JPS60241890A - 新規ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業−Ｌの（す」勿野一 本発明は、ヒトインター［ノイキン２抗体を精製する際
の試薬として用いることができるポリペプチドを産生ず
る、ヒト免疫インターフＪ「イン（以下、ヒトＩＦＮ−
γと略称することらある。）のペプチドをコ−１・する
構造遺伝子を有するＩ）　Ｎ　Ａおよびヒトインターロ
イキン２（以下、ヒｌ−１１−２と略称することらある
。）のペプチドをコードする構造遺伝子を有するｌ）　
Ｎ　Ａを連結してなるＤＮＡ、およびその用途に関する
。

蓚摩−のＬ鼾 インターフェロンは、高等動物の細胞かウィルスや核酸
などの刺激によって誘発されて産生する蛋白質であり抗
ウィルス作用、抗腫瘍作用などを有する。ヒトのインタ
ーフェロンには、現在、α型、β型およびγ型の３種の
性状の異なるタイプが存在することが知られており、γ
型はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起るような
状況下３− で、免疫担当細胞から産生されるため、免疫インターフ
ェロンとも呼ばれている。γ型は、α型やβ型と比較し
て、抗細胞増殖活性や抗腫瘍活性が高いといわれており
、臨床的応用面からより期待されている。しかし、その
産生に新鮮なリンパ球が必要であることなとの制約があ
るため、天然のものを用いる効率の良い産生糸は確立さ
れていない。そこで、遺伝子操作技術を利用して、ヒト
免疫インターフェロンのペプチドをコードする構造遺伝
子が組み込まれたプラスミドで形質転換された形質転換
体を培養することにより、ヒトＩＦＮ−γを大量に得ら
れるようになった。［Ｎ　ａｒｕｒｅｇ９−！！、５０
３　（１９８２）；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａ−ｒｃｈ　、！０．２４８７　（１９８２）　
；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１
０．３６０５　（１９８２）；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　Ｎ
Ｏ，１１，２９（１９８２）；Ａｂｓｔｒａｃｔ　ｏｒ
　４　ｔｈ　＋　ｎｔｅｒｎａＬｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐ
ｏｓｉｕｍｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｌ　ｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ−ｓｍｓ　Ｋｙ
ｏｔｏ　ｐ、　３０（１９８２）］。一方、インターロ
イキン２　［以前はＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）と４− 呼ばれた。］は、レクチンやアロ抗原等で刺激されたＴ
細胞によって産生されるリンホカインである　［５ｃｉ
ｅ−ｎｃｅ　１９３．　＋００７　（１９７６）　；　
Ｉ　ｍｍｕｎ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ−ｖｉｅｗ　５１．２５７　（１
９８０）］。１１．２は、Ｔ細胞をインビトロでその機
能を保持したまま増殖させ長期間の継代維持を可能にす
るほかに、今までに胸腺細胞のマイト−ツエン反応を促
進したり（コステイミュレーダー）、ヌードマウス脛細
胞のＴ細胞依存性抗原に対する抗体産生能を回復させた
り（Ｔ細胞リブレーシングファクター）、キラー細胞の
分化増殖を促進する（キラーヘルパーファクター）活性
を有すると報告されている［　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ！
　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌノー３．２９２８（１
９７９）　、　Ｉ　ｌｌｌｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒ
ｅｖｉｅｗ　５鼾、　２５７（１９８０）コ。

しかしながら、ヒトＩ　Ｌ　−２は、天然のものを用い
ての量産は困難であるため、遺伝子操作技術を利用して
、ヒ）　Ｉ　Ｌ−２構造遺伝子が組み込まれたプラスミ
ドで形質転換された形質転換体を培養することにより、
ヒトＩ　Ｌ　−２を大量に得られろようになった［’Ｎ
　ａｔｕｒｅ　、’（０−２−、３０５（１９８３）；
　Ｈｉｏｃｈ（Ｎｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｌ（１ｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ　Ｒ（！５ｅａ−ｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃ
ａｔｉｏｎｓ　ｖｏｌ　１０９．　ｊｌＯ，２，ｐ、：
（６３（１９８２）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｆ、４３ｏ７（１９８３］。

発明が解法りよう−と４−る−問題点 前記のとおり、　ヒトＩＦＮ−γのペプチドあるいはヒ
トＩ　Ｌ−２のペプチドをそれぞれ中独でコ　ド４−る
構造遺伝子によるこれらの発現が、それぞれ弔独で試み
られてきたが、本発明はこれら２種の異なる免疫学的あ
るいは生物学的活性を持−）異種蛋白の新規複合体を製
造−４゛ることにある。

問題点を解決するための１段 本発明行らは、ヒトＩＦＮ−γとヒｌ−１ｆ−２との異
種蛋白の複合体を遺伝ｒ−工学の手法を用い製造したと
ころ、該複合体はヒトＩＦＮ−γのもり抗ｒ゛ノイルス
作用およびその抗原性とヒトｌ　Ｌ　−２のも９′Ｉ゛
細胞増殖作用およびその抗原性との両方の性質を【丁し
ていることを見いたし、これに基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成した。

４−なわち本発明は、（１）　ヒｌ−１１”　Ｎ　γの
ペプチドをコ−１・する構造遺伝ｒをイｉずろＩ）　Ｎ
　Ａおよびヒト１１、２のペプチドをコ　１・４−る構
造遺伝子をｆ）−４゛るｌ）　Ｎ　Ａをそれぞれ読み取
り枠をそろえて連結してなるＩ）　Ｎ　Ａ　。

（２）　ヒトＩＦＮ　γのペプチドをコ　ｌ・する構造
遺伝ｒ−を有するｌ）　Ｎ　Ａおよびヒト１１、２のペ
ブヂｌ、をコートする構造遺伝ｒをイ１°−４゛るＩ）
　Ｎ　Ａをそれぞれ読み取り枠をそろえて連結してなる
Ｉ）ＮＡが組み込まれたプラスｌ’。

（３）　ヒトＩＦＮ　γのペプチドをコ　ｌ−４′る構
造遺伝ｒを有するＩ）　Ｎ　Ａおよびヒｌ−１ｆ−２の
ペプチドをコ−１・する構造遺伝ｒ・をｆｉ４”ろＩ）
　Ｎ　Ａをそれぞれ読み取り枠をそろえて連結してなる
１）ＮＡか組み込まれたプラスミドて形質転換された形
質転換体２ （４）　ヒトＩＩ”Ｎ　γのペプチドとヒト■１，２の
ペプチドとを結合したポリペプチド、および（５）　ヒ
トＩ　ＦＮ−γのペプチドをコ　ｌ−４゛る構造遺伝子
を有するＩ）　Ｎ　Ａおよびヒ１−ＩＬ２のぺ　７− ブヂトをコートする構造遺伝子を存するＩ）　Ｎ　Ａを
それぞれ読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組
み込まれたプラスミドで形質転換された形質転換体を培
地に培養し、培養物中にヒトＩＦＮ−γのベプ千Ｆとヒ
トＩＬ−２のペプチドとを結合したポリペプチドを生成
蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該ポリペ
プチドの製造法である。

本明細書においては、ヒトＩＦＮ−γのペプチドとヒト
ｌ　Ｌ−２のペプチドとを結合したポリペプチドをイン
ターリュー　Ｉｆン（Ｉ　ｎｔｅｒｌｅｕｒｏｎ）　７
２と称し、あるいは単にＩＬｆｌ−γ２と略称すること
もある。

本発明でいうヒトＩＦＮ−γのペプチドとは、ヒトＩＦ
Ｎ−γ特有の活性を有するものであればいずれでもよい
。　たとえば、本来、ヒトＩＦＮ−γが　１４６個のア
ミノ酸から成るペプチドであるのに対して、カルボキシ
ル末端側及び、アミノ末端側のアミノ酸が幾つ欠けても
よいし、また、さらに幾つ結合しているものでもよい。

要は、８− ヒｌ−Ｉ　Ｆ　Ｎ　γ特有の活性を失わないムのをいう
。

特に本発明では、カルボキシル末端側が１１残基欠損し
たペプチドが好ましい。

本発明のヒｌ−１１”　Ｎ−γのペプチドをコ　１・°
４゛る構造遺伝子の例としては、たとえば、Ｎａ［ｕｒ
ｅ２９５、５０３　（１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１０、２４８７　（１９８
２）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｉｔｅｓｅａｒ
ｃｈ！−９，３６０５（１９８２）、　Ｆ１本特開昭５
８−９０５１４号公報、１１本特開昭５８−４８９１９
７号公報、［−１本特許出願昭５８１７６０９０号明細
書（日本特開昭５９−１８６９９５号公報）、　＋１本
特許出願昭５８−４５７２３号明細書（（−１本特開昭
５９１６９４９４号公報）なとに２載された分子１１１
７０００　ｊ　＋　０００のペプチドであって、抗細胞
増殖活性１抗腫瘍活性をＩｆするしのをコ−１・する構
造遺伝−ｒが挙げられる。

］−記ロ本特開昭５８−１８９！９７号公報には、式％
式％ ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡＧＣＧ　ＧＡ
Ｔ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴＣＴＴ　ＴＴＣＴＴＡ　Ｇ
ＧＣＡＴＴ ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＡＡＡＧ　Ａ　Ｇ　
Ｇ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＡ　Ｇ　ＡＡＡＡ
　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣＣＡＡ　ＡＴＴ　Ｇ
ＴＣＴＣＣＴＴＴ ＴＡＣＴＴＣＡＡＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ ＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴＧＡＣＣＡＧ　
ＡＧＣＡＴＣＣＡＡ ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＡＴＣＡＡＧ
　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＴＧ ＡＡＴ　ＧＴＣＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＣＡＡＴ　ＡＧＣ
ＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＧ ＡＡＡ　ＣＧＡ　（’；ＡＴ　ＧＡＣＴＴＣＧＡＡ　Ａ
ＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＡＡＴＴＡＴ　ＴＣＧ　ＧＴＡ
　ＡＣＴ　ＧＡＣ’ｒＴＧ　ＡＡＴ　ＧＴＣＣＡＡ　Ｃ
ＧＣＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　ＧＡＡＣＴＣＡ
ＴＣＣＡＡ　ＧＴＧ　ＡＴＧ ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＣＣＡＧＣＡ　ＧＣ
Ｔ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＧＧＧＣＡ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃ
Ｔ　Ｇ　’ｒ’　Ｔ　Ｔ　ＣＧ　ＡＣＡＧ−Ｘ（３’）
　（＋） ［式中、ＸはＴＡＡ、ＴＧＡまたＬ！　Ｔ　Ａ　Ｇを示
ず１で表わされる塩基配列を含有するＤ　Ｎ　Ａか挙げ
られており、式（１）で示されるＤ　Ｎ　Ａは（Ｎ）　
Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｎＬｅｕ　Ｌｙｓ　＋、、ｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａ
ｓｎ　ＡｌａＧｌｙ　ｌ１ｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａ
ｌ　Ａｌａ　ＡｓｒｌＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ
　ｒ’ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　
Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｉ”；１ｕＧｌｕ　Ｓｅｒ　
Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ＭｅｔＧｉｎ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＴｙｒ　
Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＰｈ
ｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ｌ１ｅ
Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉ
ｌｃ１ｌ− Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌ
ｙｓＰｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
　ＬｙｓＬｙｓ　ＡｒｇＡｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｕ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　
Ｖａｉ　ＴｈｒＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｉ
ｎ　Ａｒｇ　ＬｙｓＡｌａ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　ＧｉｎＶａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉ、ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　
ＡｒｇＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅ
ｕ　ＰｈｅＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　
Ｓｅｒ　Ｇｉｎ（Ｃ）　（ＴＩ） で表わされるポリペプチドまたはそれと等価の免疫学的
もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをコードする
。

上記ＤＮＡ（１）は、その５′末端にＡＴＧ（ＩＩＩ）
を有していてもよい。ＤＮＡ（１）の５′末端に（■）
で示されるＡＴＧを有するときはポリペプチド（■）に
加え、（ＩＩ）のＮ末端にＭｅｔ　を有するポリペプチ
ドまたはこれらと等価の活性を有するポリペ１２− プチドをコードする［日本特許出願昭５８．．　４５７
２３号明細書（日本特開昭５９−１６９４９４号公報）
参照１゜また、Ｔ　ａｎａｋａらによって化学合成され
た式％式％ ＡＡＣ１’Ｃ’ｒ　ＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＡＴＡＣＴＣＴ
　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＡＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＣＡ
Ｔ　ＧＡＡＡＡＧ　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＴＣ
ＡＧ　（ＩＶ） で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡもＩＦＮ−γの
ペプチドをコードする構造遺伝子の例として挙げられる
［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ＲｅｓｅａｒｃｈＳｙ
ＩＩｌｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、　１１．２
９−３２　（１９Ｂ２）］。

さらに、日本特開昭５８−２０１９９５公報１日本特開
昭５９−５１７９２号公報に記載されたＤＮＡが挙げら
れる。

本発明のヒトＩ　Ｌ−２のペプチドとは、ヒトＩ■、−
２活性を有するしのであればいずれでもよい。

たとえば、活性を有する限り、ヒトＩ　Ｌ−２より短い
ペプチドであっても、長いペプチドであってもよい。

該ヒトＩ　Ｌ　−２のペプチドをコ　トする構造遺伝子
としては、たとえば、日本特許出願昭和５８年２２５０
７９号（昭和５８年（西暦１９８／年）１１月２８日付
出願）。

日本特許出願昭和５８年第２３５６３８号（昭和５８年
（西１１９８７年）１２月１３日付出願）、Ｎａｔｕｒ
ｅ　ｖｏｌ、　３０２゜ｐ、３０５（１９８３）、　Ｂ
ｉｏｃｈｅＩｌｌｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍ１ｌｌｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎｓ　ｖｏｌ、　１０９　、　Ｎｏ、　２　。

ｐ、　：（６３（１９８２）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１１、　４３０７　（１９
８３）などに記載されたＩ）　Ｎ　Ａが挙げられる。

上記特許出願昭和５８年第２２５０７９号に記載された
ヒト（Ｌ　−２のペプチドをコートするｌ）　Ｎ　Ａは
、式 ％式％ 中、　コドン１〜１３３で示される塩基配列のＤＮＡ（
Ｖ）が挙げられる。このＤＮＡ（Ｖ）は、その５′末端
にＡＴＧまたは」二記式中コドンＳ、〜Ｓ、。で示され
ろノゲナルコトンを有していてらよく、３′末端ｉ、、
−′Ｉ”　Ａ　Ａ　、　Ｔ　Ｇ　ＡまたはＴＡＧを打４
−ることが好ましく、とりわけＴＧＡが好ましい。

１゛記ＤＮＡ（Ｖ）は、式 ％式％ （１−記式中、ＸはＭｅｔ　または水素を、■ン４゛。

）で表わされろペブヂトをコ　１・七ろ。また、１−記
【１本特許出願昭和５８４１’第２３５６３８号に記載
されたヒｌ−１１、−２のペブヂ］・をコ−１・詣ろＤ
　Ｎ　Ａは、式７式％ （３） （） ［式中、ＸはＡＧＣ，ＡＧＴ、ＴＣＡ、７１”ＣＣ。

′Ｉ″ＣＧ、ＴＣＴ、ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ以外
のコドンまたは水素を示し、Ｙはコドンまたは水酸基を
示す］で表わされる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ
、」−記ＤＮＡ（Ｖｌ）は、式７式％ ［ （） ［式中、ＺはＳｅｔ以外のアミノ酸残基またけ水素を示
４−１の配列をｆ１°４゛るポリペプチドをコ　トずろ
３． １）ＮＡ（Ｖｌ）に関し、Ｘて示されろコドンは、ヒト
１１、−２と実質的に同様の活性をイｊするポリペプチ
ド（■）の一部を構成４゛るアミノ酸をコ　ドする７ｒ
　ｉ”ｙ　（ＩＩ’−し、ＸはＳｃｒをター　トする：
＋トンおよび翻訳Ｐ！＋ｔ″コドンではない）であれぽ
い「れてもヨく、更にその５′末端側にアミノ酸をコ　
１・４°ろコドンを１測具ｌ−有していてもよい。Ｘは
と１）わ１）ＡＴＧであることが好ましい。

Ｙで示さイするコドンは、翻訳終止コドンまたはヒｌ−
Ｉ　Ｌ　２と実質的に同様の活性を有するポリペプチド
（■）の一部を構成するアミノ酸をコード４−ろ＝１ト
ンであればいずれでもよく、　更にその３′末端側にア
ミノ酸をコードするコドンを１測具ＬｒＴしていてもよ
い。Ｙで示されるコドンが翻訳終１１：′１トン以外の
コドンの場合（更にその３′末端側にアミノ酸をコード
正る＝１トンを１測具１″イｒオろ場合を含む）は、３
′末端に翻訳終止コドンをイｌ′詣ることが好ましい。

なおＹで示されるコドンはＩ”　Ａ　Ａ　、　Ｔ　Ａ　
Ｇまたは′ｆ’　Ｇ　Ａであることがより好ましく、と
りわけＴ　Ｇ　Ａてあろごとか々ｒｊしい。

ポリペプチド（■）に関し、Ｚて小さイ］ろＳｅｒ以外
のアミノ酸残基としてはヒト１１７２と実質的に同様の
活性を（ｉ’　４’ろポリペプチドの・部を構成４′ろ
アミノ酸残基てあればい４゛れてもよく、例えば第１表
に示されろアミノ酸残基（但し、Ｓｅｔを除く）が挙げ
られ、更にそのＮ末端側に、例えば、第１表に示される
アミノ酸残基またはこれらアミノ酸残基の複数個で構成
されろペブチ］・をｆｌ”していてもよい。とりわ（１
７，としてはＭｅｔ　または水素が好ましい。

ヒトＩＩ”Ｎ　γのペプチドをコ　ドする構造遺伝ｒを
１丁するＤＮＡ、およびヒト１１．２のペプチドを＝１
−トする構造遺伝ｒ−をｆ了するＩ）　Ｎ　Ａを、それ
ぞれの読み取り枠をそろえて連結−４′る。

連結する方法は、公知の方法に従−・て行なえば良く、
たとえば、ｉ゛４　Ｄ　Ｎ　Ａリガ　ゼを用いてひとつ
のＤＮＡの３′　ＯＩＩ末端と他方のＤ　Ｎ　Ａの２３
− ５′１）末端とをＡ　’Ｔ’　Ｐ存在下で連結させる。

また、両構造遺伝ｒの間にリンカ−を介−４゛るのが好
ましい。

リンカ　としては、たとえばＥｃｏｆｌｌリンカ−（Ｐ
　Ｃｉ’　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　’Ｔ’　Ｔ　Ｃ’Ｔ’　Ａ
　Ｃ）などがあり、ＮｅｗＥ　ｎｇｌａｎｄ　ｒ（１ｏ
ｌａｂｓ社製（米国）、その他の市販されているものを
用いることかできろ。

連結する方法は、たとえば遺伝ｒの末端を大腸菌ポリメ
ラーゼ１（ラーノフラグメント）やＳ１ヌクレア　ゼな
どを用いて平滑末端とし、該末端とリンカ　の末端を’
ｌ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガ　ゼによ。て連結する。ごの
際リンカ−同志の重複連結を除去するために、制限酵素
で消化して粘着末端とする必要がある。制限酵素の種類
はリンカ−の種類により異なるが、たとえばＥｃｏＲＩ
リンカ−を使用したときの制限酵素はＥｃｏＲｌである
。生じた粘着末端を利用して、両遺伝子同志をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結すればリンカ−を介したひとつのＩ）
ＮＡを得ることができる。

ｌ・記両構造遺伝子が連結してなるＩ）　Ｎ　Ａの１−
流２４− に、プ「！モ　タ　を連結４−ろのか好ましい。。

なお、プロモーターのＦ流に連結されるこ々となろ筒構
造遺伝子の順序は、ブ【Ｊモータ　の１−流ニヒトＩ　
Ｆ　Ｎ　γの構造遺伝−０次いてヒトＩ＋。

２の構造遺伝子となるように、あるいは、ブ〔Ｊモータ
　の１４流にヒトｌＬ　２の構造遺伝ｒ次いでヒｌ−Ｉ
　Ｆ　Ｎ−γの構造遺伝ｒ−となる３Ｆ、うに連結され
ろ。ブ「ｌモーター以外の二台の連結の順序け、特にと
われないが、プロモータ　は最ト流に連結ずろことが必
須である。

プ［１モーターとしては、たとえば］・リリプトラフア
ン成（ｒｒｐ）プロモーター、　ｒｃｃ　Ａブ（Ｊモー
タ　、ラクト　スブ［１モータ　等があげられ、とりイ
ー）けｔｒｐプロモーターか好適である。

ブロモ　ターを連結する方法としては、たとえば発現さ
せようとする遺伝子の５′末端に適当なリンカ−を用い
て、翻訳開始コドンＡ　ｉ’　Ｇを付加し、これをブ〔
Ｊモ　タ　の３′末端に連結４゛る。

ごのとき用いる酵素としては’ｒ４　Ｄ　Ｎ　Ａリガ　
ゼが一般的であり、その方法は］１！ｊ述に亭４′ろ。

また、ブ「Ｊモ　タ　のド流には適当な制限酵素の認識
部位が設けられていることが望ましい。

両遺伝ｒ・を連結してなるＤＮＡを宿１：、微生物で発
現さｌろために、ヘクタ　としてプラスミドを用い、ご
イ１に該１）　Ｎ　Ａを組み込む。

該ヘクタ−としてのプラスミドとしては、たとえば、Ｃ
ｏ１Ｅｌ山来のｐＨＲ３２２Ｊ、Ｇ　ｅｎｅ　２！９５
（１９７７）１か最もよく利用されるが、その他のプラ
スミドであってら効率良く発現さ且得る乙のはい４゛れ
をら用いろことができろ。その例としては、たとえは、
トリプトファン合成プロモーターを組み込んたｐｔｒｌ
’＋　７８１．ｐＬ叩　７７１などか挙げられろ。

ごのようにしてｉ４られたｌ）　Ｎ　Ａをプラスミドに
組み込むには、たとえばまず、プラスミドのＤＮＡを適
当な制限酵素で処理して線状にする。これと、前述のよ
うにして得られたｌ）　Ｎ　ＡをＴ　４１）　ＮＡリガ
ーゼで連結する。

このようにして得られた両遺伝子が連結された１）　Ｎ
　Ａが組み込まれたプラスミドで宿主菌を形質転換し、
形質転換体を製造する。

該宿ト閑としては、たとえば」−ノブ６リヒア属菌。

枯苧菌、酵母なとか挙げＣ・れ、」、ノＪリヒア属菌か
特に好ましい。

該」、ノ」、リヒア属菌としてけ、たとえばノぐ腸閉（
Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｉ）ＩＩＮＩ、　ｌ
　Ｎ　ａｚｕｒｅ：　２１７゜１１１０１１１４　（＋
９６８）ｌなとか挙げら相ろ。

該プラスミドで宿−１：、菌を形質転換４ろｈ法はカル
シウム法やブ［川・プラス１−７１、なとか挙げられ、
特にカルノウノ・法か好ましい。

！記方法に、１、−）で得られた形質転換体の　例とし
て、後述の実施例１て製造されたｌ−：　５ｃｔｏ：ｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ　Ｄ　Ｉｆ　ｌ　／ｐｉ　Ｆ　Ｌ　
９９０６か半げらＡ］ろ該微生物は、財団θ、人発酵研
究所（ｌ　ＦＯ、５３２１１本国大阪府大阪市淀川区１
゛　木釘りｎ＋＋７番８５号）に昭和５９年（西暦１９
８４年）３月２７１１に受託番号Ｉ　Ｐ　Ｏ１４３３１
とし−ζ寄託され、上た、本微生物は、１１本国通商産
業省工業技術院微生物１−業技術研究所（Ｆ　ｆｌ　Ｉ
　、　３０５　［＋本国茨城県筑波郡谷Ｉ１１部町束１
丁口１番３号）に昭和５９年（西暦１９８４年）３　）
１２９　Ｉｉに受託番号ＦＩ’：　ｌ？　Ｍ　Ｐ　’ｉ
’５６７と２７− して寄託されている。

このようにして得られた形質転換体の培養に使用される
培地としては、液体培地が適当であり、その中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコ
ース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源
としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コー
ンスヂーブ・リカー、ペブ］・ン、カゼイン、肉エキス
、大（ｉ粕、バレインヨ抽出液などの無機または有機物
質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二
水素ナトリウム、塩化マグネシウムなとがあげられる。

また酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加
してもよい。とりわけ塩化カルシウム・２水和物を約０
１％およびリン酸二水素ナトリウノ、・２水和物を約２
％含有する培地が目的物の生産に有利である。また、培
養するだめの温度、ｐＨ、時間などの条件は、目的物の
生産およびその活性が最高となるように適宜に定められ
るか、一般に培養温度は約２０〜４０℃付近、培養２８
− ｐＩ＋は微酸性から微アルカリ性で、ことに中Ｐ１付近
が好ましく、培養時間は約６〜１０時間Ｒｊ度である。

本発明の発酵に於て１−１的と４−ろポリペプチドは通
常菌体内に蓄積されるので、培養物中に蓄積された該ポ
リペプチドを採取４′るには、ま４−菌体を遠心分離や
ろ過によ−）で集め、これ３１−〇該ポリペプチドを抽
出することにより行なわれる。該ポリペプチドを効率よ
く抽出させるためには、たとえば超音波処理、リゾデー
ム処理、界面活性剤などの化学薬品による処理なとが行
われる。

このようにして抽出された該ポリペプチドの精製は、従
来からの蛋白質あるいはペプチドの精製法、たとえば硫
酸アンモニウム塩析、アルコ　ル沈澱、イオン交換カラ
ムク【Ｊマ］・クラフイ　、セルロースカラ１、り【１
マドグラフイー、ゲルろ適法などの適用により行なわれ
る。

後述の実施例１において得られるＤ　Ｎ　Ａは、第１図
に示されるヌクレオヂト配列のポリヌクレオチドを含Ｙ
ｊ″４〜るＤ　Ｎ　Ａである。

このうち、第１図においてヌクレオヂト配列８４１２と
し−て示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列２−Ｈ７で表イっされるポリペプチド、つま
りヒトｌ　ＦＮ−γをコ　トする。

また、第１図においてヌクレオヂド配列４２５−８２３
として示されるポリヌクレオチドは、第２図においてア
ミノ酸配列！４２−２７４として表わされるポリペプチ
ド、−）まりヒｌ−Ｉ　Ｌ　−２をコートする。

これらのポリヌクレオチドは、直接発現のために、５′
末端に読み取り枠を一致させるように、ＡＴＧをａして
いてもよい。この場合には、Ｎ末端にＭｅｒ　を有４“
るポリペプチドをコートする。

また、これらのポリヌクレオチドは読み取り枠を一致さ
せるたぬに、任意の介在配列を有していてもよい。第１
図において、介在配列とはヌクレオヂト配列４１３−４
２４として示される。この場合には、第２図においてア
ミノ酸配列１３８−１４１　として表イつされるポリペ
プチドをコ−１・する。

萌述したように、ヒトＩＦＮ−γおよびヒト■■、−２
に関しては、それぞれ単独で、それをクドするｍＲＮＡ
が既に分離同定され、ごれらの遺伝子の発現し単独で試
みられているか、本発明のように、２種類あるいは、そ
れ以−１−の遺伝ｒ−を連結して、２種類あるいは、そ
れ以１．の異なる免疫学的らしくは生物学的活性をしっ
た１つの新たなポリペプチドを製造するという概念は、
今までに無いものである。さらに、２種類以ｌ−の独立
な免疫学的もしくは生物学的活性を有する１つのポリペ
プチドは、自然界にしその例か少なく、本発明は、新規
活性蛋白を提０（ずろという点で、遺伝子工学に追随し
たペプチドに学の先駆をなすしのである。

このアミノ酸配列で構成されろｌ　ｌ　Ｒγ２ｔｊヒト
ＩＦＮ−γのもつ抗原性とヒ１−１１．２のもつ抗原性
との両方を有しているために、抗ヒｌ−ＩＦＮ−γ抗体
を用いて１１．１１　７２を精製し、精製したｌ１ｌ−
７２を用いて抗ヒト１１．２抗体を作成精製し、精製し
た抗ヒｌ−１１，２抗体を用いて、ヒトＩ　Ｌ−２を精
製するという一連のヒト−３１＝ １１、−２精製過程の媒体あるいは試薬として使用しｉ
する。この場合、１１、Ｒ−７２が、直接関与するのは
抗ヒトＩ　１．、−２抗体を精製するときであるが、こ
の様な、未知の抗体を作成精製する方法は他に例が無く
、抗体精製の新技術として大きく期待される。

また、１１、Ｒ−７２は抗ウィルス作用に関与するヒト
Ｉ　ＦＮ−γと、Ｔ細胞増殖作用を有するヒトＩ　Ｌ−
２の双方の免疫学的もしくは生物学的活性を有する。　
さらに、本発明のＩＬＲ−７２は、ナチュラルキラー細
胞活性を存する。

本発明のＩＬＲ−７２を用いて、ヒトＩ　Ｌ　−２抗体
を精製する具体例としては次の様な方法が行ない得る。

まず、ヒトＩＦＮ−γ抗体とアガロースゲルヒーズ（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製Ａｆｆｉｇｅｌ　１０など）を結合さ
せた抗体カラムを作成する。この抗体カラムに、Ｅ、　
ｃｏｌｉ　Ｄｌｌｌ／ｐＩ　ＦＬ　９９０６抽出液に含
まれるＩＬＲ−７２を特異的に結合させる。

次に、ヒトｒ　Ｌ　−２で免疫されたラット腹水あ３２ るいはウサギの面清を、Ｌ述のｌ　Ｌｉｔ　γ２吸着Ｉ
ＦＮ−γ抗体カラムと反応させる。ごれを適当な緩衝液
で溶出すると、Ｉ　Ｌｌｔ　γ２の混合液が得られる。

この場合液をＩ）　ＥＡ　Ｅセル〔Ｊ　スカラム（Ｗｈ
ａｔｍａｎ　社製　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５２なと）の
抗体以外の蛋白質を吸着する塩濃度で溶出−４イ１ばヒ
トｌ　Ｌ−２抗体が精製される。

本発明のＩ　Ｌ　Ｒ−７２は、　ヒト１ＦＮ−γの有す
る抗ウィルス作用を有し、１１、２の有オるＴ細胞増殖
作用を有し、さらに本発明の１１，２は、ナチュラルキ
ラー細胞活性を有するので、温血哺乳動物（例、マウス
、ラット、ウサギ、犬、ネコ。

ブタ、ウマ、ヒツジ、ウソ１人なと）のウィルスによっ
てひきおこされる疾病、腫瘍、免疫機能低丁疾壱の予防
、治療に用いることができる。

本発明のＩＬＲ−７２蛋白質は高純度に精製されている
ので、抗原性がなく、低毒性である。

本発明のＩＩ、Ｒ−７２を抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、免
疫増強剤として用いるには、当該蛋白質を自体公知の薬
理学的に許容され得る担体、賦形／ＦＩＩ。

希釈剤なとと共に、たとえば注射剤、カプセル剤などと
して非経［−１的にあるいは経１−１的に投与し得る。

」〕記の投与量としては、温血哺乳動物に対し１［ｌ投
与量は、約１−１００μｇ／Ｋｇ、さらに好ましくは約
１〜１０μｇ／Ｋｇである。

なお、本願明細書および図面において、塩基やアミノ酸
なとを略号で表示する場合、１（月）ＡＣ−ＩｔＪＩＩ
　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｌｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは
当該分野にお（」る慣用略号に基づくものであり、その
例を第１表に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体
がありうる場合は、特に明示しなければＩ７一体を示す
ものとする。

第　１　表 １）　Ｎ　Ａ　デオキシリボ核酸 ｃｌ）ＮＡ　相補的デオキシリボ核酸 ＋？　Ｎ　Ａ　リポ核酸 ｍＲＮＡ　伝令リポ核酸 Ａ　デオキシアデニル酸 ・Ｉ・　デミノル酸 Ｇ　デオキソグアニル酸 Ｃデオギノノヂノル酸 【１　ウリノル酸 （Ｉ　Ａ　ｉ’　Ｐ　デオキシアデノノンーリノ酸ｄ　
Ｔ　ｉ”　Ｐ　デミノン−ニリン酸＋ＩＧ　Ｔ　Ｐ　デ
オキシクアノシンーリン酸（ｌ　ＣＴ　Ｐ　デオキシノ
ヂノン］リン酸Ａ　ｉ’　Ｐ　アデノノン−リン酸 Ｅ　１′１′ＦＡ　エチレンノアミン四酌酸Ｓ　Ｉ）　
Ｓ　Ｆデ／ル硫酸すトリウノ−１Ｇｌｙ　グリノン Ａｌａ　アラニン Ｖａｔ　バリン Ｌｅｕ　ロイシン ｌｉｅ　イソ（Ｊイノン Ｓｅｒ　セリン １’　ｈ　ｒ　スレオニーン Ｃｙｓ　ンステイン Ｍｅｔ　メチオニン ３５− に１ｕ　グルタミン酸 Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　リジン Ａｒｇ　アルギニン １１ｉｓ　ヒスチジン Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｔｙｒ　チロシン Ｔｒｐ　トリプトファン Ｐｒｏ　プロリン Ａｓｎ　アスパラギン Ｇｌｎ　グルタミン ｂｐ　塩基対 実施例 以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。

を衿例１ プラスミドｐＨＩ　Ｔ　ｔｒｐ　１１０１の構築：（１
）プラスミドｐｔｒｐ　？７１の構築発現プラスミドと
して大腸菌のトリプトファン合成のプロモータ一部分［
プロモーター、オペレ３６− −ターを含むＤＮＡ断片、２７６塩基対、ヘネノトら、
ツヤ−ナル・才ブ・モレキコラ−・ハイオロノ−，１２
１，１１３（１９７８）ｌを含むプラスミＦ　ｐｔｒｐ
６０１　（ヘクタ−はｐＩ３ｒえ３２２）を構築した（
英国特許出願公開第２１０２００６号公報参照）。

一方、プラスミドｐｌＮ？　３２２を制限酵素ｆ；：ｃ
。

１１１および制限酵素Ａｖａｌで切断し、得られたテト
ラザイクリン耐性遺伝子を含むＥｃｏｌｊｌ　Ａｖａｌ
断片ののりしろ部分をＩ）　Ｎ　Ａポリメラーゼ１ラー
ジフラグメントでうめた。この断片を’Ｉ’　４１）Ｎ
Δリガーゼを用いてｐｉｒｐ　６０１のＰ　ｖｕ　Ｉ’
ｌの切断部位に結合さｔｔｐＬｒｐ　７０１を構築した
（第３図）。

次にｐｉｒｐ　７０１に２ケ所存在する制限酵素Ｃ１ａ
１切断部位の１つを消去ずろため、ｐｒｒｐ　７０１を
Ｃ１ａｌで部分分解して二つのＣ１ａｌ切断部（Ｖのう
ち一方のみが切断されたものをｉすた。生したのりしろ
部分をＤＮＡボリメラ　ゼ１ラ−ノフラグメントでうめ
たのち、Ｔ　４１）　Ｎ　Ａリガーゼて再度結合させて
ｐｔｒｐ　７７１を得た（第３図）。

（２）プラスミドｐＨＩ　Ｔｔｒｐ　Ｉｌｏ＋の構築。

１１本特開昭５８−１８９１９７号公報に記載の方法で
得られたブラスミｌ”　ｐＨｌ　′ｒ３７０９を制限酵
素Ｐｓ＋Ｉで切断してヒトＩ　ｒ’Ｎ−γの構造遺伝子
を含むＰｓｌｌ断片を得た。この断片を制限酵素Ｂｓｔ
Ｎｌで部分分解し、ヒト１ＦＮ−γ構造遺伝子内にある
ＨｓｌＮ１部位の切断されたｎ５ｔＮ　Ｉ　−Ｐｓ１１
断片を得た。１３ｓｔＮＩ切断部位ののりしろ部分をｌ
）　Ｎ　Ａボリメラ　セ１ラージフラグメントでうめた
のち、前述したトリエステル法によって化学合成した蛋
白合成開始コドンＡ　Ｔ　Ｇを含むオリゴヌクレオヂド
アダプター ＣＧ　Ａ　’ＦＡ　Ａ　’ｒ’　Ｇ　’ｒＧ　’ｒ”ｒ
’　Ａ　ＣＴ　Ｇ　ＣＣＴ　Ａ　′Ｉ’　Ｔ　Ａ　ＣＡ
　ＣＡ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＧ　ＧをＴ　４１）　Ｎ　
Ａリガーゼで結合させた。

一方、１−記アダブターを結合させたヒトＩＦＮ−γ遺
伝ｒを、−１−記　（１）で得られたｐｔｒｐ　７７１
を制限酵素ＰｓＬＩと制限酵素Ｃ１ａｌて切断して得た
断片のトリプトファンプロモーターの下流に挿入してＴ
　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて結合させ、ヒトＩ　
Ｆ　Ｎ　−７発現プラスミドＩ）ＨＩＴｔｒ＋）　１１
０１を構築した（第４図）。

（３）なお、ト記（２）で得られたブラスミ）”　ｐＨ
ＩＴｔ　ｒｐ１１旧をＩｌ］イテプラスミｔ”ｐＨ１Ｔ
ｔｒｐ　２１０１が構築され、これを用いて人揚菌２９
４を形質転換して得らＡ］た菌Ｋ　Ｉ　ンＪリヒア・＝
１す（Ｅ、　Ｃ（山）２９４／ｐＨｌｌ’ｔｒｌ１２１
０１は、Ｆ旧に昭和５９年３Ｊ］　ｌ　９　［：ｌにＦ
ＥＲＭ　１１７５５０として寄託されている（１１本特
開昭５９１８６９９５号公報）。

参考例２ （１）ブラスミｔ；’ｐｉ’　Ｆ　ｌの構築（１）　ヒ
Ｉ−Ｉ　Ｌ−２をコ用・４゛るｍＲＮＡの分離ヒト末梢
血より調製したリンパ球を１２０テトラデカノイルポル
ポ　ル　１３−アセテ　］・（ｉ″ｐ　Ａ　Ｘ１５ｎｇ
／　ｍｌ）とコンカナバリンＡ（４０１ｚｇ／ｍりを含
むＲＰ　Ｍ　ｌ　１６４０培地（１０％の牛脂すこ而１
１１＃を含む）中、３７℃で培養し、１１、２を誘導き
りだ。２４時間後、この誘導したｌＸｌ０１０個のヒト
リンパ球を５　Ｍグアニ−ノンヂオンアネ−１・、５％
メルカプトエタノール、５０ｍＭ　ｉ’　ｒｉｓ−ＩＩ
　Ｃｌ　ｐｌ＋７．６．　ｌｏｍＭ　Ｅ　Ｄ　′ＦＡ溶
液中でテフ「Ｊンポモケナ３９− イザ−によって破壊変性した後Ｎ−ラウロイリルザルコ
ソン酸ナトリウムを４％になるように加え、均質化した
混合物を５．７Ｍ塩塩化センハム溶液５７Ｍ塩化センウ
ｊ、、、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ）６ｍｌ上に重層し、ベッ
クマン５Ｗ２８のローター（ベックマン社製、米国）を
用いて１５℃で２４０００ｒｐＩＩ＋４８時間遠心処理
を行い、１１　Ｎ　Ａ沈澱を得た。このＲＮＡ沈澱を０
．２５％Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム溶液に
とかした後、エタノールで沈澱させ、ｌ０ｍｇのＲＮＡ
を得た。このｎＮＡを高温溶液［０，５ＭＮａＣ１，１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓｉ（Ｃ１ｐＨ７，６，１ｍＭＥｒ）Ｔ
Ａ、０．３％　５ＤＳＩ中でオリゴ（ｄＴ）セルロース
カラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮＡを低塩溶
液（１０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ−ＩＩ　Ｃ１−ｐｉ−１７，
６，ｌ　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ’　Ａ　、　０．３％５ＤＳ）
で溶出させることにより、ポリ（Ａ）を含むｍＲＮ　Ａ
　３００７１ｇを分取した。

このｍＲＮＡを更にエタノールで沈澱させ、０．２ｍｌ
の溶液（ＩＯｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＩＣＩ　ｐＨ７，６，２
ｍＭＥＤＴＡ、０．３％５ＤＳ）に溶かし、６５℃で２
分間処理して１０〜３５％ンヨ糖密度勾配遠心処理（ヘ
ラ４０− クマン５Ｗ２８のロータ　を用いて２０°Ｃ，２５００
Ｏｒｐｍで２１時間遠心分離）することにより分画して
２２分画を得た。この各分画に一ノきＩｔ　Ｎ　Ａの一
部４゛−ノを、アフリカッメガエルの卵母細胞に７１人
し、合成される蛋白質中の１１、２活性を測定し、分画
１１〜１５（沈降定数８８−１５８）にＩＩ、　２の活
性を検出した。この分画のＩ　Ｌ−２ｍｌＮΔは約２５
７１ｇてあ−）た。

（１１）単鎖ＤＮＡの合成 −１−記で得たｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用い、１０
０μｌの反応液（５１１ｇの＋ｎｔｔ　Ｎ　Ａ　、５０
７１ｇオリゴ（（１’ｐ）、ｌＱＱ、：１１．：ｙ７ト
の逆転写酵素、　Ｉ　ｍＭ　４”　ッの　（ｊＡＴＰ、
ｄＣ’ｌ’Ｐ、ｄＧ’ｌ”Ｐおよびｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　、
　８　ｍＭＭｇＣＩｙ、５０ｍＭ　Ｋ、ＣＩ、ｌｏｍＭ
　ノチオスレイトル、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ、
ｐＨ８，３）中で４２°Ｃ，１時間インキコヘートした
後に、フェノールで除蛋白し、Ｏ，ＩＮのＮａ０Ｉ−１
で７０℃、２０分処理してＩｔ　Ｎ　Ａを分解除去した
。

（ｉｉｉ）　二重鎖ＤＮＡの合成 ここで合成された単鎖の相補１）ＮΔを５０７１１の反
応液（ｍＲＮ　ＡとオリゴｄＴを含まない以外は上記と
同し反応液）中で４２℃２時間反応さｌろことにより一
′重鎖ＤＮＡを合成した。

（ｉｖ）　（Ｉｃテイルの付ＩＩｎ この一゛５重鎖ＤＮＡにヌクレア　ゼＳ１を５０μｍの
反応液（−重鎖１）ＮＡ　Ｏ，１Ｍ酢酸すｌ・リウノ、
ｐＨ４，５，０，２５Ｍ　ＮａＣｌ、　１．５ｍＭ　７
．ｎＳＯ，，６０ユニツトの８１ヌクレアーゼ）中で室
温３０分間作用さｌ、フェノールで除蛋白し、エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させた後、これにターミ→゛ルトラン
スフェラーゼを５０μｍの反応液（二重鎖１）　Ｎ　Ａ
　。

０１４Ｍカー１ジル酸カリ、０．３Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ（塩
基）ｐＨ７６，２ｍＭノ千オスレイトール、　Ｉ　ｍＭ
　ＣｏＣｌ、、０．１５ｍＭ　ｄ　Ｃｉ”　Ｐ　、　３
Ｏ−ｉ−−−ッ）・ターミナルトランス７　、ｘラセ）
中で３分間３７℃で作用させ二重鎖ＤＮＡの３′両端に
約１５個のデオキシンチンン鎖を伸長させた。これらの
一連の反応で約３００ｎｇのデオキシンヂノン鎖をもっ
た二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａを得た。

（Ｖ）　大腸菌プラスミドの開裂ならびにｄ　Ｃテイル
の付加 一方、１０７１ｇの大腸菌ブラスミ）；’ｐＨ＋？　３
２２１）　ＮＡに制限酵素Ｐｓｔｌを５０７ｔｌの反応
液（１０７１Ｆ！ｌ）　ＮＡ、５０ｍＭ　ＮａＣ１，６
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｉｔｃｈ　ｐＨ７，４゜６　ｍＭ　Ｍ
ｇＣＩ＋、　６　ｍＭ　２　メルカプｌ−エタノ　Ｊし
１１００ｇｇ／ｍｌ牛血清アルブミノ、２０ユニ川・の
Ｐｓｉｌ）中で３時間３７℃で作用さｌてｐｌ（Ｒ３２
２１）　Ｎ　Ａ中に１カ所存在するｒ）ｓｔｌ認識部＋
７／を切断１２、フＪノールで除蛋白した後、タ　ミラ
ルトう／スフＪラーゼを５０／７１の反応液（１）ＮＡ
　１Ｏｊｉ、ｏ、１４Ｍカコジル酸カリウノー２．０．
３Ｍ　Ｔｒｉｓ−塩基ｐｌ＋　７．６゜２ｍＭｍナノス
レイト　ル、１ｍＭ　ＣａＣｌ、、Ｏ，１５ｍＭ　Ｇ　
Ｔ　Ｐ　、　３Ｑユニ’７１−タ　ミナルトう’７　ス
−／　Ｊラ　ゼ）中で３分間３７℃で作用さ１１−記ブ
ラスミ）・ｐＨＩ？　３２２１）　Ｎ　Ａの３′両端に
約１７個のデオキシグアニン鎖を延長さＵた。

（ｖｉ）　ｃＤＮＡ　の会合ならびに大腸菌υ）バタ？
ｌｉ１転換 このようにしてｉすられた合成−０重鎖ＤＮＡ０．１７
１ｇと１−記ブラスミド　ｐＨ（３２２，０，５７１ｇ
を０．ＩＭＮａＣｌ、５０ｍＭ　ｉ’ｒｉｓ・ｌｌＣｌ
　ｐｌ＋　７．６．　ＩｍＭ４３− ＥＤＴＡよりなる溶液中で６５℃２分間、４５℃２時間
加熱しその後徐冷して会合させＥ　ｎｅａらの方法Ｃ，
Ｉ　、　Ｍｏ１Ｂｉｏｔ、　、些、　４９５（１９７５
）コに従って大腸菌Ｍ　Ｍ　２９４を形質転換させた。

（ｖｉｉ）　ｃｌ）　Ｎ　Ａ含有プラスミドの単離この
ようにして約２０，０００個のテトラサイクリン耐性株
が単離され、これら各々のＤＮＡをニトロセル［アース
フィルターの」−に固定した。次０でＴａｎｉｇｕｃｈ
ｉらの報告［Ｎａｔｕｒｅ、　３Ｑ２．３０５（１９Ｒ
２）コシた１１、−２のアミノ酸配列をもとにしてアミ
ノ酸Ｎｏ、　７４−７８（１，ｙｓ”−旧Ｓ１．．　ｅ
ｕ　−Ｇ　Ｉｎ　Ｃｙｓ）およびアミノ酸ＮＯ，Ｉ２２
−１２６（Ｔｈｒ１′’−Ｐｈｅ−Ｍｅｔｃｙｓ−Ｇ　
ｌｕ）に対応する塩基配列（”ＡＡＡＣＡ’ｒ’　ＣＴ
Ｔ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　”および５′ＡＣＡ　ＴＴＣＡＴ
Ｇ　ＴＧＴ　ＧＡＡ”　）をトリエステル法［Ｃｒｓａ
、　Ｒ、らＰｒｏｃ、Ｎａ１ｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＪ
ＳＡ、？５，５７６５（１９７８）］により化学合成し
た。

このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ボリヌクレオヂド
カイネ−スを用いて５０μｍの反応液（オリ４４− ゴヌクレオチド０．２０μｇ、　５０ｍＭ　ｉ”ｒｉｓ
−１１ｃＩｐｒ−＋　８．０．　ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＩ２
．　ｌ０ｍＭメルカプｌ−ｒ。

り／　−ル、５ＱμＣ１７−”ＰＡＴＰ、３ユニツト’
！’４ポリヌクレオチドプノイネ　ス）中て１時間３７
°Ｃで反応させ、５′末端を３２［）で標識した。ごの
標識されたオリゴヌクＬ・オチトをブ（）−ブとしてＬ
ａｗｎらの方法（Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｉ？ｅ
ｓ、　、　９゜６＋０３（１９８＋）］に従ってに記の
二１−（１セル〔１スフイルター」二に固定したＩ）Ｎ
Ａに会合さり、オ　ｌ・ラジオグラフィーによ−）て１
−１記２種類のオリゴヌクレオヂドブＣｊ−ブに反応す
る菌株を４個中離した。これらの菌株の各々の菌体から
プラスミ＋：’ＤＮＡをアルカリ法［Ｒｉｒｎｂｏｉｍ
　Ｉｌ、　Ｃ，＆Ｉ）ｏｌｙ。

Ｊ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１
−、１５１３（１９７９］によって単離した。次にプラ
スミドＤＮＡの挿入部を制限酵素Ｐｓｔｌにより切り出
し、分離し？＝ニブラスミドうちでその挿入部の長さの
最し長い断片を含むものをえらび、このプラスミドをｐ
ＨＯＴ＋３５−８と名つけた。

（ｖｉｉ）　プラスミドｐＴＦＩの構築ｎｉｉ記（ｖｉ
ｉ）で得られたプラスミドｐｌＬＯＴＩ３５８を制限酵
素１１ｇ１Ａｌで切断し１２９４Ｍ）のＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片を’Ｉ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラ
ーゼで処理して平滑末端とした後、ＥｃｏＲ１リンカ−
ｄＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴｉ’ＣＡ’Ｉ’ＧＧＣＡをＴ４
ＤＮＡリカ−ゼを用いて結合し、　ＥＣｏＲ１リンカ−
の重複連結したプラスミドを除くため、結合物をＥｃｏ
ＲＩで消化し、さらにこの断片を制限酵素ＰＳｔｌで消
化して、ヒトＩＬ−２遺伝子の読み取り枠にそろえて翻
訳開始コドンｒＡ　Ｔ　Ｇ　ｊを付加したＤＮＡ断片を
作製した。

このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲ１とＰｓＬｌで消化
した発現用プラスミドｐｔｒｐ　７８１（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩＩ、　ｐ、　３０
７７−３０８５　（１９８３））にＴ　４１）　Ｎ　Ａ
リガーゼににり結合させた。

この反応によりｔｒｐ　プロモーターの下流に翻訳開始
コドンを有し、読み取り枠を一致させてヒ１−　Ｉ　Ｌ
−２発現プラスミドｒ）ＴＦ＋を構築した（第５図）。

このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換させる
ことにより請求めるプラスミドｐＴＦＩを含む菌株を得
た。

（２）なお、ｌ−記（１）テ得られたブラスミｌ’　ｐ
＋＋、ｏ’ｒ＋３５−８を用いてブラスミＶ　ｐＴＦ４
が構築され、ごれを用いて大腸菌Ｄｌ１１を形質転換し
て得られた菌株エノエリヒア−ｍｌす（Ｅ、　ｃｏｌｉ
　）ＤＨＩ／ｐＴＦ４は、ＩＦＯに昭和５８年１１月２
５日にＩＦＯ１４２９９として寄託されている。　また
、本微生物はＦ旧に昭和５９年４月６１１にＦＥＲＭ　
Ｐ−７５７８として寄託され、該寄託はブダペスト条約
による寄託に切換えられて、ＦＥＲＭ　ＢＰ　６２ｇと
してＦ旧に保管されている。

該形質転換体の製造法を以下に挙げる。

ト記（１）で得られたプラスミドｐｌＬＯＴＩ３５−８
を制限酵素ｔ１ｇｉＡＩ　テ切断し、＋２４９ｂｐ　ノ
１１−２遺伝ｒを含むＤＮＡ断片を得た。ごのＩ）　Ｎ
　Ａ断片をＴ　４１）ＮＡポリメラーゼで処理した後、
アラニンのコドンＧＣＡとメヂオニンのコドンＡ　Ｇ　
ＴをＣ４゛るＣ１ａ　ｌのリンカ− ＣＧ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　’Ｔ’　Ｇ　Ｇ　ＣＡＴ’　Ａ
　Ｔ　Ｔ　Ａ　ＣＣＧ　′ｒ を結合させＣ１ａ　Ｉ　、　Ｐｓｔ　ｌ処理した後、ｐ
ｔｒｐ　７７１４７− のＣ１ａ　ｌ　、Ｐｓｔ　Ｉ　５ｉｔｅにＴ４　ＤＮＡ
　ｉｉｇａｓｅを用いて組み込み、得られた発現用プラ
スミドをＩ）ＴＦ４と命名した。該プラスミドＩ）ＴＦ
４を用いてＣｏｈｅｎ　らの方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

６９、２１１０　（１９７２）］に準じて大腸菌Ｄｌｌ
　１を形質転換させ、当該プラスミドを含む形質転換体
（Ｅ−ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｄｌｌ　ｌ／
ｐＴＦ４）を得た。

（３）ヒトＩＣ−２蛋白質の製造； 」１記（２）で得たＥ、　ｃｏｌｔ　Ｄ）Ｉ　ｌ／ｐＴ
Ｆ４を２５０ｍ１容三角フラスコ内のバクト・トリプト
ン（ディフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）１％、バク
ト・イーストエキス（ディフコ・ラボラトリーズ、アメ
リカ）０５％１食塩０５％およびテトラサイクリン７μ
ｇ／ｍｌを含む液体培地（ｐｔｌ　７．０）５０ｍｌに
接種して３７℃で一晩回転振盪培養した。この培養液を
カザミノ酸０５％、グルコ−０５％およびテトラサイク
リン７μｇ／ｍｌを含むＭ９培地２．５１ｉｔｒｅの入
った５　１ｉｔｒｅ容ノヤ−ファ　メンタ−に移し３７
℃で４時間、ついで３−β−インドリルアクリル酸（２
５μｇ／ｍｌ）を添ｔＪ］１シて、さらに４時間通気攪
拌培葺して培養液４８−− ２．５１ｉｔｒｅを得た。　ごの培養液を遠心分離し、
菌体を集め、−８０℃で凍結して保存した。

−１−記で得られた凍結保存菌体１２１ｇを７Ｍ塩酸グ
アニジン、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　−１１ＣＩを含む抽出
液（ｒ）＋１７．０）１００ｍ１に均一に懸蜀し、４℃
で１時間攪拌した。ごの溶菌液を２８，０００Ｘｇで２
０分間遠心分離してｌ−清９３ｍ１を得た。

Ｌ記で得た−上清を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　・ＩＩｃＩ
緩衝液（ｐＨ１１５）に対して透析後１９，０００Ｘｇ
で１０分間遠心分離して透析」−清９４＋ｎｌを得た。

　このａｌｒｒｔ−清を００１ＭＴｒｉｓ−ｌｌＣｌ緩
衝液（ｐｔｌ８．５）で平衡化したＤＥ　５２（ｒｌＦ
＾Ｅ−セルロース、ワットマン社製、イギリス）カラム
（５０ｍｌ容）に通して蛋白を吸着さＮ１ＮａＣｌ　７
１１度直線勾配（０〜Ｏ，Ｉ５Ｍ　ＮａＣ１，！　１ｉ
ｔｅｒ）を作成してＩＩ、２を溶出させた。活性画分５
３ｍ１をＹＭ−５メンプラン（アミコン社製、アメリカ
）を用いて４８１に濃縮し、Ｏ，１Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＩＩ
ｃＩ（１）１１８．０）　ＩＭ　ＮａＣ１緩衝液で平衡
化したセファクリルＳ−２００（ファルマノア社製。

スエーデン）カラム（５００ｍｌ容）を用いてゲル濾過
を行った。　活性画分２８１をＹＭ−５メンプラノで２
．５ｍｌに濃縮した。　得られた濃縮液をウルトラボア
ＲＰＳＣ（アルテックス社製、アメリカ）カラムに吸着
させ、トリフルオ［Ｊ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶
媒とする高速液体り〔ノマトクラフイ−を行なった。　
カラム、ウルトラボアＲＰＳＣ（４，６Ｘ７５ｍｍ）　
：カラム温度、３０℃；溶出溶媒＾、０．１％トリフル
オ〔Ｊ酢酸９９９％水：溶出溶媒Ｂ、０．１％トリフル
オロ酢酸−９９９％アセトニトリル、溶出ブロクラム、
０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分（５５％八Ｆへ５
％Ｂ）−３５分（４５％＾＋５５％Ｂ）−４５分（３０
％　Ａ１７０％　Ｂ）−４８分（１００％Ｂ）、溶出速
ＩＪｊ、０．８ｍ！／ｍｉｎ　；検出波長、２３０ｎｍ
０　本条件下で保持時間３９分の活性画分を集め、非グ
リコシル化ヒトＩＣ−２蛋白質０．５３ｍｇｆ比活性、
　３０　、００００／ｍｇ　。

出発材料からの活性回収率、３０．６％、蛋白質の純度
、９９％（デンノトメトリ−による）］を含む溶液１０
ｍ１を得た。

−１−記溶液を凍結乾燥に付し、ヒトＩＬ−２蛋白質の
白色粉末を得た。本粉末の比活性は、２６．０ＯＯＵ／
ｍｇであった。

ここで得られたヒトＩＬ−２蛋白質は、上記した式（Ｖ
）で表されるＤＮＡがコ−ド４°るペブヂ）・である。

実施例Ｉ Ｉ　Ｌ　Ｒ−７２のポリペプチドを発現−４るプラスミ
ドｐｉ　ＦＬ　９９０６　の構築およびこれを保有゛４
゛る形質転換体の製造。

参考例１で得られたヒ）ＩＦＮ−γ発現プラスミド＋）
＋１１　’ｒ”ｔｒｐ　１１旧を制限酵素Ｉｆ　１ｎｒ
Ｉと１ｌｐａｌで切断して約４５０ｂりのＤＮＡ断片を
得た。このｒ）ＮＡ断片を、大腸菌ポリメラーゼ１ラ　
ノフラグメントで処理して、平滑末端とした。このＩ）
　Ｎ　Ａ断片にＴ４ｆ）ＮＡリガーゼでＥｃｏＲＩリン
カ　ｐ（ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）を結合さｌて、制
限酵素ＥｃｏｌｌｌとＣ１ａｌで断片して粘着末端とし
た。

一方、参考例２で得られたヒトＩ　Ｌ　２発現プラスミ
ドｐＴＦ＋を制限酵素ｒ：ｃｏｌｔｌとＰｓｔしご切断
して約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これら２つのＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。

さらにこのＤＮＡ断片を、制限酵素Ｃ１ａｌとＩ）ｓｔ
ｌで切断したｐｌｒｐ　７７１　（，１−記参考例１（
＋）、［１本５１− 特開昭５９−４４３９９号公報参照］と結合させてプラ
スミド　ｐｉ　Ｆ　Ｌ　９９０６を構築した（第６図）
。

このプラスミドｐｉ　Ｆ　Ｌ　９９０６を用いて大腸菌
Ｄ１−１１を形質転換させることによりプラスミドｐＩ
ＦＬ　９９０６を含む菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄｌｌｌ／　
ｐｒＦＬ　９９０６　（ｌＦ’ｏ　１４３３１．　ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−７５６７）を得た。

実施例２ （１）　Ｉｔ、Ｒ−γ２を含む菌体抽出液の訳１整：Ｉ
ＬＲ−７２発現プラスミドｐｉ　Ｆ’　Ｌ　９９０６を
含む形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉＤＩＩ　＋、／ｐｉ　Ｐ
Ｌ　９９０６（ＩＦＯ１４３３１，１”ＥＲＭ　Ｐ−’
７５６７）を２０ｍ１の１％グルコース、０．４％カザ
ミノ酸を含むＭ９培地で３７℃４時間培養した後、イン
ドールアクリル酸を３０μｇ／＋ｎｌに加え、さらに３
７°０３時間培養した。

菌体を集め、食塩水で洗ったのち、０５ｍ１の溶菌液（
ｌｏｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−１１ＣＩ、ｐＨ８，０，Ｉｈ
ＭＥＤＴ　Ａ　Ｏ，２Ｍ　ＮａＣ１，Ｉ　ｍＭ　フェニ
ルメチルスルボニルフルオライド、００２％トリトンＸ
　１００゜０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に＠副し０℃
にて４５分、３７５２− ℃にて２分放置して溶菌させた。ごれをさらに軽＜（３
０秒）超音波処理を行って、溶出した菌体のＩ）ＮＡを
切断した後、４℃で１５００Ｏｒｐｍ（ザ　パル５Ｓ３
４０−ター、デ、ボン社製、米国）、３０分間の遠心分
離操作によって−に澄み液を得た。ごの１．澄み液を菌
体抽出液とした。

（２）菌体抽出液のＩＦＮ−γ活性の測定。

前項（１）で得た菌体抽出液の抗ウィルス活性を、ヒト
羊膜由来Ｗ　Ｉ　Ｓ　ＩＩ細胞に対−４゛る水泡ｒｔ：
ｌ’ｌ内炎ウィルス（ＶＳＶ）の細胞変性効果阻止試験
を用いて測定した結果、ＩＦＮ−γ活性は、２Ｘ］０”
単位／１ｉｔｅｒ培養液であった。

（３）菌体抽出液のＩ　Ｌ−２活性。

ヒｌ−Ｉ　Ｌ−２活性の測定は、マウスの’Ｉ’　ＣＧ
　Ｉ”依存性細抱株ＮＫＣ３［日本免疫学会総会記録、
第１１巻２７７頁（１９８１年）コを用いて行った。即
ち、まず２段階稀釈により稀釈された種々の濃度のザン
ブル５０７１１をとり、平底マイクロブレ　ト（ファル
コン社製、米国）に入れた。次いで３ＸＩＯ’個のＮＫ
Ｃ３細胞を含む、１０％牛脂児血清（１０％ｉｘ　ｃ　
ｓ　）含【丁ｒ？　Ｐ　Ｍ　ｌ−１６４０液５０μｌを
加え、炭酸ガスふ卵器内で３７°０．２０時間培養した
。さらに３＋１−デミノンＩ　７１Ｃｉを加えて、４時
間培養したのち、セルバーヘスター　（和研薬工業株式
会＋１製）を用いて、細胞をガラスフィルターにトラッ
プし、洗浄、ろ過、乾燥の後、シンチレーションカウン
ターにより放射活性を測定した。サンプル中のＩＬＲ−
７２の１１．２話性は、１３Ｘ　ｔｏ’単位／１ｉｔｅ
ｒ培養液であった。

なお、−１−記活性は、日本特開昭５８−１１６４９８
号公報に記載された算出方法を基準として測定された。

（４）　１Ｌｆｌ−７２の精製。

１１本特許出願昭５８−１７６０９０（日本特開昭５９
−１８６９９５）、Ｆ、１本特許出願昭和５８−１７６
０９１（日本特開昭５９−８０６４６）に記載されてい
る方法により抗ヒトＩＦＮ−γボリク【Ｊ−ナル抗体を
水不溶性担体アフィゲル１０　（Ｒ１ｏ−Ｒａｄ社、米
国）に結合させた。抗ヒトＩＦＮ　γポリクローナル抗
体−アフイゲル１０カラム１ｍｌに前項（３）で得られ
たＥ、　ｃｏｌｉ　Ｄｌｌ　ｌ／　ｌ　Ｆ　Ｌ　９９０
６　を含む菌体抽出液５ｒＡｌをかけ、２０％デキスト
ロースを含むＰ　Ｂ　Ｓ　（２０ｍＭ　リン酸緩衝液、
ｐｉｌ　６．８．　Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣｌ）５０ｍｌを
用いてカラムを洗浄したのち、０．２Ｍ酢酸、０．］５
５Ｍ　ＮａＣ１溶液５ｍｌを用いて、カラムに吸着した
１１．１（γ２をカラムから溶出し、溶出液をたたちに
中和したのち、Ｐｒ３Ｓ　１ｌｉｔｅｒに対して５℃で
２４時間透析した。この操作により純度８０％以トのＩ
Ｉ、Ｒ−γ２のポリペプチドか約５０％の回収率で得ら
れた。

実施例３ （１）　ＩＩ、Ｒγ２を含む菌体抽出液の調！２：ロ７
Ｒ−γ２発現プラスミトりＩＴ）Ｉ、９９０６を含む形
質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｉ）１１　ｌ　／ｐｉ　ＰＣ
９９０６（ＩＦＯ１４３３１、ＦＥＩＩＭ　Ｐ　７５６
７）を２００ｍ１の１％グルコ　ス、０４％カザミノ酸
を含むＭ９培地で３７°０４時間培養した後、インドー
ルアクリル酸を３０μｇ／ｍｌに加え、さらに３７℃で
３時間培養した。菌体を集め、食塩水で洗った後、２０
ｍ！の溶菌液（０，ＩＭ　’ｌ’ｒｉｓ・ＩＩ　Ｃ＋　
（ｐｉｌ　８　）　７　Ｍグアニジン塩酸）に懸濁し０
５５− ℃で１時間半放置して溶菌させた。　これを４℃で１５
０００　ｒｐＩｌｌ（サーバルＳ　Ｓ　３４　ｏ−ター
）。

３０分間の遠心分離操作を２回行って−Ｌ澄み液を得た
。この４−澄み液を１０１ｉｔｅｒのｌ０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）とｌｏｍＭグリシン−ノン（
ｐｌ（６，５）に対して４℃で３時間ずつ透析し、更に
４℃でｌ　５０００ｒｐｍ（サーバル５Ｓ３４ｏ−ター
）、２０分間の遠心分離操作を行なって上澄み液を得た
。この」二澄み液をＣＭ−セフアゾ・ソクス（Ｃ−５０
）カラムクロマトグラフィー（ｐＨ６，５）にかけて　
ｌ０ｍＭグリシンーＮａ　（ｐＨ６，５）、０４〜１Ｍ
Ｎａｃｌで溶出される両分のうち活性をもつ部分を集め
て菌体抽出液とした。

（２）１１．、Ｒ−γ２のナチュラルキラー（ＮＫ）活
性測定： １１、Ｒ−γ２のＮＫ活性を、アドノくンスト・キャン
サ−・リサーチ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅ５−ａｅｒｃｈ）第２１巻３０５頁（１９７８）に記
載の方法に従って測定した。

標的細胞としてヒ１−Ａ５４９細胞（赤面白血病５６− 細胞）を用い、ＣＭＥＭ　（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｉｎ
ｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）で培養し
て細胞数力’　４−６ｘ１０１′のものをＮａ”ＣｒＯ
２で標識した。　またＪ−フェクター細胞としてヒト末
稍１（１１単核細胞（１）ｒ（ＭＣ）を用いた。ＰＢＭ
Ｃ（３ｘ　Ｉ　０６／ｍ１ｌＪ、ｃＭＥＭで培養して活
性化しておいた。０１ｍ１の標識された標的細胞（Ｉ　
ｘ　ｌ　０５／ｍｌ）を０．１ｍｌのエフェクター細胞
に加ええた。このときのゴ４フＪクター細胞を標的細胞
の細胞数の比は２，５：Ｉ。

５：Ｉ、１０・１に変化させた。　−夜、３７６Ｃで放
置した後培養上清を集めてγ−カウンターで測定した。

標的細胞だけをＣＭ　Ｅ　Ｍ中で放置しｌ二ときに自然
に放出される５１Ｃｒはたかだか１５％でありｔこ。

ＮＫ活性の百分率（細胞障害活性（％））は次式によっ
て算出した。

１００（％） このようにして測定される値をＯ，ｌＬＪの１１、−２
＃在下、ＩＯＵのＩＦＮ−γ存在下、１ＬＲ−７２（０
，ＩＩ　ＩＬ−２，ＩＯＵ　ＩＦＮ−γ相当）の存在下
、０．ＩＵ　ＩＬ−２，ｌＯＵ　ＩＦＮ−γ同時存在下
のそれぞれの条件でしらべた。

なお、１１−２は、上記参考例２で得られたペプチドを
用いた。　また、ＩＦＮ−γは、日本特開昭５８−１８
９１９７号公報に記載の方法で得られたペプチドを用い
た。

その結果、第７図に示したように、Ｉ　＋、、　Ｒ−７
２はＩ　Ｌ−２およびＩＦＮ−γがそれぞれ単独に存在
する場合よりもＮＫ活性が高いことが判明した。尚、第
７図において、−ム一はＩ　ＦＮ−γ（１０Ｕ）のプロ
ットを、−一−はＩＬ−２（０，ＩＵ）のプロットを−
Ｏ＝はＩ　Ｌ　Ｉ（−γ２（ＩＬ−２，ＯＩ　Ｕ：Ｉ　
ＦＮ−γ、ｌ０Ｕ）のプロットをそれぞれ示す。

発明の効果 本発明のＩＬＲ−７２を用いると、ヒト１１、−２を効
率良く精製することができる。　また、本発明のＩＬＲ
−７２は、抗腫瘍剤などとして用いることかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＩＦＮ−γのペプチドをコ−ト４゛る構造
遺伝子を有するＩ）　Ｎ　Ａおよびヒトｌｌ７２のペプ
チドをコードする構造遺伝子を有するＤＮＡを連結して
なるＤＮＡのヌクレオチド配列を、第２図は第１図に示
されるヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を、第３
図は参考例１（Ｉ）の構築図をそれぞれ示す。 第４図は参考例１（２）の構築図を示し、１部はヒｌ−
Ｉ　Ｆ　Ｎ−γのペプチドをコートする部分を示す。 第５図は参考例２　（Ｉ　Ｘｖｉｉ）の構築図を示す。 第６図は実施例１の構築図を示し、：＝　部はヒトＩ　
Ｌ　−２のペプチドをコードする部分を、二部はヒトＩ
ＦＮ−γのペプチドをコードする部分をそれぞれ示す。 第１図−２ 脅　砦 ｃｃｃ −）づきあり 狩　餐　脅 ｋ　紮　曽 第２図−１ ＭＥＴ　ＣＹＳ　ＴＹＲＣＹＳ　ＧＬＮ　ＡＳＰ　ＰＲ
ＯＴＹＲＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲＰＨＥ　ＡＳＮ　ＡＬ
Ａ　ＧＬＹ　Ｈ工５ＴＨＲＬＥＵ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　Ｇ
ＬＹ　工ＬＥ　ＬＥＵ　ＬＹＳＡＲＧ　ＬＹＳ　ＩＬＥ
　ＭＥＴ　ＧＬＮ　ＳＥＲＧＬＮ　工ＬＥＰＲＥ　ＬＹ
Ｓ　ＡＳＮ　ＰＨＥ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＧＬＮ
ＴＨＲ工ＬＥ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　ＭＥＴ　ＡＳ
Ｎ　ＶＡＬＬＹＳ　ＬＹＳ　ＡＲＧ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　
ＰＨＥ　ＧＬＵ　ＬＹＳＡＳＰ　ＬＥＵ　ＡＳＮ　ＶＡ
Ｌ　ＧＬＮ　ＡＲＧ　ＬＹＳ　ＡＬＡＭＥＴ　ＡＬＡ　
ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＳＥＲＰＲＯＡＬＡ　ＡＬＡＳＥＲＰ
ＲＯＧＬＵ　ＰＨＥ　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＰＲＯＴＨＲＧ
ＬＮ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＨＩＳ　ＬＥ
Ｕ　ＬＥＵＡＳＮ　ＧＬＹ　工ＬＥ　ＡＳＮ　ＡＳＮ　
ＴＹＲＬＹＳ　ＡＳＮＴＨＲＰＨＥ　ＬＹＳ　ＰＨＥ　
ＴＹＲＭＥＴ　ＰＲＯＬＹＳＶＡＬ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　
ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＬＥＵＳＥＲＡＳＰ　ＶＡＬ
　ＡＬＡ　ＡＳＰ　ＡＳＮ　ＧＬＹＡＳＮ　ＴＲＰ　Ｌ
ＹＳ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＳＥＲＡＳＰＶＡＬ　ＳＥＲＰ
ＨＥ　ＴＹＲＰＨＥ　ＬＹＳ　ＬＥＵＳＥＲ工ＬＥ　Ｇ
ＬＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲＶＡＬ　ＧＬＵＬＹＳ　ＰＨＥ　
ＰＨＥ　ＡＳＮＳＥＲＡＳＮ　ＬＹＳＬＥＵ　ＴＨＲＡ
ＳＮ　ＴＹＲＳＥＲＶＡＬ　ＴＩＪｉＲ工ＬＥ　ＨＩＳ
　ＧＬＵ　ＬＥＵ　工ＬＥ　ＧＬＮ　ＶＡＬＬＹＳ　Ｔ
ＨＲ（３ＬＹ　ＬＹＳ　ＡＲＧ　ＬＹＳ　ＡＲＧＳＥＲ
ＳＥＲＳＥＲＴＨＲＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＨＦ？ＬＥＵ　
ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＭＥＴ　工ＬＥ　ＬＥＵＰＲ
ＯＬＹＳ　ＬＥＵ　ＴＨＲＡＲＧ　ＭＥＴ　ＬＥＤＬＹ
Ｓ　ＡＬＡ　ＴＨＲＧＬＵ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＨＩＳ第
２図−２ ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　Ｇ
ＬＵ　ＬＥＵＡＳＮ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＳＥＲ
ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＰＨＥＩＬＥ　ＳＥＲＡＳＮ　ＩＬＥ
　ＡＳＮ　ＶＡＬ　工ＬＥ　ＶＡＬＴＨＲＴＨＲＰＨＥ
　ＭＥＴ　ＣＹＳ　ＧＬＵ　ＴＹＲＡＬＡＧＬＵ　ＰＨ
Ｅ　ＬＥＵ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＴＲＰ　ＩＬＥ　ＴＨＲ
ＴＨＲＬＥＵ　ＴＨＲ ＬＹＳ　ＰＲＯＬＥＵ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＬＥ
ＵＨ工Ｓ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＰＲＯＡＦ？Ｇ　ＡＳＰ　
ＬＥＵＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＳＥ
ＲＧＬＵＡＳＰ　ＧＬＵ　ＴＨＲＡＬＡ　ＴＨＲＩＬＥ
　ＶＡＬＰＨＥ　ＣＹＳ　ＧＬＮ　ＳＥＲ工ＬＥ　工Ｌ
Ｅ　ＳＥＦ？第３凶 算４　口 ｐＨＩＴ　３７０９ 冒 さく 只 ｉ＜１　− 第１頁の続き ｏＩｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ
１：１９ノ　６’／６（Ｊ−４１３ヨト　続　全階　−
ｉＥ　書（自発） 昭和６０年６月２１Ｂ 　− １事件の表示 昭和６０年特許願第１８３４８号 ２　発明の名称 新規ＤＮＡおよびその用途 ３　補正をする台 事件との関係　特許出願人 住所　大阪市東区道修町２丁目２７番地名称　（２９３
）　武田薬品工業株式会社代表台　倉　林　育　四　部 ４　代理人 住所　大阪市淀用区十三木釘２丁目１７番８５号６　補
正の内容 （１）明細書第１９頁第１０行のＩｉ’ｙｒｌをｆ′ｌ
″ｈｒ、ｌに′−する。 （２）司書第２９頁第１行の１寄託されている。１を１
寄託され、該寄託はブダペスト条約に基−ノく寄託に切
替えられて、受託番号ＦＥ　ＩえＭ　ＩＭＰ７１１とし
て同研究所（１”Ｉ？＋）に保管されている。」に訂正
する。 （３）同書第５３頁第６〜７行、第５３頁第１２行およ
び第５６貞第１４〜Ｉ　５行ノＩＰＩ’ｌ：ｌ（Ｍ　Ｐ
−７５６７ｊをｒＦＩシＩえＭ　ＩＮ’　−７１３＋に
それぞれ訂正する。 （４）司書第５７頁第２０行のｒ−Ａ５４９細胞（１除
する。 司書第５８頁第１行の［細胞１の後の［）Ｊ１除ずろ。 以　１− 受託番号変更届 昭和６０年６月２１１１ １　事（−１の表示 昭和６０年特許願第１８３４８号 ２　発明の名称 新規１）　Ｎ　Ａおよびその用途 ３　１続をした者 事４Ｑとの関係　特許出願人 住　所　大阪市東区道修町２丁目２７番地名　称　（２
９３）　武Ｆ（１薬品工業株式会社代表考　倉林育四部 ４　代理人 １− ５　旧寄託機関の名称 Ｉ９業技術院微生物り業技術研究所 ６　旧受託番号 微土研菌寄第７５６７’Ｊ　（ＦＥｌｔＭ　Ｐ　７５（
ｉ７）７　新寄託機関の名称 工業技術院微生物１′、業技術研究所 ８　新受託番シ） ｉＭ　Ｉ研条寄第７１１１；（１−”ＥＲＭ　ＨＰ　７
１１　）９　添付書類の１１録 （＋）新受託番号を３１Ｆ明４′る書面　１　通以　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒト免疫インターフェロンのペプチドをコード
   する構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトインターロイ
   キン２のペプチドをコードする構造遺伝子を打するＤＮ
   Ａをそれぞれの読み取り枠をそろえて連結してなるＤＮ
   Ａ０ （２）、　両構造遺伝子の上流にプロモーターを連結し
   てなる特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 （３）、　両構造遺伝子の間にリンカ−を介してなる特
   許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ０（４）、ヒト免疫イ
   ンターフェロンのペプチドをコードする構造遺伝子を有
   するＤＮＡおよびヒトインターロイキン２のペプチドを
   コードする構造遺伝子を有するＤＮＡをそれぞれの読み
   取り枠をそろえて連結してなるＤＮＡが組み込まれたプ
   ラスミド。 （５）、ＤＮＡが構造遺伝子の上流にプロモーターを連
   結してなるＤＮＡである特許請求の範囲第４項記載のプ
   ラスミド。 （６）、ＤＮＡが構造遺伝子の間にリンカ　を介してな
   るＤＮＡである特許請求の範囲第４項記載のプラスミド
   。 （７）、ヒト免疫インタ−フェｖＪンのペブチ］・をコ
   ートする構造遺伝子を有するＤＮＡおよびヒトインター
   ロイキン２のペプチドをコ　トする構造遺伝子を有する
   ＤＮＡをそれぞれの読み取り枠をそろえて連結してなる
   ＤＮＡが組み込まれたプラスミドで形質転換された形質
   転換体。 （８）、　形質転換体の宿主がエノエリヒア属菌である
   特許請求の範囲第７項記載の形質転換体。 （９）、ＤＮＡが構造遺伝子の上流にブ【１モーターを
   連結してなるＤＮＡである特許請求の範囲第８項記載の
   形質転換体。 （１０）、Ｄ　Ｎ　Ａが構造遺伝子の間にリンカ　を介
   してなるＤＮＡである特許請求の範囲第８項記載の形質
   転換体。 （１１）　ヒト免疫インターフェロンのペプチドとイン
   ター【１イキン２のペプチドとを結合したポリペプチド
   。 （１２）　ヒト免疫インターフｆ、　［７ンのペプチド
   をコードする構造遺伝子を有するＤ　Ｎ　Ａおよびヒト
   インターロイキン２のペプチドをコードする構造遺伝子
   を有するＩ）　Ｎ　Ａをそれぞれの読み取り枠をそろえ
   て連結してなるＤＮＡが組み込まれたプラスミドで形質
   転換された形質転換体を培地に培養し、培養物中にヒト
   免疫インターフェロンのペプチドとヒトインターロイキ
   ン２のペプチドとを結合したポリペプチドを生成蓄積せ
   しめ、これを採取することを特徴とする該ポリペプチド
   の製造法。 （１３）　形質転換体の宿主がエシェリヒア属菌で。 ある特許請求の範囲第１２項記載のポリペプチドの製造
   法。 （１４）、ＤＮＡが構造遺伝子の」二流にプロモーター
   を連結してなるＤＮＡである特許請求の範囲第１３項記
   載のポリペプチドの製造法。 （＋５）、ＤＮＡが構造遺伝子の間にリンカ−を介して
   なるＤＮＡである特許請求の範囲第１３項記載のポリペ
   プチドの製造法。