JPS60196668A - 即時配位子検出分析法及びそれに用いる検出試験用キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｕ産業上の利用分野ノ 、ｔ・ 本発明は微ｍの有機物質の存在を検出覆る分析に関し、
特に放射性標識付分子か生化学的且つ特定的に分子構造
ど結合リ−る時に梵生り−る光エネルギーをモニターづ
る・ことににつて有機物質の存在を検出ザる分析法に関
づる。

（背狽技術１ 医療、研究及び工業分野において、抗原、抗体、ホルモ
ン、代謝基質、酵素、薬剤などのにうな微瓜の有機物質
の存在を検出りる必要がある。医療の分野にあっては血
清またはその他の体液中にＪ３りる代謝基質、ホルモン
などの右（幾買の存否を検出彩ることは、妊娠、感染、
血液異常、Ｉｌｌ炎など多くの疾病の診断に有用である
。有機質の検出及び定量分析は免役学的、生物学的、化
学的、その他の和学的及び医学的ｕ１究において必要な
場合が多い。工業分野では、化学物質製造における品質
管理や水質汚染のモニターに利用される。

有機物質検出のために開発された多くの化学的生物学的
分析法のうら、本発明と関連があるのは沈澱及び凝集分
ル１である。代表的な沈澱分析にあっては、石）幾物質
が反応体と相互作用して錯体を形成し、これが溶液中で
沈澱する。凝集分析にあっては問題の有機物質が不可溶
反応体と交差結合して反応体を凝集させる。凝集を測定
するには光学散乱法を利用するのが普通である。沈澱及
び凝集分析の欠点は放ｑ・１性標識免役検定法はど敏感
でないことにある。これらの分析法の感度を高めるため
の光学抜術が開発されているが、この技術には特殊な設
備や分析が必要である。

有機物質を検知する他の公知分析法として、有機物！１
またはこれに対Ｊる反応体を放射性、螢光性なとの１〜
レーザ物質で標識イ］りることにより、どの程度まで４
４機物質がその反応体と結合し−Ｃいるかを（１８認す
る方法かある。

放射性標識免疫検定法はこれらの“トレーシ″分析のう
ちで最も一般的なものの１つである。放射性標識免疫検
定法においては既知量の放射性標識付き有機物質を、検
知すべき未知■の標識なしの有機物質、及び前記標識付
き及び標識なし有機物質ど無差別に結合し゛（１１１体
を形成づる特定抗体（反応体）ど組み合わＵる。潜伏期
後、多くの場合前記錯体をポリエチレングリコールと共
に沈澱させ、活ｆ！Ｉ炭または固相試桑を利用して未結
合有機物質を吸収づることにより未結含有１幾物質を結
合有機物質から分離する。次いでこの２つの成分のいず
れか一方の放飼能を測定する。一定坦の標識付き及び標
識なし有機物質が反応体と結合し、結合する標識付き右
１幾物質の鑓は被分析１ナンブル中に存在する標識なし
有機物質の量に反比例ゴる。

放射性標識免疫検定法は、結合しＩζ有機物質を結合し
ていないものから分離するために多くの場合複雑且つコ
ストの大ぎい、時間のかかる操作を何回も繰返えさねば
ならないという欠点がある。

即ち、この分離処理には洗滌液による有機物質と抗体か
らなる錯体の洗滌及び／または反応体から非結合有機物
質を除去するための混合物遠心分離を繰返すことにより
、洗滌ごとに放射能廃物が発生する。分離処理が完了す
るまでにかなりなｍの放射性廃物が発生し、この廃物は
その処分にコストがかかるだりでなく、分離処理中し含
め（、この物質を取り扱う人の健ＩＪＪにとって危険で
もある。

螢光を利用する分析では有機物質を適当な螢光物質、例
えばイソチオシアン酸フルオレセインで４３Ｘ識イ」け
すればよい。螢光物質で標識付けされた有機物質がどの
程度まで特定反応体と結合しているかを、適当な光源及
び螢光を発生させる波長の入射光を提供するフィルタを
含む光顕微鏡で分析することができる。

具体的な螢光分析法の例は米国特許第４，１６１，５１
５号に開示されており、ここでは検出すべぎ未知の有機
化合物を１）有機化合物に対する既知量の抗体、２）抗
体に対して未知有機化合物と競合し、螢光物質が結合し
ている有機アナログ、及び３）螢光物質に対する抗体、
と混合づ−る。未知有機物質と既知アナログ・螢光物質
との間の競合は抗体の濃度を効果的に低下させ、これに
より、螢光物質・抗体の多くをアナログ・螢光物質と組
み合わせる。その結果、螢光物質の発生スペクトルに対
応の変化が現われる。

螢光物質及び放射性物質を利用するトレーサ分析は米国
時ｊ［第４，０００，２５２号に開示されており、既知
Φの放射性標識イ」ぎ抗原と、未知量の標識なし抗原を
含むサンプルとを免疫シンチレータ・［ル内に配置する
。抗原に対する抗体と化学的または物理的に連１ｓｓ−
ｉる不溶化または固形燐もセルに添加する。結合してい
ない抗原をセルから洗い落としてから、結合状態の標識
イ４き抗原からの放射エネルギーによる活性化で燐から
の発光量をシンデレージョン・カウンタ内で測定Ｊる。

セルから非結合抗体を除去するには数回に亘る洗滌が必
要であり、時間がかかるた（プでなく、多量の敢剣竹廃
棄物質を発生させることにもなる。

１〜レー１）分析を凝集分析と組み台わＵる分析法が米
国特許第４，１０８，９７２号及び第４，２７１，１３
９号にカイジされている。特許第４，１０８，９７２号
の場合、それぞれが螢光性トレーサ分析と、分析すべき
抗体または抗原に対する生物学的反応体とを含有する支
持微粒子を懸濁液に添加する。抗原または抗体を懸濁液
に添加すると、反応体コーティングと結合して支持粒子
を凝集させる。凝集した物質を、反復洗滌によって懸濁
液及びその他の成分から分離する。次いで、凝集物質を
溶かし、螢光法により分析して有（幾物質含右ｍをめる
。

特許第４，２７１．１３！１９１３の場合、抗原でコー
ティングしたトリグーラム原子含有（放射性）ラテック
ス粒子と、同じ抗原でコーティングしたポリスチレン発
光粒子とを未知量の対応抗体を含イ］するサンプルと共
に水性媒に添加する。抗原被覆発光粒子と結合するトリ
チウム原子含有抗原被覆ラテックス粒子の数は抗体の含
有濃度と関連性がある。また、２個の粒子が抗体を介し
て結合されると、トリチウム原子含有粒子からの放射エ
ネルギーが発光粒子内の発光を開始させる。適当な検知
手段によって発光量を測定するが、測定された発光レベ
ルが抗体含有ｍを表わす。未知量の非放射性抗原の添加
が抗体と結合している抗原被覆粒子と競合して粒子凝集
、発光及び信号を低下させる。この分析法の欠点として
、トリチウム原子含有ラテックス粒子もポリスチレン発
光粒子も抗原で被覆しな（）ればならず、このことがコ
ストを増大させ、分析を複雑にする。さらに、上記の標
１％的な放射性標識免疫検定法に比較して、分析を正し
く行なうために極めて多量の懸濁液を必要とづる。待シ
′１第４，２７１，１３９号の分析法ではまた、２種類
の支持粒子ど結合さＵるのに比較的純粋な抗原を使用し
なｔブればならない。比較的純粋な抗原リンプルはコス
トが商いだりでなく、人手が困難である。

そこで、本発明の主な目的は微量の有機物質の存在を検
知づるための、高精度、低コスト及び１″：。

速の分析方法及び検出試験用キラ１へを提供りることに
ある。

本発明の他の目的は同じ精度を維持しなから、しかも高
度の熟練も多大の時間も必要とせずに市販の設備を利用
して実施できる分析法を１１？供りることにある。

本発明の他の極めて重要な目的は４へく少量の放射性廃
棄物しか発生させず、危険物質の取扱いが最少限で−４
む分析法を提供することにある。

本発明の別の目的は多缶のサンプルを迅速に試験するの
に利用でさる分析法を提供することにある。

本発明の他の目的は懸濁媒どし゛（水を利用Ｊる分析法
を１（？供づることにある。

［発明の要約］ 上記及びその他の目的を本発明では被分析サンプル中に
存在する有機物質の口）と関連するレベルの光エネルギ
ーを発生する検出試験用キラ］〜及び分析法を提供する
ことによって達成する。光エネルギーは粒子またはその
他の構造を呈Ｊる支持体に組み込んだ螢光物質から発生
ずる。支持体は問題の有機物質または反応体と特定的に
結合することのできる配位子で被覆する。本発明を直接
分析法として応用Ｊ−る場合、反応体を成用性標識イ］
（プケる。次いでこの放ＧＦＩ性標識（＝Ｊき反応体を
含有するサンプルを水溶液中で支持体と混合して、反応
体を配位子と結合させる。その結果、放射性標識付き反
応体が支持体に充分接近することにより、放射性標識付
き反応体からの放射エネルギーが支持体に組み込まれて
いる螢光物質を活性化し、この螢光物質をして光エネル
ギーを放出させる。この光エネルギーのレベルは配位子
と結合りる反応体の■と関連し、この量は被分析リンプ
ル中に（ｒ存する反応体の但を表わ１゜ 本発明はり“ンブル中に含まれる反応体の■をめる競合
分析法どして利用Ｊることもできる。この場合には既知
けの反応体を放射性標識付りする。

彼方４ｈザンブル中の問題の反応体には標識付すしない
。標識付き反応体も標識なし反応体心配位子と特定的に
結合ひきる。分析に際しては標識イ１き及び標′Ｉｉ４
なし右は物質を、螢光物質を含浸させ配位子で被覆した
支持体と共に水溶液に添加づる。

配位子は標識イづき反応体とも標識なし反応体とも無差
別に結合りるから、反応体は水溶液中におりるそれぞれ
の相％Ｉ　Ｆｊｈ’ｔに比例して配位子と結合Ｊる。

ただし、配位子ど結合する敢０４性標識付き反応体だけ
が該反応体からの放射エネルギーによって支持体内に組
み込まれている螢光物質を活性化させる程度に支持体に
接近している。即ち、螢光物質から発生する光エネルギ
ーのレベルはサンプル中に存在する標識なし反応体の量
に反比例する。

直接分析でも競合分析でも、螢光物質を活性化すること
のできる放射性標識イ」ぎ反応体からの放射エネルギー
は水中での移動範囲に限界がある。

従って、配位子と結合しない反応体は支持体から達すぎ
るため、その反応体からの放射エネルギーを螢光物質ま
でとどかせることができない。即ち、実際に配位子ど結
合−ツる放射性栓識飼き反応体ｌとけが螢光物質を発光
させるのであるから、螢光物質によって放出される光エ
ネルギーを測定Ｊる前に配位子と結合していない放射性
＃１ｙｙ、識イ］ぎ反応体を配位子／反応体の錯体から
分離する必要はない。

従って、本発明では遠心分離、沈澱、洗滌などの方法に
よって結合１１１体から非結合標識（＝Ｊき反応体を分
離するという手間と時間のかかる操作を省くことができ
、このような分離処理から発生Ｍ°る多量の放射性廃棄
物質を回避することができる。

本発明の他の特徴として、支持体に螢光物質を組み込む
のに独自の方法を採用する。先ず支持体を、螢光物質の
ための、水と混和円面な溶剤中に浸漬して支持体を説水
処理する。次いで、螢光物質と溶剤から成る溶液に支持
体を添加して、支持体への螢光物質の組み込み及び／ま
たは吸収を達成りる。次に溶剤から支１こ体を取り出し
てから水溶液に移し、支持体内に螢光物質を沈澱させる
ことにより螢光物質を支持体内に固定覆る。この方法に
Ｊ：り螢光物質が支持体内部に組み込まれるから、支持
体の外部に位置する配位子と結合した時、放射性標識句
ぎ反応体は螢光体に極めて近い位置を占めることになる
。

「詳細な説明］ 本発明では粒子またはその他の横ｊΔを早する支持体ま
たは支１！Ｊ粒子に、放射エネルギーによって活性化さ
れると螢光を発り−ることのできる物質を含浸及σ／ま
たはコーティングづる。支持粒子を、該支持粒子に共有
結合または直接イｑ＠することにより問題の反応体と特
定的に結合重ることのできる配位子で被覆する。次いで
支持粒子を、放射性標識（ＣＩ　ＬＪされた反応体を含
有りる水性溶液に混入する。敢剣性標識イ４き反応体が
配位子と結合Ｊるど、支持粒子に組み込まれている螢光
物質が反応体に対して物理的に極めて接近した位置を占
め、その結果、反応体から放出される放射エネルギーが
螢光物質を活性化さけ、螢光物質をして光エネルギーを
放出させる。配位子が反応体と結合する程度を表わツこ
の光エネルギーのレベルはシンデレージョン・カウンタ
、または光電増イ８管を利用するその他のモニター装置
で測定覆ればよい。

放射性標識（＝ｊぎ反応体分子から放出される放射エネ
ルギーは水中にお１プる移動範囲を著しく制限される。

配位子ど結合していない反応体分子の大部分は配位子か
ら遠リーキ゛る位置にあるため、これらの非結合反応体
分子から放出される放射エネルギーが支持構造、即ら、
支持粒子中の螢光物質にまで到達できない。これらの非
結合反応体分子の放射エネルギーによって螢光物質が活
性化されるチャンスは極めて少ないから、配位子と結合
している反応体分子からの放射エネルギーで活性化され
た螢光物質によって放出される光エネルギーをシンデレ
ージョン・カウンタで測定づる前に、配位子と結合して
いない反応体分子を配位子／反応体の１１１体から弁頭
す−る必要はない。従って、非結合状態の反応体を配位
子／反応体の錯体から分離づるという手間のかかる、し
かも危険を伴なう従来の作業を省くことができる。

木光明は競合分析法ど（７１用りることもできる。

この場合、螢光物質を組み込まれ、適当な配位子で被覆
されている支持体を、既知量の放射性標識（ｑぎ反応体
と、未知量の、標識イ」すされていない同じ反応体を含
むサンプルとを含有りる水？８液に添加づる。配位子は
標識のあるなしにかかわらず無差別に反応体ど結合りる
から、配位子ど結合りる標１１　（’Ｉき反応体の量は
サンプル中に存在する標識なし反応体のｍに反比例する
。特定サンプルを分析づる前に、秤々の既知ｍの標識な
し反応体をそれぞれ個別の容器内で一定量の放射性標識
イ１き反応体及び一定県の配位子被覆粒子と温合りる。

配位子と結合した敢用性標識付き反応体からの螢光物質
活性化によって発生する螢光エネルギーのレベルを、既
知量の標識なし反応体を含有している各容器について測
定する。この測定の結果から、標識なし反応体含右績ど
対１１ｉ、１さＵて測定した螢光エネルギーのレベルを
画く標準曲線を作成づることができる。未知量の標識な
し反応体を含有する特定サンプルを分析覆る場合、放出
される螢光エネルギーのレベルを測定りれば、上記標準
曲線からサンプル中の標識なし反応体の濃度をめること
ができる。

上記直接分析の場合と同様に、競合分析の場合にも配位
子ど結合した放射性標識イ」き反応体分子だ４Ｊが支持
粒子に充分近い位置を占め、放射性標識イ＝Ｊき反応体
からの放射エネルギーをして粒子中の螢光物質を活性化
させることができる。従って、検知された螢光エネルギ
ー・レベルは実際に配位子と結合づ”る放射性標識付き
反応体の化率をそのまま反映することになる。従って、
支持粒子を洗滌したり、あるいは他のなんらかの方法で
非結合放射性標識付き反応体を配位子から除去する必要
はなく、容器中に分析成分のり゛べてを存在させたまま
で螢光１ネルギー・レベルを測定ずればよい。

また、分Ｍｉ完了までに要づる時間は被分析系の配６１
子・反応体結合反応速度によってのみ制限される。

上）ホのように、配位子は粒子のＪ、うな支持（ｒ４）
＾ど結合し、螢光物質がこの支持（１°１１造に組み込
まれている。支持粒子としてはポリアクリルアミド、ア
クリルアミド、アガロース、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリカーボネ−１〜、またはレフ１０一ス４Ｂ粒
子（ファーマシア・ファイン・ケミカルス、スエーデン
、ウプサラ市）などを利用覆ることができる。本発明は
その他の形状Ｊ、た（１種類の支持構造、例え−ばラテ
ックス粒子を利用しても実施することがＣき、要は配位
子分子が共有結合などの形で支持粒子に（＝Ｊ着し、螢
光物質が該粒子に組み込まれていればよい。

上記セファ０−ス４Ｂのような粒子は活性状態で市販さ
れている。特定の配位子と共有結合するように粒子には
例えば臭化シアンのような化合物が組み込まれている。

配位子を粒子と結合させる方法は粒子の種類と、使用さ
れる配位子に応じて異なる。例えば、臭化シアンで品性
化したセファ１］−２４８粒子の場合、黄色ブドウ球菌
プロティンＡまたは特定反応体に対する抗体を、前記プ
ロティンＡまたは抗体及び適当な緩衝剤を含む溶液に粒
子を浸漬り−ることによって該粒子と結合させることが
できる。次いで余剰のプロティンＡまたは抗体を洗い落
とし、プロティンＡまたは抗体が付着しＣいない粒子の
活性部位を適当なブＩ］ンキング剤、例えばグリシンに
よつ−（ブロックする。

これにより問題の反応体などが配位子とではなく粒子と
直接結合Ｊるのを防止する。配位子を粒子と結合する他
の方法として、カルボジイミド・カプラー、タンニン酸
、グルタルアルデヒド及びポリエチレングリコールを使
用づる方法がある。

上）本のように本発明では、粒子表面の配位子と結合し
て螢光物質を活性化する程麿まで放射性標識付き反応体
が螢光物質と接近すると光エネルギーを放出するように
、粒子内に螢光物質を組み込む。種々の螢光物質を利用
できるが、本発明のプロセスは水溶液中で起こるから、
螢光物質は分析中に粒子から分離しないためにし水に不
可溶でなｔノればならない。また、使用Ｊ”る螢光物−
貿は故副性標識イ」き反応体から放出される放射エネル
ギー線の特定波長によって高エネルギー状ｆ＆よで活性
化されねばならず、更に、シンチレーション・カウンタ
まｌこは光用イ８管利用の他の検知装置によつＣ検知さ
れる基底エネルギー状態に戻る際に充分な光エネルギー
を放出しなりればならない。β線またはオーツ１電子の
形態を取る放射エネルギーと（ＪＩ川用る際にこのよう
な条イ！１を満に１螢光物質の一例がジフェニルＡキリ
ーゾル（以後”　ｌ）　Ｐ　Ｏ”と呼称する）である。

本発明は支持構造、例えば粒子に螢光物質を組み込む新
規の方法をもｊ；？供りる。螢光物質は水に不可溶であ
るから、螢光物質を粒子に組み込むためには螢光物質が
溶りる適当な転送媒を使用゛りる必要がある。また、こ
の転送媒自体は水と混和可能でな４−Ｊればならない。

粒子に螢光物質を組み込む本発明の新規方法は水と混和
可能な適当な螢光物質転送媒に粒子を浸１Ｉｌｊ　”Ｊ
ることにより粒子を脱水処理りる工程を含む。

次いで、この粒子を螢光物質及び溶剤から成る溶液中に
放置する。溶液中の螢光物質は粒子中に吸収される。次
いで余剰の溶剤を捨て、水または緩衝含塩水を添加する
ことにより螢光物質を沈澱させ、粒子内部に吸収及び／
または一体化さμる。

粒子内に螢光物質を沈澱させることにより螢光物質を粒
子内に固定Ｊ−る。次に、粒子を洗滌して余剰の沈ＩＦ
２螢光物質を除去してから、粒子相互の４４名を防止Ｊ
−るツイーン２０（商品名：　Ｔ　ｗｅｅｎ２０　）の
ような洗剤と、先に使用したブロッキング溶液によって
ブロックされていないか、または配位子と結合していな
い粒子表面部位と結合りるゼラチンとを含有する溶液中
に再び粒子を分散させる。これにより粒子の無差別結合
傾向が軽減される。最後に、粒子面にバクテリアが繁殖
しないように、殺菌剤、例えばアジ化ナトリウムを塗布
すればよい。

出願人はもしＰＰＯを螢光物質どして使用する場合、転
送溶媒としてジメチル・スルホキシド（以下″’　Ｄ　
Ｍ　Ｓ　Ｏ”と呼称する）が好適であるとの所見を七Ｉ
た。１）ｌ）ＯはＤＭＳＯに可溶であり、ＤＭＳＯは水
と混和可能である。また、ＤＭＳＯは水溶液に添加され
た際に粒子内に沈澱するというＰＰＯの能力を妨げない
。

本発明の方法では放射性標識付４き反応体の使用が必要
である。この放射性標識付ぎ反応体は含有りる放射性ア
イソ１〜−プの崩壊による放射エネルギーを放出するこ
とを除けば生物学的にも化学的にも標識のない反応体と
全く同じものである。

反応体に放射性標識（＝ｉ　４Ｊ−６る方法は使用する
放射性アイソ１−−ブの種類に応じ−Ｃ異なる。例えば
、反応体分子を構成する原子の１つを対応の放射性アイ
ソトープと置き換えることによって標識イ］りを行なう
ことかできる。水素原子ならトリチウム＜３ｌ−１）と
置き換えればよく、炭素原子なら炭素−１４（”Ｃ）と
置き換えればよく、ストロンチウムならストロンチウム
−３８（３８Ｓｒ）と置き換えればよい。他の標識付り
方法では、反応体の原子を放射性アイソトープと置き換
えず、反応体分子にアイソトープを添加すればよい。広
く使用されているこの種の放射性アイソ１ヘーブとして
は、沃素−１２５（”’Ｉ　）　：鉄−５９（Ｆｅ）が
ある。生体またはその一部がプロティンを合成でさる場
合、この生体を適当な放射性標識（＝ｊき先駆物質、例
えばメヂオニン−３５（３５Ｓ）と共に培養して、生体
がその生成物中にアイソトープを組み込むようにするこ
とで標識イリ（）を行なうことができる。例えば抗原、
抗体、ホルモン、ホルモン・レセプタ、酵素、または酵
素助因子のような多くの反応体が放射性標識付きの形で
種々のメーカーから市販されている。

反応体に標識付（ブづ−るのに利用される放射性アイソ
１〜−ブは水中での移動範囲を著しく制限されるから、
配位子と結合する標識付き反応体からの故国エネルギー
だけが実際に螢光物質を活性化する。螢光物質としてＰ
ＰＯを使用する場合、β線を放出するか、またはγ線か
らのオージェ電子を放出するアイソトープがこの条件を
満たずとの所見を得た。Ｐ　Ｉ）　Ｏはβ線ヤオージエ
電子よりも長い移動範囲を右りるγ線そのものでは螢光
を光しない。

本発明の分析法を特定的に結合し、配位子に対する特異
性に影響を与えずに反応体を放射性標識付すすることの
でさる任意の配位子・反応体組み合わせまたは系と（Ｊ
ｆ用りることができる。このような配位子・反応体組み
合わせの例として、抗体及びこれど対応する抗原がある
。抗体または抗原を粒子などのような支持構造に１４着
させることにより配位子として作用させる一方、対応の
抗原または抗体を反応体どして作用さければにい。プロ
ティンＡと対応の免疫グロブリンとから配位子・反応体
組み合わせ系を構成することもできる。多くの医療及び
ωＩ究作業にＪＪいて、特に疾病及びアレルギーの検出
及び免疫系の検査において、抗１５１ｊ、抗体及び免疫
グロブリンの存在を確認覆る必要がある。

本発明と１３１用するのに特に有用な配位子・反応体組
み合わせ系としては、ばかに１〉レクチン／グリ」プロ
ティン、２）ビオチン／アビジン、３）ホルモン・レセ
プタ／ホルモン、４）酵素／基質または助因子、５）Ｒ
ＮＡ／Ｉ）ＮＡ、及び６）　ＤＮＡ／ＤＮＡかある。な
お、本発明ではどろらの要素も配位子どして、あるいは
反応体どして作用できる。

本発明は酵素運動の（σ１究にも特に有用である。

酵素は放射性標識イー」き反応体ど結合する配位子とし
て作用りることができる。分析系のすべての試薬は常に
同一容器中に一緒に存在し、これらの試薬は有機溶剤中
にではなく水性緩街液中に分散しているから、異なる時
間インターバルで同じ容器から放出される光エネルギー
を測定して試薬の反応速度をめるだけで運動実験を行な
うことができる。また、ＲＮ　Ａ　−Ｄ　ＮＡ系では、
広く採用されているノーザン、サウザン及びウェスタン
・ブロード試験の代りに本発明の分析を採用する方か有
利である。

以下に、本発明の実施例を示す。

実施例■ 免疫グ［二１プリン−Ｇの存在を検知す′るために本発
明の分析を利用り−るには、（スエーデン、ラブ」ナラ
市の〕ｉ）−マシア・ファイン・ケミカルス゛から得ら
れた）臭化シアン活性化せ７７０一ス４Ｂ粒子を黄色ブ
ドウ球菌カラアン菌株１プロティンＡ（ファーマシア・
ファイン・ケミカルズ、ス工−デン、ウブリ−ラ市）ま
たは抗免疫グロブリン−Ｇ抗体で共有結合的に被覆する
。この被覆処理は臭化シアン活性化セファロース／ｌ　
ｆ３１　Ｕを塩酸１ミリモルでｔ潤さぜ、且つ洗滌する
ことによって達成り゛る。次いで、プロティンＡ２ｍＱ
または人体の免疫グロブリン−Ｇ重鎮に対づるラヒッ１
へ岱疫血清の免疫グロブリン−０分１５　ｍｇから成る
汁液中に洗滌された粒子２ｍ９．を、０．５モルの食塩
を含有ＪるＩ）ｌ−１８，３の重炭酸ナトリウム緩衝液
と共に混入する。この懸濁液を空温で２時間放置してか
ら、遠心分離により余剰プロティンを洗い去る。次いで
粒子面の残りの活性部位を０．２モルのグリシンでブロ
ックする。粒子をｈＹ酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液で
洗滌する。

次に粒子に螢光物質１−）　ｌ）　０を組み込む。組み
込み処理のため、被覆粒子を１５分間に亘ってＤＭＳＯ
に浸漬して脱水づる。ＰＰＯは水に不可溶であるから、
粒子中に水分が残っているとこれが１〕１〕Ｏの沈澱を
早めるからである。この段階を更に２回繰り返えしてか
ら、沈降によって余剰溶剤を除去づる。次いで粒子を、
重量／容積比２０〜４０％で１）ＭＳＯにｌ）　Ｐ　Ｏ
を溶かした溶液中に室温で３０分間／ｉｈ　首する。３
０分間後、余剰溶液を廃棄し、１０容積の燐酸塩緩衝食
塩水（以下゛Ｐ　Ｂ　Ｓ　”と呼称）または水を添加づ
ることにより粒子中にＰＰＯを沈澱させる。次に懸濁液
をＰＢＳ中で５回洗滌して、粒子中に組み込まれていな
い余剰の沈澱ＰＰＯを除去Ｊる。次いで、粒子相互の付
着を防止１゛る洗剤としての０．５容積／容積％のツイ
ーン２０、及びプロティンＡ、免疫グロブリン−Ｇ抗体
またはグリシンとの反応によりブロックされなかった粒
子面の残り部位と結合するだめのゼラチンを補給して最
終１旧度が１０容積／容偵％どイ【るように粒子を再び
Ｐ　［３Ｓ中に分散さＵ゛る。これにより、放射性標識
ｆ」ぎ反応体が粒子と無差別に結合゛づる傾向が（へ力
１１′ｉ減される。最後に、アジ化ナトリウムＮａ　Ｎ
３　０．０１　ａｍ／容槓％を添加ずればバクテリフッ
増＋ｒを防１にすることができる。

免疫グロブリン−Ｇの直接分析にＪ３いては、５０μ２
のプロディンＡまたは抗免疫グロブリン−Ｇ抗体で被覆
した粒子を、　Ｉ」−無水酢酸でミリモル当たりＩＵ分
５Ｘ１０１２カウントの比放射能に標識（＝Ｉ　ｔ］さ
れた種々の８′：Ｊ度の免疫グ１−１プリン＝Ｇどシン
デレージョン容器内で混合りる。０．５容積／容積％の
ツイーン２０を補充されたｌ）　［３Ｓを容器に添加し
て各容器内の総容積を３．ＯｍＱにする。次いて、ｔＪ
文ＱＪ性４２識イ・Ｊき免疫グロブリン−Ｇからのβ線
によるＰＰＯの活性化で発生する光エネルギーをシンチ
レーション・カウンタによって直接測定する。プロ゛ア
インＡで被覆された粒子を利用した分析の結果は表Ｉに
示すように、ザンブル中におけるトリチウム栓識イ」き
免疫グロブリン−Ｇの濃度を増大さＶれば句会のカラン
１〜が増大することを示づ。プロティンまたは抗免疫グ
１」プリン−Ｇ抗体で被覆されていないＰＰＯ含浸含浸
セファロース４予 使用した。

表　Ｉ Ｘ濃ＭＪ　Ｉｆ の直接分析 プロティンＡまたは抗免疫グロブリン−Ｇ抗体で被覆し
た粒子を、クロルアミン法によってミリモル当たり毎分
８ｘ１０４　カウントの比放射能まで１２５１で標識例
すした種々の濃度の人体免疫グロブリン−Ｇど混合した
ことを除（プばこの実施例は実施例■と同じである。プ
ロティンＡまたは抗免疫グロブリン−Ｇ抗体で被覆した
粒子を種々の濃度の１２５Ｉ標識（ｑき人体免疫グープ
リン−Ｇと共にシンチレーション容器に注入し、これら
の容器をシンデレージョン・カウンタ内にそのまま配置
して光子放出レベルを測定しＩこ。この試験の結果を５
分間及び６０分間のコンディショニング時間に関して表
Ｈに示した。このデータから明らかなように、標識（ｑ
き反応体をＰＰＯ含没配位子結合粒子と混合した直後に
分析値を測定覆ることができる。

表　ＩＩ 実施例ＩＩＩ 免疫グロブリン−Ｇの競合分析 臭化シアン活性化ゼノノ・ロース４Ｂ粒子（ファーマシ
ア・ファイン・グミカルズ、スエーデン。

ウブリ〜う市）をプロティンＡ（グル１　ｍＱにつき０
．１　ｍｇ　）または抗免疫グロブリン−Ｇ抗体くゲル
１　ｍＱにつぎ１．５　ｍｇ　）で実施例■に述べた態
様で被覆する。また、実施例Ｉに）小べた態様でセフｊ
／ロース４Ｂ粒子に螢光物質Ｉ）　Ｐ　Ｏを含浸ざＵる
。こうして調製した粒子５０μｐ２をシンデレージョン
容器中で０．５μｇの１２５■標識イ」き人体免疫グロ
ブリン−Ｇ、及び順次＋８ｉ度を高めた標識なし人体免
疫グロブリン−Ｇと混合り゛る３１次いで、０．５容積
／容積％のツイーン２０を補充されたＰＢＳを添加する
ことによってり”ンブルをそれぞれ３ｍＱにする。次い
で直ちにサンプルの光子放出レベルをカウントする。

光子放出レベル測定値から、種々のΦの標識なし免疫グ
ロブリン−Ｇによる放射性標識イ」き免疫グロブリン−
Ｇの結合抑制％を表わす標識抑制曲線を作成した。抗免
疫グＵプリンーＧ抗体及びプロティンＡを共に配位子と
して利用−リ−る抑制曲線を第１図にポリ−０未知帛の
免疫グロブリン−Ｇを含有りるリンプルを放射性標識イ
１き反応体の抑制％について測定し、この測定値から第
１図を利用して免疫グロブリン−Ｇ含有量をめることが
できる。

実施例ＩＶ サイロキシン測定 この実施例ではり”イロキシン検出用の標準抑制曲線を
作用りるために本発明を利用りる。臭化シアン活性化セ
フ１０−ス４１３粒子をプロティン△で被覆し、次いＣ
実施例Ｉで）本べたようにＰ　Ｐ　Ｏを含浸さＵた。こ
うして調製した粒子２００μ区を〈イリノイ州、ジノＪ
ゴ市、アボット・ラボラトリーズから１！１７られる）
４００μＱのラビット抗ザイ［」キシン免疫血清と共に
個々のシンデレージョン容器に注入した。（イリノイ州
、シカゴ市、アホッ１〜・ラボラ１へリーズから得られ
る）それぞれ深度の異なる２５μＣの標識なしサイロキ
シンを各容器に添加した。次に（イリノイ州、シカゴ山
、アボッ１へ・ラボラ１−リースから１Ｌ１られる）ア
イソトープ沃素−１２５で標識付（プされた１００μＣ
のザイ【」キシンを容器に添加しｌζ。最後に、０．５
容積／容槓％ツイーン２０を補充されｋ　Ｐ　１３　Ｓ
を添加することにより各容器中の反応Ｊλ合物を容積を
３ｍ９．とじた。次いで各容器にｔＩ３りる光子数１］
ルベルをシンデレージョン・カウンタ内で１ｌｌｌｊ定
し、その結果を確率一対数形式で第２図に示した。第２
図から明らかなように、容器に添加される標識なしサイ
ロキシンの容積が増入りるに従って、粒子と結合する標
識イ」ぎサイロキシンの比率が予想通り低下した。この
標準抑制曲線は粒子どの結合を阻止される放射性標識イ
」きサイロキシンの％をめるための実施例Ｉｎで述べた
プロトコルと同じプロトコルを利用することによって未
知リンプル中に存在するサイロキシンの聞をめるのに利
用できる。この値から、リンプル中に存在するサイロキ
シンの量を曲線から読み取ることができる。

本発明の分野の当業者には明らかなように、本発明はそ
の趣旨または本質的特徴を逸ｎ；２シない範囲で上記実
施例とは異なる形式で実施することが可能である。従っ
て」二連した即時配位子検出分析法の具体的実施例はす
べての点で説明のためのものであり、本発明を制限覆る
ものではない。本発明の範囲は以上に説明した即時配位
子検出法の実施例に制限されず、特許請求の範囲の欄で
規定した通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗免疫グロブリン−Ｇ抗体及びプロティンＡを
ハに配位子どして使用する抑制曲線、第２図はリイ１」
キシン測定にＪ３ける光子放出レベルの測定結果を確率
一対数形式で示Ｊグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）螢光物質を含浸し、配位子が結合している複
   数の支持粒子を水性懸濁液に混入し、ｂ）特定的に前記
   配位子と生化学結合でき且つ前記螢光物質を活性化する
   放出エネルギーを放出する敢剣性標識（＝Ｊき反応体を
   前記懸濁液に添加し、該反応体からの放ｑ」エネルギー
   が前記螢光物質を活性化して光エネルギーを発生させる
   ように、該反応体が前記支持粒子に充分接近し、一方、
   前記配位子に結合しない前記反応体は支持粒子から遠く
   離れているためその放射エネルギーが螢光物質を活性化
   できないようにし、 Ｃ）水性懸濁液中の前記支持粒子及び前記放射性標識付
   ぎ反応体の総量と共に螢光物質によって放出される光エ
   ネルギーを測定する段階から成ることを特徴とりる即時
   配位子検出分析法。 （２）前記螢光物質が非水溶性である特許請求の範囲第
   （１）項に記載の方法。 （３）前記螢光物質がジフェニルオキサシルである特許
   ′［請求の範囲第（２）項に記載の方法。 （４）ａ’）水と混和可能な溶剤中に前記螢光物質を溶
   かし、 ｂ）この溶液が浸透できる支持粒子を該溶液に添加し、 Ｃ）該溶液から支持粒子を取り出し、 ｄ）該支持粒子を水にさらり−ことにより含浸した状態
   で螢光物質を沈澱ざゼる ことにより支持粒子に螢光物質を含浸させる段階をも含
   む待；′［請求の範囲第（２）項に記載の方法。 （５）前記螢光物質がジフェニルオキサシルである特許
   請求の範囲第（４）項に記載の方法。 （６）　前記溶剤がジメチル・スルホキシドである特許
   請求の範囲第（５）項に記載の方法。 （７）　前記支持粒子を、前記溶液に添加する前に前記
   溶剤中に浸漬することにより脱水する段階をも含む特許
   請求の範囲第（′Ｉ）項に記載の方法。 （８）前記反応体が、β線またはＡ−シ１電子を生成さ
   せる放射性物質で敢用性＋Ｕｊ識付すされたものである
   特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。 （９）　前記配位子が抗原または抗体であり、前記反応
   体がこれに対応する生化学的に結合り−る抗体または抗
   原で必る持ｙｒ（請求の範囲第（１）項に記載の方法。 （１０）　前記配位子がレクチンまたはグリ」プロティ
   ンであり、前記反応体かこれど対応するグリコプロティ
   ンまたはレクチンである特許請求の範囲第（１）頂に記
   載の方法。 （１１）　前記配位子がプロティンＡまたはこれど結合
   可能な免疫グロブリンであり、前記反応体がそれぞれ免
   疫グロブリンまたはプロティンΔである特許請求の範囲
   第（１）項に記載の方法。 （１２１前記配位子がＲＮＡまたはＤＮＡであり、前記
   反応体がＤＮＡまたはＲＮＡである特許請求の範［ＩＪ
   ｌ第（１）項に記載の方法。 （１３）　前記配位子が第１形態のＤＮＡであり、前記
   反応体が第２形態のＤ　ＮＡである特許請求の範囲第（
   １）項に記載の方法。 （稙）　前記配位子がビオチン、イｊ機化合物と複合し
   たビオチン、またはアビジンであり、前記反応体かそれ
   ぞれアじジン、有機化合物と複合したビオチン、または
   ビオチンであるＱ：ｒ　ｎ’ｌ請求の範囲第（８）項に
   記載の方法、。 （１５）　前記配位子かホルモンまたはホルモン・レレ
   プタであり、前記反応体がそれぞれホルモン・レセプタ
   またはホルモンである１、：′Ｊ許請求の範囲第（１ン
   項に記載の方法。 り１６）　前記配位子が酵素またはり買であり、前記反
   応体がそれぞれ基質または酵素である特許請求の範囲第
   （１）項に記載の方法。 ０７′）ａ＞■未知量の放射能のない配位子反応体を含
   有する被分析サンプルと、 ■既知量の放則性標識付き配位子反応 体と、 ■前記放射性標識付さ配位子から放出 される放射エネルギーによって活性化されると光子を放
   出づ−ることができる螢光物質を含み、前記放射能のな
   い配位子反応体とも前記放用性標識付き配位子反応とも
   無差別に結合できる配位子が外表面に存在する複数の支
   持粒子であって、前記配位子が前記ＩＪＩＩＱＪ性椋識
   角き配位子反応体ど結合Ｊると該放射性標識イ］き配位
   子反応体が前記螢光物質を活性化して水性媒中に光子を
   放出さけるに充分な程度支持粒子に接近覆るのに反して
   、結合しない／１５！川性標識イ・」さ配位子反応体か
   前記支持粒子から放出される放射エネルギーが前記螢光
   物質を活性化できない程度に前記支持粒子から遠く離れ
   るようにした支持粒子と の上記■■■を水性媒中において組み合せる段階と、 ｂ）水性媒中にａ３いて組み合わされた、被分析サンプ
   ルに含まれる放射能のない配位子反応体、放射性標識イ
   」き配位子反応体及び支持粒子の総量と共に、螢光物質
   によって放出される光子を測定づる段階と から成ることを特徴どする競合即時配位子検出分析法。 ０の　前記螢光物質が非水溶性である特許請求の範囲第
   （＋７）項に記載の方法。 θ９）　前記螢光物質がジフェニルオキザゾルを含む特
   許請求の範囲第（１７）項、に記載の方法。 （２Φ　ａ）水と混和ｉ＋Ｊ能な溶剤中に前記螢光物質
   を溶かし、 ｂ）この溶液が浸透できる支持粒子を該溶液に添加し、 Ｃ）該溶液から支持粒子を取り出し、 ｄ）該支持粒子を水にさらずことにより支持粒子と一体
   化された状態で螢光物質を沈澱させる ことにより螢光物質を支持粒子と一体化づる段階をも含
   む特許請求の範囲第（１０項に記載の方法。 （２１）前記螢光物質がジフェニルオキザゾルを含む特
   許請求の範囲第Ｑの項に記載の方法。 （２２〉前記溶剤がジメチル・スルホキシドを含む特許
   請求の範囲第（２１）項に記載の方法。 （２３）前記支持粒子を、前記溶液に添加する前に前記
   溶剤中に浸漬することにより支持粒子をＩｌｌ水する段
   階をも含む特許請求の範囲第Ｑｆｆ１項に記載の方法。 （２４）前記放射性標識（ｑき配位子反応体がβ線を放
   出するかまたはオーツ１電子を生成りる特許請求の範囲
   第（１７）項に記載の方法。 （２５）前記配位子反応体が抗体または抗原であり、前
   記配位子が生化学的に結合されＩＣ抗体または抗原Ｃあ
   る特許請求の範囲第（１７）項に記載の方法。 （２６）前記配位子反応体がプロディンＡまたはこれと
   結合可能な免疫グロブリンであり、前記配位子がそれぞ
   れ免疫グロブリンまたはプロティンＡである特許請求の
   範囲第（１７）項に記載の方法。 （２７）前記配位子反応体がレクチンまたはグリコプロ
   ティンであり、前記配位子がこれと対応するグリコプロ
   ティンまたはレクチンである特ｚ′１請求の範囲第り１
   ７）項に記載の方法。 （２８）前記配位子反応体かＲＮ　Ａまたはｌ）　Ｎ　
   Ａであり、前記配位子がこれと対応するＤＮＡまたはＲ
   ＮＡである特許請求の範囲第θ力項に記載の方法。 （２９）前記配位子反応体が第１形態のＤＮＡであり、
   前記配位子が第２形態のＤ’ＮＡである特許請求の範囲
   第０７）項に記載の方法。 （３０）前記配位子反応体がビオチン、有機化合物と枚
   合したビオチン、またはアビジンであり、前記配位子が
   これと対応するアビジン、有機化合物と複合したビオチ
   ン、またはビオチンである特許請求の範囲第（１７）項
   に記載の方法。 （３１）前記配位子反応体がホルモンまたはホルモン・
   レセプタであり、前記配位子がこれに対応づるｉｊ−ホ
   ルモン・レセプタまｌこはホルモンである特許請求の範
   囲第（１力項に記載の方法。 （３２）前記配位子が酵素または基質であり、前記配位
   子反応体がこれと対応づる基質または酵素である特許請
   求の範ｒｕｔ第０７）項に記載の方法。 （３３）水性媒中で生化学的且つ特定的に配位子と結合
   する反応体を検出するための、構成成分のずべてか水性
   媒中で一つに組み合わされる試験用キットであって、 該検出試験用キットが ａ）螢光物質が組み込まれ、配位子が付着している所定
   ■の支持粒子と、 ｂ）前記配位子に対して前記反応体とほぼ同じ特異性を
   右りる所定ｍの放＋１Ｊ　ｆ１標識イ」き配位子反応体
   とから成り、 前記放射性４ｑ識（ｑき配位子反応体が、前記配位子と
   結合りると、水性媒中に存在する前記放射性標識付き配
   位子反応体と前記反応体との比に対応するレベルで前記
   放射性標識ｆ」ざ配位子反応体から水性媒を通して伝達
   される放射エネルギーにより螢光物質を活性化する程度
   まで螢光物質に接近し、前記配位子と結合しな（〕れば
   螢光物質から速すぎるため螢光物質を活性化層るレベル
   には達しないこと を特徴とづる検出試験用キット。 （３４〉前記螢光物質が非水溶性である特許請求の範囲
   第（３３）項に記載の検出試験用キット。 （３５）前記螢光物質がジメチル・スルホキシドを含む
   特許請求の範囲第（３４）項に記載の検出試験用キット
   。 （３６）前記螢光物質が、 ａ）水と混和可能な溶剤中に前記螢光物質を溶かし、 ｂ）この溶液が浸透できる支持粒子を該溶液に添加し、 Ｃ）該溶液から支持粒子を取り出し、 ｄ〉該支持粒子を水にさらして螢光物質を沈澱させる ことにより支持粒子を組み込んだものである特許請求の
   範囲第（３４）項に記載の検出試験用キット。 （３７）前記螢光物質がシフ」、ニルオキサゾルを含む
   特許請求の範囲第（３６）項に記載の検出試験用キラｌ
   〜。 （３８）前記溶剤がジメチル・スルホキシドである特許
   請求の範囲第（３１）項に記載の検出試験用キット。 （３９）前記支持粒子を、前記溶液に添加する前に前記
   溶剤に浸漬することにより脱水する特許請求の範囲第（
   ３６）項に記載の検出試験用キット。 （４０）前記放射性標識付き配位子反応体がβ線を放出
   するかまたはＡ−ジエ電子を生成する特許請求の範囲第
   （３３）項に記載の検出試験用キット。 （４１）前記配位子が抗原または抗体であり、前記放射
   性標識付」き配位子反応体がそれぞれ抗体または抗原で
   ある１５訂請求の範１ｌｌｌ第（３３）項に記載の検出
   試験用キット。 （４２）前記配位子が免疫グロブリンまたはプロティン
   八であり、＋ｆＱ記敢川性用識（ｑき配位子反応体がそ
   れぞれプロディンＡまたは免疫グロブリンである時晶′
   ［請求の範囲第（３３）項に記載の検出試験用キラ１〜
   。 （４３）前記配位子がレクチンまたはグリコブ１」ティ
   ンであり、前記放射性標識付ぎ配位子反応体がそれぞれ
   グリ」プロティンまＩこはレクチンである特許請求の範
   囲第（３３）項に記載の検出試験用キット。 （４４）前記配位子がＤＮＡまたはＲＮΔであり、前記
   放射性標識イ」き配位子反応体がそれぞれＲＮＡまたは
   ＤＮＡである特許請求の範囲第（３３）項に記載の検出
   試験用キット。 （４５）前記配位子が第１形態のＤＮＡであり、前記放
   射性標識（ｑき反応体が他の形態のＤＮＡである特５′
   Ｆ請求の範囲第（３３）Ｊｒ４に記載の検出試験用キラ
   １〜。 ＜４Ｇ）’＋”ｒｕ記配位子がビオチン、有機化合物と
   複合したビオチン、またはアビジンであり、前記放射性
   標識付き配位子反応体がそれぞれアビジン、−有機化合
   物と複合したビオチン、またはビオチンである特許請求
   の範囲第（３３）項に記載の検出試験用キラｊ−０ （４７）前記配位子がポル−［ンまたはホルモン・レセ
   プタであり、前記放射性標識イ」き配位子反応体がそれ
   ぞれホルモン・レセプタまたはホルモンである特許請求
   の範囲第（３３）項に記載の検出試験用キット。 （４８）前記配位子が酵素または基質であり、前記放射
   性標識付ぎ配位子反応体がそれぞれ基質または酵素であ
   る特許請求の範囲第（３３）項に記載の検出試験用キッ
   ト。