JPS6128384A - 変形されたインターフェロン―βをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された大腸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡ技術の一般的分野に関する。

更に詳しくは、本発明はシスティン残基の一つないしそ
れ以上の置換／欠損によって親類個体（ｐａｒｅｎｔ　
ａｎａｌｏｇｓ）とは異なった突然変異的に改変された
生物学的に活性のある蛋白質に関する。′（従来の技術
及び発明が解決しようとする問題点）組換えＤＮＡ　（
ｒＤＮＡ）技術よって微生物学的につくられる生物学的
に活性な蛋白質は、システィン残基を含有しており、そ
れらは活性に本質的なものではないが、分子間または分
子内の望ましくない結合を自由に形成する。このような
一つの蛋白質は、微生物学的につくられるヒトのベータ
インターフェロン（ＩＦＮ−β）である。ｒＤＮＡ技術
によってＩＦＮ−βをつくる過程で、高濃度のＩＦＮ−
βを含有する大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）抽出物中に、微
生物学的につくられるＩＦＮ−βのダイマーとオリゴマ
ーが形成されることが見い出された。このマルチマー形
成のため、ＩＦＮ−βの精製と分離が非常な手間と時間
のかかるものとなり、精製中に蛋白質を還元し、次いで
元のコンフォメーションに戻すためにこれを再酸化する
というように、精製単離手順に追加の段階が幾つか必要
になり、それによって不正確なジスルフィド結合形成の
可能性が高まる。更に、おそらくはマルチマー形成又は
ランダムな分子内ジスルフィド架橋形成のため、微生物
学的につくられるＩＦＮ−βは一貫して低い比活性を示
すこともわかった。従って、ＩＦＮ−βのように微生物
学的につくられ生物活性のある蛋白質を、その活性に悪
影響を及ぼさず、しかも蛋白質が望ましくない三次構造
（例えば蛋白質の活性を低下させるようなコンフォメー
ション）を有する結果になるような分子間架橋や分子内
結合の形成能力を減少し、又は排除する形で改変するの
が望ましいであろう。

（問題点を解決するための手段） 本発明は定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）により、親構造頬偵体（ｐａｒｅｎｔ
　ａｎａｌｏｇｓ）の活性を保持するが、分子間ジスル
フィド結合や望ましくない分子内ジスルフィド結合の形
成能力を欠いている突然変異的に改変された生物学的活
性蛋白質の製造に関する〔このような蛋白質を「ムティ
ン」（ｍｕｔｅｉｎ）という。「遺伝学・細胞遺伝学用
語辞典」（Ｇｌｏｓｓａｒｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ
　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）第４版、３８１
頁、スプリンジャー・バーラグ（１９７６年）〕。

これに関し、エッチ・エム・シェパード（Ｓｈｅｐａｒ
ｄ。

Ｈ，Ｍ、）等（Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１年）２９４巻
５６３〜５６５頁〕はＩＦＮ−βについて、そのアミノ
酸配列の１４１位置のシスティンがチロシンでおき代え
られたムティンを記述している〔ヒトＩＦＮ−βには１
７　、３１及び１４１位置にシスティンがある。Ｇｅｎ
ｅ　（１９８０年）１０巻１１〜１５頁及びＮａｔｕｒ
ｅ（１９８０年）２８５巻５４２−５４７頁〕。このム
ティンは、ＩＦＮ−β遺伝子のヌクレオチド４８５にＧ
−Ａ転位をもつ部分的ＩＦＮ−βｃＤＮＡクローンから
構築された雑種遺伝子の細菌による発現によってつくら
れた。このムティンは本来のＩＦＮ−βの生物学的活性
を失っており、智者らは置き換えられたシスティンが活
性に本質的であったと結論するに至った。

定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）技法は周知であり、アール・エフ・レイザー（
Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ。

Ｆ、）及びジェイ・ピー・レコック（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ
、　Ｐ、）ジエネテインク・エンジニアリング（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎ−ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツク
ブレス社（１９８３年）３１−５０頁、に検討されてい
る。オリゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム・
スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｍ、）及びニス・ギラム（Ｇｉ
ｌｌａｍ、　Ｓ、）、ジェネティック・エンジニアリン
グ：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻
１−３２頁に具体的に検討されている。

本発明の一つの面は、ジスルフィド結合を自由に形成し
、生物学的活性に非本質的であるようにな少なくとも１
個のシスティン残基をもった生物学的に活性な蛋白質の
合成ムティンであって、このムティンがシスティン残基
の少なくとも１個を欠損しているか、或いは別のアミノ
酸でおき代えられていることを特徴とするものに関する
。

本発明のもう一つの面は、上記合成ムティン類をコード
するように特に設計されたＤＮ＾配列をもつ合成構造遺
伝子（「デザイナ−遺伝子」）に関する。この面の下位
局面は、このような構造デザイナ−遺伝子を包含する発
現ベクター類、このようなベクター類で形質転換される
宿主細胞又は生物、及びこのような形質転換生物又はそ
の子孫を培養し、培養基からムティン類を回収すること
によって合成ムティンをつくる方法である。治療上有用
性をもつムティン類の場合、ムティン類の治療有効量を
含有する治療用組成物は、本発明のもう一つの面である
。

本発明のさらにもう一つの面は、望ましくないジスルフ
ィド結合を自由に形成す為ような１個ないしそれ以上の
システィン残基を有する蛋白質を、このような望ましく
ないジスルフィド結合を形成することから防ぐ方法であ
って、システィン残基を欠損させるか、これらを他のア
ミノ酸でおき代えることによって蛋白質が突然変異的に
改変されることを特徴とした方法である。

本発明の更に一つの面は、以下の工程を特徴とするオリ
ゴヌクレオチドに指示された突然変異誘発によって上記
の合成構造遺伝子をつくる方法である。

（ａｌ　　親蛋白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなる単鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライ
マーとハイブリダイズさせ（このプライマーは、欠損又
は代替えすべきシスティン用コドン、又は場合によりこ
のコドンと対合をつくるアンチセンス・トリプレットを
包含する領域に対して相補的なものであるが、当該コド
ンの欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレットを
規定するコドン又はアンチセンス・トリプレットとは不
一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）である。）、 （ｂ）　　ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長
させ、突然変異性へテロデュプレックス（ｈｅｔｅｒｏ
−ｄｕｐｌｅｘ）を形成させ、そして、 （Ｃ）　　この突然変異性へテロデュプレックスを複製
する。

本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオチドプラ
イマーは本発明のもう一つの面である。

本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的活性に本
質的ではないシスティン残基が、分子間架橋又はまちが
った分子内ジスルフィド結合の形成サイトを排除するた
めに、計画的に欠損又は他のアミノ酸でおき代えられて
いるムティン類、このようなムティン類をコードする突
然変異遺伝子、及びこのようなムティン類をつ（る手段
を提供する。

本発明によって突然変異的に改変できる蛋白質は、生物
学的に活性な蛋白質のシスティン含量、及びシスティン
残基が活性と三次構造に関して果たす役割について入手
可能な情報から確認できる。

文献ではこのような情報が入手できない蛋白質について
は、本明細書に記載の手順によって蛋白質のシスティン
残基の各々を系統的に変更し、生ずるムティン類の生物
学的活性及びそれらが望ましくない分子間又は分子内ジ
スルフィド結合を形成する傾向について試験を行なうこ
とによって、この情報は決定できる。従って、本発明は
ＩＦＮ−β及びＩＬ−２のムティン類に関して下に特に
説明、例示されているが、望ましくないジスルフィド結
合の形成に対して蛋白質を感受性にするような、機能的
に本質的ではないシスティン残基を含有する生物学的に
活性な任意のその他の蛋白質に以下の教示が当てはまる
ことが認められよう。ＩＦＮ−βとＩＬ−２以外に本発
明による突然変異性改変の候補となる蛋白質の例は、リ
ンフォトキシン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子−
１、それにＩＦＮ−α１である。候補蛋白質は、ふつう
には奇数のシスティン残基をもっている。

ＩＦＮ−βの場合、グリコジル化ｒＦＮと未グリコジル
化ＩＦＮがいずれも定量的に同様な特異的活性を示すこ
と、従って、グリコジル部分はＩＦＮ−βの生物学的活
性に関与も貢献もしていないことが報告された。しかし
、細菌でつくられるグリコジル化されていないＩＦＮ−
βは、グリコジル化された天然ＩＦＮ−βより量的に低
い比活性を一貫して示す。

ＩＦＮ−βは、１７　、３１及び１４１の位置にシステ
ィン残基をもつことが知られている。システィン１４１
は、シェパードら（前掲）により、生物学的活性に本質
的であることが立証された。４個のシスティン残基を含
有するＩＦＮ−αでは、二つの分子間−８−８−結合が
あり、一つはｃｙｓ２９とｃｙｓｌ、９８の間、他はｃ
ｙｓ　１とｃｙｓ９Ｂの間である。ＩＦＮ−βとＩＦＮ
−ｅｘとの相同性に基づいて、ＩＦＮ−βのｃｙｓｌ４
１はｃｙｓ３１と分子内−５−Ｓ−結合にしており、ｃ
ｙｓｌ７は自由に分子間架橋を形成できるであろう。ｃ
ｙｓｌ７を欠失させるか、これを別のアミノ酸と置換す
ることによって、ｃｙｓ　１７が生物学的活性に本質的
であるかどうか、またー５−３−結合形成におけるその
役割を決定できる。ｃｙｓｌ７が蛋白質の生物学的活性
に本質的でないならば、生ずるｃｙｓｌ７を欠損し又は
ｃｙｓｌ７が置換された蛋白質は、自然のＩＦＮ−βの
それに近い比活性を示し、またおそらく蛋白質の単離精
製を容易にもするであろう。

ＩＦＮ−β遺伝子のｃｙｓ１７用コドン（ｃｏｄｏｎ）
の領域に対して相補的であるがこのコドン中に１又は複
数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いるオリゴヌクレオチドで指示される突然変異
誘発手順を使用してデザイナ−遺伝子がつくられ、こう
してｃｙｓ１７がその他任意の選択されたアミノ酸でお
き代えられる。欠損を望む場合には、ｃｙｓ１７用コド
ンを欠いたオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。ｃ
ｙｓ１７をグリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン
、トリプトファン、セリン、スレオニン及びメチオニン
のような中性アミノ酸へ変換するのが好ましい方法であ
る。セリン及びスレオニンは、システィンと化学的類似
性を有するため最も好ましい代替え物である。システィ
ンを欠失させる時は、成熟ムティンは自然の粗蛋白質又
は微生物でつくられるＩＦＮ−βよりアミノ酸１個だけ
短い。

ヒトＩＬ−２は、蛋白質の５８　、１０５及び１２５位
にシスティン残基をもつと報告されている。ＩＦＮ−β
の場合のように、ＩＬ−２は細菌の菌体から単離される
時は集合したオリゴマー型になっていて、細菌抽、出物
から良好な収量を得るためには、還元剤で還元しなけれ
ばならない。そのうえ、精製され還元されたＩＬ−２は
不安定であり、貯蔵時にオリゴマー不活性型へ容易に再
酸化される。３個のシスティンが存在することは、天然
分子に見られるように正しい架橋は１個だけなΦに、再
酸化時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフィド架橋
の１個を無作為に形成しうろことを意味している。天然
ＩＬ−２蛋白質のジスルフィド構造がいかなるものか知
られていないから、ＩＬ−２遺伝子のコドン５８　、１
０５及び１２５に突然変異をつくり、どのシスティン残
基が活性にとって必要であるか、従ってまた自然のジス
ルフィド架橋形成に関与している可能性が最も大きいか
を確認するために本発明を使用できる。同様に、活性に
とって必要でないシスティン残基を修飾することによっ
てまちがった分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぎ、そ
して遊離システィン残基の除去又は置き換えによって分
子内間ジスルフィド架橋の機会番最小限に抑えることが
できる。

オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定なハイブリ
ッド形成に必要な条件により、また現在利用可能なオリ
ゴヌクレオチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌ
クレオチドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴ
ヌクレオチドを設計するに当たって、考慮すべき因子（
例えば全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）に
よって記述されている。概して、オリゴヌクレオチドの
全長は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成
を最適化するような長さであり、突然変異サイトから５
′及び３′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ
）は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に
よる突然変異の作用をさけるのに十分な大きさとする。

本発明に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレ
オチドは、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ま
しくは約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは
約１４個ないし１８個の塩基を含有する。これらは通常
、変更又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩基
３′を含有する。

変更されたＩＦＮ−β遺伝子をつくる方法は、大体にお
いて、コドン１７を消失させるが、又はそれが別のアミ
ノ酸をコードするように変更する合成ヌクレオチドプラ
イマーを使用して、ＴＦＮ−β遺伝子のコドン１７　（
ＴＧＴ）に部位特異的突然変異を誘発せしめるものであ
る。システィンをスレオニンに変え、プライマーをＩＦ
Ｎ−β遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリッド形成させ
る場合、好ましいヌクレオチドブライマーはＧＣＡＡＴ
ＴＴＴＣβ、ＣＴ□Ｃ八Ｇでへる（下線は変更されたコ
ドンを示す）。システィンを欠失させるのが望ましい時
は、好ましいプライマーはＡＧＣＡＡ、ＴＴＴＴＣＡＧ
ＣＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧ　テあり、これはｃｙｓに対
するＴＧＴコドンを喪失している。システィンをセリン
に代える時は、セリン用のＡＧＴコドンを含んだ１７−
ヌクレオチドブライマーＧＣＡＭＴＴＴＴＣＡＧ里ＣＡ
Ｇが選択される。ＣｙＳ１７で第一塩基Ｔ→Ａの転位に
より、システィンからセリンへの変化が起る。欠失を導
入する時には、所望の蛋白質の発現のためにＤＮＡ配列
の適正なリーディングフレームを保持しなければならな
い点を認識しなければならない。

プライマーはＩＦＮ−β遺伝子の１本鎖がクローニング
されたＭ１３’、ｆｄ、又はφ×１７４のような１本鎖
ファージへハイブリッド形成される。ファージが遺伝子
のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも担持できるこ
とは認められよう。ファージがアンチセンス鎖を担持す
る場合には、プライマーは、コドンの欠損、又は別のア
ミノ酸をコードするトリプレットを規定するこのコドン
とは一致しないが、突然変異させるコドンを含有するセ
ンス鎖の領域と同一である。ファージがセンス鎖を担持
する場合は、欠失させるコドンと対合するトリプレット
中では適当に不一致であるが、突然変異させるコドンを
含有するセンス鎖の領域に対して相補的である。ハイブ
リッド形成に使用される条件はエム・スミス及びニス・
ギラム（前掲）によって記述されている。温度は通常、
約０℃ないし７０℃、もっと一般的には約１０℃ないし
５０℃の範囲にある。ハイブリッド形成後、プライマー
はＤＮ＾ポリメラーゼ■、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆
転写酵素又は他の適当なりＮへポリメラーゼとの反応に
よってファージＤＮＡ上で伸長される。生ずるｄｓＤＮ
Ａは、Ｔ４ＤＮ＾リガーゼのようなりＡＮリガーゼでの
処理によって閉環状ｄｓＤＮＡへ変換される。１本鎖領
域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレアーゼ処理
によって破壊できる。

オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発は、ＩＬ
−２活性をもつがｃｙｓ１２５からセリン１２５へ変更
されたムティンをコードする突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるにも同様に使用できる。ファージが遺伝子のセン
ス鎖を担持する場合に、この突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるのに使われる好ましいオリゴヌクレオチドプライ
マーはＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡ（迫ＡＡＡＧＧＴ
ＡＡＴＣである。このオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−２
遺伝子のコドン１２５と対合するトリプレ・７トのまん
中の塩基にＣ−Ｇの変化を有する。

得られた突然変異性へテロディブレンクスは、コンピテ
ント宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。

宿主によるヘテロデュプレックスの複製により、双方の
鎖から子孫鎖ができる。複製に続いて、突然変異鎖の子
孫から突然変異遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿入
し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換
に使用する。好ましいベクター類はプラスミドｐＢＲ３
２２。

ｐｃＲｌ及びそれらの変異体、合成ベクター等である。

適当な宿主生物はＥ、コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、シュード
モーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、バシルス・ズ
ブチリス（Ｂａ−ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、
バシルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、種々の酵母菌株、バシルス
・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、ハツカネズミやラット、チャイニーズハ
ムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞のような動物細胞、植物
細胞、動植物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形
質転換する場合に、ムティンが発現されるために適当な
プロモータ・オペレーター配列も゛導入されることは認
識されなければならない。宿主は原核生物でも真核生物
でも良い。（真核細胞へＤＮＡを挿入する方法は１９８
１年９月３日公表されたＰＣ？出願番号ＵＳｇ１１００
２３９及び１Ｉｓ８１１００２４０に記述されている）
。Ｅ、コリとＣＩ（Ｏ細胞が好ましい宿主である。

本発明に従って得られるムティン類は、天然の親蛋白質
に生ずるグリコジル化およびムティン調製に使われる宿
主生物に依存してグリコジル化される場合もされない場
合もある。所望により、宿主としてＥ、コリ（Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ）及びバシルス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ）を使用する
場合に得られる未グリコジル化ムティンを、この技術分
野で知られている科学的、酵素的及びその他の変法によ
って住体外で任意にグリコジル化してよい。

ＩＦＮ−βに関する本発明の好ましい態様においては、
第１図に示すように、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列におい
て１７位のシスティン残基は、成熟ＩＦＮ−βをコード
するＤＮＡ配列のセンス鎖のコドン１７の第一塩基のＴ
−４Ａ転位によって、セリンへ変えられる。この部位特
異的な突然変異誘発は、合成１７−ヌクレオチドプライ
マーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ観ＴＣＡＧを使用して誘発
され、このプライマーはコドン１７の第一塩基に一個の
塩基の不一致がある以外は、コドン１７の領域における
ＩＦＮ−βのセンス核上の１７の個ヌクレオチド配列と
同一である。この不一致はプライマーのヌクレオチド１
２にある。遺伝暗号（コドン）は縮重（ｄｅｇｅｎｅｒ
ａｔｅ）　Ｌ／ており、アミノ酸の多くは一つ以上のコ
ドンによって暗号づけられることが認識されなければな
らない。例えばセリンの塩基暗号は、’ＴＣＴ、ＴＣＧ
、ＴＣＣ，ＴＣＡ、ＡＧＴ。

及びＡＣＧというコドンがいずれもセリンをコードする
ように、６通りの縮重である。便宜上、好ましい態様と
してＡＧＴコドンが選ばれた。同様に、スレオニンは＾
ＣＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ及びＡＣＧのコドンのどの一つに
よってもコードされる。特定アミノ酸に対して１コドン
を特定する時は、これがそのアミノ酸をコードするすべ
ての縮重コドンを包含することが意図されている。１７
−ａａｅｒは、ＩＦＮ−β遺伝子のアンチセンス鎖を担
持する１本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡにハイブリッド形成
される。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断
片を使用して、オリゴヌ然変異性へテロデュプレックス
の複製によって、不一致を含有する［ｌＮＡ鎖からクロ
ーンが得られる。

突然変異クローンは、特定の制限位置の存在又は不存在
、抗生物質耐性もしくは感受性、又はこの技術分野にお
いて知られたその他の方法によって確認され、スクリー
ニングされる。システィンをセリンによりおき代える場
合は、第２図に示されるＴ−Ａ転位に、よって、構造遺
伝子の中に新しいＨｉｎｆＩ制限部位がつくられる。突
然変異クローンは、突然変異したファージプラークのハ
イブリッド形成スクリーニングにおけるプローブとして
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して同定される。

第２図に示されるように、プライマーは親とハイブリッ
ド形成される時は唯一の不一致を有するが、突然変異し
たファージＤＮＡにハイブリッド形成される時は完全な
一致を有するであろう。オリゴヌクレオチドプライマー
を親ＤＮＡよりも突然変異ＤＮＡへ優先的にハイブリッ
ド形成させるようなハイブリッド形成の条件を工夫でき
る。新しく発生した旧ｎｆＩ部位も、ＩＦＮ−β遺伝子
の単一塩基の突然変異を確認する手段として役立つ。

突然変異した遺伝子を担持するＭ１３ファージＤＮＡを
単離し、プラスミドｐＴｒｐ３のような適当な発現ベク
ター中へ組み入れ、このベクターで大腸菌ＭＭ２９４株
を形質転換させる。形質転換体とその子孫を培養するの
に適した生育培地が当業者に知られている。ＩＦＮ−β
の発現されたムティンを単離精製し、特徴づける。

以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるため、また
例示だけの目的で提示されている。これらはいかなる形
においても本発明の範囲を限定するものと考えられては
ならない。実施例１〜９はＩＦＮ−βのムティンの調製
を記述している。実施例１０〜１５はＩＬ−２のムティ
ンの調製を記述している。

ｍ玉　ＴＦＮ−β′　云　のＭ１３ベクターへのクロー
ニング １本鎖ＤＮＡ鋳型の給源としてＭ１３ファージベクター
を使用することは、ジー・エフ・テンプル（Ｇ、Ｆ、　
Ｔｅｍｐｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２年）２９６
巻５３７−５４０頁で実証された。大腸菌ｔｒｐプロモ
ーターの制御下にＩＦＮ−β遺伝子を含有するプラスミ
ドｐβＩｔｒｐ　（第３図）を制限酵素旧ｎｄｌ［［及
びＸｈｏ　Ｉ［で消化した。Ｍ１３ｍｐ８　（ジェイ・
メッシング（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、　ｒ巨大分子に関する第３回クリ
ーブランド・シンポジウム：組換えＤＮＡ　ｊエイ・ウ
オールトン編、エルザビアプレス社、１４３−１５３　
頁（１９８１年）〕複製型（ＲＦ）　Ｉ）ＮＡ　（第４
図）を制限酵素旧ｎｄｌｌ及びＢａｍＨＩで消化し、予
め旧ｎｄｌ［［及びＸｈｏ　ｎで消化しておいたｐβｌ
　ｔｒｐ［ｌＮＡと混合した。

次に混合物を７４ＤＮＡリガーゼで連結し、連結ＤＮＡ
を大腸菌−ＪＭ１０３株のコンピテント細胞中へ形質転
換させ、Ｘｇａｌインディケータ−プレート上に播いた
（ジェイ・メッシング等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅ５（１９８１年）９巻３０９−３２１頁〕。組換
えファージを含有するプラーク　（白いプラーク）を取
り上げ、新鮮なＪＭ１０３の培養物に接種し、そして感
染細胞からＲＦ分子のミニプレツブを調整したくエッチ
・ディー・バーンボイム（Ｈ，Ｄ、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）
及びジヱイ・ドリイ（Ｊ、　Ｄｏｌｙ）、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ（１９７９年）７巻１５１３−１
５２３頁）。ＩＦＮ−β挿入部を含有するクローンを同
定するために、ＲＦ分子を種々の制限酵素で消化した。

このような１クローン（Ｍ２Ｓ−β１）の制限地図を第
５図に示す。Ｍ２Ｓ−β１クローンから１本鎖（ｓｓ）
ファージＤＮＡをつくり、合成オリゴヌクレオチドを使
用する部位特異的突然変異誘発の鋳型として用いた。

去星炭又　部立特異的突然変　３禾 ０．１ｍＭアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）　、５０　ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−塩酸）
ｐＨ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＤＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在
下に、５０μ！中で合成オリゴヌクレオチドＧＣＡＡＴ
ＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧ　（プライマー）４０ピコモ
ルをＴ４キナーゼにより３７°Ｃで１時間処理した。５
０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ）リス−塩酸、ｐ　Ｈ
８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０ｍＭβ−メ
ルカプトエタノールを含有する混合物５０μ℃中で、こ
のキナーゼ処理されたプライマー（１２ピコモル）を６
７℃で５分、及ヒ４２℃で２５分加熱することによって
１本鎖（ｓｓ）　Ｍ２Ｓ−βＩ　ＤＮＡ５μｇにハイブ
リット形成させた。アニーリングした混合物を次に氷上
で冷却し、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオチド三燐酸（
ｄＮＴＰ）、８０ｍＭトリス−塩酸、ｐ　Ｈ７，４，８
ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ　Ｘ１ｅｎｏｉｙ断片９単位、０．
５　ｍｌ’１ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を含
有する反、心理合物５０μｌに添加し、３７°Ｃで３時
間及び２５℃で２時間インキュベートした。次にフェノ
ール抽出とエタノール沈澱によって反応を停止させた。

ＤＮＡを１０ｍＭトリス・−塩酸、ｐＨ８，０，１０ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＩＥＤＴＡ）、５０％蔗糖
及び０．０５％ブロモフェニルブルー中に溶解し、臭化
エチジウム２μｓ／ｍ℃の存在下、０．８％アガロース
ゲル上の電気泳動にかけた。Ｍ２Ｓ−β１のＲＦ型に対
応するＤＮＡバンドをパーコレート法〔アール・ダブり
ニー・デービス（Ｒ，ｌ、　１）ａｖｉｓ）　　３、「
高等細菌遺伝学Ｊ　（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド・スプリング
・ハーバ−研究所、Ｎ、Ｙ、　１７８〜１７９頁（１９
８０年）〕によってゲルスライスから溶離した。溶離さ
れたＤＮＡをコンピテントＪＭ１０３細胞の形質転換に
使用し、菌を一夜生育させ、培養基上澄液から５ｓＤＮ
Ａを単離した。この５ｓＤＮＡをプライマー伸張の第二
サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製されたＲＦ型Ｄ
ＮＡをコンピテントＪＭ１０３細胞中へ形質転換させ、
寒天プレート上に播き、−夜培養するとファージプラー
クが得られる。

去隻桝１　部位　　的　然・異誘 上の実施例２−の実験をくり返す。但し、合成オリゴヌ
クレオチドプライマーとして、システィンをコードする
ものからスレオニンをコードするものへＩＦＮ−β遺伝
子のコドン１７を変えるのにＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡ
Ｃ，ＴＣＡＧを使用する。

犬皇班玉　部俺豊失負久班 上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリゴヌクレ
オチドプライマーとしてはＩＦＮ−β遺伝子のコドン１
７を欠損させるのにＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧ八
ＡＧＣＴＣＣＴＧを使用するへ ｆｆｉユ　内鉢・　抹　されたプラークのスクリ二丘２
うｊ葺月吐定 突然変異させたＭ２Ｓ−β１プラークの入ったプレート
（実施例１）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−β１ファー
ジプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各
プレートからのプラークを２枚のニトロセルロース円形
フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィル
ターを寒天プレート上へ５分間重ね、第二フィルターの
場合は１５分間重ねて移した。次に０．２　ＮＮａＯＨ
，１，５Ｍ塩化ナトリウム及び０．２％トリトンＸ−１
００に浸した厚手の濾紙上へフィルター類を５分間置き
、次に０、５　Ｍト＋／スー塩酸、ｐ　Ｈ７，５、及び
１．５Ｍ塩化ナトリウムに浸した濾紙上へ更に５分間重
ねて中和した。フィルターを同様なやり方で、２ＸＳＳ
Ｃ（標準くえん酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い
、乾燥し、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。

重複フィルターをフィルター当たり１０ｍ１のＤＮＡハ
イブリッド形成緩衝液（５ｘＳＳＣ）、　ｐＨ７，０，
４’Ｘデンハード液（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、１×＝各０．０２％
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ８）、　５
０ｍＭ￥Ａ酸ナトリウム緩衝液、ｐ　Ｈ７，０及び１０
０μｇ／ｍβの変性サケ精子ＤＮＡにより、５５°Ｃで
４時間、事前ハイブリッド形成させた。オリゴヌクレオ
チドブライマーを３２ｐで標識したＡＴＰでキナーゼ下
に処理することによって３２ｐで標識したブローフ゛を
つくった。フィルレター当たり５ｍβのＤＮ八へイブリ
ド形成緩衝液中でフィルターを３２ｐで標識したプライ
マー３．５Ｘ１０Ｓｃｐ自／ｍβに５５°Ｃで２４時間
ハイブリッド形成させた。０．１％ＳＯ５と減少する量
のＳＳＣを含有する洗浄用緩衝液中でそれぞれ３０分、
５５゛Ｃでフィルター類を洗った。フィルター類を、初
めに２ＸＳＳＣを含んだ緩衝液で洗い、そして突然変異
していないＭＩ３−β１プラークを含有する対照フィル
ターはガイガー計数管を用いて放射能の存在について検
査した。

ＳＳＣ濃度を段階的に低下させ、未突然変異Ｍ１３−β
１プラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフィルターを洗った。

ＳＳＣの使用最低濃度は０．１　ｘｓｓｃであった。フ
ィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラジ
オグラフ処理した。突然変異したＨ１３−β１のプラー
ク４８０個と突然変異していない対照プラーク１００個
をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによっ
てスクリーニングした。対照プラークではプローブとハ
イプリント形成したものが全く存在せず、一方突然変異
したＨ１３−β１プラーク５個がプローブとハイブリッ
ドを形成した。

５個の突然変異Ｍ１３−β１プラークの１個（Ｈ１３−
ｓｙ２５０１）を取り上げ、ＪＭ１０３培養基へ接種し
た。

上澄液から５ｓＤＮＡを調製し、そして細胞ペレットか
ら２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを調製した。Ｍ１３ユニバーサ
ルプライマーを使用して、クローンのジデオキシ配列決
定用の鋳型として５ｓＤＮＡを使用した。配列決定分析
の結果を第６図に示す。この結果は、ＴＧＴｃｙｓコド
ンがＡＧＴｓｅｒコドンへ変換されたことを確証してい
る。。

実施例６．　　腸閉における７１．・　ＩＦＮ−βのＭ
　１３−５Ｙ２５０１からのＲＦ　ＤＮＡを制限酵素旧
ｎｄＩ［［及びＸｈｏ　、　Ｉｆで消化し、５２０ｂｐ
の挿入断片を１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌
ｔｒｐプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｐ３　
（第７図）を酵素ＨｉｎｄｌＩ［及びＢａｍＨＩで消化
し、精製したＨ１３−５Ｙ２５０１断片と混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下に連結した。連結ＤＮＡをＥ、
コリＭＭ２９４株へ形質転換した。

アンピシリン耐性形質転換体を薬剤テトラサイクリンに
対する感受性の点からスクリーニングした。

アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の５クロー
ンからの）゛ラスミドＤＮＡを、ＭＩ３二５Ｙ２５０１
挿入部の存在についてスクリーニングするためＨｉｎｆ
　Ｉで消化した。第８ａ図は、クローンの一つ（ｐＳＹ
２５０１）のＨｉｎｆ　Ｉ制限パターンを示すが、図で
はこ汎を元のＩＦＮ−βクローンすなわちｐβｌ　ｔｒ
ｐのＨｉｎｆ　Ｉパターンを比較している。予想のよう
に、ｐＳＹ２５０１に追加の旧ｎｆＩサイトがあり、１
９７ｂｐのＩＦＮ−β内部断片が１６９ｂｐの断片と２
８ｂｐの断片に切れている（第８ｂ図）。クローンｐＳ
Ｙ２５０１の制限地図を第９図に示す。突然変異ＩＦＮ
−β遺伝子の完全なりＮＡ配列を、予測されたアミノ酸
配列と一緒に第１０図に示す。クローンｐＳＹ２５０１
　と称するプラスミドは６０６０４イリノイ州ペオリア
、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５番地、
米国農務省、科学教育局北部研究センター、発酵研究所
のアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャーコレクシ
ョン（ＮＲＲＬ）に寄託されている。指定された寄託番
号はＣＭＣＣ１５３３号及びＮＲＲＬＢ−１５３５６号
である。

ｐＳＹ２５０１及びｐβ１ｔｒｐ　（子孫を含む）の培
養物を１．０の光学密度（００６００）まで生育させた
ヶ無細胞抽出物をつくり、ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性
量を微量力価検定法でＧＭ２７６’７細胞によって検定
した。

クローンｐＳＹ２５０１の抽出物はｐβｌ　ｔｒｐより
３〜１０倍高い活性を示しく第１表）、クローンｐＳＹ
２５０１がｌＮＮ−β活性を示す蛋白質をより多量に合
成しているか、又はつくられた蛋白質がより高い比活性
をもっているかのいずれかであることが示される。

ｐＳＹ２５０１　　　　　　　６ｘｌＯＳｐβ１ｔｒｐ
　　　　　　　　　ｌＸｌ０’ｐｔｒｐ３　（対照）３
０ クローンｐＳＹ２５０１が数倍多い活性蛋白を合成叫で
いたかどうか決定するため、両クローンの抽出物を対照
抽出物と共にＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳
動にかけ、ゲルをクーマーシーブルーで染色して蛋白質
を発色させた。第１１図に示すように、りｏ　−７ｐＳ
Ｙ２５０１　とｐβ１ｔｒｐ（７）抽ｉｌｌ中に存在す
るが対照のｐｔｒｐ３抽出物中にはない約１８．０００
ダルトンの蛋白質に対応する蛋白質バンドが一つだけあ
った。この蛋白質は約２０，０００ダルトンの分子量を
もつが、１８，０００ダルトンの蛋白質のゲル移動パタ
ーンを示しており、ｐβ１　ｔｒｐの抽出物からこの蛋
白質を精製することによってＩＦＮ−βであることが予
めわかっていた。ｐＳＹ２５０１抽出物中にはｐβ１ｔ
ｒｐの抽出物中よりこの蛋白質の量が少ないから、クロ
ーンｐＳＹ２５０１抽出物中の蛋白質の比活性はクロー
ンｐβ１　ｔｒｐのそれより高い。

犬星班工ＩＦＭ−β５ｅｒ１７の°　１１ＩＦＮ−β５
ｅｒ１７をつくるように形質転換されたＥ。

コリからＩＦＮ−β５ｅｒ１７を回収した。Ｅ、コリを
次の生育培地中で、６８０　ｎ　ｍで１０〜１１の光学
密度（乾燥重量８．４ｇ／Ａ）まで生育させた。

−一一一双一一分一一一一一一一　−１−一皮一塩化ア
ンモニウム　　　　　　　　　　　２０ｍＭ硫酸カリウ
ム　　　　　　　　　　　　１６．１ｍＭ燐酸−カリウ
ム　　　　　　　　　　　　７．８　ｍ　Ｍ燐酸二ナト
リウム　　　　　　　　　　１２．２ｍＭ硫酸マグネシ
ウム・七水和物　　　　　　３ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム・二水和物　　　１．５ｍＭ硫酸マンガン・四水和物
　　　　　　　３０μＭ、硫酸亜鉛・七水和物　　　　
　　　　　３０μＭ硫酸銅・五水和物　　　　　　　　
　　　３βＭＬ−Ｌリプトファン　　　　　　　　７０
■／β硫酸第−鉄・七水和物　　　　　　　　７２μＭ
チアミン塩酸塩　　　　　　　　　　　２０■／ｌグル
コース　　　　　　　　　　　　４０’ｇ／βアンモニ
アでｐＨ８周整 形質転換ずみＥ、コリの収穫物９．９７ｔ（９，９ｋｇ
）を２０℃に冷却し、濾液重量が８．８　ｋｇになるま
で、収穫物を一１１０ｋｐａの平均圧力損失と毎分２６
０ｍ　ｊ！の定常濾液流量でクロスフローフィルターに
通すことにより濃縮した。濃縮液（約１ｊ２）を容器に
流し込み、１５℃に冷却した。濃縮液を５℃、約６９、
０００ｋｐａでマントン−ゴーリンホモジナイザーに通
すことによって濃縮液中の菌体を破砕した。

燐酸塩で緩衝化された食塩水、ｐ　Ｈ７，４（ＰＢＳ）
　１βでホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２１の最終容量が得られた。この容量を毎分５０
ｍｊ！の流量で１２０００ｘｇの連続遠心分離にかけた
。固体を上澄液から分離し、２重量％ＳＯ５を含有する
ＰＢＳ　４βに再懸濁させた。この懸濁液を室温で１５
分かきまぜたあと、目に見える懸濁物はなかった。次に
溶液を２−ブタノールで、２−ブタノール；溶液の１：
１容量比で抽出した。

液−液相分離装置中で毎分２００ｍ　ｊ！の流量を用い
て抽出を行なった。次に有機相を分離し、そして蒸発乾
固させることにより蛋白質２１．３　ｇを得た。これを
蒸留水に１＝１０の容量比で再懸濁した。

回収された生成物は、ウィルスの細胞病理作用（ＣＰＥ
）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒトＩＦＮ−β
活性について検定された。ミクロタイタープレート内で
この検定を行なった。最少基本借地５０μｌを各容器に
仕込み、第一容器には資料２５μβを入れ、つぎ容器以
降には１：３の容量の希釈を連続的に行なった。ウィル
ス（水泡性口内炎）。

細胞（ヒト線維芽細胞ＧＭ　−２７６７系統）及び標準
ＩＦＮ−β対照群を各プレートに収容せしめた。ｍ１２
当たり１００単位の標準ＩＦＮ−βを使用した。次にプ
レートに紫外線を１０分間照射した。照射後、細胞懸濁
液（ｍ７！当たり細胞１．２Ｘ１０’）　１００μβを
各容器に加え、トレーを１８〜２４時間インキュベート
した。細胞当たり１プラ一ク形成単位でウィルス液を細
胞対照プレートを除く各容器に加えた。

ウィルス対照が１００％のＣＰＥを示すまでトレーをイ
ンキュベートした。これは、ウィルス液を加えてから通
常１８〜２４時間で生じた。標準ＩＦＮ〜β対照の５０
％ＣＰＲ容器の位置の点から検定結果を解釈した。この
点からプレート上の全試料についてのインターフェロン
の力価を測定した。回収された生成物の比活性は５ｘｉ
ｏ’　Ｕ／ｍｉと決定された。

ｆｉ　　　沈２　びクロマトグラフィによる実施例７の
方法をくり返したが、但し、抽出。

水相と有機相の分離、及び有機相とＰＢＳとの容量比３
：１での混合の後、氷酢酸の添加によって混合物のｐＨ
を約５に下げた。生じた沈澱物を１ｏｏｏ。

〜１７０００ｘｇ、　１５分間の遠心分離によって分離
し、ヘレソトを１０　％Ｗ／Ｖ　ＳＯＳ、　１０ｍＭ　
ＤＴＴ、　　５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，
５に再溶解し、８０℃に５分間加熱した。

次に、溶液を、ベックマン勾配系を使用して、ブラウン
リーＲＰ−３００，Ｉ　ＯμＭ、ｒアクアポア」カラム
にかけた。緩衝液Ａは水中０．１％トリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％
ＴＦＡとした。検出は２８０ｎｍでの紫外線吸光度によ
った。溶媒プログラムは３時間で０％緩緩衝液外ら１０
０％緩衝液Ｂへの線形勾配とした。

最高のインターフェロン活性を含有するフラクションを
プールし、このプールされたインターフェロン調製物の
比活性は、天然のＩＦＮ−βにおける蛋白質ｍｇ当たり
約２Ｘ１０’国際単位に比べ、９．０×１０７ないし３
．８　Ｘ　１０＠Ｕ／ｍβと決定された。

゛大施皿９．　　ＪＰＮ−β５ｅｒ１７の生ヒ学的　徴
付け５．７ＮＨＣ７！、　　０．１％フェノールの２０
０μβ中において試料４０μｇを１０８℃で２４〜７２
時間の加水分解にかけた後、アミノ酸組成を決定した。

プロリンとシスティンは、過蟻＃＃化後、同じやり方で
決定された。この場合、フェノールを加水分解から省略
した。トリプトファンは、５．７Ｎ塩酸。

ｌＯ％メルカプト酢＃（フェノールなし）中で試料４０
０μｌを２４時間加水分解した後に分析した。

分析は、ＡＡＩＯ樹脂の単一カラムを使用するベックマ
ン１２１ＭＢアミノ酸分析装置で行なった。精製ＩＦＮ
−β５ｅｒ１７の代表的な２４−、４８−、７２一時間
の酸加水分解から計算されるアミノ酸組成は、Ｎ−末端
メチオニンが欠けているほかは、クローンＩＦＮ遺伝子
のＤＮＡ配列によって予測されるものとよく一致してい
る。精製ＩＦＮのアミノ酸末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）か
らの最初の５８残基のアミノ酸配列は、試料０．７ｍｇ
から、ベックマン８９０Ｃ配列測定装置で０．１Ｍクア
ドロール緩衝液を使づて決定された。ＰＴＨアミノ酸は
、アルテンクスウルトラスフェアーｏＤｓ；ｂ　ラム（
４，６Ｘ　２５０ｍｍ）にょる逆相高圧液体クロマトグ
ラフィ（）ＩＰＬＣ）に４５℃でかけ、４０％緩衝液Ｂ
で１．３分、４０〜７０％緩衝液Ｂで８．４分溶出する
ことにより決定された。ここで緩衝液Ａは０．０１１５
Ｍ酢酸ナトリウム、５％テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
　。

ｐＨ５，１１であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中１゜
％ＴＨＦであった。

決定されたＩＦＮ−β５ｅｒ１７のＮ末端アミノ酸配列
は、Ｎ−末端メチオニンの不在を除き、ＤＮＡ配列から
予測される予測配列に一致している。

上に示したように、ＩＦＮ−β５ｅｒ１７　調製物は天
然のＩＦＮ−βの比活性レベルに非常に近いが、それよ
りすぐれた活性を示す。ＩＦＮ−β５ｅｒ１７は遊離ス
ルフヒドリル基をもたないが、３１及び１４１位にだけ
残っているシスティン間に１個の−５−８−結合を示す
。蛋白質は容易にオリゴマーをつくらず、実質的にモノ
マー型にあると考えられる。本発明に従って得られるＩ
ＦＮ−β５ｅｒ１７は単一生成物として又は種々の型の
混合物として不活性、無毒性。

非アレルギー性で、生理的に許容される担体媒体中にお
ける医薬として受は入れられる製剤へ処方でき、がん療
法で、又はインターフェロン療法が指示される症状にお
ける臨床用、治療用に、またウィルス感染用に使用でき
る。このような媒体は蒸留水、生理食塩水、リンゲル液
、バンク液等をを包含するが、これらに限定はされない
。デキストロース、　　ＩＳＡ　（ヒト血清アルブミン
）等のような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又は静脈
内、筋肉内、腹腔内及び皮下投与のような非経口で投与
できる。本発明の変形ＩＦＮ−β製剤は、局所用に通常
利用される適当な媒体中で局所適用のためにも使用でき
る。

上記のＩＦＮ−βムティンの主な利点は、ＩＦＮ−βの
１７位の遊離スルフヒドリル基（−３）ｌ基）を排除さ
れているところにあり、これによってムティンにｃｙｓ
３１とｃｙｓ１４１の間に正しいジスルフィド結合を形
成させ、十分な生物学的活性に明白に必要なコンフォメ
ーションを取らせている。ＩＦＮ−βｓｅｒ１７の増大
した比活性のた°め、治療用により少ない投与量が使え
る。１７位置のシスティンを欠失させ、遊離−３Ｈ基を
排除することによって、ＩＦＮ−β５ｅｒ１７蛋白質は
微生物でつくられるＩＦＮ−βはどたやすくダイマーや
オリゴマーを形成しない。これが蛋白質の精製を容易に
し、その安定性を強める。

失施拠よ隻 ヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列、ＩＬ−２ｃＤＮＡライブラリーをつくる手順
、これをＩＬ−２についてスクリーニングする手順はテ
ィー・タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、）、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　（１９８３年）２４巻３０５頁以降に記述さ
れている。

有力なＩＬ−２ｃＤＮＡクローンに関して濃縮されたｃ
ＤＮＡライブラリーは、慣用手順により、誘導された末
梢血液リンパ球（ＰＢＬ）とジャーカット細胞から得ら
れる濃縮されたＩＬ−２ｍＲＮＡフラクションからつく
られた。ＩＬ−２ｍｍＲＮＡの濃縮は、ｍＲＮＡを分画
し、フラクションをキセノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐ
ｕｓｌａｅｖｉｓ）の未成熟卵母細胞に注入し、卵母細
胞の溶解物の１．Ｌ−２活性をＨＴ−２細胞で検定し、
ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性をもつフラクションを確認するこ
とによって行った〔ジェイ・ワトソン（Ｊ、Ｗａｔｓｏ
ｎ）、　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　（１９７９年）１５０巻１５７０〜１５１９
真及びニス・ギリス（Ｓ、　Ｇ１１ｌｉｓ）等、Ｊ、　
１ｍｍｕｒ＋、（１９７８年）１２０巻２０２７〜２０
３２頁〕。

コロニーハイブリッド形成法を用いて、ＩＬ−２ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした。各ミクロタイタ
ープレートを重層したニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓタ
イプＢＡ−８−５）上にレプリカ法で写取り、アンピシ
リン５０μｇ／ｍｊｌ！を含有するし寒天上で３７℃、
１４〜１６時間生育させた。コロニーを溶解し、５００
ｍＭ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムで５分
の連続処理することによってＤＮＡをフィルターに固定
し、５×標準クエン酸塩溶液（ＳＳＣ）で５分ずつ２回
洗った。フィルターを空気乾燥し、８０℃で２時間炉乾
燥した。重層フィルターをフィルター当たり１０ｍｊ！
のＤＮＡハイブリッド形成緩衝液（５０％ホルムアミド
、５×ＳＳ、Ｃ、ｐＨ７，０＋’　５　Ｘデンハード液
（ポリビニルピロリジン、フィコール及び牛血清アルブ
ミン；１×＝各０．２％）、ｐＨ７，０の５０ｍＭ燐酸
ナトリウム緩衝液、０．２％ＳＤＳ、　２０　、ｊｌ　
ｇ／ｍＡポリＵ及び５０μｇ　７ｍ　ｊｌの変形サケ精
子ＤＮＡにより、４２℃で６〜８時間事前ハイブリッド
形成させた。

タニグチ（前掲）に報告されたＩＬ−２遺伝手配列に基
づいて３ｔｐで標識された２０−ｍａｒオリゴヌクレオ
チドプローブをつくった。プローブのヌクレオチド配列
はＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡであった
。

”　Ｐ　ｃＤＮＡプローブを含有するフィルター当たり
５　ｍ　Ａ’のＤＮＡハイブリッド形成緩衝液で、試料
を４２℃で２４〜３６時間ハイブリッド形成させた。フ
ィルターを２　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ　、で３０分
間ずつ２回５０℃で洗い、次に１ｘｓｓｃと０．１％Ｓ
ＤＳで９０分ずつ２回５０℃で洗い、空気乾燥し、−７
０°Ｃで２〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性
のクローンを同定し、プローブで再度スクリーニングし
た。十分な長さのクローンが、制限酵素地図作成、及び
タニグチら（前掲）が報告したＩＬ−２ｃＤＮＡクロー
ンの配列との比較から確認された。

実施例１２．Ｍ１３ベクターへのＩＬ−２遺伝子のクロ
ーニング 大腸菌ｔｒｐプロモーターの制御下にＩＬ−２遺伝子を
含有するプラスミドｐＬＷ１　（第１２図）を使用して
、実施例１に記載のと同様にＩＬ−２遺伝子をＭ１３ｍ
ｐ９へクローニングした。ｐｔ、ｗ　１の試料は１９８
３年８月４日、２０８５２合衆国メソーランド州ロック
ビル。

パークローン・ドライブ１２３０１番地、アメリカタイ
プ・カルチャー・コレクションに預託され、ＡＴＣＣ３
９，４０５号と指定を受けた。ＩＬ−２挿入部を含有す
る］クローン（Ｍ１３−　ＴＬ−２と称する）の制限地
図を第１３図に示す。１本鎖ファージＤＮＡをクローン
Ｍ１３−ＩＬ−２からつ（す、オリゴヌクオチドで指示
される突然変異誘発用の鋳型として使用した。

前記のとおり、ＩＬ−２はアミノ酸位置５８．１０５及
び１２５にシスティン残基を含んでいる。ＩＬ−２遺伝
子中でこれらの３個のシスティン残基用コドンを含有す
る部分のヌクレオチド配列に基づいて、三つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを設計し、これらの残基用コドン
をセリン用コドンへ突然変異せしめるために合成した。

これらのオリゴヌクレオチドは次の配列をもっている。

ｃｙｓ　５３を変える　ＣＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＣ
ＡＧＡＴＧＴＴＴＣ（０Ｍ２７） ｃｙｓ１０５を変える　ＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡ
ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧ（ＤＭ２８） ｃｙｓ１２５を変える　　ＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡ
ＧＡＡＡＡＧＧＴＡＡＴＣ（０Ｍ２９） ０．１ｍＭ　ＡＴＤ　、　５０ｍＭ　）リス−塩酸、ｐ
Ｈ８，０゜１０ｍＭ塩化マグネシウム、　　５　ｍＭ　
ＤＴＴ及びＴ４キナーゼ９単位の存在下に、５０μβ中
で各オリゴヌクレオチド４０ピコモルを別々に３７℃で
１時間キナーゼ処理した。キナーゼ処理されたプライマ
ー（１０ピコモル）の各々を、１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、２０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７，９，２０ｍＭ塩化
マグネシウム、及び２０ｍＭβ−メルカプトエタノール
を含有する混合物１５μβ中で、６７℃で５分及び４２
℃で２５分加熱することによって５５Ｍ１３−ＩＬ−２
ＤＮ八２．６μｇへハイブリッド形成した。

アニーリングされた混合物を氷上で冷却し、次に０、５
　ｍ　Ｍ各ｄＮＴＰ　、　１７ｍＭ　）リス−塩酸（ｐ
Ｈ７，９）。

１７ｍＭ塩化マグネシウム、８３ｍＭ塩化ナトリウム。

１７ｍＭβ−メルカブトエクノール、ＤＮ八へリメラー
ゼＩ　Ｋｌｅｎｏ→断片５単位、０゜５ｍＭＡＴＰ、及
びＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する反応混合物２５
μｌの最終容量まで調製し、３７℃で５時間インキュベ
ートした。８０℃に加熱して反応を停止させ、反応混合
物をコンピテントＪ旧０３細胞の形質転換に使用し、寒
天プレート上に播いて一夜培養すると、ファージプラー
クが得られた。

突然変異誘発されたＭ１３ｉＬ−２プラークを含んだプ
レートと、突然変異誘発されないＭ１３−ＩＬ−２フア
ージプラークを含んだプレート２枚とを４℃に冷却し、
各プレートからのファージプラークを２枚のニトロセル
ロース円形フィルター上へ、第一フィルターの場合には
乾燥フィルターを寒天プレート上へ５分間重ね、第二フ
ィルターの場合には１５分間重ねて移した。次に０．２
　Ｎ水酸化ナトリウム、ＩｓＭ塩化ナトリウム及び０．
２％トリトンに浸した厚手の濾紙上にフィルターを５分
間置き、次に０．５　Ｍ　トリス−ＨＣ６（ｐＨ７，５
＞　と１．５　ＭＮａＣＩＩに浸した濾紙上へさらに５
分間重ねて中和した。

フィルターを同様なやり方で、２ＸＳＳＣに浸したフィ
ルター上で２回洗い、乾燥してから真空乾燥炉内で８０
°Ｃで２時間乾燥した。重層フィルターをフィルター当
たり１０ｍｎのＤＮＡハイブリッド形成緩衝液（！ｌＸ
５ＳＣ）、ｐＨ７，０，４Ｘデンハード液（ポリビニル
ピロリ−ジン、フィコール及び牛血清アルブミン、１×
−各０．０２％）、０．１％ＳＯ３。

５０　ｍ　Ｍ　燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）及
び１００μｇ／ｍβ変性サケ精子ＤＮＡにより、４２℃
で４時間事前ハイブリッド形成させた。標識をつけたΔ
ＴＰでオリゴヌクレオチドプライマーをキナーゼ処理す
ることによって、３２ｐで標識をつけたプローブをつく
った。フィルター当たり５ｍｌのＤＮΔハイブリッド形
成緩衝液中で４２℃で８時間、３２ｐで標識したプライ
マー０．　Ｉ　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／ｍβにフィルター
をハイブリッド形成させた。０．１％ＳＤＳ及び２ＸＳ
ＳＣを含有する洗浄緩衝液中で５０℃でそれぞれ３０分
ずつ２回、次に０．１％ＳＤＳ及び０．２ｘ　ｓｓｃで
５０℃でそれぞれ３０分ずつ２回フィルターを洗った。

フィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラ
ジオグラフィにかけた。

オリゴヌクレオチドプライマーＤＭ２８及び０Ｍ２９は
、突然変異誘発されたクローンに新しいｐｄｅ　Ｉ制限
部位を創出するように設計されているから（第１４表）
、これらのキナーゼ処理されたプライマーとハイブリッ
ド形成された幾つかのクローンからのＲＦ　−ＤＮＡを
制限酵素Ｄｄｅ　Ｉで消化した。プライマー　ＤＭ２８
とハイブリッド形成し、新しいＤｄｅ　Ｉ制限部位をも
つ突然変異誘発されたＭ１３−ＩＬ−２プラークの一つ
（Ｍ１３−Ｌ讐４４）を取り上げ、ＪＭ１０３培養物へ
接種し、培養上澄液から５ｓＤＮＡを調製し、細胞ペレ
ットからｄｓＲＦ　−ＤＮＡを調製した。同じく、プラ
イマーＤＭ２９とハイブリッド形成させたプラーク（Ｍ
２Ｓ−ＬＷ４６）を取り上げ、これから５ｓＤＮＡ　と
ＲＦ−１１ＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドプライ
マーＤＭ２７はＤｄｅ　Ｉ位置の代わりに新しいＰｓｔ
Ｉ制限部位を創出するように設計されている。従って、
このプライマーにハイブリッド形成されたプラークを新
しいＰｓｔＩ部位の存在の点からスクリーニングした。

このような一つのファージプラークを同定しくＭ２Ｓ−
ＬＷ４２）　、　　５ｓＤＮＡ及びＲＦ−ＤＮＡをこれ
から調製した。目標のシスティン用ＴＧＴコドンがセリ
ン用ＴＧＴコドンへ転化されたことを確認するため、こ
れらの３クロ一ン全部から得たＤＮＡの配列を決定した
。

Ｍ２Ｓ−Ｌ凶４２　、　Ｍ２Ｓ−Ｌ弱４４．及びＭ２Ｓ
−ＬＷ４６からのＲＦ−ＤＮＡをそれぞれ制限酵素旧ｎ
ｄＩ［［及びＢａｎ　ＩＩで消化し、挿入断片を１％ア
ガロースゲルから精製した。

同様に、プラスミドｐＴｒｐ３　（第７図）を旧ｎｄｌ
ｌｌ及びＢａｎ　Ｉ［で消化し、ｔｒｐプロモータを含
有する大きなプラスミド断片をアガロースゲル上で精製
し、Ｍ２Ｓ−ＬＷ４２　、　Ｍ２Ｓ−ＬＷ４４及びＭ２
Ｓ−ＩＪ４６がら単離された挿入断片の各々と連結した
。連結したプラスミドをコンピテント大腸菌に一１２Ｍ
Ｍ２９４株へ形質転換した。これらの形質転換体からの
プラスミドＤＮＡを制限酵素地図作成によって分析し、
プラスミドｐｔ、誓４２　　、ｐＬＷ４４　　、及びｐ
ｔ、葬４６の存在を確かめた。

第１４図はｐＬＷ４６の制限地図である。ｔｒｐプロモ
ーターを誘導するために、トリプトファンの不在下にこ
れらの個々のクローンの各々を生育させ、無細胞抽出液
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、３クロ
ーンｐＬＷ４２　　、ｐＬＷ４４及びｐＬＷ４６の全部
が、１４．４Ｋｄ　ＩＬ−２蛋白質を合成することが立
証された陽性対照のｐＬＷ２１に見られるものと同様な
１４．５Ｋｄ蛋白を合成することが示された。これらの
同じ抽出液をマウス）ＩＴ−２細胞でＩＬ−２活性につ
いて検定すると、クローンｐＬＷ２１　（陽性対照）と
ｐＬＷ４６のみが有意義量のＩＬ−２活性を示しく下の
第２表）、ｃｙｓ５８とｃｙｓ１０５は生物学的活性に
必要なものであり、これをセリンに変えること　（それ
ぞれｐＬＷ４２トｐＬＷ４４）によって生物学的活性が
失われることを意味している。一方ｃｙｓ１２５は、こ
れを５ｅｒ１２５　（ｐＬＷ４６）゛へ変えても生物学
的活性に影響しないがら、活性にとって不要であるに違
いない。

ＰＩＬ２−７（陰性対照）　　　　　　　ＩＰＬＷ２１
　　　（陽性対照）　　　　　１１３，０００ＰＬＷ４
２　　　　　　　　　　　　　６６０Ｐ　ＬＷ　４４　
　　　　　　　　　　　　Ｌ９９０Ｐ　Ｌ　Ｗ　４６　
　　　　　　　　　　１２３，０００第１５ａ図は、ク
ローンｐＬｌｌ１４６のコード鎖のヌクレオチド配列を
示す。天然のヒ）　ＩＬ−２遺伝子のコード鎖に比べ、
クローンｐＬＷ４６はヌクレオチド３７４にＧ−＋Ｃの
一つの塩基の変化をもつ。第１５ｂ図は、ｐＬＷ４６で
コードされたＩＬ−２ムテインの対応するアミノ酸配列
を示す。このムティンをＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称する
。天然のＩＬ−２に比べ、ムティンは１２５位にシステ
ィンの代わりにセリンをもっている。

ｐＬＷ４６で形質転換されたＥ、コリに一１２ＭＭ２９
４株の試料は、１９８３年９月２６日２合衆国ソー　２
０８５２メリーランド州ロツクビル、パークローン・ド
ライブ１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｍ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、ＡＴ
ＣＣ３９、４５２号に指定された。

ムティンＩＬ−２ｓｅｒ１２５のように１２５位のシス
ティンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられたｒ
Ｌ−２ムテイン類は、ＩＬ−２活性を保持している。従
って、これらを天然のＩＬ−２と同じように処方、使用
できる。従って、このようなムティン類は細菌。

ウィルス、寄生虫、原生動物、及びカビの感染の診断と
処置、リンフ才力イン又は免疫不全の発現に、老令のヒ
ト及び動物における通常の免疫機能の再構成に、酵素増
幅、放射能標識、放射能映像化、及び病的状態のＩＬ−
２水準をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフ才力イン類の受容体
部位を遮断する治療及び診断用に生体外でのＴ細胞生育
の促進のため、またその他種々の治療２診断、研究への
応用に有用である。ヒトＩＬ−２の種々の治療・診断へ
の応用については、ニス・エイ・ローゼンバーグ（Ｓ、
　Ａ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）＋イー・エイ・グリム（
Ｅ、　Ａ。

Ｇｒｉｍ）　ら、エイ・マザムダ−（Ａ、　Ｍａｚｕｍ
ｄｅｒ）　　ら、及びイー・エイ・グリムとニス・エイ
・ローゼンバーグが研究報告している。ＩＬ−２はそれ
自体、又は他の免疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又は
その他の治療剤と組み合わせて使用できる。治療又は診
断用には、蒸留水、リンゲル液、バンク液。

生理的食塩水などの無毒生、非アレルギー性の生理学的
に許容される担体媒体′中にこれらを処方できる。ヒト
又は動物へのＩＬ−２ムテイン類の投与は、医師が適当
と考えるところにより、経口、又は腹腔内又は筋肉内又
は皮下でありうる。関連細胞の例はＢ又はＴ細胞、天然
のキラー細胞等であり、本発明のポリペプチド類と組み
合わせて使用できる治療用試薬の例は、種々のインター
フェロン類、特にガンマインターフェロン、　Ｂ１ｍｍ
生長因子。

ＩＬ−１等である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列図である。 第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変異誘発
による突然変異株ＩＦＮ−β遺伝子の調製を示す略図で
ある。 第３図は、ＩＦＮ−β遺伝子を含むプラスミドｐβ１　
ｔｒｐの図である。 第４図は、クローニングベクターＭ１３ｍｐ８ファージ
の図である。 第５図は、クローンＭ１３−β１の制限地図を示す。 第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す突然変
異ＩＦＮ−β５ｅｒ１７遺伝子の配列順序決定ゲルパタ
ーンを示す。 第７図は、発現プラスミドｐＴｒｐ　３の図である。 第８ａ図は、クローンｐＳＹ２５０１のＨｉｎｆ　Ｉ　
＊Ｊｆｆｌパターンを示し、第８ｂ図は生ずるその二つ
の１６９ｂｐ及び２８ｂｐ断片を示す。 第９図は、クローンｐＳＹ２５０１の制限地図である。 第１０図は、ムティンＩＦＮ−β３ｅｒ１７を暗号づけ
るＤＮＡ配列と、これに対応するアミノ酸配列を示す。 第１１図は、クローンｐＳＹ２５０１及びｐβｌ　ｔｒ
ｐの抽出液におけるＩＦＮ〜β５ｅｒ１７に対応する単
一の１８．０００ダルトンの蛋白質バンドを示す。 第１２図は、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターの制御下にヒ
トインターロイキン−２（ＩＬ〜２）遺伝子を含有する
プラスミドｐＬＷ１の図である。 第１３図は、ファージクローンＭ、１３−　ＩＬ　２の
制限地図である。 第１４図は、プラスミドｐＬＷ４６の制限地図である。 第１５２及び１５ｂ図は、クローンｐＬＷ４６のコード
鎖のヌクレオチド配列、及びＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称
するＩＬ−２ムテイの対応するアミノ酸配列をそれぞれ
示す。 以下全白 図面の浄書（内容に変更なし） ＴｈｒＧｌｙＴｙｒＬｅｕＡｒｇ　Ａｓｎ−−−ＦＩＧ
、　１ フ０ライマー ↓大Ｉ１４菌の形質軒瞭 ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、８ａ ＝ ＦＩＧ、８ｂ ＦＩＧ、９　　　′／ ＩＦＮ−βの１フイ立置　アミノ１斐のシスティンのｔ
ｌ、Ｊンへの変１交ＦＩＧ、１０ Ｈｌｎ　ｄｌｌｌ ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ、　１５ａ ＦＩＧ、　１５ｂ 手続補正書（方式） 昭和５９年１２月轡日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ジスルフィド結合を自由に形成し、生物学的活性に
   とって本質的でない少なくとも１個のシステイン残基を
   もった、生物学的に活性な蛋白質の合成ムテインであっ
   て、そのムテインがシステイン残基の少なくとも１個を
   欠失しているか、又は別のアミノ酸でおき代えられてい
   るものをコードするＤＮＡ配列を遺伝子中に有する構造
   遺伝子をベクターが発現を許容する位置に含有する発現
   ベクター又はその子孫によって形質転換されていること
   を特徴とする宿主生物。 ２、前記宿主細胞又は生物がエセリヒア・コリ（Ｅ．Ｃ
   ｏｌｉ）である特許請求の範囲第１項記載の宿主生物。 ３、プラスミドｐＳＹ２５０１又はその子孫によって形
   質転換されている細菌であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の宿主生物。 ４、前記細菌がＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）であることを
   特徴とする特許請求の範囲第３項記載の宿主生物。 ５、プラスミドｐＬＷ４６又はその子孫によって形質転
   換される細菌であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の宿主生物。 ６、前記細菌がＥ．コリであることを特徴とする特許請
   求の範囲第５項記載の宿主生物。