JPS6349098A - 均質な組換え免疫インタ−フエロン断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は絹換え成熟ヒト免疫インターフＴ−［１ン全１
４　（アミノ酸配列を第１図に丞す）と比較してカルボ
キシ末端の６個〜１１　（１／ｌのアミノ酸を欠損する
均質な組換えヒト免疫インターフェロン断片に関する。 本発明はまた、上に定義する組換え免疫インターフェロ
ン断片をコードするヌクレオチドを含む複製可能な微生
物発現ベクター、それらの発現ベクターで形質転換した
微生物Ｊ３よび該インターフェロン断片および、該微生
物の：Ｊ！Ｊ製方法に関する。さらに本発明は、これら
の組換え免役インターフェロン断片の一つまたはそれ双
子を含む医薬品組成物およびこれらの組換え免疫インタ
ーフェロン断片および医薬品組成物の種々の疾病状態の
治療への使用に関する。 天然のヒト免疫インターフェロン（ＩＦＮ−γ）はリン
パ細胞の有糸分裂の刺激により！Ｌ産され、抗ウィルス
および抗増殖活着を示ず。本活性はｐＨ２に不安定であ
る。免疫インターフェロンの活性型は多量体、恐らく二
量体、三量体また（ま四は休′と考えられる（　Ｐｃ５
ｔｋａら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣＩ＋ａｍ、　２５８Ｓ
、９７０６−９７０９頁［１９８３年］）。 免疫インターフェロンはヒト遺伝子の中で、１６６個の
アミノ酸残塁より１戊るｎη駆棒体ポリペプチドコード
する単一遺伝子によりコードされていることがわかって
いる（　ＤＱｒＹｎＣｋら、Ｎｕｃｌｃｉｃ＾ｃｉｄｓ
　Ｒｃｓ、　１０巻、３６０５−３６１５頁し１９８２
年Ｊ）。翻訳後のブ［１ｔ？シングによりＮ末端配列が
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇ　ｌ　ｎ−・−・である１
４６個のアミノ酸から成るポリペプチドが生成すると考
えられでいる。 組換えＤ　Ｎ　Ａ技術の方法（例えばＨａｎｉａｔｉＳ
らの”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　　
１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｌ１ａｎｌＪａｌ　”　。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１
９８２年、参照）を用いて、これ６１４６個の７ミノ酸
より成る組換え免疫インターフェロンをコードする発現
ベクターが横２されている。これらの発現ベクターを微
生物宿主に導入すると、１４７１１ＸＩの７ミノ酎、即
ち、上述の１４６個のアミノ酸とＮ末端にさらにメチオ
ニンを有する紺換え免疫インターフエ［１ンボリベプチ
ドが合成される。追加のメチオニン（よメチオニンをコ
ードしているｍ　ＲＮ　Ａ　翻訳開始ジグ１ル△ＵＧに
出来する。親のヒト遺伝子中゛Ｃはこの翻訳開始ジグプ
ルはシグノ”ルベブヂドの前に位置している。このシグ
ナルペプチド（，１翻訳後のブ

【］セシングで翻訳開始
シグナルに出来するメチオニンと共に切断され、その結
！！！１４６周の７ミノ酸より成るメチオニンを持たな
い成熟免疫インターフェロン゛が得られる。原核細胞宿
主ではヒト免疫インターフェロン眞駆体ポリペプチドの
館のシグナルペプチドを正しい位置で切断りることが出
来ない。従って免疫インターフェロンを成熟型で発現す
るためには免疫インターフェロン遺伝子のシグナルペプ
チドをコードする配列を遺伝子操作により削除しなけれ
ばならない。成熟ポリペプチドのコード配列の０ぐ館の
ＡＴＧコドンのために組換えヒト免疫インターフェロン
ではＮ−末端にメチオニンが存在する。Ｎ−末端に余分
のメチオニンが付加しているにも拘わらず、また糖鎖が
ついていないにも拘らず、組換え免疫インターフェロン
はヒトリンパ球から甲離される免疫インター７エ０：／
ＣＧｒａＶら、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２９５　ａ、　！
３０３−　？ｉ　０８頁［１９８２年］）に匹敵するｐ
１１２不安定な抗ウィルスおよび抗増殖活着を示ず。後
にＲｉｎｄｅｒ−ｋｎｅｃｈｔら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈａｍ、２５９　’ｔＪ、　６７９０−６７９７頁［
１９８４年］）は誘尋ヒト末梢血管リンパ球から精製し
た免疫インターフ工ロンがＮ−末端のｃｙｓ−Ｔｙｒ−
ｃｙｓ−配列を欠さ゛、ピログルタミン酸残りを右する
１４３個のアミノ酸を含むポリペプチドより成ることを
示した。カルボキシ末９んは均質でないことが観察され
た。元の組換え免疫インターフェロン遺伝子のｉＴｉ　
次作によりこれらの１４３個のアミノ酸およびＮ−末端
に上述のメブオニンから成る成熟組換え免疫インターフ
ェロンをコードする発現ベクターがｖＩられる。ＣＶ　
Ｓ　−Ｔ　Ｖ　ｒ−ＣＶ　Ｓ−配列ヲ４する組換えヒト
免疫インターフエ［ｊンとこの配列を欠くものとの生物
活性を比較ザると、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−配列の欠
損により抗ウイルス活着が２償＾まることがわかった（
欧州特許出願Ｎα１４６　３５４、公開日１９８５年６
月２　（３Ｅｌ　）。 さらに欧州特許出願ＮＱ１４６　３５／１にＪ３いて、
成熟Ｉｌｉ’Ａえヒト免疫インターフェロンのトリプシ
ン部分消化により得られる免疫インターフェロン断片は
１３９または１４３個のアミノ酸を有するインターフェ
ロンポリペプチド（対照サンプル）の混合物（比９８　
：　２）と比較して抗ウィルス活性が低下した。例えば
、１２個のＣ−末端アミノ酸を欠損した１３３１個のア
ミノ酸から成る断片は上述の対照サンプルと比較して４
０−５０％の比活性に低下した。ざらにＣ−末端の３個
または６飼のアミノ酸を削除した断片は対照リンプルの
比活性のそれぞれ６−９または１％の活性であった。 従って上記欧州特許出願に例示される免疫インターフェ
ロン断片では活性が低下することから考えて、末端アミ
ノ酸を欠損する断片（よ仝で上述の対照リンプル或いは
Ｎ末端のｃ　ｙ　ｓ　−Ｔｙ　ｒ　−ＣｙＳ−配列を欠
肩する１４３個のアミノ酸より成る成熟組換えヒト免疫
インターフェロンよりも低い抗ウィルス活性を６するも
のと想像される。 ｔｊ、これまでのこの免疫インターフェロン断片はトリ
プシンによる部分消化によってのみ得られている。トリ
プシンはカルボニル！５が塩基性アミノ酸、通常（、太
アルギニンまたｔよりジン、に由来するペプチド結合の
加水分解を触媒する。トリプシンにより生成する個々の
断片のけは１１７ｉバ生成のために切断されるペプチド
結合のアクセスの程度に依存する。しかし、部分分解に
よって多種の断１１が生成し、それら混合物から特定の
所ハを均質に精製するのは、木質的に同じアミノ酸配列
を有し、大ぎさがアミノ酸数個の違いであるようなポリ
ペプチドを弁頭しなければならないため、非常に困難で
ある。このような条件下で欧州特許出願瀬１４６　３５
／１に２載される）−ＩＰＬ　Ｃによる分画ではイこに
例示されている免疫インターノエ［１ン断片を均！１に
精製するのに、即ち、大きさの貢なる池の免疫インター
フェロン斯ハを含有しないように得る！こめに不１分で
ある。さらに、トリプシンの特’／Ｉ！性のためにトリ
プシン消化によっては本発明によるしリン、グルタミン
、メ′、）Ａニン、ロイシンまたはフェニルアラニンの
五うなＪｌ：　ＰｉＡＪＪ性Ｃ−末端アミノ酸を右する
免疫インターフ１０ン断片を得ることは出来ない。この
叩出がら欧州特許出願Ｎａ１４６　３５４にはＣ−末端
にリジンまたｔよアルギニンを右するアミノ酸数１２５
，１２９．１３１および１３９の免疫インターフェロン
断片のみ例示されている。組換え１）ＮＡ技術による免
疫インターフェロン断片の、！ＩＶＪ法は上述の欧州特
許出願に一般的に記載されているが、第１図に示すアミ
ノ酸配列の最初のグルタミン残塁から数えて１３２から
１３７より成る相換えヒト免疫インターフェロン断片は
本発明によるｈ法によって初めて均！１に得られた。最
も驚くべきことに、これらの均質な組換え免疫インター
フェロン断片は全長の成熟組換え免疫インターフェロン
と比較して高い抗ウイルス比べ性を示す。同様に、免疫
インターフエ［Ｉンが承り他の生物活性（Ｔ’ｒｉｎｃ
ｈｉｅｒｉら、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｌ’ｏｄａ
ｙ　　５巻、１３１−１３６頁［１９Ｂ５年コの総説参
照）も成熟組換え免疫インターフェロンと比較して、本
発明による組換え免疫インターフェロン断片で増加して
いる。本発明による組換え免疫インターフェロン断片の
一つまたはそれ以上を含む医薬品組成物は種々の疾病状
態の治療に使用できる。疾病の例としては、ウィルス感
染、Ｉ′ｉイ［物疾患または慢性ＩＩＩ節リュすマチな
どがある。 このように、本発明は全長の成熟組換えヒト免疫インタ
ーフェロンと比較してＣ−末端の６個〜１１個のアミノ
酸が欠損した均質な組換え免疫インターフェロン断片を
提供する。さらに具体的には本発明は以下の式で示す均
質な組換え免疫インターフェロン断片を提供する。 但し、ＸはメチオニンでＹがグルタミン残塁か、Ｘが水
素でＹがグルタミンまたはピログルタミン酸９１ヰで、
￥が ３ｅｒ。 ３ｅｒ−Ｇｌｎ。 Ｓｅ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｍｅ　ｔ。 ５ｃｒ−Ｇｌ　　ｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ。 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅまたは ５ｅｒ−Ｇｌ　　ｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＡｒＱ
である。 これらの均質な組換え免疫インターフェロン断片は成熟
組換えヒト免疫インターフェロン、即ち、アミノ酸配列
の第一番目にグルタミンまたはピログルタミン酸を有す
る１４３個のアミノ酸より成る全長の組換え免疫インタ
ーフェロン、と比較して有意に高い生物活性を示す。第
一番目のアミノ酸がグルタミンの場合には、全長組換え
免疫インターフェロンは任意にメチオニン残りを１４４
番目のアミノ酸としてＮ−末端に含むことができる。 余分のメチオニン残基はメチオニンをコードＪるｍＲＮ
Ａ翻訳開始コドンのＡＵＧに由来する。 Ｅ、Ｃ０１１のような発現系ではこのメチオニンは必ず
しも取りはずされない。この余分なＮ−末端メチオニン
はほとんどのｆｌｆｉえポリペプチドの生物活性を劣化
させないことがわかっている（　Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、
　［Ｇｅｎｅ　ｕｎｄに１ｏｎｅ”中、２５５頁。 ＶＣＨ，ドイツ国つアインハイム［９８５年１）。 組換え免疫インターフェロンまたはその断片でＮ−末端
のメチオニンを除去すると新たなＮ−末端となるグルタ
ミン残基が閉環してピログルタミン酸の形をとるが、こ
れも生物活性を劣化しないと考えられている。本発明に
よる組換え免疫インターフェロン断片は多量体、好まし
くは二重体、三量体または四量体として存在することが
できる。 本発明による組換え免疫インターフェロン断片は木Ｙ１
的に同じ抗ウィルス活性を得るのに成熟組換えヒト免疫
インターフェロンの吊と比較して右忌に少ない聞の組換
え免疫インターフエロン断片と生理的に適合性のある旧
株とから成る医薬品組酸物を調製するのに使用て゛きる
。このような医薬品組成物は種々の疾病状態を治療する
のに有効である。水明凋古で開示される組換え免疫イン
ターフエ［Ｉン断片においてのアミンＭ置換、特に−叫
の７ミノＭ　Ｎ　Ｉｅｆｉが成熟組換えヒト免疫インタ
ーノコ、［Ｊンと比較して高い比７！竹を有する変種を
話力することが可能であるという事は］Ｉｌ′Ｉ′Ｍさ
れる。紺換えポリペプチドにそのような置換を導入１Ｊ
ることは技術の範囲内である。さらに一般的には本発明
は全長成熟組換えヒト免疫インターフェロンど比較して
Ｃ−末端で６へ・１１個の７ミノ酎を欠に１した全ての
組換え免疫インターフェロン断片或いはイの昨篩物およ
び７レリツク変異で全長成熟組換えヒト免疫インターフ
ェロンよりも強い生物油性を示すものを含むものである
。本発明はまた組換え免疫インターフェロン断片をコー
ドするヌクレｉ　ｆ−ド配列が発現調節配列に機能的に
結合して介イＪする複製可能な微生物発現ベクターＪ３
　Ｊ：びそのような発現ベクターで形質転換した微生物
を提供づる。さらに本発明は一種またはそれ以上の組換
え免疫インターフゴーロン断片Ｊ３よび生理的に適合性
の担体を含む医薬品組成物を提供する。本発明はさらに
、組換えＤＮＡ技術を用い１組換え免疫インターフェロ
ン断片を調製する方法、上述の複製可能な微生物発現ベ
クターで形質転換した微生物の調製方法およびそのよう
な組換え免疫インターフェロン断片を含有する医薬品組
成物の調製の方法に関する。またδらに本発明はこれら
のインターフェロン断片および対応する医薬品組成物の
種々疾病の治療への使用に関する。 本発明は以下に示す発明の訂細な記載とそれに伴なう図
面とを参考にしてざらに容易に理解されるものである。 図面では次の略号およびシンボルが用いられている。 Ｂ、Ｅ、Ｈ，Ｓ、Ｓａ、Ｓｃ、Ｘおよびｘｂはそれぞれ
制限醇ｉＢａｍｌ−１１，ＥｃｏＲＩ。 Ｈｉ　ｎｄｌ［ｌ、５ｐｈ１．Ｓａ　Ｉ　１．５ｃａＴ
。 Ｘ　＞＞　ｏ　ＩおよびＸｂａＩの１，７Ｊ所部位を示
−’ｊ。 第２図、４図および６から９図では、二＝コはｂｌａ、
１ａｃＩおよびｎｅｏ遺伝子のプロモークーを：　■耳
コはｂ　ｌ　ａ、Ｃａ　ｔ、ｎｅＯＪ３よびｌａｃ’Ｊ
のリボゾーム結合部位を；工：王はターミネータ−ｔｏ
およびＴ１を、二］コは制ｆｆＤ　ｌ−１Ｊ能ブ［：ｌ
　’ｌｌ−−ター／オペレーター囚子日子ＰＮ２５Ｘ１
ｏ＝＝］はリボゾーム結合部ｆｉ７ＲＢｓＩＩ−。 ５ｐｈＩを：→はこのりボゾーム結合部位の制御下の＝
１−ド領域を：＝−１１ＤＮＡ複製に必要な領域（ｒｅ
ｐ　Ｉ　）を：■１訃はジヒドロｌ）！ｆレダクターぜ
（ｄｈｒｒ）、クロラムフェニコールアレチルトランス
フ１ラーゼ（Ｃａｔ）、β−ラクタマーピ（ｂ　ｌ　ａ
）−，１ａｃレプレツサー（ｌａｃＩ）、ネオマイシン
　ホスフォトランスフ■ラーＬ’　（ｎｅｏ）およびイ
ンターフエ［」ンーγ（ｒＦＮ−γ）の］−ド領域を示
す。−第１図 Ｎ−末端のｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−を欠損している成
熟組換えｌ：１・免疫インターフェロンのアミノ酸配列
およびそれをコードするヌクレオチド配列を示す。組換
え免疫インターフェロン断片のＩ！４築に用い／：１Ｉ
ｉｆＩ部位を下線で示す。釘；核細胞の翻訳＃１始シグ
ナルに由来するＮ−末端メヂオニンはカッコ内に示す。 第２図 プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳＩＩ、Ｓｐｈ■を図示した
ものである。 第３図 制御可能なプロモーター／オペレーター因子ＰＮ２５　
Ｘ１０’　リボ−シーム結合部位ＲＥ３　Ｓ　Ｉｆ　。 ５ｐｈＩ、ｄｈｆｒ遺伝了遺伝−ミネータ−ｔｏ、ｃａ
　ｔｌ伝子およびターミネータ「１を含むプラスミドｐ
ＤＳ８／ＲＢＳＩ１．５ｐｈＩのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断
片のヌクレオチド配列を示す。第２図に示したｉｌＪ限
エンドヌクレアーゼ部位には上線を施し、ジヒドロ葉酸
レダクタ−ぜポリペプチドをコードするＲＦ３ＳＩＩ、
５ｐｔ１１の制御下の領域を下線で示づ。ざらにｐＤｓ
８／ＲＢＳＩＩ。 ５ｐｈｌのｏ　Ｂ　Ｒ３２２山来の部分を図示し、数字
はｐＢ　Ｒ３２２のヌクレオチド配列（Ｊ、Ｇ。 ５ｕｔｃｌｉＨｅ、Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎＦＩＩａｒ
ｂｏｒ、　　Ｓｙｍｐ、　　（ｌｕａｎｔ。 Ｒｉｏｔ、　４３巻、７７−９０頁［１９７９年コ）を
表わす。 第４図 プラスミドｐ［）Ｍｌ、１．を図示したものである。 第５図 ｐＤＭＩ、１のＤＮＡ配列を示す。８１１４図に示す制
限エンドヌクレアーゼ部位を上線で示し、ネＡマイシン
　小スフオドランスフェラーゼ（ｎｅｏ）およびｌａｃ
レプレッサー（ｌａｃＩ）のコード領域を下線で示す。 第６図 Ｎ−末端にＣｙ　ｓ　−Ｔ　ｙ　ｒ　−Ｃｙ　ｓ−をイ
１する１４６１１７ａのアミノ酸より成る組換えヒトイ
ンターフェロンをコードする遺伝子を含有するプラスミ
ドｐＲＣ２３／、Ｉ　Ｆ　ｌ　＝９００より成熟組換え
ヒト免疫インターフェロン（ｒｌｒＮ−γ）を含むフラ
グメント１の構築および単Ｗｔを図示したちのて・ある
。 第７図 フラグメント１のｐ　Ｄ　Ｓ　８　／　ＲＢ　Ｓ　Ｈ。 ５ｐｈＩへの挿入によるｐＧ　ｌ−Ｓの構築を示づ。 ｐＧＬＳの図示の中でＳｃ　”はｏ　ｌ）　Ｓ　８　／
ＲＢＳＴ１．５ｐｈＩの３ｃａ　■切断部位に結合した
フラグメント１の位置を示す。 第８図 ｐＧＬｓの）（ｉｎｆ工断片およびト１ｉｎｆ−Ｈｉｎ
ｄｌ［［−アダプターＡ　（−６）　＋’　Ａ　（−８
）　。 およびＡ（−１１）を用いての３８の異なるＩＩえ免疫
インターフェロン断片をコードするＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ−フラグメント「（−６）、Ｆ　（−８）−お
よびＦ　（−１１＞の構築を図示したものである。Ｅｃ
ｏＲＩ−Ｈｉ　ｎｄｌＩ［−フラグメンｌ−Ｆ　（−７
）、　Ｆ　（−９）およびＦ（−１０）も同様に、Ｈｉ
　ｎｆＩ−Ｈｌｎｄｎｌ−アダプター ＧＴＣＡＴＴＴＣＧＡ を用いて横築される９翻訳の停止コドンを構成する配列
を１線で示す。 第９図 フラグメントＦ　（−６）、　Ｆ　（−８＞およびＦ（
−１１＞をｐＤｓ８／ＲＢＳＩ１．５ｐｈＩのＦｃ　ｏ
　ＲＩ−およびＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ−切断部位ニ挿入しＴ
７ラスミｔ’０ＩＦＮ−７（−６＞、’ＤＩＦＮ−γ（
−８）およびｐｌＦＮ−γ（−１１）の構築を図示した
ものである。フラグメントＦ（−７）、Ｆ　（＝９）お
上びＦ　（−１０＞もＩｒ＋１様に挿入してプラスミド
ｐｉＦＮ−γ（−７）。 ｐｌＦＮ−γ（−９）およびＯＩ　ＦＮ−γ（−１０）
を得る。 第１０図 ｐＧＬＳ、ｐｌＦＮ−γ（−６）、　ｐ［ＦＮ−γ（−
７）、ｐｌＦＮ−γ（−８）、ｐｌＦＮ−・γ（〜９＞
、ｐＩＦＮ−γ（−１０）およびｐＩ　Ｆ　Ｎ−γ（−
１１）の発現によりそれぞれ得られる遺伝子産物ｒｌｌ
”Ｎ−γ、ＩＦＮ−γ（−６）、ＩＦＮ−γ（〜７’）
、ＩＦＮ−γ（−８）、　　ＩＦＮ−一γ　（−９Ｌ、
　　ＩＦＮ−γ（−１０）およびＩＦＮ−γ（−１１＞
のアミノ酸配列を示す。（１３０ａａ）１１１１位から
１３０位までの１３０個のアミノＲ（第１図参照）を示
す。 第１１図 成熟ヒト免疫インターフェロンおよびヒトインターフェ
ロン断片の５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による
分析結梁を示寸。ａ、ｂ、ｃおＪ。 び６列（第１１ａ図のＡ　）　１３よび１から９９１（
第１１ｂ図）はｐＤＭｌ、１およびさらに以下に示す発
現ベクターを保心するＥ、　Ｃｏ　ｌ　ｉ　　Ｍｉ　５
１１１ｒｃ！の溶菌物である。 発現ベクター　　　　第１１ａ図　　第１１ｂ図列　　
　　　　　　　　　列 ＤＧＬＳ　　　　　　　　　　　　　　　　ａ　　　　
　　　　　　１．　９ｐ　ＩＦＮ　−γ　（−１１＞　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｐ　ＩＦＮ
　−γ　（−５）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３ＤＩＦＮ　−γ　（−６）　　　　　　　ｂ　
　　　　　　　　　　　４ｐｌＦＮ−７（−８）　　　
　　　　ｃ　　　　　　　　　　　　５ＤＩＦＮ　−γ
　（−９）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６ｐ　ＩＦＮ　−γ　（−１０）　　　　　　−７ｐ　
ＩＦＮ　−γ　（−１１）　　　　　　ｄ　　　　　　
　　　　　　８ａ、ｂ、ｃおよびｄ列（第１１ａ図Ｂ）
および１０〜１７列並びに２０列（第１１ｂ図）はそれ
ぞｈａ、ｂ、ｃおよびｄ（第１１ａ図Ａ　）　、ｒ＞よ
び１〜９列（第１１ｂ図）の溶菌物から中鎖した精製イ
ンターフェロンポリペプチドを示す１部分缶内分解によ
り得られたヒト免疫インターフ」ニロン断片ＩＦＮ−γ
（−１４）およびＩＦＮ−γ（−１８）はそれぞれ１８
および１９列に示ず。 ＭＷ（第１１ａ図）およびＭ（第１１ｂ図）は１４．４
ｋｄ、　２１．５ｋｄ、　３１ｋｄ、　４５ｋｄ。 ６６．２に＋Ｊおよび９２．５ｋｄの分子量（１ｋｄ＝
ｉ、ｏｏｏダルトン）の蛋白質より成る蛋白分子ｆｉｌ
ｖ−カー（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）を表わす。 第１２図 ＩＦＮ−γのカルボキシル末端と抗ウィルス活性との相
関を示す。横軸のカルボキシル末端はＤａｙｈｏＨら（
“Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｒｎ　５ｅｑｕｅｎｃ
ｅ　ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ　”　、　Ｈ，０，Ｄａ
ｙｈｏＨ編集、第５巻、１７頁、　Ｎａｔｌ、　Ｂｉｏ
ｇ＋ｅｄ、　Ｒｃｓ、　Ｆｏｕｎｄ、米国メリーランド
州、シルバースプリング［１９７９年］）の記載する一
文字］−ドにより表わす。縦軸には全長成熟組換えヒト
免疫インターフェロン（“０”で表わり）と比較して横
軸に示ずカルボキシル末端のアミノ酸欠に１敗を右する
紺換え免疫インターフ−［ロン断片の抗ウィルス活性を
表わす。各点は少なくとも６回の別の測定の活性の平均
値を表わす。 棒は９５％信頼度に相当する範囲を示す。 第１３図 ＩＦＮ−γ（詳細は第１２図の説明を参照）カルボキシ
ル末端配列と抗ウィルス活性、マクロファージ活性化お
よびレセプター結合能との関係を示す。抗ウィルス活性
、マクロファージ活性化およびレセプター結合能は成熟
組換え免疫インターフェロンの値を１として相対的な鎮
を対数で示寸。 成熟組換え免疫インターフェロンのマクロファージ活性
化の絶対１直ｔよ５×１０５Ｕ／１１ｔｇである。 本発明の好ましい態様においては、組換え免疫インター
フェロン断片はヒト免疫インターフェロン遺伝子または
そのアレリックな変異種の全長コピーを含む適当なプラ
スミドを選択して調製される。ＩＩ　：Ｊ＜停！［コド
ンは免疫インターフェロンのＣ−末端をコードする領域
に、Ｓｍ１ｔｈらにより記載される（　”Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、３巻、１−３２頁［１
９８１年１．Ｊ、に　５ＯｔｌＯＷ、＾。 １１ｏ１１ａｃｎｄｃｒ編集、Ｐ！ｅｎｕＩ！＋　Ｐｒ
ｅｓｓ、　ニューヨーク）部位時７−変胃或いはこの領
域から適当なｔｉｌｌ限醇索断片を除去し、それを組換
え免疫インターフェロン断片の目的Ｃ−末端をコードす
る合成りＮＡ所ハと胃ぎ換えることにより導入すること
ができる。 侵名の方法の場合、最初のプラスミドの切断に好ましく
は二つの異なる制限エンドヌクレアーぜを用いて二個の
異なる接着末端を得る。次に相補接ｎ末端を含有する合
成りＮＡを正しい方向で挿入する。次のステップで組換
え免疫インターフェロン断片をコードするＤＮＡ配列を
、複製開始点、プ［］モーターまたプロモーター−オペ
レーター、およびリボゾーム結合部位（Ｒ８Ｓ）をコー
ドする配列より成る複製可能な微生物発現ベクター（挿
入する。適当な複製可能な発現ベクターはＨａｎｉａｔ
ｉｓら（前述）或いは本発明の実施例中に記載されてい
る。組換え免疫インターフェロン断片を発現調節配列と
機能的に結合して含有する好ましい複製可能な発現ベク
ターは組換え免疫インターフェロン断片のコード配列を
発現ベクターｐＤｓ８／ＰＢＳｆｆ、５ｐｈＩ　（１２
図）に挿入したｐｌＦＮ−γ（−６＞、　ｐＩＦＮ−γ
（−７）、ｐｌＦＮ−γ（−８＞、ｐｌＦＮ−γ（−９
）、ｐＴＦＮ−γ（−１０）およびＤ［ＦＮ−γ（−１
１）である。発現ベクターｐｒ）Ｓ８／Ｒ８５ＩＩ、５
ｐｈＴをプラスミドｐＤＭｌ、１　（第４図）で形ｔ１
転換したＦ。 ｃｏｌｉ菌株（Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉ　　Ｉ）Ｚ２９１　
＞である［、ｃｏｌｉ　　Ｍ２Ｓ（ｐＤＭＩ、１）に導
入する。プラスミドｐＤＭｉ１はｌａｃレプレツ１ノー
を］−ドしている。得られるＥ、ｃｏｌｉＭ１５株（ｐ
　Ｄ　Ｓ　８　／　Ｒ１３Ｓ　ｆｆ　、　Ｓ　ｏ　ｈ丁
；ＤＤＭＩ、１）は１９８６年８１１６０にＤｅｕｔｓ
ｃｈｅＳａｎ＋ｍ１ｕｎｏ　ｖｏｎ　Ｈｉｋｒｏｏｒｏ
ａｎｉｓｍｅｎ（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に寄託番目Ｄ　Ｓ　Ｍ
　３８０９として寄託されている。組換え免疫インター
フェロン断片ＩＦＮ〜γ（−６）、１ｌ−Ｎ−γ（−７
）、ＩＦＮ−γ（−８）。 ［ＦＮ−γ（−９）、ＩＦＮ−γ（−１０）およびＩＦ
Ｎ−γ（−１１）をコードする発現ベクターの構築の方
法は実ＩＭＰＡに詳しく記載されている。 これらの実施例に基づいて本発明の組換え免疫インター
フェロン断片を発現することの出来る発現ベクターを構
築することはこの分野の技術の範［１１１である。組換
え免疫インターフェロンＩｇｉハを発現することの出来
る複製可能な発現を次に適当＜Ｃ宿主９物に実施例中に
記載される方法によりまたＩＪ）４ａｎｉａｔｉＳら（
前述）により記載されるように導入する。使用する宿主
細胞により生成する組換え免疫インターフエ［１ン断片
は糖鎖が結合している場合としていない場合がある。好
ましい宿主生物どしてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ　（１％えばＭ１５株またはＷ３１１０株［△ＴＣ
ＣＮα２７３２５　］　）、ａａｃｌｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓなどがある。本発明で最も好ましい宿主生物
は上述のｐ、ｃｏｌｉ　　Ｍ１５株である。 本発明のポリペプチドの発現を行なうことの出来る生物
が得られると、本発明の方法は発現ベクターの構築の特
質および宿主の増殖特性により秤杆の１′ｉ法で実施で
きる。典型的にＬｉ、宿、ｔｍ胞を多聞の細胞が１７ら
れるような条件下で生育させる。 多トルの細胞が蓄積したら培地中の誘導剤またはデレブ
レッサー、或いは温度シフトににすＤＮＡ配列に挿入さ
れている：Ａ節配列を活性化してコード配列の転写およ
び翻Ｊ（を行なわυる。本弁明に於いては組換え免疫イ
ンターフェロン断片を］−ドする遺伝子の発現はｌａｃ
レプレッサーにより抑υ１されている。多量のｉｎが蓄
積したらイソプロピル−β−１つ一チオガラクトピラノ
シド（１Ｆ）丁Ｇ）の添加によりインターフ工［１ン遺
伝子をプレプレスする。組換え細胞により生産される蛋
白質はこの技術で周知の方法により細胞を溶菌すること
により放出される。本発明においては細胞の溶菌はグア
ニジンＪ冨酸で（ｊなうのが好ましい。 本発明の均質な絹換え免疫インターフェロン断片番よ、
硫酸アンモニウムにＪ：り沈でん、透析による脱塩（常
圧または真空下）、グル結合、り［ｌマドグラフィー、
調製用平板′ｙｒ−電烈゛市気泳仙、ゲル電気泳動、ら
速液体り［１マドグラフイー、イＡン交換りロマｈグラ
フィー、ゲル濾過および逆相クロマトグラフィー、アフ
イニディーク［１マドグラフイー等のような方ン人、或
いは七ツク［１−プルまたはボリク「」−ナル抗体を用
いて精製される。！４／られる均′ζ′ｉな組換え免疫
インターフェロン断片は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動また番゛１ＨＰＬＣ分析から７１１所して木
質的に他の蛋白質を含有しない。 組換え免疫インターフェロン断へは二品体、三閉体また
は四Ｍ体を形成できる。［］１ら、精製しに組換え免疫
インターフェロン断片は二個、三個または四個の断片の
組合せで存在ηることがある。 粘合の＋′を質は未だ明かではない。 組換え免疫インターフェロン断片１ＦＮ−γ（−６）、
ＩＦＮ−ｒ（〜７）、ＩＦＮ−γ（−８）、［ＦＮ−γ
（−９）、ＩＦＮ−γ（−１０＞およびＩＦＮ−γ（−
１１）の抗つィ／Ｌｚ　ス活性ハＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ
ら（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、３７　Ｗ、　　７５５−７５
８頁［１９８１年］）により記載されるように細胞市性
効宋の軽減にｌ、ｔづ＜＜１物情Ｍ測定により測定した
。ヒト羊膜ｉ胞（Ｆ　ｌ−一細胞）および５ｉｎｄｂｉ
ｓウイルスを用いた。サンプル１よ予めおよそ１０００
中旬／〆に希釈し、マイクロクイクープレートに二連ぐ
測定する。仝艮の成熟組換え免疫インターフエ［］ン（
配列は第１図）標品（ロット番号８５．２０　　ＳＸ−
プール）を４業標準として使用した。これをＮ１ト］の
対照ヒトインターフエＵンガンマー標準、ＮαＧＱ２３
−９０１−５３０に対して換ｎした。Ｎ１１」標準は３
．６８±０．３４Ｊｏｏ１０甲位／アンプル（ｎ＝３９
）の活性を有した。 結果は以下に示す第１表にまとめた。６値は少なくと６
１３回のｒくなる測定結果の平均を示す。 幾何平均値を統計的にｔ−テストで評価した。成熟ｌ１
ｌｆｉえ免疫インターフェロンと組換え免疫インク−ツ
ー［ロンＩ！７ｉハとの差は極めて有意（Ｐ＝９９％）
である。ＩＦＮ−γ（−６〉およびＩＦＮ−γ（−１１
）の活性の差も非常に大きい。ＩＦＮ−γ（−６）およ
びＩＦＮ−γ（−８）との間の差もイ１意である（　Ｆ
’　＝　９５％）。しかしｒ　Ｆ　Ｎ　−γ（−８）と
ＩＦＮ−γ（−１１）の間の活性は０意差がない。 第１表 抗ウイルス比活性 成熟組換え免疫インターフェ ロンｔ＃（ｒ　Ｉ　ＦＮ−７）　　　９．５ｘ１０６単
位／η組換え免疫インターフ■ ロン断ハ［ＦＮ−７（−６）　　　４、ｌＸ１０７１１
位／ｍｇ組換え免疫インターフェ ロン断片ＩＦＮ−γ（−８＞　　　５．９ｘ　１０７甲
位／η帽換え免疫インターフェ ロン断片１ｔ−Ｎ−γ（−１１）　　７．ＯＸ　１０７
甲位／Ｒｇ抗ウィルス活性の増加をさらに詳細に検問す
るためにざらに他の組換え免疫インターフェロン断片も
上述の通りにして１ＦＮ−γ（−４）および１１：Ｎ−
γ（−５〉を構築し、また全長成熟組換え免疫インター
フェロンのマウス上顎腺゛″△ｒ　ｇＣ１１プロテアー
ピによる部分分解によりＩ　ＦＮ−ｒ（−１４）を［１
した。本プロテアーゼはアルギニンのカルボキシル側で
特異的に蛋白質を分解する（　５ｃｈｅｎｋｅｉｎら、
　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 １８２巻、６４−７０頁［１９７７年］）。またｆＦＮ
−γ（−１８）はフィブリン分解酵素のプラスミンを用
いてＪ％ｌした。 これらのポリペプチドの抗ウイルス比活性を上述のよう
に測定した。第２表および第１２図より組１φえ免疫イ
ンターフェロン断片ＩＦＮ−γ（−８）、ＩＦＮ−γ（
−９）、ＩＦＮ−γ（−１０＞およびＩＦＮ−γ（−１
１）が成熟組換え免疫インターフエ［１ン或いは部分蛋
白分解により１りられた免疫インターフェロン断片Ｉ　
ＦＮ−γ（−ｉ４）およびＩＦＮ−γ（−１８）よりも
非常に高い抗ウイルス比活性を示ずことがわかる。 第２表 抗ウイルス比活性 （カッコ内は９５％信頼限界） ｒ　Ｉ　ＦＮ−７１，９１ｘｌＯ（１，３６刈０７−２
．６７刈ｏ７　＞ｒＩＦＮ−γ（−４）　　　２．８８
ｘ１０　　（２，１９ｘ１０−３．８０ｘ１０７）ｒｌ
ＦＮ−７（−５）　　　４．７９ｘ１０７（３，５４ｘ
１０７−６．４７刈ｏ７　＞ｒｌＦＮ−７（−６）　　
　３．３９ｘ１０（２，４６ｘ１０１−４．６６刈ｏ７
　＞ｒｌＦＮ−７（−８＞　　　７．０８ｘ１０（５，
０６ｘ１０７−９．９１刈ｏ７　＞ｒ　Ｉ　ＦＮ−７（
−９）　　　９．３３刈０７（６，６０Ｘ１０７−１．
３２　Ｘ１０８）ｒＩＦＮ−７（−１０）　　　８．３
２刈０１（６，７２Ｘ１０１−１．Ｑ３　Ｘ１０８）ｒ
ｌＦＮ−７（−１１）　　　６．３１Ｘ１０（４，９９
Ｘ１０７−７．９７Ｘ１０７）同様に免疫インターフェ
ロンＩＦＮ−γ（−８）。 ＩＦＮ−・γ（−９）、ＩＦＮ−γ（−１０）およびＩ
ＦＮ−γ（−１１）は非常に高い抗増殖活性Ｊ３よび免
役調節活性を示した。 抗増殖活性（ま敢射活性徨識したチミジンの細胞ＤＮＡ
の取り込みに対づる各種免疫インターフよりンの￥１１
害能を測定することにより調べられる。 ３種の悪性細胞株（Ｕ９３７．［３Ｓ１４．１．、Ｌｃ
１）ａ３よび１種の正常線繊芽細胞株（ΔＧ１５２３．
６−１０代継代）を使用した。切つ３７は骨髄性単球白
血病細胞株、Ｂ５１４は悪ｆ１冑髄腫患占由来、ＬＬＣ
Ｉは肺患賃由来である。細胞は９６穴のプレート中１０
％仔つシ胎児血清、１％し一グルタミン（２００ｍＨ）
　、１％ペニシリン（１００Ｕ／ｄ）−−ストレプトマ
イシン（１００μＬ：Ｊ／ｄ）、１％ＭピＭ−非必須ア
ミノ酸（１００（８）および１％ピルビン酸ナトリウム
（１００ｍＨ）を添加したｌ−？ＰＭ１１６，４０培地
に各生育曲線に依存したｍ度で植菌した：Ｕ９３７およ
びΔＧ　１５２３では１−当り２０，０００個の細胞、
［３８１４およびＬＬＣＩでは１１１ｄ！当り１．００
０個。細胞は２４時間付着きせる。次に成熟組換え免疫
インターフエ【」ン（ｒ　Ｉ　ＦＮ−γ）および・免疫
インターフェロン断片ＩＦＮ−γ（−１０）をそれぞれ
つ１ルに添加する。隘性対照は培地のみで処理し、陽性
対照としてアドリアマイシンを１０−８から１０−６Ｍ
の範囲の溌１哀で使用した。２日後に３１−１−チミジ
ンを最終、Ｉａ度１μＣｉ／つエルで添加する。さらに
１８時間イン４ユベートした後、ａ胞を集めてチミジン
の取り込みをｃａｒｒらの記Ｗａ　（Ｃｅ１１．１ｍｎ
＋ｕｎｏ１．５巻、２１−２９頁［１９７２年］）のよ
うにして測定した。ΔＧ１５２３細胞を用いた実験で成
熟組換え免疫インターフェロン（ｒｌＦＮ・−γ）と同
じ抗増殖活性を得るのに免疫インターフェロン断１″＋
’　ｌ　Ｆ　Ｎ−γ（−１０）は１４分の１の低い濃度
しか必要でないことがわかった。同様にＵ９３７．Ｂ５
１４およびＬＬＣＩ細胞を用いた場合にはｒＩＦＮ−γ
と同じ抗増殖活性を得るのにそれぞれ５分の１．３分の
１および６分の１の低い最のＩＦＮ−γ（−，１０）Ｌ
か必要でなかった。 免疫インターフェロンはいくつかの免疫調節機能を有Ｊ
ることか知られている。免疫インターフェロンはマクロ
ファージ活性化因子（ＭＡ　Ｆ　）の一つであるらしい
。マクロファージ活性化は２つの方法により測定された
。ｒａｌｍａｄｇｅら（［ｕｒ、　Ｊ。 Ｉｎｖｕｎｏｌ、　１６巻、１４７１−１４７７頁［１
９８６年１）に従って得られた正常ヒトマクロファージ
は水出バｌに記載される異なる免疫インターノ工［コン
により活性化された。酸化的破裂は過酸化物の放出の促
進としてＰｉｃｋらが記載する（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　４６巻、２１１−２２６頁［１９
８１年１）ように測定し、マクロファージの殺菌活性の
誘導はＰｅｃｋら（Ｊ、　Ｉｉｍｕｎｏｌ。 ＨＯｔｈＯｄＳ　８２巻、１３１−１４０Ｑ［１９８５
年］）により記載されるように測定した。免疫インター
フェロン（よ膜しけブタ−に結合することによりその免
疫−節償能を示すため、免疫調節活性は免疫インターフ
ェロンのそのししブタ−との結合に依存する。敢（ト）
活性標識した成熟組換え免疫インターフェロンおにび組
換え免疫インターフ工【コン断ｊ°１（Ｋｕｎｇら、　
Ｈｃｔｈ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＶ　　１１９巻、
２９６−３０１頁［１９８６年］）のインクーフエＵン
レセブターへの拮抗結合を Ｒａ５ｈｉｄｂｏ＋ｇｉら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、　　２６０８．８５１４−８５１９頁［１９８５年
］）により記載される通りに測定した。ト述の実験の結
果をまとめて第１３図に示づ一６Ｊ１常に高い抗ウィル
ス活性に加え、免疫インターフェロン断）’＋’　Ｉ　
Ｆ　Ｎ−γ（−８＞、　　ＩＦＮ−γ（−９）、ＩＦＮ
−７（−１０＞およびＩＦＮ−・γ（−１１）はマクロ
ファージ活性化およびレセプター結合活性も非常に増加
した。 新規組換え免疫インターフエ［１ン断ハを室温で数Ｅ１
間放置しＣも全長成熟組換え免疫インターフェロンで観
察されるような新しいピークがＨＰ　、Ｌ　Ｃ分析で出
現しないごとから、これらは高活性に加えて安定性もよ
いことがわかる。 本発明の精製組換え免疫インター”ノエロン断片或いは
それらの混合物は医薬組成物の調製に用いられる。これ
らの医薬組成物は成熟組換え免疫インターフェロンと比
較し又同じ抗ウィルス活性を得るのにより少ない吊の該
インターフェロン断片と生理的に適合した担体とを含イ
ｊする。この少ないｎｔというのは組換え免疫インター
ノエ［コン断片が示す有意に高い抗ウイルス比活性（単
位／ｍ９で表示）（第１表参照）に！ｊづくものである
。本発明の好ましい絹換え免疫インターフエロン断片で
は、この少ないｔｄは第１表に示す抗ウイルス比活性の
値を用いて旧のされる。成熟組換え免疫インターフエ［
ｌン（１００％として）と比較して同じ抗ウイルス比活
性を得るのに必要なｆｆｉはおよそ；組換え免疫インタ
ーフエ［１ン断）’ｌ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ（−６）で２３
％、 絹換え免疫インターフェロン断１°１ｌＦＮ−γ（−８
）−０１６％、 組換え免疫インターフェロン断片ＩＦＮ−γ（−１１）
で１４％である。第２表のデータを用いて同じような結
果が得られる。 医薬組成物は従来のいかなる耐湿でで６作製できる。例
えば；ａ）錠剤、丸薬、散剤、粒剤なとのような経「１
没与用の固体耐湿、ｂ）液体、シロップ、【ノ／Ｖ濁液
、］−リ４シルなどのような経口投り用の液剤、Ｃ）滅
菌溶液、け／ｖ濁液或いはＴマルジ３ンのような非経口
投与用の耐湿；およびｄ）溶液、け／Ｖ濁液、軟膏、ク
リーム、ゲル、微細粉末、エアロゾールなどのような局
所役り用の耐湿がある。 医薬調製物（よ滅菌されることもあり、または／　ｄ−
３よび保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調節
のための塩類および／または緩衝剤のような補助剤を含
有することらある。 非経口投与剤形は注入或いは注（ト）用溶液で静脈また
は筋肉注射され得るしの−Ｃある。これらの調製物は他
の薬効活性物質を含有することも出来る。 保存剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤などの他の添加剤す
医薬製造の容認された慣習に従って添加できる。 本発明によれば組換え免疫インターフェロン断片を含む
医薬組成物はウィルス感染、新生物疾患または慢性関節
リュウマヂの治療に使用される。 本発明による医薬組成物は医薬的に容認される経口、注
（ト）または局所組成物および方法で投与される。用済
ａ３よび投与回数は既知のインターフェロンで現在臨床
に応用されている量、！ｌｉ！型的には一日１０６単位
に対応する。本発明の医薬組成物は該組換え免疫インタ
ーフェロン断片と共に適合性の医薬的に容認される担体
物質を含有する。従来使用されているどんな担体物質も
利用できる。 ■］体物質として１よイｆｌまたは無機の不活担体物質
で、経口、経皮または非経口投与に適したものである。 適当な担体としては水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖
、でん粉、ステアリン酸マグネシウム、クルク、植物油
、ポリアルキレングリコール、黄色ワしリンなどがある
。さらに医薬組成物は他の薬効活性物質を含むことらあ
る。′Ａ香剤、保存剤、安定化剤、乳化剤、緩衝剤など
の添加物も医薬さり造の容認される慣習に従って添加で
きる。 本発明について一般的に記載したので、例示のＬｌ的で
以下に承り具体例を参考に本発明はさらによく理解され
るもので、特に記載しない限りこれらの具体例は本発明
を制限するものではない。 実施例１ 八　原Ｊ甲 成熟組換えヒト免疫インターフエ［１ンおよび本発明の
組換え免疫インク−′ノエロン断片の発現のためにｐＤ
Ｓ８／ＲＢＳＩ１．５ｐｈｒを選択した。 効率のにい発現のためにＦ記ベクターは発現調節配夕１
１として調節可能なブ［１′Ｅ−一ター／Ａベレーター
因子ｐ　　　ｘ　１Ｑ　（Ｓｔｊｉｂｃｒら、ＥＭＢＯ
Ｊ、３巻、３１４３−３１４８頁［１９８４年］）およ
びリボゾーム結合部位ＲＢＳＩＩ、８ｐｈＩを自行づる
。このリボゾーム結合部位はＥＥ、ｃｏｌｔファージ「
５ブＵモーターＰ　　　（ｌｔ、Ｇｅｎｔｚ　、博士論
文、ハイデルベルグ大学、西ドイツ［１９８４年］）の
制御下にあるリボゾーム結合部位に対応するＤＮＡ合成
から得られている。これらの発現シグナルの効率が高い
ために上述のベクターはプロモーター／ンベレーター因
子がＩａｃレプレッサーがオーベレーター内のＰ　　×
１０に結合することにより抑制されている時のみＥ、ｃ
ｏｌｉ中で安定して（！持される。ｌａｃレプレッサー
は１ａｃｌ遺伝子により＝１−ドされている。ＰＨ２５
×１０は十分楢のレブレツザー分子が存在する時のみ有
効に抑制される。従って変異プＩコモ−ターを含む１ａ
ｃＩ’アレルを用いてレプレッサー渭伝ｒの発現を高め
た。１ａｃＩＱ７レルはプラスミドｐＤＭＩ、１　（第
１１図）に合法れている。このプラスミド（まｌａｃＴ
ｍ仏子の池に選択マーカ−どじてカナンイシン耐性を呈
するｎｅｏ遺伝子を保右する。プラスミドｐＤＭＩ、１
は発現ベクターｐ　Ｄ　Ｓ　８　／　Ｒ１３Ｓ　ＩＩ　
、　Ｓ　ｏ　ｈ丁と適合性がある。ｐＤｓ８／ＲＩ″３
ＳＩＩ、５ｐｈｌをす木とした発現ベクター゛Ｃ形質転
換しようとするＥ。 ｃｏｌｉ細胞ｔ細胞用ベクターを安定に維持づ”るため
にｐＤＭｌ、１を保右していなければならない。 この系を用いた発現の誘導は目的の細胞濃度に達した時
に培地中に１１）　’ｒ　Ｇを添加することにより容易
に達成できる。 ＢプラスミドｐＤｓ８／を又ＢＳＩＩ、５ｐｈｌｐＤｓ
８／ＲＢＳＩ１．５ｐｈＩ　（第２図）中で制限上ンド
ヌクレアーＬ’ＸｂａｌおよびＸｈｏＩの間の、ＤＮＡ
複製複製上び細胞中でのプラスミド維持に必要な領域お
よびアンピシリン？ｉ＋４竹を♀するβ−ラククマーゼ
の遺伝子全体を含む部分はプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂ
ｏｌｉｖａｒら、　Ｇｅｎｅ２６　。 ９５−１１３頁［１９７７年］　：　５ｕｔｃｌｉＮｃ
　、前述）に由来する。プラスミドの残りの部分にｔま
調節可能なプロし一ター／オペレーター因子Ｐ　　　　
Ｘ　　　＜５ｔｊｉｂｃｒら２　前：Ｍ）、ＥｃｏＲＩ
／Ｎ２５　　　１（１ ３ａ　ｍ　ＨＩ断ｙ１の一部分であるリボゾーム結合部
位Ｒｔ３Ｓ１ｆ、５ｐｈｌ、マ・クスＡ　１−−３００
０のジヒドロＭ酸レダクターゼの］−ＦｆＩ域（Ｃｈａ
ｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ２７５Ｗ、６１７−６２４頁［１
９７８年］　：　Ｈａｓｔｅｒｓら、　Ｇｅｎａ２１ｆ
ｆ、　５９−６３Ｅｎ［１９８３年］＞、Ｅ、ｃｏｌｉ
ファージラムダのターミネータ−ｔｏ（Ａｃｈｗａｒｚ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ２７２巻、４１０−４１４頁［１９
７８年１）、プロモーターを含まないクロラムフエニ］
−ルアセヂルトランスフエラーピの遺伝子（Ｈａｒｃｏ
ｌ　ｉ　ら。 ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ１１０巻、１１−１４頁［
１９８０年１）Ｊ３よび［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ　ｒｒｎＢオペロン（Ｂｒｏｓｉｕｓら、　Ｊ、　
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　１４　ｓｉ、　１０７−１２
７真［１９８１Ｎ）のターミネーター−「１を含有して
いる。 Ｃ，プラスミドｐＤＭＩ　　１ プラスミドｐＤＭＩ、１　（第４図）はトランスボゾン
Ｔｎ５（Ｂｅｃｋら、　Ｇｃｎｅｌ　９巻、３２７−３
３６頁［９８２年１）由来のカナンイシン爾性を示すネ
オマイシンホスフオトランスフエラーピの遺伝子Ｊ３よ
びプロ七−ター変異Ｉ　ｑ（Ｃａ１ｏｓ。 Ｎａｔｕｒｅ２７４巻、　　７６２−７６５頁　［１９
７８年］）を持ったｌａｃレプレッサーをコードするｌ
ａｃＩｍ伝了（Ｆａｒａｂａｕｇｈ、　Ｎａｔｕｒｅ　
２７４巻。 ７６５−７６９頁［１９７８年］）を保有する。 さらにＤＤＭＩ、１はＥ、ｃｏｌｉ中Ｆ　（７）複Ｈオ
よび安定なＩｌｌ￥ｆに必要な情報を含むプラスミドｐ
ＡＣＹＣ１８４（Ｃｔ＋ａｎｇら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、　　１３４巻、１１／１１−１１５６頁［１
９７８年］）の領域を含有する。 実施例２ ＩＦＮ−γをコー゛づるブラスミぐ　Ｇ　１．、　Ｓの
Ｖ呆 へ原理 化学合成したオリゴヌクレオヂドを用いてＩＦＮ−γを
リボゾーム結合部位ＲＢ　Ｓ　ＩＩ　。 ５ｐｈＩに結合した（第６図）。Ｉ　Ｆ　Ｎ−γをコー
ドする断片を単離し、ｐ　Ｉ）　Ｓ　８　／　ｌ’（１
３Ｓ　ＩＩ　。 ５ｐｈＩに導入してプラスミドｐＧＬＳを得た（第７図
）。 合成オリゴヌクレオチド断ハは第６図に示づ。 オリゴメクレオチド自体は１９８６年５月２１日に公開
の欧州特許用１ｒｉＮαΔ１　１８１　４９１に記載さ
れる多千合成改を用い、支持体として調節ボアガラス（
ＣＰＧ）を使用して（Ｋｉｅｆｅｒら。 １ｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ、　３巻、６９−８３ｄ［１
９８５年１Ｈ５ｐｒｏａｔら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ、
１．ｃｔｔ、　　２４巻、５７７１−５７７４頁［１９
８３年］：＾ｄａｍｓら、Ｊ、八ｍ。 Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　１０５巻、６６１−６６３頁
し１９８３年］）同時に調製した。凍結乾燥したオリゴ
ヌクレオヂドを水の中で４℃１時間で溶解して１Ｑ　Ｑ
　ｎ　ｍｏｌｅ／ｄのＤＮ、１１度とする。 各ＡリゴヌクレＡチド１５０　ｐＩＩｌｏｌｅを１μｊ
！（７）［３２Ｐ］−Ａ’ｒＰ　（２Ｄｍｏｌｅｓ、　
５０００Ｃｉ　／１１ｍｏｌ）　、１　ｕ　　Ｔ４−ボ
リメクレＡチドキナーぜ（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ−ＢＲＬ、バ
ーピル）を用いて１０１１１の５０ｍＭ１−リス塩酸、
ｐＨ８，５，１０ｍＭＭＱＣｊ！２中で３３７℃１０分
間でり／Ｖ酸化する。 反応は１μｌの５　ｍ　Ｍ　　Ａ　Ｔ　Ｐを添加してチ
ェースし、反応液を６５℃７分間加熱して停止した。 １シスミドｐＲＣ２３／Ｉ　ＦＮ−９００（欧州１′ｒ
　ｉ＋Ｔ出願ＮａＡ２　９９　０８４，１９８４年１月
２５日公開）の４μＪをＤＮＡ濶度４００μ９／厩とし
、バーゼル市Ｇ　ｉ　ｂｃｏ−ＢｌでＬＪ、り市販され
るＩ”３　ＲＬ−”　Ｌ−１７緩函液（ｃｏｒｅ　ｂｕ
ｙｅｒ　）　”（５０ｍＭｔ−リス塩酸、ｐＨ１８，１
０ｍＭＭｃ＋Ｃｊ！　　、５０ｍＭ　　ＮａＣｊり中１
０中位のＮｄｅＩを用イテ全ｆｆ１２０μｆで３７℃１
時間消化Ｊる。消化（Ｇ　Ｄ　Ｎ八を−・回フェノール
抽出し、−回エーアル処理後エタノール沈でんを行なっ
てＩ！ｊられるベレットを５ｐｃｃｄ　−ｖａｅ　Ｑ縮
機で２分間乾燥する。ベレットを１゛４−リガーゼ緩衝
液（５０ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ７、８、１０ｍＭＭ　
（Ｊ　Ｃ１、１０ｍ　Ｍ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ　、　５００１
１　ＭＡ　Ｔ　Ｐ　）に溶Ｈする。１×リガーゼ緩衝液
中５ｔ）ｈＩ−ＮｄＯＩアダプター１（第６図）を含む
２５　ｐｍｏｌｃｓのりん酸化したＡリゴメクレオチド
を最終容（６２５μｌとなるよう添加する。ライゲーシ
ョンは、１μｌのＤＮＡ−リガーゼ（１ｗｅｉｓｓ−単
位、ベーリンガー、マンハイム）を用いて２２℃３時間
行なった。サンプルを６５℃７分間インキュベートして
反応を停止する。ＤＮＡをエタノール沈ぐんし、上述の
ように乾燥してから５０ｕ１のＮｃｏＩ消化緩衝液（５
０ｍｔＶｌトリスー塩酸、ｐＨ１８，１０ｍＭ　　Ｍｏ
Ｃｊ！　　、、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ３０ｍＭ　　ＫＣ
ｊりに□けん濁し、１０単位のＮｃｏＩ　（Ｂｔ又Ｌ−
Ｑｉｂｃｏ、バーゼル）を添加して３７℃１時間インキ
ュベート１Ｊ”る。制限酵素は６５℃７分間加熱しＣ不
活化する。 フェノール油出後、Ｄ　Ｎ　Ａを沈でんさせて乾燥する
。ベレットを２０μｌのフレナラ−緩衝液（５ｏｍＭト
リスー塩酸、ｐＨ１７，２，１０ｍＭＭ０８Ｏ４，１１
００ｕ　　ＤＴＴ）に溶解し、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰおよびｄＴＴＰを最終濃度が１０１００ｌ１全反
応液：　３０　／１１　）となるように添加する。フレ
ナラ酵素（１単位、ベーリンガー、マンハイム）を添加
し、２２℃で１時間インキュベートする。反応は２μｌ
の０．２５ＭＥＤＴΔを添加して停止する。反応液をフ
ェノールで一回抽出した後、ＤＮＡを上）木のように沈
でんさせ５ｐｈＩ消化緩自液（５０ｍＭトリス−塩酸、
ｐＨ１７，５，６ｍＭ　　ＭＯＣｌ　　、５０ｎ１Ｍ　
　Ｎ　Ｅｉ　Ｃ１、６ｍＭ　２−メルカプトエタノール
）にけん濁する。１０！！ｉ位の５ｐｈＴ（ＢＲＩ−−
Ｇ　ｉ　ｂｃｏ、バーゼル市）を添加後、サンプルを３
７℃で１時間インキコベートする。消化を６５℃で７分
間加熱することにより停車し、フェノール抽出を１回（
ｊなう。ＤＮＡを沈でんし、上述のＪ：うに乾燥する。 ＤＮＡベレットを１０μｍのゲル用緩衝液に溶解してＤ
ＮＡ断片を０．５×酢醇緩別液（４０ｍＭトリス−塩酸
、２０ｍＭＩ！１′￥′酸ナトリウム、２ｍＭ　　Ｅｌ
）ＴＡ、ｐＨ７，８＞を含む６％ポリアクリルアミドゲ
ルの電気泳動で分刻１する。１チジウムブ１］ミド（０
，５μｉ／成）で染色後３００ｎ　１１の紫外線でバン
ドを検出する。［ＦＮ−γをコードするＤＮＡのバンド
をメスでゲルから切り出す。マーカーＤＮＡはト１ａｅ
ｌＩ［（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ−Ｂ　ＲＬ　、バーゼル市）で
消化したファージφＸである。ゲルをＴＢＥ緩衝液（９
０ｍＭトリス−■Ｍ、　９０ｍＭｔｆｆｉｌＩＱ、３ｍ
Ｍ　　ＥＤＴΔ、ｐＨ１８，３）を含む０．７％アガロ
ースゲル中４Ｘ４Ｍのウェルに移す。つ土ルをＩＸＴ［
３Ｅ中０．７％アガロースで密封して均ｒｆＩな電場を
与える。サンプルの前に一枚のＮ　Ａ　４５１　（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ、　　Ｄａｓ
ｓｅｌ、　Ｂ　Ｒｌ）　）を挿入し、［’）　Ｎ　Ａを
膜上で３００Ｖ５分間泳動させる。ＤＮＡがのった膜を
水で洗い、２５０μｌの１．５Ｍ酢酸リチウム、５０ｒ
ＴＩＭトリスーＷ！１１２ｐＨ８おＪ：び１０ｍＭＥ　
Ｄ　ＴＡを含むエツベンドルノ管に移す。ｔ）Ｎ八を６
５℃２０分間、時々攪拌しながら溶出する。 膜片を管から取り除き、サンプルを予め１ＭトリスｐＨ
８，Ｏで飽和した２００μｍのフェノールで一回抽出す
るリンプルを１２．　ＯＯＯｒｐｍ　１０分間小型遠心
分離義で遠心し、ＤＮＡを含有する上澄を取る。１〕Ｎ
△を２０μｌの５Ｍ酢酢酸リブハムにび４４０μｌのイ
ソブ１］パノールを添加し−Ｃドライアイス上１０分間
沈′Ｃ−／υさせる。ベレットをε３０％Ｊ−クノール
で洗滌後真空乾燥づる。ベレツ１〜を１０μｆのＴＥ−
緩ｍＭ（１０ｍＭｔ−リスｍＭｐｏ７．＋３．１ｍＭ　
　ＥＤｒ△）に溶解りる。 Ｄ、プラスミドｐＤｓε３／Ｒ［３ＳＩ１．５ｐｈＴの
調製 ｌ　ｐｍｏｌｅ　（７）プラスミドｐＤｓ８／ＲＢＳＩ
Ｉ。 Ｓｐｈ　Ｉ　（４００μｒＩ／ｍ）を゛」ア緩衝液パ中
５０μｍの容量で１０単位の５ｐｈＩを用いて３７℃１
時間消化する。１単位のＳ　Ｃａ　Ｌを添加して消化を
３０分ＩＩ！１続ける。消化後サンプルを抽出ノール油
出１回行ない、エーテル処ｌｌｌ！後上述と同様に沈で
／ｕ　シて乾燥づる。ベレットを１単位の゛仔つシ小腸
ホスファター１２（ＣＩＰ、ベーリンガー・マンハイム
）を含有する２０μｍの）ＩＶｆＪ液（５０ｍＭｉ−リ
ス塩酸、ｐＨ８）に溶解する。酵素を加熱失活させて蛋
白を除去復（上記参照）ＤＮＡをエタノール沈で／Ｖす
る。ＤＮＡを再けん濁してからｃａｔ遺伝子、ターミネ
ーター−「１．複製開始点、ｂ　ｌ　ａ３１伝了、ブ１
コモ−ターＰＭ２５×１０およびリボゾーム結合部ｆＱ
Ｒ１３ｓｎ、ＳＤＩ”ＩＩを含有するｐ［）Ｓ８／Ｐ、
Ｂ５ｌ１．５ｐｈＩのＳ　ｃ　ａ　、Ｉ　／Ｓｐｈ　Ｉ
断片を１膜％７ガロースゲル中の電気泳動でＩｌ′ＩＷ
Ｂシ、電気泳動ににすＮ　Ａ　４５膜に移す。上述と同
様にして溶出し、エタノール沈でんして１００μｌのＴ
Ｅ緩！１ｉＷＩに再け／υ濁する。およそ１膜ｍｏ　Ｉ
のベクター断片を得る。 ［、プラスミドＤ　Ｇ　Ｌ　Ｓの組立て２μ夕のベクタ
ー断片を２μｍの挿入ＤＮＡ（フラグメント１）と、ｌ
　ｌｌＩ　Ｄ　ＮΔ−リガー口（１ｖｃｉｓｓ単位、ベ
ーリンガーマンハイム）を含む全δＭ２０μｌを含有す
るリガーＵ緩衝液中で結合する。ライゲーションは２２
℃で３時間行なう。反応はサンプルを６５℃７分間加熱
することにより停止する。形質転換に用いるＥ、ｃｏｌ
ｉＭ１５の感応細胞はＨａｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ　、６３巻、３２６−３３１頁
［１９７９年］）を用いて調製づる。ライグー２８２反
応液をプラスミドｌ）ＤＭＩ、１を保有する［。 ｃｏｌｉＭ１５感応細鞄の融解物２００μｌに添加りる
３、→ノンプルは氷上３０分間放置し、続いて４２℃２
分間インキュベートする。０．５ｄの１１３３８地を添
加後、す゛ンブルを３７℃の温浴中で９０分間インキュ
ベートする。次に細胞を１２゜０００　ｒｐｍで３０秒
小型遠心懇で遠心づる。上澄液を除ムし、ベレットを１
００μｌの［Ｂ培地にけｌｖ濁して１００ｆｌＬｊ／ｄ
のアンピシリンと２５μＬＪ／ｄのカナマイシン含有の
ｌ−Ｂ−寒天平板上にまく。プレートは３７℃で一晩イ
ン１：ユベー１−する。対照ライゲーションによる形質
転換では転換株は得られなかった。フラグメント１との
ライゲーションではおよそ２００の転換株が得られた。 各コロニーをつまようじで吊って１００μ７／ｄのアン
ピシリンおよび２５μｇ／Ｉｄのカナマイシン含イｒの
１０成のＬＢ培地を含む試験管に移植し、３７℃で１２
時間強い振どう下で生育させる。細胞を８．ＯＯＯｒｐ
ｍ　１０分間の遠心て集める。プラスミドｌ）　Ｎ　Ａ
はＢｉｒｎｂｏｉｍらの方法（ｌｕＣＩｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　７巻、１５１３−１５２３頁［１９７９
年］）により抽出Ｊる。 最終ベレットを２００μｌのＴＥ−緩衝液に溶解づる。 ４１１１をＳ　ｐｈ　Ｉ　ａ３よびＸｂａｌで１′１！
ｊ化してターミネータ−Ｔ１を含むＩＦＮ−γ遺伝子含
有衛片を遊離する。分析した全てのＤＮＡＩナンブルは
予想通りのａ３よそＩＫｂの大きさの断片を遊離した。 これらのプラスミドをＤ　Ｇ　Ｌ　Ｓど命名した。 Ｆ、ｌ：）ＧＬ−８にり１］−ン化されたＩＦＮ−伝−
の配列分析 ｐ　Ｇ　Ｌ　ＳにｉｌシいＩＦＮ−γ配が１が挿入され
ていることを確めるｌこめに二重ｔＡＯ状プラスミドＤ
ＮＡを［γ−”２Ｐ］−ＡＴＰで末端標識したブライマ
ーを用いて配列決定した。ブライ？　−ＩユｐＤｓ８／
ＲＢＳＩ１．５ｐｈＩの１９９−２１８位のヌクレオチ
ドを含イ１し、従ってｓｐｈ工部位のＡＴＧの６個前の
ヌクレオチドで終っている。 中鎖したＤＮＡの１５μｍ　（０，３膜ｍｏｌ）をエタ
ノール沈でんし、８０％エタノールで一回洗籟する。ベ
レットを５ｏｃｃｄ　ｖａｃ　ｍ縮機で２分間乾燥した
侵、８μｍの１／４　１’Ｅ−緩衝液に溶解づる。 ［γ−３２Ｐ］−△ＴＰで末端標識したブライマー２　
ｐｍｏｌを添加後サンプルを９５°Ｃで５分間加熱して
から４２℃の温浴中に５分間置く。ここで配列決定のた
めＳａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、　＋’ｔａｔ＋、＾ｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　、７４５５．５４６３−５４６７ＭＭｌ９７フ
イ「］）により記載されるジデオキシ法を改良して使用
した。成用活性標識したプライマーを使用づるの′Ｃ″
鎖延長反応には非標識のチオ−１−シリボヌクレＡブト
三つ／ｌ［（ｄＸＴＰ）を用いる貞が異なる。 配列決定の結束、免役インターフェロン遺伝子のプラス
ミドｏ　Ｇ　Ｌ　Ｓに計画どおりに１．Ｉ’ｉ人されて
いることがわかった。 実施例３ ＾、原理 目的の位置に翻訳停止コドンを含む化学合成したオリゴ
ヌクレオチドをＩ　Ｉ”　Ｎ−γ遺伝子の特有のＨ＋　
ｎ　ｆ　Ｉ認識部位に連結しく第８図）、最終的に断片
Ｆ　（−６）、　Ｆ　（−７）、　Ｆ　（−８）　。 Ｆ　（−９＞、Ｆ　（−１０）およびＦ（−１１）を得
る。これらの断片をｐＤｓ８／ＲＢＳＩ［。 ５ｐｈｌに連結してプラスミドｐＩＦＮ−γ（−６）、
ｐｌＦＮ−γ（−７＞、ｐ［ＦＮ−γ（−８）、ＤＩＦ
Ｎ−γ（−９）、ｐＩＦＮ−γ＜−ｉ　ｏ　＞およびｐ
ｌＦＮ−γ（−１１）を得る。 置】 ３　ｐｍｏｌｅのプラスミドｔ）ＧＬＳを゛コア緩ｍ　
ａ　”中５０μｌの容量で１５単位のＨｉ　ｎ　ｆ’　
Ｉを用いて３７℃１時間演化づる（第８図）。消化後制
限酵素を６５℃７分間加熱して失活させ、反応液をフェ
ノール抽出、エーテル洗滌、沈でんの後上述のように乾
燥する。ペレットを５０μノのリガーピ緩！７液に溶解
づる。アダプター△（−６）、Ａ（−７）、Ａ　　（−
８）、Ａ　　（−９）、Ａ　　（−１０）Ｊ３よび△（
−１１）より成るオリゴヌクレオチドを実施例２Ｂに開
成する方法で合成づる。１０１００ｐ　ｌ　ｅのり／υ
酸化アダプターをそれぞれ１０μｍのｔ」ｉ　ｎ　ｆ　
Ｉ消化プラスミドｐＧＬｓに添加する。 リガーげ緩衝液および１単位のＴ４−１）ＮＡリガーげ
を添加してライゲーションを全椿２５μｌにて２２℃１
２時間行なう。反応は嗜ナンブルを６５℃で７分間加熱
して停止する。エタノール沈でん後ＤＮＡベレットを゛
°コア緩衝液″に再けｌυ濁し、５０μｍの容量ｌで１
５単（）１のＥｃｏＲＩおよび２０甲位のＨｉ　ｎ　ｄ
　ＩＩＩで３７℃２時間消化する。力１１熱失活、フェ
ノール抽出、エーテル処理および−［クノール沈でんの
後、サンプルを１０μｌのゲル用緩衝液に溶解し″Ｃ６
％ポリアクリルアミドゲルにて電気法ｖ１を行なう。Ｄ
ＮＡバンドは３００ｎｍの紫外線トで検出する。ｌ　Ｆ
　Ｎ−γ遺伝子を含イＴするバンドをゲルから切り出し
、１πｉ述のようにしてＮ△４５膜上で電気泳動する使
用したマーカーＤＮＡはト＋ａｅｍで消化したファージ
φＸＤＮＡである。ＤＮＡを前述のとおり溶出してそれ
ぞれＦ（−６）、ト（−７）、　Ｆ’　（−８）、　Ｆ
１９）、Ｆ　（−１０）むよびＦ（−１１）と命名した
。 Ｃ，プラスミドｐＤ　Ｓ　８　／　ＲＢＳ　ＩＩ　、　
Ｓ　ｐ　ｈ　Ｉの調製 第９図に示１ように、２　ｐｍｏｌｅのプラスミドｐＩ
）　Ｓ　８　／　ＲＢ　Ｓ　ＩＩ　、　Ｓ　ｐｈ　Ｉを
仝吊５０μｌで１０甲位のＥＣ０ＲＪおよび１０単位の
Ｈｉｎｄ■を用いて３７℃１時間演化する。酵素を加熱
失活しエタノール沈でんＩ、ＤＮＡペレットを１０μｌ
のゲル用緩衝液に溶解する。１％アガロースゲル電気泳
動にか【プた後、ターミネータ−ｔｏ。 ｃａｔ遺伝子、ターミネータ−１゛１．複製開始点、ｂ
　ｌ　ａｌ伝了およびプロモーターＦ）　　　Ｘ　　を
ゲＮ２５　１０ ルから切り出し℃前ｊ本のようにして溶出する。最終Ｄ
　Ｎ　Ａペレツ１〜は５０ｕｊ！のりガーゼ緩衝液に溶
解ツる。 ０．１ラスミドｐ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ（−６＞、　ｐＩ　
ＦＮ−−７）　　　ｐＩ　　Ｆ　Ｎ　−−８）　　　　
　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−１０μｍのベクター断片と実施例３Ｂ
で得られた各単離ＩｇｉＪｉＦ　（６）、　Ｆ　（７）
。 Ｆ　（−８＞、Ｆ　（−９）、Ｆ　（−１０）およびＦ
（−１１）の１／２憤とをそれぞれ２０μｌ容ｔｉでＴ
４リガーゼを用いて２２℃３時間ライゲーションを行な
う。同時に挿入Ｄ　Ｎ　Ａなしの対照反応も行なう。サ
ンプルを６５℃７分間加熱して反応を停止する。 形質転換はプラスミドｐＤＭ１．１を保有するＥ、ｃｏ
ｌｉ　　Ｍ２Ｓを用いてＨｏｒｒｉｓｏｎ　（前コホ）
の記載する方法で行なう。細胞を上述のとおり１００１
１９／ｒｄのアンピシリンおよび２５μ’ｊ　／　ｔｒ
ｒＱのカナマイシン含有のＬ　Ｂ−寒天培地にプレート
する。平板は３７℃で一晩インキユベートする。 予想どおり対照ライゲーションでは形質転換株は得られ
なかった。ベクター１）ＮＡに各断片を加えたライゲー
ションではおよそ５００〜１０００個のコロニーが得ら
れた。各二ｊ口二一をつまようじを用いて吊り上げ、−
ｈ　述の通りにＬＢ−培地１０＃Ｉｉ！中で牛介させる
。プラスミドＤＮＡはＢｉｒｎｂｏｉｍら（前述）の方
法に従って抽出する。最終ペレットは２００μｌの］′
［−緩衝液に溶解する。単離したＤＮＡ４μｌを２１ｉ
位のαＥｃｏＲＩおよび２単位のＨｉｎｄＩ［Ｉｒ消化
する。試験した全てのクローンで予想通りおよそ４５０
ｂｐの大きざの断片が得られた。 断片Ｆ　Ｃ−６＞を含有するプラスミドをｐｌＦＮ−γ
（−６）と命名し、Ｆ（−７）、Ｆ（−８＞、Ｆ　（−
９）、Ｆ　（−１０＞およびＦ（−１１＞を保有するプ
ラスミドをそれぞれｐｌＦＮ−γ（−７）、ｐＩＦＮ−
γ（−８）。 ｐｌＦＮ−γ（−９）、Ｉ）ＩＦＮ−γ（−１０）Ｊ３
．及びＤＩＦＮ−γ（−１１）と命名する。これらのプ
ラスミドはそれぞれ組換え免疫インターフェロン断片Ｉ
ＦＮ−γ（−６）、ＩＦＮ−γ（−７）、ＩＦＮ−Ｔ（
−８）、　　Ｉ「Ｎ−ｒ（−９）、ＩＦＮ−γ（−１０
）Ｊ３よびＩＦＮ−γ（−１１）（第１０図）を］−ド
する遺伝子の発現ベクターである。 Ａ−虱饗 修飾１ｌ−Ｎ−γ遺伝子がＥ、ｃｏｌｉで多量に発現す
ることを示−まためにｐ　Ｉ　ＦＮ−Ｔ　（−６）　。 ｐＩＦＮ−γ（−７）、ｏｌＦＮ−γ（−８＞。 ＤＩＦＮ−γ（−９）、ｐｌＦＮ−γ（−１０）または
ＤＩＦＮ−γ（−１１）で形質転換したＥ。 ｃｏｌｉ　　Ｍ２Ｓ（ｐＤＭＩ、１）を用し１て発１１
通を試みた。全細胞蛋白は５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析した。 Ｂ、ｌ：、ｃｏｌｔでのＩＦＮ−蛋白　の生産プラスミ
ドｐｏＭｔ、１を保有する Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉＭｌ　５１！１１１胞をｐｌＦＮ−
γ（−６）。 ｐＩＦＮ−γ（−７）、ｐｌＦＮ−γ（−８）。 ｐＩＦＮ−γ（−９）、ｐ　ｌ　ＦＮ−γ（−１０＞ま
たはｏ　Ｉ　ＦＮ−ｒ　（−１１）および対照としてｏ
　Ｇ　Ｉ−Ｓで形質転換した。転換株は１００μｓ１／
−のアンピシリンおよび２５μ’ｊ／ｄのカナマイシン
含有しＢ−培地中で生育させる。６００真ｍの吸光度が
およそ０．７となった時にＩ　ＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ
）で誘導する。さらに６時間インキュベーションの後に
遠心分離により集菌する。 Ｃ，Ｅ、　Ｃｏ　ｌ　ｉが生産す、る蛋白質の検出４０
μｌの培養物からの細胞を３％ＳＤＳ、３％β−メルカ
プトエタノール ルおよび１２５．ｍＭｔ−リス−塩酸、ｐＨ６、８、を
含むサンプル緩衝液に再けん濁する。サンプルを５分間
沸とうさせ、氷冷して１２，ＯＯＯＸｇで３０秒間遠心
分離した（ｌＬａｃｍｍｌｉ　　（　Ｎａｔｕｒｅ２　
２　７巻，６８０−６８５真［１９７０年］）の記Ｕ．
する方法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１
２．５％アクリルアミド、アクリルアミド／ビスアクリ
ルアミド比３０１０．８）の電気泳動にか（ｊる。蛋白
をクマシー・ブリリアント・ブルー＋ｔ−２ｂｏで染色
して過剰の色素を除去する。 ゲルより組換え免疫インターフェロン断ｊ’＋ＩＦ　Ｎ
−γ（−６）、ＩＦＮ−γ（、−７）、ＩＦＮ−γ　（
−８＞、ＩＦＮ−γ　（−９＞、　　ＪＦＮ−γ（−１
０）およびＩＦＮ−γ（−１１）は同じ発現調節配＋１
１の制御下にあるにも拘らず、金良組換え成熟免疫イン
ターフェロンよりも多量にＥ。 ｃｏｌｉで生産されることがわかった。 以下の方法により全ての紺換え免疫インターフェロン断
片を均質に精製した。組換え免疫インターフェロン所へ
の発現ベクターを保りづるト。 ｃｏｌｉａ胞を叙述のとおりに生育させる。 Ｉｔ）ＴＧ誘導および続く６時間のインコ１ユベーシ］
ン後、遠心分ＶＩ（４０００ｘｇ、１０分、４’Ｃ）に
より集菌する。上澄を捨てる。細胞（１００ｙ＞の破砕
は０．０１Ｍの１１トリウム緩衝液、ｐｌ＋８．０　（
３００ｍ＞中７ＭのグアニジンＪ−酸で行なう。得られ
るけん濁液を４℃で１時間攪拌する。 可溶化した組換え免疫インターフ１０ン断片は不溶性粒
子と遠心分離（１０，０ＯＯｘｚ、３０分。 ４℃）により分離する。上澄液を１０（８容量の０．１
５Ｍ硼酸ナトリウム、ｐＨ８，０で希釈し、残る固形物
を前と同じように遠心して除去する。 ３００ｇのシリカゲル１００（粒径０．０６３−０．２
００ＭＲ）を粗抽出物に添加する。けん濁液を静かに攪
拌して沈でｌししないようにする。１時間後に攪拌を停
止する。、沈ぐんが出来たら上澄液を捨てて沈でん物を
カラムくφ５α、長さ１７．５ｃａ）に移す。カラム中
のシリカゲルを０．０１Ｍ硼酸ブトリ「クム緩衝液、ｐ
ｕ８．ｏ、中のＩＭ　　ＮａＣ１溶液で洗う（流速（３
，４／ｎｉｎ　）。 組換え免疫インターフェロン断片を０．０１Ｍ硼酸ナト
リークム緩衝液、ｐＨ１８，ｏ、中の０．５Ｍテトラメ
チル塩化アンモニウムおよび０．７Ｍ硫酸アンモニウム
ぐ溶出する（流速６ｄ／ｍｉｎ　）。溶出液は直らに予
め上記緩衝液で平衡化したフェニル−セファロース−フ
ァストフローカラム（φ５ｏ１長さ２１　ａｒｔ　：フ
ァーマシア、ｐｒｏｔｏｔｙｐ　　ゲルＫＫ３３９０４
）にのせる。！１換え免疫インターフェロン断片警よ流
出液中に認められ、一方混在づるプロテアーゼ類はシリ
カゲルに吸着する。カラムは０．０１Ｍ硼酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ１８，ｏ、で洗滌し−ｃ　Ｔｌｌ生する。 次にフェニル−セファ［１−スカラムから溶出した組換
え免疫インターフェロン断片を０．０１ＭＩＩ］ｌ酸ナ
トリウム緩衝液、ｐｌ＋８．０、中０．７ＭＩａ酸アン
モニウム溶液で平衡化したフェニル−セファ１］−スＣ
Ｌ−４Ｂカラム（φ５　ｃｍ　、長さ２１　ｒ：ｍ　：
ファーマシア〉に吸着する。カラムを」分洗滌してから
組換え免疫インターフェロン断片を０．０１Ｍ１酸ナト
リウム緩衝液、ｐｌ＋８．０、に対して４時間の勾配で
溶出する。 溶出液を４倍量の水で希釈し、予め発熱物質を含まない
０．０５Ｍすｌυ酸プｌ〜リウム緩衝液、ｐｌ＋６．０
、で平衡化したく流速４戒／ｍｉｎ　）フラクトグルＴ
ＳＫ　　ＣＭ−６５０（Ｍ）カラム（φ２、Ｆ３ｃｍ、
良さ１８　ｃｍ　：メルク）にかりる。組換　４゜え免
疫インターフェロン断片はＯか６０．６ＭＮ　ａ　Ｃ１
までの直線食塩勾配を用いて溶出づる。 精製の最終ステップとして、組換え免疫インターフ１［
１ン断片区分を０　、０　ｂ　Ｍ　’）　Ｉｖ　酸功？
Ｊ］液、ｐｌ＋７．５（発熱ｖＩＪ質なし）で平衡化し
たセファデックスＧ−５０スーパーファインカラム（φ
５ＣＩＲ１長さ８５　ｃｒｔｒ　：ファーマシア）にか
ｉノる。流速は２ｍ１７　ｍｉｎに調整づる。 このようにして精製した組換え免疫インターフェロン断
片はＲＰ　−１８１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析および５Ｏ８
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一・であること
がわかった。Ｃ−末端アミノ酸解析のために精製蛋白質
をスタフイ［］」ツカス・アウレウスのＶ８ブロラーア
ーゼで消化する。Ｃ−末端ペブヂドをＲＰ　−１８ＨＰ
　Ｌ　Ｃ′Ｃ：単離し、凍結乾燥後）」Ｃ２中で加水分
解してアミノ酸分析を行なう。 加水分解物中に予想通りのアミノ酸が検出された。 滅菌總過の後、組換え免疫インターフェロン断片は４℃
′ｒ：数ケ付間保存しても安定であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は１４３個のアミノ酸から成る成熟組換え免疫イ
ンターフェロンのアミノ酸配列を示す構造図である。 第２図はプラスミドｐ　Ｄ　Ｓ　８　／　Ｒ［３Ｓ　Ｉ
ｔ　。 ５ＤｔｌＩの模式図である。 第３図（↓１プラスミドｐＤｓ８／ＲＢＳＩＩ。 Ｓｒ＋ｈＩのＸｈ　ＯＩ　／　Ｘ　ｂ　ａ　Ｉ断片ノヌ
クオレチド配ダ１を示Ｊ構造図である。 第４図はプラスミドｐＤＭ１．１の模式図である。 第５図はプラスミドｐＤＭ１．１のＤＮＡ配シ１を示す
構造図である。 第６図はプラスミドｐＲｃ２３／ｌ　ＦＮ−９００から
ｒｌＦＮ−γの遺伝子を含むフラグメント１の構築を示
す模式図である。 第７図ｔ１１プラスミドＣＩＧＬＳの構築を示す模式第
８図は三つの組換え免疫インターフェロン断片のＣ−末
端を］−ドするＥｃｏＲＩ−Ｈｉ　ｎｄ■断片の構築を
示す模式図である 第９図は発現プラスミドＤＩＦＮ−γ（−６）、Ｄ　Ｉ
　Ｆｌｕ−７＜−８＞　、およびＩＦＮ−γ（−１１）
の構築を示す模式図である。 第１０図＠換え免疫インターフェロン断片のアミノ酸配
列を示す構造図である。 エロンおよびヒト−免疫−インターフェロン断片のＳ［
）３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す電気
泳動図である。 第１２図はＩＦＮ−γのカルボキシ末端の配列と抗ウィ
ルス活性との関係を承りグラフである。 第１３図ＬＪ　ＩＦ　Ｎ−・Ｔのカルボキシ末端の配列
と抗ウィルス活性、マクロファージの活性化およびレセ
プター結合能との関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）組換え成熟ヒト免疫インターフエロン全長と比較し
   てＣ−末端の６〜１１個のアミノ酸を欠損している均質
   な組換え免疫インターフエロン断片。 ２）以下のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１）
   項記載の均質な組換え免疫インターフエロン断片。 【遺伝子配列があります】 但し、ＸはメチオニンでＹがグルタミン残基であるか、
   Ｘが水素でＹがグルタミンまたはピログルタミン酸残基
   であつて、Ｚは、 Ｓｅｒ、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅまたは Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ である。 ３）ＺがＳｃｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａ
   ｒｇである特許請求の範囲第２）項記載の均質組換え免
   疫インターフエロン断片。 ４）ＺがＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅであ
   る特許請求の範囲第２）項記載の均質な組換え免疫イン
   ターフエロン断片。 ５）ＺがＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕである特許請
   求の範囲第２）項記載の均質な組換え免疫インターフエ
   ロン断片。 ６）ＺがＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔである特許請求の範囲
   第２）項記載の均質な組換え免疫インターフエロン断片
   。 ７）ＺがＳｅｒ−Ｇｌｎである特許請求の範囲第２）項
   記載の均質な組換え免疫インターフエロン断片。 ８）ＺがＳｅｒである特許請求の範囲第２）項記載の均
   質な組換え免疫インターフエロン断片。 ９）二量体、三量体または四量体としての特許請求の範
   囲第１）項〜８）項のいずれか一つに記載の均質な組換
   え免疫インターフエロン断片。 １０）特許請求の範囲第１）項〜８）項のいずれか記載
   の組換え免疫インターフェロン断片をコードするヌクレ
   オチド配列が、発現調節の配列と有効に結合して成る複
   製可能な微生物発現ベクター。 １１）ｐＩＦＮ−γ（−６）、ｐＩＦＮ−γ（−８）お
   よびｐＩＦＮ−γ（−１１）のグループより選択される
   プラスミドである特許請求の範囲第１０）項記載の複製
   可能な微生物発現ベクター。 １２）ｐＩＦＮ−γ（−７）、ｐＩＦＮ−γ（−９）お
   よびｐＩＦＮ−γ（−１０）のグループより選択される
   プラスミドである特許請求の範囲第１０）項記載の複製
   可能な微生物発現ベクター。 １３）特許請求の範囲第１０）項〜１２）項のいずれか
   記載の複製可能な微生物発現ベクターで形質転換され、
   特許請求の範囲１）項〜９）項のいずれか記載の組換え
   免疫インターフエロン断片を発現することの出来る微生
   物。 １４）疾患状態の治療のための特許請求の範囲第１）項
   〜９）項のいずれか一つに記載の組換え免疫インターフ
   エロン断片。 １５）該インターフエロン断片を発現できる複製可能な
   発現ベクターで形質転換した微生物を生育させ、該イン
   ターフエロンを発現させ、それを回収することより成る
   特許請求の範囲第１）項〜９）項のいずれか一つに記載
   の組換え免疫インターフエロン断片の製造方法。 １６）特許請求の範囲第１０）項〜１２）項のいずれか
   記載の複製可能な微生物発現ベクターで微生物を形質転
   換することより成る、特許請求の範囲第１３）項記載の
   微生物の調製方法。 １７）特許請求の範囲第１）項〜９）項記載の組換え免
   疫インターフエロン断片の一つまたはそれ以上および生
   理的に適合性のある担体とを含有する医薬組成物。 １８）非経口投与用の特許請求の範囲第１７）項記載の
   医薬組成物。 １９）局所投与用の特許請求の範囲第１７）項記載の医
   薬組成物。 ２０）鼻内投与用の特許請求の範囲第１７）項記載の医
   薬組成物。 ２１）特許請求の範囲第１）項〜９）項のいずれか記載
   の組換えインターフエロン断片、或いは特許請求の範囲
   第１７）項記載の医薬組成物の疾病状態の治療への使用
   。 ２２）特許請求の範囲第１）項〜９）項のいずれか記載
   の組換え免疫インターフエロン断片或いは特許請求の範
   囲第１７）項記載の医薬組成物のウィルス感染治療への
   使用。 ２３）特許請求の範囲第１）項〜９）項のいずれか記載
   の組換え免疫インターフエロン断片或いは特許請求の範
   囲第１７）項記載の医薬組成物の新生疾患治療への使用
   。 ２４）特許請求の範囲第１）項〜９）項のいずれか記載
   の組換え免疫インターフエロン断片或いは特許請求の範
   囲第１７）項記載の医薬組成物の慢性関節リュウマチ治
   療への使用。 ２５）特許請求の範囲第１５）項記載の方法で調製され
   る特許請求の範囲第１項〜９）項のいずれか記載の組換
   え免疫インターフエロン断片。 ２６）特許請求の範囲第１６）項記載の方法で調製され
   る特許請求の範囲第１３）項記載の微生物。