JPS5937947B2 - 新規ピログルタミン酸ヒドロラ−ゼ及びその酸素を用いたｌ−ヒログルタミン酸の定量方法 - Google Patents
新規ピログルタミン酸ヒドロラ−ゼ及びその酸素を用いたｌ−ヒログルタミン酸の定量方法Info
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- JPS5937947B2 JPS5937947B2 JP53083548A JP8354878A JPS5937947B2 JP S5937947 B2 JPS5937947 B2 JP S5937947B2 JP 53083548 A JP53083548 A JP 53083548A JP 8354878 A JP8354878 A JP 8354878A JP S5937947 B2 JPS5937947 B2 JP S5937947B2
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は公知のピログルタミン酸ヒドロラーゼとは種々
の特性において異なる新規なピログルタミン酸ヒドロラ
ーゼし一ピログルタミン酸の定量方法に関する。
の特性において異なる新規なピログルタミン酸ヒドロラ
ーゼし一ピログルタミン酸の定量方法に関する。
本発明のピログルタミン酸ヒドロラーゼはＡＴＰのみを
基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有しない新規な
酵素である。
基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有しない新規な
酵素である。
従来のピログルタミン酸ヒドロラーゼはピロリドンカル
ボン酸ヒドロラーゼ５−オキソプロリナーゼとも呼ばれ
る酵素であるが、ＡＴＰを基質とした場合にもＡＴＰ加
水分解活性を有しているため、Ｌ−ピログルタミン酸を
ＡＴＰなどの関与によす開環して、Ｌ−ピログルタミン
酸を生成する際に、ホスホエノールピルベート及びピル
ベートキナーゼを添加することが必須であり、更に従来
のピログルタミン酸ヒドロラーゼの活性が弱いため酵素
の使用量が多く、反応系の蛋白質濃度が高くなり、この
ため反応終了後除蛋白等の処理を施した後アミノ酸アナ
ライザー等による機器分析によりＬ−グルタミン酸の測
定を行なっていた。
ボン酸ヒドロラーゼ５−オキソプロリナーゼとも呼ばれ
る酵素であるが、ＡＴＰを基質とした場合にもＡＴＰ加
水分解活性を有しているため、Ｌ−ピログルタミン酸を
ＡＴＰなどの関与によす開環して、Ｌ−ピログルタミン
酸を生成する際に、ホスホエノールピルベート及びピル
ベートキナーゼを添加することが必須であり、更に従来
のピログルタミン酸ヒドロラーゼの活性が弱いため酵素
の使用量が多く、反応系の蛋白質濃度が高くなり、この
ため反応終了後除蛋白等の処理を施した後アミノ酸アナ
ライザー等による機器分析によりＬ−グルタミン酸の測
定を行なっていた。
そこで本発明者らはかかる現況に鑑み、ホスホエノール
ピルベート及びピルベートキナーゼ゛を用いなく−とも
Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸を効率よく
生成せしめる方法及び得られたＬ−グルタミン酸を直接
酵素法により測定することにより、血清、尿中などに存
在するＬ−ピログルタミン酸又は食品中に含まれるし一
ピログルタミン酸を定量する方法について鉛量研究を重
ねた結果、アルカリゲネス（Ａｌ ｃａ ｌｉｇｅｎｅ
ｓ ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｌ
ｒｉｕｍ ）属及びアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ ）属に属する細菌が従来になく高いピロ
グルタミン酸ヒドロラーゼ活性を有し、かつＡＴＰのみ
を基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有しない酵素
を生産することを見出し、かかる知見に基すいて本発明
を完成した。
ピルベート及びピルベートキナーゼ゛を用いなく−とも
Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸を効率よく
生成せしめる方法及び得られたＬ−グルタミン酸を直接
酵素法により測定することにより、血清、尿中などに存
在するＬ−ピログルタミン酸又は食品中に含まれるし一
ピログルタミン酸を定量する方法について鉛量研究を重
ねた結果、アルカリゲネス（Ａｌ ｃａ ｌｉｇｅｎｅ
ｓ ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｌ
ｒｉｕｍ ）属及びアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ ）属に属する細菌が従来になく高いピロ
グルタミン酸ヒドロラーゼ活性を有し、かつＡＴＰのみ
を基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有しない酵素
を生産することを見出し、かかる知見に基すいて本発明
を完成した。
すなわち本発明は、ＡＴＰのみを基質とした場合にＡＴ
Ｐ加水分解活性を有しないピログルタミン酸ヒドロラー
ゼであり、また本発明はＡＴＰのみを基質とした場合に
ＡＴＰ加水分解活性を有しないピログルタミン酸ヒドロ
ラーゼを用いてＬ−ピログルタミン酸を分解し、得られ
たＬ−グルタミン酸を測定することを特徴とするＬ−ピ
ログルタミン酸の定量方法である。
Ｐ加水分解活性を有しないピログルタミン酸ヒドロラー
ゼであり、また本発明はＡＴＰのみを基質とした場合に
ＡＴＰ加水分解活性を有しないピログルタミン酸ヒドロ
ラーゼを用いてＬ−ピログルタミン酸を分解し、得られ
たＬ−グルタミン酸を測定することを特徴とするＬ−ピ
ログルタミン酸の定量方法である。
以下本発明に説明する。
先ず本発明の精製酵素（ピログルタミン酸ヒドロラーゼ
）の理化学的性質を以下に記載する。
）の理化学的性質を以下に記載する。
（１） 作用及び基質特異性
本酵素はホスホエノールピルベート及びピルベートキナ
ーゼを用いることなくＬ−ピログルタミン酸及びＡＴＰ
から定量的にＬ−グルタミン酸及びＡＤＰ、Ｐｉを生成
する反応を触媒する酵素であり、ＡＴＰのみを基質とし
た場合にＡＴＰ加水分解活性を有しない。
ーゼを用いることなくＬ−ピログルタミン酸及びＡＴＰ
から定量的にＬ−グルタミン酸及びＡＤＰ、Ｐｉを生成
する反応を触媒する酵素であり、ＡＴＰのみを基質とし
た場合にＡＴＰ加水分解活性を有しない。
（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ
至適ｐＨは７．５〜８．２に存在し、４°Ｃ２０時間処
理でｐＨ５〜９の範囲で安定であった。
理でｐＨ５〜９の範囲で安定であった。
（３）力価の測定法
０．５モルトリス塩酸緩衝液（ｐ）（７，８） ０．１
ｍ７ 。
ｍ７ 。
０．０５モル塩化マグネシウム溶液ｏ、 １７７１１，
１モル塩化カリウム０．０８ｍ１，０．２モルＬ−ピロ
グルタミン酸ソーダ溶液０．１ ｍ、１．及び０．１モ
ルＡＴＰＯ１１ｍｌを蒸留水で０．９ｍｌにした後、任
意な濃度の本酵素液０．１ ｍｌを加え、３０°Ｃ２０
分間反応させた後直ちに１００Ｃの沸トウ水中で２分間
保持し得られた反応液中のＬ−グルタミン酸の定量を行
ない、Ｌ−ピログルタミン酸１マイクロモルを１分間で
分解する酵素量を１単位Ｕとした、又ＡＴＰ分解活性は
Ｌ−ピログルタミン酸ソーダを除いた上記反応液にて反
応させ同様に処理した後得られた反応液中のＡＤＰ又は
無機リン酸（Ｐｉ）の定量を行ない、ＡＤＰ又はＰｉｌ
マイクロモルを１分間で分解する酵素量を１単位Ｕとし
た。
１モル塩化カリウム０．０８ｍ１，０．２モルＬ−ピロ
グルタミン酸ソーダ溶液０．１ ｍ、１．及び０．１モ
ルＡＴＰＯ１１ｍｌを蒸留水で０．９ｍｌにした後、任
意な濃度の本酵素液０．１ ｍｌを加え、３０°Ｃ２０
分間反応させた後直ちに１００Ｃの沸トウ水中で２分間
保持し得られた反応液中のＬ−グルタミン酸の定量を行
ない、Ｌ−ピログルタミン酸１マイクロモルを１分間で
分解する酵素量を１単位Ｕとした、又ＡＴＰ分解活性は
Ｌ−ピログルタミン酸ソーダを除いた上記反応液にて反
応させ同様に処理した後得られた反応液中のＡＤＰ又は
無機リン酸（Ｐｉ）の定量を行ない、ＡＤＰ又はＰｉｌ
マイクロモルを１分間で分解する酵素量を１単位Ｕとし
た。
（４）作用適温の範囲
１０分間反応で３０〜５５°Ｃで良く作用する。
（５） ｐＨ温度などによる失格条件
４°Ｃ２２０時間処理の場合にはｐＨ５以下、ｐＨ９以
上で失活する。
上で失活する。
１０分間処理の時は５０°Ｃ以上で失活が初まり、５６
°Ｃで５７％安定、６０°Ｃで完全失活する。
°Ｃで５７％安定、６０°Ｃで完全失活する。
（６）阻害、活性化及び安定化
１ｍＭパラクロロマーキュリーベンヅエート（ＰＯＭＢ
）、１ｍＭＮ−エチルマレイイミド（ＮＥＭ）及び１０
ｍＭオルソフェナントロリン−１０分間処理で失活０．
１ｍＭシナオスレイトール（ＤＴＴ）及び１０％グリセ
リン添加により安定化する。
）、１ｍＭＮ−エチルマレイイミド（ＮＥＭ）及び１０
ｍＭオルソフェナントロリン−１０分間処理で失活０．
１ｍＭシナオスレイトール（ＤＴＴ）及び１０％グリセ
リン添加により安定化する。
（７）精製方法
粗酵素液に硫安を添加し、３０％飽和の沈澱区分を除去
し、更に硫安を添加し５０％飽和沈澱区分を得る。
し、更に硫安を添加し５０％飽和沈澱区分を得る。
これを０．０１モルリン酸緩衝液（ｐｌ（７，０）に懸
濁後透析し、更に透析後上記緩衝液で平衝化したＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラムにて食塩グラジェント溶出を行な
い得られたピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性区分を、
上記緩衝液で平衝化したＮ、０．Ｋａｐ ｌ ａｎ等の
方法により調整したｇ−アゾーＡＴＰ−セファローヌカ
ラムにてＡＴＰグラジェントを行ない、１〜５ｍＭ濃度
近辺の活性区分を得る。
濁後透析し、更に透析後上記緩衝液で平衝化したＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラムにて食塩グラジェント溶出を行な
い得られたピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性区分を、
上記緩衝液で平衝化したＮ、０．Ｋａｐ ｌ ａｎ等の
方法により調整したｇ−アゾーＡＴＰ−セファローヌカ
ラムにてＡＴＰグラジェントを行ない、１〜５ｍＭ濃度
近辺の活性区分を得る。
（アフイニイテルクロマト）。
更にＬ−ピログルタミン酸−ＡＨ−セファロースカラム
（アフイニイテイークロマト）にて食塩グラジェントを
行ない、活性区分を濃縮して、バイオケ’）Ｌ／Ａ −
０，５ｍによりゲル濾過を行ない精製酵素を得る。
（アフイニイテイークロマト）にて食塩グラジェントを
行ない、活性区分を濃縮して、バイオケ’）Ｌ／Ａ −
０，５ｍによりゲル濾過を行ない精製酵素を得る。
（８）分子量 沈降平衝法により１２３．０００゜（９
）等電点 焦点電気泳動を用いて測定した結果ｐＨ５，０５である
。
）等電点 焦点電気泳動を用いて測定した結果ｐＨ５，０５である
。
００）元素分析値（イ）
０ ５２．３．Ｈ６，９，Ｎ １７．３゜０ ２２．
４，８ １．２ 本発明酵素は従来にないＡＴＰのみを基質とした場合に
、ＡＴＰ加水分解活性を有しない基質特異性を有し、か
つ極めて高いピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性を示す
ことから、本発明酵素は公知の何れのピログルタミン酸
ヒドロラーゼとも異なって新規な酵素と認められる。
４，８ １．２ 本発明酵素は従来にないＡＴＰのみを基質とした場合に
、ＡＴＰ加水分解活性を有しない基質特異性を有し、か
つ極めて高いピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性を示す
ことから、本発明酵素は公知の何れのピログルタミン酸
ヒドロラーゼとも異なって新規な酵素と認められる。
次に本酵素を製造するだめの具体的手段について以下に
述べる。
述べる。
先ず製造原料としては類例なる起源のものでもよいが例
えば微生物起源殊にアルカリ土類金属、ブレビバクテリ
ウム属及びアシネトクター属に属し、上記したピログル
タミン酸ヒドロラーゼを生産する能力を有する菌株を用
いるのが本酵素を製造する上で特に有利である。
えば微生物起源殊にアルカリ土類金属、ブレビバクテリ
ウム属及びアシネトクター属に属し、上記したピログル
タミン酸ヒドロラーゼを生産する能力を有する菌株を用
いるのが本酵素を製造する上で特に有利である。
そしてアルカリ土類金属に属する菌株の具体的な例とし
てはアルカリゲネス（Ａｌ ｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ ）
ＳＰ、Ｆ−１３７（微工研菌寄第４５６３号）、アルカ
リゲネス・フェカリス（Ａｔ ｃａ ｌ ｉ ｇｅｎｅ
ｓｆａｅｃａｌｉｓＸＡＴｃｃ８７５０）等、ブレビバ
クテリウム属に属する菌株の具体例としては、ブレビバ
クテリウム・フスカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｆｕｓｃｕｍ）（ＡＴｃｏ １５９９３ ）、アシネ
トバクタ−属に属する菌株の具体例としてはアシネトバ
クタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ） １００ （
微工研菌寄第３７８７号）等が挙げられ、これらの菌の
変種もしくは変異株も用いることができる。
てはアルカリゲネス（Ａｌ ｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ ）
ＳＰ、Ｆ−１３７（微工研菌寄第４５６３号）、アルカ
リゲネス・フェカリス（Ａｔ ｃａ ｌ ｉ ｇｅｎｅ
ｓｆａｅｃａｌｉｓＸＡＴｃｃ８７５０）等、ブレビバ
クテリウム属に属する菌株の具体例としては、ブレビバ
クテリウム・フスカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｆｕｓｃｕｍ）（ＡＴｃｏ １５９９３ ）、アシネ
トバクタ−属に属する菌株の具体例としてはアシネトバ
クタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ） １００ （
微工研菌寄第３７８７号）等が挙げられ、これらの菌の
変種もしくは変異株も用いることができる。
上記したアルカリゲネスＳＰ、Ｆ−１３７は、本発明者
らが土壌中より分離した菌株の１菌種でその菌学的性質
は以下に示す通りである。
らが土壌中より分離した菌株の１菌種でその菌学的性質
は以下に示す通りである。
なお菌学的性質は概ねマニュアル・オブ・マイクロバイ
オロジカル・メソツヅ（マグロ−・ヒル・ブック・カン
パニー社出版、１９５９年）記載の方法に準拠した。
オロジカル・メソツヅ（マグロ−・ヒル・ブック・カン
パニー社出版、１９５９年）記載の方法に準拠した。
ａ 形態的性質
顕微鏡的観察（肉汁寒天培地で３７°Ｃ１１２時間培養
） （１）細胞の形および大きさ： ０．５〜１．ＯＸｌ、０〜２．６ミクロンの短桿菌（２
）細胞の多形性：認められない。
） （１）細胞の形および大きさ： ０．５〜１．ＯＸｌ、０〜２．６ミクロンの短桿菌（２
）細胞の多形性：認められない。
（３）運動性：あり。
（４）胞子の有無 ：形成せず。
（５）ダラム染色性：陰性。
（６）抗酸性：陰性。
ｂ 各培地における生育状態：
（１）肉汁寒天平板培養：
３７°Ｃ１２４時間培養で直径２〜３朋。
コロニーは円形表面扁平、平滑、周縁、金縁の集落を形
成、わずかに褐色味を帯びた乳白色で半透明の鈍い光沢
をもつ。
成、わずかに褐色味を帯びた乳白色で半透明の鈍い光沢
をもつ。
（２）肉汁寒天斜面培養：
３７°Ｃ１２４時間で線状ないしやや拡布状にに良く生
育する、色、光沢は平板培養と同様。
育する、色、光沢は平板培養と同様。
（３）肉汁液体培養：
３７°Ｃ４８時間で均一に生育する、沈澱物を形成する
。
。
（４）肉汁寒天穿刺培養：
３７°Ｃ１２４時間で上部に良く生育し、ガスの発生は
ない。
ない。
（５）肉汁ゼラチン穿刺培養：
表面に生育するが、３０°Ｃ１４８時間ではゼラチンを
液化しない。
液化しない。
（６） リドマスミルク
３０°Ｃ１７２時間ではアルカリ性であり、凝固せず、
変化は認められない。
変化は認められない。
Ｃ生理的性質
（１）硝酸塩の還元 ： 陽 性。
（２）脱窒反応 ： 陰 性。
（３）ＭＲテスト ： 陰 性。
（４）ＶＰテスト ： 陰 性。
（５）インドールの生成 ： 陰 性。
（６）硫化水素の生成 ： 陰 性。
（７）デンプンの加水分解： 陰 性。
（８）クエン酸の利用 ： ｋｏｓｅｒの培地、Ｃ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地とも利用０（９）無機窒素
源の利用 ： 硝酸塩アンモニウム塩とも利用する。
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地とも利用０（９）無機窒素
源の利用 ： 硝酸塩アンモニウム塩とも利用する。
（１０）色素の生成 ： な し。
０υ ウレアーゼ ： 陰 性。
０２）オキシダーゼ ： 陽 性。
（１３）カタラーゼ ： 陽 性。
（１４）生育ｐＨ：５〜１１（最適ｐＨ６〜８）０５）
生育温度：２０〜４５゛α最適温度３０〜４０°Ｃ）（
１６）酸素に対する態度 ： 好気性。
生育温度：２０〜４５゛α最適温度３０〜４０°Ｃ）（
１６）酸素に対する態度 ： 好気性。
α７） ０−Ｆ テスト：いずれの場合も酸生成は
なし。
なし。
（１８）糖類からの酸およびガスの生成：（１）Ｌ−ア
ラビノース、（２）Ｄ−キシロース （３）Ｄ−グルコ
ース （４）Ｄ−マンノース （５）Ｄ −フラクトー
ス （６）Ｄ−ガラクトース （７）麦芽糖 （８）シ
ョ糖 （９）乳糖 ００）トレノ・ロース ０１）Ｄ−
ソルビット （１２）Ｄ−マンニット （１３）イノジ
ット （１４）クリセリン （１５）デンプンのいずれ
の糖類からも酸およびガスの生成なし。
ラビノース、（２）Ｄ−キシロース （３）Ｄ−グルコ
ース （４）Ｄ−マンノース （５）Ｄ −フラクトー
ス （６）Ｄ−ガラクトース （７）麦芽糖 （８）シ
ョ糖 （９）乳糖 ００）トレノ・ロース ０１）Ｄ−
ソルビット （１２）Ｄ−マンニット （１３）イノジ
ット （１４）クリセリン （１５）デンプンのいずれ
の糖類からも酸およびガスの生成なし。
ｄ 諸性質
（１）栄養要求性なし。
（２） コハク酸、ケロン酸、フマール酸、Ｌ−ピロ
グルタミン酸等の有機酸を利用する。
グルタミン酸等の有機酸を利用する。
（３）Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸
等のアミノ酸を良く利用する。
等のアミノ酸を良く利用する。
（４）亜ヒ酸酸化能は弱い。
上述のピログルタミン酸ヒｌｓｏラーゼ生産能を有する
菌株の分類学的諸性質を「バージエイス・マニュアル・
オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版（
１９７４年）の分類と対比すると、本菌はアルカリ土類
金属に属するものと判定されるが、種にいたって・は４
種の記載しかなく、その分離源及び２〜３の性質からア
ルカリゲネス・フェカリスに近縁な菌株と考えられる。
菌株の分類学的諸性質を「バージエイス・マニュアル・
オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版（
１９７４年）の分類と対比すると、本菌はアルカリ土類
金属に属するものと判定されるが、種にいたって・は４
種の記載しかなく、その分離源及び２〜３の性質からア
ルカリゲネス・フェカリスに近縁な菌株と考えられる。
即ち、ピログルタミン酸ヒドロラーゼ生産能を有する本
発明使用菌株はダラム陰性、好気性の無胞子短桿菌で周
毛１〜４本を有し、運動性があり、グリコースを利用出
来ず、オキシダーゼ陽性で、菌体は乳白色であることか
らアルカリ土類金属に属するものと認められ、糖の利用
性からアルカリゲネス・フェカリスに近縁と目されるが
、有機酸アミノ酸の利用性で異なっており、又亜ヒ酸の
酸化能もほとんど認められない等生理的性質に相異点が
ある。
発明使用菌株はダラム陰性、好気性の無胞子短桿菌で周
毛１〜４本を有し、運動性があり、グリコースを利用出
来ず、オキシダーゼ陽性で、菌体は乳白色であることか
らアルカリ土類金属に属するものと認められ、糖の利用
性からアルカリゲネス・フェカリスに近縁と目されるが
、有機酸アミノ酸の利用性で異なっており、又亜ヒ酸の
酸化能もほとんど認められない等生理的性質に相異点が
ある。
これをまとめて示すと第１表の如くである。次に上記し
たアシネトバクタ−１００は、本発明者らが腐植土中よ
り検策して得た新菌体で、その菌学的性質は以下に示す
通りである。
たアシネトバクタ−１００は、本発明者らが腐植土中よ
り検策して得た新菌体で、その菌学的性質は以下に示す
通りである。
なお菌学的性状の診断実験は前記記載の方法に準拠した
。
。
ａ形態
顕微鏡的観察（肉汁寒天培地で３７℃、１２時間培養）
１ 細胞の形および大きさ：
０．５〜１．５Ｘ１．０〜２．５ミクロンの球菌に近い
短桿菌。
短桿菌。
２ 細胞の多形性：
停滞期では球菌に近く又少数ではあるが、フィラメント
状を呈する異常細胞も認められる。
状を呈する異常細胞も認められる。
（３）運動性 ：な し。
（４）胞子の有無 ：形成せず。
（５）ググラム染色性 ：陰 性。
（６）抗酸性 ：陰 性。
ｂ 各培地における生育状態
（１）肉汁寒天平板培養：
３０°Ｃ１２４時間培養で直径２〜３ ｍｍ。
コロニーは円形、表面扁平、平滑。
周縁、金縁の集落を形成、わずかに黄色味を帯びた乳白
色で半透明の鈍い光沢をもつ。
色で半透明の鈍い光沢をもつ。
（２）肉汁液体培養：
３０°Ｃ１２４時間で線状ないしやや拡布状に良く生育
する。
する。
色、光沢は平板培養と同様。（３）肉汁液体培養：
３０°Ｃ１４８時間で均一に良く生育する、況澱物を形
成する。
成する。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：
表面及至上部に生育するが、３０°Ｃ１４８時間ではゼ
ラチンを液化しない。
ラチンを液化しない。
（５） リドマス・ミルク
３０°Ｃ１２４時間ではわずかに酸性であり、凝固せず
、変化は認められない。
、変化は認められない。
Ｃ生理的性質
（１）硝酸塩の還元：還元されないかもしくは陽性。
（２）脱窒反応 ： 陰 性。
（３）ＭＲテスト ： 陰 性。
（４）ｖｐテスト ： 陰 性。
（５）インドールの生成 ： 陰 性。
（６）硫化水素の生成 ： 陰 性。
（７）デンプンの加水分解： 陰 性。
（８）クエン酸の利用 ： Ｋｏｓｅｒの培地、Ｃ
ｈｒｉｓ ｔｅｎｓｅｎの培地とも利用。
ｈｒｉｓ ｔｅｎｓｅｎの培地とも利用。
（９）無機窒素源の利用 ： 硝酸塩、アンモニウム塩
とも利用する。
とも利用する。
（１０）色素の生成 ： な し。
αυ ウレアーゼ ： 陰 性。
αつ オキシダーゼ ： 陰 性。
（１３）カタラーゼ ： 陽 性。
（１４）生育の範囲：ｐＨ５〜１１（最適１）Ｈ６〜８
）温度１０〜４５°Ｃ（最適温度３０〜４０°Ｃ）（１
５１酸素に対する態度 ： 好気性。
）温度１０〜４５°Ｃ（最適温度３０〜４０°Ｃ）（１
５１酸素に対する態度 ： 好気性。
（１６） ０−Ｆ テスト二弱いながらも酸を生成
酸化。
酸化。
σＤ 糖類から酸およびガスの生成
酸生成 ガス生成
Ｉ Ｌ−アラビノース 千 −
２Ｄ−キシロース ＋ −
３Ｄ−グルコース 十 −
４Ｄ−マンノース ＋ −
５Ｄ−フラクトース − −
６Ｄ−ガラクトース 十 −
７麦芽糖 −−
８ショ糖 −−
９乳糖 −−
０〇）トレハロース −−
０υ Ｄ−ソルビット −−
〇２）Ｄ−マンニット −−
（１３）イノソット − −（１４）グリ
セリン −− （１５）デンプン − −ｄ 諸注
質 （１）・ペニシリン耐性 ： ２０ｕ／ｍｌのペニシ濃
度に耐性を示す。
セリン −− （１５）デンプン − −ｄ 諸注
質 （１）・ペニシリン耐性 ： ２０ｕ／ｍｌのペニシ濃
度に耐性を示す。
（２）栄養要求性 ： な し
上述のピログルタミン酸ヒドロラーゼ生産能を有する菌
株の分類学的諸性質を「バージエイス・マニュアル・オ
ブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版（１
９７４年）の分類と対比すると車両はアシネトバククー
属に属するものと判定されるが、アシネトバクタ−属に
は、アシネトバククー・カルコアセティカス（Ａｃ １
ｎｅｔｏｂａｃ−ｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ
） １種しか記載がなく、その分離源液及び２〜３の
性質が車両はアシネトバクタ−・カルコアセティカスと
は相違する。
株の分類学的諸性質を「バージエイス・マニュアル・オ
ブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版（１
９７４年）の分類と対比すると車両はアシネトバククー
属に属するものと判定されるが、アシネトバクタ−属に
は、アシネトバククー・カルコアセティカス（Ａｃ １
ｎｅｔｏｂａｃ−ｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ
） １種しか記載がなく、その分離源液及び２〜３の
性質が車両はアシネトバクタ−・カルコアセティカスと
は相違する。
即ち、ピログルタミン酸ヒドロラーゼ生産能ヲ有する本
発明使用菌株（微工研菌寄第３７８７号）は、ダラム陰
性、好気性の無胞子短稈菌で、鞭毛を有さず、運動性が
なくかつフィラメント状を呈する菌も認められ、グルコ
ースから酸を生成し、オキシダーゼ陰性、ペニシリン耐
性等によりアシネトバクタ−属に属し、しかもアシネト
バクタ−・カルコアセティカスに近縁と目されるが、酢
酸カルシウム培地では充分な生育を示さず、しかも寒天
培地でトウイツチング運動を示さない等の生理的性質に
相異点がある。
発明使用菌株（微工研菌寄第３７８７号）は、ダラム陰
性、好気性の無胞子短稈菌で、鞭毛を有さず、運動性が
なくかつフィラメント状を呈する菌も認められ、グルコ
ースから酸を生成し、オキシダーゼ陰性、ペニシリン耐
性等によりアシネトバクタ−属に属し、しかもアシネト
バクタ−・カルコアセティカスに近縁と目されるが、酢
酸カルシウム培地では充分な生育を示さず、しかも寒天
培地でトウイツチング運動を示さない等の生理的性質に
相異点がある。
なお、アルカリゲネスｓｐ、Ｆ １３７は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第４５６３号として
、アシネトバクタ−１００は微工研菌寄第３７８７号と
して寄託されている。
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第４５６３号として
、アシネトバクタ−１００は微工研菌寄第３７８７号と
して寄託されている。
又前記アルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０、
ブレビバクテリウム・フスカムＡ、ＴＯＣ１５９９３は
いずれもＡ Ｔ ＣＣ（Ａｍｅｒ ｉ ｃａｎ Ｔｙ−
ｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃａ１ｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託
され〔ザ・アメリカン・タイプカルナニア・コレクショ
ンカタログ・オブ・ストレインズ１３版（１９７８年）
第２７頁、第４９頁〕、分譲可能となっている。
ブレビバクテリウム・フスカムＡ、ＴＯＣ１５９９３は
いずれもＡ Ｔ ＣＣ（Ａｍｅｒ ｉ ｃａｎ Ｔｙ−
ｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃａ１ｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託
され〔ザ・アメリカン・タイプカルナニア・コレクショ
ンカタログ・オブ・ストレインズ１３版（１９７８年）
第２７頁、第４９頁〕、分譲可能となっている。
本発明の方法により、ピログルタミン酸ヒドロラーゼを
製造する方法について以下に述べる。
製造する方法について以下に述べる。
本発明に使用される培地としては、培養に必要な炭素源
、窒素源、無機塩その他使用菌の必要とするビタミン、
微量の栄養素を含有する培地を好適に使用することがで
きる。
、窒素源、無機塩その他使用菌の必要とするビタミン、
微量の栄養素を含有する培地を好適に使用することがで
きる。
すなわち炭素源としては、グルコース、マンノース、ア
ラビノース等の素水化物、酢酸、コハク酸等の有機酸、
グルタミン酸、プロリン等のアミノ酸などが使用可能で
ある。
ラビノース等の素水化物、酢酸、コハク酸等の有機酸、
グルタミン酸、プロリン等のアミノ酸などが使用可能で
ある。
窒素源としてはアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝
酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウ
ム塩類、あるいは尿素およびその他の窒素含有物質並び
に含窒素天然物、例えはペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、コーンステイープリカー、麦芽エキス、フィツシュ
ミールあるいはその消化物、大豆粉、脱脂大豆粕あるい
はその消化物が使用可能である、無機物としては、リン
酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸第１鉄硫酸亜鉛、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシ
ウムなどが使用される。
ンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝
酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウ
ム塩類、あるいは尿素およびその他の窒素含有物質並び
に含窒素天然物、例えはペプトン、酵母エキス、肉エキ
ス、コーンステイープリカー、麦芽エキス、フィツシュ
ミールあるいはその消化物、大豆粉、脱脂大豆粕あるい
はその消化物が使用可能である、無機物としては、リン
酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸第１鉄硫酸亜鉛、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシ
ウムなどが使用される。
菌の培養は通常液体培養法を採用するのが好ましく、振
盪培養、攪拌培養、通気培養などの適当な培養法を用い
培養を行なうことができる。
盪培養、攪拌培養、通気培養などの適当な培養法を用い
培養を行なうことができる。
工業的には深部通気攪拌培養を行なうのが有利である。
培養温度は、ピログルタミン酸ヒドロラーゼ生産菌が生
育し、ピログルタミン酸ヒドロラーゼを生産する範囲内
で変更することができるが、１０〜４５°Ｃ１好ましく
は２５〜４５°Ｃである。
育し、ピログルタミン酸ヒドロラーゼを生産する範囲内
で変更することができるが、１０〜４５°Ｃ１好ましく
は２５〜４５°Ｃである。
培養時ｐＨは４０〜９．０の間で行なうことができるが
、ｐＨ６〜８がより好適である。
、ｐＨ６〜８がより好適である。
培養時間は培養形態によっても異なるが、振盪培養ない
し通気攪拌培養により好気的に培養すれば７２時間以内
で効率よく菌体内に生成蓄積される。
し通気攪拌培養により好気的に培養すれば７２時間以内
で効率よく菌体内に生成蓄積される。
本発明は、このように通常の栄養培地からピログルタミ
ン酸ヒドロラーゼを効率よく生産することができるが、
さらにＬ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸若しくはそ
のアナローブ（類似物質）の存在下で前記菌株を培養す
れば特に顕著にピログルタミン酸ヒドロラーゼの収率が
増加する。
ン酸ヒドロラーゼを効率よく生産することができるが、
さらにＬ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸若しくはそ
のアナローブ（類似物質）の存在下で前記菌株を培養す
れば特に顕著にピログルタミン酸ヒドロラーゼの収率が
増加する。
例えば予じめＬ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸若し
くはそのアナローブを含有させた培地に該菌株を接種し
て培養を行なってもよく、又培養開始後１６時間以前に
Ｌ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸若しくはそのアナ
ローブを培地に添加して培養を行なってもよい。
くはそのアナローブを含有させた培地に該菌株を接種し
て培養を行なってもよく、又培養開始後１６時間以前に
Ｌ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸若しくはそのアナ
ローブを培地に添加して培養を行なってもよい。
Ｌ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸のアナローブとし
てはＤＬ−２−ピペリドン−６−カルボキシレート（Ｄ
Ｌ ２−ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｅ’６−ｃａ−ｒｂｏｘ
ｙｌａｔｅ ）等が挙げられる。
てはＤＬ−２−ピペリドン−６−カルボキシレート（Ｄ
Ｌ ２−ｐｉｐｅｒｉｄｏｎｅ’６−ｃａ−ｒｂｏｘ
ｙｌａｔｅ ）等が挙げられる。
この際、Ｌ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸若しくは
そのアナローブの添加量は培地総量に対して０．１〜３
％が好適である。
そのアナローブの添加量は培地総量に対して０．１〜３
％が好適である。
この様にＬ及び／又はＤＬ−ピログルタミン酸等を添加
して培養することにより、通常の栄養培地に培養する場
合に比較して、約１０〜３０倍の活性を有するピログル
タミン酸ヒドロラーゼを得ることができる。
して培養することにより、通常の栄養培地に培養する場
合に比較して、約１０〜３０倍の活性を有するピログル
タミン酸ヒドロラーゼを得ることができる。
かくして得られた培養物からの本酵素の抽出、精製は、
一般に酵素の抽出、精漿に用いられる方法が用いられる
。
一般に酵素の抽出、精漿に用いられる方法が用いられる
。
例えば適当な方法により培養物から菌体を分離し、その
菌体を摩耗剤の存在下ですりつぶす方法、リゾチーム等
の溶菌酵素を用いる方法、超音波エネルギーを適用する
方法、浸透圧ショックを適用する方法等の公知の方法に
より破壊するか、またはトルエン等の存在下で振盪もし
くは放置して自己消化を行なわせ、酵素を菌体外に排出
させた後、該溶液を濾過後、遠心分離方法などの適当な
操作により処理し、固形物を除去して得られた菌体抽出
液を、通常の酵素回収法すなわち硫安塩析法、等電点沈
澱法、溶媒沈澱法、ゲル沖過法、アフィニテイクロマト
グラフイー、イオン交換体処理など一般に行なわれる酵
素回収法で高収率に取ることができ、又公知の方法を適
宜選択組み合わせて実施することにより高度に精製する
ことができる。
菌体を摩耗剤の存在下ですりつぶす方法、リゾチーム等
の溶菌酵素を用いる方法、超音波エネルギーを適用する
方法、浸透圧ショックを適用する方法等の公知の方法に
より破壊するか、またはトルエン等の存在下で振盪もし
くは放置して自己消化を行なわせ、酵素を菌体外に排出
させた後、該溶液を濾過後、遠心分離方法などの適当な
操作により処理し、固形物を除去して得られた菌体抽出
液を、通常の酵素回収法すなわち硫安塩析法、等電点沈
澱法、溶媒沈澱法、ゲル沖過法、アフィニテイクロマト
グラフイー、イオン交換体処理など一般に行なわれる酵
素回収法で高収率に取ることができ、又公知の方法を適
宜選択組み合わせて実施することにより高度に精製する
ことができる。
又アルコール類、ペニシリン等を培養後期に培地中に添
加することにより培地中にも生成させることができる。
加することにより培地中にも生成させることができる。
次にＡＴＰのみを基質とした場合に、ＡＴＰ力日本日水
分解活性しないという特異性を有する本発明ピログルタ
ミン酸ヒドロラーゼを用いることにより、Ｌ−ピログル
タミン酸含有溶液にホスホエノールピルベート及びピル
ベートキナーゼを添加しなくとも効率よくＬ−グルタミ
ン酸含有溶液を得ることができる。
分解活性しないという特異性を有する本発明ピログルタ
ミン酸ヒドロラーゼを用いることにより、Ｌ−ピログル
タミン酸含有溶液にホスホエノールピルベート及びピル
ベートキナーゼを添加しなくとも効率よくＬ−グルタミ
ン酸含有溶液を得ることができる。
この場合の作用条件としては使用するピログルタミン酸
ヒドロラーゼの最適条件が採られる力、≦、例えばアル
カリ土類金属に属する上記ピログルタミン酸ヒドロラー
ゼを生産する能力を有する微生物から得られた本発明ピ
ログルタミン酸ヒドロラーゼの場合にはｐＨ７，５〜８
．２が適当であり、他の菌株から得られた場合は通常ｐ
Ｈ６〜８．０である。
ヒドロラーゼの最適条件が採られる力、≦、例えばアル
カリ土類金属に属する上記ピログルタミン酸ヒドロラー
ゼを生産する能力を有する微生物から得られた本発明ピ
ログルタミン酸ヒドロラーゼの場合にはｐＨ７，５〜８
．２が適当であり、他の菌株から得られた場合は通常ｐ
Ｈ６〜８．０である。
又例えばピログルタミン酸ヒドロラーゼの活性が蛋白１
ｍｙ当り０．２Ｕ以上の場合に於ては、ＡＴＰのみを基
質とした場合のＡＴＰ力日本日水分解酵素活性白１／１
１１Ｉ当り０．０１Ｕ以下存在してもホスホエノールピ
ルベート を必要としない。
ｍｙ当り０．２Ｕ以上の場合に於ては、ＡＴＰのみを基
質とした場合のＡＴＰ力日本日水分解酵素活性白１／１
１１Ｉ当り０．０１Ｕ以下存在してもホスホエノールピ
ルベート を必要としない。
次にＬ−グルタミン酸を測定するには、ピログルタミン
酸ヒドロラーゼによるＬ−グルタミン酸生成系により得
られたＬ−グルタミン酸含有液（０〜３０γ）に０．５
Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩（苛性ソーダでｐｌ（ｓ．
ｏに調整）１．５ｍｌ、５ｍＭβ−ＮＡＤ０．５ｍｌ、
グルタメートデヒドロゲナーゼ０．５１／２Ｌ！を蒸留
水で３ｍｌ，！＝し、３０°Ｃ、１時間反応後３４０ｍ
μで比色定量する。
酸ヒドロラーゼによるＬ−グルタミン酸生成系により得
られたＬ−グルタミン酸含有液（０〜３０γ）に０．５
Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩（苛性ソーダでｐｌ（ｓ．
ｏに調整）１．５ｍｌ、５ｍＭβ−ＮＡＤ０．５ｍｌ、
グルタメートデヒドロゲナーゼ０．５１／２Ｌ！を蒸留
水で３ｍｌ，！＝し、３０°Ｃ、１時間反応後３４０ｍ
μで比色定量する。
上記方法により測定した所、第１図に示す如く結果が得
られ、Ｌ−ピログルタミン酸０〜３０γの範囲で直線関
係が得られた。
られ、Ｌ−ピログルタミン酸０〜３０γの範囲で直線関
係が得られた。
ここでピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性とＡＴＰのみ
を基質とした場合のＡＴＰ加水分解酵素活性の割合によ
るＬ−グルタミン酸の生成量について実験例を挙げて説
明する。
を基質とした場合のＡＴＰ加水分解酵素活性の割合によ
るＬ−グルタミン酸の生成量について実験例を挙げて説
明する。
実験例
ピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性（５）とＡＴＰのみ
を基質とした場合のＡＴＰ加水分解酵素活性（２）を第
２表に示す如く組合わせて、上記のＬ−グルタミン酸測
定法により、１μモルのＬ−ピログルタミン酸を反応さ
せた時に生成するＬ−グルクミン酸量を測定し又ＡＤＰ
の量を測定した結果を第２表に示す。
を基質とした場合のＡＴＰ加水分解酵素活性（２）を第
２表に示す如く組合わせて、上記のＬ−グルタミン酸測
定法により、１μモルのＬ−ピログルタミン酸を反応さ
せた時に生成するＬ−グルクミン酸量を測定し又ＡＤＰ
の量を測定した結果を第２表に示す。
尚、ＡＤＰの量は、０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝
液（ ｐＨ ７． ６ ） ２．５ｍｌ、１ ２ ｍ
Ｍ ＮＡＤＨ ０．２７７１、１１ホスホエノールピル
ベート溶液（１０ｍＭホスホエノールピルベート、１．
３ Ｍｋｃｌ 、 ０．４ＭＭｇＳＯ４）０．５ｍｌ、
ラクテートデヒドロナーゼ５４単位、ピルベートキナー
ゼ３０単位、試料０、 １ ｍ１．を蒸留水で３ｍｌと
し、３０°Ｃで反応させた後３４０ｍμの吸光度の減少
から求める。
液（ ｐＨ ７． ６ ） ２．５ｍｌ、１ ２ ｍ
Ｍ ＮＡＤＨ ０．２７７１、１１ホスホエノールピル
ベート溶液（１０ｍＭホスホエノールピルベート、１．
３ Ｍｋｃｌ 、 ０．４ＭＭｇＳＯ４）０．５ｍｌ、
ラクテートデヒドロナーゼ５４単位、ピルベートキナー
ゼ３０単位、試料０、 １ ｍ１．を蒸留水で３ｍｌと
し、３０°Ｃで反応させた後３４０ｍμの吸光度の減少
から求める。
又無機リン酸の定量を行なう場合にはフイツグ、スバロ
（Ｆｉｓｋｅ ａｎｄ Ｓｕｂｂａｒｏｗ）の方法（Ｊ
．Ｂｉｏｌ。
（Ｆｉｓｋｅ ａｎｄ Ｓｕｂｂａｒｏｗ）の方法（Ｊ
．Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ．６６ 、、３．７５〜４００（ １９２５）
）により測定される。
）により測定される。
以上の結果から、ピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性（
Ｕ）が０．２０の場合には、（１）及び（２）の範囲で
あればホスホエノールピルベート、ピルベートキナーゼ
を添加しなくともＬ−ピログルタミン酸使用量と同モル
のＬ−グルタミン酸を生成することが示されたが、（３
）〜（５）の場合にはホスホエノールピルベート、ピル
ベートキナーゼを使用しなければＬ−ピログルタミン酸
使用量と同モルのＬ−グルタミン酸を得ることは困難で
あることが認められる。
Ｕ）が０．２０の場合には、（１）及び（２）の範囲で
あればホスホエノールピルベート、ピルベートキナーゼ
を添加しなくともＬ−ピログルタミン酸使用量と同モル
のＬ−グルタミン酸を生成することが示されたが、（３
）〜（５）の場合にはホスホエノールピルベート、ピル
ベートキナーゼを使用しなければＬ−ピログルタミン酸
使用量と同モルのＬ−グルタミン酸を得ることは困難で
あることが認められる。
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれにより制限されるものではない。
明はこれにより制限されるものではない。
実施例 Ｉ
ＫＨ２ＰＯ４０．１％，に２ ＨＦＯ２ ０． １％，
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００．００１％ＭｇＳ０４・７ Ｈ
２Ｏ ０． ０ ５％、酵母エキス０．２％、Ｌ−ピロ
グルタミン酸１．２％の組成からなる培地（ｐＨ６．０
）を各５０罰宛、各５００ｍｌ容の振盪フラスコに分注
し、１２０°Ｃ、１０分間殺菌後、アルカリゲネスｓｐ
、Ｆ−１３７（微工研菌寄第４５６３号）を接種し、３
７°Ｃ１１６時間、振幅５Ｃ７７Ｌ、１２Ｏｒ、ｐ、ｍ
、で振盪培養した。
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００．００１％ＭｇＳ０４・７ Ｈ
２Ｏ ０． ０ ５％、酵母エキス０．２％、Ｌ−ピロ
グルタミン酸１．２％の組成からなる培地（ｐＨ６．０
）を各５０罰宛、各５００ｍｌ容の振盪フラスコに分注
し、１２０°Ｃ、１０分間殺菌後、アルカリゲネスｓｐ
、Ｆ−１３７（微工研菌寄第４５６３号）を接種し、３
７°Ｃ１１６時間、振幅５Ｃ７７Ｌ、１２Ｏｒ、ｐ、ｍ
、で振盪培養した。
培養終了後、培養液１Ｏ００７１１１をｐ別し、得られ
た菌体を０．０１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，００，０
２５％硫酸マグネシウム）に懸濁した後、超音波処理（
海上電機社製、２０ＫＣ！、３分間）によって破砕し、
遠心分離により固形部分を除き、細胞抽出液４００ｍ１
を得た。
た菌体を０．０１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，００，０
２５％硫酸マグネシウム）に懸濁した後、超音波処理（
海上電機社製、２０ＫＣ！、３分間）によって破砕し、
遠心分離により固形部分を除き、細胞抽出液４００ｍ１
を得た。
この細胞抽出液を酵素液として、該抽出液４００ｍ、ｌ
に対して硫安７０．４．９（３０％飽和）を加えて沈澱
区分を除去し、更に硫安５０．８ｇ（５０％飽和）をカ
ロえ沈澱区分を得る。
に対して硫安７０．４．９（３０％飽和）を加えて沈澱
区分を除去し、更に硫安５０．８ｇ（５０％飽和）をカ
ロえ沈澱区分を得る。
これを０．０１モルリン酸緩衝液（ｐＨ７，ｏ Ｏ，
０２５％硫酸マグネシウム）６５ｍｌに懸濁後、１晩透
析する。
０２５％硫酸マグネシウム）６５ｍｌに懸濁後、１晩透
析する。
更に透析後上記緩衝液で平衝化したＤＥＡＥ−セルロー
ス（シ・エチル・アミン・エチル・セルロース、米国ブ
ラウン社製）カラム（５，２Ｘ ８０（１ｍ）にて食塩
グラジェント溶出を行ない、０．０８モル〜０．１８モ
ル食塩濃度近辺のピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性区
分２００ｍ１をダイアフロー濃縮器（アミコン社製、米
国）にて４０ｍ１に濃縮し、次に得られた酵素液を、上
記緩衝液にて平衝化した８−アゾーＡＴＰセファロース
〔セファロース４Ｂ（ファーマシア社製、スエーデン国
）にＮ、０．Ｋａｐ−１ａｎの方法によりＡＴＰをカッ
プリングして調製〕カラム（１，５Ｘ ２０（ｍ） Ｒ
：てＡＴＰグラジェント溶出を行ない０．１〜０．５ｍ
ＭのＡＴＰ濃度近辺の活性区分を集め、更に同様に平衝
化したＬ−ピログルタミン酸ＡＨセファロースＣＡＨセ
ファロース４Ｂ（ファーマシア社製、スエーデン国）に
カルボジイミドによりＬ−ピログルタミン酸をカップリ
ングして調整〕カラム（１，５Ｘ ２ ｏｃｒｒＬ）に
て食塩グラジェント溶出を行ない０．１〜０．１５モル
食塩濃度近辺のピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性区分
を得る。
ス（シ・エチル・アミン・エチル・セルロース、米国ブ
ラウン社製）カラム（５，２Ｘ ８０（１ｍ）にて食塩
グラジェント溶出を行ない、０．０８モル〜０．１８モ
ル食塩濃度近辺のピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性区
分２００ｍ１をダイアフロー濃縮器（アミコン社製、米
国）にて４０ｍ１に濃縮し、次に得られた酵素液を、上
記緩衝液にて平衝化した８−アゾーＡＴＰセファロース
〔セファロース４Ｂ（ファーマシア社製、スエーデン国
）にＮ、０．Ｋａｐ−１ａｎの方法によりＡＴＰをカッ
プリングして調製〕カラム（１，５Ｘ ２０（ｍ） Ｒ
：てＡＴＰグラジェント溶出を行ない０．１〜０．５ｍ
ＭのＡＴＰ濃度近辺の活性区分を集め、更に同様に平衝
化したＬ−ピログルタミン酸ＡＨセファロースＣＡＨセ
ファロース４Ｂ（ファーマシア社製、スエーデン国）に
カルボジイミドによりＬ−ピログルタミン酸をカップリ
ングして調整〕カラム（１，５Ｘ ２ ｏｃｒｒＬ）に
て食塩グラジェント溶出を行ない０．１〜０．１５モル
食塩濃度近辺のピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性区分
を得る。
この活性区分を２ｍｌに濃度し、同様に平衝化したバイ
オゲルＡ ０．５ｍ（バイオラド社製、米国）カラム
２．５ Ｘ １５０ｃ／ｒＬ）にてゲル濾過を行ない、
ＡＴＰのめを基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有
しないピログルタミン酸ヒドロラーゼを得た。
オゲルＡ ０．５ｍ（バイオラド社製、米国）カラム
２．５ Ｘ １５０ｃ／ｒＬ）にてゲル濾過を行ない、
ＡＴＰのめを基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有
しないピログルタミン酸ヒドロラーゼを得た。
上記各精製段階に於けるピログルタミン酸ヒドロラーゼ
活性及びＡＴＰのみを基質とした場合のＡＴＰ加水分解
活性を第３表に示す。
活性及びＡＴＰのみを基質とした場合のＡＴＰ加水分解
活性を第３表に示す。
尚、ピログルタミン酸ヒドロラーゼ活性及びＡＴＰ加水
分解活性は前述した方法により測定し、蛋白質はビュー
レット法、銅−フォーリン法にて測定した。
分解活性は前述した方法により測定し、蛋白質はビュー
レット法、銅−フォーリン法にて測定した。
全活性（Ｕ）を蛋白質量で除した値を比活性として表示
した。
した。
ｆｌお以下同様に表示するものとする。
実施例 ２
アシネトバクタ−１００（微工研菌寄第３７８７号）及
びブレビバクテリウム・フヌカム（ＡＴＣＩＣ１５９９
３）を実施例１同様に培養し、培養終了後、培養液１０
１００Ｏを炉別して得られた菌株を実施例１同様に精製
を行ない、第４表に示すようにＡＴＰのみを基質とした
場合にＡＴＰ加水分解活性を有しないピログルタミン酸
ヒドロラーゼを得た０ 実施例 ３ Ｌ−ピログルタミン酸含有血清を第５表に示す如く調整
し、その０．１ ｍｌとトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８
）１０マイクロモル、ＫＣｌ１６マイクロモル、ピログ
ルタミン酸ヒドロラーゼ０．１単位を蒸留水で０．２
ｍｌにし、３７°Ｃ１１５分間反応を行なった後、該反
応液に０．５Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩（苛性ソーダ
でｐＨ８，０に調整）１．５ｍｌ、５ｍＭβＮＡＤ０．
５ｍ４グルタミン酸デヒドロゲナーゼ４０単位を加え蒸
留水で３７ｒＬｌとし、３０°Ｃ１１時間反応後３４０
ｍμで比色定量を行ない、第５表に示す如く結果を得た
。
びブレビバクテリウム・フヌカム（ＡＴＣＩＣ１５９９
３）を実施例１同様に培養し、培養終了後、培養液１０
１００Ｏを炉別して得られた菌株を実施例１同様に精製
を行ない、第４表に示すようにＡＴＰのみを基質とした
場合にＡＴＰ加水分解活性を有しないピログルタミン酸
ヒドロラーゼを得た０ 実施例 ３ Ｌ−ピログルタミン酸含有血清を第５表に示す如く調整
し、その０．１ ｍｌとトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８
）１０マイクロモル、ＫＣｌ１６マイクロモル、ピログ
ルタミン酸ヒドロラーゼ０．１単位を蒸留水で０．２
ｍｌにし、３７°Ｃ１１５分間反応を行なった後、該反
応液に０．５Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩（苛性ソーダ
でｐＨ８，０に調整）１．５ｍｌ、５ｍＭβＮＡＤ０．
５ｍ４グルタミン酸デヒドロゲナーゼ４０単位を加え蒸
留水で３７ｒＬｌとし、３０°Ｃ１１時間反応後３４０
ｍμで比色定量を行ない、第５表に示す如く結果を得た
。
回収テストの結果、いずれもほぼ１００％の結果が得ら
れた。
れた。
第１図はピログルタミン酸濃度と３４０ｍμにおける０
、Ｄ、値との関係を示す図である。
、Ｄ、値との関係を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 以下の理化学的性質を有するピログルタミン酸ヒド
ロラーゼ。 （ａ） 作用： ホスホエノールピルベート及びピルベートキナーゼを用
いることなくＬ−ピログルタミン酸及びＡＴＰから定量
的にＬ−グルタミン酸、ＡＤＰ及びＰｉを生成する反応
を触媒する。 （ｂ） 基質特異性； ＡＴＰのみを基質とした場合にＡＴＰ７ＪＯ水分解活性
を有しない。 （ｃ） 至適ｐＨ及び安定ｐＨ； 至適ｐＨ； ７．５〜８．２ 安定ｐＨ； ６〜９ （ｄ）作用適温の範囲； ３０〜５５°Ｃの範囲で良く作用する。 （ｅ） ｐＨ１温度などによる失活の条件；ｐＨ５以
下、ｐＨ９以上で失活し、また、５０°Ｃ以上で失活が
始まり６０°Ｃ１１０分の熱処理で完全に失活する。 （ｆ）阻害、活性化及び安定化； パラクロロマーキュリ−ベンゾエート （Ｐ ＯＭＢ ）、Ｎ−エチルマレイイミド（ＮＥＨ）
及びオルソフェナントロリンの処理で失活し、ジチオ′
スレイトール（ＤＴＴ）及びグリセリンの添加で安定化
する。 （ｇ） 分子量； 沈降平衡法による分子量は１２３，０００である。 （ｈ） 等電点； 焦点電気泳動法による等電点はｐＨ５，０５である。 ２ Ｌ−ピログルタミン酸を含む液に、ＡＴＰのみを
基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有しないピログ
ルタミン酸ヒドロラーゼ及びＡＴＰを添加してＬ−グル
タミン酸を生成せしめ、該Ｌ−グルタミン酸を測定する
ことを特徴とするＬ−ピログルタミン酸の定量方法。 ３ Ｌｌ’ルタミン酸生成系における、ＡＴＰのみを
基質とした場合にＡＴＰ加水分解活性を有しないピログ
ルタミン酸ヒドロラーゼ活性が蛋白１１１１１当り０．
２Ｕ以上で、ＡＴＰのみを基質とした場合のＡＴＰ加水
分解酵素活性が蛋白１〜当り０．０１Ｕ以下である特許
請求の範囲第２項記載のＬ−ピログルタミン酸の定量方
法。 ４ Ｌ−グルタミン酸をグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
及びＮＡＤを添加して得られた反応液より常法により比
色測定する特許請求の範囲第２項記載のし一ピログルタ
ミン酸の定量方法。 ５ ＡＴＰのみを基質とした場合に、ＡＴＰ加水分解
活性を有しないピログルタミン酸ヒドロラーゼがアルカ
リ土類金属、ブレビバクテリウム属またはアシネトバク
タ−属に属する微生物から選ばれた微生物を培養して得
られた酵素である特許請求の範囲第２項記載のＬ−ピロ
グルタミン酸の定量方法。 ６ アルカリ土類金属、ブレビバクテリウム属及びアシ
ネトバクタ−属に属する微生物がそれぞれアルカリゲネ
スＳＰ、Ｆ−１３７（微工研菌寄第４５６３号）、ブレ
ビバクテリウム・フスカー（ＡＴＣＣ１５９９３）、ア
シネトバクタ−１００（微工研菌寄第３７８７号）であ
る特許請求の範囲第５項記載のＬ−ピログルタミン酸の
定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53083548A JPS5937947B2 (ja) | 1978-07-11 | 1978-07-11 | 新規ピログルタミン酸ヒドロラ−ゼ及びその酸素を用いたｌ−ヒログルタミン酸の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53083548A JPS5937947B2 (ja) | 1978-07-11 | 1978-07-11 | 新規ピログルタミン酸ヒドロラ−ゼ及びその酸素を用いたｌ−ヒログルタミン酸の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5513007A JPS5513007A (en) | 1980-01-29 |
| JPS5937947B2 true JPS5937947B2 (ja) | 1984-09-12 |
Family
ID=13805555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53083548A Expired JPS5937947B2 (ja) | 1978-07-11 | 1978-07-11 | 新規ピログルタミン酸ヒドロラ−ゼ及びその酸素を用いたｌ−ヒログルタミン酸の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5937947B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014126186A1 (ja) * | 2013-02-15 | 2014-08-21 | キッコーマン株式会社 | ５－オキソプロリナーゼ、５－オキソプロリナーゼ遺伝子、および５－オキソプロリナーゼの製造方法 |
-
1978
- 1978-07-11 JP JP53083548A patent/JPS5937947B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014126186A1 (ja) * | 2013-02-15 | 2014-08-21 | キッコーマン株式会社 | ５－オキソプロリナーゼ、５－オキソプロリナーゼ遺伝子、および５－オキソプロリナーゼの製造方法 |
| JPWO2014126186A1 (ja) * | 2013-02-15 | 2017-02-02 | キッコーマン株式会社 | ５−オキソプロリナーゼ、５−オキソプロリナーゼ遺伝子、および５−オキソプロリナーゼの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5513007A (en) | 1980-01-29 |
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