JPS6031471B2 - グリセロ−ル酸化酵素およびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グリセロール酸化酵素（以下、グリセロール
・オキシダーゼという）およびその製法に関する。

さらに詳しくは本発明は、下記の性質によって特徴づけ
られるグリセロール・オキシダーゼに関する。【ａー
作用：酸素の存在下グリセロールを酸化し、過酸化水素
とグリセルァルデヒドを生成する。

｛ｂ’ 基質特異性：グリセロールおよびダィ／・ィド
ロキシアセトンに特異的に作用する。‘ｃー 至適ｐＨ
：７．８〜８．６ 〔ｄ｝ 安定ｐＨ：７．５〜１０．０ 【ｅー 作用適温：３７００ ‘ｆ｝ グリセロールに対するミノ・ェリス定数（Ｋｍ
値）：８．０×１０‐３Ｍ（ｇ）ｐＨによる失宿の条件
：ｐＨＩＯ．５以上、またはＰＨ７．０以下で失活する
。

位地高度による失活の条件（３０分間処理）：４５００
で約１５％、５０ｏｏで約６５％失活する。

（ｉ）酵素阻害剤：阻害剤無添加時の酵素活性を１００
とし、阻害剤（ｌｍＭ）を添加した時の酵素の発揮する
活性を無添加時と比較して第１表に示す（活性測定は反
応に使われる酸素の消費速度をワールブルグ検圧計で測
定した）。第 １表（ｉ）酵素の安定化：ＷｏｄのＴＥ
Ｓ〔Ｎ−ｍｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）一ｍｅｔ
ｈｙｌ−２−ａｍｌｎｏ−ｅ比ａｎｅｓｕｌｆｏｎｊｃ
ａｃｉｄ〕緩衝液（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ、５
、Ｎｏ．２、４６７〜４７７、１９６６）を用いると、
耐熱性および保存安定性が向上する。

比）分子量：セフアデックスＧ一２０の容を用いた分析
によればその溶出パターンから３０万以上と推定される
。

０株宕晶構造および元素分析値：未だ結晶化に至ってい
ないので未分析。

さらにまた、本発明は上記の性質を有する、グリセロー
ル・オキシダーゼを、ベニシリゥム属の菌株を利用して
製造する方法に関する。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明者らは先にグリセロール・オキシダーゼおよび、
ァスベルギルス属もしくはノィロスポラ属の菌株を利用
するグリセロール・オキシダーゼの製造法を発明した（
特競昭５２−４４１４６：昭和５２年４月１９日出願）
。

本発明者らは、さらに研究した結果、先に発明した、グ
リセロール・オキシダーゼとは、基質特異性、至通およ
び安定ｐＨ、作用適温、基質親和性（グリセロールに対
するミ／・ェリス定数）などにおいて相異なるグリセロ
ール・オキシダーゼが、べニシリウム属に属する菌株に
よって製造される事実を見し、出した。

すなわち、本発明者らは、種々の微生物を用いて、酵素
の生産性について研究した結果、下記に菌学的性質を示
す、ベニシリウム属菌株（Ｐｅｎｊｃｉｌｌｉｕｍｓｐ
．ＫＹ８６８）によって前記した性質〔（ａ｝〜（１）
〕を有するグリセロール・オキシダ−ゼーが得られる事
実を見し、出した。

Ｐｅｎｊｃｍｊ山ｍｓｐ．ＫＹ８６８の菌学的性質：１
各種塔地における生育状態（ａ｝ ッアベック寒天培
地：２５０○、１週間後径１５肋、生育不良でコロニー
は罪薄半透明、極めて少量の胞子を着ける。

｛ｂ｝ 麦芽寒天塔地：２５ｏｏ、一週間後、径３２柵
、平担で緊密な（ｃｏｍｐａｃｔ）コロニー、周綾部白
色、中央部はオリーブ（ＣｏｌｏｒＨａｒｍｏｎｙＮ鷺
ｎ雌１；Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐ，ｏｆ Ａｍｅ
ｒｉｃａによれば、Ｏｌｉｖｅ（・芸ｎｉ〜・き１）、
分泌液滴なし、裏面白色２ 分生子柄（ｃｏｎｉｄｉｏ
ｐｈｏｒｅ）５０仏内外、径３山、１〜２回非対称的に
分岐（船ｙｍｍｅｔｒｊｃａ）、基底梗子（ｍｅｔ山ａ
ｓ）は大角度で分岐（Ｄｉｖａｒｉｃａは）明確な突起
はないが顎粒状に見えることがである。

３ 基底榎子（ｍｅｔ山ａｅ）：９〜１２×２．５〜３
〃内外、外観的には分生子柄（ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒ
ｅ）と同様。

４ 梗子（ｓｔｅｒｉｇｍａｔａ）：８〜９仏×２．５
〜３一、先端は狭くなり、ボーリングのピン状を呈する
。

５ 分生胞子（ｃｏｎｉｄｉａ）：榎子上に放散状に着
生し、柱状にはならない、明確な突起を有するが顕著で
はない。

蓬３仏内外６ 菌核（ｓｃｌｅｒｏｔｉａ）、被子器（
ｐｅｒｊｔｈｅｃｉａ）：なし。

７ 生育温度：麦芽寒天培地上、２５ｏｏでは正常に生
育するが３０００では１週間後も径１〜２脚の白色嬢状
を呈し、胞子の着生もない。

８ 栄養要求：ッアベック寒天借地上では２５００でも
上記１（狐こ記載した如く、生育極めて不良、コーン・
スチープ・リカー寒天堵地上では１週間後、径２５肋に
達し、胞子の着生も見られるが、全体的には麦芽寒天に
は及ばない。

９ 生理的条件 ｛ａ）最適生育条件 ｐＨ：４〜７、温度：２０〜２ｙＣ （ｂｌ 生育範囲 ＰＨ：２〜９、温度：０〜３００○ 次に、本発明によって提供される新規な酸素の製造法な
らびに精製法について詳述する。

グリセロール・オキシダーゼは、ベニシリウム属に属す
るグリセロール・オキシダーゼ生産能を有する微生物を
適当な炭素源、窒素原、無機物およびその他の栄養素を
含む栄叢培地中に培養し、該培養物中よりグリセロール
・オキシダーゼを採取することによって得れる。

用いられる微生物は、ベニシリゥム属に属し、グリセロ
ール・オキシダーゼを生産する能力を有する微生物であ
ればいず−れも用いることができる。

本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機
物その他栄養素を程よく含有する培地ならば合成培地ま
たは天然塔地のいずれも使用可能である。

炭素源としては、グルコース、シュクロース、廃糖蜜な
どの糖類、グリセロール、ソルピトール・マンニトール
などの糖アルコール類が使用できる。

窒素源としては、アンモニア水、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
、燐酸アンモニウムなどの各種無機および有機のアンモ
ニウム化合物、尿素などの窒素化合物、ベプトン、酵母
エキス、カゼイン加水分解物、脱脂大豆あるいはその消
化物などの窒素性有機物質などが使用できる。

無機物としては、ナトリウム、カリウム、マンガン、マ
グネシウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、亜鉛、
銅などの金属の塩類、クロム、硫酸、燐酸、硝酸、塩酸
などの塩類が使用できる。

本発明においては、ベニシリウム属に属するグリセロー
ル・オキシダーゼ生産性菌株をグリセロールを含有した
培地中で培養した時にグリセロール・オキシダーゼを最
も収量よく得られる。培養温度は通常１８〜３０ｏ０の
範囲で、好適には２０℃〜３５００の範囲で行なわれる
。培養開始時のＰＨは通常６〜８の範囲で好適には６．
部付近で行なわれる。

このような条件下で３０〜７幼時間振とうもしくは深部
損梓培養すれば、培養物中にグリセロール・オキシダー
ゼが著量生成する。かくして培養物中に生成したグリセ
ロール・オキシダーゼは次のごとき方法で採取される。

グリセロール・オキシダーゼは通常菌体中に存在するの
で、菌体中の酵素の採取法について述べる。培養終了後
、培養液を炉過して得られた菌体を水又は緩衝液でよく
洗修する。得られた菌体を適量の緩衝液に懸濁し菌体を
破砕する。破砕には機械的破砕（例えば乳鉢、ダィノミ
ル、マントンガウリン、フレンチプレス、フューズフ。
レス、超音波破砕機その他による）によって行なわれる
。かくして得られた菌体の破砕液中より、固形物を炉週
もしくは遠心分離によって除去し、次いで破砕液中のグ
リセロール・オキシダーゼは酵素単離の常法によって採
取される。例えば‘１’硫安による分画沈殿、【２ーＤ
ＥＡＥセルローズ塔によるカラムクロマト、｛３｝セフ
アデックスによる節別分画、‘４｝ハイドロキシアパタ
ィト塔によるカラムクロマト、‘５｝活性区分の凍結乾
燥の工程に従って酵素粉末を得ることができる。勿論同
一操作をくり返すこと、他の常法の精製手段を必要に応
じて組み合せて用いることもできる。

かくして得られたグリセロール・オキシダーゼの理化学
的性質について以下に詳述する（なおグリセロール・オ
キシダーゼは実施例で得られた精製際品を用いた。

）１ 作用 酸素の存在下グリセロールを酸化して過酸化水素とグリ
セルアルデヒドを生成する。

｛ィ｝ 過酸化水素の生成の確認 １ グリセロールに酸素の存在下グリセロール・オキシ
ダーゼを作用させ、次いで該酵素系にパーオキシダーゼ
、フェノール、４ーアミノアンチピリンを加えて反応さ
せると反応系にキノンィミン色素が生成する。

〔過酸化水素とパーオキシダーゼ、フェ ノールおよび４−アミノアンチピリンの反応については
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０、４７０頁（１９７４）に示
されている〕２ グリセロールに酸素の存在下グリセロ
ール・オキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ
、該発生した過酸化水素をカタラーゼで処理して分解し
た後、該反応系に／ぐーオキシダーゼ、フェノール、４
ーアミノアンチピリンを加えて上記と同様に反応させて
も反応系には同じキノンィミン系色素が生成しない。

３ グリセロールに酸素の存在下、グリセロール・オキ
シダーゼを作用させた反応系に、カタラーゼを共存させ
ると酸素の吸収量が半減する現象が観察される。

この事実は以下の実験事実によって支持され上る。

反応組成Ａ（カタラーゼ無添加系） 試薬 ０．０１Ｍグリセロール水溶液 ０．５肌０．
１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０） １．０の‘
グリセロール・オキシダーゼ水溶液〇．２舷※２ ２．４のＭ４ーアミノアンチピリン水溶液０．５Ｍ ４２のＭフェノール水溶液 ０．５Ｍパーオキ
シダーゼ水溶液 ０．２の‘※２水
０．１叫※１ 本発明の実施例１
で得られた比活‘性６．３グリセロール・オキシダーゼ
５仏ｍｏｌｅを含む。

※２ シグマ社製（米国）、比活性１０００のものを２
０仇ｍ船を含含む。

反応組成Ｂ（カタラーゼ添加系） 試薬 ０．０１Ｍグリセロール水溶液 ０．５の【０
．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０） １．０泌
グリセロール・オキシダーゼ水溶液〇．２Ｍ※１ カタラーゼ水溶液 １．０の【※３水
０．３机※１ 反応組成
Ａに同じ。

※３ シグマ社（米国）、比活性１００のカタラーゼを
１００ｕｎ船を含む。

反応操作 カタラーゼ無添加系の場合、反応組成Ａ に示した各試薬を混ぜ、３７０で蝿梓下に反応させ消費
させる酸素の量をワールブルグ検圧計によって測定した
。

結果は第１図に示す。

カタラーゼ添加系の場合、反応組成Ｂに 示した各試薬を混ぜ３７０で反応させた。

同様に消費される酸素の量を測定し、第１図に併せて示
した。

第１図から明らかな如く５．０山ｍｏｌのグリセロール
を基質にして、カタラーゼ無存在下（第１図の曲線Ａ）
で４．９８仏ｍｏｌｅの酸素を消費した。

また、カタラーゼ存在下（第１図の曲線 Ｂ）では２．５１一ｍｏｌｅの酸素を消費し、（Ａ）に
比べて２分の１に減少していることが判かる。

以上１、２、３記載の事実より、本酵素が過酸化水素を
生成することが確認された。

なお、発生する過酸化水素量の定量的な頚。

定は生成したキノンィミン系色素の比色定量によって求
めた。即ち、反応組成Ａの系において生成した過酸化水
素を後記の４一ＡＡ法で定量した結果、５仏ｍｏｌｅの
グリセロールから４．９６仏ｍｏｌｅの過酸化水素の生
成が確認された。‘。

｝ グリセルアルデ／・ィドの生成確認【１｝ グリセ
ロールに酸素の存在下、グリセロール・オキシダーゼを
作用させ、反応生成物をグリセルアルデヒドと同定した
。

同定の手順 ‘１｝ 反応液 グリセロール・５０の９′の‘の水溶液５滴、グリセロ
ール・オキシダーゼ溶液１０Ｕ／叫、５滴（０．０２Ｍ
ＴＥＳ緩衝液中）、カタラーゼ１４０００Ｕ′ｍ‘、１
滴を合し、約２功時間、３０ｏｏで振とう下に反応した
。

｛２） 同定この反応液中の生成物は以下に示す薄 層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣと略 す）の結果、標品と比較してグリセルア ルデノ・ィドであると同定した。

使用した薄層プレートはシリカゲル・ Ｇ−６岬−２５４（商品名、Ｅメルク社 製、西ドイツ）で、展開溶剤は溶剤系１ 〔ブタノール：酢酸：水＝４：１：１ （容量比）〕、溶剤系２〔ブタノール：ピリジン：水＝
３：２：１．５（容量比）〕である。

展開後、プレート上でアニシジン反 応、過ヨウ素酸−ベンチジン反応、２・ ４−ジニトロフヱニルヒドラジン反応の 三種類の反応を行って、反応生成物の Ｒｆ値および上記各反応により生ずるス ポットの色調が標品のそれらと一致する ことを確認した。

結果を第２表に示す。第 ２ 表 ＴＬＯによる反応生
成物の同定（Ｒｆ値及び里反応）（ ）内はスポットの
色調を表示 ただし、過ヨウ素酸一ベンチジン試薬 の気合の（十）※は青色地に白色の Ｓｐｏｔを意味する。

法ｍ ｐーアニジン塩酸試薬：糖類等の 還元性のカルボニル化合物はＰ−アニシ ジン塩酸と反応して各々構造に特有の発 色を示す。

｛２’過ヨウ素酸一ベンチジン試薬：ポ リァルコール及び頚以の構造は過ヨウ素 酸を消費し、ベンチジン試薬に反応しな くなり、白色のスポットとして検出され る。

（３’ ２・４ージニトロフエニルヒドラジン：カルボ
ニル化合物は２・４−ジニ トロフェニルヒドラジンと反応して２・ ４ージニトロフェニルヒドラゾンを作 り、樽色のスポットとして検出されるヒ 上表に示した如く生成物とグリセルア ルデ／・ィド標品がＲｆ値および各発色試薬による発色
において完全に一致するこ とから両者の同一性が確認された。

即ちグリセロールに酸素の存在下、グリセロ ール・オキシダーゼを作用させて得られ る生成物がグリセルアルデ／・ィドであることが確認さ
れた。

〔２１ グリセロールに酸素の存在下、グリセロール・
オキシダーゼを作用させたときに生成するグリセルアル
デノ・ィドの量は、反応系に２・４ージニトロフエニル
ヒドラジンを加えて生成物の２・４−ジニトロフェニル
ヒドラゾンを作り、これを比色法により定量して消費さ
れたグリセロールとほぼ等モルのグリセルアルデ／・ィ
ドが生成していることから確認した。

し一 酸素の吸収量の確認 グリセロールにグリセロール・オキシダ−ゼを作用させ
た系中の酸素の消費は、酸素電極およびワールブルグ検
圧計よって測定した。

その結果、グリセルアルデノ・ィドの生成量に見合う量
の酸素の吸収が確認された。８‘ィ１、‘。

｝、し一の三項に記載された方法によって求められた過
酸化水素量、グリセルアルデノ・ィド量、酸素の吸収量
（消費量）の定量結果が化学量論的に極めてよく対応す
ることが確認された。以上述べた定性的および定量的な
実験結果より、下式に従って本酵素がグリセロールを（
特異的に）酸化すること、過酸化水素を発生させること
、グリセロールを酸化してグリセルアルデノ・ィドを生
成すること、即ち、本酵素がグリセロール・オキシダー
ゼであることが確認された。

０ 基質特異性 グリセロールに対する活性を１００としたときの他の基
質に対する相対活性の測定結果を第３表に示す。

相対活性は後に記載の４−ＡＡ法による力価の測定法に
おいてグリセロールと同モル量の他の基質を用いて測定
した。

第３表基質特異性 ｍ 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ７．８〜８．６の範囲にある。

測定は３７℃、１■ふ、各ｐＨ（ＴＥＳ緩衝液）での活
性を測定した。結果は第２図に示す。安定ｐＨ範囲はｐ
Ｈ７．５〜１０．０である。測定は３７ｑ０で、１５分
、各ｐＨ（ＴＥＳ緩衝液）で処理后、残存活性を測定し
た。結果を第３図に示す。Ｗ 力価の測定法 ３７０にて酸素の存在下、１分間にグリセロールを１ム
ｍｏｌ分解する酵素量を１単位とする。

力価の測定は、グリセロールに酵素を振とうしつつ作用
させ、生成する過酸化水素に、パーオキシダーゼの存在
下、４ーアミノアンチピリンとフェノールを作用させ、
キノンィミン色素に導く。この生成したキノンィミン色
素の可視部の吸収を測定して発生した過酸化水素量を求
めることによって酵素の力価を測定する。

（以下この方法を４−ＡＡ法と略称する）尚、以下本発
明に於いては、比活性は蛋白１肌９当りの活性（Ｕｎｉ
ｔ）で表示した。

又、酵素蛋白量は銅−Ｆｏｌｉｎ試薬を用いる山ｗひの
方法〔０．日．Ｌｏｗひ、Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕ軌
、Ａ．Ｌ．Ｆａｎａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｒａｎ独ｌ１、Ｊ．
Ｂｊｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９３、２６５（１９５１）〕
によって測定した。川原理 酵素活性の測定は、酵素によって発生する過酸化水素を
、パーオキシダーゼの存在下に、４ーアミノアンチピリ
ンとフェノールを反応させ、生成したキノンィミンを定
量することによって行なう。

反応式は次式｛１｝、■で示される。尚、式‘２）の反
応原理は、Ｃ．Ｃ．ＮｌａｉｎらＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ、
２０、４７０（１９７４）に示されている。

｛ｏ｝試薬■基質：０．１Ｍグリセロール水溶液 ０
．５の上■緩衝液：０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８）
１．０泌■４ーアミノアンチピリン：２．４のＭ水溶液
〇．５の‘■フェノール：４２のＭ（水溶液） ０．
５の‘■パーオキシダーゼ水溶液：（蛋白質２の９／私
、比活性１００） ０．１Ｍ■水
０．３叫■酵素水溶液
０．１私し一操作上記試薬■〜
■を試験管に入れ、よく振とうし、５分間、３７０で振
とうする。

次いで酵素（液）を加えて溶液の全量を３Ｍに調整する
、３７０で１０分間振とうして反応させる。一方コント
ロールとして基質の代りに、水を用いたものを同様に処
理する。反応液の５０仇のでの吸収値を求めコントロー
ルとの差を求め△ＯＤとする。６ 力価の計算法 グリセロール・オキシダーゼの１単位は、３７ｑ０で１
分間にグリセロールをｌＡｍｏｌｅ分解する酵素量であ
る。

一方、１のＭのキノンィミンの吸光係数は５．３３と報
告されている〔ＣＩｉｎ．ｃｈｅｍ．２０、４７０（１
９７４）〕から、し一の操作で求められた、反応液３の
‘の５０仇仇の吸収（△ＯＤ）をａと表示すると、求め
る酵素溶液１の上当りの力価（Ａ）は Ａ：ａｘ交３ｘ３ｘ毒＝ａｘ〇．〇５６（ｕ肌妙より求
められる。

尚、力価の測定において反応時間をかえて反応させ反応
液の５０血ののＯＤ値を測定すると、第４図に示す如き
結果が得られた。

第４図より反応時間と、５０仇仇のＯＤ値は直線関係に
あることがわかる。（ここに述べた酵素の力価の測定法
を４−アミノアンチピリン法、略して４一ＡＡ法という
）。

Ｖ 作用適温の範囲 ｐＨ８、反応時間１０分における至適温度を検討した結
果を第５図に示す。

至適温度は３７０付近に存在した。Ｗ ｐＨ、温度など
による失活条件ｐＨ条件による失活において ｍの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲の項で述べた如く、Ｐ
Ｈ７．０以下もしくはＰＨＩＯ．５以上で失活する。

温度による失活について ０．１ＭＴＥＳ緩衝液中、ｐＨ７．８で１８分間加熱処
理して、残存活性を測定した。

第６図に結果を示した様に、４０午０迄１００％安定、
４３０で約１５％失活した。肌 阻害、活性化および安
定化について 前記した通りである。

風 基質親和性 べニシリウム属の産生するグリセロール・オキシダーゼ
の基質グリセロールに対するミハヱリス．定数※（Ｋｍ
値）は８．０×１０‐３Ｍであった。

一方、先に発見されたアスベルギルス・ャポニカス、ニ
ューロスポラ・クラツサのグリセロール・オキシダーゼ
（特顔昭５２−４４１４６）のＫｍ値はそれぞれ１．８
５×１０‐２Ｍ、１．９０×１０‐２Ｍであり、これら
に比べてべニシリウム属のそれは半分以下である。従っ
て、ベニシリウム属のグリセロール・オキシダーゼはグ
リセロールに対する親和性が高く、グリセロールの定量
により−層適していることが判洋した。※ミ／・ェリス
定数の求め方は次の文献の記載に従った。

日．Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ｂｕｒｋ，Ｊ
．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、５０ ６５８（１９
３４）。

本発明によって提供されるグリセロール・オキシダーゼ
は、グリセロールの定量法に利用される。

以下、グリセロールの定量法について説明する。グリセ
ロールの定量法には■ 酸素の存在下グリセロールにグ
リセロール・オキシダーゼを作用させ、生成した過酸化
水素を定量する方法、＠ 同じく生成するグリセルアル
デ／・ィドに２・４ージニトロフェニルヒドラジンを作
用させて、２・４−ジニトロフエニルヒドラゾンを生成
せしめ、この２・４ージニトロフェニルヒドラゾンを比
色法により定量することにより、グリセロールを定量す
る方法、■酸素の存在下グリセロールにグリセロール・
オキシダーゼを作用させ、この系の酸素の吸収量を測定
する方法があげられる。

■、＠および公の原理、方法は既に１（酵素の）作用の
項において夫々述べたとおりである。しかしながら以下
に■の、生成する過酸化水素量を測定することにより、
グリセロールを測量する方法について述べる。即ち、Ｗ
、＠試薬の項中、基質グリセロール溶液の濃度を０．１
ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、５．０ｍ
Ｍ、１０．０ｍＭと変え１叫中に比活性２．４酵素０．
１の９を含む溶液を用いてＷ．Ｑ項記載の操作を行って
５０仇ｍでの反応液の吸収値を求めると次のような結果
が得られた。

第 ４表 即ち、基質濃度（グリセロール濃度）と ５０価のでの反応液のＯＤ値とは直線関係が認められる
。

この原理により、溶液中の未知の濃度のグリセロールを
定量できる。

この事実は、グリセロールの定量が関与する分野におい
て新たな定量手法、定量用キツトの作成を示唆するもの
である。

従釆より、例えば生化学の分野においてグリセロールの
定量法が必要とされていた。

即ち血清中のトリグリセライドを加水分解してグリセロ
ールと脂肪酸にして、このグリセロールを測定してトリ
グリセライドを定量する方法が種々知られている。グリ
セロールの化学的定量法としては、クロモトロープ酸法
、アセチルアセトン法、トリアゾール法、Ｒａｎｄｒｕ
ｐ法、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ蟹光法が知られているが、
いずれも反応が非特異的という欠点を有している。

又酵素法として、グリセロキナーゼーを用いる方法が知
られているが、反応をピルピン酸キナーゼー、乳酸脱水
素酵素で共役させる結果測定に時間がかかるので、多数
検体の処理には不向きという次点がある。

しかしながら本発明によって提供されるグリセロール・
オキシダーゼを用いることによってグリセロールを直接
酸化し、過酸化水素が化学量論的に生成してくることが
判明した。

従ってこの過酸化水素を発色系に導き、比色定量によっ
て極めて簡単に又特異的にグリセロールの定量即ちトリ
グリセラィドの定量が可能になる。以上において説明し
たように、本発明において得られるべニシリウム属菌に
よるグリセロール・オキシダーゼは先に発見されたアス
ベルギルス属、ニュー。

スポラ属の菌によるグリセロール・オキシダーゼと比べ
ると至薄ｐＨ、基質特異性等で相異る酵素蛋白であるこ
とが判る。又、耐熱性があり、Ｋｍ値も低く、グリセロ
−ルの定量により適していることが明らかになった。次
に実施例によって本発明を詳しく説明する。

実施例 １べニシリゥム・ェスピー・ＫＹ８粥（徴工研
菌寄第４５６７号）（ＮＲＲＬＩ１３３９）を２そ三角
フラスコ中、グリセロール３０夕／そ、コーン・スチー
プ・リカー６夕／夕、酵母エキス２夕／その組成を有す
る種培地（殺菌前ＦＨ６．５）３００机に楯菌し、２５
ｑ０で４雛ｒ振縁培養する。

この種培養液９０の【（フラスコ３本分）を３０クジャ
ー・ファーメンター中上記種培地と同じ培地１５そに楯
菌し、２５ｏｏで４独特間、通気（１５夕／分）蝿梓（
２５仇ｐｍ）培養する。培養後、この培養液をブナフー
漏斗を用いて炉過し、水で洗浄後、菌体約７３夕（乾重
量）を得る。この菌体をｌｏｗＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．８）５そに懸濁し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌ
ｙ Ａ 母ｃｈｏ企ｎ社製、スイス）にかけ菌体を磨砕
する。磨砕した後、冷凍遠心機にて遠心分離（２０００
０×夕、２０分）し、上清液４．５ぐ（蛋白量２３夕、
比活性０．０１ｕｎｉｔ／ｍ９）を得る。得られた上情
液に硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム３０〜
７０％飽和で沈殿する区分をとり、１０ｍＭ ＴＥＳ経
緩衝液（ｐＨ７．８）５０の‘に溶解する。この溶液を
セロフアンチューブを透析膜として１０のＭ ＴＥＳ緩
衝液１０そに対して透析する。１２時間おきに透析液を
とりかえながら、合計４０その透析液で４劉時間透析す
る。

透析した酵素液を予め１０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７
．８）で平衡化したＤＥＡＥーセルロース（Ｓｅｗａ社
製、西独）のカラム（５．５×４０弧）に通す。この操
作で、酵素は吸着され、同じ緩衝液で、吸着されない不
純蛋白を洗修し次に０．１ＭＮａＣＩを含む０．０１Ｍ
ＴＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８、２夕で溶出するとグリセロ
−ル・オキシダーゼは溶出される。この活性分画５００
の【（蛋白量０．６９、比活性０．２１）を合わせ、硫
酸アンモニウムを７０％飽和になるように添加し、酵素
を沈殿させる。次に、遠心分離（２００００×夕、２０
分）で沈殿を集め、１０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
８）２３の‘に溶解する。

これを１０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化
しておいたセフアデックスＧ−１００（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＦｉｎｅＣｈｅｍテｃａｌｓ社製、スウェ−７ン）
のカラム（５．５×８０弧）に通す。

１０ｍＭＴＥＳ緩衝液１夕を流し分画した熔出液を得る
。溶出液の分画中で、比活性の高い区分３００の【（蛋
白量１４０の夕、比活・性０．６１）を得、硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和まで添加し、酵素を沈殿させる。次
に沈殿を遠心分離（２００００×夕、２０分）で集め、
ｌｏｗＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）１０叫で溶解さ
せる。この溶液をセロフアン・チューブを透析膜として
用い、ｌｏｗＭ ＴＥＳ緩衝液５そで２回透析液を替え
て、２４ｈｒ透析する。透析後酵素液を、ｌｏｗＭ Ｔ
ＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化しておいたハイドロ
オキシ・アパタイトの力ラム（５．５×２０伽）に通す
。同緩衝液２５０机【をさらに通し、溶出液を分画回収
する。比活性の高い分画を集め、凍結乾燥しグリセロー
ル・オキシダーゼの粉末精製酵素標品４．物９（比活性
６．３）を得る。精製酵素は細胞抽出液に比べて比活性
は約６３０倍に上昇し、活性の収率は１１．４％である
。実施例 ２ 【ィー 用いる試薬 ｛１｝被検液グリセロール含有水溶液（濃度未知）〇．
５叫‘２｝緩衝液、０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８）
１．０叫‘３’４−アミノアンチピリン：２４ｍＭ水
溶液〇．５舷‘４’フェノール：２４ｍＭ水溶液
０．５泌■パーオキシダーゼ水溶液（蛋白量２．０
ｍ９／机上、比活性１０００）
０．１の‘‘６’水
０．３の‘‘７ー酵素（蛋白量１．０の９／泌、比活
性２．４） ０．１Ｍ何操作上記試薬｛１ー〜■を試験
管に入れ、５分間、３７℃でよく振とうする。

次いで酵素液を加えた後、液量を３の上に調整する。３
７ｏ０で１０分間振とう反応させる。

一方コントロールとして、被検液の代りに水を用いたも
のを同様に処理する。被検液の５０血のでの吸収値を求
め、コントロールとの差、△ＯＤは０．３２２であった
。第７図の検量線より、被検液中のグリセロール含量は
０．５３２ｍＭであると分析した。

【図面の簡単な説明】

第１図はグリセロールに酸素の存在下、グリセロ−ル・
オキシダーゼを作用させた反応系における酸素の吸収量
を示す（図中、Ａは反応系に力々ラーゼを共存させない
場合の酸素に吸収量であり、Ｂはカタラーゼを共存させ
た場合の酸素の吸収量である）。 第２図は、３７ｏ０１０分、各ｐＨにおける相対活性を
示す。第３図は３７ｑ０１５分、各ＰＨで処理後の残存
活性を示す。第４図は酵素の力価の測定に係る反応時間
とＯＤ値（５００ｎのにおける）の関係を示す。第５図
は、ｐＨ８、１０分、各温度における酵素活性を示す。
第６図は、１５分、各温度で熱処理後の残存活性を示す
。第７図は第４表を図示したものである。務‘図 漆仏図 多ス鼠 多３図 蜂ヒ図 象ら‘粛 券７鼠

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記性質を有するグリセロール酸化酵素（ａ）作用
   酸素の存在下グリセロールを酸化し、過酸化水素とグリ
   セルアルデヒドを生成する。 （ｂ）基質特異性 グリセロールおよびダイハイドロキシアセトンに特異的
   に作用する。 （ｃ）至適ｐＨ：７．８〜８．６ （ｄ）安定ｐＨ：７．５〜１０．０ （ｅ）作用適温：３７℃ （ｆ）グリセロールに対するミハエリス定数（Ｋｍ値）
   ：８．０×１０＾−＾３Ｍ（ｇ）分子量：３０万以上 ２ ペニシリウム属に属し、グリセロール酸化酵素を生
   産する能力を有する菌株を培地に培養し、培養物よりグ
   リセロール酸化酵素を採取することを特徴とするグリセ
   ロール酸化酵素の製法。