JPS6018940B2 - 免疫学的分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的分析に関し、詳細には抗体、及び蟹光
体・消光体ベアを形成する発色体を用いる免疫学的分析
に関する。

少量の有機化合物を測定するための急速かつ釣ょ敏な方
法に対する必要性は引き続き存在している。

このため多数の方法が開発されている。商業的に利用で
きる方法は、放射線免疫分析、スピンラベル免疫分析（
試薬は商品名ＦＲＡＴ■で販売されている）、均等酵素
免疫分析（試薬は商品名ｏＥＭＩＴ■で販売されている
）及び凝血法（ＨＩ）等である。これら技術は１０６〜
１０‐１０Ｍもしくはそれ以下の範囲にある物質量を測
定するのに有効である。上記技術においてはすべて、リ
セプター分子（普通は抗体）が被分析分子の特異的な空
間−極性組織を認識できることが必要である。

凝血法を除き、これら方法はリセプターに対し被分析分
子と競合できる試薬を使用することに基づく。受体に結
合している試薬と結合していない試薬とを識別すること
により、存在する対象化合物の量を測定できる。免疫学
的分析の開発は、受体の入手性及び特性により制限され
る。

しかも、他試薬及び測定法に関しても、一層正確で便利
で又は商業的に望ましい分析法にするためには多数の様
々な考慮すべき事項がある。第一に、様々な試薬を用い
ての測定回数及び解析（ｔｒａｎｓｆｅｒ）が最小であ
ることが望ましい。

第二に、幅広い使用者が入手できるように測定菱道はか
なり経済的でなければならない。第三に、用いる試薬は
貯蔵・輸送が可能なように比較的安定でなければならな
い。第四に、方法は被分析サンプル中に偶然に存在する
ことがある他物質の妨害を受けることがあってはならな
い。他の考慮すべき事項は、技術トレーニングが容易で
あること、健康障害がないこと、感度、再生性、幅広い
リガンドーこ適用できるか否かである。本発明は、２種
の発色体間のエネルギー移動現象に基づく。

蟹光発色体とこの発色体により吸収される光で照射する
時、この蜜光発色体はより波長の長い光（即ち後光）を
発することにより吸収した光のエネルギーを消散できる
。この蟹光体から１００Ａ以播内に別の発色体があり発
光を吸収するならば、他因子により左右されるが、姿光
がその発色体に移り、光として発せられるはずであった
エネルギーにより蟹光が消光される可能性がある。アメ
リカ特許３７０斑斑号発明は放射線免疫分析の一例であ
る。アメリカ特許３６０班３４号発明はスピン免疫分析
の一例である。アメリカ特許３６５４０９び号、斑１７
８３７号の発明は酵素免疫分析の一例である。

興味ある論文には、ＬｕｄＭｇ、ＢｒａｎｄとＪａｍｅ
ｓＲ．Ｃｂｈｌｋｅとによる‘‘フルオレッセンスプロ
ーブズ フオーストラクチヤー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｃｅＰｒｏはｓｆｏｒＳＵ此ｔｕｒｅ）’’という題名
の論文〔ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉ比ｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、４１「 ８４３〜８６８（１９７２）〕；及
びＳｔｎｙｅｒの論文〔Ｓｃｉｅ皿ｅ、１６２、５２６
（１９６８）〕がある。

１９７２王１０月２日提出されたアメリカ特許出願４０
２６９３号も興味ある。

本発明により、それに対する受体（普通には抗体）を入
手でき又は製造できる有機化合物の存在又は量を測定す
るための方法が提供される。

この有機化合物を以下“リガンド”と呼ぶ。本発明の分
析法を実施するにおいては姿光体・消光体ベアを形成す
る２種の発色体を用いる。

消光体の消光距離内にある蟹光量は、被分析媒体中に存
在するりガンドの量の影響を受ける。１つの発色体は、
リガンドに特異的に結合する受体組成物に共有結合させ
て被分析媒体中に導入する。

第二の発色体は様々な方法：ポリリガンドの存在下又は
不存在下で、第一の発色体に結合した受体組成物と同一
又は異なった（いずれの場合もリガンド‘こ特異的に結
合している）受体組成物に共有結合させる方法、又はリ
ガンド類似体に共有結合させる方法（リガンド類似体は
受体組成物に対しリガンドと競合できる）；で被分析媒
体中に導入できる。導入方法の選択は、リガンド中に存
在する独立のェピトープ又はハフ。テン部位の数に左右
される。リガソドが唯一つの独立したュピトープ部位を
持つ場合（モノーェピトープ性）には、普通には１つの
発色体をリガンド受体に共有結合させ、他の発色体はリ
ガンド類似体、又はポリ（リガンド類似体）と、リガン
ド受体に共有結合した発色体との組合せに共有結合させ
る。リガンドが複数の独立したェピトープ部位を持つ場
合（ポリェピトープ性）には上述の方法に加え以下の方
法も使用できる。

一方法では２つの発色体をリガンド受体に別々に結合す
る。第二の方法ではリガンド受体を様々な供給源から得
、１つの発色体は１供給源からのりガンド受体の受体に
結合し、他の発色体は他供給源からのりガンド受体の受
体に結合する。後者の方法では分析法に融通性があり、
広範囲の分析法に共通の試薬を使用でき、精製方法を簡
素化でき、また集合体（成分部分から明らか）の存在を
測定できる。様々な材料を水性緩衝媒体中にあわせ、イ
ンキュベートし、蜜光分子により吸収される光で照射す
る。

一定時間インキュベートした後又は系が平衡に達した後
に蟹光量を測定し、その結果を１もしくはそれ以上の既
知標準物で得た結果と比較することによりリガンドの存
在又は量を測定できる。本明細書で使用する術語を定義
する。

リガンド−有機分子又はその集合体。

分子量は通常１００より大きく、又少なくとも１つの官
能基を持ち、通常樋性を有し、これに対する受体は天然
に入手できるか製造できる。リガンド類似体−その実質
的部分がリガンドと同一の空間・適性組織を持ち、受体
の結合部位に対してリガンドと競合できる決定（ｄｅｔ
ｅ肌ｉ雌ｎｔ）即ちェピトーブ部位を限定する１価又は
多価のラジカル。

リガンドとは、池分子に結合する部位に原子又は官能基
がなく、又リガンド中に初めに存在する１個もしくはそ
れ以上の原子の代わりに導入されている結合基を持つ点
で異なる。リガンド類似体の前駆体は、リガンド又はリ
ガンド類似体を他分子、例えば発色体に結合するために
用いられる化合物である。集合体−共有結合以外の方法
により・結合した有機分子の組合せ。

一般に６００を越える分子量を持ち、普通には１０００
を越え、１００００００もし〈はそれ以上になることも
ある。これに対する受体は天然に入手できるか製造でき
る。例示すると、抗原と抗体、又は２つの別個の物質か
ら製造された分子量（通常、極性結合、ジスルフイド結
合などの弱い結合で結合しており、系の条件下では個々
の物質と平衡状態に：あることができる）である。

発色体−蟹光又は消光分子、本発明では蟹光体と消光体
は相互関係がある。

総光分子は或る波長の光を吸収し、波長のより長い光を
発することができる発色体である。消光分子は、驚き光
分子から短距離（普通には約１００Ａ以内）にある時に
は、蟹光として発せられるエネルギーを受けることによ
り蟹光を阻止できる。発色体が結合している分子又は組
成物に関する限り、いずれかが優光することが多いが、
ほとんどの場合蟹光体と消光体は互変性である。それゆ
え、祖四暦し、２つの分子は発色体と呼び、個々をＣｈ
，、Ｃｈ２と呼ぶ。リガンド類似体−発色体〔リガンド
類似体一（Ｃｈ２）ｘ〕ーリガンド類似体は１もし〈は
それ以上の受光分子又は消光分子に共有結合する。小さ
なリガンド（分子量が約１００００以下、普通には約２
０００以下）の場合には、リガンド類似体は普通には１
の固以下、普通には１〜１の固、分子量１０００当り約
１個以下の発色体に結合する。リガンドが大きい場合（
分子量が少なくとも２０００、普通には少なくとも約１
００００）には複数の発色体がリガンド類似体に共有結
合できる。存在する発色体の数は、リガンドの余りに多
くのェピトーブ部位を遮へいすることなく導入して確実
に消光するのに充分な数の発色体を持つことができる数
により制限される〔受体−Ｃｈ，がリガンド類似体−（
Ｃ〜）ｘに結合している〕。ポリ（リガンド類似体）ー
ポリ（発色体）〔ポリ（リガンド類似体）−ポリ（Ｃｈ
２）〕−リガンド類似体と発色体が高分子量（リガンド
類似体及び発色体と比較して）水溶性多官能性中心又は
中核分子に結合して、受体−Ｃｈ，がリガンド類似体に
結合する時に幾つかのＣｈ，基がＣｈ２基の消光距離内
に存在するように分子の表面に位置させ複数のリガンド
類似体基と発色基を提供する。

ポリ（リガンド類似体）−リガンド類似体基が高分子量
（リガンド類似体に比べて）水溶性多官能性中心又は中
核分子に結合している。

このため、ポリ（リガンド類似体）が適当な割合で受体
−Ｃｈ，及び受体−Ｃｈ２で飽和されている時には消光
が起こるのに充分な数のＩＪガンド類似体が単位面積当
り存在する。受体−発色体（受体−Ｃｈ，及び受体−Ｃ
ｈ２）−受体はェピトープ部位を識別し、この部位に結
合できる分子である。

普通には受体は１ぴを越える、多くは１びを越える結合
定数を持つ。ほとんどの場合受体は抗体であるが、酵素
、核酸、特定グロプリンも又受体として作用できる。本
発明においてはほとんどの場合受体は、１もしくはそれ
以上、普通には少なくとも２もし〈はそれ以上の発色基
が結合する抗体である。受体組成物−リガンド及びリガ
ンド類似体に特異的に非共有結合できる均質又は不均質
組成物。

リガンドを特異的に認識する組成物（抗リガンド）、抗
リガンドの組合せ、及び抗リガンドを特異的に認識する
組成物〔抗（抗リガンド）〕等が該当する。本発明の方
法は、蟹光体・消光体ベアを形成する２種の発色体を用
いることに基づく。

発色体の一方が共有結合しているリガンドを特異的に認
識し、即ちそれに結合する組成物（受体）を用い、第二
の発色体をリガンド類似体又は受体に結合させることに
より、被分析液中に存在するりガンドは、蟹光体の消光
距離内にある消光体に影響を与える。本発明の分析は競
合的に実施でき、この場合リガンド類似体は受体に対し
てリガンドと競合し、リガンド類似体はポリ（リガンド
類似体）として存在するか発色体に共有結合している。
分析は又、複数のェピトープ部位を持つリガンドを用い
て非競合的にも実施でき、この場合発色体の各々を持つ
受体はリガンドに結合する。用いる個々のプロトコール
（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）及び対象リガンドーこより、次の
試薬組成物の１もしくはそれ以上を被分析媒体中に用い
る。

リガンド類似体−発色体、ボリ（リガンド類似体）ーポ
リ（発色体）、ポリ（リガンド類似体）、１もしくはそ
れ以上の受体及び１もしくは２の受体−発色体。

第一に考慮すべき組成物はリガンド類似体−発色体であ
る。リガンド類似体−発色体及びポリ（リガンド類似体
）−ポリ（発色体）リガンド類似体−発色体は２グルー
プに細分できる。

第１のグループはリガンド類似体一発色体が比較的短い
結合基により結合された唯一のリガンド類似体と唯一の
発色体とを持つ。これらの場合、リガンド類似体は主と
して抗原的でなくハプテン的であり、又発色体への結合
のために用いる結合基を除き分子量は一般に約１０００
０更に普通には約６０００以下、多くは約１２５〜１０
００の範囲にある。主として、リガンド類似体は、結合
により道換される特定官能基、結合により置換される水
素、又は結合により置換される短い炭素鎖（結合には単
結合のほか多重結合を含む）を有し、発色体へ結合する
ための結合基に結合するという点でリガンドと異なる。
様々なハプテン則ち低分子量リガンドにつき以下述べる
。結合基はリガンドと発色体との間の鎖中に約１０個以
下の原子、更に普通には１つの結合基が約１〜６個の原
子を持つ。原子は主としてＣ、０、Ｎ及びＳ、特にＣ、
０及びＮである。結合基に含まれる官能基は通常、非オ
キソカルポニル（ィミノとチオノカルボニルを含む）オ
キシ、アミ／（特に３級又は４級アミノ）又はそれらの
組合せ、例えばアミド、カルバミル、アミジノである。

２種の発色体は蟹光体にしろ消光体にしろ通常は、非オ
キソカルボニル（Ｎ及びＳ類似体を含む）と反応するた
めのアミノ基かアルコール基かのいずれか、又はアミ／
基又はアルコール基と反応できる非オキソカルボニル基
を持つ。

０ リガンドの分子量が少なくとも２０００である場合
には複数の発色塞がりガンド‘こ結合できる。

普通には分子量２００００当り少なくとも１個の発色基
、更に普通には分子量１００００当り少なくとも１個の
発色基、そして分子量１０００当り１個以下の発色タ基
、更に普通には分子量２０００当り１個以下の発色基が
存在する。リガンドに結合させる発色体の数について考
慮すべき点はすでに列挙した。結合基は前に述べた通り
である。普通には、リガンドは複数のアミノ基を持つ抗
原性ポリベプチド又は蛋０白である。活性ハロゲン又は
非オキソカルボニル（Ｎ及びＳ類似体を含む）を、共有
結合、アミド、アミジン、チオノアミド、尿素、グアニ
ジン及びチオ尿素を形成するために使用できる。別法と
して、リガンドと発色体（Ｃｈ，又はタＣＱ）とは中心
分子に結合できる〔ポリ（リガンド類似体）ーポリ（発
色体）〕。この中心分子則ち中核分子は、様々な理由に
より有利に用いることができる。中心分子は一般的には
比較的高分子量の重合分子であり、分子量は通常２００
００を越え、０多くは６００００であり、１千万もしく
はそれ以上でもよい。この中心分子は通常水溶性である
か水性媒体中に分散して安定な分散液を提供し、この場
合分散性物質は光の吸収又は照射を妨害しない。中心分
子は天然物質かそれを変性させたものか又夕は合成品で
ある。例を示すとポリベプチド、蛋白、多糖類、合成ポ
リマー等である。中心分子の性質は、リガンドと発色分
子を導入するのに充分なほど官能性である限り広く変え
ることができる。０ 使用できる蛋白は、アルブミン、
グロブリン、プロテオグリカン等：ポリサツカライドは
アミロース、セルロース、アガロース、デキストラン等
（得られたままのものあるいは部分的に減成したもの）
：合成ポリマーはポリビニルアルコール、アクリレート
、それらのコ−ポリマー等である。

通常、分子量５００００当り約１個以上の結合（リガン
ド類似体又は発色体）分子、更に二普通には分子量２５
０００当り約１個以上の結合分子、又普通には分子量１
０００当り約１個以下の結合分子、更に普通には分子量
２０００当り約１個以下の結合分子が存在する。リガン
日こ対する発色分子の比は、一般には約０．０５〜２０
：１、更に普通には約０．５〜２０：１好まし〈は約１
〜１０：１、更に好ましくは約２〜８：１である。

発色体が本発明の総光分子である場合には、リガンド１
分子当り一般には少なくとも０．５〜２０、更に普通に
は約１〜１い好ましくは約２〜７個の蟹光分子が存在す
る。

蜜光体が消光分子である場合、リガンド１分子当りの消
光分子数は一般に約０．５〜２０、更に普通には約１〜
２止好ましくは約２〜１５である。中心分子への結合体
は、発色体をリガンドに結合するのに用いたのと同一タ
イプの結合基を持つ。

どの官能基を選択するかは、中心，分子上に導入できる
官能基による。受体−発光体 多くの場合受体は抗体であるから、以下受体の一例とし
て抗体を取り挙げ記述する。

抗体は、発光体を抗体に共有結合するのに使用できる多
数の活性アミ／基を持つ。便宜上、この発光体は非オキ
ソカルボニル官能基（そのＮ、Ｓ類似体を含む）又は活
性のＱ−ハロカルボニル官能基を持つことができる。こ
の発光体を抗体に結合するための官能体を例示するとア
シルハラィド、混成無水物、ィミデートアルキルェステ
ル、ィソチオシアネート、クロル−、フロムー又はヨー
ドアセチル等である。結合条件としては、中等度の温度
（ｏｏ〜４０℃）で水性媒体のｐＨを中等度にする。

発光体の蛋白への結合は当業界で知られ，ている。“ｌ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’、１８、８６５（１９７０）：
Ｃｅｂｒａ等著“Ｊ．ｌｍｍ皿ｏｌ”、９５、２３０（
１９６５）：Ｇｏｌｄｍａｎ著“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｔ Ａｍｔｉｂ幻ｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ’●、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９総）。

抗体に結合する発光基の数は、発光基により比較的広範
囲に変えるごとができる。

抗体１個当り少なくとも１個の、普通には平均で約２〜
３針函、更に普通には約３〜２９函の発光基が存在する
。発光体が蟹光体である場合、抗体１個当りの発光基の
平均数は約１〜２止普通には２〜１ふ更に普通には２〜
１０である。発光体が消光体である場合、抗体１個当り
の発光基の平均数は約２〜３０、普通には３〜２ふ更に
普通には５〜２５である。複数のヱピトープ部位を持つ
リガンドのために抗体を製造するときには受体組成物は
均質でないことも又特記すべきことである。即ち、様々
なェピトープ部位を識別する抗体を受体が持つ。“受体
”というきには、リガンドのェピトープ性部位のいずれ
かに特異的に結合できるすべての抗体が含まれる。ポリ
（リガンド類似体） ポリ（リガンド類似体）は、発光体が存在せず、リガン
ド類似体のみが存在する点においてリガンド類似体−発
光体及びポリ（リガンド類似体）ーポリ（発光体）と異
なる。

ポリ（リガンド類似体）ーポリ（発光体）に対するのと
同一タイプの中心分子、同程度の結合がポリ（リガンド
類似体）に適用される。しかし、リガンド類似体は中心
分子が受体を供給できる以上の高い比で存在できる。そ
れゆえ、最小数のりガンド類似体は必須であるが、最大
数は単なる便宜的なものである。重要な要素は、受体分
子はポリ（リガンド類似体）に結合した時には発色体が
消光距離内に来るのに充分なだけ近づくことができると
いうことである。中心分子の選択においては多くの考慮
すべき点がある。

中心分子が水溶性であることは必須要件ではないが、多
くの場合望ましい。いずれにしても中心分子又は組成物
は水性媒体中に安定して分散できる。第二に、中心分子
は蟹光体の発光を吸収して消光するものであってはいけ
ない。第三に、中心分子は励起光で照射した時蜜光体の
波長の総光を発するものであってはならない。それゆえ
、中心分子による吸収は約５２仇肌以下、好ましくは約
４５仇肌以下でなければならない。中心分子は高度に官
能性（好ましくはアミノ基又はヒドロキシル基で。しか
し他の反応性基、例えばカルボキシも役立つ。）でなけ
ればならない。第四に中心分子は貯蔵・使用条件下で安
定でなければならない。第五に、中心分子は発光体とり
ガンド中に存在する、結合のための官能基以外の官能基
に不活性でなければならない。最後に、中心分子は、例
えば研究象たる生理学的流体中に存在することのある天
然の受体を持つことにより免疫分析を妨害するものであ
ってはならない。いかなるサイズの分子も用いることが
できるが、非常に大きい分子又は細胞では実用上の問題
点がある。例えば、蟹光計を通過する非常に大きい分子
はピーク高を突然高める。それゆえ、得られるシグナル
はかなりの期間にわたり平均されなければならないだろ
う。大きい分子も又ピーク高を高めるが、この散乱は適
当な光学装置により補償できる。好ましくは、主として
、分子量が約１千万以下、更に好ましくは約３００００
〜１００００００の分子を用いる。発光体 抗体は被分析媒体中に通常に存在し、蛋白は約３１仇肌
までの波長を持つ光を吸収するので、蟹光体は３１仇肌
以上、通常には３５仇肌以上、好ましくは約４０仇凧以
上を事実上吸収するであろう。

蟹光体の選択は又、個々のリガン日こよっても支配され
る。蜜光体は対象となっているリガンド又はリガンド類
似体よりも波長の長い光を吸収するものでなければなら
ない。高い吸収係数（ほとんどは１０を越え、好ましく
は１びを越え、特に好ましくは１ぴを越える）が望まし
い。蟹光体に対する水性媒体中で良好な結果が得られな
け机まならない。便宜上、姿光体の吸収ピークはリガン
ドが変わってもそれほど変わるものであってはならない
。多数の様々な蟹光体が、前述の論文、即ちＳｏｙｅｒ
あるいはＢｒａｎｄ等による論文に記述されている。

前述した多数の望ましい特性を持つ蟹光体の１グループ
はキサンテン染料であり、これには３・６−ジヒドロキ
シ−９−フエニル−キサントヒドロールから誘導される
フルオレスセィン類、ローザミン類及びローダミン類（
３・６−ジアミノー９−フェニルキサントヒドロールか
ら誘導される）等が該当する。

ローダミンとフルオレスセィンとは９−ｏーカルボキシ
フェニル基を持ち、９一ｏーカルボキシフエニルキサン
トヒドロールの誘導体である。これら化合物はフェニル
基に瞳換基（結合のための部位として又は結合基として
使用できる）を持つものが商業的に入手できる。

例えば、アミ／又はィソチオシアネート置換フルオレス
セィン化合物が入手できる。もうひとつのグループの蟹
光化合物は、Ｑ又は８位、普通にはＱ位にアミノ基を持
つナフチルアミン類である。

このナフチルアミノ化合物には１−ジメチルアミノナフ
チル−５−スルホネート、１ーアニリノ−８ーナフタレ
ンスルホネート及び２一ｐートルイジニル−６−ナフタ
レンスルホネートが含まれる。他の染料としては３−フ
ェニル−７−ィソシアネ−トクマリン、アクリジン、例
えば９ーイソチオシアネートアクリジンとアクリジンオ
レンジ；Ｎ−〔ｐ一（２−ペンゾオキサゾリル）フエニ
ル〕マレイミド；ペンゾオキサジアール、例えば４ーク
ロルー７ーニトロベンゾー２−オキソー１・３−ジアゾ
ールと７一（ｐーメトキシベンジルアミノ）一４−ニト
ｏベンゾー２−オキサー１・３−ジアゾール；スチルベ
ン、例えば４−ジメチルアミノー４−イソチオシアネー
トスチルベンと４−ジメチルアミノ−４′−マレイミド
スチルベン；Ｎ・Ｎ′ージオクタデシルオキサカルポシ
アニンＰ−トルェンスルホネート；ピレン、例えば８ー
ヒド。

キシ−１・３・６ーピレントリスルホン酸と１−ピレン
ブチル酸、メロシアニン鼠０ ０ーズベンガル、２・４
ージフエニル−３（が）‐フラノン、及びその他の容易
に入手できる受光分子がある。これらの染料は活性官能
基を持つかそれらを容易に導入できる。姿光分子に対す
るのと同様な考慮すべき点を消光分子にあてはめること
ができる。

但し、蟹光体の蟹光を測定する場合には蟹光量が良好で
ある必要はない。消光分子に対して更に考慮すべき点は
、それが蟹光体の発光波長を吸収するということである
。蟹光体の発光と消光体の吸収とは良く重なることが望
ましい。染料の吸収と発光特性は、溶液中で遊離してい
る状態から、蛋白又はリガンドに結合した状態において
変わりうる。

それゆえ、染料の様々な範囲と特性とをさす時には、用
いられた染料をさし、非結合の、又任意溶媒中で特性づ
けられる染料を示さない。蟹光と消光とが重なる地域に
おいては、消光体は蟹光分子による吸収に対して設定さ
れたと同一もしくはそれより高い消光係数を特く）。リ
ガンド 前に示した様にリガソドは幅広く変わり、通常には少な
くとも１１０の、更に普通には少なくとも１２５（最大
値に制限はないが普通、】．千万を越えない）の分子量
を持つ。

大抵の場合、リガンドに関する重要な因子は、受体をそ
のリガンド‘こ対して作ることができるか利用できるか
という点にある。通常、受体は極性官能基を持つ多くの
有機化合物に対して作ることができる。化合物を抗原特
性を持つ化合物に結合することによ‘りその抗体を形成
できる前者化合物をハプテンと上【、う。化学変性ない
こ抗体形成を引き出す化合物を抗原と呼ぶ 。〔 Ｋａ
戊ｔ 等 者 、“ ＥＸｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｍｍ
ｕｍにｈｅｍｉＳｔび ”、 ＣｈａｒｌｅＳ ＣリＴ
ｈｏｍｄＳ 、Ｓｐｒｉｎｇｉｌｄ、ｎｌｉ皿ｉＳ、１
９６７〕興味ある非重合性リガンドは通常は約１２５〜
２０００の分子量を持つ。これら化合物には、様々な構
造、官能基及び生理学的特性を持った広範囲の化合物が
含まれる。これら化合物は非環式でも脂環式でも複素環
式でも単環でも多環でもよい。へテロ原子は○、Ｎ、Ｓ
、ハロゲン（Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、１）、ボロン、Ｐ、周期
表ＩＡ、２Ａ族の金属カチオン、転移金属等である。官
能基はアルコール、エーテル、カルボン酸、ェステル、
アミド、アミン（一級、二二級、三級及び四級）、ハロ
、ニトリロ、メルカープト等である。

通常、これら化合物はＣ、日、ｌ０、Ｎ、ハロゲン及び
Ｐのみから、特にＣ、日、ｌ０及びＮのみから構成され
ている（塩が含まれる場合には適当な金属イオン又はア
ンモニアイオンが加わる）。存在する複秦環はピロール
、ピリ・ジン、ピベリジン、インドール、チアゾール、
ピ．べラジン、ピラン、クマリン、ピリミジン、プリン
、トリアジン、イミダゾール等である。本発明の分析法
により測定できる化合物は幅広いので、様々な基は、特
定官能基又は環横造の存在によるか特定機能を共有する
ということにより、又は一クラスとして認識されるとい
う理由により様々な、多くは人工的なカテゴリーに分類
される。

興味ある第一のクラスの化合物は，．アミノ基を複素環
〆ンバーとしてか脂肪族鎖上の官能基として有する化合
物である。

これむ化合物は分子量が通常には約１１０〜８００、更
に普通には約１２５〜６５０である。これら化合物は多
くは、ベンゼン環から２〜３個の脂肪族炭素原子により
離れたアミノ基を持つ。興味ある第一のグループの化合
物はアルカロイドと、摂取されるアルカロイド代謝産物
である。

第一のグループの重要なアルカロイドはモルヒネグルー
プのアルカロイドである。このグループにはモルヒネ、
コデイン、ヘロイン、モルヒネグルクロナィド等が含ま
れる。次のグループのアルカロイドはコカインアルカロ
イド（特に代謝産物としてペンゾィルェグゴニンとエグ
ゴニンを含む）である。

別のグループのアルカロイドはキニンなどのキナ皮アル
カロイドである。

インキノリングループのアルカロイドはメスカリン等で
ある。

ペンジルイソキノリンアルカロイドグループはパパベリ
ンを含む。

フタリドイソキノリンアルカロイドグループにはナルコ
チン、ナルセイン及びコタルニンが含まれる。

インドロピリドコリンアルカロイドグループにはョヒン
ビンとしセルピンが含まれる。

麦角アルカロイドグループにはェルゴタミンとりゼルグ
酸が含まれる。

他のグループのアルカロイドはストリキニーネアルカロ
イド、ピリジンアルカロイド、ピベリジンアルカロィド
、ピロリジジンアルカロィド等である。

第一の対象アルカロイドは、モルヒネ、コカイン、メス
カリン、リゼルグ酸などの濫用薬物のカテゴリーの中に
入るものであり、被分析生理学的流動体により、化合物
又はその代謝産物を分析できる。

多数の合成薬が、天然の濫用薬物の生理学的特性を部分
的に又は全体的に模倣している。

これらに含まれるのは、メサドン、メベリジン、アンフ
エタミン、メタンフエタミン、グルテチミド、ジフェニ
ルヒダントイン、及びペンズジアゾシクロヘブタン、フ
ェノチアジン及びバルビッレートのカテゴリーに入る薬
物である。その生理学的特性により興味ある薬物はカテ
コールアミンと呼ばれるものである。

このカテコールアミンにはヱピネフリン、エフエドリン
、Ｌ−ドパ及びノルェピネフリンが含まれる。対象とな
る他薬物はトランキライザーメプロバメート、タージト
ール及びスクシンイミド、例えばエトクスミド（Ｅｔｈ
ｏｘｓｍｍｉｄｅ）である。

対象となる化合物はテトラヒドロカンナビノール、カン
ナビノール、その誘導体、特にマリジユアナ（ｍａｒＩ
Ｊ雌ｎａ）から誘導される化合物、その合成変性体及び
代謝産物である。特に興味ある別のグループの化合物は
ステロイドである。ェストロゲン、ゲストゲン、アンド
ロゲン、副腎皮質ホルモン、胆汁酸、強○グリコィド、
アルギコン、サポニン、サポゲニン等である。別のクラ
スの化合物はビタミン、例えばＶ．Ａ、Ｂ群（例えばＢ
、Ｂ６、Ｂ，２）、Ｅ、Ｋ等である。

別のクラスの化合物は糖類（単糖類と多糖類）、特に二
糠類及びそれ以上の高級多糖類である。

別のクラスの化合物はプロスタグラソジンである。

別のクラスの化合物はアミノ酸、ポリベプチド、蛋白で
ある。

ポリベプチドは普通、約２〜ＩＯＮ固のアミノ酸単位を
含む（普通には分子量は約１２０００以下）。大きなポ
リベプチドは蛋白と呼ばれ、普通約１〜２の固のポリベ
プチド鎖から構成される。ポリアミノ酸はポリベプチド
と蛋白を含む。特に興味あるアミノ酸はチロニン、トリ
ー及びテトラヨードである。試薬として２個の抗体を用
いる本発明で用いられるポリアミノ酸は一般に約５００
０〜１０？、普通には１ぴ〜１びの分子量を持つ。特に
興味あるポリベプチドと蛋白（ポリアミノ酸）はホルモ
ン、グロブリン、抗原及び特異な生理活性を持つことが
わかっている化合物である。類似した構造特徴を持つ蛋
白族、特別の生物作用を持つ蛋白、特定微生物（特に病
原微生物）に関連した蛋白等については幅広い蛋白が考
えられる。

以下は構造により分類した蛋白のクラスである。

ブロタミン、ヒスタミン、アルプミン、グロブリン、硬
蛋白、リン蛋白、ムコ蛋白、色素蛋白、リポ蛋白、核蛋
白、未分類蛋白、例えばソマロトロピン、プロラクチン
、インシュリン、ペプシン。

人間の血糠中に発見される多数の蛋白は臨床上重要であ
り、以下のものがある。

プレアルブミン、アルブミン、Ｑ，一リポ蛋白、Ｑ，一
酸糠蛋白、Ｑ，一抗トリプシン、Ｑ，一糠蛋白、トラン
スコルチン、４・簾−ポストアルプミン、トリプトフア
ンに乏しいＱ．−糠蛋白、Ｑ．Ｘ−糖蛋白、チロキシン
縞合グ。

プリン、インターＱートリプシンー阻止剤、Ｇｃ−グロ
ブリン（ＱＩ−１）、（Ｑ２−１）、（Ｑ２一２）、ハ
プトグロビン（Ｈｐｌ−１）、（Ｈｐ２−１）、（Ｈｐ
２−２）、セルロプラスミン、コリンエステラーゼ、Ｑ
２ーリポ蛋白、Ｑ２ーマクログロブリン、Ｑ２一ＨＳ一
糠蛋白、Ｚｎ−Ｑ２−糠蛋白、Ｑ２ーノィラミノー糖蛋
白、ェリスロポィェチン、８−リポ蛋白、トランスフェ
リン、ヘモベキシン、フイプリノーゲン、プラスミノー
ゲン、８２−糖蛋白１、３２一糖蛋白ｎ、免疫グロブリ
ンＧ〔（１ｇＧ）又はｙＧ−グロブリン、分子式：ｙ２
Ｋ２又はｙ２ ＾２ 〕、免疫グロブリンＡ〔（１ｇＡ
）又はＱＡ−グロブリン、分子式：（Ｑ２Ｋ２）ｍ又は
（Ｑ２ ＾２））、免疫グロブリンＭ〔（１ｇＭ）又は
ＱＭーグロプリン、分子式：（仏２Ｋ２）５又は（ム２
＾２ ）５ 〕、免疫グロブリン○〔（１ｇＤ）又は
入Ｄ−グロブリン（＾Ｄ）、分子式：（８２Ｋ２）又は
（６２ ＾２）〕、免疫グロブリンＥ〔（１ｇＥ）又は
＾Ｅ−グロブリン（＾Ｅ）、分子式：（ご２Ｋ２）又は
（ご２ 入２ ）〕、フリーライトチェーン（Ｆｒｅｅ
ｃｈａｉｎｓ）、補体因子：Ｃ′，、〇Ｍ、Ｃ′，ｒ、
Ｃ′，Ｓ、Ｃ′２、Ｃ′３、３，Ａ、Ｑ２Ｄ、Ｃ′４、
Ｃ′５、Ｃ′６、Ｃ′７・Ｃ′８・Ｃ′９０重要な凝血
因子は次表の通りである。

第肌表 凝血因子 国際名称 名 称 Ｋ クリスマス因子、血数トロンポプラスチン成分
（ＰＴＣ）Ｘ スチュアルト−プロアワｍ因子、オ
ートプロトンビンｍ幻 血鰍トロンポプラスチン前駆
体 （ＰＴＡ） 皿 ハーゲマン因子 Ｘｍ フィブリン安定化因子 重要な蛋白ホルモン 。

プチド及び蛋白ホルモンパラチロイドホルモン（バラト
ルモン）、チロカルシトニン、インシュリン、グルカゴ
ン、レラシン、エリスロポイエチン、メラーノトロピン
メラノサィト刺激ホルモン：インターメディン）、ソマ
トロピン（成長ホルモン）、コルチコトロピン（アドレ
ノコルチコトロピンホルモン）、チロトロピン、卵胞刺
激ホルモン、黄前形成ホルン（間質細胞刺激ホルモン）
、ルデオマンモトロピンホルモン（ルテロトロピン、プ
ロラクチン）、ゴナドトロピン（繊毛ゴナドトロピン）
。

織ホルモンセクレチン、ガストリン、アンギオテンシン
１、０、ブラジキニン、人間の胎盤ラクトゲン。

下垂体後葉からのべブチドホルモンオキシトシン、バン
プレシン．、放出因子ＲＦ）（ＣＲＦ、ＬＲＦ、ＴＲＦ
、サモトトロピン−Ｆ、ＧＲＦ、ＦＳＨ−ＲＦ、、ＰＩ
Ｆ、ＭＩＦ）。

対象となる他の重合性物質はムコ多糖類と多糠である。
微生物から得られる抗原多糖類を例示すると次通りであ
る。

へモセンシチン （ＨｅｍｏｓｅｎｓＭｎ） プルセラ アボルツス 組エキスヘモフイル
ス ィンフルェンザ 多糖類へモフイルス ベ
ルッシス 組トレポネマ ラィテリ
多糖類パイロネラ リ
ポ多糖類ェリシベロトリクス 多糖
類リステリア モノサイトデネス 〃クロモノ
バクテリウム リポ多糖類ミコバクテリウ
ム ツベルクロシス ９０％フエ／ールで抽出されたミ
コバクテリアと、細胞とツベルクリンの多 糖類フラクションとの塩水エキ ス クレブシヱラ アセロゲネス 多糖類クレブ
シェラ クロァカ 多糖類サルモネラ
チポサ リポ多糖類、多糖類サルモネラ チピー
ムリウム； 多糖類サルモネラ デルバイサルモ
ネラ プロルム シゲラ ダイセンテリア 〃シゲラ フレ
クスネリ シゲラ ソンネィ 粗、多糖類リケツト
シア 組エキスカンジダ アルビカン
ス 多糖類ェンタモェバ ヒストリチカ
組エキス別の化合物グループは、ペニシリン、ア
クチノマィシン、クロロマィセチン等の抗生物質である
。

対象となる化合物はセロトニン、スペルミン、フェニル
ピルビン酸である。

最後に、殺真菌剤、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤などの殺
生剤である化合物も又分析対象となる。

対象化合物以外に、抗原性であり、又それに対する天然
受体が発見できる細胞、ウイルスその他の生物学的集合
体も又分析できる。分析される微生物は完全であり、溶
解されあるいは破砕され、得られた組成物又は一部は例
えば抽出により分析される。

対象となる微生物は次の通りである。０コリンバクテリ
ア コリンバクテリウム ジフテリア 肺炎球菌 ジプロコツカス フ。

ノイモニア連鎖球菌 ストレプトコツカス ピオゲネス ストレプトコツカス サリバルス ブドウ球菌 スタフイロコツカス オーレウス スタフイロコツカス アルブス ナイセリア ナイセリア メニンギチジス ナイセリアゴノレア 腸内菌 Ｅ‐コリ マエロバクター アエロゲネス コリホームバクテリア
クレブシエラ プノイモニアサルモネラ チフオサ 洲杯ラコレラエスイス｝洲モネラ サルモネラ チピリウム シゲラ ジセンテリア シゲラ シユミツツイ シゲラ アラピノターダ シゲラ シゲラ フレクスネＩＪ シゲラ ボイジイ シゲラ ソンネイ 他の腸内菌 字≦手≧雲量表≧妻｝プ。

テウ樋ブソイドモナス オールギノーサ アルカリゲネス フアエカリス ビブリオ コレア へモフイルスーポーデテラグループ ヘモフイルス インフルエンザ・、 日．デユクレイ 日．へモフイルス 日．オージプチクス 日．／ｆラフインアルエンザ・ ポーデＪテラ ベルテユシス ／ぐストイレラ ／ぐストイレラ ベスチス ／ぐストイレラ ツラロイシス ブルセラ ブルセラ メリテンシス ブルセラ アボトツス プルセラ スイス 胞子形成好気菌 ／ゞチルス アソトラシス バチルス サブチリス バチルス メガテリウム ／ゞチルス セレウス 胞子形成嫌気菌 クロストリジウムボツリヌム クロストリジウムテタニ クロストリジウム ベルフリンゲンス クロストリジウムビイ クロストリジウム セプトリクム クロストリジウムヒストリチクム クロストリジウム テルチウム クロストリジウム ビフエルメンタンス クロストリジウム スポロゲネス ミコバクテリア ミコバクテリウム ツベルクロシス ホミニスミコバク
テリウム ボビスミコバクテリウム アビウム ミコバクテリウム レプラ ミコバクテリウム パラツベルクロシス 放線菌 真菌状バクテリア アクチノマイセスイスラエリ アクチノマイセス ボビス アクチノマイセス ナエスルンジ ／力ルジア アステロイデ′ス ノカルジア ブラシシエンシス スピロヘータ トレボネマ パリデユム スピリルム ミヌストレポネ
マ ベルテヌエ ストレプトバチルスモニリホルミスト
レポネマカラテウム ボレリア レクレンチス レプトスピラ イクテｏヘモラギア レプトスピラ カニコフ ミコプラズマ ミコプラズマ プノイモニア 他の病原体 リステリア モノシトゲネス ヱリシブロトリクス ルシオパチア ストレプトバチルス モニリホルミス ドンノゞニア グラヌロマチス バルトネラ バチリホルミス リケッチ バクテリア状寄生虫 リケッチア プロバゼキ リケッチア モーセリ リケッチアリケトシ リケッチア コノリ リケッチア オーストラリス リケツチア シビリクス リケッチア アカリ リケッチア ツツガムシ リケッチア ブルネチ リケッチア キンタナ クラミディア 未分類の寄生バクテリｆアノウイルスク
ラミディア剤 名称不確定 真菌 クリプトコツカス ネオホルマンス プラストマイセス デルマシジス ヒストプラズマ カプスラツム コクシジオイデスイミチス パラコクシジオイデス ブラシリヱンシスカンジダ ア
ルビカンス アスベルギルス フミガツス ムコ コリンビフエニル（アブシジア コリソビフエラ
）リゾプス オリザエ リゾプス アルヒヅス 簾菌 リボプス ニグリカンス スポロトリクムシエンキイ ホンセアエア ベドロソイ ホンセカエア コン／ぐクタ ホンセカエア デルマチチジス クラドスポリウム カリオニ フイアロホラ ベルコサ アスベルギールス ニデ′ユランス マデユレラ マイセトミ マデユレラ グリセア アレシエリアボイジイ フイアロスホラ ジエアンセルメィ「 ミクロスポルム ジプセウム トリコフイトン メンタグロフイぅニス ケラチノマイセスアジロイ ミクロスポルム カニス トリコフイトン ルプルム ミクロスポルム アンドウイニ ウイルス アデーノウイルス 庖疹ウイルス ヘルペス シンフ。

レツクスバリセラ（チキン ボックス） ヘルペス ゾスター（シングレス） ウイルス Ｂ サイトメガロウイルス 天然痘ウイルス バリオラ（スマルポツクス） ／ゞクシニア ボックスウイルス ボビス ／ぐラ／ゞクシニア モルスクム コンタギオスム ピコルナウイルス ポリオウイフレス コクサツキーウイルス エコーウイルス リノウイルス 粘液ウイルス インフレンザ（Ａ、Ｂ、Ｃ） パラインフルエンザ（１一４） ムンブスウイルス ニューキヤツスル病ウイルス ミースレス ウイルス リングーベスト ウイルス カニネ ジステンベラ ウイルス レスピラトリシンシチアル ウイルス ルベラ ウイルス アルボウイルス イースタン エキン オイセフアリチス ウイ′レスウ
エスタン エキシ オイセフアリチス ウイ′レフくシ
ンドビス ウイルスチクングンヤ ウイルス センリキ ホレスト．ウイルス マヨラ ウイルス セントルイス エンセフアリチス ウイルスカルボルニ
ア エンセフアリチス ウイルスコロラド だに熱 ウ
イルス黄熟ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス レオウィルス１−３型 肝炎ウイルス 肝炎ウイルスＡ型 肝炎ウイルスＢ型 種擬ウイルス ロイシヤー ロイケミア ウイルス グロス ウイルス マロネイロイケミア ウイルス ブレンド ロイケミア ウイルス マウス ママリー種場ウイルス アピアン ロイコシス ウイルス ロウス サルコマ ウイルス ポリオマ ウイルス シアミン ウイルス ４０ ／ぐピロマ ウイルス 微生物の調製： ストレプトコツカス ピオゲネス、蛋白 パステウレラ ベスチス、蛋白トキシン クロストリジウムテタニトキソイド クロストリジウム ベルフリンゲス Ｑ−レシチナーゼ
Ｅ．コリ、炉液トレポネマ レイテリ蛋白エキス コネリバクテリウム ジフテリアトキシントキソイド ミコバクテリウム ツベルクロシス、蛋白ッベルクロシ
ス、細胞質 ッベルクロシス、培養炉液とツベルクリンミコプラズマ
プノイモニア“粗”抗原 免疫分析 本発明の免疫分析は、蟹光分子にそれにより吸収される
光（好ましくは吸収ピーク内の）を照射する場合に媒体
中のりガンドの作用として溶液中に生ずる消光の程度に
基づく。

即ち、消光が起こる距離内にある蟹光分子と消光分子の
数は被分析媒体中に存在するりガンドの量に関連がある
。分析は、発色体に結合した、リガンドに対する受体（
抗リガンド）（抗リガンド−発色体）又は発色体に結合
した、抗リガンドに対する受体〔抗（抗リガンド）〕〔
抗（抗リガンド）一発色光〕を用いて実施できる。以下
に述べる理由により、後者の技術（二重受体法）により
、単一受体法で可能な分析に加え、手順上の利点がある
。二重受体法では、介在する受体（抗リガンド）を通じ
て受体−発色体をリガンドに間接的に結合し、これによ
り試薬を更に自由に変えることができる。単一受体技術
を用いる分析の実施においては、リガンド類似体試薬は
発色体、リガンド類似体−（ＣＨ２）ｘ又はポリ（リガ
ンド類似体）ーポリ（Ｃｈ２）に直接に（共有結合によ
る）か、発色体（Ｃｈ２）に間接的に（受体−Ｃｈ２を
通じて）結合したりガンド類似体を有する。ついで、被
分析媒体中に、Ｃｈ２に結合したりガンド、受体−Ｃｈ
，及び禾知物をあわせることにより、分析を実施する。
様々な添加順序が可能である。リガンド類似体をＣｈ２
に間接的に結合させる場合には、受体−Ｃｈ，と受体−
Ｃｈ２とは段階的に又は事実上同時に添加できる。便宜
上、受体−Ｃｈ，と受体−Ｃｈ２とは適当な割合であわ
せ単一試薬とできる。

この方法で、２つの共通受体の比を注意深くコントロー
ルし、被分析混合物に正確に添加できる。この混合物は
凍結乾燥混合物でも、あるいは所望濃度の水溶液（通常
斑５〜１０に、普通には６．５〜８．５に緩衡されてい
る）でもよい。対象リガンドの濃度は、一般には約１０
‐４〜１０‐１４、更に普通には約１０‐６〜１０‐１
２、最も普通には１０‐６〜１０‐１０Ｍである。

リガンドの濃度はリガンド濃度を反映する。媒体は通常
には、水性であり、０〜４０、更に普通には０〜２仇／
ｖ％の極性有機溶媒を含む。

この溶媒を例示すれば、エチレングリコール、エタノー
ル、力ルビトール、ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド等である。好ましくは、この水性媒体は事実
上、他の極性溶媒を含まない。この媒体は通常、約５〜
１０に、好ましくは約６．５〜８．５に、更に好ましく
は約７〜８５に穣衡されている。ボレート、ホスフエー
ト、カーボネート、バルビツール酸、トリス等の様々な
穣衡物を使用できる。いずれの緩衝物を選ぶかは絶対要
件ではないが、個々の分析において好ましいものがある
。緩衡物濃度は通常には約０．００５〜０．８Ｍ、更に
普通には約０．０１〜０．１Ｍである。分析中は、通常
には中等度の温度を用い、一般に約ｏｏ〜４５午０、更
に普通には約１５０ 〜４０００である。

温度の選択は、便利さ、蟹光効率に及ぼす温度効果、及
びリガンドに対する受体の結合定数により左右される。
蟹光効率と結合定数が高まるので分析能率は低温で良く
なる。便宜上、単一受体分析法は、リガンドが発色体に
共有結合している場合と、リガンドが受体を介在し発色
体に間接的に結合している場合とに分けられる。

第一の分析法では、発色体がリガンドに共有結合してい
る組成物を用いる。

前述した通り、一つの発色体は一つのＩＪガンド‘こ結
合でき、又中心原子を用いることにより複数のリガンド
は複数の発色基に結合できる。別法として、リガンドが
蛋白のように大きい時には複数の発色基を一つのりガン
ドに結合できる。リガンド類似体−発色体は、一般に対
象物の技高濃度の１０の音以下から最低濃度の０．０１
倍以上、更に普通には対象物の最高濃度から技低濃度の
０．１倍以上、好ましくは対象物の最低濃度の約１０倍
内（ｗ他ｉｎａｎｏｒｄｅｒｏｆｍａ靭ｉｔｕｄｅｏｒ
ａはｃｔｏｒｏｆｌｏ）の濃度にある。

受体−発色体濃度は、少なくとも１０％、好ましくは少
なくとも２０％で最高１００％、普通には約２０〜８０
％、好ましくは５０〜８０％を消光するのに充分な量の
受体を加えることにより測定される。用いられる受体−
発色体の量は、結合定数、対象物の濃度（リガソド−発
色体濃度に影響する）、装置の感度等と関連する。リガ
ンドに結合した発色体は消光体でもよいが、大低の場合
姿光体である。

これは操作上の問題ではなく便宜的なものである。多く
の場合、受体は抗体（複蛋白混合物）であり、リガンド
ーこ対する抗体のほか、他の抗体及び蛋白を含む。抗体
組成物を発色体でラベリングする時には、この発色体の
ほとんどの部分はリガンドに対する抗体（抗リガンド）
以外の蛋白に結合する。それゆえ、蟹光体が受体に結合
している時には、被分析媒体中に大きな背景蟹光が生ず
るであろう。別法として、抗リガンドの比較的純粋なサ
ンプルが利用できる時には、リガンドを蟹光体ではなく
消光体に結合するのが好ましいであろう。被分析媒体へ
の様々な物質の添加順位は本発明では絶対的なものでは
ない。

未知物とＩＪガンド類似体−発色体は受体一発色体と同
時にあわせることも、又順々にあわせることもできる。
好ましくは、未知物を受体−発色体とあわせ、平衡に達
するのに充分な時間インキュベートする。それゆえ、受
体の結合可能部位は被分析媒体中に存在する未知物の量
に比例して減る。ついでリガンド類似体−発色体を加え
、インキュベートし、ついで蟹光計に移し、蟹光体に吸
収される波長を持った光で励起して蟹光強度を測定する
。インキュベート時間は用いる温度、受体の結合定数、
被分析媒体中に存在する物質の濃度により左右される。

通常は少なくとも約５秒、好ましくは約６時間を越えず
、更に普通には約３の段〜２時間、好ましくは１〜３０
分である。インキュべ−ト温度は一般に約１ｙ 〜４０
ｑｏである。既知濃度のリガンドを含む一連の液を用い
ることにより、蟹光又は消光率をリガンド濃度に関連づ
けた標準曲線が得られる。

ついで、被分析媒体からの蟹光量を、その中に含まれる
禾知物の濃度に直接に関連づけることができる。第二の
方法（リガンドは発色体に間接結合している）では、抗
リガンドを２つの部分に割け、１つの部分を蟹光体と結
合させ、他の部分を消光体と結合させる。

この方法では、リガンドが複数の決定即ちェピト−プ部
位を持つか、あるいはリガンドが唯１つ又は２つのェピ
トープ部位を持つ場合にはポリ（リガンド類似体）が製
造できることが必要である。即ち、リガンドは同時には
２〜３の、普通には約１〜２の抗体を供給できるにすぎ
ない。前述通り、ボリ（リガンド類似体）はリガンド類
似体を高分子量の中心分子に結合することにより製造さ
れる。リガンドを発色体に共有結合する分析法では、リ
ガンドが０の状態から濃度が上昇していく分析反応は、
最大量の蟹光が得られるまで蟹光が上昇するにつれてな
めらかな曲線を描く。同様な結果が、ボリ（リガンド類
似体）を用いてリガンド、受体−蟹光体、受体−消光体
を測定する時にも観察される。しかし、抗原（複数の決
定部位を持つ）を用い、受体−消光体と受体−蟹光体の
みを被分析物に加える時には最大蟹光が得られ、この最
大篭光は抗原濃度が上昇するにつれて低下して最小とな
り、ついで再び上昇して最大蟹光に達する。この二相結
果の原因は明らかである。

抗原を加えると、消光体と蜜光体とはこの抗原の表面上
に集まり、その結果幾分消光現象が起こる。抗原濃度が
高まるにつれて２つの受体は増々抗原表面に集まり消光
が高まる。しかし、ある濃度で消光は最大になる（蟹光
は最小になる）。抗原が増すにつれて、いずれか１つの
抗原に結合した受体の量は減り、その結果消光量も減る
。結果として、抗原濃度が高い時には、いずれか１つの
抗原に結合した受体の量は消光するほどではない。それ
ゆえ、抗原を分析する時には２つの異なった希釈度で実
施する必要がある。この方法で、曲線の下降部分にある
のか上昇部分にあるのか決定できる。利用できるリガン
ド類似体を基にしてのポリ（リガンド類似体）の濃度は
、発色体に共有結合したりガンドと同一範囲内にある。
２つの結合受体（例えば抗体）を用いて分析を実施する
においては、普通約０．１〜１のｃ′の‘の蛋白（例え
ばアルブミン）の存在下で抗原を抗体と結合させ、充分
な時間（一般に約５秒〜６時間、更に普通には約１／２
分〜２時間、好ましくは１〜３０分）約１５ｏ 〜４０
午０の範囲の温度でインキュベートする。

インキュベート時間を決めるのに考慮すべき点は前に述
べた通りである。ポリ（リガンド類似体）を用いる時に
は２つの結合抗体を被分析物とあわせ、インキユベート
し、ポリ（リガンド類似体）を加え、更にインキュべ−
トする。

この分析にも又、前述の時間と温度を適用できる。つい
でサンプルを蜜光計に導入し、適当な波長の光で励起し
ながら蟹光を測定する。

この蟹光は測定波長帯により姿光体又は消光体に由来す
る。この分析は手で又は自動式に実施できる。本発明の
方法は、２段階法とｙ−グロブリン（例えば人間の）に
対する受体一発色体（Ｃｈ，とＣｈ２）を使って人間の
生理液中の抗体又は抗原の存在を測定するのに容易に採
用できる。

抗原に結合している抗体その他の受体分子の集合体と、
溶液中に遊離している抗体その他の受体とは、分子量の
差により容易に区別できる。人間の生理液（例えば血液
）中の抗原又は抗体の存在又は不存在のいずれを測定す
るかによっては、補足物質を普通には対象物の最大濃度
を事実上越える量で加える。

例えば、特定抗原に対する血清中の抗体の存在を測定し
たいならば抗原を生理液に加え、抗体より大きい分子量
（＞１６００００）を持つ成分を例えば遠心分離により
分離する。上燈液と沈澱物を分離した後に沈澱物を再分
散させ、人間のｙ−グロプリンが存在するか杏かを本発
明の方法により分析する。抗原が存在する時にのみ人間
のｙ−グロブリンは沈磯物中に存在する。それゆえ、沈
澱物中に人間のｙーグロブリンが存在することは、当該
抗原に対する抗体が血清中に存在することを示す。２段
階法により、同一の受体−発色体を使って広範囲の抗原
と抗体を測定できる。

この方法により、特異抗原に対する抗体を直接に測定で
きる。抗原は、その抗原を含むと思われる流体に抗体を
加え、ついで結合抗体と未結合抗体とを分離した後に沈
澱物中の抗体の存在を分析することにより間接的に測定
できる。二重受体法は、ハプテン、抗原、抗ーリガンド
の測定を可能にする（特にリガンドがポリェピトープ抗
原である時）均質法である。

最も簡単な方法では、リガンド検出のためにリガンドを
発色体（特に蟹光体）に結合させ、抗−リガンドと抗（
抗リガンド）−発色体（特に消光体）とを被分析液に加
える。

この方法で、多数の消光分子をリガンドに結合し、消光
の機会を増すことができるであろう。実際、抗ーリガン
ドはリガンドに結合できる消光分子数を増加できる。試
薬濃度は単一受体法の類似試薬と同様であり、抗（抗リ
ガンド）−発色体は抗ーリガンドのモル数より多く、一
般にそのモル比は約１．５〜１０：１である。所望なら
ば、完全な１ｇＧではなく個々のＦａｂ単位を用いるこ
とができる。以下の方法では、発色体は共にリガンドに
間接結合している。

この方法では、抗リガンドと抗（抗リガンド）−Ｃｈ，
と抗（抗リガンド）−Ｃｈ２を用いる。しかし、これら
試薬の導入に先き立って抗リガンドの一部を抗（抗リガ
ンド）−Ｃｈ，と、そして他の一部を抗（抗リガンド）
−Ｃｈ２と結合させる。望ましくは、抗（抗リガンド）
は一官能、例えばＦａｂである。抗リガンド‘こ結合し
た抗（抗リガンド）−Ｃｈ，と−Ｃ〜はそれぞれ受体−
Ｃｈ，、受体−Ｃｈ２に匹敵する試薬となる。抗（抗リ
ガンド）−発色体と抗リガンドとの比は前述と同様であ
る。好ましい具体例においては、２つの異なった種類（
例えば噸乳動物、例えば羊と雌牛）から得た抗リガンド
を用いる。

この場合、ェピトープ部位又はハプテン部位は、同一リ
ガンド‘こ対する２つの抗リガンドが異なる。２つの異
なる供給源からの抗リガンドについては抗リガンドの前
に小文字を置き〔例えばａ−抗リガンド〕区別する。

この方法で、抗リガンドと抗（抗リガソド）−発色体と
は前もって結合する必要はない。様々な試薬の比は、前
述した類似試薬の場合と同様である。発色試薬は、抗（
ａ−抗リガンド）−Ｃｈ，と抗（ｂ−抗リガンド）−Ｃ
ｈ２である。したがってＣｈ，はａ一（抗リガンド）の
みと、Ｃｈ２はｂ一（抗リガンド）と結合している。こ
の方法により、溶液中の集合体（集合体のメンバーは少
なくとも１個のェピトープ部位だけ異なる）の測定が可
能になる。

集合体の１メンバーのためにａ−（抗リガンド）を、も
う１つのメンバーのためにｂ−（抗リガンド）を製造で
きる。消光体と蟹光体とは２つのメンバーが結合される
時にのみ一体となるであろう。２つの異なる供給源から
の抗リガンドを使えば、抗−リガンドと抗（抗リガンド
）−発色体を前もって結合させる必要を省き、又独立し
て存在できる２つの部分の間に共有結合が生ずる場合に
は例えば化学反応が起こるのを避けるという利用をもっ
てリガンドと共に用いることもできる。

試薬は別々のバィアルに入れることも、又凍結乾燥状態
で混合することも、いかなる所望濃度の水溶液（通常に
はｐＨ５〜１０に、普通には６．５〜８．５に穣衡され
ている）にすることもできる。好ましくは、抗（ａ−抗
リガンド）は使用前長期間試薬として溶液中でａ−（抗
リガンド）と結合されないだろう。便宜上、２つの抗リ
ガンドを結合させ、２つの抗（抗リガンド）を結合する
ことができる。二重受体を使う特別の利点は、リガンド
に関係なく同一ベアの抗（抗リガンド）一発色体を用い
ることができ、抗リガンドのベアのみがリガンドが変わ
ることである。

特定抗原に対する抗体の存在を測定するためには、既知
量の抗原を被分析媒体に加える点を除いては抗原を測定
しているかのように分析を実施する。被分析物中に存在
するいかなる抗体も抗原に結合した抗（抗リガンド）‐
発色体の量を減じ、従って抗体不存在下では生ずるであ
ろう消光の量を減じる。もちろんト抗リガンド‘ま測定
対象の抗体とは別の供給源（噸乳動物以外）に由来する
。以下の実施例は本発明を例示するものであり限定する
ものではない。温度は特記ない限りすべて。

○である。部は特記ない限りすべて重量部である。緩衡
液はすべて水性緩衡液である。すべての記号は特記ない
限り通常の意味を持つ。次の記号を用いる。

１ｇＧ一ｙ−グロブリン； １ｇＧ（Ｘ）−抗−Ｘ； Ｒ一テトラメチルロダミン、例えばＲｉｇＣ（Ｘ）−抗
一Ｘに結合したテトラメチルロダミン：Ｆーフルオレス
セィン、例えばＦｉｇＣ（×）−抗−Ｘに結合したフル
オレスセィン；及びｈｌｇＧ一人間のッーグロブリン。

実施例 １ イソシアン酸フルオレスセィン（ＦＩＴＣ）の０３−ア
ミノヱチルモルヒネへの結合体（ＦＬＵＭ〇Ｓ′） Ａ フルオレスセインアミン（０．５夕）〔シグマ、異
性１、純粋、ｔｉｃ（ＭｅＯＨ／ＣＨＣ１３）１：３〕
を２０舷の乾燥ァセトン（無水Ｋ２Ｃ０３で乾燥）に溶
解し、チオホスゲン（３地）のアセトン（５の【）溶液
に強く燈拝しながら室温で滴下した（１／幼時間）。

縄梓を１時間続け、氷格で５℃にまで冷却して生じた沈
澱物を紬競結ガラス炉斗で急速炉取した。この沈澱物を
乾燥ァセトン（３Ｍ）ついで５×５の‘の細ＨＣＩで洗
い、一方深紅色になるまでスパーテルで砕き、ついで一
夜真空乾燥した（８００ＫＯＨ）。得られたィソチオシ
アン酸フルオレスセィンは純粋だった〔Ｕｃ＝５０％（
ＭｅＯＨ／ＤＭ『）〕。

Ｂ ０３−アミノエチルモルヒネ（１００の９）を５Ｍ
のアセトンに溶解し、アセトン（２０柵）、水（５私）
及びトリェチルアミン（０．０７の【）の混合物に加え
た。

得た溶液に櫨拝しながら１５分かけてＦＩＴＣ（１００
Ｍ）のアセトン（５泌）溶液を滴下した。損洋を更に８
び分続け、この間トリェチルアミンの希アセトン溶液（
１．４肌【／１０叫アセトン）の滴下により州を９．５
に調整した。ついで室温で回転蒸発器を使いアセトンの
一部を除去した。ついでＰＨが６〜６．５に低下するま
で日２０を添加（１０凧【まで）しながら溶液中にＣ０
２を通気して生成物を沈澱させた。沈澱物を競緒ガラス
炉斗で急速炉過し、ＱＣ０３溶液（２泌、ｐＨ６．０）
で洗った。収量＝６０の９、炉液と洗液とをあわせ、前
述と同じくＣ０２通気をくりかえて第二の収穫物を得た
。収量＝２７ｍｃ。生成物を８０ｏ で一夜真空乾燥し
た（Ｐ２０５）。全収量＝８７の夕。生成物はｔｉｃ（
ジメチルホルムアミド中５０％メタノール）で単一スポ
ットを示した。Ｒｆ＝０．４ふ実施例 ロ モルヒネ抗体〔１ｇＧ（ｍ）〕のテトラメチルロダミン
イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）による精製とラベリ
ングＡ【ａ）モルヒネの製造−免疫吸着剤 へキサメチレンジアミンとカップルさせた臭化シアン活
性セフアロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）碑（８〜１０〃
モル／１の‘パックゲル）を指示書により製造した（Ｐ
ｈａｒｍａｃｌａ、Ｕｐｓａｌａ）。

湿潤ゲル（２．５Ｍ）をボレ−ト綾衡液（１０の‘、０
．１Ｎ、ｐＨ＝８．８）中に懸濁させ、ＤＭＦ（２の‘
）中のび−カルポキシメチルモルヒネとイソブチルクロ
ルホルメートとの混成無水物（０．１ミリモル、大過剰
）を袷時（ｏｏ）加え、３時間反応させた。ゲル状物を
炉取し、日２０（５００の‘）、０．１Ｍボレート穣衡
液（ｐＨ＝９．０、５００の【）、Ｈ２０（５００舷【
）、希ＨＣＩ＋０．１ＭＮａＣ１（ｐＨ：２．５、１５
００の‘）及び比０（１０００の【）で連続洗浄した。
洗浄終点でモルヒネは検出できなかった。希酢酸加水分
解法〔Ｆａｉｌｌａ等、Ａｎａｌ．ＢｉＭｈｅｍ．、５
２、３６３（１９７３）〕により結合モルヒネの測定を
実施した。Ｕ．Ｖ．スペクトルを０３−カルボキシメチ
ルモルヒネのものと比較した。結合モルヒネの量は５．
０５ｒモル／１の【パックゲルだった。【ｂ１ モルヒ
ネ抗体の精製モルヒネ−セフア。

−ス結合体をキＱｄ‐力ラム．に充填し、各１００Ｍの
ボレート穣衡液（０．１Ｍ、ｐＨ＝９．０）、日２０、
希ＨＣ１（ｐＨ＝１．５）、比○、同一のポレート緩衡
液で連続洗浄した。ストックの羊１ｇＧ溶液（７のと、
２．１８×１０‐４Ｍの結合部位）をカラムに入れ、つ
いで、流出液中に蛋白が検出されなくなるまで（Ｕ．Ｖ
．検定）ボレートタ緩衝液（１０．１Ｍ、ｐＨ＝９．０
）で洗った。モルヒネスピンラベル測定法（アメリカ特
許３６９雌私号明細書）で測定したら抗モルヒネ活性は
すべてカラムにより保持されていた。グリシンーＨＣＩ
緩衝液（０．１Ｎ、ｐＨ＝４．０）での洗浄を続けたが
蛋白は溶出されなかった。ついでグリシンーＨＣＩ綾衡
液（０．１Ｎ、舟＝１．５）で抗体を溶出し、３の【ず
つのフラクションを、１叫のＩＮボレート緩衡液（ｐＨ
＝９．０）を含むチューブ中に室温で集めた。ほとんど
すべての抗体は３つのフラクション中に集められており
、これらをあわせて、０．１Ｎホスフェート緩衡液（ｐ
Ｈ＝７．ふ ２×２００奴‘）で２想時間透析した。単
離したフラクションの抗モルヒネ活性をモルヒネスピン
ラベル法で測定したら、初めの結合抗モルヒネ活性の７
０％だった。このフラクションは、２８仇ｍＵ．Ｖ．ス
ペクトルで測定した蟹白含量に比較しての抗モルヒネ活
性力価により測定したところによると１００％純粋だっ
た。Ｂ■ モルヒネ抗体の精製ーセフアデックスクロマ
トグラフイー抗モルヒネ１ｇＧ（ｍ）溶液（２の上、〜
５０の夕／私全蛋白）を、セフアデツクスＧ−２００カ
ラム（２×３０肌）で０．０１ＭＰＢＳ（ホスフエート
綾衡塩水）（ｐＨ＝７．４ 流速１の【／１０分）によ
り分離した。

１ｇ０は１ｇＭ及びアルブミンから明らかに分離し、又
２〜３の【ずつのフラクションを集めた。得られた１＆
は、セルロースアセテート電気泳動（Ｔｒｉｓｂａｒｂ
．で緩衡、ｐＨ＝８．＆り＝０．１）ではアルブミンを
示さず、又３２〜３５％の抗モルヒネに富んだ１ｇＧだ
った。回収は、集めた１ｇＧピークの切り幅（Ｃｕｔ−
Ｍｄｔｈ）で行ない、普通には、カラムに入れた全抗モ
ルヒネ活性の５０％だった。集めた１ｇＧフラクシヨン
を０．０１Ｍホスフエート穣衡液（冊＝７．５）で透析
した。‘ｂ｝ 牛血清ァルブミン（聡Ａ）‐免疫吸着剤
処理指示書により斑ＡをＣＮＢＧ活性セファｏ‐スの（
Ｐｈａ−ｎｎａｃｉａ）とカップリングした（指示量の
５０％過剰のＢＳＡを使用した）。

５の‘のセフアデツクスクロマトグラフイーしたねＣ溶
液（２０の９／泌）をＢＳＡ−免疫吸着剤カラム（１×
１５肌）に入れ、０．０１Ｍホスフエ−ト緩衡液（ｐＨ
７．５）中を通過させた。

集めた蛋白フラクション（２０叫）の蟹白含量（Ｕ．Ｖ
．）と抗モルヒネ活性（スピンラベル法）を分析した。
蛋白回収率７０％、抗モルヒネ活性回収率９０〜９２％
。‘ｃ｝ ＴＲＩＴＣでラベルした抗モルヒネ〔１＆（
ｍ）〕〔ＲＩや（ｍ）〕１や（ｍ）（７肌／０．５Ｍ）
の０．０１Ｍホスフェート緩衡液（ｐＨ７．５）溶液に
、室温で櫨拝しながらＰＨが１０．０〜１０．５になる
まで結晶炭酸カリウムを加えた。

ついでＴＲｍＣ（テトラメチルロダミンイソチオシアネ
ｍト）（１５〜１０００山夕）のアセトン（３〜３０〃
」夕）溶液を加え、額拝を３時間続けたｐＨはまず９．
０に下がり、ついで安定になった。必要ならば結晶炭酸
カリウムを注意深く加えて９．０〜９．５に総特できる
。ついで０．０１Ｍホスフェート緩衡液（ｐＨ＝７．５
）の入ったセフアデツクスＧ−２５（Ｍ）カラム（１×
１５の）に入れ、他帯から完全に分離した第１着色帯の
港出液を１０〜１５分後に集めた。遊離染料を完全に除
去するために分離を２度くり返した。沈澱物が形成され
た場合にはセフアデックスでの分離に先立ち遠心分離し
て除去した。次表は、上記方法で様々な程度にラベリン
グされた結合体の製造を示す。蛋白（％抗別的秋）・事
泌染料（ＴＲ１ＴＣ）Ｄ／Ｐ※〃夕 （Ｍ／Ｍ）％
活性回収率※Ｄ／Ｐ＝染料／蛋白 実施例 ｍ フルオレスセインイソチオシアネート （ＦＩＴＣ）でラベルしたモルヒネ抗体〔ＦＩや（ｍ）
〕【ａ’結合方法 実施例０と同様にクロマトグラフィーしたモルヒネ抗体
の１の‘フラクション（０１．０１Ｍホスフェート緩衡
液中、ｐＨ＝７．５）４個を、結晶炭酸ナトリウム（Ｎ
もＣ０８）でｐＨ９．５にした。

ＦＩＴＣのアセトン溶液（２のｏ／３００山そ）の１１
０、２リ３０及び５０山夕を、それぞれ４個の抗体フラ
クションに室温で蝿拝しながら加えた。３」時間後に４
つの反応混合物をあわせ、ついて；８等分し、０．０１
Ｍホスフェート穣衡液（ｐＨ７．５）を均一分散させた
セフアデツクスＧ一２５カラム（１×１５伽）を通過さ
せた。

同一緩衛液で第１着色帯を溶出して、未反応染料を含ま
ない結合体を得た。‘ｂー ＤＥＡＥーセルロースカラ
ムでのＦＩＴＣ結合体の分離（Ｍ．ＧＩｄｍａｎ著“Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＡｎｔｉｂｏｄｙＭｅｔｈｏｄ
ｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｅｄ．、１９６
８、１０４〜１０刀頁を参照せよ）。

ＦＩＴＣ−抗モルヒネ結合体を、０．０１Ｍホスフェー
ト綾衡液（州＝７．３）が均一分散されたＤＥＡＥーセ
ルロースカラム（１×３肌）に加えた。同一緩衝液でＮ
ａＣＩ濃度を徐々に高めながら溶出して、染料舎量が徐
々に増しているフラクションを得た。様々なフラクショ
ンの梁料含量Ｄ／Ｐを、ゥェルズノモグラフ（Ｗｅｌ“
ｎｏｍｏｇｒａｐｈ）〔Ａ．Ｆ．Ｗｅｌｌｓ、Ｃ．Ｅ
．Ｍｍｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｋ．Ｎａｄｅｌ、Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌ、１４２７１（１９６６）〕で測定
した。普通通りモルヒネスピンラベルで抗モルヒネ活性
を測定した。次−のフラクションを得た。フラクション
修 蛋白（物） Ｄ／Ｐモルノモル実施例 Ｗ人間のｙ
ーグロブリンに対する抗体〔１ｇＧ（ｈｌｇＧ）〕であ
り、ＦＩＴＣに結合したもの〔ＦｉｇＣ（ｈｌｇＧ）〕
又はＴＲＩＴＣに結合したもの〔Ｒｉｇ（ｈｌｇＧ）〕
の精製（ａ｝ 親和クロマトグラフィーによる、人間の
１ｇＧに対する抗体の精製マニュアルに記載された通り
にセフアロース−の（２夕）を１８の９の人間のｙ−グ
ロブリン（ｈｌｇＧ）とカップリングした（Ｐｈａｒｍ
ａｃｌａ、Ｕｐｓａｌａ）。

ｈｌｇＧに対するウサギの抗血清（５０泌、５のｐ抗体
／の‘）〔１ｇＧ（ｈｌｇＧ）〕をアンチボデイーズイ
ンコーポレーテイツド（池ｔｉ戊ｄｉｅｓＩｎｃｏｒｐ
ｏはｔｅｄ）から得た。

上記セフアロースーｈｌｇＧ結合体のカラム（１×３弧
）を０．０１Ｍボレート穣衡液（冊＝８．０）で調製し
た。抗血清をカラムを通過させ、ついで、溶出液中に蛋
白が検出できなくなるまで同一緩衡液で洗浄した。カラ
ムを更に０．１Ｍグリシソ・ＨＣＩ緩衝液（ｐＨコ５．
０）で洗った。ついで０．１Ｍグリシン・ＨＣＩ緩衡液
（柵＝２．５）で抗体を熔出し、３必ずつのフラクショ
ンをあつめ、０．８Ｍボレート緩衡液（斑＝９．０）で
直ちに中和した。かくして集めた抗体溶液の全量は３０
の‘だった。この抗体溶液を０．０８Ｍホスフヱート緩
衝液（ｐＨ＝８．０）で一夜透析し、ついでアクアサィ
ド（Ａｑｕａｃｉｄｅ）で濃縮し、再透析した。最終量
は１１のとであり、２８皿凧吸収スペクトルで３測定し
て蛋白−抗体含量は３．７６の９／の‘だった。抗体回
収率は８３％だった。【ｂ’Ｆｉｇ０（ｈｌｇＧ）の製
造 （ｉ）上記の抗体０．０９Ｍホスフェート緩衝液（餌＝
８．０）溶液（１叫）を結晶Ｎａ２Ｃ０３でｐＨ９．５
３にした。

室温で３時間蝿拝しながらアセトン（１０ムそ）中のＦ
ＩＴＣ（１００ムタ）を加えた。ついで、０．０９Ｍホ
スフェート機衡液（餌＝８．０）を均一分散させたセフ
アデツクスＧ−２５（Ｍ）（１×１ルホ）で結合体を分
離した。４結合体を１．５の【中に集めた。

Ｄ／Ｐ＝４．３（Ｍ／Ｍ）（染料／蛋白）、ウェルズノ
モグラフで測定して２．０５雌／私。【ｃ｝ ＲＩｇＣ
（ｈｌｇＧ）の製造 （ｉ）上記抗体溶液（１凧【）を結晶Ｎａ２Ｃ０３でｐ
Ｈ９．５とした。

室温でアセトン（２０〜３０山〆）中ＴＲＩＴＣ（０．
５のｃ）を加え、３時間蝿拝した。形成された沈澱物を
遠心分離して捨てた。

ついで、０．０９Ｍホスフェート緩衝液（冊＝８．０）
を均一分散させたセフアデックスＧ−２５カラム（１×
１０伽）で結合体を２度分離した。生成物を２の【容量
で回収した。Ｄ／Ｐ＝１０：２８０５１節机吸収スペク
トルで測定して０．７の９／泌。（ｉｉ） ｈｌｇＧに
対するウサギ抗血清（６．４の９抗体／の【）のＤＥＡ
Ｅーセルロース分離１ｇＣフラクション（２７．６雌／
肌【）アンチボデイーズ（抑ｔｉｂｄｉｅｓ）Ｉｎｃ．
から得た。

この蛋白液（０．５の‘）を結晶Ｎａ２Ｃ０３で−９．
５にし、冷却（４ｏ）渡洋しながら３の９のＴＲＩＴＣ
（５０ｒそのアセトン十０．５奴の日２０に入れてある
）を加えた。３時間後を沈澱物が生じ、これを炉去した
。

得たバイオレット色溶液を、０．０９Ｍホスフェート緩
衝液（ｐＨ＝８．０）を均一分散させたセフアデツクス
Ｇ−２５（Ｍ）カラム（２×３０弧）で２度連続分離し
た。吸収スペクトルから計算して得られた結合体は０．
１のｏ抗体／机上、Ｄ／Ｐは１２〜１５（Ｍ／Ｍ）だっ
た。実施例 Ｖ 人間のｙーグロプリン（ｈｌｇＧ）のフルオレスセィン
への結合体（ＦｈｌｇＧ）ＩｍｐのＨＩｇＣ（人間の１
ｇＧ）を０．４Ｍの０．１Ｍホスフェート綾衡液（ｐＨ
７．５）に溶解し、結晶Ｎａ２Ｃ０３でＰＨを９．５に
した。

ＦＩＴＣ（７０山ののアセトン溶液（１０ムそ）を燭拝
しながら加え、室温で３時間混合した。生じた溶液を、
０．０９Ｍを、０．０８Ｍホスフェート綾衡液（ｐＨ：
８．０）が均一分散しているセフアデツクスＧ−２５（
Ｍ）力ラム（１×１５肌）で２回分離した。溶出したＦ
ＩＴＣ−ｈｌｇＧ結合体溶液はウェルズノモグラフで測
定したら濃度０．５８奴／私、Ｄ／Ｐ＝５．５（Ｍ／Ｍ
）だった。実施例 のモルヒネの牛血清アルブミンへの
結合体 ０３−カルポキシメチルモルヒネ（３．４３夕）と１．
３１の上のイソブチルクロルホルメートとを００の３０
の‘ＤＭＦ中にあわせた。

生じた澄明液をついで２．８８夕のＢＳＡと１３夕のＮ
ａＨＣ０３とを６００Ｍの水（ｏｏ）に入れた麓梓溶液
に加えた。添加は、シリンジの先端を溶液表面以下に入
れて実施した。得た溶液を袷室で一夜燈拝した。上記溶
液を大きなセフアデツクスカラム中を通過させた後に溶
出液をダウＨＦＤ／１，で−夜６０の‘にまで濃縮して
、凍結乾燥して３．１夕を得た。

Ｕ．Ｖ．分析により、生成物は平均して約４４個のモル
ヒネ基を持つことが示された。リガンドの存在を測定す
るための‐一方法としての、蟹光の消光現象を利用して
の本発明の有効性Ｚを実証するために、様々なプロトコ
・‐ルを用いて多数の異なる分析を実施した。

第一の分析では、フルオレスセィンィソチオシアネート
の０３−アミノェチルモルヒネへの結合体（ＦＬＵＭＯ
′Ｓ′）を用いてモルヒネとコデインＺを分析した。

この分析の第一部として、様々な程度にロダミンをうべ
リングした多数の抗体結合体をＦＬＵＭ〇Ｓ′とあわせ
て最大消光を測定した。

ＦＬＵＭ〇Ｓ′は０．０９Ｍボレート藤衡液（軸＝８０
）中で１．８３×１０‐９Ｍの濃度であった。ＦＭｘ＝
５１６〜５１紬肌での蟹光相対強度を、４９加川から５
３肌机に走査させ、励起線を４６２〜４鼠ｎｍをし、ス
リット感度／ブで調整してピークをスぅ「ール上に保ち
、パーキンェルマ−ＭＰＦ‐泌型蟹光分光光度計で記録
した。この分光光度計のセル（１触角、容量３の【）を
２個のミラーコンビネ・−ションベース中に据えた。結
合抗体を、受光の読みを取る前に３０〜４０分、パイレ
ツクスバイアス中、室温でＦＬＵＭ〇Ｓ′と共にインキ
ュベートした。結合体の染料／蛋白比（Ｄ／Ｐ）（Ｍ／
Ｍ）は０．９ ２．２、４．４１．５〜１６、２０〜滋
だった。相対効率〔対応する結合部位当量の数で技大消
光量（％）をわった数の１／２〕はそれぞれ６、１６．
４、２４５１．４ ３１．５だった。分析の実施におい
ては次の試薬を順いた。

ＦＬＵＭＯ′Ｓ′−１．３８×１０‐７Ｍ：ＲｉｇＧ（
ｍ）Ｄ／Ｐ３０、４．球×１０‐７Ｍ；ボレート穣街液
０．０８Ｍ母８．０：標準モルヒネ溶液（１．５×１０
‐３〜１．５×１０‐７Ｍ）。

インキユベーシヨンはガラスチューブ内で行なった。方
法：等量のＲＩ＆（ｍ）（４０〃夕）を０．０９Ｍボレ
ート穣衡液（ｐＨ＝８．０ ２９４０〜２９馴れタ）で
希釈し、モルヒネ量を増しながら（５〜１０Ａその標準
モルヒネ溶液）室温で１時間インキュベートした。

ついでＦＬＵＭＯ′Ｓ′（１０山夕）を加え、更に１時
間インキュベートした。各チューブの最終量は３の上だ
った。最終濃度はＦＬＵＭ〇Ｓ′が４．６×１０‐１０
Ｍ、ＲｉｇＧ（ｍ）が６．１×１０‐９Ｍ（結合部位に
おいて）だった。結果を、最大蟹光（ＦＬＵＭ〇Ｓ′が
抗体を消光することがない）の％として、蟹光強度上昇
として次表に示す。

０ 表ｌ 別離も濃度）シ州職度群渋 モルヒネの代わりにコディンを用いて実験をくり返した
。

次表にその結果を示す。表ｎ コデイン（けし濃度〉シグナノレ強度器字さ塚Ｄ／Ｐ（
染料／蛋白）（Ｍ′Ｍ）比が３０であるロダミンラベル
モルヒネ抗体〔ＲｉｇＧ（ｍ）〕の代りにＤ／Ｐが２２
であるＲｉｇＧ（ｍ）を用いて分析をくりかえした。

次表にモルヒネを用いた結果を示す。表町 モルヒネ（モ…濃度）シグナノレ強度農学さる次に行な
った実験ではポリリガンド、即ちモルヒネが牛血清アル
プミンに結合したもの（アルブミン当りのモルヒネ平均
数は４４）を用いた。

第１のテストでは、ポリリガンドは合成蛋白（複数のモ
ルヒネェピトープ部位を持つ）として用いた。第２のテ
ストではポリリガンドをモルヒネ又はコディンの分析で
用いた。これら分析において、どの発色体も対象物のェ
ピトープ部位に共有結合しておらず、抗体を介して結合
している。即ち、抗体はポリリガンド上でモルヒネにラ
ンダム結合している。対象物の各濃度において、受体−
消光体としての消光体と受体−蟹光体としての蟹光体と
の比が約５〜１であった場合最適消光が得られることが
発見された。第一のテスト〔ポリ（リガンド類似体）を
分析する〕では、各々、蟹光／抗体のＤ／Ｐ比が９であ
る６．４×１０‐９Ｍ（結合部位において）の抗モルヒ
ネとローダミン／抗体のＤ／Ｐ比が約２２である３．４
７×１０‐８Ｍ（結合部位において）の抗モルヒネとを
、１．２×１０‐６Ｍの牛ｙ−グロブリンを含み軸が８
．０の０．０９ Ｍホスフェート穣衡液に含めた。

様々な量のモルヒネ結合牛血清アルブミン（１アルブミ
ン当り約４４のモルヒネ）（０．０１２〜１．２舷夕）
を各チューブに加え（５〜１０ム〆）で最終量を０．５
の【とし、室温で３０分インキュベートした。ついで各
チューブの蟹光を測定し、可能な最大蟹光（ＢＳＡに結
合したモルヒネが存在しない時）に対する％として表現
した。結果を次表に示す。表 Ｗコディンの分析には次
の方法を用いた。

上で用いたのと同一の抗モルヒネーフルオレスセイン〔
ＦｉｇＧ（ｍ）〕と抗モルヒネーローダミン〔ＲＩｇＧ
（ｍ）〕とを用い、３０仏夕のＦｉｇＧ（ｍ）（２．６
４×０１０‐７Ｍ）と３０ムそのＲｉｇＧ（ｍ）（１．
４４×１０‐６Ｍ）とを一連のチューブ中で、１．５×
皿け牛ｙ−グロブリン（３９０〜４３０ｒそ）を含む０
．０８Ｍホスフェート緩衡液（ｐＨ８．０）で希釈した
。コディンを徐々に濃度を上げながら１１．５×１０‐
３〜１．５×１０‐６Ｍ）刀ｏょえ、室温で０．５時間
インキュベートした。ついで各チューブに前に使ったの
と同じ１０仏〆（０．２４仏夕）のモルヒネ−牛血清ア
ルブミン結合体を加え、更に１時間インキュベートした
。各チューフ内の最終量は０．５泌だった。各チューブ
の５１節肌０での蟹光を記録し、可能な最大蟹光（モル
ヒネ−斑Ａ結合体が存在しない時）に対する％で表わし
た。次表にその結果を示す。表 Ｖ コデイン（Ｍ） Ｆｍａｘに対する％３ｘ
ｌｏ‐６ １００次の２つの実
験では天然の蛋白である人間のｙ−グロブリンを使った
。

第一の実験では人間のｙーグロブリンを測定するために
Ｄ／Ｐが５．５の人間のｙーグロブリンーフルオレスセ
イン（ＦｈｌｇＧ）を用いた。

各、Ｄ／Ｐが１２〜１５である０．０１７の２／机上の
抗人間ｙ−グロブリンｍローダミン結合体〔ＲｉｇＧ（
ｈｌｇＧ）〕（１００山そ）を、ＢＳＭ（０．６の９／
の‘）を含むｐＨが８．０の０．０９Ｍホ，スフェート
穣衡液（３３０〜３８０一〆）に含む一連のチューブを
調製した。ついで人間ｙ−グロブリ〕／（１５〜３５仏
そ）を徐々に増量しながら加え、室温で３０サインキユ
べ−トした。ついで３０一その０．０１４の９／泌のＦ
ｈｌｇＧを加えた。各チューブ内の最終量は０．５の‘
だった。Ｆｈｌｇｏの最終濃度は５．４×ＩＣ「９Ｍで
あり、一方人間ｙ−グロブリン濃度は４．８４ｘ；１０
‐１０〜６４５×１０‐８Ｍだった。３０分２回目のイ
ンキュベートした後に各チューブの蟹光を５２九ので記
録し、可能な最大蟹光に対する％として表わした。

次表にその結果を示す。表の ｍｇＧ（Ｍ） ＦＭｘに対する％次の
測定では抗人間ｙーグロプリンーフルオレスセィン〔Ｆ
ｉｇ○（ｈｌｇＧ〕結合体と抗人間ｙ−グロプリンーロ
ーダミン結合体〔Ｒ鴇Ｇ（ｈｌｇＧ）〕とを用いて人間
ｙ−グロブリンを分析した。

フルオレスセイン結合体は４．３の、ローダミン結合体
は１０のＤ／Ｐを持っていた。すべての試薬は、０．６
の９′の‘の牛血清アルブミンを含みＰＨが８．０の０
．０９Ｍホスフェート穣衡液で希釈した。各４００仏〆
のこの緩衝液円含む一連のチューブを製造した。各チュ
ーブに３０ｒその２．７ムタ′の‘のＦＩｇＣ（ｈｌｇ
Ｇ）と３０山その３５山夕／机のＲｉｇＧ（ｈｌｇＧ）
とを加えた。混合し、人間ｙーグロブリンを徐々に増量
しながら４０一Ｚ溶液で加え、室温で１時間インキュべ
−トした。ついでチューブの蟹光を測定し、人間ｙーグ
ロブリンが存在しない場合の全蟹光に対する％として表
わした。次表にその結果を示す。表肌 人間の１ｇ（Ｍ） Ｆｍａｘに対する％
表肌から明らかな通り、人間のｙ−グロブリン濃度が増
すにつれて姿光は低下して最少になり、ついで上昇する
。

それゆえ、未知物の場合には２つの希釈物を用いて曲線
のいずれの部分（上昇側か下降側か）に該当するかを決
定する必要がある。上記結果は、本発明の分析法の極上
感度及び適用性の広さを示す。

蜜光一消光現象を用いることにより広範囲の様々な化合
物（ハプテン及び抗原）を直接に分析できる。試薬を用
いることができ、この場合ハプテン又は抗原が発色体に
共有結合しており、あるいは対象化合物は複数のヱピト
ープ部位を持ち、抗体混合物を、消光体に結合した抗体
の一部、及び蟹光体に結合した抗体の一部と共に用いる
ことができる。この場合、天然受体が入手でき又はリガ
ンドが抗原‘性であるならば試薬を製造するのにリガン
ドの誘導体は必要ない。加えて、中心分子に結合した複
数のハプテン分子又は抗原分子を持つ試薬を製造できる
。中心分子は発色体及び用いる抗体（蜜体−消光ベアの
残りに結合している）に結合でき、あるいは上述の抗体
混合物を用いる。分析は比較的急速であるが、濃度によ
りインキュベーション時間が異なる。更に、比較的安価
で読み取りが容易な通常の後光計を用いることができる
。本発暁は、理解を容易にするため例示、実施例を用い
て述べられてきたが、本発明の範囲内においてそれらの
変更・修正が可能であることは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ （Ａ） 水性緩衝液中のリガンドを、特異的非共有
   結合で結合可能な蛍光性リセプター複合物と混合し、（
   Ｂ） 前記混合液を、前記リセプター複合物を少なくと
   も一部が、存在するリガンドの少なくとも一部と結合す
   るに十分な時間インキユベートし、（Ｃ） インキユベ
   ートした溶液を、前記リセプター複合物が蛍光を生じる
   波長の光で照射し、そして（Ｄ） 前記リガンドの存在
   により影響される蛍光の量を測定し、既知量のリガンド
   の場合と比較する；ことよりなるリガンドの存在が予想
   される被測定溶液中のリガンドの検出又は測定方法にお
   いて、 少なくとも一つのエピトープ性部位を有する前
   記リガンドとともに、蛍光体（Ｃｈ＿１）および蛍光消
   光体（Ｃｕ）の対を形成する２種の発色体を用い、その
   際Ｃｈ＿１は前記リセプター複合物に共有結合させ、そ
   してＣｈ＿２は（ａ）前記リガンドに非共有結合的に結
   合しうる第二のリセプター複合物に共有結合させるか、
   あるいは（ｂ）リガンド類似体〔ここで、リガンド類似
   体とはその実質部分が前記リセプターの結合部位への結
   合をリガンドと競合しうるエピトープ性部位−又は二以
   上を規定する一価又は多価の基である〕に共有結合的に
   もしくは非共有結合的に結合させて用いることを特徴と
   する、リガンドの検出又は測定方法。