JPS60196196A - ペプチドの合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遊離のカルボキシ末端を有するペプチドの合
成法に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在することが相つ
いで知られ、治療１診断などの医薬品としての重要性並
びに呈味物質としての重要性がますます増大しつつある
。それに伴い、ペプチド合成法の開発も活発である。現
在までに知られているペプチド合成法の主なものとして
は１例えばファルマシア、レビュー、３号、　２４−４
７百（１９８０年）にまとめられているように、化学合
成法と酵素法の二つに大別することができる。その化学
合成法としては、アジド法、混合酸無水物法、活性エス
テル法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次的に縮合す
る方法とフラグメントで縮合させる方法などが代表的な
ものであるが、これらどの化学合成法においても、ラセ
ミ化及び副反応が起きやすく。

反応時間が長く、末端アミノ基を保護へにて反応前にあ
らかじめ保護しておく必要があるなど種々の問題がある
。フラグメント縮合法の場合、特にラセミ化が起こりや
すいという重大な欠点を有するものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法として。

プロテアーゼを用いる酵素法が提案されているが。

この方法においてもやはり９反応時間が長り、末端アミ
ノ基を保護基にて保護しておく１Ｉｌ−要があるなど操
作の煩雑さを改良するには至らなかった。

さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法では。

用いる酵素が本来ペプチド分解活性を有しているため、
住したペプチドが合成と併行して分解され。

しばしば目的のペプチドかえられないという重大な欠点
を示すものであった。特に、オリゴペプチドの合成に適
用した場合には、一部のアミノ酸が欠落した目的外のペ
プチドかえられる重大な欠点が指摘されている（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー誌、２５６
巻、　１３０１頁（１９８１年）。また、酵素法による
ペプチド合成法としては、プロテアーゼ法の他に、特定
なアミノ酸配列を有する１」（−ペプチドの合成のみを
司る特殊な酵素を用いる方法が知られている。この主の
酵素としては１例えばグルタミン酸／システィン／グリ
シンの配列であるトリペプチドを合成するグルタチオン
合成酵素（特開昭５４−１２２７９３号公報）やデカペ
プチドであるグラミジンＳを合成するグラミジンＳ合成
酵素（現代化学１９７４年１２月号１２つ）などが報告
されている。しかし、これらの酵素ば特殊な酵素であっ
て、この酵素によって合成しうるペプチドは、甲声され
た一種のみのペプチドであり、目的とする任意なペプチ
ドを合成することができない。このため２　この方法は
一般的なペプチド合成法とはなり得ないのが現状である
。

本発明者らは、ペプチドの有用性に濁み、上記のような
欠点、特にラセミ化、副反応の生起１反応の煩雑さなど
の原因となり、同時に経済性を損なう保護基の必要性を
解決し、汎用性のある新規なペプチド合成法を提供する
ことを目的として鋭意研究を重ねた結果、アミノ酸を核
酸の一種であるｔ　ＩＩＮＡに結合させる作用を有する
！！ｉｖ素で、従来全くペプチド結合を形成する作用が
知られていなかった、アミノアシル−ｔＲＮＲＮＡシン
テターゼくべきことに、ペプチド”合成能があることを
見いだし、この酵素を縮合剤として用いると、前記の目
的がすべて達成させることを見いだし、先に特許出潮し
た（特開昭５８−１４６５３９号公報参照。）。しかし
、この方法で、目的として遊ｇｕのカルボキシ末端を有
するペプチドの合成を試みる場合、ｐｉ１を７以下に維
持して反応を行うと、特に良好な収率で目的物を得るこ
とができない場合もあり、また。

最初からｐＨを７以上、特に８以上に維持して反応を行
うと９時に副反応が激しく起きるためか、生成物の単離
が困難な場合もあり、特にペプチド鎖が短い場合、その
傾向があり、有効な改良が望まれていた。

そこで２本発明者らは、上記の点を改良するために鋭意
研究を重ねた結果、まずｐＨ７未満の反応液を得２次い
で得られた反応液のｐＨを７以上に調整すると、良好な
収率で遊離のカルボキシ末端を有するペプチドが得られ
ることを見い出し２本発明を完成した。

すなわち１本発明は、アミノ酸とアミノ酸エステル又は
ペプチドエステルとから遊離のカルボキシ末端を有する
ペプチドを合成するに際し、まずアミノ酸とアミノ酸エ
ステル又はペプチドエステルとをアミノアシル−ｔ　Ｒ
ＮＡシンテターゼの存在下で反応させてｐＨ７未満の反
応液を得、ついで得られた反応液のｐｉを７以上に調整
することを特徴とする遊離のカルボキシ末端を有するペ
プチドの合成法である。

本発明に使用されるアミノアシル−ｔ　Ｒ１ｊΔシンテ
ターゼは、酵素分類６．１．１に属し９次式アミノ酸＋
ＡＴＰ＋ｔ　ｌ’１ＮＡ−アミノ７シルーｔ　ＲＮＡ　
十ＡＭＰ　＋ピロリン酸 の反応を触媒する酵素であり２例えばウサギ、ウマ、ウ
シ、ラット、ニワトリ、ヘビなどの動物組織より得られ
るもの、イネ、イモ、トマトなどの植物組織より得られ
るもの、カビ、酵母、キノコ。

細菌、放線菌などの微生物及び藻類より得られるものな
どがあげられる。なかでも、酵素の取得が容易であるこ
とから、微生物より得られるものが好ましく、さらに酵
素の安定性からバチルス・ステアロサーモフィルス、サ
ーマス・サーモフィルス、サーマス・フラバス、クロス
トリジウム・サーモアセチカム、サーマスアクアテイカ
スなどの耐熱性細菌より得られるアミノアシル−ｔｌｌ
ＮＡシンテターゼが最適である。

これらの各種アミノアシル−ｔ　ＲＮ八へンテタ−ゼは
、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダイノミルなど
で破砕したのち９例えばバイオケミストリー誌、１３巻
、　２３０７頁（１９７４年）に記載されているように
Ｉ）Ｆ　Ａ　Ｅ−セルロースカラムクロマトグラフィー
、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーなど
のクロマトグラフィー及び硫酸アンモニウムによる分別
沈殿法など通常の酵素精製法を用いて２精製することに
よって得ることができる。アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシ
ンテターゼは２種々のα−アミノ酸に特異性のあるもの
が用いられ。

例えばチロシンに特異性のあるものとしては、チロシル
−ｔ　ＲＮＡシンテターゼが、またロイシンに特異性の
あるものとしては、ロイシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ
が、さらにバリンに特異性のあるものとしては、ハリル
ーｔ　ＲＮＡシンテターゼ、その他イソロンル−ｔ　Ｒ
ＮＡシンテターゼ、フェニルアラ−）Ｌ／−ｔＲＮＲＮ
Ａシンテターゼラニル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、グル
クミル−ｔ　ＲＮＡ　シンテターゼ。

アスパラギニル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、メチオニル
−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、ヒスチジル−ｔ　ＲＮＡシ
ンテターゼ、リジル−ｔ　ＲＮＡ　シンテターゼ、トレ
オニル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ、セリル−ｔ　ＲＮＡ
シンテターゼなどが具体例としてあげられる。

本説明で好ましく用いられるアミノ酸としては。

例えばチロシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、
フェニルアラニン、メチオニン、リジン。

セリン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸。

グリシン、グルタミン、グルタミン酸、システィン、ト
レオニン、トリプトファン、ヒスチジン。

プロリン、アルギニンなどのα−アミノ酸があげられる
。

本発明に使用されるアミノ酸エステルの好ましいものと
しては５例えばグリシン、アラニン、ロイシン、イソロ
イシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、グルタミン
、イソロイシン、システィン、チロシン、アルギニン、
バリン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、メチオ
ニン、トリプトファン、トレオニンなどのα−アミノ酸
、β−アラニン、β−アミノイソ酪酸などのβ〜ルアミ
ノ、クレアチンなどの含窒素Ｔ−アミノ酸、ピペリジン
酸などのγ−アミノ酸、ε−アミノカプロン酸などのε
−アミノ酸などの各種アミノ酸のエステルがあげられる
。また、ペプチドエステルの好ましいものきしては２例
えば上記アミノ酸が異種又は同種の組み合わせで互いに
アミド縮合したペプチド類のエステルを用いることがで
きる。以後アミノ酸エステル又はペプチドエステルを総
称してエステル類という。このエステル類のエステル基
としては９例えば炭素数１〜１０個、好ましくは炭素数
１〜６個のアルコールから誘導されるものがあげられる
。このエステル基の具体例としては、メチル、エチル、
ｎ−プロピル、ｎ−ブチル。

ヘキシル、ドデシル、オクタデシル、シクロヘキシルが
あげられ、特にメチル、エチルが好適である。

本発明ではまずアミノ酸とエステル類とからアミノアシ
ル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼの作用によりペプチド化反
応を行って９１１７未満の反応液を得ることが必要であ
る。このためには、まずアミノ酸とエステル類との混合
物を得るか、あるいはエステル類とアミノアシル−ｔ　
ＲＮＡシンテターゼとの混合物を得ることが望まれる。

そのためには１例えば水又は緩衝液中アデノシン三リン
酸又はデオキシアデノシン三リン酸存在下に、アミノ酸
とエステル類とを混合するか、あるいは水又は緩衝液中
アデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リンｍ存
在下に、エステル類とアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテ
ターゼとを混合することによって行えばよい。このとき
に２次の反応を円？Ｐｔに進行させ、酵素の失活を防ぐ
ことを主目的として２反応系にマグネシウム、マンガン
などの二価カチオン、メルカプトエタノール、ジチオス
レイトールなどのスルフヒドリル化剤、ビロフォファタ
ーセを単独又は混合して添加してもよい。各添加剤の好
適な濃度としては、二価カチオン０．０１ｍＭ〜５００
ｍＭ、スルフヒドリル化剤０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ
、ピロホスファターゼ０．００１　：ｌ−ニット／ｍｌ
〜ｌｏｏ　ｊ−＝　ソト／ｍｌであり。

最適な濃度としては、それぞれ二価カチオン０．１”〜
１０＋ｎＭ、スルフヒドリル化剤０．０１ｍＭ−１ｍＭ
、ビロホスファクターゼ１ユニット／ｍ１〜１０ユニッ
ト／　ｍ　Ｉである。また、アミノ酸、アミノアシル−
ｔＲＮＡシンテターゼ及びアデノシン三リン酸又はデオ
キシアデノシン三リン酸の使用量は特に制限されないが
、実用的な収量を得るためには、アミノ酸とアミノアシ
ル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼのモル比ヲＩｎ”　：　１
〜１：１．アミノ酸とアデノシン三リン酸又はデオキシ
アデノシン三リン酸とのモル比１：１〜１：１００の範
囲内で行うのが好ましい。

さらに、エステル類の濃度としては、　１０ｍＭから１
０Ｈの範囲が適当であり、　１００ｍＭから２Ｍの範囲
が好ましい。また、これよりさらに低くしても用いるこ
とができる。

このときに用いる緩衝液としては、アミノ酸。

エステル類、アミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ及
びアデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸
が溶解し、しかも酵素活性を維持し、所望のｐＨが得ら
れるものであれば、いかなるものを使用してもよい。そ
のような具体例として５例えばトリス塩酸塩緩衝液、ヘ
ペス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、マレート緩
衝液、リン酸緩衝液などがあげられる。これら緩衝液に
親水性有機溶媒を加えた混合媒体も上記条件を満たしさ
えすれば、使用可能である。この親水性有機溶媒として
は、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのようなエー
テル、さらにジメチルスルホキシド。

ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトンなど
が好ましく用いられる。これら有機溶媒は。

それぞれ単独又は２種以上組み合わせて使用してもよい
。この時の混合液全体に占める有機溶媒の容量の濃度と
しては、０．５〜８５％、好ましくは５〜６０％、最適
には１０〜５０％の範囲である。

次に、上記で得られたアミノ酸とエステル類との混合物
とアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼとを混合し、
あるいは上記で得られたエステル類とアミノアシル−ｔ
　ＲＮＡシンテターゼとの混合物とアミノ酸とを混合し
、アミノ酸とエステル類とをアミノアシル−ｔ　ＲＮＡ
シンテターゼの存在下で反応させればよい。また、あら
がしめアミノ酸とアミノアシル−ｔ　ＲＮＡシンテター
ゼとをアデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リ
ン酸の存在下に反応させて１反応混合物を得、これにエ
ステル類を反応させればよい。このときの反応液のｐＨ
は７未満、好ましくは５〜６．８．最適には６〜６．８
の範囲である。反応温度としては、酵素活性を維持する
観点から一般に０℃〜７０℃、好ましくは１０℃〜５０
℃、最適には２０℃〜４０℃で行われる。

次に２本発明では上記で得た反応液のｐｕを７以上に上
げることが必要である。このためには１例えば水可溶性
の塩基を２反応液に攪拌下加えることによって達成でき
る。塩基の例としては、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタン、　Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリ
シン、イミダゾール。

炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、リン酸二ナトリ
ウム、リン酸二カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、水酸化リチウムなどのアルカリ又はアルカリ塩
、　２，４．６−コリジン緩衝液、トリエタノールアミ
ン緩衝液、ベロナール緩衝液、ジェタノールアミン緩衝
液、２−アミノ−２−メチル１．３−プロパンジオール
緩衝液、トリ、スヒドロキシメチルアミノメタン緩１ｓ
ｉ液、ホウ酸緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸緩衝液などの各
種の緩衝液があげられ、これらは単独又は混合して用い
られる。ここで１反応液のｐｎを７以上に保つ訳である
が、これにはｐｔ＋検出器で反応液を検出しながら、上
記塩基を少しづつ添加し、そのまま放置するのが良い。

反応装置としては２例えばｐｎ検出器と塩基を供給する
ポンプとを設けたものを用いることもできる。塩基の添
加量としては、所望するｐＨ値に依存して加減すればよ
い。好ましいｐＨ範囲はｐＨ７〜１１．さらに好ましく
はｐｔ１７〜１０゜最適にはｐＨ７〜９である。この範
囲で反応液はθ℃〜７０℃に保たれるが、酵素の活性を
維持する観点から好ましい１０℃〜６０℃、最適には２
０℃〜５０℃で行われる。放置する時間は通常１時間以
−ヒ２日間の間であるが、この範囲には限定されない。

本発明によって得られる遊離のカルボキシ末端を有する
ペプチドは１例えば血圧降下作用などのあるブラジキニ
ンや内・外分泌抑制作用などのあるソフトスタチンなど
の各種ホルモン及び抗生物質ペプチド、呈味ペプチドの
ような他の生物学的活性物質として有用である。

本発明によれば、上記有用ペプチドを保護基を用いるこ
となく、良好な収率で製造することができるので、製造
コストも安価である。

以下本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例Ｉ バチルス・ステアロサーモフィルスＵＫ７８８　（微工
研菌寄　第５１４１号）の菌体６ｋｇを２倍量の１００
１トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、ダイノ
ミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離により不溶物を除
去し、チロシンに特異的なチロシル−ｔＲＮＡシンテタ
ーゼを含む粗抽出液を得た。あらかじめ５’ｍＭメルカ
プトエタノール、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリ
ウム及び０．１ｍＭホスホフェニルスルホニルフルオリ
ドを含む５０ｆｆＭ　）リス緩衝液（ｐＨ７，５）で平
衡化したマードレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）
を充填したカラムに、上記の粗抽出液をとおし、塩化カ
リウムを上記緩衝液に加えた溶液で、線速度６０ｃｒｔ
＋　−ｈ″１で溶出せしめると、チロシル−ｔ　ＲＮ＾
シンテターゼが熔出した。

この区分を集め、濃縮、脱塩を行った結果、約７０％の
収率でチロシンに特異的なチロシル−ｔ　ＲＮＡシンテ
ターゼを含む粗酵素液を得た。上記操作をすべて４℃で
行った。

参考例２ サツカロミセス・セルビシアエα５２８８Ｃｌ０００　
ｋｇをダイノミルで細胞破砕後、得られた粗抽出液を硫
酸アンモニウム分画、　ＤＥＡＥ−セルロースクロマト
グラフィー、リン酸セルロース（ワットマン社Ｍ）クロ
マトグラフィー、　ＤＥＡＲ−セファセル（ファルマシ
ア社製）クロマトグラフィー、ウルトロゲルＡＣＡ３４
クロマトグラフィー及びＣＭ−セルロース（ワットマン
社製）クロマトグラフィーでロイシンに特異的なロイシ
ル−ｔ　ＲＮ＾シンテターゼを３．２ｇ得た。

参考例３ ウサギの肝臓１０００ｋｇをワーリングブレンダーで破
砕後、遠心（１５０００ｇ）　シ、その上清をさらに超
遠心（１０５，０００ｇ　）　して可溶製タンパク画分
を得これを硫酸アンモニろム分画セファデフクスＧ−２
００（ファルマシア社製）ゲルクロマトグラフィー、　
ＯＦ、ＡＥセファセルクロマトグラフィー及びハイドロ
キシアパタイトクロマトグラフィーでメチオニル−ｔ　
ＲＮＡシンテターゼを４．５ｇ得た。

参考例４ エシェリヒア・コリーに一１２株１５０に、から参考例
１と同一のカラム操作で、アスパラギン酸に特異的アス
パラチル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼを１．５ｇ得た。

参考例５ バチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡ　１５０３株
１００　ｋｇから参考例１と同一のカラム操作でアルギ
ニンに特異的なアルギニル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼを
１．１ｇ得た。

実施例１．比較例１．２ Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル８ｇを含む２０ｍ
Ｍビベス緩衝液＋　ｐｌ（７，ｏ＋　４５ｍ１に、塩化
マグネシウム０．１５ｇ、　アデノシン三リン酸二ナト
リウム０．３ｇ、Ｌ−チロシン１０ｍｇ、　ビロホスフ
ァクターセ（ヘーリンガー・マンハイム？、［）　２０
０ユニツト及びジチオスレイトール０．０１＋＋＋ｇを
加え、混合液の容量を５０＋ｎ　ｌに調整した。この混
合液のｐＨを６．８に維持した状態で、参考例１で得た
チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼｏ、ｅｍｇを加え、よ
く混合し１反応温度を３０℃に保って１日放置して反応
させてｐＨ６，８の反応液を得た。

次いで、この反応液にＩＮの水酸化ナトリウムを攪拌下
に加え、　ｐＨを８．７に調整し、３０℃で１日間反応
液を放置した後、ゾルパックスｏｎｓカラムに反応液を
供し、塩酸水溶液ｐＦ１５．０とアセトニトリルとの直
線濃度匂配により分離溶出し、Ｌ−チロシル−し−フェ
ニルアラニン塩酸塩１８ｍｇを得た。

その元素分析値（自ｅ　Ｈ２ＯＮｚ　０４　Ｃ１＝３６
３．８２）は計算値（％）　Ｃ＝５９．４２　Ｈ＝５．
５４Ｎミ７．７０　Ｃ１＝９．７４ 測定値（％）　Ｃ＝５９．１８　Ｈ＝５．３８Ｎ＝７．
９１　Ｃ１＝９．９ であった。

次に、比較（比較例１）のため、　ｐＨを６．８に維持
したままで、他は実施例１と同様にして反応を行ったと
ころ、目的のし一チロシルーし一フェニルアラニン塩酸
塩は根跡程度しか得られなかった。

また、比較（比較例２）のため、ｐＨを最初から８゜７
に維持したままで、他は実施例１と同様にして反応を行
ったところ５　Ｌ−チロシル−１７−フェニルアラニン
塩酸塩の収量は９ｆｆ１ｇであり、実施例１の半分であ
った。

実施例２〜４．比較例３〜８ Ｌ−アルギニン−メチルエステル９．５　ｇ　ヲ含ム５
０ｍＭ　ヘペス緩衝液、ｐＨ７，５、４５ｍ１に塩化マ
グネシウム１００ｍｇ、　アデノシン三リン酸二ナトリ
ウム２００ｍＢ、Ｌ−チロシン９ｍｇ、ピロホスファタ
ーゼ（ヘーリンガー・マンハイム社製）２００ユニツト
及びジチオスレイトール０．０１ｍｇを加え、混合液の
ｐＨを６，５に維持しながら容量を５０ｍ１に調整した
。この混合液に参考例１で得たチロシル−ｔ　ＲＮＡシ
ンテターゼ０．４　ｍｇを加え、よく混合して、　ｐＨ
６，５゜反応温度４０℃に保って、２時間反応させてｐ
ｌ＋　６．４５の反応液を得た。

次いで、この反応液に５００ｍＭのトリスヒドロキシメ
チルアミノメタン緩衝液を１０ｍ１攪拌下に加えｐＨ８
，８に調整し、４０℃で１日間引き続き攪拌した。

得られた反応液を実施例１と同様の方法で分離し。

Ｌ−チロシル−し−アルギニン塩＃、塩１７ＴＩＲを得
た。

その元素分析（Ｃ１５Ｈ２Ａ　Ｎ５０４　ＣＩ＝３８８
．８３）は計算値（％）Ｃ＝４６．３３　８　＝５．９
６Ｎ＝１８．０Ｉ　ＣＩ＝９．１２ 測定値（％）　Ｃ＝４６．５０　Ｈ−５，９３Ｎ＝１７
．８２　ＣＩ＝９．０ であったり 次に、Ｌ−アルギニン−メチルエステルの代わ１／ｌ　
ニＤ−アルギニンエチルエステル８．３ｇを加えて実施
例２と全く同様に反応を行った（実施例３）。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｄ−アルギニン塩酸塩を１６
ｍｇを得た。

さらに、実施測長のし一チロシンの代わりにＤ−チロシ
ンを用いて実施例２と全く同様に反応を行った（実施例
４）。

その結果、　Ｄ−チロシル−Ｌ−アルギニン塩酸塩＋６
．５ｍｇを得た。

なお、比較（比較例３．４．５）のため、　ｐＨを６．
５に維持したままで、他は実施例２．３．４とそれぞれ
同様にして反応を行ったところ、目的物の収量は表１に
示すとおりであった。また、比較（比較例６，７．８）
のため、　ｐｔ＋を最初から８．８に維持したままで、
他は実施例２，３．４とそれぞれ同様にして反応を行っ
たところ、目的物の収量は表１に示すとおりであった。

表１ 実施例５．比較例９，１０ Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル２ｇを含む３０ｍ
Ｍ　２．５−ジメチルイミダゾール緩衝ｔｉ、ｐＨ６，
（１１３ｍｌに塩化マグネシウム２０ｍｇ、アデノシン
三リン酸二ナトリウム５０ｍｇ、ピロホスファターゼ（
べ一リンガー・マンハイム社ｍ）　１０ユニツト、メル
カプトエタノール２０μｌ及び参考例２で得たロイシル
−ｔ　ＲＮＡシンテターゼ３Ｂを加え、混合液の−ｐｌ
＋を６．５に維持しながら容量を１５ｍ１に調整した。

これにＬ−ロイシン１ｍｇを加え、よく混合し１反応塩
度を２０℃に保って１０時間反応させてｐｌ＋６．５の
反応液を得た。

次いで、この反応液の温度を４０℃に上げ、同時にＩＮ
炭酸カリウム水溶液を加えζｐｌ＋を９．０に合わせて
２日放置した。

得られた反応混合物を実施例１と同様に分離し。

Ｌ−口イシル−１５−フェニルアラニン１Ｍｆｆ１１．
８ｍｇを得た。

その元素分析値（Ｃ１０Ｈ２２Ｎｘ　Ｏ３Ｃ１＝３１３
．８１）は計算値（％）　Ｃ＝５７．４Ｌ　Ｈ＝７．０
７Ｎ＝８．９３　ＣＩ＝１１．３０ 測定値（％）Ｃ＝５８．ＯＯ）（＝６．７３Ｎ＝９．０
Ｉ　ＣＩ＝１０．７ であった。

次に、比較（比較例９）のため、ｐＨを６．５に維持し
たままで、他は実施例５と同様にして反応を行ったとこ
ろ、Ｌ−ロイシン−し−フェニルアラニン塩酸塩の収量
は、約０．０１ｍｇであった。また。

比較（比較例１０）のため、　ｐｎを最初から９．０に
維持したままで、他は実施例５と同様にして反応を行っ
たところ、Ｌ−ロイシル−し−フェニルアラニン塩酸塩
の収量は、　０．７　ｍｇであった。

実施例６．比較例ＩＬ　１２ β−アラニンプロピルエステル５ｇを含む５０ｎ＋Ｍリ
ン酸緩衝液、　ｐＨ６，０，３５ｍ１　に塩化マグネシ
ウム１００　ｍｇ、Ｌ−メチオニン２ｍｇ、ピロホスフ
ァターゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）　１００ユ
ニツト、ジチオスレイトール０．０１ｍｇを加えて混合
液を得た。この混合液に参考例３で得たメチオニル−ｔ
ＲＮＡシンテターゼを１ｍｇを加え、混合液のｐＨを６
．０に維持しながら容量を４０ｍ１に調整し、これにデ
オキシアデノシン三リン酸二ナトリウム１００ｍｇを加
え＋　ｐＨ６，０に保ってｐｌ＋６．０の反応液を得。

この反応液を実施例５と同様に反応を行い２分離してＬ
−メチオニル−β−アラニン塩酸塩３ｍｇを得た。

その元素分析（ＣＩｌ　Ｎ２２　Ｎ２０２　、ＣＩ　Ｓ
　＝２８１．８２）は計算値（％）　Ｃ＝４６．８８　
Ｈ＝７．８７Ｎ＝９．９４　ＣＩ＝１２．５８ 測定値（％）　Ｃ＝４６．７１　Ｈ＝７．８８Ｎ＝１０
．０ＯＣ１＝１２．７ であった。

次に、比較（比較例１１）のため、　ｐＨを６．０に維
持したままで、他は実施例６と同様にして反応を行った
ところ、Ｌ−メチオニル−β−アラニン塩酸塩の収量は
、約０．０１ｍｇであった。また、比較（比較例１２）
のため、　ｐＨを最初から９．０に維持したままで、他
は実施例６と同様にして反応を行ったところ、Ｌ−メチ
オニル−β−アラニン塩酸塩の収９は、約０．８　ｍｇ
であった。

実施例７，８．比較例１３〜１６ し−フェニルアラニンエチルエステル８ｇを含む２０ｍ
Ｍピペス緩衝液、　ｐｌ＋　６．２．４５ｍ１に塩化マ
グネシウム１５０ｍｇ、アデノシン三リン酸二ナトリウ
ム３００　ｍｇ、Ｌ−アスパラギン酸２ｍｇ、ピロホス
ファターゼ（ヘーリンガー・マンハイム？［）　２００
ユニツト及びジチオスレイトールＯ，ＯＬｍｇを加え、
混合液をｐｌ＋　６．２．容ｉｔ５０ｍｌに調整した。

これに参考例４で得たアスパラチル−ｔ　ＲＮＡ　シン
テターゼ０．１ｍｇを加え、よく混合し、　ｐＨ６，２
，反応温度３０’ｃに保って１日静置反応させてｐＨ６
，２の反応液を得た。

この反応液を実施例１と同様に処理して、Ｌ−アスパラ
チル−Ｌ−フェニルアラニンＦ３塩ｓ、４ｍｇを得た。

次にＬ−アスパラギン酸の代わりにＩ７−アルギニンを
、アスパラチル−ｔＲＮ＾シンテターゼの代わりに参考
例５で得たアルギニル−１ＲＮＡ　シンテターゼを用い
て実施例７と全く同様に反応を行って、Ｌ−アルギニル
−フェニルアラニン塩酸塩ｓ、。

ｍ８を得た。

なお、比較（比較例１３．１４）のため、　ｐＨを６．
２に維持したままで、他は実施例７．８それぞれ同様に
して反応を行ったところ、目的物の収量は、実施例７．
８の約１／１００であった。また、比較（比較例１５．
１６）のため、ｐｌ（を最初から８．７に維持したまま
で、他は実施例７．８とそれぞれ同様にして反応を行っ
たところ、目的物の収量は、実施例７，８の約１７２で
あった。

代理人　児玉雄三

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１１アミノ酸とアミノ酸エステル又はペプチドエステ
   ルとから遊離のカルボキシ末端を有するペプチドを合成
   するに際し、まずアミノ酸とアミノ酸エステル又はペプ
   チドエステルとをアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ
   の存在下で反応させて１１１７未満の反応液を得２次い
   で得られた反応液のｐＨを７以上に調整することを特徴
   とする遊離のカルボキシ末端を有するペプチドの合成法
   。