JPS6352060A - 間接ビリルビンの定量法及び定量用キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １童業上の利用分野 本発明は間接ビリルビンの定量法及びそれに用いるキッ
トに関する。

ビリルビンは、赤血球の代謝産物で生体には不要な成分
である。これは肝臓から排出され、ウロピリンや、ステ
ルコピリンとなって体外に排出される。血液中のビリル
ビンの量を知ることによって肝機能の障害の程度を知る
ことができる。ビリルビンは血清中で蛋白質と結合して
いるが、ゆるく結合している直接ビリルビンと、固く結
合している間接ビリルビンの２つの型があり、これらの
量を知ることによって肝疾患の種類を知ることができる
。

従来の技術 ビリルビンとジアゾ試薬とを界面活性剤等の反応促進剤
の存在下に反応させて生成するアゾ色素を定量すること
によって、間接ビリルビン及び直接ビリルビンの合計ｌ
を定量する方法は公知である。

反応促進剤の非存在下に上記反応を行わせることによっ
て、直接ビリルビンのみを定量することは公知である。

両者の差を求めることによって間接ビリルビンの量を知
ることができる。

又、ビリルビン・オキシダーゼを用いてビリルビンの黄
色色調の減少を測定する方法は公知である（特開昭５６
−２７６５６）。

さらに、ビリルビン・オキシダーゼの至適ｐＨより低い
ｐＨ条件下ではビリルビン・オキシダーゼの作用によっ
て直接ビリルビンのみ分解し、間接ビリルビンは分解し
ないことを利用する直接ビリルビンの定量法は公知であ
る（特開昭５９−１２５８９９）。総ビリルビン量から
これを差引くことによって間接ビリルビンを定量できる
。

発明が解決しようとする問題点 ジアゾ試薬を用いる方法は、感度が小さく微量の直接ビ
リルビン定量には適切でない。また、血清試料中には脂
質等の反応液を混濁させる成分を含有する。これを溶解
するのに好適な界面活性剤を用いると、間接ビリルビン
もジアゾ化し、直接ビリルビンのみを定量できない。

一方、ビリルビン・オキシダーゼを用いる方法は、酵素
反応の前後における測定が必要であり、試料を多量に要
する。又、ビリルビン自体による吸光度の変化を測定す
るための感度がジアゾ試薬を用いる方法より低い。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、直接ビリルビン及び間接ビリルビンを
含有する試料中の直接ビリルビンを、ビリルビン・オキ
シダーゼの作用によってビルベルジンに変換し、次いで
間接ビリルビンとジアゾ試薬とをジアゾ反応促進剤の存
在下に反応させて色素を生成させ、これを定量すること
によって、間接ビリルビンを定量できる。

本発明を実施するに際しては、ビリルビンを含有する試
料にビリルビン・オキシダーゼを加えて適当な緩衝液中
で反応を行わせ（以下第一反応という）次いで、これに
ジアゾ試薬としてジアゾニウム塩を間接ビリルビンの等
モル以上、通常１０〜１０００倍モル及び反応促進剤を
加えて反応させる（以下第２反応という）。

第１反応は１５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃で行
われ、２〜３０分間、通常約５分で完了する。

第２反応は５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行わ
れ、２〜３０分間、通常約５分で完了する。

反応後着色した反応液の吸収を生成色素の極大吸収波長
（λｍａｘ　）で試薬ブランクを対照として測定し、予
め既知量についての試験から求めた検量線を利用して試
料中の間接ビリルビンを定量できる。

第１反応で用いられるビリルビン・オキシダーゼは、ミ
ロセシウム属、トラキデルマ属等の微生物由来の酵素が
容易に入手でき、これらは０，１〜１０１１／ｍｌで用
いられる。

第１反応、第２反応で用いられる緩衝剤としてはｐＨ１
〜１１のもの、例えば塩酸−塩化カリウム。

クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、酒石酸、トリス−塩酸
、コハク酸、シュウ酸、Ｇｏｏｄ’ｓ等が０．００５〜
２Ｍ／Ｌで用いられる。

第２反応で用いられるジアゾ試薬としては、間接とリル
ビンと反応して安定な色素を定量的に生成するものであ
ればいずれも用いろるが、例えばＰ−スルホベンゼンジ
アゾニウム塩、２．４−ジクロロフェニルジアゾニウム
塩、２．５−ジクロロフェニルジアゾニウム塩、一般式
（１） （式中、Ｘはハロゲン例えばＦ、ＣＩ、Ｂを示す）で表
される化合物〔以下化合物（１）という〕等のジアゾニ
ウム塩が用いられる。

これらのジアゾニウム塩としては安定化された塩、例え
ば１，５−ナフタレンジスルホン酸塩が好ましく用いら
れる。

反応促進剤として例えば、カフェイン、ダイフィリン、
安息香酸塩、ジメチルスルホキシド、酢酸塩、尿素、ア
セトアマイド、サリチル酸塩、トＩＪ　）ンＸ−１００
等の界面活性剤等が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ含有さ卓
る。

実施に際しては、ビリルビン・オキシダーゼを緩衝剤に
溶解した第１試薬液及びジアゾニウム塩及び反応促進剤
を溶解した緩衝剤に溶解した第２試薬液を用意しておい
て反応を行わせるのが便利である。

本発明によれば間接ビリルビン定量用キットが提供され
る。このキットは、ビリルビン・オキシダーゼと緩衝剤
の組合せからなる第１試薬及びジアゾニウム塩１反応促
進剤と緩衝剤の組合せからなる第２試薬からなる。第２
試薬のジアゾニウム塩には不安定なものがあり、その際
にはジアゾニウム塩の代わりにジアゾニウム塩を調製す
るための化合物を組合せることができる。

ジアゾニウム塩調製用化合物としては、２．４−ジクロ
ロアニリン、２．５−ジクロロアニリン、式（Ｘは前記
と同義を示す）で表される化合物〔以下化合物（ｎ）と
いう〕と、ジアゾ化のための亜硝酸ソーダ及び酸、例え
ば塩酸、硫酸が組合わされる。

これらのキットにおける各化合物は、前記反応で用いら
れる濃度の範囲となるように組合わされる。

本発明方法によれば、第２反応で反応促進剤を多量に用
いることができるので、試料中の混濁成分を溶解するに
充分な量の界面活性剤を加えることができ、試薬ブラン
クのテストの必要がなく、試料も少量で測定でき且つ簡
便である。

以下に本発明の態様を示す実施例を示す。

実施例１゜ 第一試薬として、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０
）１００ｍｌにビリルビン・オキシダーゼ〔トラキデル
マ属微生物由来、宝酒造四社製〕を１００単位溶解した
ものを調製する。第二試薬として、０、０５　Ｍフタル
酸緩衝液（ｐＨ３，０）１０　Ｑｍｌにトリトンｘ−ｉ
ｏｏを１ｇ、アセトアマイドを２５０■、およびジアゾ
ニウム塩として、化合物（１）（Ｘ＝ＣＩを示す）を５
０ｍｇ溶解したものを調製する。

第一試薬にビリルビン標準液（オメガビリルビンコント
ロール）を添加し、３７℃で５分加温後、第二試薬を添
加する。３７℃で５分加温後、その吸光度を試薬盲検を
対照としてλｍａｘ５４０ｎｍにて測定する。間接ビリ
ルビンの濃度と吸光度の関係を第１表に示す。

第　　　　１　　　　表 間接ビリルビンの濃度と吸光度との関係は直線的比例関
係にあることが第１表から明らかである。

実施例２゜ 第１試薬として０．１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０
）１０　Ｑｍｌにビリルビンオキシダーゼ〔トラキデル
マ属微生物由来、宝酒造■社製〕を１００単位溶解した
ものを調製する。第二試薬として０．０５　Ｍフタル酸
緩衝液（ｐＨ３，０）１０　ＱｍｌにトリトンＸ−１０
０をＩｇ、アセトアマイドを２５０ｍｇおよびアジゾニ
ウム塩として、■Ｐ−スルホベンゼンジアゾニウム、１
．５−ナフタレンジスルホン酸ナトリウム、■２．４−
ジクロロフェニルジアゾニウム、１．５−ナフタレンジ
スルホン酸ナトリウム。

■２．５−ジクロロフェニルジアゾニウム、１．５−ナ
フタレンジスルホン酸ナトリウム、■化合物Ｉ（Ｘ＝（
Ｊ）を各々５０ｍｇずつ溶解したものを調製する。

５種類の血清試料各々に第一試薬を添加し、３７℃で５
分加温後、それぞれの第二試薬を添加する。３７℃で５
分加温後、その吸光度を試薬盲検を対照としてλｍａｘ
５４Ｑｎｍにて測定し、予めビリルビン標準液を用いて
作成しておいた検量線より、血清試料中の間接ビリルビ
ン濃度を求めた。測定値を公知のジアゾ法による測定試
薬であるビリルビンＢテスト「和光」　〔和光純薬■社
製〕で求めた値と併記して第２表に示す。ただし、ビリ
ルビンＢテスト「和光」の間接ビリルビン値は総ビリル
ビン値から直接ビリルビン値を差し引いて算出した値で
ある。

第　　　　２　　　　表 ジアゾニウム塩の種類にかかわらず、アルカリアゾビリ
ルビンブルー法を用いた「和光」キットと良い相関を示
している。

発明の効果 本発明方法により、より正確に間接ビリルビンを定量す
ることができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）直接及び間接ビリルビンを含有する試料中の直接
   ビリルビンをビリルビン・オキシダーゼの作用によって
   ビルベルリンに変換し、残存する間接ビリルビンとジア
   ゾ試薬とを反応促進剤の存在下に反応させてアゾ色素を
   生成させ、これを定量することを特徴とする間接ビリル
   ビンの定量法。
2. （２）Ａ、ビリルビン・オキシダーゼと緩衝剤の組合せ
   からなる第一試薬及び Ｂ）ジアゾ試薬、反応促進剤及び緩衝剤の組合せからな
   る第２試薬 からなる、間接ビリルビン定量用キット。