JPS60252500A - 修飾インタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は新規インターフェロンの設計のための遺伝子組
換え技術の利用に関する。これらの新規インターフェロ
ンは１個もしくは２個以上のシスティン残基の添加また
け欠失によって修飾したヒトβ−インターフェロンのア
ミノ酸配列からなり、インターフェロンのジスルフィド
架橋特性を変化させたものである。

従来技術 以下に述べる本発明の新しい判微は、ヒトインターフェ
ロンβ遺伝子（ＨｕＩＦＮ−β）の遺伝暗号配列を、特
定部位の突然変異誘発法により、特定部位で変化させ、
新規なアミノ酸配列を誘導するものである。

とくに、システィン残基の企号および配列を変えて、ヒ
トインターフェロン−α（ＨｕＩＦＮ−α）族にみられ
ると類似のパターンを産生する。この新規配列は、■Ｆ
Ｎ−βタンパク質配列上に工ＦＮ−α様三次構造を付与
し、その結果、分子に新しい性質が導入されることを期
待したものである。

αおよびβインターフェロン、とくにヒトＩＦＮα１；
（Ｄ）およびヒトエＦＮ−βは構造的に関連が深い。両
者は、ヌクレオチドレベルで４５％、アミノ酸レベルで
２９％の相同性を示す〔タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
　）ｒｌ＝ネーチャー（’Ｎａｔｕｒｅ　）　２８５　
：　５４７　ｒ１９８０年〕。スタンペルグ（１９ｔｅ
ｒｎｂｅｒｇ　）とチェノ（０ｏｈｅｎ　）　［インド
、ジエイ、パイオル、マクＯ−ｆ：ｆｉｖ、（工ｎｔ、
　Ｊ、　Ｂ１１１．　ＭａＣｒＯｍＯｌ、　）　４　：
１６７員、１９８２年〕は、αおよびβインターフェロ
ンの三次構造が類似することを示唆するモデルを示して
いる。ジスルフィド結合が、三次元タンパク構造および
安定性の両者に影響することけよく知られているが、ヒ
トエＦＮαの三次構造は一部分、ジスルフィド結合に依
存することも明らかにされてきたペラエル（Ｗｅｔｚｅ
ｌ　）ら：ユシーエルエイ　シンホ２モル、セル、パイ
オール（ＵＯＬＡ　Ｅｌｙｍｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ
　Ｂｉｏｌ　）、１９３２年、２５：３６５〜６７６頁
〕。

インターフェロンは、を椎動物に屍いださねる１群のタ
ンパク質であって、病原に対する抵抗性の増大、細胞生
育の制限、免疫系の調節等、細胞機能の生物学的調節因
子としての機能を有する。

インターフェロンについてもつともよく研究されている
性質は、細胞を“抗ウイルス状態”に変換する性質であ
って、この間、細胞はウィルスの複製に対する抵抗性が
強まる〔レンジエル（Ｌｅｎｇｙｅｌ　）　：アニス、
シブ。バイオケミ。

（Ａｎｎｕ＋Ｒｅｖ＋Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　＋　５１
　：　２５１７Ｍ、＋１９８２年〕。

標的細胞に抗ウイルス性を付与するほか、インターフェ
ロン（１Ｐ？Ｊｅ　）は、免疫論節作用と抗増殖作用を
有するしステフルｌ−（５ｔｅＷａｒｔ　）　、　１９
７９年、インターフェロン　システム（Ｔｈｅ工ｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ　８ｙｓｔｅｍ　）　、　スプリング９ル
　ベルリン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　、Ｂｅｒｌｉｎ　）　
〕。工ＦｔＬｓは、その抗原的、生物学的、物理化学的
性質によって、３種に分類できる。■型、工ＦＮ−α（
白血球）および工ＦＮ−β（線維芽細胞）、ならびに■
型、ＩＩＱｉ−γ（免疫）である〔ステワルト（Ｓｔｅ
ｗａｒｔ　）ら：ネーチャー（Ｎａｔｕｒθ）、２８６
　：　１１０　ｒ　１９８０年〕。現在では、詳細な情
報が、ウィルス誘導、酸安定性ＩＦＮ−αおよび工ＦＮ
−βならびにミドダ誘導溝工ＦＮ−γから得られている
。これら６種のＩＦＮのｃＩ）ＮＡはすべて、誘導され
たそわぞれのｍＲＮＡからクローン化され、ＤＮＡ配列
およびタンパク配列が推定されている〔タニグチ（Ｔａ
ｎｉｇｕｃｈｉ　）　ｌｌ−Ｉ：プロク、ジャパン　ア
カド、セ／ｌ／　、（Ｐｒｏｃｌ、ＴａｐａｎＡｃａ＋
ｉ、　５ｅｒ−）Ｂ５５．　４６１〜４６９負、　１９
７９年；ホーグトン（ＨＯｕｇｈｔＯｎ　）ら：ヌクレ
イツクアシド　レス、　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　）　８：２８８５〜２８９４頁、１９８０
年；すが夕（Ｎａｇａｔａ　）ら：ネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ　）　Ｔ　２８４’３１６〜３２０頁、１９８０
年；ナガタ（Ｎａｇａｔａ　）ら；ネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ　）　、　２８７　：　’ｌ　Ｏ１〜４０８頁、
１９８０年；ゴーデ／ｌ／　（Ｇｏｅｄｄｅｌ　）ら；
ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　＋　２９０　：　２０
〜２６頁。

１９８１年；グレイ（Ｇｒａｙ　） う：ネｆヤ−（Ｎａｔｕｒｅ　）、２９５　：　５０３
〜５０８頁、１９８２年〕。工ＦＮｓ−αおよび工ＩＱ
Ｊ−βは均一に精製さね、得られた部分タンパク配列か
ら、由来の工ＦＮ−βの配列や一部の組倹えｘｙＮ−α
の配列が確認されている〔アレンラ（Ａ’１ｌｅｎ　＆
Ｆａｎｔｅｑ　）　：ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、
２８７　：４０８〜４１１頁、１９８０年；ナイト（Ｋ
ｎｉｇｈ、ｔ）ら：ｔイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２
０７：５２５〜５２６頁、１９８０年；スティン（５ｔ
ｅｉｎ　）ら：プロク、ナトル、アカド、サイ、　（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａ、ｄ、　８ｃｉ、　）、米国７７：５７１６〜５
７１９頁。

１９８０年；ゾーン（Ｚｏｏｎ　）ら：サイエンス（ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）、２０７：５２７〜５２８頁）。β−イ
ンターフェロンの１７位におけるシスティンのセリンに
よろ慣換も行われている〔オコーネル（Ｆ、　Ｏ’　Ｃ
！０ｎｎｅｌｌ　）　：ゼネチツク　チクノロシイニュ
ース（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔθｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｎｅｗ
ｓ　）　、３　：　２゜１９８３年７月、ヨーロッパ特
許出願第８３３０６２２１．９号）。

ヒト１ＦＮ−αは、少なくとも１４種の異なる遺伝子、
さらに少なくとも６種の偽遺伝子およびハイブリダイゼ
ーションすることが知られている他の４種の遺伝子から
なる多重遺伝子族によって特定されるが、まだ配列は確
定されていない〔ワイズマン（Ｗθ１θｓｍａｎ　）　
：分子および細胞生化学に関する第１１回年次ＵＣＬＡ
シンポジウム（１１ｔｈＡｎｎｕａｌ　ＵＯＬＡ　Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ’ｌａｒ　ａｎｄ　
Ｏｅ、１１ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）、１９５２年
〕。一方、ヒトエＦ’Ｎ−β遺伝子については、ただ１
稲であるが配列が明らかにされている〔オーウェルバッ
ハ（Ｏｗｅｒｂａ、ｃｈ　）ら：プロク、ナトル。

アカド、サイ、　（Ｐｒｏｃ−’Ｎａｔ１．　Ａｃａａ
、　Ｓｃｉ、）米国、７８：３１２３〜３１２７頁、１
９８１年〕。

工ＰＮ−γ遺伝子は、■ＦＮ日−αおよびエフ”Ｎ−β
と３個のイントロンをもつ点で異なり、これがＩ型およ
び田型ＩＦＮθのひとつの識別回前な特性となっている
〔グレイら（Ｇｒａｙ　＆　Ｇｏｅａｄｅ’ｌ　）　：
ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２９８　：　８５９〜
８６３頁、１９８２年〕。

ヒトエＦＭ−α多１遺伝子族のメンバー間には相同が存
在するか、ヒト１ＦＮ−αと工ＦＮ−β遺伝子の間にも
相同がある。工ＦＩＪ−αおよび工Ｆ’Ｎ−β遺伝子は
古い遺伝子の重複の産物であると思われる。多分、を椎
動物の進化の早ＪｃＩ＋に分岐したものであろう〔タニ
グチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　）ら：ネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ　）ｔ２８５　：　５４７〜５４９頁、１９８０
年〕。一方、工ＦＮ−α多重遺伝子族のメンバーははる
かに最近になって、多分少なくとも２６００万年以内に
分岐したものと考えられる〔ミャタら（Ｍｉｙａｔａ　
＆Ｈａｙａｅｈｉａａ　）　：ネーチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ　）、２９５　：６５ 〜１６８頁、１９８２年〕。

インターフェロンの作用機構については完全に明らかに
されているわけではないが、ある種の生理活性や酵素活
性には、インターフェロンの存在に応答するものがある
。これらの活性には、たとえばＲＮＡの合成やタンパク
の合成がある。インターフェロンによって誘導される酵
素には、たとえば（２’−５’）　（Ａ）ｎシンテター
ゼがあり、これは二重鎖ＲＮＡによって活性化される。

このシンテターゼはＡＴＰから２’−５’結合オリゴア
デニレートを生じ、これが潜伏エンドリボヌクレアーゼ
、ＲＮＡ８ｅＬを活性化し、これがメツセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ　）やリボソームＲＮＡ　（ｒ−ＲＮ／ｋ
　）のような−重鎖ＲＮＡを切断する。インターフェロ
ンはプロティンキナーゼを誘導し、これが少なくとも１
個のペプチド鎖開始因子をリン酸化して、タンパク合成
を阻止する〔レンジエル（Ｌｅｎｇｙｅｌ　）による：
前出文献、２５３頁〕。

インターフェロンはＮ　（２’　−５’）　Ａｎシンテ
ターゼ活性の調節による細胞の陰性生長調節因子である
ことが明らかにされてきた〔クリーゼイ（０ｒｅａｓｅ
ｙ　）ら： モル、セル、バイオ＃　、　（Ｍｏ’１．　Ｏｅ’ｌｌ
　Ｂｉｏ’１．、　）　。

３ニア８０，７８６．１９８３年〕。■ＰＮ−βは、抗
工ＦＮ−β抗体の使用により、インデュサー非存在下に
おける細胞サイクルの正常な調節に関与するが間接的に
明らかにさねた。同様に、インターフェロンが分化〔ド
レイ（Ｄｏｌｅｉ　）らニジエイ、ジエン、ビＯ−＃　
、　（、ｒ、　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、　）、４６：２２
７〜２３６．１９８０年〕や免疫調節〔グレッサー（Ｇ
ｒｅｓｓｅｒ　）　：セル、イムノ＃　、（Ｃｅ１ｌ工
ｍｍｕｎｏ１．）、５４：４０６〜４１５Ｔｊｌ　１９
７７年〕に役割をもつことが示されている。

インターフェロンはｍＲＮＡのメチル化パターンも変化
させ、膜ホスホリピドの脂肪酸の割合を変え、その結果
、細胞膜の剛性を変化させる可能性が考えられている。

これらの機構や他、の機構が、インターフェロン様ポリ
ペプチドの構造に応じてその程度を変え、インターフェ
ロン様分子の作用の基盤になっているのであろう。工Ｆ
Ｎ−αジスルフィドパターンをもつ工Ｆトβは新しい有
利な表現型として働く可能性が想定される。たとえは、
抗増殖活性に比べて抗ウィルス活性の大きい（１′たは
その逆の）　工ＦＮｅ　、あるいは、弔゛定のウィルス
感染組織または形質転換細胞に対して高い活性／特異性
を有する工ＦＮθである。

新しいジスルフイｒ結合の創成の結果として、安定性の
増大も期待される。安定性とは変性、タンパク分解酵素
および他の物理的または活性変化に対する抵抗性の増大
と定義される。安定性の増大により、製造中の回収率の
改善、保存可能期間の延長、溶液中での活性の持続など
がもたらされる。

α−インターフェロンジスルフィドパターンをもつβ−
インターフェロンから構成された新しいインターフェロ
ン様ポリペブチ２の設計および合成は、正常インターフ
ェロン誘発活性のごく一部の選択的活性化を可能にする
ものと思われる。このようなハイゾリツドボリペノチド
であれば、インターフェロン系を活性化するのに適当に
使用できる可能性がある。さらに、これらの修飾インタ
ーフェロンの細胞表面レセプターに対する親和性も天然
のインターフェロンの場合とは異なってこ　１よう。そ
うすれば、特定の細胞型に対するインターフェロンの選
択的または差別的標的化が可能になるものと考えられる
。

修飾システィンパターンを有する新規インターフェロン
は、本発明の方法により、α−１β−またはｒ−インタ
ーフェロンのシスティンパターンをもつように構築でき
る。すなわち、ヒトα−インターフェロンにはヒトβ−
またはヒトγ−インターフェロンのシスティンパターン
を導入できもヒトβ−インターフェロンにはヒトα−ま
たはヒトγ−インターフェロンのシスティンパターンを
導入できる。ヒトγ−インターフェロンにはヒトα−マ
タハヒトβ−インターフェロンのシスティンパターンを
導入できる。同様に、２種以上のインターフェロン種の
システィンパターンの組合せを第６のインターフェロン
種に置換させることも可能である。

図面の説明 第１図は、特定部位の突然変異誘発によるアミノ酸変化
での工ＦＮＸ８０２．，８０３および８０４の生成を例
示したフローチャートである。

第２図は、構築Ｉの制限酵素切断地図を示した図である
。（複製型分子８．４　ｋｂｐ　）。

第６図は、構築■からＶまでの制限酵素切断地図を示し
た図である。（複製型分子８　ｋｂｐ　）。

第４図は、工ＦＮＸ　３０２を生じる特定部位の突然変
異誘発を例示した図である。

第５図は、工ＦＮＸ　８　Ｄ　３を生じる特定部位の突
然変異誘発を例示した図である。

第６図は、■ＦＮＸ　８［１４を生じる特定部位の突然
変異誘発を例示した図である。

第７図は、構築■、■および■の制限酵素切断地図を示
した図である。（シラスミド３．９２　ｋｂｐ）。

チャート１：工ＦｔＪＸ　８Ｑ　２のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列（アミノ酸については、旧来の６文
字による省略記号のほか、チャートの最下部ニ、■ＵＰ
Ａ　Ｃ−エロＢコミッション　オン　バイオ−ケミカル
　ノーメンカルチャー（Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎＢ
ｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃ：Ｌａｔｕ、ｒ
ｅ　）推薦の１文字での省略記号を示した。Ａ：アラニ
ン、Ｃ：システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｋ：グルタ
ミン酸、Ｆ：フェニルアラ ニン、Ｇニゲリシン、Ｈ：ヒスチジン、工：イソロイシ
ン、Ｋ：リジン、Ｌニロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：
アスパラギン、Ｐニブロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：ア
ルギニン、ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン、
ｗニトリブトファン、Ｙ：チロシン） へ　。

ト”）。

訃　−ＩＪｆｆｌ　ＩＪ　ｒ　Ｈリ　Ｈリ　−へ　−１
１−嘔販　０　１ ．＋１　＋１ＩｖＪ　Ｃ””　ＨすＨ’−’−ヘＥ”’
ｌ　”ｉ　ｅ”　Ｆ”発明の要約 本発明のひとつの目的ｆｌ、Ｈｕ工ＦＮ−βのアミノ酸
配列に特定の変化を生じるように）ｌｕ：ｒＦＮ−βを
コーｙ−５−る配列の個々のヌクレオチＶに特定部位の
突然変異誘発法を適用し、Ｈｕ工ＦＮ−βにおけるシス
ティンの位置および数を、Ｈｕ工ＦＮ−α族の揚台に類
似のパターンに再構成することにある。得られた修飾１
ｕｌＦＮ−β分子はＨｕ工ＦＮ−α族の示ず性質に類似
の性質をもつようになる可能性が考えられる。修飾Ｈｕ
工ＦＮ−β、工ＦＮＸ８０２，８０３および８０４分子
の構築のフローチャートに第１図に示したとおりである
。同様に、α−１β−およびγ−ヒトインターフェロン
のジスルフイＶパターンおよヒアミノ酸配列を合して、
新しいハイプリツｒまたは修飾インターフェロンを形成
させることもできる。

本発明の他の目的に、修飾インターフェロンの、安定性
を言めた物理的および薬理学的を改良するジスルフイＶ
結合を創成することにある。

本発明の目的はまた、修飾インターフェロンｘＦｎｘ８
０２，８０３，８０４，８１５．８１６＋８１７．８１
８および４５７の産生をコードするＤＮＡ配列、ならび
にそわらのアミノ酸配列自体を製造１−ることにある。

不発、明の他の目的は、抗カイルス、抗増殖、抗腫瘍、
免疫−１節または免疫原性治療に有用な修飾インターフ
ェロンの治療翁効債な含有する医薬組成物の製造におる
。さらに、本発明の他の目的は、微生物を利用して本発
明の修飾インターフェロンを製造する方法を提供するこ
とにある。

白血球（α）インターフェロン（工Ｆ′Ｎ−α）族の遺
伝暗号配列は線維芽細胞（β）インターフェロン（工Ｆ
Ｎ−β）′４Ｉ伝子の１列と連給関係にある。

たとえは、Ｈｕ工ＦＮ−α□（Ｄ）の遺伝暗号配列はヌ
クレオチドレベルで４５％、アミノ酸レベルで２９％、
Ｈｕ工ＦＮ−βに相同であるしタニグチ（Ｔａｎｉｇｕ
ｃｈｉ）ら：ネーチャー（、Ｎａｔｕｒｅ　）、２８５
　：　５４７３Ｌ１９８０年〕。

α−およびβ−インターフェロンの二次および三次構造
は、６柿のコンビ゛ニーターモデリング操作によって推
論きれてさた。スタンペルグら（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ＆
　Ｃｏｈθｎ）：イント、ジエイ、パイオル、マクロモ
ル、（工ｎｔ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｍａｅｒｏｍｏｌ、
）。

４：１３７頁、１９８２年〕は、α−インターフェロン
にもβ−インターフェロンにも適用でキルインターフェ
ロン三次構造の七デルを作成し、各型のインターフェロ
ンのイン　ビボにおける構造は顛似することを示唆して
いる。

ヒトインターフェロンαは１，２９，９８゜１３８の位
置（工ＦＮ−α２（Ａ）の配列についての位置）に４個
のシスティンを有し、これが２個の分子内ジスルフィド
橋、すなわちｅｙｅ　１と０ｙｓ９８゜Ｃｙｅ　２９と
ｅｙｅ１６８の結合を形成することが明らかにさ、れて
いる〔ペランエル（ｗｅｔｚｅｘ　）　：ネーチャー（
Ｎａｔｕｒｅ　）　、２８９　：　６０６頁、１９８１
年〕。ヒトインターフェロンβは、１７．３’ｌおよび
１４１の位置に６個のシスティンをイ１ｊる。

βの位置６１および１４１はインターフェロンα族にお
ける位置２９および１６８に類似すると考えられる。Ｃ
ｙ　ｓ　１４１をＴｙｒ　１４１に変換するとインター
フェロンβの抗ウィルス活惰は消失することが明らかに
されている。さらに、 ＨｕＩＦＮ−βを還元剤ジチオスレイトールで前処置す
ると、抗ウィルス活性が消失することも報告されている
〔シェパード（ｓｈθｐａｒｃＬ　）ら：ネーチャー（
Ｎａ、ｔｕｒｅ　）、　２９４　：　５６３頁、１９８
１年〕。

これらの結果は、Ｃｙ８３１−１４１間のジスルフィド
結合がＨｕＩＦＮ−βの活性に８佛であることを犀スも
のと考えられる。

修ｆｉｔインターフェロンのシスティンｔｍは他のイン
ターフェロンの類供位＠または同じ順序のアミノ酸位置
に行うことカーできる。同じ順序の位置から、システィ
ンをポリペプチドの両末端方向に１個から４個までのア
ミノ酸位にたけ移動し、正常のインターフェロ：／のそ
の位ｆｔ［あるアミノ酸を置換することも可能である。

したがって、ヒトβ−インターフェロンの６番目のアミ
ノ酸を置換ｊるシスティンは、位置１，２，４，５．６
または７のいずれのアミノ酸を置換してもよい。同様に
、位Ｎ１０１のシスティン置換は、位置９７゜９８．９
９．　１００，１０２，１０３，１０４筐たは１０５の
い１れの位置に行われてもよい。これらの置換位攬の差
は、生成したジスルフィド結合の張力に差を生じる。

ｎ１％定部位の突然変異誘発法の概略 オリゴヌクレオチドを用いて特定の配列変化を起こさせ
る特定部位の突然変異誘発は、多分、ｉｎ　ＶｉｔｒＯ
で突然変異体を産生させるもつとも特異的な方法と思わ
れる。

この方法の関与する背景については、シーラーら（Ｚｏ
ｌｌｅｒ　＆　Ｓｍ１ｔｈ　）　（ヌクレイツク　アシ
トレス、　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ＋ｉｓ　Ｒｅｓ、
　）　、１１（’Ｉ　Ｑ　）　：６４８７頁、１９８２
年〕の総説があり、これには寸だ技術的観点からの多く
の方法論が詳述されている。

操作を要約すると、所望のヌクレオチド変化を同定し、
問題のヌクレオチドに領域５′および６′で相補性のオ
リゴヌクレオチドを構築する。この位置で、使用される
ヌクレオチドは所望の突掛変異に相補性になるものであ
る（たとえは第４図〜第６図１）。すなわち、オリゴヌ
クレオチドが遺伝暗号配列にアニーリングされたとき、
問題の位置で不適正塩基対の形成が起こる。

遺伝暗号鎖を一重鎖の形に作るためにもつとも実用的な
方法は、その生命サイクル中に二升鎖および一重＠　Ｄ
ＮＡ両相をもつバクテリオファージにその配列を導入す
る方法である。２棟のファージ、φＸ１７４およびＭ１
３が一般に用いられる。この方法では、バクテリオファ
ージＭ　ｉ　３を使用した。

突然変異を起こさせる配列にオリゴヌクレオチドをアニ
ーリングしたのち、閉じた環状分子を転写し、連結させ
る。完全分子は、アルカリ憔庶糖勾配による分離〔シー
ラーら（Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｓｍ１ｔｈ）。

１９８２年〕ま１こは電気泳動と低温度ケ゛ル化アガロ
ースからの溶出のいすねかによって、不完全転写体から
分離できる。後者の方法は、ＤＮＡのコンピテント　イ
ー、コリ（ｌｌｉ、　ｃｏｌｉ　）　ＪＭ　ｊ　Ｑ　１
細胞への次の形質転換がアガロースの存在下に実行でき
、操作の数を減らせるので有利である。

転換体の分離に先立って、いずれの方法を用いた場合で
も、不完全転写体をＳｌヌクレアーゼで分解して分離段
階での分解能を大きくしておくこともできる。形貴転換
後、突然変異体の集団と野生型分子が得られ、これは多
くのスクリーニング方法のひとつによって識別できる。

たとえば、所望の変化が制限エンドヌクレアーゼ部位の
導入であれ、欠失であれ、それは容易に検出できる。ま
た、オリゴヌクレオチドゾライマーとはじめの配列ｔた
は突然変異配列の間に形成されたハイブリッドのＴｍ　
（５０％不可逆融廃）の差に基づくハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニング法をとることもできる〔たとえばシ
ーラーら（Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｓｍ１ｔｈ　Ｌ　１９１
３　’１年〕。

突然変異体の収率を増大させるためには、形質転換細胞
のプールを用い、−不銹（ａｓ）Ｄ’ＮＡ分子の混合集
団を作ることができる。ついでこれらを、はじめの配列
よりも突然変異配列にオリゴヌクレオチドのアニーリン
グが起こりやすい条件下でのアニーリング／転写の（り
返しに際し、鋳型として使用できる。

チャート１〜８に示したＩ）ＮＡ配列は、同じチャート
に示した修飾インターフェロンアミノ酸配列の合成をコ
ードするＤＮＡ配列の好ましい例を例示したものである
。遺伝暗号〔レニンガ−（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ　）　：
パイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ８ｔｒｙ　）　
、ウォース出版社（ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　
）　、９６２頁〕により、チャート１〜８に記載のアミ
ノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を役割し、合成す
ることもできる〔ヌクレイツク　アシド　リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ、　）　、
１１　：　４７７頁、１９８３年〕。

このような別の配列は、本発明の修飾インターフェロン
を産生するため、プラスミドｐＪＡ　ｌ　、ｐ、ｒＡ２
およびｐＪＡ　３中に用いることができる。

第１表　構築の命名 １　Ｍ１３−ＩＲＢ−ＤＯＭｕ工ＦＮ−βｎ　Ｍ１３−
４ＡＢ−ＤＯ）（ｕ工ＦＮ−β■ｍＪＡ１ｎｕ工ＦＮ　
−Ｘ８０２ ｐｉ　ｍＪＡ２ＨｕＩＦＮ　−Ｘ３Ｑ３Ｖ　ｍＪＡ３　
Ｍｕ工ＦＮ　−Ｘ３［］４ＮＴ　ｐＪＡｌ　ｎｕ工ＦＮ
　−Ｘ８’０２■　Ｉ）ＪＡ２　Ｒｕ工ＦＮ　−Ｘ１３
Ｑ３■　ｐＪＡ３　Ｈｕ工ＦＮ　−Ｘ８０４Ｍ１ろはバ
クテリオファージ、細菌性ウィルスであり、さらに特定
すれは、いわゆる線状ファージであって、雄性大腸菌（
イー、コリ；以下ム兄禦」−で示ｊ）細胞に感染する。

多くのバクテリオファージと異なり、ウィルスまたはフ
ァージ粒子に見いだされるＤＮＡは一本鎖（８日ＤＮＡ
　）である。

Ｅ、　Ｃ０１ｉ細胞に感染すると、ＥＩＥＩＤ’ＮＡは
相当する二本鎖型（（１８ＤＮＡ　）に変換し、適当な
生育条件下にたとえば１細胞あたり２００〜３００コピ
ーに増幅する。ファージ感染細胞には新しいファージ粒
子を放出する溶菌は起こらず、速度は遅くなるが生育、
分裂を続ける。これは、アガール板上に明領域として、
非感染細胞を背景に生育の遅い細胞のプラークとして認
められる。

（１８ＤＮＡは複製型分子（ＲＦ）とも呼ばれる。これ
は細菌性プラスミドに相当し、クローニングおよび表現
ベクターとして使用できる。ＲＦはファージ増殖過程の
中枢をなす。それは５日ＤＮＡ合成およびＭ１３ファー
ジ遺伝子情報のタンパク生合成を経た表現の鋳型である
。前者の過程でファージ粒子が産生され、後者ではファ
ージタンパクの合成が可能になり、それが感染細胞にお
けるファージ粒子の産生なさらに要求することになる。

野生型Ｍ１３は、ファージＤＮＡの非必須領域にラクト
ースオペロン制御領域（！ａＱ−プロモーター）を含有
し、活性β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ　）に対す
る情報がコードされたｌｉｊ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ断片
を挿入することにより、すでに、クローニングビークル
として使用できるように改良されている。しかしながら
、ＤＮＡ断片のクローニングは一般に１ａｃ　Ｚ遺伝子
の妨害を生じ、したがってβ−ｇａｌは発現せずに無色
のプラークを生じる。すなわち、組換え体は肉眼で検出
できる。

たとえば、線状ハイブリツＶファージの産生を目的とし
た英国特許第１．５８８，５７２号は以上概述した技術
段階に関する典型例である。

この公知のシステムによれば、サイズの異なる外因性Ｄ
ＮＡ断片のクローニングおよび抗生物質抵抗性遺伝子の
使用によらない組換えクローンの同定が可能になる。ま
た同時に、組換え体の特性づけおよびＤＮＡ配列決定に
使用するためのファージＢ５ＤＮＡの精製や、判定部位
の突然変異誘発を可能にする。

公知のバクテリオファージＭ１３ｍｐ７０１は本発明の
出発点とみなすことができる。自由に利用できるこのベ
クターは、市販されているＭ１３ｍｐ　７から公知方法
で構築さねた。同様にＭ１３ｍｐ　７はＭ　１３　ｍｐ
　２から構築さねた。この関係の文献としては、たとえ
ばメソシング（Ｍθｓｓｉｎｇ、　、Ｔ、）ら：ゾロク
、ナトル、アカド、サイ、　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａ、ｄ、Ｓｃｉ、　）　、米国７４：
３６４２頁。

１９−７７年がある。

Ｋ−’ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　’１株ＨＢ　１０１中のプラ
スミドｐＪＡ１．ｐＪＡ２およびｐＪＡ　３のＡＴＯＯ
寄託番号は、それぞれ３９５２０，３９５２１および３
９５２２である。アメリカン　タイプ　カルチャー　コ
レクショｙ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）（ＡＴＯＯ）の住所
は１２３０１パークラウン　ドライブ、ロツクビ／ｌ／
　（Ｐａｒｋｌａｗｎ、　Ｄｒｉｖｅ　。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　）　、ＭＤ　２０８５２　を米国
である。

例１ 構築１　（Ｍ１３−１ＲＢ−ＱＱ、　Ｈｕ工ＦＮ−β）
ヒト線維芽細胞インターフェロン遺伝子と！」−プロモ
ーターの再クローニングによるＭｌ　３−１′ＲＢ［Ｊ
Ｏ（第２図参照）の調製：左側にμＯＲ王部位で結合し
、右側に坪偲Ｈ工部位で結合した成熟Ｈｕ工ＦＮ−β１
遺伝子を伴う、ｔｒｐプロモーター言有１１７２　ｂｐ
　ＤＮＡ断片（英国特許用ＩＩＡ第２，０６８，９７０
号）をファージＭ１３ｍｐ　７０１の、ＫＯＯＲ工と旦
ａｍＨ工部位の間に、次のようにして再クローニングし
た。

Ｈｕ工ＦＮ−β１遺伝子を含有するμ＋ＯＲニーμＨ工
断片のμ巴旦ニーＩ３ａｍＨ工消化Ｍ１３ｍｐ７０１ベ
クターへの結合は、０．２５μｇベクター、０．９μｇ
ｆＱＱｏ　ＲニーＢａｍＨＩ切断ｐ１／２４含有インキ
ュベーション液５０１ｔＪ−中で実施した（英国特許）
。各プレート上約８チのプラークは無色で、組換えファ
ージ（ＩＲＢ−ＤＯ）の存在を示した。組換えｆ；ｉｆ
−は、大きさ、ヌクレオチド配列解析、また抗ウィルス
活性の発現により明確に同定された。

ヌクレオテげ配列解析に十分な５ｓＤＮＡを調製するに
は、無色のプラークをとり、Ｋ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２
ＪＭ　１０１の濃厚な一夜培養液２５μｍを営む２．５
ｄのＹＴメジウムに加えた。５時間３７°Ｃで通気して
ファージを生育させ、５ｓＤＮＡは公知方法で精製した
〔たとえば、サンジャー（Ｓａｎｇｅｒ　。

Ｌ　）らニジエイ、モル、パイオル・（Ｊ、　Ｍｏ’ｌ
・Ｂｘｏｌ、　）、１４３　：　１６１頁、１９８０年
参照〕。

θ５ＤＮＡをジデオキシ配列決定法の鋳型とβ２て用い
た〔たとえは、サンガー（Ｓａｎｇθｒ＋”）ら：プロ
ク、ナトル、アカド、サイ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）米国、７４：５４６３頁、１
９７７年参照〕。たとえは、ｔｒｐプロモーターの存在
および配列ならびにＨｕ工ＰＮ−βｌ遺伝子の存在は、
Ｈｕ工ＦＮ−βコーディング領域のプライマーとして知
られたオリゴヌクレオチドプライマー、工Ｆ工Ａ（英国
特許出願第２，０６８，９７０号）で確立された。

例２ Ｍｌろ−１ＲＢ−０，０（Ｉ）からのｌａｃプロモータ
ーの欠失による、ｔｒｐゾロモーターのみの制御下に成
熟ＨｕＩＦＮ−βを表現できる組換え体の調製（ＩＩ＝
Ｍ１ろ一４ＡＢ−００，第６図参照）：このクローンの
構築は４　Ｑ　６ｂｐ　−Ａｖａ　ニー７ｃ叩工断片の
切り出しによって次のように行われた。

憂ニーＥｃｏＲエニ重消化は、構成Ｉで得られたｄ日Ｄ
ＮＡ　１０μｇ〔たとえは、バーンざイムら（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉ、ｍ、Ｈ，Ｏ，＆　Ｄｏｌｙ、、ｒ、　）　：ヌ
クレオシド、Ｌ／／（、（’Ｎｕｃｌ　Ａｃ１５　Ｒｅ
θ、）、７：１５１３頁、１９７９年参照〕、Ｔｒｉｌ
−ＨＣ，／−（ＰＩ３７．５　）　６ｍＭ＋１［１ｍＭ
　ＭｇＣｌ２．　６　ｍＭ　２−７＋　ルカプトエタノ
ール、５０　ｍＭ　ＮａＣＪ、１５単位のＡｗＰＬ工お
よび１５単位の煕只工を含有する液１００μｌ中、３７
℃で９０分間実施した。ｔＲＮＡ２０μｇｒ　０．３　
Ｍ　ＩＪａＡｃ（最終濃度０．３　Ｍ、　ｐＨ４，５）
およびエタノール０．３ｄを加えて１０分間−７０℃に
保ち、ＤＮＡを沈殿させた。次に突出５′−末端のＤ’
ＮＡポリメラーゼによる修復を最終容量５０　／１１で
実施した。

突出５′−末端の充填には、Ｄ’ＮＡ断片を、１［１ｍ
ＭＮａ（Ｊ中１　μ、ｇ　ＤＮＡ　、　５　Ｑ　ｍＭ　
Ｔｒｉｅ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，８）、ｊ　Ｑ　ｍＭ　？
ＣＪ’２＋　１　ｍＭ　２−メルカプトエタノール、３
．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド５′−トリホスフエ
ート、２０μｇ／−ウシ血清アルブミン、０．２ｍＭ各
デオキシヌクレオシド５′−トリホスフェートおよびク
レノー（ｘ’：ｔｅｎＯ！　）酵素１単位を含む反応液
５０μｌ中、１４℃で２０分間、６５℃で１０分間反応
さ せ、インビトロにおいてＤＮＡポリメラーゼｌ〔クレノ
ー（ＫｌｅｎＯＷ　：以下Ｋｌｅｎｏｗで示ｊ〕断片〕
による修復を行つ１こ。

修復ＤＮＡは上記インキュベーションｉ５μｌ（ＤＮＡ
　０．１　μｇに相当）、＜５６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｊ　（ｐＨ７，５）、５ｍＭＭｇ（Ｊ２．　２ＱｍＭＤ
ＴＴ、ｉ　ｍＭＡＴＰおよびＴ４Ｄ’ＮＡ　ＩＪガーゼ
４．５単位を含むインキュベーション液５０μβ中、２
５°Ｃで１７時間処理すると自己結合した。ＤＮＡの０
ａＣ２２処置ｚ、　ｃｏｌｌに１２７Ｍ１０１への取り
込みおよびプラーク形成のための細胞の培養は標準方法
を用いて実施した。

新しいクローン（Ｍ１３−４ＡＢ　−ＤＯ）の同定はＴ
ａｇ工制限別析によって確認された。

例６ 構築ｉｌｌ　（ｍ、ＴＡ　１．　Ｈｕ工ＦＮ　−Ｘ　８
０２　）ヒトインターフェロンβ（ＨｕＩＦＮβ）アミ
ノ酸乙のシスティンへの変換によるｍＪＡ　ｌの調製（
第６図、第４図、チャート１径照）： 配列５’　０Ｈ−ＡＧＴ　ＴＧＯＡＧＯＴＯＡ　ＴＧ−
ＯＨＯ）テトラデカマー（第４）を標準のホスホトリエ
ステル法ヲ用いて構築した〔ヌクレイツク　アシド　リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃＬｓ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　）　、　ｌ　１：　４７７頁、１９８３年参照〕
。この配列は、イニシェーク−ＡＴＧで始まり以下、５
′末端から数えてプライマーの６番目のヌクレオチドが
所望の突然変異の補体に相当することを除きヒトＴＰＮ
−βの遺伝暗号配列の最初の１６個（英国％許第２，０
６８，９７０号）が続くヌクレオチドである５′ＣＡＴ
ＧＡＧＣＴＡＯＡＡＯＴ配列に相補性である。この突然
変異では暗号配列８番目のヌクレオチドＡがＧに変化す
る。

合成オリゴヌクレオチドの突然変異誘発領域への特異的
プライミングは以下の操作によって観察された。ます、
オリゴヌクレオチドを５′末端で［３２ｐ〕により標識
した。オリゴヌクレオチド１゜ｐｍｏｌｅを、５［１ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７−６Ｌ　１０ｍＭＭｇｃＪ
２．　Ｑ、１ｍＭ　ＦｊＤＴＡ　（エチレンジアミン四
酢酸）、１３ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭスペ
ルミジン、５０　μＯ１（ｒ−３２Ｐ″ＩＡＴＰ（５，
ＱＱＱ（！ｉ／ｍｍｏｌｅ、アメルシャム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ　））およびポリヌクレオチドキナーゼ５単位を
含む総容葉５０μｌの液中でインキュベートした。反応
混合物を３７℃で６０分間、ついで６５°Ｃで５分間イ
ンキュベートした。オリゴヌクレオチドをホワットマン
（Ｗｈａｔｍａｎ　）　ＤＦＪ５２イオン交換樹脂カラ
ム（床容量０．３　ｍ　）がらの分別溶出して、導入さ
れなかった〔γ−３２Ｐ〕から分離した。

オリゴヌクレオチドを０．５　Ｍ　Ｎａｃｚ、１０　ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ　（ｐＨ７−５）　、ｌ　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ中に溶出し、］１ｆｉｃｏ１１ｔＲＮＡ　２　Ｑ
μｇを加え、６＠量のエタノールを加えたのち一７０℃
でオリゴヌクレオチドを沈殿させた。オリゴヌクレオチ
ドを１Ｑ　ｍＭ　ＴｒｉＳ−ＥＣＬ（ｐｔ（７−５）、
ｉ　ｍＭ　ＩＩＣＤＴＡ、３μノに再溶解した。

［３２Ｐ：）オリゴヌクレオチド５　ｐｍｏｌｅを１［
１ｍＭＨａ（Ｊ、４　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ！（
ｐＨ７，５）、２０　ｍＭＭｇ（４２、２ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール含有の総容量５１ｔｌｊの液中、Ｑ
、５　ｐｍｏｌｅのＭ　１３−４ＡＢ−００と８０°Ｃ
に５分間加熱し、ついで２０℃で１時間インキュベート
して、Ｍｌ　３−４ＡＢ−００にアニーリングさせた。

サンプルを、７５７．５　ｍＭ　’ＮａＣ２，４５ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７−５Ｌ　２５ｍＭＭｇＣＪ
２　、　１　ｍＭ　２−　メルカプトエタノール、各８
３　ｐＭ　ｃｖ　ｄＡＴｐ　ｊａａＴ、ｐｊ（１（）Ｔ
Ｐ　、　ｄＴＴＰおよび０．５単位のＤＮＡポリメラー
ゼエ（ＢＲＬ工ｎｃ、）のＫｌｅｎｏｗ断片を官有する
最終容量１５μｍに調整した。このサンプルを２５℃で
４時間インキュベートした。サンプルを１０　ｍＭＴｒ
ｌ、５−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）　、　１　ｍＭＫＤＴ
Ａで８倍に希釈し、６５°Ｃに５分間加熱し、０．３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐ）１４．６）に調整し、最後に３倍
容のエタノールを加えて一７０℃に１５分間保持して核
酸を沈殿させた。特異的ゾライミング生成物の同定には
、サンゾルを酵素’ｆ５ｃＯＲ工で消化し、生成物を、
１６５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ　（ｐ）ｆ　８，８　）
、４５　ｍＭホウ酸ナトリウム、１ｍＭ　ＦｆＤＴＡ中
に調製した７Ｍ尿素、６％アクリルアミｙ、０．３％ビ
ス（Ｎ　、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミｒ）ｒル
による電気泳動で分離した。

塩基１５０個の特異的転写生成物は４　ＡＢ　−００中
のＢ、　ｃｏｌｉ部位上流とオリゴヌクレオチド５′末
端の間に相当することが同定された。

完全な閉環状分子の形成は次のようにして達成された。

オリゴヌクレオチドヲ、〔γ−”Ｐ）ＡＴＰの代わりに
最終濃度１　ｍＭのＡＴＰを用いたほかは前述の場合と
同様にして、リン酸化した。ついで、プライマーと鋳型
の割合を１００とした（０．５ｐｍｏｌｅの鋳型に対し
てオリゴヌクレオチ）Ｆ５０ｐｍ　０１θ）ほかは前述
の場合と同様にして、オリイヌクレオチ−をアニーリン
グさせた。

生成物の転写とりｒ−ジョンは以下の方法によった。鋳
型０．５　ｐｍｏｌｅとプライ−ｑ　−５Ｑ　ｐｍｏｌ
ｅを１００　ｒａＭＮａ（Ｊ、　４０　ｍＭｔｒｉｓ−
ＨＣＪ　（ｐｉ（７，５）　。

２０　ｍＭＭｇｃＪ！ｚ　、　２ｍｙ２−メルカプトエ
タノール中に官有するアニーリングしたプライマー−鋳
型１０　ｔｔＪ−を、６７．５　ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、　４
５　ｍＭ　ＴｒｉＳ−１（（Ｊ（ｐＨ７，５）、　２５
　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、１ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ール中に２０μＣ１〔α其Ｐ　）ｄＡＴＰ　（２，００
０ａｉ　／　ｍｍｏｌｅ　）、各２５０　ｔｔＭ１７Ｊ
　ｄＡＴｐ　、　ｄａＴｐ　。

（ＩＧＴＰ　、　ｄＴＴｐ　、　０．８単位のＫｌｅｎ
ｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼエ、２単位のＴ４リガーゼ（
ＢＲＬ工ｎｃ、）を官有する容［２０μｍに調整した。

２２℃に３０分間おいたのち、（ＬＡＴＰを２５０μＭ
まで加え、さらに０．８単位のＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポ
リメラーゼを加えた。

混合物を２２°Ｃでざらに２．５時間インキュベートし
た。ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）に
調整し、６容量のエタノールを加えて一２０℃に一夜（
１６時間）放置して沈殿させた。

不完全転写体は以下のようＫｓｓよヌク１／アーゼで消
化した。ＤＮＡを３００　ｍＭＮａｃｊ　、　５　ｍＭ
”　”’２　ａ　５０　ｍｙ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，
５）の溶液中、初期の鋳型濃度１　ｎＭ　、最終容量２
５０μｍで、３０分間インキュベートした。Ｓ□ヌクレ
アーゼは初期の鋳型０．０１　ｐｍｏｌｅに対して１単
位の割合で添加した。

生成物は直接、０℃でコンピテント１．　ｃｏｌｉＪＭ
ｌｏｌ　０．４ｍｌに添加した。４０分後、細胞に４２
℃で２分間熱シヨツクを与え、２０ｍのＹＴ培地（トリ
ジトン８９／ｌ　、イースト抽出液５１１／ｌ　、Ｎａ
ＣＬ５ｇ／ｌ　）中に６７°Ｃで希釈した。培胞を５７
℃で１６時間生育させた。細胞を遠心分離してペレット
状とし、上澄液中のファージは６０％グリセロール中−
２０℃で保存した。

７アージの希釈液で指示細胞上を覆ｂ、２〜４００個の
プラークを含むプレートを、ベントンおよびデービス（
Ｂｅｎｔｏｎ　＆　Ｄａｖｉθ）の方法〔サイｘンス（
５ｃ１ｅｎｃｅ　Ｌ　１９６　：　１８０頁、１９７７
年〕と同様にして［３２ｐ　］リン酸化オリゴヌクレオ
チドをゾローゾとして用い、ハイブリダイゼーションの
ためのニトロセルロースレプリケートの作成に使用した
。フィルターは予め、６　Ｘ　ＳＳＯ中４０℃で６時間
洗浄し、プライマー４００　ｐＭを含む６ＸＳＳＯ／１
０Ｘデハライツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ　）／Ｄ、１％Ｓ
Ｄ８溶液３００μノを用い、パラフィン油下、４０℃で
１６時間、ハイブリダイゼーションを行ツｆ、−〔Ｉ　
Ｘ　Ｓ８０　＝　［１，１５Ｍ　ＮａＣＪ、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム、ＰＨ７，２，１０×デハライッ
＝０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）、０．２％
ポリビニルピロリドン（ｐｖｐ　Ｌ　Ｏ，２％フイコル
（Ｆｉｃｏｌｌ−）　〕。フィルターは６　Ｘ　１３８
（！　／　０．１％ＳＤＳ中１５９Ｃで、５分ごとに６
回液を交換して洗浄した。

バックグラウンド以上のハイブリダイゼーションを示ｊ
５０個のプラークを各５０μｌのＬ’１ｒＢ（１［］］
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ７，５２［１ｍＭＮａｃＬ、
１　ｍＭＥＤＴＡ　）中にとった。細胞層を遠心除去し
、各プラークについて上澄液１μノを、６７℃で６０分
間生育させたに、　ｃｏｌｉ　ＪＭ　ｉ　［］　ｉのロ
ーン上にスポットした。−夜生育させると、Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　、ＴＭｌｏｌのローン上に大きなプラークが形成
された。ニトロセルロースレプリケートを再びとり、上
述したと同様にしてハイブリダイゼーションを省っだ。

５１中１９個のプラークがコントロールレベル以上のハ
イブリダイゼーションを示した。これを上述したと全（
同様にして再スクリーニングを行った。６個をとって、
さらにＤＮＡ配列決定法により解析した。所望の変化は
Ａ２Ｂであるので、暗号鎖を５′末瑞標識によりついで
マキサムおよびギルバー）　（Ｍａｘａｍ　＆　Ｇ１１
ｂｅｒｔ　）の化学的分解配例決定法〔マキサムら（Ｍ
ａｘａｍ　＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ　）　：メリーズ　イン
　エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏａｅ　ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　）　、（５５巻（１）、４９９頁、１９８
０年〕のＣ反応により、一方非暗号鎖は６′末端標識に
よりついでマキサムおよびギルバー）　（Ｍａｘａｍ＆
　Ｇ１１ｂθｒｔ　）法のＣ反応にまりＷＣ析した。突
然変異体では、母体のＭｌ　！ｌ−４ＡＢ−［１０の平
行反応に比べ、暗号鎖で余分の０１非暗号鎖で余分のＧ
を示すことになる。したがって、ＤＮＡをｌ（ｉｎａｍ
で消化して６′標識のだ めの付着端を生成させるか、−Ｈｐａ　ｌで消化して５
′標識のためのプラント末端を生成させた。

標識後、断片なりｇｌ　ｌで消化して標識末端を分離し
た。必要な断片は、１３５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊｐ
ｌ（８，８＋４５ｍＭホウ酸ナトリウム、１ｍＭ　Ｆｉ
ＤＴＡ中１０％アクリルアミド／　０．３３％ビス−ア
クリルアミドデル上笥気泳動を行い単離した。断片を０
．６ＷＬｌホワットマ：／　（Ｗｈａｔｍａｎ　）　Ｄ
Ｆｉ　５２イオン交換樹脂上に電気溶出し、濃縮し、つ
いでＤＮＡ配列決定を行った。６個のクローンはすべて
所望の変化を示した。り四−ンの２個をとって、遺伝子
生成物が依然として抗ウィル活性を示すことをテストし
た。

インターフェロン抗ウイルス試験は、Ｍ１６感染または
プラスミド形負転換細胞抽出液について、次のように実
施した。トリプトファンを含まないミネラルメジウム＋
グルコース中の２００　ｍｌ培養液５０個を光学密度（
６０ＯｎＩｎ　）　０．６〜０．９で、１０．０００　
ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離して収穫した。細胞を
−７０００で凍結し、１５％（Ｗ／ｖ）庶糖、５　Ｑ　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ＪｐＨ８，Ｏｙ　Ｏ，１％（Ｗ／
ｖ）？−１・血清アルブミンおよび２．５ｍ９ライソヂ
イムの２．５〜５．０ｍＡ存在下に解凍し、ついで２０
℃において振盪下に１５分間インキュベートした。細胞
層を１５．０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離して除き
、上澄液は孔径０．２μｍのニトロセルロースフィルタ
ーでろ過して、さらに澄明化、滅菌した。最後に、この
抽出液について、ｉｎ　ｖｉｔｒｏミクロプレート試験
システム〔たとえば、ダールら（Ｄａｈｌ　。

Ｈ，＆Ｄθｇｒｅ、Ｍ、　）　：アブツ、パス、ミクロ
パイオル、スカン、　（Ａｂｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎ、）。

１３８０　：　８６３頁、１９７２年）により、ｖｅｒ
。

（アフリカミドリザル）細胞のＫＭＯ（転心筋炎）ウィ
ルス感染における細胞変性効果に対する＆謹作用を調べ
、抗ウィルス活性を測定した。

母体とほぼ同レベルの抗ウィルス活性が観察された。−
木鐸ファージＩ）ＮＡをひとつのクローンから確立され
た方法で単離し、構築■の鋳型として使用した。

例４ 突然変異インターフェロンβ（ｍＪＡｌ）の７ミ／酸１
０１（バリン）のシスティンへの変換によるｍｒｒＡ２
の調製（第６図、第５図およびチャート２参照）： 配列５’　０Ｈ−Ｃ！ＴＴＣ’０ＡＧＧ（！ＡＴＧＴＣ
！ＴＴＣ！Ａ−ＯＨ３’のオクタデカマー（第５図）を
、構築■の場合と同様にホスホトリエステル法を用いて
構築した。この配列は工ＦＮ−β１暗号配列２９４〜３
１０ヌクレオチＶ（英国特許出願第２．０６８，９７０
号参照）の配列５’　ＴＧＡＡＧＡＯＡＧＴＯＯＴＧＧ
ＡＡＧ　３’と、５′末端から９番目と１０番目のヌク
レオチｒが所望の突然変異の補体に相当するほかは相補
性である。すなわち、所望の変化は暗号配列のヌクレオ
チド３０１におけるＧかＴへ、ヌクレオチｒ３０２のＴ
がＧである。

特異的プシイミングはｍＪＡｌと正確に一致した。

特異的生成物は、前述したと同様に転写生成物のＨｐａ
　Ｉによる消化お工び電気泳動で６４８塩基フラグメン
トとして同定された。

閉環状分子の形底、連結、トランスフェクションｉ　ｌ
＋ｔｌ　３と同様に行った。ファージＤＮＡは形澗転換
体の全プールから調製し、プライマーの再アニ−リング
、転換、連結、Ｓ１ヌクレアーゼ処置およびトランスフ
ェクションに前述したと同様に使用した。ただし、Ｓ１
反応では、母体鋳型とプライマーの間の不適正塩基対の
消化を増強し、集団中の突然変異閉環状分子が増大する
ように条件を変化させた。すなわち、反応は、１００　
ｍＭＮａＣｆ。

３ｐｍＭ酢酸ナトリウムｐ）１４．５．５　ｍＭ　Ｚｎ
Ｃ１の５００μＬ中、初期鋳型３．８ｐ　ｍｏｌｅおよ
びＳ１ヌクレア一ゼ２単位を含有させて実施した。

ファージＤＮＡは形質転換体の総プールから調製し、濃
縮ステージは上述したと正確に同じにくり返した。第２
回目の濃縮での５０個のプラークは１　ｍ６　（ＹＴメ
ジウム）に生育した。各懸濁液２ｄヲ直接ニトロセルロ
ース上にスポットし、前述したと同様にハイブリダイゼ
ーションｆｔ行った。６個の陽性プラークと２個の陰性
プラークが再スクリーニングされた。ファージＤＮＡを
調製し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法で濃
縮した。ファージをＬＴＢ　５０μＬに再懸濁し、６０
０倍の凝度とした。各懸濁液２１Ｌｉ−をニトロセルロ
ース上にス？ントし、前述したと同様に（３１ｉｐ）リ
ン酸化プライマーとハイブリダイゼーションをｆ［した
。

ハイブリダイゼーションで６個の陽性プラークが確認さ
れた。所望の変化の存在はＤＮＡ配列決定法（マキサム
およびギルバート）によって確認された。−重鎖ファー
ジＭＡは確立された操作で調製された。β配列のアミノ
酸１１４〜１１７をコードてる配列と相補性の短いオリ
ゴマーは前述のようにして調製し、〔γ−３２Ｐ　：ｌ
　ＡＴＰを用いてリン酸化した。これを前述のようにし
てファージＤＮＡにアニーリングし、生成した短い転写
体を真１１で切断した。肋人的プライξング生成物に相
当する２１３ｂのバンドを７Ｍ尿素、８％アクリルアミ
ド、０．２％ビス−アクリルアミド、１３５ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＲＣｆ　ｐＨ８−８，４５ｍＭホウ酸ナトリウム、
’ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｌ”ル上で即離した。この断片
を電気溶出し、ＤＮＡ配列はマキサムおよびギルバート
法を用いて決定した。ＤＮＡ配列により所望の変化（第
５図、第６図）が確認さねた。１個のクローンをとり試
験したところ、前述したと同様に、遺伝子生成物は抗ウ
ィルス活性を 維持していた。このクローンを構築Ｖにおける鋳型とし
て使用した。

例５ 突然変異ヒトインターフェロンβ（ｍＪＡ２）　０）ア
ミノ酸１７（システィン）のセリンへの変換によるｍＪ
Ａ３の調製（第６図、第６図およびチャート３参照）： 配列５’　０Ｋ−ＣＴＧＡＣＴＯＴＧＡＡＡＡＴＴＧ　
３’　（１）　ヘキサデカマー（第６図ε照）を、構築
■および■の場合と同様、ホスホトリエステル法を用い
て構築した。こｆ）　配列ｔ−ｊ工ＦＮ−β暗号配列の
３９〜５４ヌクレオチｒ（英国特許出願第２．０６８．
９７０号参照）の配列５’　０ＡＡＴＴＴＴＯＡＧＴＧ
ＴＣＡＧ　３’と、５′末端から６番目のヌクレオチＶ
が所望の突然変異の補体に相当するほかは、相補性であ
る。所望の変化は暗号配列のヌクレオチｒ４９における
Ｔ−４Ａである。

特異的プライミングは例６および４と同様に明らかにさ
れた。特異的生成物は、転写生成物の、町些Ｒ工消化お
よび電気泳動により、前述したと同様にして、１８７塩
基断片として同定された。

閉環状分子の形成および連結は、構成ｌ■および■につ
いて前述したと同様に実施した。閉環状分子１ｔｌ　６
７．５　ｍＭＴｒｌｓ−ＨｃＬｐ）１８−８　、２２．
５　ｍＭホウ酸ナトリウム、０，５　ｍｕ　ｕ＋Ｔｈ、
　１μ、！、ｌ／−エチジウムブロマイド中１％低融点
アガロースによる電気泳動を用い、Ｓｌヌクレアーゼ前
処置を行わないで不完全生成物と分離した。閉環状二重
鎖完全長分子に相当する領域を長波長（３６６ｎｍ　）
透過によって可視化し、ｒルから切断し、６０　’Ｃで
５分間溶融させた。二重鎖生成物Ｑ、３　ｐｍｏｌｅに
相当する容緻を用いて、確立された操作でＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＪＭ　ｊ　Ｄ　ｊの形質転換行った。形質転換細胞
をアガール上に直接まいた。−夜生育させたのち、ニト
ロセルロースレノリケードをとり、前述したと同様に〔
３にＰ〕リン酸化プライマーとハイブリダイゼーション
を行った。ハイブリダイゼーション温１ｆｔｌ：４２°
Ｃ５６６時間とした。Ｅ、ｃｏｘＩＤＮＡ　（１０ｐｆ
ｌ　／　ｍｌ。

熱変性）がプレハイブリダイゼーション液に含まれてい
た。最後に、フィルターを６　ｘ　ｓｓｃ中４４０Ｃで
洗浄した。

背景上にシグナルを示したプラーク２４個をとり、２５
μぶり対数期Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０１含有ＹＴ培地
１ｒＲｔ中で６時間生育させた。細胞を遠心分離して除
き、溶液中のファージをｐＥＧ沈殿法によって８０倍に
濃縮し、最終容１１１０μノとした。各４μｍをニトロ
セルロース上にスポットし　［３２ｐ〕ゾライマーを用
いてハイブリダイゼーションを行った。約５０％のスポ
ットがパックグラウンｐレベルよりも強いシグナルを示
した。陽性ファージ４個について、さらにプ２−り精製
を行った。ファージを明瞭な、ハイブリツＶ陽性プラー
クから単離シ、ｄ８ＤＮｊａｌｉ！ｍｅ子（ＲＦ）　ヲ
ｍＭ　シタ。所望の変化の存在は新しい一状リゾ１部位
の出現によって推論された。所望の変化Ｔ−４Ａは、５
’ＧＡＧＴＣ配列を導入し、これは酵素−Ｈｌｎｆ　１
の認識配列である。この部位の存在に母体ＲＦにおける
１９７塩基対のＨｌｎｆ・１断片を、突然変異ＲＦでは
１６９お工び２８塩基対の２分子に切断する。　。

すなわち、ＲＦ　５　ｆｉｌを、６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＪ、　ｐＨ７，５。

６　ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２　、６　ｍＭ　２−メルカゾトエ
タノール、５０　ｍＭＮａｃｚの認容ｊｔ５００μｍｇ
中、１２．５単位のＨｌｎｆ　工により、６７℃で１６
時間消化した。この制限酵素は認識部位のＧとへの間を
切断するので、断片は６′末端で〔３２αＰ　′ＪｄＡ
ＴＰにより標識された。

反応液はＤＮＡ　０．４　ｐ　ｍｏｌｅ　、　２　Ｄ　
ｐｃｊ［α−”　２Ｉｌ＋：）　６ＡＴｐ（２，ＯＤ　
Ｑ　Ｃ１／ｍｍｏｌｅ　）および２単位のに１ｅｎｏｗ
ＤＮＡボリメラーデエを６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　ｐ
Ｈ７，５，５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、　６ｍＭ　ＭｇＣｌ２
．７　ｍＭメルカプトエタノールの５０μ！中に言有し
、反応は２５°Ｇで６０分行った。断片を、１６５　ｍ
ＭＴｒｉｅ−ＨＣＪ　ｐＨ８，８、４５ｍＭホウ酸ナト
リウム、Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中１０中子０％アクリルア
ミ０．３３％ビス−アクリルアミｒ上で分離した。４個
のプラークの分析ではすべて所望の制限パターンを示し
、所望の突然変異の誘発が明らかであった。

列６ ■：　１）ＪＡ２．　ＨｕＩｙＮ−ｘ８０５　、　ｉｌ
ｌ　：　Ｉ）ＪＡ３　、　Ｈｕ工ＦＮ−ｘ８０４　） 突然変異体β構築体のｐＭＮ　３９−１へのザブクロー
ニング（第７図）： ｆ５スミＰｐＭＮ３９−１ｉ’ｊ７’う、Ｘミ）’ｐ１
−２４の月１１１と２．ｍ　Ｈ工部位の間の４３４ｂｐ
が欠失したものである。したがって、ｐＭＮ３９−１は
天然Ｊ（ｕ工ＦＮ−β遺伝子をｔｒｐアテニュエーター
のマイナスコントロール下にｉ有ｆるｔｒｐコントロー
ル領域と工Ｆ’Ｎ−βの１６１個のアミノ酸は６２　ｌ
　ｂ：ｐＥＯＯＢ工／Ｂ８ｔ　Ｉ　ＩＩ断片上に存在す
る。この断片は除去して、ｍＪＡｌ　、　ｍ、ｙ＊２ま
たはｍ、Ｔａ２からの類似の断片で置換し、それぞれ：
ｐ、ｒＡ　１．　ｐ、Ｔａ２．　ｐＪＡ３を調製するこ
とができる。これらの構築体は、β−ラクタマーゼ遺伝
子もコーＶする高頻度コピー数シラスミＶ上、ｔｒｐコ
ントロール下に突然変異Ｈｕ工ＦＮ−β遺伝子をもつの
で、形質転換Ｈ０ｃｏｌｉ細胞のアンピシリン抵抗性に
よっても選択可能である。

ｍＪＡ　１１ｍＪＡ　２　＃　ｍＪＡ　３からのＲＦサ
シクローニングには、閉環状プラスミドｐＭＮ　３９−
１を酵素ＫｃＯＲＩおよびＢｓｔＥ工１で消化した６各
ｍ、ｒＡ　１　、　ｍＪＡ２およびｎｏ、ｒＡ３の１ｐ
ｒｎｏ１θを各反応液の総容量２５０μＪ中、Ｂｓｔ　
ｌエエ１０単位により、３７°Ｃで１６時間消化した。

２ｐｍｏｌｅの’Ｉ）ＭＮ３９−　Ｉ　Ｈ総容量２５０
μ中、Ｂｅｔ　Ｋ工１１０単位により６７°Ｃで１６時
間消化した。

ＤＮＡを沈殿させ、それぞれ総容量２５０μｍ中、Ｂｃ
ｏＲ工各２０単位により、３７℃で１６時間再消化した
。消化生成物を沈殿させ、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ａ
ｃｉ　ｐＨ７，５，１ｍＭＫＤＴＡの２０μｍ中に再溶
解した。

ｐＭＮ　３９−１消化の生成物は、１μｇ／−エチジウ
ムプロ”１イｆ含有ｔ５７．５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｊ　ｐＨ８，８。

２２．５　ｍｘａホウ酸ナトリウム、中０．８％低融点
アガロース上で分割した。デルから３３０３　ｂｐＥＣ
ＯＲ工／　Ｂｓｔ　Ｉ！＋エエ断片を切り取り、６０°
Ｃで溶融させた。

ｍＪＡ　１１　ｍＪＡ２ｊ　ｎ＋ＪＡ３の消化生成物は
、アカロース濃度を２％としたほかは上に述べたと同様
にして分割した。デルから各消化での生ｔＮ、ｗ、６２
１ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　／　Ｂｓｔ　Ｅ　ｎ断片を切り敗
り、６０８Ｃで省融させた。

３、：り　ｋｂ　ｐＭＮ　３９．１断片０−１７　ｐｍ
ｏｌｅを含有するｄＰＰ−容量とｍＪＡ　１．　ｍ、Ｔ
Ａ　２．　ｍＪＡ　３それぞれの０．６２　ｋｂ断片Ｑ
、４　ｐｍｏｌｅを飽性するｔ１３＆容りを混合した。

断片は６５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊｐｌ（７，５、５
ｍＭＭｇ（Ｊ２　、　２［１ｍＭジチオスレイトール、
ｉ　ｍＭ　ＡＴＰの総容量２［１０μｌ中、１単位のＴ
４リガーゼと、２０℃で２４時間処理し、連結させた。

すｒ−ジョン混合初冬５０μ）をコンピテントＦ２．　
ｃｏｌｉ　Ｋ　１２）ＬＢ　Ｉ　Ｃ１１細胞の確立され
た操作での形砲転換に用いた。

各ＩＪ　ｒ−ジョンでの数種の形質転換体を生育させ、
ビルンボインおよびドーレイ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆Ｄ
ｏｌｙ　）の方法〔ヌクレイツク　アシド　レス。

（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　、７　
：　１５７３頁。

１９７９年〕によってプラスミドＤＮＡを調製した。

プラスミドＤ’ＮＡはＨ１ｎｆ工で消化し、構築■の解
析について述べたと同様にしてｐＭＮ　３９−１の場合
と比較した。ｐ、ＴＡｌおよびｐＪＡ　２についての消
化パターンはｐＭＮ　３９−１の場合と同一であった。

ｐＪＡ　３のＨｌｎｆ　１消化物は、期待されたように
、１９７　ｂｐバンドが存在せず、代わりに１６９およ
び２８　ｂｐのバンドが 存在する点でＰＭＮ　３９−１の場合と異っていた。

例７ 修飾工ＦＮ−βの抗ウイルス性 抗ウィル性試験は、ｉｎ、ＴＡ　１の構築（構築■）に
関して記載したと同様にして実施した。

構築体■〜■の場合には、メジウムはアンピシリン１０
０μｇ／−を含んでいた。

インターフェロンの収率は、構築体が生物活性を維持し
ていることを指標として得られた（第２表）。Ａ６００
は誘発した場合０．４、収穫した場合１．０であった。

いずれの場合も、誘発条件でｔｒｐプロモーターからの
表現か検知できた。しかしながら、収率はｍｙＡ３（構
築■）の場合６Ｘ１０”〜５．３　Ｘ　１０’工Ｕ／Ｌ
　、　ｍＪＡｌ　（構築１１１）＋７）場合３．７　ｘ
　１０３〜７．９　ｘ　１０’工σ／Ｌ　、　ｍＪＡ２
（構築■）の場合１．４５Ｘ１０”〜２　Ｘ　１　［１
５工σ／Ｌであった。

第２表 １　ｐＭｎ３９−１　２．３Ｘ１０７２．３Ｘ１０７２
　ｐ鼎３９−１　３．５ｘ１０’ ■ｐＪＡ２　６．６５　Ｘ　１０’ ３　、　ｐＭＮ３９−１　６．ろ５Ｘ１０”■Ｉ）ＴＡ
２　３Ｘ１０’ ■Ｉ）、ＴＡ　３　２．１　ｘ　１０６プラスミド構築
ＫＶＩ〜■の抗ウィルス力価を検討した。実験結果（第
２表）は母体のシラスミドｐＭＮ３９−１に比し、力価
の低下を示している。

とくにｐＭＮ　５９−１からｐＪＡｌへのＡのＧへの変
換は１オ一ダー以上の明らかな力価の低下を生じた。

第２表のまとめ ｐＭＮ３９−１　２．１４Ｘ　１０’ ｐＪＡ　１　６．２Ｘ　１０５ ｐＪＡ　２　２．３５Ｘ　１０６ ｐＪＡ３　２．１　Ｘ　１０’ 粗リゼート物角で行った不均一細胞試験のデータでは、
ｐＭＮ３９−１生成物とｐ、ＴＡ　１およびｐ、ｒＡ　
２生成物の活性間には差がなかった。

タンパク中のＳＨ基の測定 ４６　Ｍ　インターフェロン中のスルフヒドリル基の存
在はボイヤー（Ｂｏｙｅｒ　）の方法〔ざイヤー（Ｂｏ
ｙｅｒ、Ｐ、Ｄ、　）　ニジエイ、アム、ケミ、ソシ。

（ｙ、　ｈｍ、　Ｏｈｅｍ、　ｓａｃ、　）　、７６　
：　４３３１頁。

１９５４年〕により、ｐ−マーキュリ−ベンゾアートを
用いた化合滴定で測定した。この方法は、たとえば８Ｍ
尿素中、また遮蔽されずに埋没した一８Ｈ基には０．５
〜１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いて行われる。アル
キル化反応に基づく他の方法、たとえばＮ−エチルマレ
イミド（ＮＢＭ）の使用も適当である〔グレゴリイ（Ｇ
ｒｅｇＯｒ７　＋Ｊ、Ｄ、　）　ニジエイ、アメ、ケミ
、ソシ、（Ｊ、Ａｍ。

ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、）ｙ　７７：３９２２頁、１９５５
年〕。

また、ジスルフィドたとえば５，５′−ジチオビス（２
−ニトロベンゾエート）との反応に基ツくエルマン（Ｋ
ｌｌｍａｎ　）の方法〔アーク、バイオケミ。

パイオフィス、　（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　）　。

８２　：　７０頁、１９５９年〕も使用できる。これは
発色して、比色定量にも応用できる。

タンパク中の−５−Ｓ−基の測定 タンパクのスルフヒドリＡ／（−８）ｉ）含量を測定す
る方法が、その１１ジスルフイド（−Ｓ−Ｓ−）含量の
測定に応用できる。ます、−５−Ｓ−橋を還元剤で還元
する。−５−Ｓ−結合の数は、還元後の総ＳＨ含量に対
する非還元タンパク中の一８Ｈ基の比からＳＨ基の数を
知ればわかる。たとえば、カバリーニ（Ｃａｖａｌｌｉ
ｎｉ　）ら〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）。

２１２：２９４．１９６６年〕によって開発された方法
では、−５−Ｓ−基をボロハイドライドで還元し、生成
した８Ｈ基の数をエルマン（Ｋｌｌｍａｎ　）法（前出
）で測定している。

タンパク中のジスルフィド粘二此ノλ僧」Ｆ！λ更し定
−５−Ｓ結合を酸化的に開裂して強酸性のスルホン基を
形成させると、システィン含有ペプチドの電気泳動にお
ける移動性が著しく変化する。ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ
　＆　Ｈａｒｔｌｅｙ　）　（バイオケミ、ジエイ。

（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）、８９　：　５９頁、１
９６３年；バイオケミ、ジエイ、　（ＢｉＯＣｈｅｍ、
　ｙ、　）、１０１　ｒ２１４０．１９６６年〕は、ろ
紙上ペプチドの”斜行電、気泳動”を用いてタンパク中
のＳ−Ｓ結合の位置を調べる方法を開発した。酵素加水
分解物をｐＨ６，５で電気泳動に付す。乾燥後、切片を
電気泳動図から切り取り、新しいろ紙に縫いつける。

次に２回目の電気泳動をｐＨ６，５で、面角Ｋｌ初の電
気泳動の方向に行う。その結果、ペプチドは斜線に沿っ
て、その移動性に応じて配列する。最初の電気泳動後に
切り取ったろ紙片を違ギ醇の蒸気に曝すと、この操作で
システィン酸を含むペプチドが生成して、斜線からはす
れる。この方法によ′す、タンパク中でＢ−６橋により
結合しているペプチドは容易に同定される。

このペプチドをろ紙から溶出し７、アミノ酸分析および
／−１，たはペプチド配列決定法を行えば、タンパク中
のペプチド結合の位置を決定できる。

例８ 工ＦＮＸ　８　１　５　、工ＦＮＸ８１６．　工ＦＮＸ
　８　１　７　。

修飾インターフェロンエＦＮＸ　８１５　、８１６　。

Ｂ１７，８１Ｂおよび４５７のＤＮＡヌクレオチＶ配列
およびアミノ酸配列をチャート４〜８に示す。

これらのＤＮＡ配列は、例３，４．５および乙の方法ヲ
用イ、ノラスミｒｐＪＡ　１．　Ｉ）、ＴＡ２　オ！ヒ
ｐ、ｌＡ３から構築される。修飾インターフェロンは列
９の方法を用いて単離される。また、チャート４〜８に
特定した全ＤＮＡ配列を、トリプレットコＶンを示ｊ標
準遺伝子暗号お↓び列３，４および５に示したホスホト
リエステル法を用いて台底することモ”Ｃ−きル。プラ
スミＫＰＭＮ　３９−１　、　ｐＪＡ’ｌ　。

ｐＪＡ２またはｐＪｈ　３は、ついで例６の方法を用い
てプラスミドの製造に使用される。

例９ インターフェロンの抽出および序育製 インターフェロンにその産生細胞から、次の操作を用い
て単離できる。

工程１：破壊細胞グレバレーションの遠心分離■程２：
　５　［］　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　ｐＨ８−０中、
タンパクにＳＤＳが６倍Ｗ／Ｗ鍋剰となるように用いて
ぺｌ／ノット再懸濁する。ＤＴＴを１０　Ｑ　ｍＭまで
加え、９５℃に加温する。９５℃に５分間保持する。

■程６：澄明抽出液を得るための遠心分離工程４　：　
ＡＣＡ　４４カラム（４，４Ｘ　６０口）上、溶出液と
して５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＣＬｐＨ８，０＋　１０　ｍ
ＭＤＴＴ　、０．５％ｓＤｓを用い４０ｍＥＺ時でｒル
ろ過する。このカラムのサイズは名目１０１の発醇槽（
現在の細胞濃度で）を１バンチで処理できる。

非経口投与 本発明の修飾インターフェロンは公知の方法に従い医薬
組成物に処方できる。活性インターフェロンポリペプチ
ドを医薬的に１容される担体ビークル、たとえはアルブ
ミンと合する。本発明のインターフェロンの供給に適し
た組成物および処方についてはレミントンズ　ファーマ
セウチ力ルサイエンセス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｅ　Ｐ
ｈａｒｍａｃθｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　）　（
−ｙ−チン（Ｅ、　Ｗ、　Ｍａｒｔｉｎ　）著〕が参考
になる。

本発明の医薬組成物はインターフェロンタンパクの刹効
邦を、治療的に投与するのに適した担体とともに富有す
る。投与方法としては非経口投与がある。また、鼻孔内
スプレーも使用できる。

インターフェロン組成物の投与は、抗腫瘍細胞生育もし
くは免疫調節または抗ウイルス処置を必要とする患者に
適用される。投与量および１日用量は、臨床試験に現在
用いられている量とほぼ等しく、１日１０５〜１０８単
位である。さらに低いまたはさらに高い投与量が長期投
与または急性短期投与時に採用できる。非経口投与の場
合、好ましい投与ｉは１日１０６〜１０７単位である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、特定部位の突然変異誘発によるアミノ酸変化
での工ＦＮＸ８０２．８０３お工び８０４の生成な例示
したフローチャートである。第２図は、構築■の、また
第３図は構築■からＶまでの制限酵素地図である。第４
図は、工ｙＮｘ　８０２を生じる、第５図は工ＦＮＸ　
８０３を生じる、第６図はＩＦＮＸ　８０４を生じる特
定部位の突然変異誘発をそれぞれ例示した図である。第
７図は構築■。 ■および■の制限酵素地図である。 馬面の浄書（内容に変更なし） ■ ＩＦＮＸ１３０２ ↓ 丁ＦＮＸｇ０４ ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ　２ ＦＩＧ、　３ １　アミノ６変３．　乙）　ＩＦＮ４．　Ｔｙｒ　−＞
　ＣｙｓＬ　成　’Ｊ’ｌ）　ＴＦＮＹ８０２　（Ｈｕ
Ｉｌ’Ｎ−Ａ（Ｔｙｒ’　−＞　Ｃｙ’！’））７”７
４７　３’Ｇ　ＴＡＣＴＣＧ　ＡＣＧ　ＴＴｃｌＡ　５
′析しＩ＃Ｊｌｌ’１．Ｉ　丁ＣＣＡＴＣｌ　ＡＧＣＴ
ＧＣＡＡＣ丁ＴＧＣソ５ ＦＩＧ、　４ ２　７ミｚ’酉ｆ　＋ｏ＋、とＬ　ｒＦＮＹＢＯＺ、　
Ｖａｌ−＞　ｃｙｓ隻Ａ彷ＩＦＮＹＢＯ！ｒ （ｊ４ｕｌＦＮ−／３（Ｔｙｒ”　−＞　Ｃｙｓ’）　
（Ｖａｔ　”’　−７Ｃｙｐ、１０’））０４ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ１工りめら訝乙列　ら°　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ
　ＧＴ（：　ＣＴ（、ＧＡＡ　５ＡＡ　３アライア−Ａ
ＣＴＴＣ丁ＧＴ　ＡＣＧ　ＧＡｃＣＴＴ　Ｃ５’新しい
ｉｚ列　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＴＧＣＣＴＧ　ＧＡ
Ａ　ＧＡＡｙ５ ＦＩＧ、　５ ３、　アミノ酸１７．ヒｐ　ＩＦＮＸＢＯ３ＣｙＳ　−
＞　５ｅｒ生１１２１ｙ　ｒｒ−Ｎｙｅｏ４ （ＨｕＩＦＮ−／３（Ｔｙｒ　−）　Ｃｙｓ３）（Ｖａ
ｔ　１０’　−＞Ｃｙｓ　ＨＣｙｓ　−＞　５ｅｒ　ｌ
）１工乙゛１１／）／１〜乙列　５’　ＡＧＣＡＡＴ　
７７丁　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＡＧ　３’７′クイマー　
Ｇ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＴＣ丁ＣＡ　ＧＴＣ５’楽ケい
＝ｉｉ乙列　ＡＧＣＡＡＴ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　
ＣＡＧｅＩ− 輝ＲＩ　ヒ用 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１４識別記号　庁内整理 ＠発明者　ジョン　ロバート　ア　イギリス［ディアー
　−、ウイｒ １パックス、ハイ　ワイコウム、ラウドウォータ１ウ　
ウェイ、３ 特許庁長官殿 １．事件の表示 昭和５９年特許願第２６７６４１号 ２、発明の名称 修飾インターフェロン ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所 氏　名　ジー、ディ、サール　アンド　コンパニー（名
　称） ４、代理人 ５、補正命令の日付 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和！７年特許願第−２６７ｚダ／号 ２、発明の名称 ４１１古φインターフエ」コツ ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和１ｏ年　２月Ｊダ日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図　面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１ｌｉＥ１のインターフェロンのシスティン１個もし
   くは２個以上を欠失させるか、またＦｉ第２のインター
   フェロンのシスティン位置に相当する第１のインターフ
   ェロンの配列位置１個もしくは２個以上をシスティンに
   置換したアミノ酸配列からなる修飾インターフェロン分
   子 （２）　システィン欠失または置換により、第２のイン
   ターフェロンにおけるジスルフイｒ結合に相当する位置
   で１個またＶ′１２個以上のジスルフィン結合の形成が
   可能になる特許請求の範囲第１項記載の修飾インターフ
   ェロン （３１第１のインターフェロンはヒトβ−インターフェ
   ロン、第２のインターフェロンはヒトα−インターフェ
   ロンである特許請求の範囲第２項記載の修飾インターフ
   ェロン （４１１！１のインターフェロンはヒトα−インターフ
   ェロン、第２のインターフェロンはヒトβ−インターフ
   ェロンである特許請求の範囲第２項記載の修飾インター
   フェロン （５）　第１のインターフェロンはヒトβ−インターフ
   ェロン、＄２のインターフェロンはヒトｒ−インターフ
   ェロンである特許請求の範囲第２項記載の修飾インター
   フェロン （６）第１のインターフェロンはヒトｒ−インターフェ
   ロン、第２のインターフェロンはヒトβ−インターフェ
   ロンである特許請求の範囲第２項記載の修飾インターフ
   ェロン ｆ７）　第１のインターフェロンはヒトα−インターフ
   ェロン、第２のインターフェロンはヒトｒ　−インター
   フェロンである特許請求の範囲第２項記載の修飾インタ
   ーフェロン （８）　第１のインターフェロンはヒトｒ−インターフ
   ェロン、第２のインターフェロンはヒトα−インターフ
   ェロンである特許請求の範囲第２項記載の修飾インター
   フェロン （９）　β−インターフェロンのアミンａ！１〜６の１
   個がシスティンで置換されている特許請求の範囲第６項
   記載の修飾インターフェロン ００）　β−インターフェロンのアミノ酸９７〜１０５
   の１個がシスティンで置換されている特許請求の範囲第
   ３項記載の修飾インターフェロン住υ　β−インターフ
   ェロンのアミノ酸９７〜１０５の１個がシスティンで置
   換されている特許請求の範囲第６項記載の修飾インター
   フェロン圓　アミノ酸配列はＩＦＮＸ　８０２の配列で
   ある特許請求の範囲第９項記載の修飾インターフェロン
   ０：タ　アミノ酸配列はニジＪ８０３の配列である特許
   請求の範囲第１１項記載の修飾インターフェロン ０（１）　アミノ酸配列は工ＦＮＸ　８０４の配列であ
   る特許請求の範囲第１１項記載の修飾インターフェロン ０５）　アミノ酸配列ｉ−ｊ：　工、ＦＮＸ　８１５の
   配列である特許請求の範囲第９項記載の修飾インターフ
   ェロン（１０アミノ酸配列は工ＦＮＸ　８１６の配列で
   ある特許請求の範囲第１１項記載の修飾インターフェロ
   ０η　アミノ酸配列はＩＦＮＸ　８１７の配列である特
   許請求の範囲第９項記載の修飾インターフェロンａ８１
   　アミノ酸配列は工ＰＮＸ　８１８の配列である特許請
   求の範囲第１１項記載の修飾インターフェロン （１鐘　アミノ酸配列は工ＦＮＸ　４５７の配列である
   特許請求の範囲第１１項記載の修飾インターフェロン 四　位置１〜乙のシスティンと位置９７〜１０５のシス
   ティンの間にジスルフィド結合が形成される￥ｊｖｆ請
   求の範囲第１項記載の修飾インターフェロン ０１）　第１のジスルフィド結合がシスティン１〜６と
   システィン９７〜１０５の間に、第２のジスルフイげ結
   合がシスティン６１とシスティン１４１０間に形成され
   る特許請求の範囲第１４項記載の修飾インターフェロン レ４　特許請求の範囲第１項から第２１項１でのｂずれ
   かに記載のハイブリッドもしくは修飾インターフェロン
   のアミノ酸配列から主としてなるポリペブチＹを９０％
   以上の純度で含有するバクテリア抽出物 （２３１特許請求の範囲第１項から第２１頂までのいず
   れかに記載の修飾インターフェロンの治療有効散を含有
   する、医薬としての投与に適した医薬組成物 （２）非経口投与に適した特許請求の範囲第２６項記載
   の医薬組成物 Ｃ５）特許請求の範囲第１項から第２１項までのいずれ
   かに記載の修飾インターフェロンの抗ウィルス、免疫調
   節もしくは免疫原性療法への利用またほこのような療法
   に有用な医薬組成物の製造への利用 （２つ　ａ）特許請求の範囲第１項から第１９項までの
   いずれかに記載のポリペブチＶを表現できる複製可能な
   細菌性表現ビークルで微生物を形質転換し、り形質転換
   した微生物な発酵させることを特徴とする、上記ポリペ
   プチドを表現できる微生物の産生方法 邸　新しいジスルフィド結合の創成による修飾インター
   フェロンの安定化方法 （２９）　ポリペグチ−エＦＮＸ８０２ｊ　工ＦＮＸ８
   ０３゜工ＦＮＸ８Ｄ４．ＩＦＮＸ８１５．■ＰＮｘ８１
   ６＋工ＩＩ″ＩＶＩｘ８１７．工ｙＮｘ８１Ｂまたは工
   ＦＮＸ　４５７の合成をコー１するヌクレオチＶ配列か
   らなるＤＮＡポリマー （２、特許請求の範囲第２９項記載のＤＮＡポリマーを
   含有するプラスミド ｃｌｌ）　プ７スミＰ　ｐＪＡｌ　（ＡＴＯＯ３９５２
   ０）である特許請求の範囲第６０項記載のプラスミげ６
   り　プラスミドｐｒｒＡ２（ＡＴＣ！０３９５２１　）
   である特許請求の範囲第６０項記載のプラスミｒ（ハ）
   　プラスミドｐＪＡ３（ＡＴＣａ　３９５２２ンである
   特許請求の範囲第６０項記載のプラスミド