JPS60203193A - 新規生理活性ペプチド及びそのｄνａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は新規生理活性ポリペプチドの遺伝情報を有する
ポリデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと略する）に関する
。

不発ψＪは又、該ＤＮＡを含む複製可能な組換ＤＮＡ及
び該複製可ｆｊシなδＵ換ＤＮＡで形質転換された微生
物またはＡ４１１胞に関し、東に又、該ＤＮＡが有する
迫伝情報を発現して得られる新規生理油性ホリペプチド
及びその製造方法に関する。

更［旺しくは、組換ＤＮＡ技術を用いてＴＮＦ（Ｔｕｍ
ｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉａ　Ｆａｃｔｏｒ　）のＤＮＡ配
列及びそれから演紳されるＴＮＦのアミノ酸配列、また
このＤＮＡを用いるＴＮＦの製造法、１だ、この製法に
より得る産生される産生物の用途に関するものである。

本明細岩において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ生化学命名妾員会（ＣＢＮ）で採用された略記法
ｆより狭示され、し・１」えは下記の略号が使用される
。なお、アミノばなどに関し光学！Ａ性体があり得る場
合は、特に明示しなけれは５体を示すものとする。

Ｃｙｓ　：　システィン残基 Ｇｔｎ：　グルタミン残基 Ａｓｐ　：　アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ　：　プロリン残基 Ｔｙｒ　：　チロシン残基 ＶａＺ　：　バリン残基 Ｌｙｓ　：　リジン残基 ＧＺｕ　：　グルタミン酸残基 Ａム：　アラニン残基 Ａｓｎ　：　アスパラギン残基 Ｌｅｕ　：　ロイシン残基 Ｐｈｅ　：　フェニルアラニン残基 ａｔｙ　：　グリシン残基 Ｈｉｓ　：　ヒスチジン残基 Ｓｅｒ　：　セリン残基 Ｔｈｒ　：　スレオニン残基 ＩＩＡ：　イソロイシン残基 Ｔｒｐ：）リグドアアン残基 Ａｒｇ　：　アルギニン残基 Ｍｅｔ　：　メチオニン残基 また、本り」細Ｗ中においてＤＮＡのポリマーまたはオ
リゴマーは下記の如き略号の配列にょシ表記する。

Ａ：２′−デオキシアデニル酸 Ｃ：２′−デオキシシチジル酸 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸 Ｔ：チミジル酸 特にことわらない団゛す、配列の左から右への方向は５
′から３゛への方向を示すものとする。

網内系賦活化作用ｆ：；ｆ］する種々の物質、例えは、
各種ダラム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗
腫瘍細胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多斂
報告ぜれている。例えばＣａｒｓｗｅｌｌらは、ＣＤ−
Ｉ　５ｗ１ｓｓ　マウスＫ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）を投与し、その２
週間後にエンドトキシンを静脈内注射して得られる訊マ
ウスの血清が、培＊Ｌ細胞に対して殺細胞作用を有でる
こと、およびＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａで担癌させ
た（　ＢＡＬＢ／ｃ　Ｘ　Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウス
のし瘍を出血性壊死に至らしめる現象を見出し、ＴＮＦ
　（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　）
　と名づけた（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７２巻（ＩＩ［Ｌ９）　３６６６−
３６７０頁（１９７５年）〕。その後、ｎｕｆｆら（Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１２５巻（Ｎａ４　）　１６７１　Ｐ−１６７７頁（１
９８０年）〕　およびＭａｔｔｈｅｗｓら［Ｂｒ、　Ｊ
、　Ｃａｎｃｅｒ　４２　Ｇ　４１６〜４２２頁（１９
８０年）〕は、前記Ｃａｒｓｗｅｌｌらの方法に準じて
萌」製しゾζウサギ血清からＴＮＦの相１」製を試みて
、それぞれ原血清に比べて約２０００倍および約１００
０倍精製されたものを得ている。しかし、いずれの場合
にも精製されたものに関しては動物′）！：験において
抗腫糾効果を確認していない。

特開昭５７−１４０７２５号は、紺１内系賦活化作用を
有する物質のｉ　ａｔ　ｔたは２釉以上を哺乳動物（マ
ウス、ウサギ、モルモット等）ニ投与し、次いでグラム
陰性菌由来のエンドトキシンを注射することによって、
または咄乳動物由米の活性化マクロファージを含む組織
培養系にグラム陰性菌由来のエンドトキシンを加えるこ
とによって銹発される制癌作用を有する螢白性生理活性
物質を単回り精製した、と開示している。火に、その物
質の分子量は、ゲル涙過法および５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル（ｌｉ気泳ｊｎｉｌ法では３９，０００±５
，０００　％’　４１　電点けｐＨ３，９±０．３　（
／；ｙ７電点電気泳Ｕｊｉｌ法）である、と開示してい
るが、その詳細なオｈ端は開示されていない。

−力Ｍａｔｔｈｅｗｓ　ＣＢｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ
　４４　巡’　（３）　４１Ｂ　−４２４頁（１９８１
年）〕はＢｃａｙ、：投与し２週間を紅過したウサギの
各種ホ１１織からイリた単核貧食細胞がその細胞培養液
へエンドトキシンを添加することによりＬ細胞障害性物
質を生産することを示している。しかし、この物質の詳
細なＪＩ’ｒ造は７３”されておらず、丑だ血清中に見
出されるＴＮＦと同一の！物質であるという証拠も示さ
れていない。

水弁間者０１、ＴＮＦの物１生、構造、産生細胞吟、に
つき（と意０１元Ｉｃわしけ／こ結果、網内１式活化作
用を有する物質を投与されたウサギから、細菌のエンド
トキシンπよる刺激にてＬ　ｉ；ｌｌ胞障害活性を肪生
ずる細胞を取イＵし、該り細胞障省活性が、ウサギ血清
から得るＴＮＦと分子量的、血清学的に同一であること
を証明することにＪ成功した。

一方遺伝子操作技術の進歩１ｃ　１’ｉ、いアミノ酸配
列が知られていない蛋白であっても、その遺伝子を単離
することができれは、その（１１造のｈ７す」から蛋白
の構造を’Ｉ’ｊ７ｆ明し、またとの迫、伝子を用いる
ことにより、微生物またはシ１【１胞培養で睦蛋白を製
造することが可能となった。

不発り」者は、このような遺伝子操作技術を上記Ｌ　Ｉ
！Ｉ１１胞障害活性産生＋１．：！Ｉ胞に応用して研究
を続けた結果、ＴＮＦ遺伝子の単離に成功し、その遺伝
子構造及び蛋白構造を決定する匠至り、寸だこの遺伝子
を用いるＴＮＦの製造に成功し、本発明を冗成するに至
った。

すなわち、本発明はＴＮＦが次の如きアミノ酸配列を有
するポリペプチドであることを１ｊｉｌ　７Ｊくする。

Ｓｅｒ　ＡムＳｏｒ　Ａｒｇ　Ａｌ＋ａＬｅｕ　Ｓｅｒ
　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ａム　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　ＶａＡ　ＡＬＬ　Ａｓ
ｎ　Ｐｒｏ　ＧＬｎ　Ｖａｌ　ＧｌｕＧＡｙ　Ｇｔｎ　
Ｌｅｕ　Ｇ＆　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＧＡｎ　Ａｒ
ｇ　Ａ７！ＪＩＡｓｎＡＩＡＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
Ａｓｎ　ＧＡｙ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａ
ｓｐＡｓ＋ｎ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　ＶａｔＶａ７　Ｐｒｏ
　ＡＬｈＡｓｐ　ＧＡｙ　Ｌｅｕ　ＴｙｒＬｅｕ　ＩＩ
ＡＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＶａｔＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓ
ｅｒ　ＧＡｙ　ＧｉｎＧｔｙＣｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔ
ｈｒＶａｔＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ＡムＶａｔＳｅｒ
　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＬｙｓＶａｔ　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＡムＩ／Ｊｌ！　Ｌｙｓ　Ｓｅ
ｒ　Ｐｒｏ　ＣｙｓＨｌｓ　Ａｒｇ　ＧＴｈ　Ｔｈｒ　
Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　Ｇｔｕ　Ａム　Ｇｌ−ｕ　Ｐｒｏ　Ｍ
ｅｔＡム　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　ＧＬ、ｘ　Ｐｒｏ　Ｉ＃　
Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＧＡｙ　Ｇｔｙ　ＶａｔＰｈｅ　Ｇｔ
ｎＬｅｕ　ＧｔｕＬｙｓ　ＧｔｙＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅ
ｕ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＧｔｕ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｇｔｎ　
Ｐｒｏ　Ｇ＃　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａム
Ｇｌｘ　Ｓｅｒ　Ｇｔｙ　Ｇｌｓ　ＶａｔＴｙｒ　Ｐｂ
ｅ　Ｇｔｙ　Ｉ４ｅ　ＩＩＡ　ＡＭｅｕ 上記ポリペプチドば′また成熟ＴＮＦとも称される。

不発り」は−ｔ／ζ、前記ポリペプチドのＮ末端にメチ
オニン残基がペプチド結合しているポリペプチドをも包
含する。

本発明は１／こ、ＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＡＴ
ＧＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧ
ＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧ
ＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＴＧＣＣＴ
ＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧ
ＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴ
ＴＣ１”ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴｌ”ＣＡＧＧＧ’ｌ
’ＧＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡ
ＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＴＣ
ＡＡＣＣＣＴＧ’ｌ’ＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣ
ＣＣＴＣＡＧＡの塩基配列で示されるＤＮＡから４かれ
るアミノ酸配列で示されるペプチドのＣ−末端を討む一
部また全部のペプチドが前記成熟ＴＮＦのＮ−末端側に
結合している中間体をも包含する。

自然の変異によりまたｄ１人工的変異により、主たる活
性に変化を力えることなく、蛋白質の構造の一部（＋［
異せしめることが可ＩＩヒであるが、本発明は、前記す
べてのポリペプチドの相同変異に相当するイＩ′、）造
をイコするポリペプチドをも包含する。

更に本発明はＴＮＦ遺伝子が５′より次の如き塩基配列
をイｊするものであることを開かする。

ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＧ
Ｔ　ＧＡＣＡＡＧ　ＣＣ’ｌ’ＣＴＡ　ＧＣＣＣＡＣＧ
ＴＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＣＡＡ　ＧＴＧ
　ＧＡＧＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ
　ＡＧＣＣＡＧ　ＣＧＴ　ＧＣＧ　ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ
　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＡＡＣＧＧＣＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴ
ＣＡＣＧ　ＧＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴ
Ｇ　ＣＣＧ　ＧＣＣＧＡＣＧＧＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＣＴ
ＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ　ＧＴＴ　ＣＴＣＴＴＣＡ
ＧＣＧＧＴ　ＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧ
ＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＡＣＴ　ＣＡＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣ
ＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣ
ＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　ＧＣＣＡＴＣ
ＡＡＧ　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧ　ＧＡＧ　Ａ
ＣＣＣＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡ
ＴＧＧＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＣＴＡＣ
ＣＴＧ　ＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＴＴＧ　Ｇ
ＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＧ　ＣＴＣＡＧＣＡ
ＣＣＧＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　Ｔ
ＡＣＣＴＧ　Ｇ、ＡＣＣＴＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＴＣＣＧ
ＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣＡ
ＴＴ　ＧＣＣＴＧ 本発明は成熟ＴＮＦを微生物もしくは＋ｉ’ｌｌ胞の培
養暉よりノ工生ぜしめるために、前記塩基配列の５′端
にＡＴＧをイ・」加し／こ４（・・；造を）１」する塩
基配列をも包含する。

本　）６　明　１ｄ、ｉ　１こ、ＡＴＧＡＧＣＡＣＴＧ
ＡＧＡＧＴＡ’ｆ’ＧＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧ
ＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡ
ＡＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡ
ＧＣＧＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣ
ＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡ
ＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴ
ＣＡＧＧＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡ
ＧＡＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＴＣ
ＴＡＧＴＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＴ
ＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡのｉｊｌ’１基配列でボされるＤ
ＮＡの３′−末☆１ム１を君む一部−二または全部のＤ
ＮＡが前％ｅ　ＴＮＦ　；＋に伝子の５′−末端側に結
合していゐノ丘仏子も包君する１−１目然の変異により
１１こは人工的俊菓により、主たる活性に変化を−りえ
ることなく　ポリペプチド４ｉ’；造の一部を変異せし
めることが司ｉ’＋Ｗであるが、不発ゆ１は前「記した
ポリペプチドの）１１１回泉二共に相当するイ（”・ｊ
造を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をも包
含する。

遺伝子コードの縮ＭＶｃより、アミノ酸配列を変化させ
ることなく、遺伝子の塩基配列を変化させることができ
る。本発明は前記したすべてのポリペプチドに係る遺伝
子の、遺伝子コードの縮爪に基くすべての塩基配列を包
含する。

更に不ｙＡ明は形質転換されｆｔ微生物又はｉｆ’ｌｌ
ｌ胞中で、ＴＮＦのアミノｉ：Ｉｆ２配列をもむポリペ
プチドｆ：発現し得る複製可能な組換ＤＮＡ　Ｋ係る９
゜このような近且換Ｉ）ＮＡとしては、例えはｐＲ２−
２、ｐＲ１２、ｐＴＮＦ−ムｃ−１、ｐＴＮＦ　−Ｌｈ
ｃ　ＵＶ　５−１からなるグループから辺択されるｍ換
ＤＮＡか挙りられる。

更に本発明は、ＴＮＦのアミノ酸配列を９むポリペプチ
ドを発現し得る複製可能な組換ＤＮＡで形質転換された
微生物またはｒｉ伯胞に保る１゜このような微生物１２
こは＋ｉ；ｉｌ　Ｊｌｔｉとして、大腸用、枯草菌、酵
母、尚等蛎物１１１！ｉｊ胞か挙＆ＪらＩしる。

史に本発明は、ＴＮＦ遺伝子をコードする遺伝子を、微
生物又は細胞中で発現さゼ°ることからなるＴＮＦの製
造方法に係る。

詳しくは複製可能な組換ＤＮＡで形質転換され１だ微生
物又は細胞を増殖させ、ＴＮＦのアミノ酸配列を含むポ
リペプチドを産生さ寝、該ポリペプチドを回収すること
からなる該ポリペプチドの製造方法に係る。即ち、本発
明の他の態様によれば、前述の本発明のポリデオキシリ
ポ核酸を複製可能なベクターに組入れて該ポリデオキシ
リポ俵酸を有する複製可能な組換ＤＮＡを得、イ七られ
た該組換ＤＮＡで微生物または細胞を形質転換させて該
組換ＤＮＡを含有する形質転換体ｆ：得、祷られた該形
質転換体を培養して該ポリデオキシリポ核ばの有する遺
伝情報を発現させることからなる新規生理活性ポリペプ
チドの製造方法が提供される。

更に本発明は直接発現産物として成熟形で宿主細胞から
分泌されるＴＮＦの製造に係る。このような方法として
、例えは、シグナルペプチドとして知られる１５．〜３
０アミノ酸よりなる微生物または高等生物由来のアミノ
酸配列を、成熟ＴＮＦのアミン端に結合するべく遺伝子
配列を）＝ｔｌ＆することによシ達成される。

ＴＮＦは次のようにして得られノζ。

Ｌ　ウサギを網内賦活化作用を有する物質により刺激し
た。

２　前記ウサギを５〜１５日間飼背した後、グラム陰性
菌のエンドトキシンで処理し、その血清を取得した。こ
の血清はＬ　ｌｌＣｌ胞障簀活性及び抗腫瘍活性を示し
た（この活性を示す物質を血清ＴＮＦと称する）０ ３、　網内賦活化作用を４１する物質により刺激された
ウサギを５〜１５日ＩＬｉＪ飼育した仮、気管切開によ
シ肺胞洗浄ｍ胞を得た。

４、　肺胞洗浄細胞を、グラム陰性丙より得たエンドト
キシンと共に培養し／ζ０ ＆　前記細胞培養の上清中ｉｃＬ細胞障害活性を認めた
。この活性は、血＠ＴＮＦをマウスに処理して得られる
抗血清（以下抗ＴＮＦ抗体と称する）により消去された
。エンドトキシンを共存させない細胞培養上清中にＬ＋
＋、ｉ１１胞障害活性は認められなかった。

６、　前記細胞培養中に放射性メチオニンを共存させて
得られる上清をＳＤＲポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析することにより、分子量１７５００±２０００　
の蛋白の生成を認めた。エンドトキシンを共存させない
細胞培養上清にはこの蛋白の生成は、認められなかった
。

７、　前記細胞培養の上清をＳＤＳポリアクリルアミド
ゲルゲル泳！４１ｖｃよυ分画したところ、分子量１７
５００±２０００の位置ＫＬ細胞障害活性を認めた。

血清ＴＮＦのＳＤＳホリアクリルアミドゲル電気泳動分
析もこれに一致した。

＆　前記細胞培養から細１１ｉｉ１　’（ｉ−集め、リ
ボヌクレアーゼ阻害、の存在下に１細胞質ＲＮＡ　（以
下、リボヌクレイン酸をＲＮＡと略す）を抽出した。

９、　細胞質ＲＮＡから、オリゴｄＴカラムに対する吸
着性画分〔以下ｍＲＮＡ　（メツセンジャーＲＮＡ　）
と略す〕を得た。

１０、上記ｍＲＮＡをショ糖密度勾配遠心により分画し
た。

ＩＬ　上日己分画をアフリカッメガエル卵母細胞に注入
し、培養し、培地および卵母細胞中にＬ細胞障害活性を
示す分画をＭ〜めた。

１２、、上記アフリカッメガエル卵母細胞中に生成する
Ｌ　１（ＩＩ胞障害活性は、抗ＴＮＦ抗体により消去さ
れた。

１３、分画されたｍＲＮＡを、これに相補的な一１鎖Ｄ
ＮＡに転換し、これから更に二重鎖ＭＡを調製した。こ
の３′末端にデオキシシチジル酸のオリゴマーを付加せ
しめ、１つ又は複数の衣状型マーカーを有するプラスミ
ドのようなベクターの中に挿入した。

１４、このように調製されたベクターを使用して大腸菌
細胞を形質転換して、ｒｒ＋ＲＮＡ　ｉＣ相補的なりＮ
Ａを含有する大腸菌１２０００株を得た。

１５、　血清ＴＮＦ　ｆ：石′Ｉ製し、そのアミノ酸配
列を定めた。

１６、血ｉ　ＴＮＦのアミノ酸配列に基きオリゴヌクレ
オチドを合成し、これを放射線標識した。

１７、　１４で調製しｆｃＤＮＡを移しとった口紙と、
１６で得た放射線標識されたＤＮＡをハイブリダイズさ
せ、Ｘ線フィルムを強く感光させる株９個を選択した。

１＆１７で選択された９個の菌株からプラスミドを単離
し、制限酵素で切断し、共通の大きさの断片を有するプ
ラスミドを有する菌株を得た。このうち２株はＬ細胞障
害活性を有する物質を生産することが判明した。

１９、この菌株からプラスミドを単離し、塩基配列を決
定した。この塩基配列から演鐸されるアミノ酸配列の１
つは、１６で得られたＴＮＦのアミノ酸配列と一部した
。

２０、ＴＮＦのアミノ酸配列を与えるＤＮＡ配列を発現
ベヒクルの下流１ｍ統し、この発現ベヒクルを適当な宿
主細胞を形質転換するために用い、この宿主細胞を培地
中で増殖させ、θ「望のＴＮＦを発現させた。

２Ｌ　ここに得られたＴＮＦ　ｒｈ性は、抗ＴＮＦ抗体
により消去された。

以上により、本発明者が、ＴＮＦの遺伝子を取得し、こ
の構造を解り」シ、この遺伝子を用いるＴＮＦの製造方
法を完成さぜた過程が示されたが、本発明は以上に限定
されるものではない。

ＴＮＦの遺伝情報を直接的に示しているｍＲＮＡを含有
する細胞質ＲＮＡは、上記の如くエンドトキシン処理さ
れた肺胞洗浄細胞から取得されたが、ウサギの他の細胞
例えば末梢血中のプラスチック吸着性細胞、また末梢血
や′肝臓、肺臓等のエンドトキシン感受性細胞をエンド
トキシン処理することによシ、得ることができる。

また、他の動物、例えばマウス、ハムスター、モルモッ
ト、ヒト等の同様な細胞をも、ｍＲＮＡの取得源として
用いることができる。また、単球系の株化細胞や、エン
ドトキシン感受性もしくはＬ細胞障害活性並生細胞を用
いることができる。この様な細胞としては例えばＲＰＭ
Ｉ　１７８８、ＴＨＰ等の細胞を挙げることができる。

ｍＲＮＡはまた、染色体ＤＮＡを適当なベクターに接続
して動物細胞ｖｃ％入することにより、得ることができ
る。このような系として、ＳＶ４０をベクターとし、Ｃ
Ｏ８細胞をホストとする組換による方法がよく知られて
いる（例えばＭａｎｔａｌらＮａｔｕｒｅ。

２８１巻４０頁、１９７９年、Ｍｅｌｌｏｎら、Ｃｅ１
ｌ、２７巻２７９頁、１９８１年など）。

かくして得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、プロー
ブを用いるハイブリダイゼーションによって選択された
ＤＮＡは、種々の目的に応じて組換えられる。

各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成された
人工のＤＮＡに置換えることも可能である。

ＴＮＦはまた、細胞内で未成熟形態（ブレまたはプレグ
ロペプチド）で産生され成熟過程（プロセシング）ｖｃ
より中間体を経由して成熟ＪＪＦとなることが推定され
る。ＴＮＦのこのような未成熟形態は、ＴＮＦ遺伝子の
塩基配列から推定することができる。未成熟形態及び中
間体のＴＮＦをコードする遺伝子を含むＴＮＦ遺伝子も
また、天然のまたは人工的ＤＮＡを用いて組換を行うこ
とができる。

これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＧ）　を成熟あるいは未成熟わるいは中間体ＴＮＦ
遺伝子の５′端に尋人することである。このようにする
ことにより、適当なプロモータによって合成されるｍＲ
ＮＡから成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦが産
生される。この様にＮ末端に付加されたメチオニン残基
は宿生によっては自然に除去さ袢る。

また別の形態としては、シグナル配列と呼ばれる疎水性
に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外また
はグラム隘性１１１１菌においては、ペリプラズムと呼
ばれる部分へ、分泌させることも可能である。

また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するペプチドとＴＮＦとの融合ペプチド
を形成するが、この場合は化学的または酵素的に切断す
るか、もしくはＴＮＦの主たる活性に変化がなければ、
その１１用いることかで　−きる。

このように得られたＴＮＦ遺伝子を、正しく転写、翻訳
が行われるような配列においてプロモーター等の５′領
域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物細胞中で
複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得、この組
換遺伝子によって細菌または高等生物ν１４１胞を形質
転換し、この形質転換体を増殖せしめＴＮＦ遺伝子を発
現せしめることによりＴＮＦを得ることかできる。

宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはＥ、　ｃｏｉ
ｌ　Ｋ　１２株の種々の変異株、例えばＨＢ　１０１（
ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｃ６００Ｋ　（ＡＴＣＣ３３９
５５）、Ｄ　１２１０、ＲＲＩ　（ＡＴＣＣ３１３４３
）、ＭＣ１０６１、ＬＥ　３９２　（ＡＴＣＣ３３５７
２）、ＪＭ　１０１　（ＡＴＣＣ３３８７６）、χ１７
７６　（ＡＴＣＣ３１２４４）などが用いられる。

大腸菌を宿主とづる場合のベクターとしては、ｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ
９、ｐＭＢ　９、（ＡＴＣＣ３７０１９）、ｐＪＢ　８
　（ＡＴＣＣ３７０７４）、ｐＫＣ（ＡＴＴＣ３７０Ｂ
４　）等のプラミスドあるいはλｇｔ、λＢ１　シャロ
ン４Ａのようなλファージ、ＭＩ３ファージなどが用い
られる。

大腸菌の自体中Ｋ　ＴＮＦを産生させるために、大腸菌
の遺伝子またはファージ遺伝子のプロモーターが使用さ
れる。このようなプロモーターとして、好適にはラクト
ース分解酵素（ＬＡＣ）、またはそのＵＶ５変異プロモ
ーターまたはベニシリナーゼ（ＢＬＡ）やトリプトファ
ン合成酵素（ＴＲＰンのプロモーター　、λファージの
ＰＬプロモーターあるいはトリプトファン合成酵素と、
ラクトース分解酵素の融合プロモーターであるＴＡＣプ
ロモーター等が用いられる。

枯草菌を宿主とする場合にはＢＤ１７０株（ＡＴＣＣ３
３６０８八ＢＲ１５１株（ＡＴＣＣ３３６７７）、Ｍ１
１１２株（ＡＴＣＣ３３７１２）などが用いられ、ベク
ターとしてはｐＣ１９４（ＡＴＣＣ３７０３４）、ｐＵ
Ｂ　１１０　（ＡＴＣＣ３７０１５）、ｐｓＡ２１００
　（ＡＴＣＣ３７０１４）、ｐＥ１９４　などのプラス
ミドなどが用いられる。

枯草菌を宿主とする」６合のプロモーターとしてハ、ク
ロラムフェニコールアセチル化ｕ　＞’＝　（ＣＡＴ　
）やベニシリナーゼ、エリスロマイシン１１０丁性等の
遺伝子のプロモーターが用いられ□０ 酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅａ　ｃｅｒｅｖｉａｅａ
ｅ　）のＲＨ２１８株（ＡＴＣＣ４４０７６）、５ＨＹ
Ｉ株（ＡＴＣＣ４４７６９）、ＳＨＹ　３株（ＡＴＣＣ
４４７７１）、Ｄ　１３１　Ａ株、４８３株、８３０株
などが用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐ　１３　
（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ　６、ＹＲｐ　７、Ｙ
Ｉｐ　５　などのプラスミドが用いられる。

酵匍を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロケナーゼ（ＡＤＨＩ）
、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、ホスホグリセレ
ートキナーゼ（ＰＧＫ　）　、チトクロームＢ（ＣＯＢ
）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる。

高等生物の培養細胞を宿主とする場合は、サル腎細胞、
ｃｏｓ細胞、マウスＣ１２７細胞（ＡＴＣＣ１６１６）
などが用いられ、そのベクターとしてはｓＶ　４０　。

ウシポリオーマウィルス晴を用いることができる。

本発明の新規生理油性ポリペプチドは生体の正常組織は
傷つけず、腫瘍だりを殺す生体物質である。実際に生体
に適用するにあたっては注射液に調剤して有効量を注射
投与することができる。注射液の調剤にあたっては一般
に用いられる添加剤を加えることができる。本発明で用
いられる添加剤の例を列挙すれば、アルブミン、ゼラチ
ン、グロブリン、プロタミン、プロタミン塩などの安定
化剤、ショ糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボ
キシメチルセルロースなどの増粘剤、各種無機塩のｐＨ
調整剤などである。また注射投与する代りに、錠剤とし
て有効量を経口投与することもできる。錠剤の調製にあ
たっても、一般に用いられる添加剤を加えることができ
る。錠剤の〃ｄ製にあたって用いられる添加剤の例とし
ては上述の安定化剤、デンプン、乳糖などの賦形剤を挙
けることができる。具体的には、動物実験の結果、マウ
スの腫瘍も大半か−、二回の注射投与で完治することが
分った。たとえば、マウスの皮膚に人工のｊ型温（メス
Ａ）を移植し、直径６〜７ミリになった段階で本発明の
新規生理油性ポリペプチドをわずか２．０マイクログラ
ム注射したところ、−週１１４１後にかさぶた状になり
、二過１ｉｊＪ後には丹び毛が生え始めて完治、その後
で妊娠、山肌にも成功することが分った。

以下に実施例によって不発ゆｊを０１細にＮ［２ず。

本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作製、組換体の微
生物への導入は、特に断わらない限り下記の実験書に従
って実施した。　。

（１）烏木康敬編著、遺伝子操作マニュアル、講談社（
２）高木康敬ｍ１１６著、遺伝子操作実験法、講戯社（
３）　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｇｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　
Ｆｒ１ｔａｃｈ、　Ｊ、　ＳａｍｂｒｏｏｋＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国） （４）　Ｒａｙ　Ｗｕら、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　１０１巻Ａｃａｄｅｍｌｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ刊（米国）参考例Ｉ　Ｌ細胞障害活性Ｈｔ価 り細胞を用いる活性評価は、Ｒｕｆｆ　（Ｌｙｍｐｈｏ
ｋｉｎｅＲｅｐｏｒｔｓ　２巻Ｅ、Ｐｉｃｌｃ編集、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｔｉｓ　２３５頁（１９８０年
）〕わるいは（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２６巻２３
５頁（１９８１年）〕の方法に堺じ、不発明による生理
活性物質がＬ　９２９　？１ｉｌｌ胞（アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション、ＣＣＬＩ）を殺す効
果を測定するものである。すなわち、順次培地で希釈し
た試料０．１−と１０５コ／１ｎｌＶの濃度のＬ細胞の
培地懸濁ｇ　ｏ、ｔ　＋＋＋ｌ。

を９６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボ
ラトリ−社、米国）Ｋ加えた。培地は１　ｖ／ｖ％のウ
シ胎児血清及び最終濃度５μｖ／ｄのアクチノマイシン
Ｄｆ：含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
その組成は、たとえは、「組織培養」中井準之助他編集
、朝倉壺店、１９６７年に記載されている）を用いた。

マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空気中、３７
℃で２１時間培養した。培養終了後、グルタルアルデヒ
ド２０μｔを加え細胞を固定した。同定後、マイクロプ
レートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレンブルー溶
液を０．１ｍｌ力ばえ、生き残った＋ｔ４＋１胞を染色
した。

余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残ったメ
チレンブルーを０．３６Ｎ塩酸溶液で抽出し、その６６
５　ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マルチスキ
ャン（フロー・ラボラトリ−社、米国）で測定した。こ
の吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ９２９細
胞の５０％を殺すために必要な生理活性量を１単位／ｒ
ｒｔと定義し、試料を加えない対照の吸光度の５０％の
値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算によ
ってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位／
ゴで表記する）とした。

一方、蛋白質量は、Ｂｒａｎｆｏｒｄ　らの方法（Ａｎ
ａｌ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２巻２４Ｂ　−２５４Ｅｌ　（１
９７６年）〕により、クーマシー・ブリリアント・ブル
ー０２５０を用いる色素結合法から算出した。

実施例１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌つサギ（体重２．５〜３．０に９）Ｋホルマリンにて
死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａ
ｃｎｅｓ　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒ
ｖｕｍ、ウェルカム社、英国）５０ｑを耳静脈より注射
しｊｔ−ｏ該つサギに８日後再度１００μ２のエンドト
キシン（大腸１０ｚ６：　Ｂ６由来のりボボリザツカラ
イド、ディフコ社、米国）を耳静脈より注射し、２時間
後にノウ臓より全採血した０採取した血液Ｋ　Ｚｏｏ−
当り　１００単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５
．００Ｏｒｐｍで３０分間冷却遠心操作を行ない、血球
および不溶固型物を除去した。

４０羽のウサギより、血清ＴＮＦ下３　Ｘ　１０’単位
／ｌｒｔの力価を有する血漿２．４ｔが得られた。

実施例２（血清ＴＮＦの部分精製） 実施例１で得た血漿２．４１ＶＣセライト２４２を加え
、１時間攪拌しん後炉遇した。Ｆ液に１．２ｔの０．０
４Ｍ）リスー垣酸緩衝液（ｐＨ７，８）を加えた後、０
．１　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４　Ｍ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で充分に平衡化したＤＥＡＥ
セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムＩｃ　’ｌｌ’ａ加した。０．０４Ｍ）リ
ス−塩酸緩衝液で洗滌後、０．１８　Ｍ塩化ナトリウム
を含む０．０４Ｍ）リスー塙酸緩衝液（ｐＨ７，２）　
を用いて死出した。Ｌ細胞障害活性を示す両分を、限外
濾過により渓縮した。次いでｏ、ｔｓＭ＃、ｆｆｉ化ナ
トナトリウムむ５　ｍＭ　’）ン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）で平衡化したセファクリルＳ　−２００（ファルマシ
ア社、スウェーデン）のカラムに該濃縮液を躇加し、同
緩衝液にてゲル濾過を行った。活性区分は限外濾過によ
りぬ縮し３．５　Ｘ　１０’単位を回収した。蛋白延量
に基く比活性は１８ＸｌＯ’羊位／ｎｑであつｌこ。

実施例３（抗ＴＮＦ抗体） 血清より得たＴＮＦを実施例２０ヌ１４＜部分４＋ｊ製
しフロイントの完全アジュバントを１＝１で混合し１２
週令の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部皮下に注射した０２
週後、及び４週後にこの操作を繰返し、更ｖｃ１週後に
全採血し、その血清°を取得した。

この血清をＬ細胞障害活性を測定する培地中に終濃度５
００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得ｆｃ
　ＴＮＦのＬ細胞障害活性を測定したところ、Ｌ細胞障
害活性は認められなかった。ここに得たマウス血清は、
ウサギ血清ＴＮＦ　ｖｃ対する抗体（Ｉ５ｊ　ＴＮＦ抗
体と称する）を含むものと結論できた。

実施例４　（ＴＮＦ鹿生純生細胞取 得つサギにホルマリンにて死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ　（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ、ウェルカム社、英国
）を静脈内投与し、７日後に気管切開し、肺を生理食塩
水で洗滌することにより浮遊性細胞を得た。この細胞を
生理食塩水で洗滌後、１０チ牛脂児血清〔フロー・ラボ
ラトリ−社、米国）を含むＲＰＭＩ　１６４０　（フロ
ー・ラホラトリー社、米国）を培地とし、炭酸ガス５％
含肩空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベーターにて
、３７℃で培養した。培養器を２コに分け、一方には大
腸菌由来のエンドトキシン（大腸菌０２６：Ｂ６由来の
りポボリサツカライド、ディフコ社、米国）を１０μｍ
／−となるように添加し、−力には同量の滅菌水を添加
した。エンドトキシンを添加した培養上清ＫＬ細胞障害
活性が出現し７７時間で最高値に達した。この活性は、
抗ＴＮＦ抗体で消去されたが、正常マウス血清では消去
されなかった。

一方、エンドトキシンを添加しなかった細胞培養上清に
はＬ細胞障害活性は認められなかった。

実施例ｓ　（ＴＮＦの分子払） 実施例４における細胞培誉においてエンドトキシンと共
に放射性Ｌ　［”Ｓ）メチオニン（１３００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｔ　アマージャム社、英国）をｔ　ｍＣｔ　／ｒｎｌ
（！：なるように添加して培養を行った。培養上清をＬ
ａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　
（１９７０年）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２
２７巻６８０−６８５頁〕に従ってＳＤＳポリアクリル
アミドゲル寛気泳劫により解析した。ゲル濃度は１２．
５％となるように調製した。泳動後エンハンスにュー・
イングランド・ヌクＬ／７−４ｋ、米国）により処理し
、乾燥後、Ｘ線フィルム（フジＲＸ、富士写真フィルム
）に密着露光せしめた。

エンドトキシン存在下に培養した培養上清に、分子お約
１７５００の物質の生成が認められた。

１だ実施例４におりる細胞培養の上清を、上記と同様に
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に刊した後、２
．５％ＮＰ４０（カルピオケム社、米国）で１時間、水
中で２時間振とり後、各泳動レーンを切断分離し、泳動
方向に直角に２羽巾にスライスした。各スライス断片を
Ｌ細胞と共に培養することにより、Ｌ細胞障害性を調べ
た。エンドトキシン存在下に培養上清を展開したレーン
の分子量約１７５００の位置ＫＬ細細胞障害走認められ
、その他の位置には活性は認められなかった。

実施例６　（ｍＲＮＡの取得） 実施例４と同様な細胞培養においてエンドトキシンを添
加後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（微工研に
おける寄託受託拒否通知書の通知番号：　５８微寄文第
１６３６号）を集めた。細胞質ＲＮＡおよびその中から
のｍＲＮＡの抽出は下記の如（Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの茶
件［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、　。

Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　１８巻５２９４頁（１９７
９年）〕に従って行った。細胞３　Ｘ　１０８個に対し
、４−の４Ｍグアニジンチオシアネート済液を加え、ホ
モジナイザー（ＡＭ−７、日本精機製作所）Ｋて破砕し
た。残渣を遠心除去後、２．４２の塩化セシウムをｆｆ
１Ｍし、あらかじめ２．５−の５．７Ｍ塩化セシウム、
０．ＩＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，５）　ｆ：入れである
ポリアロマ−チューブへ静かに重層した。

ベックマン５Ｗ４１０−ター（ヘツクマン社、米国）を
用いて２０℃３００００回転にて１２時間、超遠心分離
を行った後、上清を除き、ベレットを１０ｍＭ）リス、
塩酸緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、　１　％　ＳＤＳを含有
する）１−にて溶解し／こ。この菌液を１　ｍｌのクロ
ロホルム−１−ブタノール（４：１）　混液で抽出し、
水層ｖｃＯ，０５容積の２Ｍ酢酸ナトリウムと、２．５
容積のエタノールを加え、−２０℃で２時間以上放置し
てＲＮＡを沈澱さぜた。遠心にて沈澱を集め、乾燥させ
たのち滅菌水５００μｔに浴解して、細胞質ＲＮＡ溶液
を得た。

上記細胞質ＲＮＡ清液を６８℃、２分間加熱後急冷し、
５００μｔの２倍濃度の１０ｍＭ）リスＥＤＴＡ緩衝液
ｐＨ７，４（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１　ｅ１５ＳＤ
Ｓ及び０．５Ｍ塩化リチウムを名む）を加え、２゛００
■のオリゴ（ｄＴ）−セルロース（ベセスダ・リザーチ
・ラボラドリース・インク社、米国、以下ＢＲＬ社と略
す）力２ムＶＣ展開、１倍濃度の上ｉ己バッファー１ｏ
ｔｎｌで洗浄、晶出緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ
７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＤＳをＳむ）
２−で浴出した。

溶出液Ｋ　Ｏ，０５谷石゛（の酢酸ナトリワム、２．５
容積のエタノールを加えて一２０℃冷却にて沈澱せしめ
た。

沈澱を遠心にて集め、１ｑ度同様にオリゴ（ｄＴ）セル
ロースカラムに吸溜する画分を呆めｌヒ。紫外吸収スペ
クトル分析により、８５μＶのｍＲＮＡ　を回収した。

実施例７　（ｍＲＮＡのサイズ分画） 芙施秒１」６と同ｔ３４に、して得たｍＲＮＡ　８８０
μ２を２５０μｔの水ＩＣ沁Ｓし、５−２５　％直線シ
ョ糖密度勾配ｌ〇−に重層した。ショ糖密度勾配は、５
および２５チのショ糖を各々賞むトリス緩衝液（２５ｍ
Ｍ　）リス塩酸ｐＨ７，２，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１％
ＳＤＳを含有する）を用い、ｌ５ＣＯ５７０グラジエン
ター（イスコ社、米国）により作製した。

ペックマン５Ｗ４１Ｔｉを用い、４℃４００００回転、
１２時間の超遠心を行ったのち、分両回収装図（ベック
マン社、米国）により各４００μｔの分画を回収した。

各分画Ｕ：Ｊ、エタノール沈澱し、遠心後滅菌水に溶解
した。

実施例８　（ｍ、ＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍＲＮＡの翻訳は、
実紗曹（例えば寺岡宏、五木幹男、日中兼太部、蛋白質
、核酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９８
１年）に依った。アフリカッメガエルは、浜松生物数羽
より得た。実施例５で得た分画ｍＲＮＡを（１μ２／μ
ｔ　になるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり
、５０　ｎＡずつを微量注入し、ｌπ−の牛血清アルブ
ミンを含有するＢａｒｔｈ　ｌ液（７，５ｍＭ）リス塩
酸ｐＨ７，６，８８ｍＭ食塩、１　ｍＭ塩化カリ、０．
３３　ｍＭ硝酸カルシウム、０．４１　ｍＭ　ｋｊｉ化
カルシウム、０．８２　ｍＭ　ｉｆ　酸マグネシウム、
２．４ｍＭ重炭酸ナトリウム、１８　’　Ｕ／ｄペニシ
リンＧ１１８μｙ／ｍｔストレプトマイシンを含有する
）中で２４時間培養した。培養液のまま卵母細胞をつぶ
し、遠心後、上溝のＬ　Ｘ４ｉ１胞障害性を測定した。

沈降定数１６Ｓ句：ｉａ、ＶＣおいて、Ｌ細胞陣害活性
が最高値を与え／こ０またこの活性は実施例３で得た抗
ＴＮＦ抗体によシｒ１１去されたが正常マウス血清でに
、１′ｒｊ去されなかった。

実施例９（形質転換体の取得） 実施例５て得た分画ｍＲＮＡを５μ２用い、実験書（１
）９７頁以降に従って、二止鎖ＤＮＡをｉｕ；ｉｆ鳥し
た。

逆転写ｒ４ｙ鍬はライフザイエンス社（米国）のものを
使用した。二ｉ鎖ＤＮＡを、３．５％ゲル□、（度のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にて分画し、狡さ約１０
００〜２０００　垣）・七対（以下塩基対をｂｐと略す
）の−分３３０ｎグを得た。この１１分７ｎｌＰを用い
同上の丈鉄沓に従い、ターミナルデオキシヌクレオテジ
ルトランスフエラーゼ（ＢＲＬ社）ｆ：用いてデオキシ
Ｃ鎖をつなき゛、同様にＰｓｔ　Ｉ部位にデオキシＧ鎖
をつないだプラスミドｐＢＲ３２２５６ｎｆ！ト７ニシ
ルぜしめた。アニール後の混合物を用いて大腸菌Ｅ、　
ｃｏｌｉＫ−１２株（ＨＢ　１０１　、　ＡＴＣＣ３３
６９４）を形質転換し、１２０００株の形質転換体を得
た。

実施例１０　（ＴＮＦのｉＢ分アミン眩匡夕１」）実施
例２でｂｉＳ分稲製したＴＮＦを、実施例５におりると
同様Ｋ　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
軸装した。一部全りマジ〜・ブリリアント・ブルー染色
し、分子ｂ【約１７０００の位置にあるバンドをゲルか
ら切出し、１％重炭酸アンモニウムにより抽出した。５
　Ｘ　１０７年位のＴＮＦを使用し、蛋白として約１８
０μｍを回収した。

このうち１５０μｆ　Ｋ？　１％亜炭酸アン七ニウム７
５μＳ’　ＶＣ，４％　、ＴＰＣＫ　Ｆ　！Ｊ　７’シ
ン（ワーシントン・バイオケミカル社、米１！ｉｌ）を
３μ２を碍加し、３７℃、４丙間インキュベートした。

灰地・液をコスモシール５Ｃ８（半回化学）を担体とす
る１「６速成体クロマトグラフィーにより分画し、トリ
プシン消化断片を得た。

上記の如く高純度Ｖｒ、梢製したＴＮＦお゛よびそのト
リプシン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカ
ラムで脱塩し、凍結乾ｆＮ後、アミノ酸シークエンスア
ナライザー・モデル４７ＯＡ　（アプライドバイオシス
テム社、米国）を用いＲ，ＭｌｌｅｗＩｃｋ　らの方法
（Ｊ、　１３ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、　２５６巻７９９０
−７９９７頁、１９８１年）Ｋ準じて、Ｎ末端よりエド
マン分ｉＩ／ｆを行った。

谷ステップにおいて遮熱してくるフェニルｆオヒダント
インアミノ酸は、高速液体クロマトグラフィーモデルｓ
ｐ　５１ｏｏ　（スペクトラフィジックス社、米国）を
用い、ゾルパックスＯＤＳ　（テユ・ボン社、米国）を
カラムとして、常法Ｋｊ：り分析した。この結果、ＴＮ
ＦＯＮ末４ｉ側からのアミノ酸配列は下記の通りであっ
た。

Ｓｅｒ　ＡムＳｅｒ　Ａｒｇ　ＡムＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ
ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｉ、ｅｕ　Ａ／Ｊ　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　ＶａＡ　ＡムＡｓ
ｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｘｒ　ＶａｔＧｌｕ　Ｇｌｙ　ＧＴｈ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｂまたトリプシン消化断片のうちの１つ
は、そのＮ末端より下記のアミノ酸配列であった。

Ｇ／ａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇ／！ＪＩ　ＧｔｕＡｌａ　
Ｇｂａ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ａム実施例Ｕ　（オリゴＤＮ
Ａプローブの合成）実施例１ＯでイυたＴＮＦのアミノ
酸配列から推定されるｍＲＮＡの塩基配列に対し、相補
的な、オリゴＤＮＡを合成した。合成方法は１本発明者
が既に発声している改良リン酸トリエステル法（ＨｏＩ
ｔｏ　ｅｔａｌ、Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅａ
、　１０巻１７５５〜１７６９頁、１９８２年）により
行った。

アミノ酸配列から推定される１ｓ２鍾ｔＡのオリゴＤＮ
Ａを５グループに別け、谷々１６．１６．３２．３２゜
３２種類の混合物として合成した。

表１に本発明の新規生理活性物頂のアミノ１ν配列の一
部と、これに基く５種類の合成オリゴＤＮＡのプローブ
の塩基配列を示す。各々を常法に従って脱保護し、Ｇ−
５０（ファルマシア社、スウェーデン）を用いるカラム
クロマトグラフィー、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動及び、　ＤＥ５２　（ワットマン
社、米国）カラムクロマトグラフィーによりイＩ製し、
０．１ｍＭ　）リスＥＤＴＡ緩衝液に対し、透析した。

各々の精製オリゴＤＮＡを常法により′ｒ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（バイオランドラボラトリ′−ズ社、米
国）およびγ−３２Ｐ−アデノシントリリン＋ｉ２を用
いて放射性ラベルし、ＤＥ５２カラムにより精製した。

各々、約３　ｘ　１１０８ｃｐ／μｉの放射能が導入さ
れた。

実施例１２　（オリゴヌクレオチドの検定）実施例６に
従って得たＴＮＦ産生λ（ｌ胞のｍＲＮＡをグリオキザ
ール及びジメチルスルフオキシドの存在下に５０℃６０
分間処理したのち、１．１％アガロースゲル電気泳動に
より分画した。分画されたｍＲＮＡを、電気泳動式トラ
ンスファーブロツテリンング装置１コ（バイオラッドラ
ボラトリーズ社、米国）を用いて、メーカーのマニュア
ルに従い、移動せしめた。次いで、このｊ艮上のｍＲＮ
Ａと、５ＸＳＳＣ及びｉｓｏμｔ　／ｍｅの変性サケ精
子ＤＮＡを含む５×デンハルトｍ液で６５℃、２時間処
理したのち、放射性標識したオリゴＤＮＡをＩ　Ｘ　１
１０７ｃｐ／ｍｇ、５×ＳＳＣ沼液を剖む５Ｘデンハル
ト溶液で５０℃、２時間処理した。次いでこの膜を６×
ＳＳＣで室温、４０℃、５０℃、６０’Ｃで１ｌｊｉ次
洗滌し、Ｘ線フィルムＭＡＲ−５（コダック社、米国）
に対し露光せしめた。この結果、　ｍＲＮＡと最も強く
ハイブリダイズスルオリゴＤＮＡは、ＭＪであって、Ｍ
Ｊ混合物中にｍＲＮＡと完全に相補的な配列を有するオ
リゴＤＮＡが含壕れていることが判明した。

実施例１３（ＴＮＦ遺伝子のり°ローニング）実施例９
で得た形質転換体を実験８（２）　１６２頁の方法に従
ってニトロセルロースフィルター上に移し、そのＤＮＡ
と、実施例１２で選択された放射性標識オリゴＤＮＡ（
ＭＪ）　とを実施例１２と同様の条件でハイブリダイズ
せしめた（コロニー・）１イブリダイゼーシヨン）。強
くノーイプリタ“イズする株４９個を選び更にフィルタ
ー上に固定して再度コロニーノ・イブリグイゼーション
を実施し、９個を選んだ。

この９個の株から、実ｈ　ｄ　（１）　６頁の迅速プラ
スミド分離法に従って各々約５μＶのプラスミドを取得
した。このプラスミドを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　５Ｔａｑ
　１％　Ｒｓａ　Ｉ、　Ｐｖｕ　ＩＩ　（いずれもＢＲ
Ｌ社）を用い、メーカーのマニュアルに従って切断し、
１％アガロースゲル電気泳動で、各々のｉ尊崇による切
断片の長さを比較した。

この結果、９株すべてが、約５０ｂｐのＰｖｕ　Ｉｆ　
とＲｓａ　Ｉによる断片を有し、８株がＲｓａ　１によ
る約２００ｂｐの断片を有し、共通の配列を有すること
が示唆された。第１図に制限酵素による解析結果を図示
する。

また、このうち７株を１０μｆ／ｒｄのテトラサイクリ
ンを含む２ｍｌのＬ培地中で培養し、遠心にて集めた菌
体を２　ｔｒｔの生理食塩水中で超音波により破砕し、
遠心上清のＬ　ｒｔ４１胞ｉΣ・７−ｇ活性を測定した
ところ、表２に示す如く、Ｌ１罰胞障害活性を示した１
、またこの活性は抗ＴＮＦ抗体により消去され、正常マ
ウス穐消では消去されなかった。従ってこの９株すべて
がＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドを有していることが示
されまた。

以下余白 表２　各種形質転換体によるし細胞障害活性実施例１４
　（ＴＮＡ遺伝子の塩基配列の決定）プラスミドｐＲ１
１，およびｐＲ１７を含有する大腸菌株を、１０μ？／
ｙＪ、のテトラサイクリンを含有するＭ９培地〔実’９
Ａ　書（３）　４４ｏ頁〕ｌｔ中で培養した後、実験書
（３）　９０頁の方法に従ってプラスミドを単離し、各
々約１５０μｔを得た。

各々の塩基配列をマキサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ
　ｅｔ、ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　５５巻４９０頁１９８０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓ＋ｓ　）に従って決定した。また、この塩基
配列（微工研に寄託のため郵送した書留郵便番号第１ｏ
ｏｔｌｌＱ号）と実施例９で決定された部分アミノ酸配
列の一致により、　ＴＮＦ蛋白の全構造が解明された。

実施例１５ プラスミドｐＲ１７の組み変え体を用いてＥ、　ｃｏｉ
ｌ内でｌａｃをプロモーターとしてＴＮＦを直接発現さ
せることを目的にプラスミドの横条を行った。第２図に
示す様に１０μ２のプラスミドｐＲ１２をｌＯユニット
のＡｐａＩ（ＢＲＬ社）で３７℃で２時間消化し、４％
のポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で約６３０　ｂ
ｐ断片を単離した１、約１βの断片がゲルから電気泳動
溶出した。実施例１０と同様の方法によって図示の２個
のデオキシオリゴヌクレオチド即ち、５’−ＧＡＴＣＣ
ＡＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３’とｓ’−
ＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧ　−ａ’　（第２図）
とを合成し、実験書（３）１２２頁に従って約１００　
ｐｍｏｌｅの各デオキシオリゴヌクレオチドの５′末端
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した
０１反応終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにク
ロロフォルム抽出した後、オリゴマーを９．５４の６１
０塩基対のＡｐａ　Ｉ断片と合せてエタノール沈澱した
。実験書（１）３７頁に従がって１０ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで前記の断片を４℃で１夜反応させ結合し
た。

反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニツトのＢａｍ
ＨＩで３７°Ｃ３時間消化し、４チのポリアクリルアミ
ド上の電気泳動にかけ、約６７０ｂｐの断片を電気泳動
浴出により回収した。市販のプラスミドｐＵＣ−８（Ｐ
−Ｌバイオケミカル社、カタログ番号４９１６、米国）
１／をＢａｎ　ＨＩで消化してフェノール抽出、クロロ
フォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベクター
０．５βに約６７０ｂｐのＴＮＦの全構造遺伝子を含む
両端がＢａｍＨＩサイトを持った断片をＴＡ　ＤＮＡ　
！Ｊガーゼを用いて結合した。実験書（４）％　２０頁
に従がって、　Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴＣ
Ｃ３３８７６）を形質転換してＩＰＴＧ　（イソプロピ
ルチオガラクトシド）及びｘ−ｇａＬ（５−ジブロモ−
４−クロロ−３−インドリルガラクトシド）を含む寒天
培地が約２００個の透明プラークを、得た１１これらの
トランスフォーマント１００個からプラスミドＤＮＡを
ｉ、１ＩｉＩ！！！！！し、ＢａｍＨＩで消化したとこ
ろ、１５個が目的の約６７０　ｂｐのＢａｍＨＩ断片を
含んでいた。さらに、挿入の方向を調べるために、上記
１５個のプラスミドをそれぞれ１ケ所しか認識部位がな
いＥ、ｃｏＲＩ（ｐＵｃ　−８上ｖｃ認龍部位かめる）
とＰｖｕＩＩ（約６７０ｂｐの断片上に認識部位がある
）を用いて消化し、６係ポリアクリルアミドゲル電気泳
ｍＪを用いて調べたところ、７個のグラスミドかし目的
の約１４０　ｂｐの断片が確認され、ｐｔｒｃ−ｓ上の
ｌｓｃプロモーターから＋１方向でおることが千」明し
た。

塩基配列の解析により、この７個のプラスミドは同一で
、ｔ＆ｃプロモーター、合成りＮＡ及びｃＤＮＡ間の結
合部に所望のヌクレオチド配列をイコすることが確認さ
れた。

実施例１６ プ９７１．ミドｐＲ１７を用いて、Ｅ、　ｃｏｉｌ内で
ムＣＵｖ５プロモーターとしてＴＮＦを直接発現させる
ことを目的にグラスミドの栴築を行つｌし。第３図に示
す様に１０μ２のグラスミドｐＲ１７をｌＯユニットの
ＡｐａＩ　（ＢＲＬ社）で３７℃２時間消化し、４％の
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６ａｏｂｐの断片
を単離した。約１１１９の断片がダルから電気泳動溶出
した。実施例１Ｏと同様の方法によって図示の２個のデ
オキシオリゴヌクレオチド即ち、５′−ＡＡＴＴＣＡＴ
ＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＣＣ−３′とｓ’−ＣＧ
ＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧ　−３’とを合成し、笑鹸
書（３）１２２頁に従って約１００　ｐｍｏｌｅの上り
己２オ重のテオキシオリコ゛ヌクレオチドの５′木端を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。

反応終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロ
フォルム抽出した後、先に得たｐＲ１７のＡｐａ工消化
断片（約６３０ｂｐ）　０．５μ２　と合わせてエタノ
ール沈澱し１こ。実ｉ＞　ｔＪ’　（１）３７頁に従っ
て１０ユニツトのＴ４リガーゼで４℃１夜沫応させ、結
合せしめた。反応後、反応液をエタノール沈澱し、２０
ユニツトのＦＪｃｏＲ：［で３７℃３時間消化し、４％
のポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によシ約６７０
ｂｐの断片を電気泳動により回収した。

グラスミドｐＯＰ　９５−１５は、フラーの方法（Ｆ◆
Ｆｕｌｌｅｒ、　Ｇｅｎｅ、　１９巻４２Ｍ−５４頁、
１９８２年）に従って調製した。

ｐｏｐ　９５−１５の１　、ＲをＥｃｏＲＩて消化して
フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を
して調製したベクター０．５μ７と、１Ｍ１２の如く合
成デオキシオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦ遺伝子を結合
して得た約６７０ｂｐの断片を、Ｔ、　ＤＮＡ　ＩＪガ
ーゼを用いて結合した。実験省（４）、２０頁に従って
、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３８７６
）を形質転換してＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクト
シド）及びｘ−ｇａ７（５−ジブロモ−４−クロロ−３
−インドリルガラクトシド）を含１＋−寒天ｊ名地上に
わ１５０個の透明コロニー２４むだ。

これらのコロニー１００個からグラスミドＤＮＡを詭製
し、ＥｃｏＲＩで消化したところ１２個が、目的の約６
７０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をイＪしていた。さらに挿入
の方向を調べるために上ｎＵ２１２個のプラスミドをＰ
ｖｕＩＩとＰａｔＩを用いて消化し、１．５係アガロー
スゲル電気泳動を用いて調べたところ、４個のプラスミ
ドカラ目的ノ約１２８０ｂｐ及び２６００ｂｐの１ｖ１
片が確認され、ムｃＵＶ５プロモーターから順方向にＴ
ＮＦ遺伝子が接続されていることが判明した。

塩基配列のが１析により、この４個のプラスミドは同一
で、ムｃＵＶ５ブロモー！−１合成デオキシオリゴヌク
レオチド、及びｃＤＮＡが正しく結合されていることが
ｃｏｇされた（　ｐＴＮＦ　−／！Ａｃ　ＵＶ　５−１
と命名する）。

実施例１７（大腸値の生理するＴＮＦの精製）実施例１
６で得られたプラスミドを含有する大腸菌株を１００μ
２／１ｎｌ！、のアンピシリンを含有するＬ培地５０−
で１夜培養し、５ｔの向上の培地に移して更に３時間垢
養した。インプロピルβ−Ｄ−チオガラクトビシノシド
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、米国）を終濃
ｆ　１　ｍＭ　ｖｃなる様に添加し、更に６時間培養を
続けたのち冷却し、遠心分離により菌株を集めた実施例
１３におけると同様に頭体をｏ、ｏ４Ｍ　）　！ｊスー
塙醒緩伽液（ｐＨ７，８）５を中で超音波破砕し、菌体
蛋白菌液を得た。この溶液は６．７　Ｘ　１０’単位／
ｌのＬ細胞障害粘性を示した。

この浴液を実施例２と同様に精製を行った結果１．２　
Ｘ　１０’単位のＴＮＦを得た。このものの比活性は６
．９　Ｘ　１０７単位／りであった。

実施例１８　（ＭｅｔｈＡ　ｓａｒｃｏｍａ担癌マウス
を用いる活性評価） ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部皮円に２　Ｘ　１０ｓコのＭ
ｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、７日後移植
した腫瘍の大きさが直径７〜８ｕとなり、出血性壊死が
なく良好な血行状態にある腫瘍を有するマウスを選び、
尾静脈より生理食塩水で希釈し／こ０．２７！の試料を
注射し、２４時間後に次の利足基準に則り壊死反応の判
定を行つプζ。

（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性急死 （＋）：中程贋の出血性壊死 （移植癌表面の真中〃・ら５０％以上にわたって壊死） （＠）：顕著な出血性壊死 （移植勉の中央部が重度に壊死し、周 囲の癌組絨がわずかに歿つｌＣ状慇） また、試料投与後２０日目ｖｃ　ｔ＆が几全に退癲した
かどうかを観察し完治率をめた。

以上の方法により測定した、大腸菌の生産するＴＮＦの
活性を表３１Ｃ示す。

表　３ 巣位／匹 ２ＸＩＯ’　５　０　０　１　４　５１５完治率：完全
に癌が退緬したマウス数／実験マウス数

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の新規生理宿性ポリペプチドの遺伝子
を含有するプラスミドの制限酵素切断地図を示す。第２
図は、本発明の組換ＤＮＡであるｐＴＮＦ−ムｃ−１の
調製方法を示すフローシートであり、第３図は、ｐＴＮ
Ｆ−ムｃ　ＴＪＶ　５−１　の調製方法を示すフローシ
ートである。 特許出願人　旭化成工業株式会社 第１図 Ｊ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）　少くとも次のアミノ酸ｉ記列 Ｓｅｒ　ＡｔＩＬＳｅｒ　Ａｒｇ　ＡムＬｅｕ　Ｓｅｒ
   　Ａａｐ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｌｅｕ　ＡムＨｉｓ　Ｖａｔ
   ＶａｔＡムＡｓｎ　Ｐｒｏ　ＧＴｈＶａｔＧｔｕ　ＧＡ
   ｙ　Ｇｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｔｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ
   　ＧｊｎＡｒｇ　ＡムＡｓｎ　ＡムＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔ
   ｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｔｙ　ＭｅｔＬｙ８Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
   Ａｓｐ　Ａｓｎ　ＧムＬｅｕ　ＶａＡ　ＶａＡ　Ｐｒ。 ＡムＡｓｐ　ＧＡｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｉ＃　
   Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＧｔｎＶａｔＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ
   　ＧｈＧｔｎＧｔｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　５ｅｒＴｙｒ　
   ＶａｔＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈ４ｓ　Ｔｈｒ　Ｖａ
   ｔＳｅｒ　ＡｒｇＰｈｅ　ＡムＶａｔＳｅｒ　Ｔｙｒ　
   Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＶａｔＡｓｎＬｅｕ　Ｌｅｕ
   　Ｓｅｒ　Ａ／、ａ　ＩｔｅＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　
   Ｃｙａ　ＨｉｓＡｒｇ　Ｇ／！ＪＩＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇ
   ＩＡＧＩＡＡムＧｔｕ　Ｐｒｏ　ＭｅｔＡムＴｒｐ　Ｔ
   ｙｒ　ＧＡＩ　Ｐｒｏ　Ｉ＆　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＧＡｙ
   　ＧｔｙＶａｔＰｈｅ　Ｇｔｎ　Ｌｅｕ　ＧＩＡＬｙｓ
   　ＧｔｙＡｓｐ　Ａｒｇ　ＬｅｕＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｔ
   ｕ　ＶａｔＡｓｎ　ＧムＰｒｏ　Ｇ＃　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
   Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＡムＧｔｕＳｅｒ　ＧｔｙＧｌｎ　Ｖ
   ａｔＴｙｒ　ＰｈｅＧＬｙ　Ｉ＃　Ｉ＃　ＡムＬｅｕ をコードする塩基配列を含むことを時機とするポリデオ
   キシリポ核酸
2. （２）少くとも次の塩基配列 ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＧ
   Ｔ　ＧＡＣＡＡＧＣＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＣＣＡＣＧＴＡ
   　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＣＡＡＧＴＧ　ＧＡ
   Ｇ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ａ
   ＧＣＣＡＧＣＧＴ　ＧＣＧ　ＡＡＣＧＣＣＣＴＧ　ＣＴ
   Ｇ　ＡＣＧ　ＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧ　ＣＴＣＡＣＧ
   　ＧＡＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣ
   ＧＧＣＣＧＡＣＧＧＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴ
   ＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＴ　ＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧＧＴ　
   ＣＡＡ　ＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＣＧＴＧ　ＣＴ
   ＣＣＴＣＡＣＴ　ＣＡＣＡＣＴ　ＧＴＣＡＧＣＣＧＣＴ
   ＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＡＡＧ　
   ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ　ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ
   　ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＣ
   ＣＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＧＧ
   ＣＣＴＧＧ　ＴＡＣＧＡＧ　ＣＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ
   　ＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　
   ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＧ　ＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧ
   ＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＣＣ
   ＴＧＧＡＣＣＴＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＴＣＣＧＧＧ　ＣＡ
   Ｇ　ＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧ　ＡＴＣＡＴＴ　ＧＣＣ
   ＣＴＧ およびこれに相補的な配列を含むポリデオキシリボ核酸
   。
3. （３）遺伝子コードの縮重に基き、特許請求の範囲（１
   ）のアミノ酸配列を変化させることなく、特許請求の範
   ｌ７１１第（２）項記載の塩基の１′または２以上ｆ：
   置換して得られるポリデオキシリボ核酸。
4. （４）特許請求の範囲第（１）乃至（３）項記載のいず
   れかのポリデオキシリボ核酸と、複製可能なベクターと
   からなる祝製可能な組換ＤＮＡ　。
5. （５）特許請求の５１１ル囲第（４）項記載の複製可能
   な組換ＤＮＡで形質転換された微生物または細胞。
6. （６）少くとも次のアミノ酸配列 Ｓｅｒ　ＡムＳｅｒ　Ａｒｇ　Ａｔ＆Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　
   Ａｓｐ　Ｌｙｅ　Ｐｒ。 Ｌｅｕ　ＡムＨｉｓ　ＶａｔＶａｔＡムＡｓｎ　Ｐｒｏ
   　Ｇｌｎ　ＶａｔＧｈｘ　ＧｔｙＧｌｎ　Ｌｅｕ　ＧＩ
   ＡＴｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＧムＡｒｇＡムＡｓｎ　Ａ
   ムＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＧｔｙＭｅｔ　Ｌ
   ｙ＋５Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａａｎ　ＧｔｎＬｅｕ
   　ＶａｔＶａｔＰｒｏ　ＡムＡｓｐ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　
   Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＩムＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｔｎ　Ｖａｔ
   Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｔｙ　Ｇｔｎ　ＧｔｙＣｙ
   ｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＶａＬＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔ
   ｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　ＶａＡ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈ
   ｅＡムＶａｔＳｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ
   　Ｖａｔ　Ａｓｎ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａム　Ｉ！
   ＡＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　ＡｒｇＧ
   ムＴｈｒ　Ｐｒｏ　ＧムＧｔｕ　ＡムＧｔｕ　Ｐｒｏ　
   Ｍｅｔ　ＡムＴｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉ＃　
   Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｔｙ　Ｇｔｙ　ＶａＡＰｈｅ　Ｇｉ
   ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｂ　Ｌｙｓ　Ｇｔｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ
   　Ｌｅｕ　５ｅｒＴｈｒ　Ｇｌｂ　ＶａＡ　Ａｓｎ　Ｇ
   ｔｎＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＬｅｕ　
   Ａム　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｙ
   ｒ　Ｐｈｅ　ＧｔｙＩｔＩ３　ＩＩＡ　Ａ＆　Ｌｅｕ を含む新規生理活性ペプチド。 （力　特許請求の範囲第（１）乃至（３）項記載のいず
   れかのポリデオキシリボ核酸をＴＭＨ可能なベクターに
   組入れて該ポリデオキシリボ核酸を含む複製可能な組換
   ＤＮＡを得、得られた該組換ＤＮＡで微生物または細胞
   を形質転換させて該組換ＤＮＡを含有する形質転換体を
   得、得られた該形質転換体を培養して該ポリデオキシリ
   ボ核酸の有する遺伝１ｈ報を発現させることからなる特
   許請求の範囲第（４）項記載の新規生理活性ポリペプチ
   ドの製造方法。