JPS60202899A - 安定性の高い組換えガンマインタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の分野］ 本発明は、組換λ−ＯＮ△技術の領域に係り、安定性の
高い組換えガンマインターノエロンのｖｊＢに前記の如
き技術を利用する手段及び方法、前記インターフェロン
の産生並びに７１ｆｑ−される種々の産物及びそれらの
用途に係る。 ［発明の前照１ 本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、多くの刊
行物及びその他の文献を引用して本明ｗＡ書中に包含し
、便宜上、これらの参考文献に参照番岡を付し、本明細
書末尾に目録として添附した。本文中では参考文献を参
照番号で示す。 ヒトインターフエ［Ｉンは、抗１ｒｕ１．生物学的特竹
及び１−化学的特性の違いに基いて３秤のグループに分
類し得るゎ第１のグループは、通常ウィルスによって誘
発されたヒト血液構成細胞が主として産！トスる白血球
インターフェロン類である。これらのインターフェロン
は、既に微生物によってア 産生され、生物学的に活性であることが知見されでいる
（＠考文献１．２及び３参照）。このインターフェロン
は、その生物学的特信故に、ウィルス感染症及び悪性腫
瘍状態の治療話としての臨床使用が１論まれている（４
）。 第２のグループのヒト線絹牙細胞インターフェロンは、
通常、ウィルスに誘発され／、：　Ｆ’ｊｌ　Ｉ［を芽
細胞によって産生される。これらのインター７１．ロン
も同じく既に微生物によって産生されており、広範な生
物学的活性を示すことが知られている（５）。臨床試験
においてもこれらのインターフェロンの潜在的治療価値
が示唆さ４１ている。白血球インターフェロンと線帷芽
細胞インターフ■「】ンは、アミノ酸レベルでの相同（
ｈｏｍｏｌｏｏｙ）の程度が比較的低いにもかかわらず
、生物学的特性が極めて類似している。又、これらのグ
ループのインターフェロンはいずれも、約１６５乃至約
１６６個のアミノ酸を含み且つ酸に対して安定なタンパ
クである。 ヒトガンマインターフェロン（免疫インターフェロン、
γ−インターフェロン、ＩＩＦ又はＩＦＮ−γともいう
）は、前記インターフェロンの抗ウィルス特１１及び抗
細胞増殖特性を示すが、白血球インターフェロン及び線
維芽細胞インターフェロンとは９Ｊ照的に０１１２で不
安定である。これらガンマインターフ１０ンは、組換え
ＤＮＡ技術によって産！１−される以前

【こは主として
リンパ球のンイトゲン誘発によって産生されていた。ヒ
トガンマインターフェロンｌン（ま、白血球インターフ
ェロン及び線緒芽細胞インターフェロンとは抗原的に明
らかにｙ−なっている。Ｇ　ｒａｇ、　Ｇ　ｏｅｄｄｅ
ｌ等は組換えガンマインターフェロンの発現を最初に報
告しており（６）、これによってヒトガンマインターフ
ェロンに’ｌ￥Ｎ　’Ｊ性質即ちｐ１］２での不安定性
と共に抗ウイルス活性及び抗細胞増殖活性を示すことが
確められた。大腸菌（Ｆ、ＣＯＩ＋）中で産生され／：
Ｇｒａｙ及びＧＯｅｄｄｅｌの組換えガンマインターフ
ェロンは１４６個のアミノ酸から成り、この分子のＮ末
端部は配列ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ　−ｃｌＲ：Ｌつて
いた。続いて、［）ｃｒｙｎｃｋ等が、同じＮ昶Ｑすを
有しｎつ１個のアミノ酸が置換さねでいる別の帽換えガ
ンマインターフ１，１］ンを全１１告した（　７）が、
おそらくこのポリペプチド１３１、でれより前に参考文
献（６）に報告されたインターノＵ　１１ンの対（ｒ変
異型（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｔａｎＢであろう１．史
に、他の研究名等によって別の組換えガンマインターフ
１０ンの産生についての報告がなされＣおり、彼らにに
つて産生された組換λガンンインターノ１１］ンでは、
Ｇ　ｒａｙ及びＧＯＯｄｄＯｌが最初に開示したアミノ
酸配列（６）のうち１個又はそれ以上のアミノ酸が置換
されていると報、告されている１゜例えば、Ａ　Ｉ　ｔ
　Ｏｎ　Ｔは、Ｑ　ｒａｙ等のガンマインターフェロン
（６）の８１番目のアミノ酸を１つ置換した一連のＩＦ
Ｎ−γを報告している（１７）が、得られたｆＦＮ−γ
は１０％（相対基準）の活性しか有しておらｆｌさらに
このＩＦＮ−γの１．２．３番目のＣＹＳ−ＴＹＲ−Ｃ
ＹＳを欠失させると、相対活性が更に低下し、Ｑｒａｙ
等のガンマインターフェロン（６）の４９％の活性しか
有していないＩＦＮ−γとなる。 本発明者等の研究によって、Ｎ末端アミノ酸配列にシス
ティン残基を含む組換えガンマインターフェロンは、１
個又はでれ以上のシスティン残基のスルノヒドリル基が
ジスルフィド結合形成に関与するＡリボマー化という見
地から問題を醸し出すことが確認された。本発明者等の
研究に於いてこれらの１１１定ジスルノイド組合を完全
に還元することができなかったことから、問題はより複
雑であり、おそらくはシスティンと結合したチロシン残
基のヒドロ−シル官能基を介する反応が含まれると思わ
れる。又、これらの組換えインターフェロンは多少不安
定であり、不安定性のためかその他の原因によるかは明
らかでないが、耐過な効果が１ｑられないことが判明し
た。 ［発明の大要］ 本発明は、安定性及び活性が優れた組換えガンマインタ
ーフェロンに係る。最も好ましい態様では、Ｎ末端から
伸延して続くトＲ１！−）’ミノ酸配り１１（以下、１
完全前列」という）をイＴ　’６る紺換えガンマインタ
ープ［■ン、及び前Ｈｌ！配９１１のカルボ１シ末端の
特定部位を欠く種々のインクーノ］：　ｒ、ｌンアプロ
グ（類似体）が１１？供される１゜１２７　１２８　１
２９　１３０　１；＄１　１．５Ｚ　１．ＩＪ　１ｊ４
　１，１３ここで、Ｘはメブオニン残り又は水素であり
、Ｙは、グルタミン残基であるか、又はＸが水氷である
ときはグルタミン残基若しくはピログルタミン酸残基で
ある。本発明はまた、対応するクローン化遺伝子、これ
らを含む発現ベクター及び本発明のインターフェロンの
ＩＪ換えＤＮＡ技術による産生に有用な形質転換体を提
供する。本発明の好ましい組換えガンマインターフェロ
ンは、（文献中に既に記載されているインターフェロン
と比較して）天然ガンマインターフェロンの真のアミノ
酸配列に最も近似していると思われる。この天然ガンマ
インターフェロンは本発明者等が天然起源から精製し充
分に特性を明らかにしたものである。 本発明の好ましい態様のインターフェ【］ンは、文献中
に既に記載されているインターフェロンに比べて大幅に
改良された安定性と活性を示す。 本発明の前記及び他の目的を達成する様相は、以下の詳
細な説明及び添附の図面の記載から明らかになるであろ
う１゜ 第１図は、本発明の組換えガンマインターフェロンのア
ミノＭ１〜１４３　、並びにジグノル配列が先行してい
る該アミノ酸配列をコードしており１つ非翻訳ＤＮＡか
らなる５′−及び３′−フランキングＷ４域を有するＤ
ＮＡ配列を示す。 第２図は、旦、　ｃｏｌｉによる本発明の組換えガンマ
インターフェロンの直接合成のための情報をコードして
いるプラスミド及びその調製法を示す模式図である。 第３図は、本発明によってｍ製されたガンマインターフ
ェロンの優れた安定性を示すデータである。 ［詳細な説明Ｊ 本発明者等は、天然ヒトガンマインターフエロン（即ち
、ヒト末梢血リンパ球のフイトグン誘発によって産生さ
れて精製されたもの）が、Ｇ　ｒａｙ等が組換えガンマ
インターフェロンと指称し参考文献（６）に示した配列
をもするポリペプチドのＮ末端ＣＹ　Ｓ　−Ｔ　Ｙ　ｌ
で−ＣＹＳを欠くポリペプチドであることを解明した。 本発明者等の研究に係る高度に精製した天然ガンマイン
ターフェロンをトリプシン消化して得られる！ＩＩｔｌ
質中には、Ｇ　ｒａｙ等の相換えガンマインターフェロ
ン（６）のＮ末端部にほぼ相当するアミノ酸組成を有す
るが、但しＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを欠く配列が含有さ
れていた。天然ガンマインターフェロンのアミノ酸配列
解析をＮ末端から行なうことはできむかったので、この
分子のＮ末端のα−アミノ酸は保護されていると推定さ
れた。Ｑ　ｒａｙ等（６）によるとＣＤＮＡが］−ドし
ている２つ目のシスティンの次の第１アミノ酸はＧＬＮ
（グルタミン）であるので、Ｇ　Ｌ、　Ｎ残りが環化し
てピ臼グルタミン酸に代りその結果Ｎ末端がブロックさ
れていると１１１測された。ピ［１グルタミン酸アミノ
ベブヂダーげによってピ［１グルタミン酸を除去覆ると
、次に］−ドされているアミノ酸すなわちＡＳＰのα−
アミノ基が遊１１ｉ１１　Ｌ、、配列解析が続行できる
ようになり、その結果天然のヒトガンマインターフ■［
１ンの１υ初に報告されたものと同じ結果が得られＩこ
　。 ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを含有する組換えヒトガンマイ
ンターノコ−ロンのＣＤＮＡを適当に改造することによ
り、［記の完全配列（但し、ＸはＭ１’Ｆ　Ｉ　ｔ−あ
り、ＹはＧＬ、Ｎである）を有するタンパクを−１−ド
しているＣＤ　Ｎ　Ａから新規な組換えガンンインター
フ１［１ンをＥ、ｃｏｌｉ中で直接発現さゼることか可
能になった。Ｎ末端のメＦオニンはｍＲＮ　Ａの翻訳“
°開始″シグナル△ｔＪ　Ｇによって］−ドされている
人為＜ｙ、　５７であり、例示した「。 す」」による発現という特定の場合に【Ｌ宿−Ｆ系にＪ
、り除去処理さｔ′１ない。他のＩｉ！／１物系、例え
ばシー宿−ドｔナス（ｐｓＯＩｌｌｌｏｍＯｎａｓ）　
’ｒ、１．Ｉ：、メ＝１４ニンが除去され得る１、いｆ
れにせ、Ｌね’＋４’ｌに必東ぐあるとは思われない。 メチオニンが除去されると、使用する系に応じで、ＧＩ
Ｎ残りがビ■グルタミン酸の形態に環化し１９るがこの
場合も活１１が１（１われることは４１い。 本発明者等の研究によるど、Ｇｒａｙ等１こより以前に
報告されたＣＹＳ−−丁ＹＲ−ＣＹＳを含イ１する組（
柴えガンマインターフェロンは、と１〜而：ｉ’ｔ　’
？ルブミンを用いて処りすることＣ安定化しく９だ。 しかしｂから、最終凍結乾燥産物中に而ｉＩ′＋　’ｊ
’ルブミンが０右する場合番、１、岐路産物に対してで
は＜ｉく凍結乾燥に先立って成る種の品質調整処叩を行
なう必要がある。一方、本発明の新規な組換えガンマイ
ンターフェロンの場合には、凍結乾燥状態の物質は、血
清アルブミンを含有しなくとも充分に安定であることが
判明した。しかしながら、所望であれば、本発明のガン
マインターフエ［１ンを薬剤上許容される即度のヒト血
清アルブミンと調合してもよい。 更に、本発明のＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを欠く紺換えヒ
１−ガンマインターフェロンは、細胞変性Ｍ害試験に於
いて、抗ウィルス剤としてＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ含有
アナログよりも顕茗な活性を示すように思われる。活性
は通常、マイクロタイタープレー１〜上でヒトｌｌｌ′
ｌＩ癌由来の細胞株Ａ３４９に対する脳心筋炎ウィルス
の細胞変Ｊ、ｌ効果（ＣＰＦ）の阻害によりアッセイさ
れる（１２）。 本発明の組換えガンマインターフェロンは、前開完全配
列のアミノ酸１〜約１２６を含有するインターフェロン
を全て包含する。完全配列に対してカルボキシ末端部を
種々切り取ったガンマインターフｘ　ｒｌンは、アミノ
酸１〜約１２６が存在する限り、成る場合に多少レベル
が低下りるとしても、依然どしてヒ］・ガンマインター
フェロンに特有の性質を承り−１，実際、（７）に報告
さｔｌ、　ｔｃ　ＣＹ　５ＴＹＲ−ＣＹＳ含有アナログ
を用いた実験で、アミノ１１１３２（本発明の番目付け
による）に続くアミノ酸配列を、活性を損失することな
く他の配列（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ）で置換された例が示された（例えば、（８）参照）
。本発明ａｔの予備的データは、アミノ酸１から１２６
　（ＴトＩＲ）付近までの配列は比較的強固に結合して
活性と関連りるど思われる二次元（１体配胃をとってい
るが、完全配列の残りのアミノ酸は比較的構造ｌ−の制
限が緩くタンパク分解に比較的敏感（゛あるという仮説
を支持している。制限条ｆｉ下でのトリプシン消化によ
つ−Ｃ１アミノ酸１２６より上流の配列は種々の部分が
除去されるがこれより上流は除去されない。 本発明者等が研究した天然ガンマインターフェロンは、
アミノ酸１２７．　１２８．　１２９．　１３０．　１
３２及び１３４にわたる秤々の分子を含む。本発明者等
は、メチオニンに続くアミノ酸配列が（ＭＥＴの後の）
アミノ酸１〜約１３９及び１へ・約１３１の種々のもの
から成る完全に活性な組換えガンマインターフェロンを
発見した。後者のアミノ酸１〜・約１３１は、組換えガ
ンマインターフェロンをトリプシンで制限消化しその後
配列確認することによって得られた。（Ｍ　ＩＥ　Ｔよ
り先の）アミノ酸約１２８及び１２９に末端をイｊする
同様のトリプシン消化断片は、実質的に低十していると
はいっても活性を保持していた。一方、１２６番目のス
レオニンとそれに続くアミノ酸を消化して除去した（Ｎ
末端メチオニンに加えて）１２５個のｊ′ミノ醒をイ１
Ｊる物質（ま、ＯＰＦ用害アッセイに於いて来演化物の
活性の　１％未満の活性しか示さなかった。 組換えによって誘導されにガンマインターフＩ［１ンは
、メブニオンが細胞内でｔま開裂されイｃいＪ、うな宿
主内で産生された場合に先頭メチオニンを右するのに加
えて、１３０個のアミノ酸（第１図の番号イ」による）
をイｊするｂのが多（１）で１４３個のアミノ酸を有す
るものが生部であると考えられる。 この２種の組成はアミノＭ　１３’１個の種が約９５％
より多く、最も好ましくは約９７％より多い。制限条件
下のトリプシン消化はまた、アミノＭ１２６例近から下
流の種々の部分の配列を除去する。本発明者署の研究に
係る組換えガンマインターフェロンのこのような制限ト
リプシン消化物は、アミノ酸１２５（先頭メチオニンを
含めると１２６）、１２９゜１３１及び１３４をにわた
る秤々の種を含む。これらの種は、アミノ酸１２５付近
から１２９付近に伸びる場合、実質的に低下するとして
も活着を保持している。少なくともほぼ１２９個のアミ
ノ酸、特に少なくとも１３１個のアミノ酸を有する種、
すなわち約１２９・〜１４３個のアミノ酸を有する種が
本質的、又機能的に完全な活着を保持している。 以上のことから明らかなように、本発明は、上記の完全
配列を有する組換えガンマインターフェロンだけでなく
、アミノ酸１４３を欠くか又はｌ→アミノ酸１４３のア
ミノ酸配列（但し、Ｚはアミノ１１１２７．　１２８．
　１２９．　１３０．　１３１．　１３２．　１３３゜
１３４、　１３５．　１３６．　１３７．　１３８．　
１３９．　１４０゜１４１又は１４２である）を欠く種
々の組換えガンマインターフェロン及びこれらの混合物
をも含む。 ）　本発明の組換えガンマインターフェロンをコードし
ている二本鎖ＤＮＡ配列が、上記の完全配列を］−ドし
ているＤＮＡ配列だけでなり、−Ｆ配した秤々のカルボ
キシ末端を切り取ったアブログのみをコードしている配
列をも含むことも同様に明らかであろう。この秤々のノ
ｊルボ１−シ末喘を切１１ｉ　シた場合には次に続く」
トンが翻訳終ｒジグー１ルを１−ドＪる。 本明細書中、ｒ　ＩＩ　１？えガンマインターフｘ　ｒ
ｌン」とは、組換えＤＮＡ技術によって１！１られる複
製可能な発現ベヒクルから形質転換細胞中で発現される
ポリペプチド（これを産生する細胞によってグリ］シル
化されているかいないかにかかわらず）を意味する。本
発明のポリペブチを月ｉｔ、天然ヒトガンマインターフ
ェロンに特ｈ０１Ｑ質Ｉノ５、稈１復の差はあれ多少と
もヒトに於ける抗ウイルス活着及び抗細胞増殖活着並び
にｒ）ｌ−１２に於する不安定性を示す。 本用細出に記載した組換えガンマインターフェロンは、
本発明の目的として少なくと６１へ・約１２６のアミノ
酸を各々有する前記の如きポリペプチドの２個の組合せ
（各ポリペプチドは同数又は異なる数のアミノ酸を右し
得る）として定義される［二量体１を形成すると考えら
れる。化学結合形成機構に関する性質は充分には解明さ
れていな戸 いが、其有結合以外の結合であると思われる。二量体を
生ずる結合は自然に起こるようであり、本川１ｍに記載
する系では不可避であると思われる。 従って、本発明の組換えガンマインターフェロンを投与
するときには、通常二量体の形態であろう。 更に、別に特徴づけられた組換えガンマインター７ｚｎ
ンに関する文献（８，９）の開示と同様に、水用Ｉｌｌ
書中に開示しに組換えガンマインター７ｚｎン中、アミ
ノ酸１２６４１近の上流若しくは下流又ＬＬ　Ｃ末端部
分で、保右するインター７■ロン活竹を損うことがなυ
れば、アミノ酸のｆ￥換又は付加、特に１個のアミノ酸
の置換及び複数のアミノ酸の付加又は置換が可能である
と１！Ｉ！解すべきである。本発明の範囲を超えること
なく、前２の如き置換もしくは付加をなしくｑることは
当業古には明らかであると思われる。さらに本発明の紺
換えガンマインターフェロンは完全Ｖダ１（第１図参照
）の改変種及び対立変巽種であって完全配ダ１の６のと
同等、あるいはそれ以上の／ｌ−物学的活性を持つ種を
包含する。 本発明の特徴として、精製した１１換えガンマインター
フェロンは実質的にヒト由来の他のタンパクを含まない
であろうし、この特徴によって、今まで入手可能であっ
た天然のヒトガンマインターフェロン組成物とは区別さ
れるであろう。　一本発明は、（処７’ｉ　ｉｎｉに）
約９！）ｌ）ｌ′ｌより高ｌ＄４！度、好ましくは約９
８％よりｔ＆　１１１１印の組換えガンマインターフｘ
　１１ン組成物を包含し、このため、該組成物は今まで
に入手可能であった天然のガンマインク−フ１０ンと区
別される。 同様に、Ｎ末端アミノ酸残基がメチオニンである本発明
の具体例の１つの組換えガンマインターフェロンはヒト
の体内で序生きれるガンマインター７１［１ンと区別さ
れ、ＣＹ　Ｓ−Ｔ　Ｙ　Ｒ−ＣＹ　Ｓの欠失以外にも同
様な理由で、Ｇｒａｙ等（６）が報告した配列を有する
インターフェロンとは区別されるであろう。 本用細占中、複製可能な発現ベヒクルとは、二本鎖１）
　Ｎ　Ａ　、好ましくはプラスミドを意味し、これは、
複製開始領域、プロモーター又はプロモーター−オペレ
ーター、リポソーム結合部位をコードする配列、翻訳開
始シグナル］トン及びこれらと遺切な解読相にあり所望
の組換えガンマインターフェロンを］−ドしている遺伝
子、更にこれに続く翻訳終了］トンから成る。現在では
、組換えＯＮΔＮΔの一般的技術及び用語は当業者には
充分理解されており、いずれにゼよ当業者ｔｉｔ、本発
明の全ての具体例及び合法的に均等であると認識される
例の実施にＩ′ｌ！Ｉするバックグラウンド情報として
必要な変更を加えて（１１）を参照でさるであろう。 友災訓 Ａ、り」−ニング 参考文献（６）及び特開昭５８−り０５１４号公報の２
載に従い、誘発ヒト末梢血リンパ球から得たメツセンジ
ャーＲＮＡを用いて、ガンマインターフェロンｃＤ　Ｎ
　Ａ配列を有する組換えＤＮＡクローンを調製した。ク
ローンｐ６７のＯＮΔ配ダ配合１１図に示す。５゛−非
翻訳領域に続いて、２３個のアミノ酸から成る前駆体即
ちシグナルペプチドを一＝１−ドしている６９個のヌク
レオチド、１４３個のアミノ酸から成る成熟インターフ
ェ［１ンボリベブチドを］−ドしている４２９個のヌク
レオチド及び３゛−ジＩ　ａｌｌｌｌ列配列成する５８
７個のヌクレオチドがある。 Ｂ９発現 １、Ｆ、　ｃｏｌｉによ−ケ例 ｊ、ｃｏｔ−ｊ中で組換えＩＦＮ−γを高レベルで梵現
さｌるためには、シグナルペプチドの△ＴＧ（アミノＭ
Ｓ１）ではなく、成熟ポリペプチドのグルタミン］トン
（アミノＭ　１）の直前のＡＴＧ］トンからタンパク合
成を開始すべきである（第１図参照）。旦、ｃｏｌｉ中
で直接に９６７のｃＤ　Ｎ　Ａイン４ノートを発現させ
るためにとった手順の概略をｍｌ？ｌに示す。ＧｒａＶ
等（６）のｃＤ　Ｎ　ＡインリートをＦ−、ｃｏｌｉ中
で発現覆るために使用したアプローチと同様のアプロー
チをとった。 シグプルペプチドコード領域を除去するために、ａｔ定
成熟−１−ド配列の］トン２に位盾するＮす■制限部位
を用いた。２種の合成デオキシオリゴヌクレオチドを、
アミノ酸１及び２の」トンを再生し、ＡｒＧ翻訳開始］
トンを帽み込み１１つ×−１＋；！７帖着（’ｌ末端を
ｎ成するＪ：うにｆす゛インした。これらの２種のＡリ
ボン−を、ＣＩ）Ｎ△インリートの残りに結合して、　
１４４個のノアミノ＾Ｑ　／＋日日−成るポリペプチド
を一］−ドし［）つ両端に２Ｘ−１＋Ｈ１址びｉｊ’Ｆ
＋Ｉｉ部位を有する１０６３堪り対の合成−入然ハイｆ
リッド菫伝子を組み立てた。この）☆１へｒをｆノスミ
ドｐｌ−ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ２５　（１０＞の泣！２叩１’
　ｌｋ、び１乙−１１部位の間に挿入して、発現プラス
ミドｐγ−Ｃ￥　Ｃ！１を作製しＩ、′。このプラスミ
ドでＥ、ｃ−ｏｌｉ　Ｗ３１１０株（Ｆ−１λ−１原栄
養株ｐｒｏｔｒｏｐｌ＋ｉｃ）　（八［ＣＣＮ　０．２
７３２５）を形質転換して、宿１−　ベクター糸Ｆ、　
ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０／　Ｄ７−　ＣＹＣ５を得た。 ２．１８養細胞の例 第１図に示し／、：　Ｊ、う＜ｇ　Ｎ末端アミノ酸を含
む成熟ガンマインターフェロンｊ豐伝ｆからの産物′Ｃ
″あることを確認するために、第１図に示したようなシ
グナルペプチド及びガンマインターフェロンの双方を］
−ドしている遺伝子を、放射活性標識シスｊイン及びメ
チオニンの存在下でＣ０８−７細胞（１６）中で発現さ
せた（旦、　ｃｏｌｔによる発現の場合と異り、ここに
例示したような哺乳動物細胞系の発現産物はＮ末端メチ
オニンを欠いている）。 ６０ｍｍベトリ皿中の００８−７細胞の集密単層（ＣＯ
ｎｆｌｌｌｅｎｔ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）に、改ｆｆ１
ＤＥＡＥ−デキス］・ラン法を使用してＤＮＡをトラン
スフェクトしたものを２組Ｗ４製した。ＤＮＡ添加の３
日後、培地を除去した。各プレートに、１００μＣ１５
３５−メチオニン又は＄３５−システィンを添加したＤ
ＭＥＭ　２−を加えた。１／ｉ射活ｆｌ標識アミノ酸の
存在下′ｃ１６時間インキ１べ−１〜した後、培地を除
去し、抗ガンンインターフエ１］ンモノクローナル抗体
又は抗１−１８８　ＡＵモノクローナル抗体を第１抗体
としウサギ抗ンウスＩＯＧ抗体（ＣａｐｐｅｌｌＩｎｃ
、）を第２抗体として５００μＣの免疫沈陪を実施した
。前記抗体との反応及びその侵のスタフィロコッカス（
Ｓ　ｔａｐｉｌｙ、り遅１さ）Ａ細胞（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ）への結合は、Ｐ　、　Ｒｅｒｌａｎ　Ｗによっ
て記述されている（１８）。リンプルを５ｎｓ−メルカ
プトエタノール中に再懸濁し、１０％５Ｏ８−ＰＡＧＥ
ゲル上で電気法Ｖ；にかけた。ゲルをＴタノール中７％
酢酸で固定し、ヒｒＨｊａ叶ｅ　（Ｎ　ｅｗＥ　ｎｏｌ
ａｎｄ　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ）螢光溶液に浸し、乾燥し、
Ｋ　ｏｄａｋ　Ａ　Ｒ５フイルム及び増感スクリーン（
ｒ）　ｕＤＯｎｔ）を使用して２遍間霞）にさけた。 本研究に使用したプラスミド１まｐＳ■γ６９（１１）
、ｐＤＬ　Ｒ１（１９）（Ｂへり肝炎ウィルス表面抗原
発現ベクター、ｐＳＶγ６呵）の前駆体）及びｐｌ）［
ＲＩ７　５ａ１１（１１ＳＶ７６９（１１）（７）８３
０ｂｆｌ　Ｓ！。 ３Ａ所片を金石するボリシストロンプうスミドでアリ、
ｐＤＬ　ＲＩ（７）ｌＥｃｐＲＩ部イ（ｌ　ＧＬ、挿入
サレタガンマインターフｚＯンをコードしている全配列
を含むもの）であった。後者のプラスミドはガンマイン
ターフェロン及び１ｌＩ３ｓＡＯ双方のコード領域を含
む転写産物を産生する。 抗ガンマインターフェロン抗体（Ａ）又は抗１−ＩＢｓ
Ａ（＋抗体（Ｂ）と反応する５３５−システィン及び５
３５−メチオニン標識タンパクを比較すると、ｐＤＬＲ
Ｉ−γ　３ａｕでトランスフェクトし５３５−システィ
ンで標識したｌＩｌ飽では、抗ガンマインターフェロン
抗体を使用して特異的に免疫沈降する物質は、グリ］シ
ル化物（ＭＷ２９，０００）の４Ｃｔ　四に移動するも
のもモノグリコジル化物（ＭＷ１８，０００）の（☆置
に移動するものもないのに対し、これとは対照的に、５
３５−メチＡニンＩＩＡｖＡｌｌ胞ではガンマインター
フェロンの免疫沈降が生じた。 Ｃ、Ｉ」 旦、　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０／　ｐＴ　−ＣＹＣ５ｋ用
イル４１１換えヒトインター７１［［ｌンーガンン（ｒ
ｌＦＮγ）の産生は、容量１０乃争１０００Ｑ（７：範
囲のバラｆで実施する。発酵後、インター−）■［１ン
を含４ｊ−Ｊる旦、刻月細胞をブロスから回収し、ｒｌ
ＦＮ−γをｔｌ頗精製する。以下に発酵及び細胞回収１
）法を記載する。 １）ノドツクカッしり、！二の一週−暫−及−び」「、
持次の組成： バクトトリプトン　１０！１／　１ 酵母抽出物　！＋Ｑ／１ 塩化プトリウム　５−１０ｍｇ／ｌ を右する無菌培地１５０へ−５００ｍｌ−を含ｆ］する
無菌のバッフル板付培養°ノラス］中で、ストックカル
チャーを調製する。 次ニ、Ｆ、ｃｏｌｊ　Ｗ３１１０／　ｒ１７−　ＣＹＣ
！＋の−次ｊ８養物を培地に接種する。 次いで、５５０ｎｌｌｌに於ける吸光１αが約１０にな
るまで、接種したノラス」を振盪器上２５〜３１℃でイ
ンキユベートする。３０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルスルボ
Ｖリイド約５０％（Ｖ／Ｖ）を１０スに添加する。直ち
に１ｍｌのアリコートを無菌バイフルに分与し、ふたを
閉める。バイアルは一６０℃以下で保存する。各々の発
酵は、接種用複製ストックカルチャーを用いて１７０始
する。 ２）接種物の調製 接種物を振鰻フラス］又は小型ファーメンタ−内で前記
の培地（Ｌ、　Ｂプロス）を用いて調製する。約３７℃
で約８１ｉ間イン４−コベートした後、接種物をファー
メンタ−に移す。接種物の容量は、発酵容かの２乃至１
０％である。 ３）発　酵 組換えインターフェロン−ガンマの産生は、約１０乃金
１０００１の信用容積を＋ｊ　ｔＪるノア・−メンタ−
内で行なう。発酵１８地（Ｅ、１Ｑ当り次の組成を４−
１′？ｒる１゜ グルコース（：ｌ：　）　５０　１００！１硫酸アン七
ニウム　４．０　８．ＯＱ −塩基性リン酸ノＪリウｌい　３．０−ｈ、ｏｌ二１窩
基竹リン酸カリウ１８５０−８０！ｌＩ硫酸ングネシウ
ムＬ水１福　０．５−５．ｉｇクエン酸す１−リウムニ
水ｔｑ　Ｏ，！ｉ　−２，０ＱＬＩ　ＣＯＮ　Ｌ　Ｂ　
−６２５０，５−２，０ｍ１．−塩化第二鉄人水塩　０
．００５−０．１５Ｑ硫酸！■鉛七水石　０．０（＋１
−０．１５ｇ塩化コバルＩ〜六水塩　０．００１−　ｏ
、ｏｏ５ｇモリブデン酸プトリウ１８二水石 ０、（１（１１−ｏ、ｏｏ５ｇ 硫酸第二銅五本＠Ｏ，０Ｏ１−０，００５（１ホウＭ　
Ｏ，００？　−０，００５ａ 硫酸ンンガンー水塩　０．００１−０．００５（＋１、
［０，０−１，ＯＮ− チアミン−）−Ｉ　Ｃρ　０．０−０．１１１テトラリ
イクリンーＨＣｊ　Ｏ，００１−０，０１ＱＬ−トリプ
トファン（＊）　０．１　−０．５（］Ｍｌ”Ｊ抽出物
　２．０　−８．０Ｑ ３−β−インドールアクリルＭＯ，０２−０，１０（１
（ニド）グル」−ス及び１〜リプトフ１ンは一部を最初
に７１−メンタ−に入れ、残部は発酵中に供給する。 培地中の成分は、発酵に使用する萌に、熱処理又（まｅ
過により殺１々する。 発酵は２！）へ・４０°０で行う。伯の操作条件は次の
通りである； 撹ｆｆ　（ｒｐｎ＋＞　１００〜１０００通気（ＶＶｍ
）　０．５〜１．５ （必要４にときには酸素を補充） １’）ｌ−１６，５・〜７７５ （水酸化アンモニウムの添加によＶ）　Ａ節）４）精　
製 ａ）　＠　Ｊ！Ｊ　Ａ　ｊＪ　＞　Ｙ　イ＞　’ｌ　−
７−ｔ　ｎ　＞−ｆ７３ＪＩＩＩｌ！塩及びｒｌｌ−１
６乃至９、好ましくは約９の適当な緩衝液を含０する１
８地中にＩＬ、　、ｃｏ４−ｊキｉｆｆ　Ｉｌｌを懸濁
さＵる。ガラリン（Ｇａｕｌｉｎ　）ミルの如き、！′
ちＪｉ］ｒ＋イドミル中（・細胞懸濁液をホ［グノイズ
して紺換えガンマインターノ丁目ンを抽出する。 充分イｚポリ゛Ｌブレンイミンを前記溶液に添加して、
０．１乃金１％（Ｗ／Ｖ）の溶液に調装りる、２土清に
ガンンインターノｔｌｌンが含、Ｌれ（いる１゜ｂ）紺
−挽λＪＬンーイゴーンーターニＪ」、−１：１ンｑ２
り一＋７．−！４−へ５　、’Ｊ　ｌ：、ｔ　４−１１
！＞　Ｍ−７ｉｑ−−ｊ−、ｇ−（１）　１Ｂ−Ｑ、４
Ａ−Ｖｐ１１６乃争　９の範囲の適当／、に塩溶液Ｃ洗
浄」ノで不純物を除去したシリカをベースどする吸着剤
にト記（ａ）のトで＾を吸着させる。０５乃金１．０Ｍ
の塩化テトラメチルアンモニウムを含有する溶液を用い
て組換えガンマインターフェロンを溶出する。本工程の
全操作はａｔ−１７乃至９で行なう。 上記（ｂ）の溶出液を透析し、アニオン交換クロマ）〜
グラノイー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除
去する。増大するｊｈ勾配で組換え刃シマインターフｌ
ロンを溶出する。本工程で使用できる典型的アニオン交
換樹脂には、カルボキシメチルセルロース及びスルホエ
チルヒルロースがある。全操作はｐｌ−１７乃至９で行
なう。 ｄ）男之１堕Ｊヒｌグムｊルクロマ１ニー立二上記（Ｃ
）の溶出物をリン酸カルシウム媒体に吸着させ、次いで
洗浄して不純物を除去する。 リンｖｉ塩溌磨勾配中で塩濃度を増加させて紺換えガン
マインターフェロンを溶出する。本工程の全操作は、ｌ
１ｌ−１７乃↑９で実１＃する１゜上記（ｄ）の溶出物
を透析し、アニオン交換クロマトグラフイ一媒体に吸着
させ、次いで洗浄して不純物を除去する。アニオン交換
媒体から塩濃度を増大する勾配で組換えガンマインター
フェロンを溶出する。典１ｖ！的なアニオン交換りｎ−
ントグラノイー媒体は、カルボ１シメブルセルロース及
びスルホエチルセルロースである。 本工程の全操作はｐ１ニア乃芋９で実施する。 た１製 １記（ｅ）の溶出物をゲルパーミＴ−ジョン媒体に適用
し、カラムを塩含有溶媒で展開する。 組換えガンンインターフエ［１ンを含有する適当な両分
をプールして、精製バルクを得る。本工程の全操作Ｉｔ
　ｐＮ　７乃至９で行なう。 （１）　Ｃ末端アミノ醇−酢泗 Ｃ末端配列を決定するために、サンプルを１０％蟻酸中
に透析し、臭化シアンで開裂し、得られたペプチドをＡ
　Ｉｔｅｘ　ＬＪ　１ｔｒａｓｐｈｃｒｅ　Ｃ８逆相１
］Ｐ　Ｉ　Ｃカラムで分縮した。ピークを集め、アミノ
酸及びその配列解析を行った。検知されたＣ末端ペプチ
ドは、−Ｌ　Ｆ　ｔＪ　−Ｐ　ＨＦ　−Ａ　ＲＧ　Ｇ　
Ｌ　、Ｙ　Ａ　ＲＧ　（残基１３５〜１３９、第１図）
であり、ある場合に１．Ｕ他のペプチドがｉｐ、　ＩＮ
＋されており、その１列もよ−Ｉ　Ｆ　ｔｌ　−１’）
　ＨＦ−ΔＲＧ−Ｇ　１．　Ｙ　Ａ　ＲＧ　Ａ　ＲＧ−
Δ１Δ−３Ｆ　＋（・ＧｉＮ（残す１３５・〜・１４３
、第１図）（・あ−）／Ｌ　にれらの２種のペプチドの
ｉ’１１１含を決定するＬ二めに、（アミノ酸分析によ
り）既知のｈｌを逆相１−ＩＰ　Ｌ　Ｃカラ１１にか（
オ、それぞれのヒ゛−りの＾さを測定した。３回の産／
ｌにおいて枝鎖のペプチド（１３５へ、１４３　、第１
図）の含イ１幻目、東それぞれ約２％未満であり、残り
は５　ｆｉ１体（アミノ酸５個のもの）であった。この
データＧ、Ｌ　、　ｌ”　、ｃｏ４ｊによる１３９個の
アミノ酸含有及び１４３個のアミノ酸含有のガンマイン
ターフェロン（いずれの場合も存在するＮ末端メチオニ
ンを含まない）の混合物の産生と一致するものであり、
それぞれの相対比率は約９８＝２％である。 ５）設」ｊ」１ 前記Ｔ稈に従い製造した組換えガンマインターフェロン
を、次表の好ましいノ１経ロ投与用の製剤にする。 バイノ！ル１本当りのＩｉ％ 成　分　０．！＋ｍワバイアル（１）　２０ｍリバイノ
′ル（２）Ｍ１換えヒ１〜（ンターノエロンーγ　０．
ｔｉ　２．０ンンニ１〜−ル　１（１（１１１０ ］ハク酸−刃１−・リパノム六水１２晶　１２４　９９
グリシン　５．Ｇ　４．！＋ １晶化月・リウｌｘ　４．４　３．、’＋ポリソルベー
１−２０　０．　Ｉｔ　Ｏ，６−】ハク酸　０．ｔｉ　
０．４ （１）　ｔ’ｔｍ川ニｌ用Ｌハｉ’　ｊｌルを２５ｍＱ
（１’＞１（（（閉本（”　ｒｒ＋　１７１’ｌ成りる
。。 （２）　性用用にはバイ）ノルを２．０ｄの無菌水でｊ
［ｌ　＋Ｍ成する。 本発明のインターフ１０ンは、医学的に適切な投与量範
囲、例えば体表面積１Ｍ２当り１０ｍ０で使用し１！７
る。 カルボ１シ末端の違った秤々のガンマインターフコロン
の活性を決定するために、上記の旦。 岨υの例に記述したようにａ￥Ｊしたガンマインターフ
１ｒ−１ンを種々の程度にトリプシン消化し、前述のＡ
３４９細胞を用いるＣＰＥアッセイによって試験した。 前）！ｌＳのように調製した組換えガンマインターフェ
ロン（ｒ−ｆｌｕ　Ｉ　ＦＮ−７＞の試料（６，５ｍｇ
）をＳ　ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　〜２５モレキ１ラーシー
ブ小カラム（Ｐ　Ｄ　−１０，Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）
によりｐｉ−１８，５の０．１０Ｍ重炭酸アンモニウｌ
ｘＭ函液中に１１１２　ｊＭ　シ、最終タンパクＦｌｌ
ｌｆ　２１ｍ９／ｍｌｌとした。希釈トリプシン溶％　
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　［ＰＣＫ　ト’）　ｆシン
、０．００１ＭＭＣｌ！　中　１０７ｇ　ｙ’　ｍＱ　
、　１６メＩＣ）　を　ｒ−１１１１Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ溶
液のＬ’）ｍＱ　（４，ＯＩｎ’！　＞に加え、混合し
て室温でインキュベートした（トリプシン：タンパク鵞
〕＝　１　：　２５，０００）。イン１コベートｆｌ１
合物から、　１時間後、３．５峙間後１，５．７５＋１
．％間後、８１１．’１間後及び１０．２５時間後にそ
れぞれ試料を敗１〕出し１．：。８１１．’１間ｍ１１
５μ（１（１５０１（］）の希釈トリプシン溶油を内１
ａ加えＵｌｏ、２５時間後の最終試料採取のための反応
を卯進した１゜ 各時点の試Ｈの各成分への分画化はＲｉｏＲａｄＢｉｏ
ｏｃｌ　Ｉ−（Ｐ　Ｈｌ−カラムを使用するＷ　ａｔｃ
ｒｓｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃシステムで行なった１、千炭Ｍ
　Ｍ　ｔｉ　１ｌｌｌ＋中の各時点でのアリコートは試
料採取１１．１にｈ″／八に１接（手操作による注入に
より）入れた。０．０１Ｍリン酸ノ°１−リウム、ｐＬ
Ｉ　８．０．３０（ｔＭ塩化カルシウムにＪ、リカラム
を平衡化し、平廂化緩衝液の−１線勾配及び０．５Ｍリ
ン酸ナトリウム緩％ｌｉ液、ｌｌＨ８，０、０，６／１
ＭＪｕ化カルシウムを使用してタンパクをカラ１１から
溶出した。 ２１４ｎｍ及び２８０ｎｌにおける吸光度により検出し
たタンパクのピークを分取し、分析に使用するまで４°
（］で密閉保存した。選択、されたピークに対する典型
的な分析は以下のものを含む。 １、ヒｌへ肺癌由来のｉｌｌ胞Ａ３４９／ＥＭＣウィル
スアッセイシステムにおける抗ウィルス活性（１３）。 ２．１ａｅＩＩ１ｍｌｉゲルシステムを使用する４！！
準法によるＳＤＳ／ＰＡＧＥ分画化（１４）。 ３、市販の色素（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、。 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ　Ｉ−、）結合法によるタンパク
ｊ　濃度決定、。 ４　ダ化シアンによるタンパク開裂とそれに続くペプチ
ド同定のためのｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析（１５）。 タンパクの試料は７０％蟻１１１１ｉ　１．′、ス・１
して・晩透０１（１２，０００−１４，０００Ｍ　Ｗノ
ノッｌ−Ａ’　７　）　Ｌ、１１−タリＩ　ｌ＜　ホＬ
／−シ３　ンニヨ’ｌ　’１１　Ｎ　Ｉｖ　、”＋０Ｏ
ＩＩｅ　（ｒ）　７０９６蟻酸に再］α懸濁した。１２
Ｘ　７５１１ｍガラス管中の各リンプルに固体臭化シア
ンを加え、密１・１シて溶ｖＲ７１るまで混合し、アル
ミボイルをかＩＪ　、通気のよい場所で室温において一
晩イン１］べ−１〜した。 ６■裂の後、試料を「１−タリー」−バポレーションに
より乾燥し、０５−の水に再懸濁し、ｌ１１１σ乾燥し
た。トＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによる分画化に先立ち、試ｒ４を
５０％蟻酸中に再溶解してタンパク温度約１　ｍ９　／
　ｍＱとした。 Ａ　ｆｌｅｘ　Ｕ　１ｔｒａｓｐｈｅｒｅ　Ｑ　ｃｔｙ
ｌカラム及びトリフルオロ酢酸／水−トリフルオ［１酢
Ｍ／アセトニトリル直線溶出勾配を使用するＷａｔｅｒ
ｓ　ＨＰ　ｌ−Ｃシステムにより、ペプチドを分画化し
た。ｉ１能な場合はアミノ酸分析によりペプチドを同定
した。 短縮された形態のｒ−Ｈｌｌ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γの比較デ
ータを表１に示した（ａａｌ、ｉアミノ酸を表わす）。 表１ （比較用） １３１ａａ　ΔＡＫＴＧＫＲＫＲ４Ｏ−５０１２９ａａ
ＡＡＫＴＧＫＲ６−９ １２！＋ａａ　ＡＡＫ　約　１ ＊　第１図の？ｒ１ｉ’、（・ｌｌＪにＪ、るが、イれ
ぞれにおいて存イ１するＮ末端メヂＡニンは除く。 ＊＊　−文字の略記号は）アミノ酸残１．」の常用の略
記号である。 Ａ−アラニン 「＝ノミニルアラニン ０−グリシン １く−リジン １−１１イシン Ｒ−ｊ’ル−ニニン −「・・スレＡニン １２６ａａ　〜１４３ａａの範囲（Ｎ末端メ１）ｉニレ
１．Ｌ　Ｑまない）の■意の良さのカンマインターフ１
１１ンは適切に末端調整された遭１大−ｒから発現され
ることがわかるであろう。例えば第１図に示された逍伝
子（よ・　１２３　１２　Ａ Δ１ａ　△１ａ にｆ　！！！！　／Ｉ　ｔ（制限部位をｎ１る。ｌ：、
　ｎ＋＋　４　Ｉｔに、Ｊ、るシ１限の４塾に、パ終了
゛′］トンの（Ｊいｌ、：所望の配列をコードする合成
オリゴヌクレＡ−ｆド及び′ｆｌ現プラスミド中で使用
川面な制限部（＋／　１．Ｔ、適合するリンカ−をガン
マインターフｒ　ｒ’ｌン遺伝ｆの前部に結合すること
ができる。例えば、配列： ＣＧへ　ＴＴＴ　ＴＧ−１ΔＴＣ’Ｔ八〇（Ｘは１個以
上のアミノ酸を］−ドする）はｌ”ｎｕ４１１とＩＩＩ
ＩＴでプラスミドを消化した後に前記例示のＦ、Ｃ−０
１ｉ発現ベヒクルに結合でき、結合の結果の終了］トン
は下記のようになる。 終了 Ｂ（ｌＩＴ［ Ｆ、）７ツ廿イ、細胞変性ｌ害 １、テス］へ方法 Ｆ　ａｏｌｅ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中に４Ｘ１０５細胞／ｄ
の含有量に調整したヒト肺癌由来（Ａ　５１１９）細胞
（Ａ　ＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ　１８５）の懸濁液１００度
を各ウェルに加える、。 プレートを３７℃で約１８時間インキュベートする。 １８−．２４時間インキ１ベートした後、第１列目の各
ウェルに培地８０μＣを）０加する。１インターフエロ
ン活竹を測定する試料２０μｅ８第１列目のつｌルに加
える。 第１列の各ウェルの内容物１００７＋ｅをぞｔ′ｌぞれ
の横の第２列目のウェルに移す。 ウェルの内容物１００μｅを次列へ移し、これを全部で
１０回繰り返して、第１１列［１まで移す。 ２４ｈ間イン１ユベートした後、ヒルコントロールを除
き全てのウェルに脳心筋炎ウィルス５０μｅを感染させ
、感染後２４時間後の細胞変性効果が１００％となるよ
う感染を繰り返す。 トレイをふたで覆い３７℃で２４１）間イン」〕ベート
する。 全てのウェルから液体を抜さ、５・〜・１５分間０．５
％クリスタルバイオレツ］・で染色する。 細胞の４１−存能力を染色細胞を観察することにより測
定する。 試別のタイターは、５０％！１存可能細１ｆＶが残りす
る希釈１ａの逆数である。。 ２　δＬ片 全ての試別の活Ｉ１１を、下記によりｈ１粋されるＲｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ　ＩＪｎｉｔｓ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
　Ｆａｃｔｏｒによって規格化りる。 ３　匿盾滑 Ｎ　Ｉ　）ＩによるｒＦＮ−γ基準物質にＪ：り標準化
された△！’＋４９／Ｅ　Ｍ　ＣＶバイオアッセイシス
テムを使用するど、組換λヒトＩＦＮ−γの抗ウィルス
比活性は、Ｎ末端に３つのト１加アミノ酸（ＣＹＳ−Ｔ
ＹＲ−ＣＹＳ）のついた改変ｒｌＦＮ−γ分−ｆの活１
１１より約３倍ｌ！１い。 ４１々一定−性 土間のＩ−Ｌ物学的活１１１の測定（△Ｍ９／Ｅ　Ｍ　
ＣＶ　’）にＪ、るど、調合後バイアル中に保存しくあ
るｒｌＦｆｌ−γは、／Ｆ産後３ノ１月間（４”Ｃ：　
’Ｃｔｒｉ’　ｉ＆　）安定である（イ（物学的活（１
１の１（３失ｔｉｔ　＜１い）。 Ｆ　、　イ１ｊ（−ｆｉ−と−ご？Ｘ□、ゴーー二２ク
ーコア２−−堅−に一、で（−□さ≧１−て？−−二＝
−−−；イエＳコ之、＝＋３□第１≧−ｑｊｑ　、ｒ−
ｊ　Ｆ二」＼−二−３二／Ｑ−」八−肺！　ｎ４３ｃＨ
−外）活１牛１　材料及び１ノ法 ｒｌＦＮ−ｒ：溶液形態のＣＹＳ−ＴＹＲ０ＹＳ−欠失
組換えインターフ１［１ン −７（２０ｍＭａハクｆｌｑリトリウム。 ０．１５ＭＮａ　Ｃｆｆ１．　ｐｌ−１６）　、前記の
旦、　ＣＬｏｆ−ｊの例に依る方法でＪ４製した。比活
性は２．７Ｘ１０７Ｉｔノ／ｍｙタンパクであった。 ＣＴＣ−ｒｌ　ＦＮ−７： 溶液形態の、分子のＮ末端に ”　ＣＹ　Ｓ　−Ｔ　Ｙ　ｌ≧−ｃ　ｙ　ｓ　’構造を
有する組換えインターフｘ、　ｒｌン−γ（２０１１１
Ｍ：］ハク酸ナトリウム。 ０．１５　Ｍ　Ｎａ　ＣＩ　ＤＨ６）。 比活ｆ１は　１ＪＸ　１０７１　ｔＪ　／ＩＲＦＩタン
パクであった。 ト１ｕｌＦＮ　−β　： ヒトニ（Ｑ体包皮線緒芽ｌ１ｌＩ１２ｉ内で産／１．さ
れたヒ１〜線維芽１胞インターフェロンの？Ｊｉ　ｉｌ
！Ｉ乾燥物で、比活性（よ　１ｘｌＯ’　Ｉ（Ｊ／ｍク
タンパクより高く、Ｔ　ｏｒａｖ　Ｉ　ｎｄ、　、　Ｉ
　ｎｃ、により調製されたもの。バイアル中に １１１１１ＦＮ−β　３ｘ１０６１Ｕ及びヒト血清アル
ブミン３＃Ｉ！Ｊを含む。 ＨＩＩＩＦＮ　−α　： １　１”）ｒ　、に、　Ｃａｎｔｃｌｌ、　Ｃｅｎｔｒ
ａｌＰｕｂｌｉｃ　１ｌｅａｌｔｈ　１−ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　。 １−１ｅｌｓｉｎｋｉ　、　Ｆ　１ｎｌａｎｄより供与
された溶液形態のヒト天然自＋６＋球イ ン台−ノ丁［１ンで、比ン古ヤ１（ま　４×１０６１　
ｔＪ　／ｍ！Ｊタンパクである。５−］ンヒトール： ヒト血清アルブミン３ｍｇを含イ１１するプラシーボ、
。 培養培地：　ｔｌｅ　Ｉ　ａ　、　ＫＲ，ＩＩＭＶ−１
。 Ｆｌ及び、ｊ−１１１＠胞についてＩＬ１１０％熱不活
化初乳前籾／１了！１而循（１〕Ｎ　ＣＳ　）及び２ｍ
Ｍ　ｌ−グルタミンを添加したＦａｇｌｅｏｓｌ、＾少
必須培地を使用しｌ、：。Ａ３４９細胞には１０％熱不
活化ＰＮ　ＣＳ　、１００メ等１ｍＱ力ｔ−ｖイシン及
びｌ＋Ｍ　ｌ−グルタミンを含イＪ’ｌるＩ）ｕ　Ｉ　
ｂａｃｔ：ｏ　’ｓ最少必須＋３１１ｊｌ　４使用した
。表２に挙げた残りのヒｌ−ｍ胞には熱不活 化ＰＮＣ８及び１００．ｉｇ　／　ｒｎ９カナマイシン
を添加したＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０１ｉ３１１！ｉを
使用した。 ２　杭−１月１９ｊ％盾」燵Ｊ−価 ｌｊ４養培地に懸濁しｌこ試験細胞をプラスブック組ｒ
ＸＡＦ＜Ｆｓｌレ−１−ＩＺ　５ｘｌＯ”　Ｍｉｌｌｉ
ｌｏ、５　ｍＱ／つｘルのＩｎ１（ｔでｌｆｉ　秤し１
＝。Ｕｌ、いて対応する培地（０，５ｇ＋ｌりに溶解し
Ｉこ種々のｈｌのインターフェロンを添加した（ＯＦ＋
＞。培養は３７℃において　５％ＧＯ２，９５％空気の
況ａ−１人気中で行った。浮遊増殖バＩＩＩＢ胞につい
ては、６１１目に培養培地を除去し、懸濁培養液中の細
胞をＣ０ｕｌｌｅｒカウンターでの細胞貫１数のために
ＩＩｌ＋Ｊ′ｉＡｌ　５ｏｔｏｎ　Ｗ　（Ｇｏ旧ｔ（！
ｒ　Ｆ　ｌ０Ｃ１ｒ０１１ｉＣＳＩｎｃ、）申に懸濁し
Ｉ、−、、プラスブック容器中でシー１−を形成４る細
胞（，１、測定に際し、ｌ　５ｏｔｏｎ　Ｔｌ中−〇の
甲−細胞懸濁物を調製するＩ、：めに０．０５％トリＪ
シンー０．０７％ＩＥ　Ｄ　’Ｆ　Ａでが１処理した。 インターフェ【］ンの抗細胞増殖活性は、−１ントｌ−
１−ル１８養物（インターフエ〔１ンなし）とＩし較し
て細胞数を５０％減少するのにｅ　Ｊる抗ウィルス甲位
数として表わした（　Ｉ　Ｃ、Ｉ　ＬＪ　／　ｍｅ）。 ノ５０ 弄べ一餌種インク二ノ去８ン点几較し仁」↓旦Ｎ二Ｔの
抗柵胞増消盾性試験細胞の組織学的　ＩＣ，５０（ＩＩ
Ｉ／　ｄ）！ｌ！Ｉ胞　タイス区、Ｄ４綻−Ｕ則ゴ　」
叫逆地ユリ叶」：旦！叫用りＫＡＴＯ−ＩＴｔ　冑Ｊｌ
ｉ’ｉＳ！ＱＩＯｔ−ｒｉｎ（ｌ細胞　１．２　１．３
　−−　−１４にＮ−１胃扁甲ト皮１；　３７　３３０
　−−　−−ＨＫＮ−２８高分化ｌ（゛１胃腺ｆ（’ｆ
、　＞１０”　＞１０”　−−−１化Ｎ−４５（１（分
化！（゛！胃腺癌　＞１０”　＞１０”　−−ＨＫＮ−
７４高分化型胃腺癌　＞１０”　＞１０”　−−１１０
１−ａ　了高゛頚癌　２２　１３２　４４Ｇ　＞１０３
ＫＢ　の咽腔癌　５４　３３０　＞１０’　＞１０’１
１８Ｖ−１無メラニン＋’を悪１１１黒色腫　３８　４
５　１３０　８２０Ｓ「にＩ−Ｆ　悪性黒色腫　１３５
　＞１０”　１３７　６６３「１　羊膜（ノ１悲ゼ１肚
瘍起源）　３Ｂ　４５　＞１０３＞１０’Ｉ’Ｃ−８（
１化型１１１１ｉ１１１ｉ１＄１ｔｓ　＞１０”　＞１
０３＞１０’　＞１０”ＰＣ−１２１ｂｌｉｌｌｌｉｌ
ｌｒＡ　＞１０”　＞１０３＞１０’　＞１０３八！ｉ
４９　１１１１１リプ帛　５５　−　−　−ＱＧ−！ｉ
６　肺扁平１皮ａ＝　Ｓ　−−−ＱＧ−９０未分化−１
１１肺小細胞癌　５．５　−　−　−Ｄａｌｌｄｌ　Ｂ
１１ｒｋｌｌ劃１ルバＩＩＩ　＞１０”　＞１０”　４
７　７１１Ｓｍａ１ｗａ　Ｂｕｒｋｉｌｌ　リンパＩｔ
！Ｉ”　＞１０”　＞ｉｎ”　−−Ｊ−１１１中球１１
白血病　２５　８４　２０４　＞１０”表に示した通り
、ｒｌＦＮ−Ｔの抗細胞増殖活性はヒト細胞種にまり七
しく異っていた。このＢ＋合、ＫＡＴＯ−１［１すなわ
ち胃癌５ｉＱｌｅｌ−１’ｉｎＱ細胞【ま高度に敏感で
１．２１Ｕ／ｍ（！の１Ｃ５ｏを示すが、Ｕ′）ａｕｄ
ｉｌ胞すなわちＢ旧’ｋｉｔｔｌＪンパ腫は丁１１°１
インターフェロン〈トロＩ　ＩＦＮ−α、１０１１１Ｎ
−β）に対しては高度に敏感であるのに対しく、ｒｌＦ
Ｎ−γを含む■型インターフエ［１ンに対して【ま非感
受性であった。肺腺癌（ＰＣ−８，ＰＣ−１２）は試験
した全てのインターフエ［１ンに対しＣ非感受１１１で
あった。ｒ［ＦＮ−７とＣＩＣ−ｒｌ　ＦＮ−７間の抗
細胞スペクトルは殆んど同一であるが、一般的にｒｌＦ
Ｎ−７の抗細胞１ｔ’ｌ　Ｍ効果はＣ−「Ｃ−ｒｌＦＮ
−７”のそれよりも優れているようである。。 ４つのインターフェロン庖比較した場合、ｌ’）ａｕｄ
ｉｌＩｌ胞を除いて　ｒｌＦＮ−γにおいて最も＾い効
果が得られた。 Ｇ　、　１１ｊ−Ｙｉ−を靭！！′Ｌ例先の一池伸−し
６末６１”ｌｊ”Ｎ二Ｊ玄−Ω−シ（ン三−土ｊＦゴ丈
二ニアーｎ安定１鵠則事１０ｍｇヒト而γ１′ｉアルブ
ミン、リンＦｌ！ｉ　ｒｆｌ衝液及び等化ＩＩｉのＮａ
（１！をｆｔ’Ｌぞれ含有しくいる、前記の１−、、Ｃ
ＯＯ１２例に従つＣ調製しＩこ　ｒｌＦＮ−γの凍結乾
燥物ｌｘ　１０６１　ｔＪ　／パイフル及びＮ末端に“
ＧＹＳ−ｒＹＲ−ＣＹＳ”構造をイー］′づるｒｌＦＮ
−γの凍結乾燥物１ｘ１０６１Ｕ／バイアルを蒸留水で
溶解し、’ｆＡ庶を４ｘ１０’　ＩＬＪ／ｄに調整した
。 インターフエ［１ンのリ　ｖｉｔｒｏにおける安定性は
、種々の液体中における残存抗ウィルス活性を測定する
ことによって評価（〕た。上記のインターフ＋１−１ン
溶液を、３７℃又は４℃の水浴インキュベーターて゛１
０分間ルインキ］べ−１〜した９倍容愼のウリギ血γ＾
、ヒト自消あるいはＥ　ａ！Ｉｌｅ’　ｓ　Ｍ　ＦＭに
加えるごとによってインキ１ベートを開始した。０．　
０．２５　、　０．５．　Ｉ、４．１１．２４．７２続
び１４４ｈ間（股にアリ」−トを採取し、９（ｊ１容１
１）の［ａｇｌｅ’　ｓ　ＭＦＭど１１Ｎ合した、１試
穿：ＩＬＬ、インターフ１１１ンタイターの測）１ンＬ
　’−（７，１″イーｌノリーリ゛−中において−ＲＯ
’に　（’　ｉ４ｉ　１７＋保／ｒｌ、　／；：　、、
（ンターノエ［］ンタイターは、８口）旧＋ｉｓつｆル
スを感染さｌたヒ］・羊ＩＩＱ細胞（ト１細胞）を（す
！川りるＣ　Ｐ　Ｆ　４．（１法により測定した。結果
は初期タイターに対する残存タイターのパーｉ？ンテー
ジとしく第３図に示した。 旦、兜倶及びＣＯ３−７ｔＩＡ１５中で発現さける好ま
しい貝体例を参照して本発明を例示したが、本発明の絹
換えガンマインターフェロンが他の細菌株、酵母及び１
１織培養系の如′ｃ〜他の系内に於いでも産生され得る
ことは明らかである。１！ｉ開Ｉｌｌ　！＋　８−９０
５１４号公報及び参考文献（６）参照。即も、本発明は
最も好ましい貝体例に限定されず、むしろ前記特許請求
の範囲の全ての適法範囲の均等物に乃る。 劃−惹一文−１ １、Ｄ、　Ｇｏｃｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２８７．　４１１（１９８０） ２、　Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２凹、２０（１９８１） ３、　Ｅ、Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｃｓｅａｒｃｈ、　９．　７３
１（１９８１）４、Ｑｕｔｔｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、
、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｉ　ｎｔ、Ｍｅｄ。 ９３、　３９９　（１９８０） ５、　Ｄ、　ＧＯｃｄ（ｌｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　！！、　４
０５７　（１９８０）６、　Ｐ、　Ｇｒａｖ　Ｑｌ　ａ
ｔ、、　ＮａＬｌｌｒｅ、　２−９Ｍ、５０３−５０８
　。 ：　（１９８２） ７、　Ｒ，Ｄｅｒｙ＋１ｃ、ｋ　ｅｌ　ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１！！、　３
６０５　（１９８２）８、Ｒ、ｌ’）ｃｒｙｎｃｋ　ａ
ｔ　ａｌ、、［ｎｔｅｒｒｃｒｏｎ　５ｃｉｃｎ−ｔｉ
ｆｉｃ　Ｍｅｍｏｒａｎｄａ、Ａｕｇ＋＋ｓｔ　１９８
２．　Ｍｅｍｏ　−１−Ａ　１１９３／２ ９、Ｒ、Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｌ　ａｔ、、　”　Ｆ　ｘ
ｌ＋ｒｃｓｓｉｏ＋＋　ｏｆｌｌｌｌｍａｎ　ｌ　ｎｔ
ｏｌ’ｒｅｒＯｎ　Ｇａ１ｌｌｌｌｌａ　ｉｎ　１ｌｃ
ｔｅｒｏｌｏ−ＱＯＬＩＳ　３　ｙｓｔｅｎｔｓ”　Ｉ
ＩＩ　Ｅ　Ｘｐｆｌｌ”−１１１１（！ｎ１ａｌ　Ｍａ
−ｎｔｐＨ１ａｊｔＯｎ　Ｏｆ　（’ｒＱｎｅ　Ｅ　Ｘ
ｐｒ１３ＳＳ！Ｏｎ、△ｃａｄｃｍ−ｉｃ　Ｐ　ｒｅｓ
ｓ、ｌ　ｎｃ、２４７　（１９８３）１０、ｌ）、Ｑｏ
ｃｄｒｌｃｌ　ａｔ　ａｌ、、ＮａＮ１ｒｃ、ｇ８〆、
ｌｌ１ｌ−４１６（１９８０） ｉｔ、　Ｄ、　Ｇｏｅｄｔｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＶＡ
州６１　ｉ＋ｌ出■出会１公聞第０１γ、６１０号 １２、　Ｗ、　Ｆ、　Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｈ，”　Ｔ　ｈ
ｅ　Ｉｎ１ｅｒ−ｒｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　”　、Ｓ
ｐｒｉｎｇｃｒ　Ｖｃｒｌａ。 （Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　１１１１．１３−２６（１９
７９）１３、　５ｔＯＷａｒｔ、”　Ｉ　ｎｔｅｒｒｃ
ｒｏｎ　５ＶＳｔＯＩＩＩＲ”　’Ｅｌ＋、：３ｔｃｗ
ａｒｔ、ｐ、１３．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−１）ｃｒｌａ
ｇ　、　Ｎ　ｅｗＹｏｒｋ　（１９７９） １４、ｌ−ａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７．　６
８０　（１９７０）１５　Ｇｒｏｓｓ、ｅｔ　ａｊ、、
　Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ　ｉ−ｐ　Ｆｎｚｙｍｐ二切！ｉＶ
、ＸＴ、２３８ １Ｇ、Ｇ１１１７１１ａｎ、Ｃｅｌ＋、２３．　１７５
（１９８１）１７　Ａｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　”ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　。 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＦ　ｆｆｃｃｔｓ　ｏｆ　Ｒｃｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ　Ｄ　Ｎ　ＡＯｅｒｉｖｅｄ　１１　ｔｖａｎ
　ｌ　Ｆ　Ｎ　−ａｌｐｂａ　ａｎｄＩ　Ｆ　Ｎ−ｏａ
ＬＩＩＩＩｌａ　Ａｎａｌｏｇｓ”　、Ｔｈｅ　３　ｉ
ｏｌｏｇｙＯｆ　ｔｈｅ　Ｔｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｙ
ｓｔｅｍ、　［）ｅ　ＭａｅＶＯｒａｎｄ　５ｃｈｅｌ
ｌｅｋｅｎｓ、Ｆｄｓ、、ＥｌｓｅｌｖｉｅｒＳｃｉｅ
ｎｃｅ　ｐｕｂｌ、（１９１１３）　。 １Ｂ、１３ｅｒｍａｎ　ａｔ　ａｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ
、　２２２　、　５２４（１９８３） １９、　３　ｉｍｏｎｓｅｎ　Ｏ↓　ｇｌ、、Ｍｏ１．
　Ｃｅ１１．　Ｒｉｏｌ、。 ３．２２５（１（１９８３）

【図面の簡単な説明】

第１図１１、本発明の絹模λガンンインターノｉ［１ン
遺伝ｒのヌクレオ”ｆｌ−′ＰＩｉ！り１１境ひぞれか
ら１１１定さねる）Ｉミ、ノ酸配列を４、す図であり、
第２図ＬＬ本発明によって１Ｇ１ｇ合成される絹模λガ
ンマインターフェロンを−１−ドしているＪ−ノスミド
の調製法を示ｔｌ；１２明図であり、第３図は本発明の
ガンンインターフｌ目ンの侵れた安定性を示すグラノぐ
ある。 第１頁の続き Ｑｌｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　０１９８群２月２７日［相］米国（Ｕ　Ｓ）［有］
５８４２１７手続谷１１正ｖ１（方式〉 昭和６０年４月λλ日 １、事ｆ１の表示　昭和５９年特許願第２６３６９９号
２、発明の名称　安定性の高い組換えガンマインターフ
ェロン３、補１「をする者 事ｆｌとの関係　特許出願人 名　称　ジ１ネンテツク・インコーホレイテッド４、代
　埋　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビ
ル（１）　明細書中、第７１頁第１０行目にｒ　Ｔ　ｏ
ｒａｙｌｎｄ、、Ｉｎｃ、　ｊとあるをｒ　ｌ−−シ　
インド、。 インク、（Ｔｏｒａｙ　Ｉｎｄ、、Ｉｎｃ、ｌｌと補正
する。 ■　明細書中、第７１真下から第３行目にｒＤｒＫ、　
ＣａｎｔｅｌｌＪとあルヲｒ　ドクター　’７−、　カ
ンチル（Ｄｒ　、　Ｋ、　Ｃａｎｔｅｌｌ）　Ｊと補正
する。 Ｏ）　明細店中、第７１頁下から第３行目乃ｆ第２行目
に「Ｃｅｎｔｒａｌ・−・−１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｊどあるをｌ’　Ｌントラル　パブリック　ヘルス　ラ
ボラ１へり−（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｕｂｌｉｃ　ｌ−１
ｅａＨｈ　ｌ　ａｈｏｒａｌｏｒｙ　）　Ｊと補止する
。 （４）　明細書中、第７１頁最下ト行にｒ　ｌｌ　ｅｌ
ｓｉｎｋｉ　Ｉとあるを「ヘルシンキ（ｌ−１ｃｌｓｉ
ｎｋｉＮと袖口する。 （５）　明細書中、第７１頁最下行にｒ　Ｆ　１ｎｌａ
ｎｄＪとあるを［フィンランド（１”　１ｎｌａｎｄ）
　Ｊど補正する。 〈６）　明＃Ｉｍ中、第１９頁第４行目乃至第８１自帽
旧ｉｒ１　ディ、ゲデルら（１）　、Ｇｏｅｄｄｅｌ　
ｅｔ　ａｌ、１．ネイ５−ｖ　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　
２Ｈユ４１４　（１９８０）２．１’イ；’ｊ−５−ル
ら（Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチｖ
−（Ｎ　ａｔｕｒｅｌ、ユ９０．２０（１９８１）３　
イー、イエ−ルベルトンら（Ｆ　、　Ｙ　ｅｌｖｅｒｔ
ｏｎｅｔ　ａｔ、）、ニコークレイツク　アシッズ　リ
サーブ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）、　９．　７３７（１９８１） ４　ギッターマンら（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ　ｃｔ　ａｌ
、　）、アンプルス　−Ａ−７インド、メト、（Δｎｎ
ａｌｓ　ｏｆＩｒ＋１．　Ｍｅａｌ、）　９３　３９９
（１９８０）５　ディ、ゲデルら（Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ　ｅｔ　ａｌ、１．　二］−クレイツク　アシツズ　
リサーチ（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃＡ　ｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈｌ、　８．４０５７（１９ｇ（１１６ピー、グレ
イら（Ｐ　、　Ｇ　ｒａｙ　ｅｔ　ａｔ、）、ネイチｔ
？−（Ｎ　ａｔｕｒｅ　）、２９５　５０３−５０８（
１９８２）７　アール、プリンクら（Ｒ、Ｄｃｒｙｎｃ
ｋ　ｃｌａｌ）、二」−り（ノイツク　７シツズ　リＩ
　−−ｒ（Ｎ　１ｌｃｌＯｉｃ　Ａ　ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ）、！−Ｑ−Ｌ−３ＧＯ！＋（＋９１’１２
） ｒ８．アール、プリンクら（Ｒ、Ｄ　ｅｒｙｎｃｋ　ｃ
ｔａｌ、）　、インターフェロン　１ノイＴ゛ノティノ
イッ勺メモランダメ（ｌ　ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５ｃｉ
ｅｎｔＨｉｃ　Ｍｅｍｏ−ｒａｎｄａ　）　、　８月　
１９８２．メモ−Ｉ　−Ａ　＋１９３．／　２９　アー
ル、プリンクら（Ｒ、ｒ）　ｅｒｙｎｃｋ　ｅｌａｌ、
）、”エクスプレッション　オブ　ヒ〕−マンインター
フＩロン　ガンマ　イン　ヘテ［１０ガス　システム（
Ｅ　ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌ−１ｕｍａｎＩ　ｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｇａｍｍａ　ｉｎ　ｌ−１ｅｔｅｒ
ｏｌｏｇｏ１−１ｅｔｅｒｏｌｏ　”■クスベリメンタ
ル　マニブレーション　オブ　ジーン　エクスプレッシ
ョン（１：ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａ旧ｐｕｌａｔ
ｉｏｎｏｆ　ＱｅｎｅＥ　ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）　、
アカデミツク　プレス　インク。 （△ｃａｄｅｍｉｃ　ｐ　ｒｅｓｓ、ｌ　ｎｃ、）２４
７　（１９８３）１０．、　ｆイ、ゲデルら（Ｄ、　Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ）、ネイチｖ　−（Ｎ　ａｔ
ｕｒｅ）、　２８７．４１１−４１６　（１９８０）１
１　ディ、グデルら（Ｄ、　Ｃ１ｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　
ａｔ　、）、欧州特許出願公開第０．０７７．６７０Ｂ
１２　ダブリ］、イー、スチ］ワードＴｒ（Ｗ、Ｅ。 ３　ｔｅｗａｒｔ　ＩＴ　）、　”ジ　インターフェロ
ン　システム（ｒｈｃ　ｌ　ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　３ｙ
ｓｔｅｍ）”　、スプリンガーベルラグ（Ｓ　ｐｒｉｎ
ｔｅｒ　Ｖ　ｅｒｌａｇ）　（ニーｘ　−３−り（Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　））ｒｌＤ、１３−２６＜１９７９）１
３　スチ］ワ−１−（Ｓｔｅｗａｒｔ）　、”インター
フェロン　システムズ（Ｉ　ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓ　
ｙｓｔｅｍｓ）　”スチＥ　ワ−Ｌ−ｍ　（Ｅ　ｄ：Ｓ
　ｔｅｗａｒｔ）、ｐ、　１３．スブリンガーーデルラ
グ（Ｓ　Ｄｒｉｎｇｅｒ−［）　ｅｒｌａＯ）　、　ニ
ュー　３−り（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　＜１９７９＞１
４　ラ王ムリ（１−ａｅｍｌｉ）、ネイチャー（叱什肛
１２２７、６８０ロ９７０） １５　グロスら（Ｇｒｏｓｓ、　ａｔ、、　ａｌ、）　
、メソツズイン　エンザイモロジ−（Ｍ−灸ｔ１版ｉｎ
−り眩■１皿−Ｖ　）、Ｘ　Ｉ　、２３８１６　グルズ
マン（Ｇ　ｌｕｚｍａｎ）、　ｔ？ル（Ｃ−ｅｌｆ）、
　２−３．。 １７５（１９８１） １７、アルドンら（△１１０ｎ　吋　引１．）、”ブ［
１タクション、キャラクラリ１−ジョン　ｊ′ランドバ
イＡ−ロジカル　エフ丁りン　Ａブ　リー］ンビプンｌ
〜ＤＮＡ　プライブト　ヒユーマン　Ｉ　ＦＮ−アルフ
ァ　アンド　ＩＦＮ−ガンマ　アブ［１グズ（Ｐ　ｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
　ａｎｄＢ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅ　Ｈｅｃｔｓ　Ｏ
ｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉａｎｔ　Ｄ　Ｎ△Ｄ　ｅｒｉｖｅｄ
　ｌ−１＋１１１ａｒｌ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−ａｌｐＨａ　
ａｎｄ　ｌ　Ｆ　Ｎ　−ｇａｍｍａ　Ａｎａｌｏｇｓ　
）”　、ザ　バイオロジイ　第１ジ　インターフェロン
　システム　（Ｔ　ｈｅＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ
　ｌ　ｎｔｅｒｒｅｒｏｎ　３ｙｓｔｅｍ）、デメイヤ
ー及びシエレケンズ編（ＤＥ　Ｍａｅｒ　ａｎｄＳＣｈ
ＱＩ　ｔＣｋＣｎｓ、　Ｅ　／Ｉｓ、　）、　１−ルセ
ルビエ　リイエンス　バブル、（Ｅ　１ｓｅｌｖｉｅｒ
　３　ｃｉｅｎｃｅ　ｐ　ｔＪｈｌ、　）（１９８３） １８　ベルンンら（Ｒｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、）、　
４３イＴンス工５ｃｉ−ｅ；以０、−η−ζ−５２４Ｎ
９Ｂ３）１９　シ［ン廿ンら（３ｉｍｏｎｓｅｎ　ｅｔ
　ａｌ、）、モル。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）Ｎ末端から伸延する下記アミノ酸配列（但
   し、ＸＧまメブオニン残基又は水素であり、Ｙは、グル
   タミン残基であるか、又はＸが水素であるときはグルタ
   ミン残基若しくはピログルタミン酸残基である）を含有
   する組換えガンマインターフェロンポリペプチド；又は
   、 （ｂ）　（ａ）のガンマインターフェロンポリペ−ブチ
   ドの改変種で同等の性質を有するものを含む薬剤投与に
   適した組成物： （２）　Ｘがメチオニン残基であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の組成物。 （３）　前記ポリペプチドがＸの後に伸延する１２６＋
   ｎ個（旧：Ｌ　Ｏ又は　１乃至１７の整数である）のア
   ミノ酸をイｊ−ｃｌることを特徴とする特許請求の範囲
   第２項に配械の組成物。 （４）ｎ個のアミノ酸が、 ＧＬＹ−１，、ＹＳ−ＡＲＧｉ　ＹＳ−ＡＲＧ−１２７
   １２８１２９１３０１３１ ＳＥＡ−ＧＬＮ−ＭＥ丁−Ｌ　Ｅ　ＩＪ−Ｐ　ｌ−Ｉ　
   Ｅ　−１３２１３３１３４１３５１３６ △ＲＧ　−Ｇ　Ｉ　Ｙ−△ＲＧ　−Ａ　ＲＧ−Δ１Δ−
   １３７１３８１３９１４０１４１ Ｓ　Ｅ　Ｐ　（）ｌ−Ｎ １４２　１４３ であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の
   組成物。 （５）　ポリペ１ヂドが、前記ポリペプチドの〆ナログ
   で７ミノ酎１４３を欠くか又はアミノ酸配列７→アミノ
   酸１４３　（ａｌｌ、、７は７ミノ醇１２７゜１２８、
   　１２９．　１３０．　１３１．　１３２．　１３３．
   　１３４゜１３５、　１３６．　１３７．　１３８．　
   １３９．　１４０．　１４１ｙ（，１１４２である）を
   欠くポリペプチドから成るグループから選択されたもの
   であることを特徴とケる１！ｆ８′［請求の範囲第３項
   に記載の組成物。 （６）　Ｚがアミノ酸１２７であることを特徴とする特
   許請求の範囲第５項に記載の組成物。 （７）　Ｚがアミノ酸１２８であることを特徴とする特
   許請求の範１ｙ１１＄５項に記載の組成物。 （８）　７がアミノＭ　１２９であることを特徴とする
   特許請求の範囲第５項に記載の組成物、。 （９）　７がアミノ酸１３０であることを特徴とする特
   許請求の範囲第５項に記載の組成物１゜（１０）　Ｚが
   アミノ酸１３１であることを特徴とする特許請求の範囲
   第５項に記載の組成物。 （１１）　７がアミノ酸１３２であることを特徴とする
   特許請求のψ四箇５項に記載の組成物。 （１２）　７がシ′ミノ醒　１３３ぐあることを特徴と
   する特ｉＴ　請求の範囲第５項に記載の組成物。 （１３）　Ｚがアミノ酸１３４であることを特徴とする
   特許請求の範囲第５項に記載の組成物。 （１／ｌ）　、７がアミノ酸１３５であることを特徴と
   する特許請求の範囲第５項に記載の組成物。 （１５）　７がアミノ酸１３６であることを特徴とする
   特許請求の範囲第５項に記載の組成物。 （１（ｉ）　Ｚがアミノ酸１３７であることを特徴とす
   る特、１１請求の範囲第５エロに記載の組成物。 （１７）　７がアミノＭ１３８であることを特徴とする
   特許請求の範囲第！□′５項に記載の組成物。 （１８）　７がアミノ酸１３９であることを特徴とする
   特許請求の範囲第５項に記載の組成物。 （１９）　Ｚがアミノ酸１４０であることを特徴とする
   特ｔ；’ｔ’　請求の範囲第５　Ｊｒ口こ記載の組成物
   １、（２０）　／がノアミノ酸　１４１　”Ｃ’　ｔｕ
   ることを１？ｊ徽どりるＶＩ　ＲＴ　請求の範囲第５ｉ
   　ＪＴ口こム（１級の組成１１＋　、。 （２１）　、７がアミノ酸　１４２であることを？、！
   ｊ　ＩＭとりる特許請求の範囲第５拍に記載の組成Ｑｂ
   ｌ　、。 （２２＞　アミノ酸１４３だ【ｊを欠くことを特徴とす
   る特許請求の範囲第５１ｒ１に記載の組成物、１（２３
   ）　ポリペプチドが、細胞変ｆ１１凡１害ンイク［Ｊタ
   イターアッセイに於いて、ト記）アミノ酸配９１１（但
   し、Ｘは水素であり、Ａ　＜ｓ　Ｃｙ　ｓ〜Ｔ−Ｙ　Ｉ
   ’？　−＝ＣＹＳである）を有するＩＩ換えガンマイン
   ター−ノＴ　［、−１ンの活１１１と少＜【りどｂ＋−
   １ば香しい活１１ｉを示りことをＦｌ徴どりる特１１品
   求の昧聞第１項乃？第２？］ｎのいずれかに記載の組成
   ｖＩＩ： （２４）　細胞変性阻害マイクロタイターアッセイに於
   いて、下記アミノ酸配列（但し、Ｘは水素であり、Ａ）
   まＣ￥　Ｓ−Ｔ　Ｙ　Ｒ−ＣＹ　Ｓである）を有する組
   換えガンマインターフ１：０ンの活性の少なくとも約２
   倍の活性を示すことを特徴とする特許請求の範囲第１項
   乃至第２２項のいずれかに記載の組成物： ＴＨＲ−ＩＬＬＥ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＭＥＴ−
   ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＹＳ−７２７３７４７５７６７７７
   ８７９８０ＰＨＥ−ＰＨＥ−ＡＳＮ−８ＥＲ−ＡＳＮ−
   ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＡＲＧ−８１８２８３８４８
   ５８１３８７８８８９ＡＳＰ−ＡＳＰ−ＰＨＥ−ＧＬＬ
   Ｊ−ＬＹＳ−ＬＥＬＪ−丁ＨＲ−ＡＳＮ−ＴＹＲ−９０
   ９１９２９３９４９５９６９７９８ＳＥＲ−ＶＡＬ−Ｔ
   ＨＲ−ＡＳＰ−ＬＥｔＪ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＧＬＮ−Ａ
   ＲＧ−９９１００１０１１０２１０３１０１１１０５１
   ０６１０７ＬＹＳ−ＡＬＡ−ｒ　ＬＥ−ＨＩｓ−ＧＬＵ
   −ＬＥＵ−Ｉ　ＬＥ−ＧＬＮ−ＶＡＬ−１０８１０９１
   １０１１１１１２１１３１１４１１５１１６ＭＥＴ−Ａ
   ＬＡ−ＧＬＬＩ−ＬＥＬＪ−３ＥＲ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−
   ＡＬＡ−ＬＹＳ−１１７１１８１１９１２０１２１１２
   ２１２３１２４１２５ＴＩ−ＩＲ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−Ａ
   ＲＧ−ＬＹＳ−ＡＲＧ−８ＥＲ−ＧＬＮ−ＭＥＴ−１２
   ６１２７１２８１２９１３０１３１１３２１３３１３４
   （２５）　形質転換された微生物又は培養細胞中で、Ｎ
   末端から伸延する下記アミノ酸配列（但し、Ｘはメヂオ
   ニン残り又は水素であり、Ｙは、グルタミン残基である
   か、又はＸが水素であるときはグルタミン残基若しくは
   ピログルタミン酸残基である）を含有するポリペプチド
   を発現し得る複製可陥ｂｎｍベビ々ル： （２６）　Ｘがメチオニン残りであることを特徴とする
   特許請求の範囲第２５項に記載の発現ベヒクル。 （２７）　前記ポリペプチドがＸの俊に伸延する１２６
   ＋ｎ個（ｎＧ；Ｌ　Ｏ又は１乃至１７の整数である）の
   アミノ酸を有することを４−’ｊ徴とする特許請求の範
   囲第２６項に記載の発現ベヒクル。 （２８）　ｎ個のアミノ酸が、 Ｇ　Ｌ　Ｙ−Ｌ−、Ｙ　Ｓ　Ａ　ＲＧ　Ｌ　Ｙ　Ｓ　Ａ
   　ＲＧ−１２７１２８１２９１３０１３１ Ｓ　Ｅ　Ｒ−Ｇ　Ｉ　Ｎ　−Ｍ　Ｅ　Ｔ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ
   　−Ｐ　ＨＥ　−１３２１３３１３４１３５１３６ ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　Ａｌ−Ａ−１３７１
   ３８１３９１４０１４１ ＳＥＰ−ＧＬＮ １４２　１４３ であることを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載
   の発現ベヒクル。 （２９）　アミノ酸１４３を欠くか又はアミノ酸配列７
   −→アミノ酸１４３（倶し、７は７ミノ酎　１２７゜１
   ２８、　１２９．　１３０．　１３１．　１３２．　１
   ３３．　１３４゜１３５、　１３６．　１３７．　１３
   ８．　１３９．　１４０．　１４１又は１４２である）
   を欠く特許請求の範囲第２８１（１に記載のポリペプチ
   ドのアブ」１グから成るグループから選択されたポリペ
   プチドを発現し得る発現ベヒクル。 （３０）　微生物中で使用するためのものであることを
   特徴とする特許請求の範囲第２５項乃〒第２９項のいず
   れかにｉｔ！械の発現ベヒクル。 （３１）　細菌中で使用するためのものであることを特
   徴とする特許請求の範囲第２５Ｍ／ＩＪ〒第２９Ｉｎの
   いずれかに記載の発現ベヒクル。 （３２）　前記ポリペプチドの発現がこれに結合したシ
   グナルベブブドの形成を全く伴わないことを特徴とする
   特許請求の範囲第２５項乃至第２９項のいずれかに記載
   の発現ベヒクル。 （３３）　特許請求の範囲第２５項乃〒第２９項のいず
   れかに記載の複製可能な発現ベヒクルによって形質転換
   された宿主細胞からなる形質転換細胞。 （３４）　特許請求の範囲第２５項乃至第２９項のいず
   れかに記載の微」動用の複製可能な発現ベヒクルによっ
   て形質転換された宿主微生物からなる形質転換徹り一物
   。 （３５）　特許請求の範囲第２５項乃至第２９項のいず
   れかに記載の細菌用の複製可能な発現ベヒクルによって
   形質転換された宿主細菌からなる形質転換細菌。 （３６）　］−ド鎖及び相補鎖からイ【る二本鎖Ｉ’）
   ＮＡであって、前記］−ド鎖が４、ポリペプチドのＮ末
   端から伸延する下記アミノ酸配列を有するポリペプチド
   を］−ドしていることを特徴とする前記二本鎖Ｉ’）Ｎ
   Ａ　： ＭＥＴ　ＧＬＮ　ＡＳＰ　ＰＲＯＴＹＲＶＡＬ−１，、
   ＹＳ−Ｇｌ−１１−ＡＩ−Ａ−１２３４５６７８ ＨＲ ２６ （３７）　前記ポリペプチドが、献初にコードされてい
   るメチオニン残りに続いて伸延する１２Ｂ＋　ｎ個（ｎ
   は０又は１乃至１７の整数である）のアミノ酸を有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３６項に記載の二本
   鎖ＤＮＡ。 （３８）　ｎ個のアミノ酸が、 Ｇ　Ｌ　Ｙ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ　−Ａ　ＲＧ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ
   　−Ａ　ＲＧ　−１２７１２８１２９１３０１３１ Ｓ　Ｅ　Ｒ−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｍ　Ｅ　Ｔ　−Ｌ　Ｅ　Ｕ
   　−Ｐ　ＨＥ　−１３２１３３１３４１３５１３６ Ａ　ＲＧ　−Ｇ　Ｌ　Ｙ−Ａ　ＲＧ　−Ａ　ＲＧ　−Ａ
   　Ｌ　Ａ　−１３７１３８１３９１４０１４１ Ｓ　Ｅ　Ｐ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ １４２　１４３ １　であることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に
   記載の二本鎖ＤＮＡ。 （３９）　コード鎖及び相補鎖からなる二本鎖ＤＮ八で
   あって、前記コード鎖が、アミノＭ　１４３を欠（か又
   はアミノ酸配列Ｙ→アミノ酸１４３（但し、Ｙはアミノ
   酸１２７．　１２８．　１２９．　１３０．　１３１゜
   １３２、　１３３．　１３４．　１３５．　１３６．　
   １３７．　１３８゜１３９、　１４０．　１４１又は１
   ４２である）を欠く特Ｆ＋’ｒ　請求の範囲第３８項に
   記載のポリペプチドのアナログから選択されたポリペプ
   チドをコードしていることを特徴とする前記二本鎖ＤＮ
   Ａ。 り４０）　天然ヒトガンマインターフェロンに特有の性
   質を示し、少なくとも特許請求の範囲第１　Ｉｆｆに記
   載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。 （４１）　アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続
   いて伸延しており、その伸延部が Ｇ　Ｌ　Ｙ　Ｌ−Ｙ　Ｓ　Ａ　ＲＧ　−Ｉ　Ｙ　Ｓ　Ａ
   　ＲＧ〜１２７　１２８　１２９　１３０　１３１Ｓ　
   Ｅ　Ｒ−Ｇ　Ｌ　Ｎ　Ｍ　Ｅ　Ｔ　Ｌ　Ｆ　ＬＪ　−Ｐ
   　ＨＥ　−一１３２　１３３　１３４　１３５　１３Ｂ
   Ａ　ＲＧ　−Ｇ　Ｌ　Ｙ−△ＲＧ １３７　１３８　１３９ であることを特徴とする特許請求の範囲第４０項に記載
   のポリペプチド。 ”（４２）　アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に
   続いて伸延しており、その伸延部が ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＡＲＧ−Ｌ　ＹＳ−ＡＲＧ−１２７１
   ２８１２９１３０１３１ Ｓ　Ｆ　Ｒ−Ｇ　ｉ　Ｎ　−Ｍ　Ｅ　Ｔ　−１−Ｅ　ｔ
   Ｊ　−Ｐ　トＩＥ−１３２１３３１３４１３５１３６ Ａ　ＲＧ　−Ｇ　Ｌ　Ｙ　−Ａ　ＲＧ　−Ａ　ＲＧ　−
   Ａ　Ｌ　Ａ　−１３７１３８１３９１４０１４１ Ｓ　Ｅ　Ｐ　−Ｇ　Ｌ　Ｎ １４２　１／１３ であることを特徴とする特に’Ｆ論求の範囲第４０項に
   記載のポリペプチド。 （４３）　アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続
   いて伸延しており、イの伸延部が Ｇｌ−Ｙ−１，、、Ｙｓ　＝ＡＩ≧６ １２７　１２８　１２９ であることを特１？シどりるＩＩ　ｏ’１　請求の範囲
   第４０１１’Ｊ　１．、前記載のポリペプチド。 （４４）　アミノ酸配列が、１２６番［］の】アミノ酸
   に続いて伸延しており、イの伸延部が ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＡＲＧ−Ｉ　ＹＳ−ΔＲＧ１２７　１
   ２８　１２９　１３０　１３１であることを特徴とする
   特６１請求の範囲第４０項に記載のポリペプチド。 （４５）　アミノ酸配列が、１２６番目のアミノ酸に続
   いて伸延しており、その伸延部が Ｇ　Ｌ　Ｙ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ−Ａ　ＲＧ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ　
   −Ａ　ＲＧ　＝　７’１２７　１２８　１２９　１３０
   　１３１（但し、７′は水素又は下記アミノ酸若しくは
   アミノ酸配列である）であることを特徴とする特許請求
   の範囲第４０項に記載のポリペプチド：ＳＥＲ； ３２ （４６）　アミノ酸配列が、　１２６番目の７ミノＩ’
   ｌ！２Ｌ二続い−（伸延しており、その伸延部が ＧＬＹ−ＩＹＳ−−△１よＧ−ＬＹＳ−△ＩマＧ−／’
   １２７　１２８　１２９　１３０　１３１（但し、７′
   は水素又は下記？ミノ酸菩しくはｊ′ミノ酸配列である
   ）であることを１！１１９Ｑどする待ｉ′（請求の範囲
   第４０項に記載のポリペプチド：ゴ　」ｑ 区　〇− （４７）　特許請求の範囲第４１項及び第４２項に記載
   のポリペプチドの混合物よりなる組成物、。 （４８）　特許請求の絶間第４１偵に記載のポリペプチ
   ドを約９５％、１り多く含有Ｊることを特徴とする特ｆ
   ｌ′品求の範囲第４１項に記載の組成物。 （４９）　特許請求の範囲第４１項に記載のポリペプチ
   ドを約９７％より多く含有することを特徴とする特許請
   求の範囲第４７項に記載の組成物３、（５０）　薬剤士
   許容できる即度のヒ］・面γ１′Ｉアルｆミンを含有づ
   ることを特徴とする’ｌｊｌ　ｉ！’Ｆ　請求の範囲第
   １項に記載の組成物。