ
って製造することができる。

この場合、ＰＨ調整前の溶液におけるこれら各物質の濃
度としては、ゼラチン０．０１〜２％程度、好ましくは
０．０５〜１．０程度、そして水溶性多糖類０．０１〜
２％程度、好ましくは帆０５〜１．０％程度である。メ
タリン酸塩はゼラチン乾燥重量の３〜１５％程度を含有
させるようにするのがよい。各物質はこれらの濃度範囲
において、所望の粒子の粒径および物性に応じて適宜穴
めればよい。

ＰＩ−１調整前の溶液にはそのほかのものとして、親水
性有機溶媒、界面活性剤、着色剤などを適宜加える。

親水性有機溶剤は生成する粒子の物性、特に分散性およ
び硬さなどを改善することができる。親水性有機溶媒の
例としては、低級アルコール、たトエハメチルアルコー
ル、エチルアルコール、７０ロピルアルコール等、およ
びアセトンなどを用いることができ、濃度は４〜２５容
量％程度が好適である。

界面活性剤は生成した粒子の凝集を防止して分散を維持
するためであり、陰イオン系または非イオン系のものが
よい。

陰イオン系界面活性剤の例としては、アルキルスルホコ
ハク酸、アルキルスルホマレイン酸、アルキル硫酸エス
テル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステ
ルなど、そして非イオン系界面活性剤の例としては、ポ
リオキシエチレン脂肪酸エステル、ホリオギシエチレン
アルキルエーテル、ホリオキシエチレンアルキルフェニ
ルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルな
どを挙げることができる。ＰＨ調整前の溶液における濃
度としては、陰イオン系界面活性剤の場合は０．００１
〜０．０１％程度、非イオン系界面活性剤の場合は０．
０１〜０．１％程度で凝集防止効果が得られる。

溶液を冷却すればもっと低い濃度で凝集を防止すること
ができる。

担体を着色する場合には、着色剤を粒子形成前に溶液に
加えておくのがよい。着色を必要とする例としては、本
発明品を間接受身凝集反応の担体として用いる場合を挙
げることができる。すなわち、本発明品は通常は無色不
透明であるところから、これを着色することによって凝
集像の判定を容易にすることができる。着色剤としては
、たとエバ食用赤色３号、ローダミン、ローズベンガル
、月？ン：／−３ＲＸ＆ルドー８１フクシン、エオシン
、および二一一トラルレンド々どの赤色色素、あるいは
クリスタルバイオレット、トルイジンブルー（９） およびメチレンブルーなどの青色色素等を用いうる。し
かしながら、リアクティブ・レッド、ダイレクト・ブル
ーなどの反応性染料で着色すれば色落ちしないことから
、反応性染料が特に好適である。着色剤を添加する場合
には、通常は０．００５〜０．５％程度であるが、反応
性染料を用いればゼラチン乾燥重量の１〜５係程度で足
りる。

このような溶液を調製する過程は問うところではなく、
例えば各々を温水に溶解してから混合してもよく、各々
を一緒に溶解してもよい。しかしながら、各物質の溶解
を容易にするために親水性有機溶媒はあとから加えるの
がよく、また水溶性多糖類には不溶成分も少量含まれて
いることが多いところから、別途に溶解して添加するの
がよい。

一方、ゼラチンは等電点以下のＰＨでは水溶性多糖類と
反応して白濁を生ずるので酸性ゼラチンを用いる場合に
はアルカリを加えて溶液のＰＨを少なくともその付近に
まで高めておくのがよい。しかしながら、この白濁は生
じた後でもアルカリを添加することによって消すことが
できる。いずれにせ（１０） よ、溶液は酸の添加を開始する甘えには白濁のない状態
にしておかなければならない。

溶液の温度はゼラチンのケ゛ル化温度以上でなければ々
らない。この温度はゼラチンの濃度等によって異なるが
通例２５〜３０℃程度である。良好な粒子形成の観点か
ら特に３５〜５０℃程度がよい。

次に、この溶液を攪拌しながら酸を加えてＰ１１２．５
〜６．０に調整する。この工程は１で子を生成させると
ころである。均一な粒子を形成させるために、３５〜５
０℃に加温を続け、適度に攪拌しながら酸を滴下してい
くのがよい。Ｐ１１２゜５〜６．０の範囲における至適
のＰＨは原料溶液の組成および目的とする粒径によって
異なるので予め実験を行なって定めるのがよい。たとえ
ば得られた粒子を抗原感作用担体に用いる場合には２〜
１０μ程度の粒径にするのがよく、その場合至適のＰＨ
は４．０〜５．５の範囲にある。とのＰＨ調整に使用す
る酸は特に限定されるものではなく無機酸でも有機酸で
もよいが、なるべくおだやかなものがよく、たとえは酢
酸などが好適である。

本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンのケ゛ル化
温度以下に下げても消失しないので母液との乎衡関係は
ない。

酸の添加後は生成した粒子の凝集を防止するために速か
に粒子分散液を冷却するのがよい。そして、液温が１０
℃以下になっ／こところでアルデヒド系架橋剤を添加し
て粒子を不溶化する。この架橋剤の添加量はゼラチン乾
燥重量の０．１〜２００係程度であり、添加後は一夜程
度放置して架橋反応を充分に行なわせる。架橋剤の例と
しては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリ
オキザール、クロトンアルデヒド、アクロレイン、アセ
トアルデヒドなどを挙げることができるが、特にグルタ
ルアルデヒドが好適である。

アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離等で回収
して、必要により洗浄する。洗浄液は粒子分散のために
用いた界面活性剤と同じものを同濃度で含む水で２〜３
回行なえばよい。

このようにして得られた担体を種々の用途に供ずればよ
いが、架橋が不充分な場合には塩類溶液中で膨潤するこ
とがある。そこでこのような用途に用いる場合にはアル
デヒド系架橋剤で処理して膨潤を防止するのがよい。例
えば、抗原を感作する場合にはリン酸緩衝液中で行なう
ので、赤血球を固定化する条件でホルマリン処理する。

この処理によって膨潤を防止するとともにホルマリンの
殺菌効果によって長期間の保存に耐える担体が得られる
。

本発明の担体は例えば間接受身凝集反応の担体として従
来段もすぐれているとされていた動物赤血球と同等な性
能を有し、さらに化学的、物理的に均質かつ安定であり
、抗原活性がなく任意の粒径のものを容易かつ安価に大
量生産できるなど動物赤血球にない幾多の利点を有する
ものである。

以下、担体の製造例および使用例を示す。なお、本明細
書において、係は特に記載がなければ重量係を表わして
いる。

製造例１ 等電点がＰＨ９であるゼラチン４ｇを４０℃の温（１３
） 水に１．００　ｍｌになるように溶解し、１０％の水酸
化ナトリウム溶液を用いてＰＨ９に調整した。アラビア
ゴム４ｇを１００ｍ１になるように水に溶解し、不溶物
を戸別しだ後４０℃に加温した。

このようにして得られたゼラチン溶液５０ｍ１とアラビ
アゴム溶液５Ｑｍｌを混合し、この混合液をあらかじめ
４０℃に加温した３０容量係のメチルアルコール溶液３
００ｍ１に注ぎ入れ、よく攪拌した。これに１０チヘキ
サメタリン酸ナトリウム溶液１．６ｍｌ、　　１％アル
キルスルホマレイン酸（商品名デモールＥ　）溶液２ｍ
ｌ、および１％ダイレクトブルー溶液５　ｍｌを加えて
よく攪拌した。

次いで、４０℃に保ちながら１０容量係の酢酸溶液を滴
下してＰＨ４，８に調整し、粒子を生成させた。

とのＰＩ］調整によって得られた粒子分散液を水冷して
５℃にしてからゲルタールアルデヒド１．３ｇを加え、
よく攪拌後との温度で一夜静置した。それからこの粒子
分散液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して粒子ｋ
　、６レツドとして回収した。この（１４） 粒子を０．００５　％デモールＥ溶液に懸濁して遠心分
ｐ 離する洗浄操作を３回繰返してから、４容量係ホルマリ
ン溶液に分散し、５℃で１週間放置した。

本例で得られた担体粒子は７．７ｇであり、その７５％
が３〜６μの範囲にあった。

この担体粒子の電気泳動度を測定した。装置には米国ペ
ン・ケン社（Ｐｅｎ　Ｋｅｎ　Ｉｎｃ。）製のレーザー
・ノー・システム３０００　（Ｌａ５ｅｒ　Ｚｅｅ　ｓ
ｙｓｔｅｍ３０００）を用い、２５℃で測定を行なった
。測定方法としては、この粒子をｐＨ７，２の０．１５
ＭＰＢＳ中に懸濁し、その１ｍｌを直径１間で長さが２
０箇の円筒状電気泳動セルに入れ、１ｍ当り］−０４，
８Ｖの電圧勾配をかけて泳動速度を測定した。その結果
、この粒子の電気泳動度は−０，９６９±０．００９μ
ｍ／８　ｅ　Ｃ／　Ｖ　／Ｃｍであった。一方、同じ条
件で製造した着色していない粒子についても電気泳動度
を測定したところ、−０，９７２士帆０ｌ２１℃ｍ／　
ｓｅｅ　／Ｖ／ｃｔｎ　であった０ 製造例２ 下記の点を除いて製造例１と同様にして担体粒頂を調製
した。

すなわち、捷ずアラビアゴム４ｇのがわりにカルボキシ
メチルセルロース１ｇを、そして３ｏ容量係のメチルア
ルコール溶液のかわシに３０容量％エチルアルコール溶
液を用いた。それから、添加量についても、ゼラチン１
０襲へキサメタリン酸す）　ＩＪウム溶液、１係デモー
ルＥ溶液、１％ダイレクトブルー溶液、およびグルタル
アルデヒドをいずれも４分の１にした。丑だ、ＰＩ−１
も４．８から４．６にしだ。

このようにして得られた担体粒子は３．８ｇであり、そ
の９０％が１〜２μの範囲にあった。

製造例３ 下記の点を除いて製造例１と同様にして担体粒子を調製
した。

すなわち、ゼラチン溶液を５０ｍ１から４０ｍ１にし、
アラビアゴム溶液を５０ｍ１から６０　ｍ、ｌに変えた
。それから、１０％へキサメタリン酸ナトリウム溶液を
１．６ｍｌから１゜２ｍｌに、１％ダイレクトブルー溶
液を６〃ｌｌから４．８ｍｌに、そしてグルタルアルデ
ヒドを１．３ｇから１．０ｇにそれぞれ変えた。

また、酢酸滴下終了ＰＨを４，６とした。

本例で得られた担体粒子は６．４ｇであり、その９０％
が１〜２μの範囲にあった。

この担体粒子の電気泳動度を製造例１と同様にして測定
したところ−０，９３９±０．０５９μｍ　／　Ｓ　ｅ
　Ｃ／Ｖ　７ｃｍであった。

製造例４ 下記の点を除いて製造例１と同様にして担体粒子を調製
した。

すなわち、ゼラチン溶液を５０ｍ１から６０ｍ１にしア
ラビアゴム溶液を５０ｍ１から４（Ｊｍｌに変えた。

それから、１０％へキサメタリン酸ナトリウム溶液を１
．６ｍｌから２　ｍｌに、１％ダイレクトブルー溶液ｋ
　６ｍｔ：かう７．２ｍｌに、そしてグルタルアルデヒ
ドを１．３ｇから１．８ｇにそれぞれ変えた。また、酢
酸滴下終了ＰＨを４．８とした。

本例で得られた担体粒子の収量は８゜６Ｉであり得られ
た粒子の７５％が３〜６μの範囲にあった。

この担体粒子の電気泳動度を製造例１と同様に（１７） して測定したところ−Ｑ、９９６±０．０４０μｍ／　
ｓｅｃ　／ｖ／ｍであった。

製造例５ 等電点がＰＨ９であるゼラチン４ｇを４０℃の温水に１
００ｍＪになるように溶解し、１０％の水酸化すトリウ
ム溶液を用いてＰＨ９に調整した。アラビアゴム４Ｉを
１００ｍＪになるように水に溶解し、不溶物をｐ別後４
０℃に加温した。

」二記のゼラチン溶液５０ｍ１およびアラビアゴム溶液
５０ｍ１を混合し、これに３０容量チエチルアルコール
溶液３００ｍｌ、　　１０　％へキサメタリン酸ナトリ
ウム溶液１．６ｍｌ、および１チリアクテイブレンド溶
液６　ｍｌを加えてよく攪拌し、全体を４０℃に加温し
た。

次いで、この混合液を攪拌しながら１０容量チの酢酸溶
液を滴下してｐＨ５，０に調整した。

ＰＨ調整により生成した粒子分散液を水浴中でただちに
５℃まで冷却し、グルタルアルデヒド１．３ｇを加えた
。そして、よく攪拌しだ後５℃で一夜静置した。それか
らこの粒子分散液を２０００　ｒｐｍ（１８） で］００分間遠心離して粒子（ｍ−”レットとじて回収
した。この粒子を０．００５　％のデモール、■％溶液
に懸濁して遠心分離する洗浄操作を３回繰返してから４
容量係ホルマリン溶液に分散し、５℃で１週間静置した
。

こうして得られた担体粒子の収量は６．４　ｇであり、
得られた粒子の７５係は３〜６μの範囲にあった。

製造例６ 等電点がＰＩ］９であるゼラチン４ｇを４０℃の温水に
１００ｍ１になるように溶解し、１０％の水酸化すトリ
ウム溶液でＰＨ９に調整した。アラビアゴム４ｇを１０
０ｍ１に々るように水に溶解し、不溶物を戸別しだ後４
０℃に加温した。

ゼラチン溶液５０ｍ１とアラビアゴム溶液５０ｍ１を混
合し、これに４０℃の蒸溜水３００ｍ１１１０係へキサ
メタリン酸す）・リウム溶液１．６ｎ＋／、および１％
ダイレクトブルー溶液６ｍｌを加えた０次いで、この溶
液を４０℃に保ち、攪拌しながら１０容量チ酢酸溶液を
滴下してｐＨ４，８に調整し、粒子を生成させた。

粒子分散液を氷冷して５℃にしてからゲルタールアルデ
ヒド１．３ｇを加え、よく攪拌後との温度で一夜静置し
た。それからこの粒子分散液を２０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離して粒子を技レットとじて回収した。この粒
子を粒子濃度が５係に々るように４容量係のホルマリン
溶液に分散し、５℃で１週間静置した。

本例で得られた粒子は７．５ｇであり、その７５％が２
〜３．２μの範囲にあった。

使用例１ 製造例１で得られた担体粒子を、下表に示す濃度のタン
ニン酸を含むＰＨ７，２のリン酸塩緩衝生理食塩水（以
下、ＰＢＳと略記する。）中に粒子濃度が２．５飴にな
るように分散し、３７℃で１５分間加温した。粒子を遠
心分離して生理食塩水で充分洗浄した。

梅毒病原体トレポネーマ・・やリーダム（以下、ＴＰと
略記する。）菌体をＰＨ６，／ｌ０ＰＢＳ中に浮遊させ
超音波で菌体を破壊してＴＰ抗原液とした。

前記のタンニン酸処理粒子をＰＢＳに５％の濃度に分散
し、この分散液を下表に示す倍数で希釈したＴＰ抗原液
と等容づつ混合した。混合液を３７℃で４０分間加温し
て、粒子にＴＰ抗原を感作したＯ ＴＰ抗原感作粒子を遠心分離してＰＨ６，４のＰＢＳで
充分洗浄し、分散用メディウムに濃度が５％になるよう
に分散した。

このようにして得られたＴＰ抗原感作粒子分散液に用い
、マイクロプレート法で梅毒陽性血清と反応させ／こと
ころ下表に示す如き結果が得られた。

なお、対照としてヒツジ赤血球を担体に用いた場合の結
果もあわせて下表に示す。

（２１） （２２） 使用例２ 製造例１で得られた担体粒子をタンニン酸１０ｐｐｍを
含むｐＨ７，２のＰＢＳ中に粒子濃度が２．５％になる
」＝うに分散し、３７℃で１５分間加温した。

粒子を遠心分離して生理食塩水で充分洗浄し、１係にな
るようにＰＨ７，２のＰＢＳ中に分散した。一方、高純
度に精製したストレプトキナーゼをＰＨ７，２ノＰＢＳ
に１２８　Ｕ／ｍｌになるように溶解した。

タンニン酸処理粒子分散液４ｍｌとストレノ１〜キナー
ゼ溶液４　ｍｌとを混合し、３７℃で３０分間加温した
。その後、粒子を遠心分離してＰＨ７，２のＰＢＳで洗
浄し、粒子濃度１％になるようにＰＨ７，５のゼラチン
緩衝液に分散した。なお、ゼラチン緩衝液はゼラチン５
．！ｉ’、塩化ナ塩化ナトリウム１．拙である。

この粒子分散液のストレプトキナーゼ活性は約６０Ｕで
あったので、溶液中の酵素の約１２係が粒子に固定され
たことになる。

酵素活性の測定方法は次のように行なった。すなわち、
酵素溶液丑たは粒子分散液０．２５ｍ１にヒトプラズマ
Ｏ０１．　ｍｌおよびトロンビン溶液０．０５ｍ１ｆ加
えて３７℃で３０分間加温した。トロンビン溶液は５０
０単位のトロンビンをホウ酸緩衝液で８０倍に希釈した
ものである。酵素活性は、線凝固を阻止するストレプト
キナーゼの最大希釈倍数で示した。

特許出願人　富士臓器製薬株式会社 代理人弁理士　１）　中　　政　　浩

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ゼラチン、水溶性多糖類およびメタリン酸イオンヲ含み
   、ゼラチンのアミン基間がアルデヒドによって架橋され
   、２５℃で測定したｐＨ７，２の００１５Ｍ　ＩＪン酸
   塩緩衝生理食塩水中の電気泳動度が−１，１〜−０，８
   μｍ／ｓｅｃ／Ｖ／ｃｍにあり、粒径が１〜１００μの
   球形であって親水性かつ不溶性の粒子であることによっ
   て特徴づけられた活性蛋白固定化用担体。