JPS63264500A - 新規ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 竜呈上Δ秤且分」 本発明は、医薬品などとして有用な新規ポリペプチドお
よびその製造法に関するものである。

従来の技術 γ型インターフェロン（以下、ＩＦＮ−γと略称するこ
とがある）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起
るような状況化で、免疫担当細胞から産生されるため、
免疫インターフェロンとも呼ばれている。ＩＦＮ−γは
ＩＦＮ−αやＩＦＮ−βと比較して、抗細胞増殖活性や
抗腫瘍活性が高いといわれており、臨床応用面からより
期待されている。しかし、その産主に新鮮なリンパ球が
必要であることなどの制約があるため、これまで効率の
よい産生糸は確立されていなかった。

しかし最近、遺伝子組み換え技術が広く利用されるにい
たって、ｒｐＮ−’ｙの相補ＤＮＡ（ＣＤＮＡ）がクロ
ーン化され、そのヌクレオチド配列やその配列から予測
されるアミノ酸配列が明らかにされるととらに、ｃＤＮ
Ａや化学合成した遺伝子を各種の宿主を用いて発現させ
ることが可能となってきた［グレイ、ｐ、ｗ、ら、ネイ
ヂ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２９５．５０３（１９８
２）、デボス、Ｒら、ヌクレイツク・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、）Ｌ更、
２４８７（１９８２）、タナ力、Ｓら、ヌクレイツク・
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　
Ｒｅｓ、）。

１上、１７ｏ７（１９８３）など］。

グレイ（Ｇｒａｙ）ら、ネイチャー、２９５，５０３（
１９８２）およびプリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）ら、ヌク
レイツク・アソッズ・リサーチ１０．３６０５（１９８
２）には、ＩＦＮ−γとして、１４６個のアミノ酸より
なるペプチドが示されている。本明細書においては、構
成アミノ酸の番号は、上記文献に示されたそれをいうも
のとする（第４図参照）。

さらにモノクローナル抗体を用いる精製法により、遺伝
子組み換え技術で得られるＩＦＮ−γ（以下、ｒｌ　Ｆ
Ｎ−γと略記することがある）の大量生産も可能になっ
てきた［ＥＰＣ公開公開第０１０３８母８ 直接関与しないと考えられるアミノ酸配列を欠失させる
ことが種々行なわれてきた。

たとえば、特開昭６０−２０２８９９号公報よびＣ末端
の１３０位のｃｒｙ乃至１４６位のＧｌｎのペプチド鎖
においてそのＮ末端から数えて１〜１７個のアミノ酸も
しくはペプチドが欠失したものが示されている。

また、特開昭６０−２３３　１　００号公報には、アミ
ノ酸配列５−１２７．１−１２７および５−１４６より
なるＩＦＮ−γの部分配列が示されている。しかしなが
ら、アミノ酸配列５−１２７のものはペプチドを発現す
るためのＤＮＡを構築してはいるものの、ポリペプチド
の発現は行なわれていない。

さらに、特開昭６１−５０９６号公報には、ＩＦＮ−７
のＮ末端のＣｙｓ−’Ｉ’ｙｒ、　Ｃｙｓ−Ｔｙｒ　−
ＣｙｓまたはＣｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ
およびＣ末端の１３１位のＬｙｓ乃至１４６位のＧｌｎ
のペプチド鎖においてそのＣ末端から数えて１〜１６個
のアミノ酸もしくはペプチドが欠失したものが示されて
いる。

発明が解決しようとする問題点 前述したとおり、ＩＦＮ−γのＮ末端およびＣ末端のア
ミノ酸またはペプチドを欠失させた部分ポリペプチドに
ついて種々研究されてきたが、本発明は、Ｃ末端のアミ
ノ酸配列をさらに欠失させて最大のＩＦＮ−γ活性を有
するポリペプチドを提供するところにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、ｒＩ　ＦＮ−γの活性中心を確立すべく
研究の結果、おどろくべきことに、Ｃ末端を１２６位Ａ
ｌａよりもさらに短くして１２２位Ｇｌｕないし１２５
位Ｐｒｏとすることにより、第４図に示されるインタク
トなＩＦ’Ｎ−γよりも高いＩｒｉ’Ｎ−γ活性を示す
ポリペプチドを見い出し、これに基づいてさらに研究を
進めて、本発明を完成した。

本発明は、 （１）、（Ｎ）　Ｈ−Ｘ−Ｙ−Ａｓｌ）　　Ｐｒｏ　　
Ｔｙｒ　　ＶａｌＬｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｕ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　ＬｙｓＬｙｓ　　’Ｉ’ｙ
ｒ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｈ４
５Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　
　Ａｓｎ　　ＧｌｙＴｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　ＬｅｕＬｙｓ　　Ａｓｎ
　　Ｔｒｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　５ｅｒ
Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｍｅｔ　　
Ｇｌｎ　　５ｅｒＧｌｎ　　Ｉｌｅ　　Ｖａｌ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＬｙｓ　　Ｌｅｕ　
　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　ＬｙｓＡ
ｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｇ
ｌｎ　　ＬｙｓＳｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ
　　Ｉｌｅ　　Ｌｙｓ　　ＧｌｕＡｓｐ　　Ｍｅｔ　　
Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　ＰｈｅＡｓ
ｎ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｌ、ｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌ
ｙｓ　　ＡｒｇＡＳＩ）　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　ＴｈｒＡｓｎ　　Ｔｙｒ　
　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　ＬｅｕＡ
ｓｎ　　　Ｖａｌ　　　Ｇｌｎ　　　Ａｒｇ　　　Ｌｙ
ｓ　　　Ａｌａ　　　ｌ１ｅＨｉｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ［式中、
ＸはＭｅｔまたは結合手を示し、ＸがＭｅｔのときＹは
Ｇｌｎまたは結合手を、Ｘが結合手のときＹはＧ　Ｉｎ
、＜　Ｇ　ｌｕまたは結合手を、Ｚは（Ｎ）Ｇｌｕ　　
Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ（Ｃ）で示されるペプチド
鎖においてそのＮ末端から数えて１〜４個のアミノ酸ら
しくはペプチドをそれぞれ示す。コで表わされるポリペ
プチド（■）。

（２）、ポリペプチド（１）をコードする領域を有する
ＤＮＡ。

（３）、上記（２）項のＤＮＡを何するプラスミド。

（４）、上記（３）項のプラスミドを保持する形質転換
体、および （５）、上記（４）項の形質転換体を培地に培養し、培
養物中にポリペプチド（Ｉ）を生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするポリペプチド（１）の製造法
である。

本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を有する
ＤＮＡとしては、ポリペプチド（１）をコードする領域
を有するものであればいずれでもよい。

該ＤＮＡの具体例としては、たとえば式％式％ ＧＡＴ　　ＧＡＣＴＴＣＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＣＴＧ　
　ＡＣＴ　　ＡＡＴ　　ＴＡＴＴＣＧ　　ＧＴＡ　　Ａ
ＣＴ　　ＧＡＣＴＴＧ　　ＡＡＴ　　ＧＴＣＣＡＡ　　
ＣＧＣＡＡＡ　　ＧＣＡ　　ＡＴＡ　　ＣＡＴ　　ＧＡ
Ａ　　ＣＴＣＡＴＣＣＡＡ　　ＧＴＧＡＴＧ　　ＧＣＴ
−Ｚ’（３’）　　　（’ｆＩ）［式中、Ｙ′はＣＡＧ
または結合手を示し、Ｚ′は（５′）ＧＡＡ　ＣＴＧ　
ＴＣＧ　ＣＣＡ　　（３’）で示される塩基配列におい
てその５′末端から数えて１〜４個のコドンからなる塩
基配列を示す。］で表されるＤＮＡが挙げられる。

５′末端にＡＴＧを有しその下流にポリペプチド（１）
をコードする領域、ついで翻訳終止コドンを有するＤＮ
Ａ（プラスミド）は、化学合成であるいは遺伝子工学的
に製造された公知のｒＦＮ−γのｃＤＮＡもしくは染色
体由来のＩＦＮ−γＤＮＡを加工することにより製造す
ることができる。

ポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を有するＤＮＡを
有するプラスミドを製造するにあたって、ベクターとし
て用いられるプラスミドとしては、たとえばＣｏ１Ｅ　
Ｉ　　由来のｐＢＲ３２２［ジーン（Ｇｅｎｅ）、２．
９５　（１９７７）］、ｐＢＲ３１３［ジーン。

ム、７５（１９７７）］、ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５
［ジーン　４，１２１（１９７８）］、ｐＢＲ３２７，
ｐ１３Ｆｔ３２８［ジーン±、２８７　（１９８０）］
、ｐＫＹ　２２８９［ジーン影、Ｉ（１９７８）］、ｐ
ＫＹ２７００［生化学１点、７７０（１９８０）］、＋
３ＡＣＹＣｌ　７７　、ｐＡＣＹＣ１８４［ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　ｌ　３４　、１１４１（１
９７８）］、ｐＲＫ２４８．ｐＲＫ６４６．ｐＤＦ［メ
ソッズ・イン・エンジ−モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６８，２６８（１９７９）］
、ｐＵＣｌ　８゜ｐＵｃ１９［ヤニシューベロンら、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）、　３３．１０３（１９８５）］など
が挙げられる。また、バクテリオファージ、たとえばλ
ファージを使用したえｇｔ系のλｇｔ−λＣ［Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　　７　１　．４　５　７
　９（１９７４）コ、λｇｔ　　・λＢ　［Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ
、　７２゜３４１６（１９７５）］、λＤａｍ［ジーン
ｌ　、２５５（１９７７）］やシャロンベクター［サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　１９６．　　ｌ　６１（
１９７７）；ジャーナルｅオブービーロロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２９．５５５（１
９７９）］、繊維状ファージを使用したｍｐ系のｍｐｌ
　８　、ｍｐｌ　９　［ヤニシューペロンら。

ジーン（Ｇｅｎｅ）、３３，１０３（１９８５）］ベク
ターなども挙げられる。

上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモーターを有してい
るのが好ましく、該プロモーターは、形質転換体の製造
に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればい
かなるものでもよい。

たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ
）ではｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅ
ｃ　Ａプロモーター、λＰＬプロモーター、　ｔｐｐプ
ロモーターなど、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）ではＳＰＯｌプロモーター、５ＰＯ２プロモ
ーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、酵母（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ではＰＨ０
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーターなど、動物細胞ではＳＶ４０
由来のプロモーターなどが挙げられる。

上記製造法をより具体的に説明するために、■Ｆ　Ｎ−
γ遺伝子（ｃＤＮＡ）含有プラスミドｐＬ　Ｃ２（ヨー
ロッパ特許出願公開第１５４３１６号公報Ｒｅｆｅｒｅ
ｎｃｅ　Ｅｘａｍｐｌｅ　　４参照）を原料にポリペプ
チド（Ｉ：　但し、Ｚはペプチド、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ）を
コードする領域を有するＤＮＡ含有プラスミドの製造法
を以下に例示する。

プラスミドｐｔ、　Ｃ２を制限酵素、たとえばＥｃｏＲ
ｌにより消化することにより、ＩＦＮ−γ全領域をコー
ドするＤＮＡ断片を得ることができる。この断片をＭ＋
３ファージ由来のベクターｍｐ１９に組み込むことによ
って、上記ＩＦＮ−γ遺伝子を含むファージ一本鎖ＤＮ
Ａを取得する。この一本鎖ＤＮＡとリン酸アミダイト法
により合成されたオリゴヌクレオチド、ＡＴＧ　ＧＣＴ
　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＴＡＡＴＧＧ　ＴＴＧ　ＴＣＣを用
いて、アマジャム社（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　　ｐｉｅ、　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈ
ｉｒｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）のキット［オリゴヌクレオ
チド・グイレクチイツト・イン・ビトロ・ムタジェネシ
ス・システム（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　　ｉｎ　　ｖｉｔｒ。

ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　　ｓｙｓｔｅｍ）］を用いた
公知の部位特異的突然変異誘発法によって、１２４位か
ら１４６位のコドンを欠失させた上記ＩＦＮ−γをコー
ドするＤＮＡを取得する。本ＤＮＡを適当なプロモータ
ーの下流につないで適当な宿主に導入する。

必要によりＳＤ（シャインアンドダルガーノ）配列をプ
ロモーターの下流に挿入してもよい。

本発明の形質転換体は、上記のようにして得られる発現
用プラスミドを自体公知の方法［例、コーエンＳ、　Ｎ
、ら、プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｌ　Ｕ、Ｓ、Ａ、）、６９．２１１０
（１９７２）］で宿主を形質転換することにより製造す
ることができる。

形質転換される微生物の宿主としては、たとえば、エシ
ェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌、酵母などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア・コ
リ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）が挙げられ、具体的にはエシェリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）Ｋ　
１２　Ｄ　Ｈｌ［プロシーディンゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）６０　、　Ｉ　
６０（１９６８）］、ＪＭ−１０３［ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ。

（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９
　、３０９　（１９８１）］。

ＪＡ２２１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ）　１先ル、５１７（１９７Ｂ）］、Ｈ
Ｂ１０１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー、４１，４５９（１９６９）コ、Ｃ６００［ジエネ
ティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、３　９，４　４　０
（１９５４）コ、Ｎ４８３０［セル（Ｃａｌｌ）２５．
７１３（１９８１）］、Ｋ　−１２ＭＭ２９４［プロシ
ーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・
サイエンシズ７３．４１７４（１９７６）］などが挙げ
られる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられ
、具体的にはバチルス・サチルスＭＩ　Ｉ　ｌ　４（ジ
ーン。

旦、２５５（１９８３））、２０７−２１［ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５．８７（１９８４）コな
どが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツカロマイセス・セレビ
シアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）が挙げられ、具体的には、サツカロマイセス・
セレビシアエＡ　ｌ（２２［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７５　１９２９（１９７８）］、Ｘ５Ｂ５２−２３Ｃ［
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７７　２１７３（１９８０）］、］ＢＨ−６４１
ＡＡＴＣＣ２８３３９）、２０Ｂ−１２［Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ８５．　　　２３（１９７６）コ、　０Ｍ３　Ｃ−
２［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ。

７８　２２５８（１９８１）］などが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７［セル
（Ｃｅｌｌ）２３．　　ｌ　７５　　（１９８１）］。

Ｖ　ｅｒｏ［（日本臨床　２１．　１２０９（１９６３
）コ。

チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ［ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メデイシンＵ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）１０８．　９４５（１９８５）］、
ｖウスＬ細胞［ジャーナル・オブ・ナショナル・キャン
サー・インスティチュート（Ｊ、　Ｎａｔ、　Ｃａｎｃ
ｅｒｌｎｓｔ、）４．　１６５（１９４３）］、ヒトＦ
Ｌ細胞［プロシーディンゲスΦオブ・ザ・ソサエティ・
フォー・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・
メデイシン（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｔｐ、　　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｍｅｄ、）９±、　　５３２（１９５７）］、
ハムスターＣ細胞などが挙げられる。

ポリペプチド（Ｉ）は、上記形質転換体を培養し、培養
物中にポリペプチド（１）を生成、蓄積せしめ、これを
採取することにより製造することができる。

培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ
９培地［ミラー、Ｊｌ、エクスペリメンタ・イン・モレ
キュラー・ジエネテイクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、　４
３　ｔ　−４３３（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ｏｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、１
９７２）］、２ｘＹＴ培地［メシング、メソッド・イン
・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、　ｌ　Ｏｌ　、　２０　（１９８３）］
などが挙げられる。ここに、必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えてもよい。

培養は通常的１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要
により、通気や攪拌を加えてもよい。

λｃ　Ｉ　ｔｓリプレッサーと、λＰＬ−プロモーター
を含有する発現ベクターとを有する組み換え体を使用す
る場合には、培養は約３０℃〜３６℃の温度で行い、λ
ｃｌｔｓリプレッサーの不活化は約３７℃〜４２℃で行
うのが好ましい。またｒｅｃＡプロモーターをより効率
良く働かせるため、すなわちｒｅｃ　Ａ遺伝子発現抑制
機能を低下せしめるため、必要によりマイトマイシンＣ
，ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、紫外
線を照射してもよい。

培養後、公知の方法で菌体を集め、たとえば緩衝液に懸
濁したのち、たとえば、蛋白変性剤処理。

超音波処理やリゾチームなどの酵素処理を行って菌体を
破砕し、遠心分離など公知の方法によって上清を得る。

なお、Ｚが３以下のアミノ酸を有するポリペプチドもし
くはアミノ酸残基であるポリペプチド（Ｉ）は、当該Ｚ
よりも多くのアミノ酸を有する（例えば、Ｚが前記４個
すべてのアミノ酸を有するペプチド）ポリペプチド（１
）をコードする領域を有するＤＮＡを含有する形質転換
体を培養し、形質転換体中のプロテアーゼの作用をうけ
やすい条件下に精製することによっても製造することが
できる。

上記により得られる上清がらポリペプチド（１）を単離
するには、通常知られている蛋白質の精製法に従えばよ
い。とりわけＩＦ’Ｎ−γまたはポリペプチド（１）に
結合能を有する抗体、とりわけその抗体カラムを用いて
有利に精製することができ、たとえば＜　Ｇ　１ｕ−Ａ
　５ｐ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｙｒ−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｙｓ　
−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　５ｎ−Ｌ　ｅｕ
−Ｌ　ｙｓ−Ｌ　ｙｓ−Ｔ　ｙｒ−Ｐ　ｈｅ−Ａｓｎ−
Ａ　Ｉａ−Ｇ　１ｙ−ＯＨで示されるペプチドに対する
モノクローナル抗体の抗体カラム［特開昭６０−１０７
５６９号公報　実施例１１（ＷＮ７２−７６．５３モノ
クロ一ナル抗体の抗体カラム）］などが例示される。、 上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえばポ
リペプチド（１）含有物を中性付近の緩衝液、たとえば
リン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カラ
ムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したの
ち、ポリペプチド（１）を溶出する。溶出液としては、
弱酸性溶液たとえば酢酸溶液、ポリエチレングリコール
を含む溶液。

ポリペプチド（１）にくらべ抗体により結合し易いペプ
チドを含む溶液、高濃度塩溶液などおよびこれらの組み
合わせ溶液などが用いられ、ポリペプチド（１）の分解
をあまり促進しないものが好ましい。

カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。

必要により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行う
ことができる。

ポリペプチド（１）において、Ｘが結合手であるポリペ
プチドとＸがＭｅｔであるそれとの混合物として得ても
よい。

また、ポリペプチド（１）においてＮ末端アミノ酸がＧ
ｌｎのときは、それが＜　Ｇ　ｌｕであるポリペプチド
（１）との混合物として得られることもある。

該混合物はそのままでも以下に記載の目的に使用できる
が、必要により、例えば上記精製操作の後、加熱または
弱酸（例、希酢酸）処理を行うことによりＮ末端アミノ
酸がｐＧ　ｌｕであるポリペプチド（１）に導くことが
できる。

このようにして得られるポリペプチド（Ｉ）のなかでも
ＸがＭｅｔ、　ｙがＧｌｎであるポリペプチド（１）が
好ましく、さらに好ましい具体例としては、たとえば後
述の実施例で得られるポリペプチド［ｄｅｓ　−Ｃｙｓ
　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、　ｄｅｓ　−Ｓｅｒ　−・・−
−ポリペプチド［ｄｅｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃ
ｙｓ、　ｄｅｓ　−ポリペプチド［ｄｅｓ　−Ｃｙｓ　
−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ、　ｄｅｓ　−などが挙げられる
。

ここで得られるポリペプチド（１）溶液は透析に付し、
必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることができ
る。凍結乾燥に際しては、ソルビト−ル、マンニトール
、デキストロース、マルトース。

グリセロールなどの安定剤を加えることができる。

かくして得られるポリペプチド（１）は、ｒＩＦＮ−γ
活性を有し、しかもＣｙｓを有しないため、二虫化や多
量化を起こしにくく安定であるため、有利に医薬品等と
して使用できるものである。

本発明のポリペプチド（Ｉ）は、ヒト羊膜由来ＷＩＳＨ
細胞に対する水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）の細胞変
性効果阻止試験によるウィルス活性測定において１０６
υ／＋ｎｇ以上の比活性を有するポリペプチドに精製す
ることができ、公知のｒｌＦＮ−γ［グレイ、ｐ、ｗ、
ら、前出コや天然由来の■ＦＮ−γ（−ｔｙｐｅ　２　
Ｉ　ＦＮ）［サルビンら、ジャーナル・オブ・ナショナ
ル・キャンサー・インスチチュート（Ｊ、　　Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、　５
５　、１２３３（１９７５）］と同様の目的に同様の用
法により使用できる。

本発明のポリペプチド（１）は、抗ウィルス、抗腫瘍、
細胞増殖抑制、免疫増強作用を示し、しかもその毒性は
低く、抗原性もない。

従って、本発明のポリペプチド（Ｉ）は、抗ウィルス剤
、抗腫瘍剤、細胞増殖抑制剤、免疫増強剤などとして、
ウィルス性疾患、腫瘍、免疫低下疾患を有する温血哺乳
動物（例、マウス、ラット、ネコ、犬。

羊、ヤギ、牛、ヒトなど）のこれら疾患の予防、治療に
用いることができる。

本発明のポリペプチド（［）は滅菌水、ヒト血清アルブ
ミン（ＩＳＡ）、生理食塩水その他公知の生理学的に許
容される担体と混合することができ、非経口的は又は局
所に投与することができる。たとえば、その１日投与量
は、約２千〜２００万ユニツト／　ｋｇ、好ましくは、
約８万〜８０万ユニツト／ｋｇを、静注または筋注など
により非経口的に投与することができる。

本発明のポリペプチド（１）を含有する製剤は、塩、希
釈剤、アジュバント、他の担体、バッファー。

結合剤、界面活性剤１．保存剤のような生理的に許容さ
れる他の活性成分も含有していてもよい。非経口的投与
製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との
懸澗液アンプル、または生理学的に許容される希釈液で
用事希釈して使用しうる滅菌粉末（通常ポリペプチド（
Ｉ）溶液を凍結乾燥して得られる）アンプルとして提供
される。・艶朋 後述の実施例および参考例から明らかなように、本発明
のポリペプチド（［）は顕著なＩＦＮ−γ活性を示し、
本発明のポリペプチド（１）に最大の■ＦＮ−γ活性が
存在する。

実施例 以下、実施例および参考例により本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

本明細書および図面において、アミノ酸、ペプチド、保
護基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、それ
らはＩ　Ｕ　Ｐ　Ａ　Ｃ−Ｉ　Ｕ　Ｂ　（Ｃｏｍｍｉｓ
ｓｉｏｎｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃ
ｌａｔｕｒｅ）による略号あるいは当該分野における慣
用略号に基づくものであり、その例を第１表に挙げる。

また、アミノ酸などに関し光学異性体がありうる場合は
、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

第１表 ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ　　：
デオキシシチジン三すン酸ＡＴＰ　　：アデノシン三リ
ン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ｃｒｙ　　ニゲリシン Ａｌａ　　：アラニン Ｖａｌ　　：バリン Ｌｅｕ：ロイシン １１ｅ　：イソロイシン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ　　：スレオニン Ｍｅｔ　　＋メチオニン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ａｓｐ　　：アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　：リジン Ａｒｇ　　：アルギニン Ｈｉｓ　　・ヒスチジン Ｐｈｅ　　：フェニールアラニン Ｔｙｒ　　：チロシン Ｔｒｐ：）リプトファン Ｐｒｏニブロリン Ａｓｎ　　：アスパラギン Ｇｌｎ　　：グルタミン ＜ＧＬｕ：ピログルタミン酸 本明細書におけるポリペプチド（１）のユニット（Ｕ）
は、Ｊ　ＲＵ　（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃ
ｅ　Ｕｎｉｔ）であり、その−１定法は次に示される。

すなわち、ヒト羊膜由来のＦＬ細胞に対するシンドビス
　ウィルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）の細胞変性
効果阻止試験により、目的とする標品およびユニット（
Ｕ）の確定した国内標準品（Ｊａｐａｎ　５ｔａｎｄａ
ｒｄ）の細胞変性効果阻止能を測定し、それらの比率か
ら抗ウィルス活性（Ｕ／ｄ）を求めた。さらに、タンパ
ク濃度（ｍｇ／蔵）の値をもとにして比活性（Ｕ／ｍｇ
）を算出した。

なお、上記のＪｒｔＵで示されたユニットは、特開昭５
９−１８６９９５号公報（ヨーロッパ特許公開第１１０
０４４号公報に対応する。）に記載のユニット（Ｕ）の
１／６．４に相当する。

なお、下記実施例に開示している形質転換体エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｔｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｄ　
ＨＩ　／ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ／ｐｌＧＴ−１２３，エ
シェリヒア・コリ　ＤＨＩ／ｐＲＫ２４８ｃ［ｔｓ／ｐ
ｌ　ＧＴ−１２４およびエシェリヒア・コリ　ＤＨＩ／
ｐｒ’ｔＫ２４８ｃｌ　ｔｓ／ｐｌ　ＧＴ　−１２５は
、昭和６２年９月１日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ
）に寄託番号ＩＦ０　１４６４７．ＩＰｏ　　１４６４
ｇおよびＩＦＯ１４６４９としてそれぞれ寄託され、ま
た昭和６２年９月９日から通商産業省工業技術院微生物
工業研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１
４７４，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４７５およびＦＥＲＭ　
　ＢＰ−１４７６としてそれぞれ寄託されている。

一方、下記参考例に開示している形質転換体エシェリヒ
ア・コリ　Ｎ４８３０／ｐＩＧＴ−１２６は、昭和６１
年１２月１９日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄
託番号ＩＦＯ１４５５７として寄託され、また昭和６１
年１２月２５日から通商産業省工業技術院微生物工業研
究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥｒ（Ｍ　　Ｐ−９１１３
として寄託されている。

実施例１（形質転換体の製造） ＩＦＮ−γ発現プラスミドルＬ　Ｃ２（ＲＰ　Ｃ公開第
１５４３１６号公報Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｅｘａｍｐｌ
ｅ　４　）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＩＦＮ−γ
遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を分取した。この断片を、
ＥｃｏＲ［消化したＭ１３ファージ由来のＤＮＡ、ｍｐ
１９にＴＡ−ＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、大腸菌
ＪＭ１０３［メシングら、ヌクレイツク・アンラド・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）　９　
、３０９（１９８１）］に形質導入した。得られたＭ−
１３フアージのプラークよりＩＦＮ−γ遣云子のマイナ
ス鎖をファージ粒子中に含むものを選択し、ＤＮＡを抽
出精製することによって、単＠ＤＮＡｍｐ１９−　Ｉ　
ＧＴ（−）を得た。□ この単鎖ＤＮＡ及びリン酸アミダイト法により合成した
オリゴヌクレオチド（ａ）〜（Ｃ）：Ｃａ）　　Ａ　Ｔ
　Ｇ　Ｇ　ＣＴ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　
Ｔ　Ｇ　Ｇ　ＴＴ　Ｇ　Ｔ　ＣＣ、（ｂ）　　Ｇ　ＣＴ
　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　ＣＧ　ＴＡ　Ａ　Ｔ　Ｇ
　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　ＣＣ、（Ｃ）　　Ｇ　Ａ　Ａ　
ＣＴ　Ｇ　ＴＣＧＣＣＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＴＣＣを用
いて、アマジャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　　Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ　　ｐｌｃ。

Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、　　Ｅｎｇｌａｎｄ
）のキット［オリゴヌクレオチド・ダイレクチイツト・
イン・ビトロ・ムタジエネシス・システムコを用いた公
知の方法により部位特異的突然変異誘発を行なった。な
お、上記合成オリゴヌクレオチドは遺伝子の不用部分を
欠損させ、（ａ）は１２３位、（ｂ）は１２４位、（Ｃ
）は１．２５位までのＩＦ’Ｎ−γの配列をそれぞれ有
するものとなるように設計したらのである（第２図参照
）。

上記キットの指示に従ってＤＮＡ操作の後、大腸菌ＪＭ
−１０３をトランスフォーメーシコンすることによって
得られたプラークより、大腸菌ＪＭ−１０３をホストと
してファージを培養し、培養液中のファージ粒子より単
鎖ＤＮＡを、ホストの菌体中より二重鎖ＤＮＡをそれぞ
れ取得した。

単鎖ＤＮＡを用いて変異部位の塩基配列を決定し、それ
ぞれ変異を確認した。二重鎖ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化することによって、変異したＩＦＮ−γ遺伝子
のＤＮＡ断片をそれぞれ単離することができた。これら
のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した　ｐＬ　
Ｃ２のλＰＬプロモーターの下流にそれぞれ挿入した（
第１図参照）。

一方、大腸菌ＤＨＩ株にλＰＬプロモーターの温度感受
性リプレッサー遺伝子をもったプラスミド［ｐＲＫ　２
４８ｃｌ　ｔｓ：ハンスーウリヒら、メソッズ・イン・
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌ、）６８，４８２（１９７９）コをマニアティスらに
よる手順書しモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　ｌｏｎｉｎｇ）、（１９８２）、　Ｃｏ１ｄ
　　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ］に従って形質転換した株Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＨ１／りｌＫ２４８ｃＩ　ｔｓを樹立した
。本株を、上記ＤＮＡによって、同方法に従ってそれぞ
れ形質転換し、目的のポリペプチド［ｄｅｓ　−ｒＦＮ
−γをコードする発現プラスミド　ｐｌＧＴ−１２３を
保持する形質転換体エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅ
ｒｔｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　　ＤＨＩ／ｐＲＫ２４８
ｃｌｔｓ／ｐＩ　ＣＡＴ　−１２３（Ｉ　ＦＯ１４６４
７、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４７４）、ポリラスミドｐＩ
ＧＴ−１２４を保持する形質転換体エシェリヒア・コリ
　ＤＨ！　／ｐＲＫ　　２４８ｃｒｔｓ／１）ＩＧＴ−
１２４（ＩＰＯ１４６４８゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４７
５）、およびポリペブチミドｐｌ　ＧＴ−１２５を保持
する形質転換体エシェリヒア・コリ　ＤＨ１／ｐＲＫ２
４８ｃｌｔｓ／ｐ［Ｃ；Ｔ−１２５（ＩＦＯ１４６４９
，Ｆ’ＥＲＭＢＰ−１４７６）がそれぞれ得られた。

実施例２（形質転換体の培養） 実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ　Ｄ
１４１／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ／ｐｌＧＴ−１２３（Ｉ
ＦＯ１４６４７，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４７４）、エシ
ェリヒア・コリ　ＤＨＩ／ｐＲＫ２　４　８ｃｌｔｓ／
ｐｌ　　ＧＴ　−１２４（Ｉ　　ＦＯ１４６４８、ＰＥ
ＲＭ　　ＢＰ−１４７５）およびエシェリヒア・コリ　
ＤＨｌ／ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ／ｐＩＧＴ−１２５（Ｉ
ＦＯ１４６４９，ＦＥＲＭＢＰ−１４７６）を、５０　
μｇ／ｄ（７）７　ンピシリンを含む１．６％バクト　
トリプトン、１％イースト　エキストラクト、ｏ、５％
ＮａＣ１よりなる２ＸＴＹ培地で、３０℃にてそれぞれ
一夜培養し、飽和培養液を得た。これを２ＸＴＹ培地で
３倍に希釈し、４２℃で更に５時間培養し、遠心分離に
より菌体養集めた。菌体は、それぞれ使用時まで一８０
℃に凍結保存した。

実施例３（ポリペプチドの精製） 実施例２の方法で得られた凍結菌体５０ｇを７Ｍ塩酸グ
アニジンを含むホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐ［−１７゛
、２）４８！に懸濁し、４℃で１時間攪拌したのち２２
，０００ｘｇで３０分間遠心分離にかけてそれぞれ上清
５７ｄを得た。これらの上清を、１Ｍ尿素を含んだ１３
７＋ｎＭ塩化ナトリウム。

２．７ｍＭ塩化カリウム、８．１ｍＭリン酸二ナトリウ
ムおよび１．５ｓ＋Ｍリン酸−カリウムからなる緩衝液
（ｐＨ７，４）（以下ＰＢＳと略す）で１４倍に希釈し
、抗体カラム（ＷＮγ２−７６．５３．カラム容量１４
ｄ）に流速４０ｄ／時間でかけた。そののち、１Ｍ尿素
を含むＰＢＳ５０７１１２でカラムを洗浄し、ついで２
Ｍ塩酸グアニジンを含む２０ＩＩＩＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出ｄｅｓ−８ｅｒ　−−・・
・−ＧｌｎコＩＦ’Ｎ−７，ポリペプチド［ｄｅｓ　−
Ｃｙｓ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ、　ｄｅｓ　−Ｐ　ｒ。

−・・・・−〇ｉｎ］ＩＰＮ−γおよびボリペブチド［
ｄｅｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、　ｄｅｓ　−
Ａ　ｌａ　−・・・・−〇Ｉｎ］ＩＦＮ−γを含む画分
３０蔵をそれぞれ得た。

これらの両分をあらかじめ２Ｍ塩酸グアニジンを含む２
５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６、０）で平衡化
したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）のカ
ラム（５，Ｏｘ５１ｃｍ、カラム容量１０００Ｔｎ１）
にかけ、同一緩衝液で溶出してポリペプチド［ｄｅｓ−
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、　ｄｅｓ−９ｅｒ　−−−−
−−Ｇｌｎ］Ｉ　ＦＮ−７，ポリペプチド［ｄｅｓｌ　
　　２　　３　　　　１２５ −　Ｃｙｓ−、Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、ｄｅｓ　−Ｐｒｏ　
−・−書・−Ｇｌｎ］ＩＦＮ−７およびポリペプチド［
ｄｅｓ　−−Ｇｌｎ］ＩＦＮ−γを含む画分３７旙をそ
れぞれ得た。

これらの両分を２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，０）２２に対して４℃で１日透析し、透析外液を置
換してさらに１日透析した。そののち、ＹＭ−５１［ｉ
を用いてＤｉａｆｌｏ（アミコン社製）で濃縮し、アク
ロディスクフィルターを通して、５．３旙の標品をそれ
ぞれ得た。ウシ血清アルブミンを標準液としてＬｏｗｒ
Ｙ法［ローリ−ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリーＵ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、１９
３，２６５（１９５１）］で測定した総タンパク量は、
ポリペプチド［ｄｅｓ　−−Ｇｌｎ］［ＦＮ−７が７　
、９　ｍｇｓポリペプチド［ｄｅｓｌ４６ −ＧｌｎコＩＦＮ−７が１６．７ｍｇ、ポリペプチド１
　　　　２　　　　３　　　　　　　１２Ｂ［ｄｅｓ　
−Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、　ｄｅｓ　−Ａｌａ　
−−−−−−Ｇｌｎ］　　ＩＦＮ−７が１５．６ｍｇで
あった。

これらの標品を　Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉの方法［ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、　　２２７．６８０（１９７０）
コに準じてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析したと
ころ、分子量約　１４，０００の位置に単一バンドが検
出された（第３図参照）。第３図において、ｌは分子量
マーカー（ホスホリラーゼＢ、　９２，５００．ウシ血
清アルブミン、６６．２００．オブアルプミン。

４５．０００；カルボニックアンヒドラーゼ。

３１．０００．ダイズトリプシンインヒビター。

２１．５００．リゾチーム、１４，４００）の、２およ
び３は後述の参考例で得られたポリペブチド［ｄｅｓ　
−Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、　ｄｅｓ　−Ｌｙｓ　
−−−・・−〇ｉｎ］ＩＦＮ−γおよびポリペプチド［
ｄｅｓ１Ｆ’Ｎ−γの、４．５および６は前述のボリペ
ブ−ＧｌｎｌｌＦＮ−７の５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果をそ
れぞれ示す。

ここに、均一なポリペプチド［ｄｅｓ　−Ｃｙｓ　−一
γ（以下、ｒＦＮ−７４−１２３と略記することかある
）、ポリペプチド［ｄｅｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｙｒ（以
下、［ＦＮ−７４−１２４と略記するこｌ とがある）およびポリペプチド［ｄｅｓ　−ＣｙＳ−−
γ（以下、ＩＦＮ−７４−１２５と略記することがある
）の標品をそれぞれ得た。これらの標品について、以下
の諸性質を調べた。

（ａ）、アミノ酸組成： 上記で得られた標品７０μｇをそれぞれガラス製加水分
解用試験管にとり、４％チオグリコール酸を含む定沸点
塩酸を加えて、減圧下に封管したのち、１１０℃で２４
時間加水分解した。加水分解後、開管し、減圧下に塩酸
を除去し、残渣を０．０２Ｎ塩酸に溶解して日立製８３
５型アミノ酸分析計によりアミノ酸分析を実施した。そ
の結果を第２表に示す。

第２表 アミノ酸　　　　　１分子中の残基数８ＩＦＮ−γ　　
　ＩＦＮ−γ　　　［ＦＮ−γＴ　ｈｒ　　　　　　　
　３．９　　　　３．８　　　　３．７Ｓ　ｅｒ　　　
　　　　　６．６　　　　７．２　　　　６．８Ｇ　ｌ
ｕ／　Ｇ　Ｉｎ　　　　１７．３　　　１？、２　　　
１７ＪＰｒｏ　　　　　　　　１．０　　　　１．０　
　　　２．ＩＧ　ｌｙ　　　　　　　　３．２　　　　
３．２　　　　３．２Ａ　Ｉａ　　　　　　　　５．２
　　　　５．２　　　　５．３Ｖａｌ　　　　　　　　
７Ｊ　　　　　７．５　　　　７．６Ｍｅｔ　　　　　
　　　′Ａ、８　　　　３．８　　　　３．９１１ｅ　
　　　　　　　６．５　　　　６．５　　　　６．６Ｌ
　ｅｕ　　　　　　　　９．４　　　　９．５　　　　
９．５Ｔｙｒ　　　　　　　　４．８　　　　４．１　
　　　４．ＩＰｈｅ　　　　　　　　９．２　　　　９
Ｊ　　　　　９．２Ｌ　ｙｓ　　　　　　　１６．６　
　　１７．０　　　１７．ＩＨｉｓ　　　　　　　　１
．８　　　　１．８　　　　１．９Ａｒｇ　　　　　　
　　３．１　　　　３．１　　　　３．２’　　Ａｓｐ
／Ａｓｎの残基数を２０とした際の値である。

ｗ′米　−：　検出されず （ｂ）、Ｎ末端アミノ酸配列 標品１２μｇに気相プロテインシークエネータ−（アプ
ライド・バイオシステムズ社製４７０Ａ型、アメリカ）
を用いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末端アミノ
酸配列をそれぞれ分析した。

フェニルチオヒダントインアミノ酸（ＰＴＨ−アミノ酸
）はミクロバック５Ｐ−ＯＤＳカラム（パリアン社製、
アメリカ）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより
同定した。各ステップで検出されたＰ　Ｔ　Ｈ−アミノ
酸を第３表に示す。

第３表 （ｃ）、Ｃ末端アミノ酸： 標品２２０μｇをそれぞれガラス製ヒドラジン分解用試
験管にとり、無水ヒドラジン０．０５ｄを加えて減圧下
に封管したのち、１００℃で６時間加熱した。得られた
ヒドラジン分解物を凍結乾燥したのち、蒸留水に溶解し
た。この溶液にベンズアルデヒドを添加し、室温で１時
間攪拌し、遠心分離を行なったのち、上清を得た。この
上清を凍結乾燥し、日立製８３５型アミノ酸分析計によ
りアミノ酸分析を実施した。その結果、Ｉ　ＦＮ−１４
−１２３，ＩＦＮ−１４−１２４，ＩＦＮ−γ　４−１
２５について、それぞれロイシン。

セリン、プロリンのみが検出された。

（ｄ）、抗ウィルス活性： ＩＦＮ−７４−１２３，ＩＦＮ−７４−１２４、ＩＦＮ
−７４−１２５について、それぞれ！４．５ｘ１０’、
９．８７ｘｌＯ’、１２，１ｘ１０”Ｕ／ｍｇタンパク
質であった。

後述の参考例で得られたＩＦＮ−７４−１２１、■Ｆ’
Ｎ−７４−１２６，ＩＦＮ−γ　４−１２７と抗ウィル
ス活性について比較すると第４表のとおりである。

第４表 第４表から、ＩＦＮ−７４−１２３，ＩＦＮ−７４−＋
２４ｊＦＮ−７４−１２５が顕著な抗ウィルス活性を示
すことが明らかである。

参考例１（形質転換体の製造） 実施例１で得られた単鎖ＤＮＡｍｐｌ　９−　Ｉ　ＧＴ
（−）及びリン酸アミダイト法によって合成したオリゴ
ヌクレオチド（ｄ）：（ｄ）ＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＡ
ＧＡＡＡＡＣＡＧＧを用いて、以下の部位特異的突然変
異誘発［シラーら、メソッズ・イン・エンザイモロジ−
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、　
ｌ　Ｏ０。

４６ｇ（＋９８３）］を行なった。

一本鎖ＤＮＡと合成オリゴヌクレオチド（ｄ）との間に
、二重鎖を形成させ、続いてＤＮＡポリメラーゼクレノ
断片及びＤＮＡリガーゼを用いて、二重鎖閉環状ＤＮＡ
を作成した。このＤＮＡを制限酵素ＥＣ０ＲＩで消化す
ることによって、ＩＦ’Ｎ−γ遺伝子の変異したプラス
鎖を含むＤＮＡ断片を単離することができた。このＤＮ
Ａ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したｐＬ　Ｃ２のλ
ＰＬプロモーターの下流に挿入した。一方、大腸菌ＤＨ
Ｉ株にλＰＬプロモーターの温度感受性リプレッサー遺
伝子をもったプラスミド［ｐＲＫ２４８ｃｌｔＳ；ハン
スーウリヒら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　６８．
４８２（１９７９）］をマニアナイスらによる手順書［
モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）。

（１９８２）、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］に従って形質転換し
た株Ｅ、　ｃｏｌｔ　　ＤＨＩ／ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ
を樹立した。本枕を上記ＤＮＡによって、同方法に従っ
て形質転換した。

得られた形質転換コロニーの中から、ポリペプチド［ｄ
ｅｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ、ｄｅｓ　−Ａ
　ｌａ　−−・・・−〇ｌｎ］ＩＦＮ−γを発現して０
る株を選択した。

この株が含有するプラスミド中でＩＦＮ−γをコードす
る部分は、式［１１］において、Ｙ′はＣＡＧでＺ′は
（５’　）ＧＣＴ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　　ＴＣＧ　　
ＣＡＡ　　ｃｃＡ（３’）でそれぞれ示される塩基配列
であることが確認され、目的のボリペプチド［ｄｅｓ　
−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ、ｄｅｓ　−Ａ　ｌａ
　−−−・・−ＧＩｎ］ＩＦＮ−γをコードする発現プ
ラスミド　ｐｌＧＴ−１２６が構築された。

このプラスミドを用いて、大腸菌Ｎ４８３０［’Ｊ−ド
、セル（Ｃｅｌｌ）２５，７１３（１９８１）］を形質
転換し形質転換体エシェリヒア・コリＮ４８３０／ＩＧ
Ｔ−１２６（ＩＦＯ１４５５７，ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１
１３）を得た。

参考例２（形質転換体の製造） 実施例１で得た単鎖ＤＮＡｍｐｌ　９−　ＩＧＴ（−）
及びリン酸アミダイト法によって合成したオリゴヌクレ
オチド（ｅ）　〜（ｆ）：（ｅ）Ｔ　ｃ　ａ　ｃ　ＣＡ
　ａ　ＣＡ　ＧＣＴＴＡＡＴＧＧＴＴＧＴＣＣ，（ｆ）
ＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＧＧを用いて
、実施例１と同様にしてポリペプチド［ｄｅｓ　−ＣＹ
Ｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、ｄｅｓ−Ｇｌｕ　−・・・・−Ｇ
ｌｎ］Ｉ　ＦＮ−γをコードする発現プラスミドｐｉ　
ＧＴ−１２１を保持する形質転換体エシェリヒア・コリ
ＤＨＩ／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ／ｐｌＧＴ−１２１゜−
Ｌｙｓ　−・−・・−Ｇｌｎ］Ｉ　ＦＮ−７をコードす
る発現プラスミドｐｒＧＴ−１２７を保持する形質転換
体エシェリヒア・コリ　Ｄ　Ｉ−１１／ｐＲＫ２４８ｃ
ｌｔｓ／ｐｉ　ＧＴ　−１２７がそれぞれ得られた。

参考例３（形質転換体の培養およびポリペプチドの精製
） 参考例１および参考例２で得られた形質転換体エシェリ
ヒア・コリ　ＤＨＩ／Ｉ）ＲＫ２４８ｃｌｔｓ／ｐＩＧ
Ｔ−１２１，エシェリヒア参コリ　ＤＩ−１１／ｐＲＫ
２４８ｃｌｔｓ／Ｉ）Ｉ　ＧＴ−１２７およびエシェリ
ヒア・コリＮ４８３０／Ｉ）ＩＧＴ−１２６（Ｉ　Ｆ’
Ｏｌ　４５５７．ＦＥＲＭ　Ｐ−９１１３）を、それぞ
れ実施例２と同様の方法により培養し、遠心分離により
菌体を集めた。これらの菌体から、それぞれ実施例３と
同様の方法により精製してポリペプチド［ｄｅｓ　−Ｃ
ｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ、ｄｅｓ　−ＩＦＮ−γを取
得した。

これらの標品を実施例３に記載の方法によりドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）によって分析したと分子量約１４，０００
の位置に単一バンドが検出された（第３図参照）。

は単一バンドが得られたが、抗ウィルス活性は検出され
なかった。

ＩＦＮ−１４−１２６と略記することがある）ＩＦＮ−
７４−１２７と略記することがある）の標品について、
以下の諸性質を調べた。

（ａ）、アミノ酸組成： 実施例３に記載の方法によりアミノ酸分析を実施した。

その結果を第５表に示す。

（以　下　余　白） 第５表 アミノ酸　　　１分子中の残基数１ １ＦＮ−γ　　　ＩＦＮ−１ Ａｓｐ／Ａｓｎ　　　　２０　　　　２０Ｔｈｒ　　　
　　　　　３．９　　　　３．８Ｓｅｒ　　　　　　　
　８．２　　　　７．６Ｇ　ｌｕ／　Ｇ　ｉｎ　　　　
Ｌ７．２　　　　ｉｆ！、９Ｐｒｏ　　　　　　　　２
．０　　　　２．０ｃｒｙ　　　　　　　　３．１　　
　　３．５Ａ　ｌａ　　　　　　　　６．３　　　　７
．３Ｖ　ａｌ　　　　　　　　７．５　　　　７．８Ｍ
ｅｔ　　　　　　　　４．０　　　　３．７Ｅ　ｌｅ　
　　　　　　　６．６　　　　６．０Ｌｅｕ　　　　　
　　　９．３　　　　８．８Ｔｙｒ　　　　　　　　４
．１　　　　　：１．９Ｐｈｅ　　　　　　　　９．４
　　　　９．１Ｌｙｓ　　　　　　　１６．１　　　１
６．３ＨＩｓ　　　　　　　　１．８　　　　１．８Ａ
ｒｇ　　　　　　　　３．１　　　　３．０Ｔｒｐ　　
　　　　　　Ｏ，６−”″ る。

１″′　−二　検出されず （ｂ）、Ｎ末端アミノ酸配列 実施例３に記載の方法によりＮ末端アミノ酸配列を分析
した。その結果を第６表に示す。

第６表 （ｃ）、Ｃ末端アミノ酸： 実施例３に記載の方法によりカルボキシル末端アミノ酸
を同定したところ、ＩＦＮ−７４−１２６、ＩＦＮ−７
４−１２７について、いずれもアラニンのみが検出され
た。

（ｄ）、抗ウィルス活性： ＩＦＮ−７４−１２６，Ｉ　ＦＮ−７４−＋２７につい
て、それぞれ３．３　ｘ　ｌ　Ｏ”、２．６　ｘ１０’
Ｕ／ｍｇタンパク質であった。

発明の効果 本発明のポリペプチド（Ｉ）は、第４図に示されるイン
タクトなＩＦＮ−γ・より強い抗ウィルス作用、抗腫瘍
作用、免疫増強作用等を有し、安定であるので医薬品等
として有利に使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に示したプラスミドＩ）ＩＧＴ−１
２３の構築図を示す。（→は［Ｆ’Ｎ−γ遺伝子を示す
。−へ−　は変異点を示す。）第２図は、実施例１で用
いる単鎖ＤＮＡｍｐ１９−ＩＧＴ（−）の塩基配列の一
部および実施例！で用いる合成オリゴヌクレオチドを示
す。（−は欠損部分を示す。＊＊＊は翻訳終止コドンを
示す。）第３図は、実施例３および参考例３で得られた
５ＤＳ−ＰＡＧＥのパターンを示す。 第４図は、ＩＦＮ−γのアミノ酸配列および本′−＜ ・・・　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　Ｔ
ＣＧａ）　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ ｂ）　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ ｃ）　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＧ 図 喝−−一　　　　　暑−■−一 ３　図 ？

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 【遺伝子配列があります】 ［式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を示し、ＸがＭｅｔの
   ときＹはＧｌｎまたは結合手を、Ｘが結合手のときＹは
   Ｇｌｎ，＜Ｇｌｕまたは結合手を、Ｚは（Ｎ）ＧｌｕＬ
   ｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ（Ｃ）で示されるペプチド鎖にお
   いてそのＮ末端から数えて１〜４個のアミノ酸もしくは
   ペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチド
   。
2. （２）ＸがＭｅｔ、ＹがＧｌｎである特許請求の範囲第
   １項記載のポリペプチド。
3. （３）式 【遺伝子配列があります】 ［式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を示し、ＸがＭｅｔの
   ときＹはＧｌｎまたは結合手を、Ｘが結合手のときＹは
   Ｇｌｎ，＜Ｇｌｕまたは結合手を、Ｚは（Ｎ）Ｇｌｕ　
   Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
   おいてそのＮ末端から数えて１〜４個のアミノ酸もしく
   はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
   ドをコードする領域を有するＤＮＡ。
4. （４）ＸがＭｅｔ、ＹがＧｌｎである特許請求の範囲第
   ３項記載のＤＮＡ。
5. （５）式 【遺伝子配列があります】 ［式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を示し、ＸがＭｅｔの
   ときＹはＧｌｎまたは結合手を、Ｘが結合手のときＹは
   Ｇｌｎ，＜Ｇｌｕまたは結合手を、Ｚは（Ｎ）Ｇｌｕ　
   Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
   おいてそのＮ末端から数えて１〜４個のアミノ酸もしく
   はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
   ドをコードする領域を有するＤＮＡを有するプラスミド
   。
6. （６）ＸがＭｅｔ、ＹがＧｌｎである特許請求の範囲第
   ５項記載のプラスミド。
7. （７）式 【遺伝子配列があります】 ［式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を示し、ＸがＭｅｔの
   ときＹはＧｌｎまたは結合手を、Ｘが結合手のときＹは
   Ｇｌｎ，＜Ｇｌｕまたは結合手を、Ｚは（Ｎ）Ｇｌｕ　
   Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
   おいてそのＮ末端から数えて１〜４個のアミノ酸もしく
   はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
   ドをコードする領域を有するＤＮＡを有するプラスミド
   を保持する形質転換体。
8. （８）ＸがＭｅｔ、ＹがＧｌｎである特許請求の範囲第
   ７項記載の形質転換体。
9. （９）式 【遺伝子配列があります】 ［式中、ＸはＭｅｔまたは結合手を示し、ＸがＭｅｔの
   ときＹはＧｌｎまたは結合手を、Ｘが結合手のときＹは
   Ｇｌｎ，＜Ｇｌｕまたは結合手を、Ｚは（Ｎ）Ｇｌｕ　
   Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
   おいてそのＮ末端から数えて１〜４個のアミノ酸もしく
   はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
   ドをコードする領域を有するＤＮＡを有するプラスミド
   を保持する形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ポ
   リペプチドを生成蓄積せしめ、これを採取することを特
   徴とする該ポリペプチドの製造法。
10. （１０）ＸがＭｅｔ、ＹがＧｌｎである特許請求の範囲
    第９項記載の製造法。